KR20140121449A - 췌장 베타-세포 장애에서의 가용성 ｍａｎｆ - Google Patents

췌장 베타-세포 장애에서의 가용성 ｍａｎｆ Download PDF

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KR20140121449A
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푸미히꼬 우라노
코수케 카네쿠라
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유니버시티 오브 매사추세츠
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Abstract

본 발명은 부분적으로 췌장 β-세포 장애의 진단, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 모니터링, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 유효성의 모니터링, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 확인, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체의 선택, 임상 연구에 참여하기 위한 대상체의 선택, 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출 방법을 제공한다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본에서 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 하나 이상의 수준의 결정이 포함된다. 또한 가용성 MANF 단백질을 함유하는 약학 조성물 및 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 함유하는 키트가 제공된다.

Description

췌장 베타-세포 장애에서의 가용성 ＭＡＮＦ {SOLUBLE MANF IN PANCREATIC BETA-CELL DISORDERS}
우선권 청구
본 출원은 2012. 1. 24.자로 출원한 U.S. 특허 출원 일련 번호 61/590,021을 우선권으로 청구한다. U.S. 특허 출원 일련 번호 61/590,021은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된다.
대상체에서 췌장 β-세포의 기능 또는 수의 손실은 1형 당뇨병(진성 당뇨병), 2형 당뇨병, 및 볼프람 증후군을 포함하는 몇몇 질환의 병인에 기여한다. 1형 당뇨병에서, 환자는 인슐린 결핍으로 인해 고혈당 수준을 갖는다. 일반적으로 말하면, 인슐린의 절대적 결핍은 1형 당뇨병 환자에서 일어나는 반면, 인슐린의 상대적 결핍은 2형 당뇨병 환자에서 일어난다. 점점 증가하는 증거는 기능성 췌장 β-세포 물질의 감소가 1형 및 2형 당뇨병 모두에 대해서뿐만 아니라 볼프람 증후군과 같은 유전적 형태의 당뇨병의 일반적 특징임을 시사한다(Pipeleers 등, Novartis Found Symp. 292: 19-24, 2008). 1형 또는 2형 당뇨병의 진행 동안, 췌장 β-세포 기능 및 물질이 점차적으로 감소하고 결국 인슐린 결핍 및 고혈당증으로 이어진다. 최근에 발견한 사실에서는 "스트레스를 받은" 췌장 β-세포가 기능이상 및 사멸에 감수성이 있음을 시사한다(Oslowski 등, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17: 107-112, 2010; Oslowski 등, Curr. Opin. Cell Biol. 23:207-215, 2011; Fonseca 등, Trends Endocrinol. Metab. 22:266-274, 2011). 췌장 β-세포 기능이상 및 사멸이 발생하는 대상체의 감수성 예측을 돕는 진단 마커는 대상체에서 췌장 β-세포 장애(예로 1형 또는 2형 당뇨병)를 치료하거나 이러한 장애의 진행을 지연시키는데 도움이 될 것이다.
발명의 요약
본 발명은 부분적으로 스트레스를 받은 췌장 β-세포가 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)를 생성 및 분비하고, 가용성 MANF는 췌장 β-세포를 소포체 스트레스-유도 아폽토시스로부터 보호하며, 가용성 MANF는 췌장 β-세포에서 소포체 산화환원 항상성을 유지한다는 발견에 기반한다.
이들 발견의 견지에서, 본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 진단, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측, 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체)에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 모니터링, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 확인, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체의 선택, 임상 연구의 참여를 위한 대상체의 선택, 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 적어도 한 수준의 가용성 MANF(예로, 대상체로부터의 생물학적 표본 또는 배양 배지 중 내인성 수준의 가용성 MANF)의 결정이 포함된다.
또한 본원에서는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고; 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고; 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준이 상승된 대상체를 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 확인하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 진단 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다.
또한 본원에서는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고; 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고; 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준이 상승된 대상체를 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인하거나 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준이 감소하거나 유의차가 없는 대상체를 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 정상이거나 감소된 것으로 확인하는 것을 포함하는, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다.
또한 본원에서는 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고; 두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고; 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준을 비교하고; 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준이 상승된 대상체를 췌장 β-세포 기능이 감소하거나 췌장 β-세포가 감소한 것으로 확인하거나 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준이 감소하거나 유의미한 변화가 없는 대상체를 췌장 β-세포 기능에 변화가 없거나 증가된 것으로 또는 대상체에서 췌장 β-세포 물질의 변화가 없거나 증가된 것으로 확인하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 모니터링 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다.
또한 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 유효성의 모니터링 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고, 두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고, 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 비교하는 것이 포함되며, 여기서 (i) 첫 번째 시점은 치료 전이고 두 번째 시점은 치료 개시 후의 임의의 시점이거나, (ii) 첫 번째 시점은 치료 개시 후이고, 두 번째 시점은 치료 동안의 이후 시점 또는 치료 후이고; 첫 번째 시점에 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 감소된 수준은 치료가 대상체에서 효과적이었음을 시사한다.
또한 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연 방법, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소 방법(예로, 시험관 내 방법), 또는 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 대상체에 대한 유효량의 가용성 MANF 또는 아포모르핀의 투여 또는 췌장 β-세포 또는 췌장 β-세포 모집단과 가용성 MANF 또는 아포모르핀의 접촉이 포함된다. 일부 구현예에서, 가용성 MANF는 포유류 가용성 MANF 단백질 서열(예로, 서열 목록 번호 2 및 4-7 중 임의의 하나)에 적어도 80%(예로, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 예로 그 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
또한 본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연을 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF(예로, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 가용성 MANF) 또는 아포모르핀의 사용 방법이 제공된다. 또한 본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 사용하기 위한 단리된 가용성 MANF(예로, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 단리된 가용성 MANF) 또는 아포모르핀이 제공된다.
또한 본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물에 대한 스크리닝 방법(예로, 시험관 내 방법), 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소 방법(예로, 시험관 내 방법), 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 췌장 β-세포를 제공하고, 췌장 β-세포와 후보 화합물을 접촉시키고, 후보 화합물의 존재 하 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준을 결정하고, 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고, 기준 수준 대비 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 상승된 수준과 연관되는 화합물을 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연을 위한 후보 화합물로서 선택하는 것이 포함된다. 이들 방법에서, 기준 수준 대비 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 상승된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연을 위해 유용할 수 있음을 시사한다.
또한, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스- 유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질(예로, 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질), 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 췌장 β-세포)의 제공; 세포와 평가 화합물의 접촉; 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양 결정; 및 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양과 기준 수준의 비교가 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 산화된 리포터 단백질의 상승된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용할 수 있음을 시사한다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 산화된 리포터 단백질의 역치 수준이다.
또한, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법(예로, 시험관 내 방법)이 제공된다. 이들 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질(예로, 녹색 형광 단백질), 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 췌장 β-세포)의 제공; 세포와 평가 화합물의 접촉; 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양 결정; 및 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양과 기준 수준의 비교가 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 환원된 리포터 단백질의 감소된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용할 수 있음을 시사한다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 환원된 리포터 단백질의 역치 수준이다.
또한, 가용성 MANF(예로, 인간 가용성 MANF)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 및 인슐린, C-단백질, 및 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)로부터 선택되는 단백질에 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 키트가 제공된다. 또한, 가용성 MANF 단백질(예로, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질) 및/또는 아포모르핀, 및 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 적어도 하나의 추가 제제(예로, 피오글리타존, TUDCA, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 색사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 듀토글립틴(dutogliptin), 제미글립틴(gemigliptin), 및 알로글립틴(alogliptin)))를 함유하는 약학 조성물이 제공된다.
용어 "췌장 β-세포 장애"란, 그 발병기전의 일환으로 췌장 β-세포 기능(예로, 인슐린 분비) 감소 또는 대상체에 존재하는 생활성 인슐린 분비 췌장 β-세포(췌장 β-세포 물질)의 수 감소를 포함하는 질환을 의미한다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 장애는 대상체에서 췌장 β-세포 모집단(예로, 둘 이상의 췌장 β-세포)에서 소포체 스트레스의 증가를 추가 특징으로 할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 췌장 β-세포 기능의 감소, 생활성 췌장 β-세포(췌장 β-세포 물질)의 수 감소, 또는 대상체에 존재하는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 증가는 본원에 기재된 방법 또는 당분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 간접적으로 검출될 수 있다. 췌장 β-세포 장애의 비제한적 예에는 1형 당뇨병(진성 당뇨병), 2형 당뇨병, 및 볼프람 증후군이 포함된다.
용어 "췌장 β-세포 기능"이란 포유류(예로, 인간) 췌장 β-세포(예로, 췌장 β-세포에 특히 고유한 활성)를 설명하기 위해 사용되는 생물학적 활성을 의미한다. 췌장 β-세포 기능의 비제한적 예에는 인슐린의 합성 및 분비, 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 합성 및 분비, 및 C-펩티드의 합성 및 분비가 포함된다. 인슐린, IAPP, 및 C-펩티드의 합성 및 분비의 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다. 췌장 β-세포 기능은 또한 본원에 기재된 방법뿐만 아니라 당분야에 공지된 방법(예로, 혈당 수준 결정 및 당화 헤모글로빈 A1C 수준 결정)을 이용하여 간접적으로 검출될 수 있다.
용어 "췌장 β-세포 물질"이란 포유류(예로, 인간)에서 생활성 인슐린-분비 췌장 β-세포의 총 수를 의미한다. 대상체에서 췌장 β-세포 물질의 간접적 결정 방법이 본원에 기재된다. 대상체에서 췌장 β-세포 물질의 추가적인 간접적 결정 방법은 당분야에 공지되어 있다(예로, 혈당 수준 결정 및 당화 헤모글로빈 A1C 수준 결정).
췌장 β-세포 물질은 대상체에서 내인성 생활성(viable) 췌장 β-세포의 총 수를 나타낼 수 있거나 대상체에서 내인성 생활성 췌장 β-세포의 수와 대상체에 이식된 생활성 췌장 β-세포(예로, 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식된 생활성 췌장 β-세포)의 수의 합을 나타낼 수 있다.
용어 "가용성 MANF"란 중뇌 별아교세포-유래 영양 인자(MANF)의 가용성 포유류 형태의 서열에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 가용성 MANF는 서열 목록 번호 2 및 4-7 중 임의의 하나, 즉 서열 목록 번호 2 또는 4-7의 전장에 적어도 80% 동일한(예로, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유하는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 MANF는 야생형 포유류 가용성 MANF(예로, 서열 목록 번호 2 및 4-7)일 수 있다.
가용성 MANF 단백질은 치료적 치료제로서(예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 재조합 또는 정제된 내인성 단백질로서) 투여될 수 있다. 정제된 가용성 MANF 단백질은, 예로 건조 중량을 기준으로 적어도 80%(예로, 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%) 순수할 수 있다. 가용성 MANF의 추가 개질 형태가 본원에 기재된다.
용어 "증가하다" 또는 "상승된"이란 기준 수준 또는 동일 대상체에서(예로 동일 대상체로부터의 생물학적 표본 중) 더 이전 또는 더 이후 시점에 측정된 수준 대비 관찰 가능하거나 검출 가능하거나 또는 유의미한 수준 증가를 의미한다.
용어 "감소하다"란 기준 수준 또는 동일 대상체에서(예로 동일 대상체로부터의 생물학적 표본 중) 더 이전 또는 더 이후 시점에 측정된 수준 대비 관찰 가능하거나 검출 가능하거나 또는 유의미한 수준 감소를 의미한다.
어구 "가용성 MANF의 상승된 수준과 연관된 화합물"이란 화합물의 부재 하에 대조군 포유류 세포(예로, 동일한 또는 동일한 유형의 포유류 세포)에 의해 생성 또는 분비되거나 존재하는 가용성 MANF(예로, 단백질 또는 mRNA)의 수준 대비 화합물과 접촉된 포유류 세포에 의해 생성 또는 분비되거나 존재하는 가용성 MANF(예로, 단백질 또는 mRNA)의 상승된 수준을 유도하거나 야기하는 화합물을 의미한다.
어구 "질환 발생 위험"이란 대조군 대상체 또는 모집단(예로, 건강한 대상체 또는 모집단, 또는 췌장 β-세포 장애의 가족력이 없는 대상체 또는 모집단) 대비 대상체에서 향후 췌장 β-세포 장애가 발생할 상대적 개연성을 의미한다. 본원에서는 가용성 MANF의 수준 결정을 포함하여 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험(향후)의 결정 방법이 제공된다.
용어 "치료"에는 대상체에서 질환(예로, 췌장 β-세포 장애)의 증상의 수 감소 또는 중증도, 기간 또는 하나 이상의 증상의 빈도 감소가 포함된다. 용어 치료에는 또한 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 (향후)발생 위험 감소 또는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상의 개시 지연이 포함될 수 있다.
어구 "췌장 β-세포 장애의 발병 지연"은 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상이 대상체에서 관찰되기 전의 기간 (the lenght of time)의 증가를 의미한다. 일부 구현예에서, 대상체는 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 미리 확인될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 대상체는 본원에 기재된 방법을 이용하여 또는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력 관찰에 의해 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인될 수 있다.
용어 "생물학적 표본"에는 생물학적 유체를 포함하여 대상체로부터 수집되는 임의의 표본이 포함된다. 비제한적 표본에서, 생물학적 표본에는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 침, 담즙, 위액 또는 모유가 포함될 수 있다.
어구 "소포체 스트레스"란 소포체 관강의 산화환원 전위의 이동 및/또는 소포체 관강 내에 잘못 폴딩되거나 폴딩되지 않은 단백질 축적을 일으키는 반응성 산소종(친-산화종)의 생성 및 반응성 산소종(또는 이들의 중간체)을 해독(제거)하는 세포 또는 세포 소기관의 능력 간의 소포체 불균형을 의미한다. 소포체 스트레스는 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR)(본원에 추가 기재됨)으로 명명되는 독특한 스트레스 경로를 유발한다.
췌장 β-세포에서의 소포체 스트레스는 여러 분자 이벤트(예로, 소포체에서 증가된 수준의 자유 지방산, 고인슐린혈증, VEGF의 과생성, 저산소증, 글루코오스 결핍, 돌연변이체 섬 아밀로이드 폴리펩티드, 돌연변이체 인슐린, 증가된 수준의 IL-1, 증가된 수준의 IFN-γ, 또는 바이러스 감염)에 의해 유도될 수 있다. 여러 상이한 화학 제제(예로, 탑시가긴 또는 투니카마이신)가 또한, 소포체 스트레스를 유도하는데 이용될 수 있다. 소포체 스트레스는 소포체를 산화성 환경으로부터 보다 환원성 환경으로 이동시키는 것으로 나타났다. 일부 구현예에서, 소포체를 ER 스트레스 조건 하에 환원성에서 산화성 환경으로 이동시키는 능력을 갖는 제제는 ER 스트레스를 감소시키는 것을 도울 것이고/것이거나 ER 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사를 감소 또는 예방시킬 수 있다.
소포체 스트레스는 당분야에 공지된 여러 상이한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 개시 검출, 감소 또는 지연을 위한 예시적 방법이 본원에 기재된다.
어구 "췌장 β-세포 모집단"이란 둘 이상의 췌장 β-세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 모집단은 포유류(예로, 인간) 대상체에 존재할 수 있다(예로, 대상체의 내인성 췌장 β-세포, 췌장 β-세포의 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식). 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 모집단은 시험관 내에서 배양될 수 있다(조직 배양). 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 모집단은 췌장 β-세포주(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포주)이다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 임의의 포유류종(예로, 인간, 원숭이(예로, 침팬지), 마우스, 돼지, 래트, 또는 유인원)에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 모집단은 일차 세포주 또는 불멸화된 세포주일 수 있다.
용어 "췌장 β-세포"란 보통 포유류 췌장의 랑게르한스 섬에 존재하는 인슐린-생성 세포를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 췌장 β-세포는 포유류의 체내에 존재하는 췌장 β-세포(예로, 내인성 췌장 β-세포, 또는 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식 췌장 β-세포) 또는 시험관 내 배양된 췌장 β-세포(예로 본원에 기재된 임의의 포유류종으로부터의 췌장 β-세포의 생체 외(예로 일차) 배양 또는 췌장 β-세포주(예로, 일차 또는 불멸화된 세포주))를 포괄한다. 일부 구현예에서, 포유류에 존재하는 췌장 β-세포는 췌장에 존재한다. 일부 구현예에서, 포유류에 존재하는 췌장 β-세포는 췌장 이외의 조직에(예로 간 조직에) 존재한다. 다른 구현예에서, 췌장 β-세포는 대상체에 이식되는 장치(예로, 생체적합성 중합체)에 캡슐화된다. 용어 췌장 β-세포는 또한 포유류(예로, 인간, 돼지, 래트, 및 마우스) 세포주 또는 일차 포유류(예로, 인간, 돼지, 래트, 및 마우스) 세포 배양에서의 췌장 β-세포를 포괄한다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 분자 생물학 기법을 이용하여 유전적으로 조작되어 하나 이상의 재조합 단백질(예로, 인슐린)을 발현하고/하거나 하나 이상의 내인성 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.
용어 "소포체-유도 아폽토시스성 세포사"란 세포(예로, 췌장 β-세포)의 소포체에서 스트레스에 의해 유발되는 프로그래밍된 세포사를 의미한다. 일부 구현예에서, 아폽토시스성 세포사를 유도하는 소포체 스트레스는 세포(예로, 췌장 β-세포)에서 폴딩되지 않은 단백질 반응(UPR) 경로를 유도한다. UPR 경로의 예시적 성분이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같이, 소포체 스트레스는 여러 제제(예로, 생물학적 및 화학적 제제)에 의해 유도될 수 있다. 췌장 β-세포에서 소포체-유도 아폽토시스성 세포사의 개시 검출, 측정, 감소 및 지연 방법이 본원에 기재된다. 소포체-유도 아폽토시스성 세포사의 추가적 검출 및 측정 방법은 당분야에 공지되어 있다.
용어 "수준 결정"이란 특정 분자의 수준(예로, 생물학적 표본 또는 세포 배양 배지 중)을 평가하기 위한 하나 이상의 과학적 기법(예로, 분자 생물학, 분자 유전학, 면역학 및 생화학적 수단 또는 분석)의 사용을 의미한다. 어구 수준 결정에는 표본(예로, 생물학적 표본 또는 세포 배양 배지)에 대한 특정 분자(예로, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약의 물리적 접촉이 포함된다.
용어 "두 번째 시점"이란 일반적으로 첫 번째 시점(예로, 입원 시점) 후 일어나는 임의의 시점을 의미한다. 두 번째 시점은, 예로 첫 번째 시점의 적어도 6시간, 12시간, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 2개월, 6개월, 1년, 또는 2년 후에 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 첫 번째 시점 및 두 번째 시점 사이에 치료제를 투여받을 수 있다.
용어 "산화환원-감수성 형광 단백질"은 그 산화환원 환경 변화(예로, 소포체의 산화환원 환경 변화) 시 그 형광 특성이 변하는(예로, 여기 및/또는 방출 스펙트럼(예로, 피크 여기 또는 방출 파장)이 변하는) 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질의 상기 형광 특성의 변화는, 예로 하나 이상의 디설피드 결합의 형성 및/또는 절단 결과 일어날 수 있다. 산화환원-감수성 형광 단백질의 비제한적 예에는 산화환원-산화 감수성 녹색 형광 단백질(roGFP) 및 산화환원-감수성 황색 형광 단백질(rxYFP)이 포함된다. 추가적인 산화환원-감수성 형광 단백질은 당분야에 공지되어 있다.
다른 정의는 본 개시 전반에 걸쳐 문맥 상에 나타난다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료가 본원에 기재된다; 그러나 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한을 위한 것이 아니다. 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 본원에서 언급되는 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참조로 도입된다. 상충 시, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선이 될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면 그리고 특허청구범위로부터 자명할 것이다.
도면의 간략한 설명
도 1은 처리하지 않고 또는 탑시가긴(50nM) 또는 투니카마이신(0.5㎍/mL)으로 24시간 처리 후 래트 췌장 β-세포주(INS-1 832/13) 배양물의 농축 배지 중 또는 래트 췌장 β-세포주(INS-1 832/13)의 용해액 중 MANF 단백질 수준을 나타내는 면역블롯이다.
도 2는 하기 조건 하에 배양된 래트 췌장 β-세포주(INS-1 832/13)에서 MANF mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다: 11mM 글루코오스(24시간); 25mM 글루코오스(24시간); 25mM 글루코오스(48시간); 25mM 글루코오스(72시간); 11mM 글루코오스 및 5μΜ 투니카마이신(TM)(24시간); 또는 11mM 글루코오스 및 20nM 탑시가긴(Tg)(24시간). 나타낸 데이터는 정량적 실시간 PCR을 이용하여 생성되었다(n = 3, S.D.).
도 3은 5일 동안 5mM 글루코오스(LG), 11mM 글루코오스(MG), 또는 25mM 글루코오스(HG), 또는 5일 동안 5mM 글루코오스(LG) 및 6시간 동안 0.5μΜ 탑시가긴(TG)과 배양된 마우스 일차 섬에서 MANF, WFS1, TXNIP, 및 CHOP mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다. 나타낸 데이터는 정량적 실시간 PCR을 이용하여 생성되었다(n = 3; S.D.).
도 4는 5.5mM 글루코오스(UT), 25mM 글루코오스(HG), 0.25μΜ 탑시가긴(TG), 10μΜ 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP), 또는 500μΜ 팔미테이트와 소 혈청 알부민(팔미테이트)의 24시간 처리 후 2명의 인간 공여자(HP11139-01 및 HI 11-20)의 인간 일차 섬에서 MANF mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다. 나타낸 데이터는 정량적 실시간 PCR을 이용하여 생성되었다(n = 3; S.D.).
도 5는 추가 처리하지 않고 또는 25mM 글루코오스(24시간), 0.25μΜ 탑시가긴(24시간), 또는 0.5mM 팔미테이트(24시간)를 이용한 처리 후 인간 일차 섬의 배지에서 가용성 MANF의 수준을 나타내는 면역블롯이다.
도 6은 추가 처리하지 않고 또는 25mM 글루코오스(24시간), 0.25μΜ 탑시가긴(24시간), 또는 0.5mM 팔미테이트(24시간)를 이용한 처리 후 인간 일차 섬의 배지로부터 면역침강된 가용성 MANF의 수준을 나타내는 면역블롯이다. 상기 실험에서, 인간 MANF는 토끼 항-인간 MANF 항체(Proteintech)를 이용하여 면역침강되었고, 동일한 항체를 이용하여 면역블롯을 전개하였다.
도 7은 처리하지 않고 또는 24시간 동안 2μΜ 투니카마이신을 이용한 처리 후 MANF mRNA를 표적화하는 3개의 상이한 siRNA 분자 중 하나(siMANF#1, siMANF#2, 또는 siMANF#3) 또는 음성 대조군 siRNA(NC)로 형질감염된 쥐과 췌장 β-세포주(MIN6)에서 BiP mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다. 이들 데이터는 정량적 실시간 PCR을 이용하여 생성되었다(n = 3; S.D.).
도 8은 미처리 또는 24시간 동안 1μΜ 투니카마이신 또는 100nM 탑시가긴으로 처리되고, 0, 40, 또는 200nM 가용성 MANF로 추가 처리된 쥐과 췌장 β-세포주(MIN6)에서 절단된 카스파아제-3의 수준을 나타내는 면역블롯이다.
도 9A는 포유류 소포체-편재된 산화환원-감수성 GFP(MEROS-GFP)의 다이어그램이다.
도 9B는 COS7 세포의 2개의 공초점 이미지이다. MEROS-GFP의 형광을 왼쪽 패널에 나타내고, DsRed-ER 추적물질의 형광을 오른쪽 패널에 나타낸다.
도 10A는 처리 없이 또는 상이한 농도의 DTT의 처리 후 MEROS-GFP의 여기 스펙트럼 세트이다(방출 파장 510nm).
도 10B는 미처리 NSC34 세포에서 산화된 MEROS-GFP의 방출 스펙트럼이다(여기 파장 394nm).
도 10C는 2mM DTT로 처리된 NSC34 세포에서 환원된 MEROS-GFP의 방출 스펙트럼이다(여기 파장 473nm).
도 11은 2mM DTT로 처리된(오른쪽 두 패널) 또는 처리되지 않은(왼쪽 두 패널) INS-1 832/13 세포에서 476-nm 여기 파장(하부 두 패널) 또는 405-nm 여기 파장(상부 두 패널)을 이용하여 수집된 MEROS-GFP의 4개의 공초점 현미경 이미지 세트이다.
도 12는 미처리 상태로 두었거나(라벨 없음) 또는 H2O2(1 또는 0.1mM H2O2) 또는 DTT(0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 또는 10mM DTT)로 처리된 INS-1 832/13 세포에서 MEROS-GFP 비의 그래프이다. MEROS-GFP 비는 플레이트 리더를 이용하여 결정되었다. 나타낸 데이터는 평균 ± S.D.이다(n = 3).
도 13은 미처리 상태로 두었거나(왼쪽 레인) 또는 2mM DTT로 처리한(오른쪽 레인) 세포의 용해액에서 4-아세트아미도-4'-말레이미딜스틸벤-2, 2'-디설폰산(AMS)-개질 MEROS-GFP의 비환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 사진이다. 용해액은 전기영동 전에 미처리 상태로 두었거나(-βΜΕ)(상부) 또는 β-메르캅토에탄올(+βΜΕ)로 처리하였다(저부).
도 14는 1mM DTT로 10분 처리 후 세척된 NSC34 세포에서 MEROS-GFP 비의 시간 경과를 나타내는 그래프이다. MEROS-GFP 비는 처리 전 1분부터 세척 후 4분까지 매 분 간격으로 계산되었다. 하부 선은 473nm에서 여기로 관찰된 형광을 나타내며, 검은 선은 MEROS-GFP 비를 나타내고, 밝은 회색 선은 394nm에서 여기로 관찰된 형광을 나타낸다(n = 3; S.D.).
도 15는 처리 없이 또는 DTT(0.2, 0.5, 또는 10mM DTT)로의 처리 후 MEROS-GFP로 안정적으로 형질감염된 INS-1 832/13 세포의 형광 보조 세포 정렬(FACS) 데이터이다. 데이터는 488nm 및 405nm의 여기 파장 그리고 510nm의 방출 스펙트럼을 이용하여 수집되었다. 하부에서 상부로 가면서 상이한 세트의 데이터는 미처리, 0.2mM DTT, 0.5mM DTT, 및 10mM DTT를 나타낸다(증가하는 농도의 DTT를 이용한 처리 후 보다 환원된 상태로의 이동을 시사함).
도 16은 처리 없이 또는 DTT(0.2mM, 0.5mM, 또는 10mM DTT)를 이용한 처리 후 MEROS-GFP로 안정적으로 형질감염된 INS-1 832/13 세포의 FACS 데이터의 막대그림이다. 가로축은 MEROS-GFP 비를 나타내며 세로축은 세포의 수를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로 가면서 피크들은 미처리, 0.2mM DTT-처리, 0.5mM DTT-처리, 및 10mM DTT-처리 세포를 나타낸다.
도 17은 처리 없이 또는 DTT(0.2, 0.5, 또는 10mM DTT)를 이용한 처리 후 MEROS-GFP로 안정적으로 형질감염된 INS-1 832/13 세포에서 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 나타낸 MEROS-GFP 값은 미처리 값에 대해 표준화된다.
도 18은 처리 없이 또는 1mM H2O2로 30분 동안 처리 후 MEROS-GFP로 안정적으로 형질감염된 INS-1 832/13 세포의 FACS 분석 데이터를 나타내는 2개의 그래프이다. 오른쪽 그래프는 미처리 또는 1mM H2O2로 처리된 INS-1 832/13 세포에서 MEROS-GFP 비의 막대그림이다. 왼쪽 그래프는 미처리(왼쪽) 또는 1mM H2O2로 30분 동안 처리된 INS-1 832/13 세포에서의 중앙값 MEROS-GFP 비를 나타낸다.
도 19는 처리 없이 또는 투니카마이신(TM)(5μΜ; 24시간), 탑시가긴(TG)(10nM; 24시간), TG(1μΜ; 4시간), 브레펠딘 A(BreA)(100ng/mL; 24시간), 또는 MG132(100nm; 24시간)를 이용한 처리 후 FACS 분석을 이용하여 INS-1 832/13 세포에서 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 오차 막대는 ± S.D.를 나타낸다(* p < 0.01). 데이터는 미처리 세포에 대해 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비에 대해 표준화된다.
도 20은 미처리 상태로 두거나 1μΜ 탑시가긴(TG)으로 4시간 동안 처리된 INS-1 832/13 세포에서의 MEROS-GFP 비를 나타내는 막대그림이다.
도 21은 11mM 글루코오스(24시간) 또는 25mM 글루코오스로 24, 48, 또는 72시간 동안 처리 후 FACS 분석을 이용하여 INS-1 832/13 세포에서 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 오차 막대는 ± S.D.를 나타낸다. 데이터는 11mM 글루코오스로 24시간 동안 처리된 세포에 대해 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비에 대해 표준화된다.
도 22는 처리 없이, 혈청 결핍 또는 글루코오스 결핍 후 FACS 분석을 이용하여 INS-1 832/13 세포에서 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 오차 막대는 ± S.D.를 나타낸다(* p < 0.01). 데이터는 미처리 세포에 대해 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비에 대해 표준화된다.
도 23은 미처리 또는 팔미트산(0.2mM; 24시간), 팔미트산(0.2mM) 및 고글루코오스(25mM)(24시간), 팔미트산(0.5mM; 24시간), 올레산(0.5mM; 24시간), 또는 리놀레산(0.5mM; 24시간)을 이용한 처리 후 INS-1 832/13 세포에서 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 오차 막대는 ± S.D.를 나타낸다. 데이터는 미처리 세포에 대해 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비에 대해 표준화된다.
도 24는 미처리 상태로 두거나 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)(10μΜ; 24시간), 마우스 IAPP(10μΜ; 24시간), 또는 시토카인(인터류킨-1β(5ng/mL), IFNγ(100ng/mL), 및 TNFα(25ng/mL); 24시간)을 이용한 처리 후 INS-1 832/13 세포에서 중앙값 MEROS-GFP 비의 그래프이다. 오차 막대는 ± S.D.를 나타낸다. 데이터는 미처리 세포에 대해 계산된 중앙값 MEROS-GFP 비에 대해 표준화된다.
도 25는 미처리 상태로 두었거나(왼쪽) 0.5mM 팔미테이트(PA)로 24시간 처리된 INS-1 832/13 세포의 FACS 데이터의 두 그래프이다. y-축은 488nm을 이용한 여기 후 형광을 나타내며, x-축은 405nm을 이용한 여기 후 형광을 나타낸다.
도 26은 처리 없이 또는 0.5mM 팔미테이트(PA) 또는 0.5mM 올레산(OA)을 24시간 동안 처리 후 INS-1 832/13 세포에서 FACS 분석을 이용하여 계산된 MEROS-GFP 비를 나타내는 그래프이다. 팔미테이트로 처리된 세포에 대한 데이터가 오른쪽으로 이동한다.
도 27은 11mM 글루코오스로 24시간 또는 25mM 글루코오스로 24, 48, 또는 72시간 동안 처리 후 INS-1 832/13 세포 모집단에서 환원된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다(** p < 0.01).
도 28은 처리 없이, 혈청 결핍 24시간, 또는 글루코오스 결핍 24시간 후 INS-1 832/13 세포 모집단에서 환원된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다(** p < 0.01).
도 29는 처리 없이 또는 10μΜ 인간 IAPP, 10μΜ 마우스 IAPP, 또는 인터류킨-1β(5ng/mL), IFNγ(100ng/mL), 및 TNFα(25ng/mL)의 조합물을 24시간 동안 처리 후 INS-1 832/13 세포 모집단에서 환원된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다(** p < 0.01).
도 30은 처리 없이 또는 24시간 동안 0.2mM 팔미테이트, 0.2mM 팔미테이트 및 25mM 글루코오스, 0.5mM 팔미테이트, 0.5mM 올레산, 0.5mM 리놀레산, 소 혈청 알부민 및 0.5mM 팔미테이트, 0.5mM 팔미테이트 및 0.5mM 올레산, 그리고 0.5mM 팔미테이트 및 0.5mM 리놀레산 처리 후 INS-1 832/13 세포 모집단에서 환원된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다(** p < 0.01).
도 31은 BiP-P-mCherry로 형질감염된 세포의 다이어그램 및 유세포 측정기 레이저 선 및 필터의 구성을 나타내는 다이어그램이다.
도 32는 산화된 또는 환원된 INS-1 832/13 세포에서 중앙값 BiP-P-mCherry의 발현 그래프이다. 세포는 미처리 상태로 두었거나 24시간 동안 10nM 탑시가긴, 5μΜ 투니카마이신, 25mM 글루코오스, 혈청 결핍, 글루코오스 결핍, 0.5mM 팔미테이트, 10μΜ 인간 IAPP, 또는 인터류킨-1β(5ng/mL), IFNγ(100ng/mL), 및 TNFα(25ng/mL)의 조합물로 처리되었다. BiP-P-mCherry의 발현은 FACS 분석을 이용하여 결정되었다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 33은 5μΜ 투니카마이신(TM, 상부 막대그림) 또는 글루코오스 결핍(하부 막대그림)으로 24시간 동안 처리된 산화된 및 환원된 INS-1 832/13 세포를 나타내는 2개의 막대그림이다. x-축은 인간 BiP 프로모터에 의해 유도되는 mCherry 발현 수준을 시사한다.
도 34는 24시간 동안 0.5mM 팔미테이트로 처리된 INS-1 832/13 세포의 FACS 데이터의 막대그림이다.
도 35는 FACS-분리된 산화된 및 환원된 INS-1 832/13 세포의 순도를 나타내는 막대그림이다.
도 36은 24시간 동안 0.5mM 팔미테이트로 처리된 INS-1 832/13 세포에서 BiP(왼쪽 그래프) 및 스플라이스된 XBP1(sXBP)(오른쪽 그래프)의 발현 수준을 나타내는 2개의 그래프이다. BiP 및 sXBP의 발현 수준은 실시간 PCR을 이용하여 측정되었다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 시사한다.
도 37은 산화된 또는 환원된 INS-1 832/13 세포로부터 정제된 소포체에서 Derlin3, BiP, Herp, 및 PDIa5의 발현 수준을 나타내는 표이다. 발현 데이터는 DNA 마이크로어레이 분석을 이용하여 수집되었다.
도 38은 DMSO 단독, 10nM 탑시가긴(Tg), 10nM Tg 및 10μΜ 피오글리타존, 또는 10nM Tg 및 500㎍/mL 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA)으로 처리된 INS-1 832/13 세포의 죽은 세포의 백분율(왼쪽 그래프) 또는 중앙값 MEROS-GFP 비(오른쪽 그래프)를 나타내는 2개의 그래프이다.
도 39는 MEROS-GFP 시스템을 이용하는 스크리닝 시스템을 나타내는 다이어그램이다.
도 40은 10μΜ 아포모르핀(Apo)의 부재(상부 왼쪽 그래프) 또는 존재(상부 오른쪽 그래프) 하에서 0.5mM 팔미테이트를 이용한 처리 후 INS-1 832/13-MEROS-GFP 세포에서 수집된 FACS 데이터를 나타내는 2개의 막대그림 및 10μΜ 아포모르핀의 부재 또는 존재 하에 처리 없이 또는 0.5mM 팔미테이트를 이용한 처리 후 INS-1 832/13 MEROS-GFP 세포에서 환원된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 시사한다.
도 41은 10nM 또는 50nM 아포모르핀(Apo)과 조합된 또는 조합되지 않은 0.5mM 팔미테이트(PA)를 이용한 처리 후 Mitoprobe 염료로 염색된 INS-1 832/13-MEROS-GFP 세포에서 수집된 FACS 데이터의 막대그림이다.
도 42는 처리 없이 또는 0.5mM 팔미테이트 단독 또는 0.5mM 팔미테이트 및 10nM 아포모르핀 처리 후 FACS 분석으로 분획화된 저 Δψm 세포의 백분율(왼쪽 그래프) 및 죽은 세포의 백분율(오른쪽 그래프)을 나타내는 2개의 그래프이다.
도 43은 처리 없이 또는 10nM 탑시가긴(Tg)으로의 처리 또는 10nM Tg 및 10nM 아포모르핀으로의 처리 후 죽은 세포의 백분율 그래프이다.
도 44는 10nM 아포모르핀 또는 10μΜ 피오글리타존으로 처리된 10nM 탑시가긴-처리 일차 인간 섬(오른쪽 면역블롯) 및 2μΜ 독시사이클린-처리 WFS 1 녹다운 INS-1 832/13 세포(shWFS1)(왼쪽 면역블롯)에 존재하는 절단된 카스파아제 3(c-카스파아제 3) 및 절단된 PARP(c-PARP)의 양을 나타내는 2개의 면역블롯이다.
도 45는 11mM 글루코오스 또는 25mM 글루코오스(24시간)에서 배양(각각 상부 패널 및 하부 패널), 및 48시간 동안 0 또는 0.5㎍/mL 가용성 MANF로의 처리(각각 왼쪽 패널 및 오른쪽 패널) 후 소포체에서 환원된 형태의 EroGFP를 함유하는 INS 1 832/13 세포(췌장 β 세포주)의 백분율을 나타내는 형광 보조 세포 정렬 데이터의 그래프이다. 세포는 510nm의 방출 스펙트럼 및 473nm에서의 파장을 이용하여 여기되었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로 가용성 MANF가 스트레스를 받은 췌장 β-세포에 의해 분비되고 가용성 MANF가 소포체 스트레스-유도 췌장 β-세포의 아폽토시스성 세포사를 지연시키고 소포체 스트레스를 유도하는 제제 또는 조건에 노출된 췌장 β-세포에서 소포체의 산화환원 상태의 변동을 감소시킨다는 발견에 기반하고 있다. 이들 발견의 견지에서, 췌장 β-세포 장애의 진단, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측, 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체)에서 췌장 β-세포 기능 및 췌장 β-세포 물질의 모니터링, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 유효성의 모니터링, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 확인, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체의 선택, 임상 연구 참여를 위한 대상체의 선택, 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출 방법이 제공된다. 이들 방법에는 적어도 하나의 수준의 가용성 MANF(예로, 대상체로부터의 생물학적 표본 중 또는 배양 배지 중)의 결정이 포함된다.
대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 및 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법이 또한 제공된다. 이들 방법에는 대상체에 유효량의 가용성 MANF 또는 아포모르핀의 투여 또는 췌장 β-세포 또는 췌장 β-세포 모집단과 가용성 MANF의 접촉이 포함된다. 일부 구현예에서, 예로 그 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
또한, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이들 방법에는 췌장 β-세포를 제공하고, 췌장 β-세포와 후보 화합물을 접촉시키고, 후보 화합물의 존재 하에 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준을 결정하고, 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 이들 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질(예로, 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질 또는 산화환원-감수성 황색 형광 단백질), 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 췌장 β-세포)를 제공하고; 세포와 평가 화합물을 접촉시키고; 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양을 결정하고; 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양과 기준 수준을 비교하는 것이 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 산화된 리포터 단백질의 상승된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용할 수 있음을 시사한다. 일부 구현예에서, 이들 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질(예로, 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질 또는 산화환원-감수성 황색 형광 단백질), 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 췌장 β-세포)를 제공하고; 세포와 평가 화합물을 접촉시키고; 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양을 결정하고; 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양과 기준 수준을 비교하는 것이 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 환원된 리포터 단백질의 감소된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용할 수 있음을 시사한다.
췌장 β-세포 장애
췌장 β-세포 장애는 대상체에서 췌장 β-세포 기능이상 또는 췌장 β-세포 물질의 점진적 감소를 특징으로 하는 질환군이다. 췌장 β-세포 장애가 있는 대상체에서 감소될 수 있는 췌장 β-세포 기능에는 비제한적으로 인슐린 생성 및 분비, C-펩티드 생성 및 분비, 및 섬 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP) 생성 및 분비가 포함된다. 췌장 β-세포 장애의 비제한적 예에는 1형 당뇨병(진성 당뇨병), 2형 당뇨병, 및 볼프람 증후군이 포함된다. 췌장 β-세포 장애는 임의의 연령의 인간, 예로 유아, 어린이, 성인 및 노령 대상체에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 췌장 β-세포 장애는 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90세 초과 연령의 대상체에서 일어날 수 있다.
헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 간호사 보조원, 또는 실험 기술자)는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의(예로, 2, 3, 4, 또는 5개) 증상 평가에 의해 대상체에 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단할 수 있다. 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 비제한적 증상에는 건강한 개인 또는 모집단(예로, 공복 혈당 수준 100mg/dL 초과 또는 120mg/dL 초과) 대비 혈당 수준(예로, 공복 혈당 수준)의 유의미한 증가, 건강한 개인 또는 모집단(예로, 헤모글로빈 A1C 수준 6.5% 초과, 7.0% 초과, 또는 8.0% 초과) 대비 당화 헤모글로빈 수준(헤모글로빈 A1C 수준)의 유의미한 증가, 갈증 증가, 빈뇨, 과도한 배고픔, 설명할 수 없는 체중 감소, 소변 중 케톤 존재, 피로, 시야 혼탁, 느리게 낫는 상처, 약간 높은 혈압, 및 빈번한 감염이 포함된다. 헬쓰 케어 전문가는 또한 부분적으로 대상체의 췌장 β-세포 장애 가족력에 대해 진단의 기준을 둘 수 있다. 헬쓰 케어 전문가는 대상체가 헬쓰 케어 시설(예로 의원 또는 병원)에 외래한 경우 대상체에 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단할 수 있다. 일부 경우에서, 헬쓰 케어 전문가는 대상체가 보조 케어 시설에 입원한 동안 대상체에 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단할 수 있다. 전형적으로 의사는 대상체에서 하나 이상의 증상의 관찰 또는 검출 후 대상체에서 췌장 β-세포 장애를 진단한다.
헬쓰 케어 전문가는 또한 하나 이상의 하기 요인에 근거하여 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인할 수 있다: 체중 증가(예로, 신체 물질 지수 > 25 또는 > 30), 무활동, 췌장 β-세포 장애의 가족력, 인종, 연령, 다낭성 난소 증후군의 진단, 고혈압, 고밀도 지단백질 수준 감소(예로, 35mg/dL 미만), 및 고수준의 트리글리세리드(예로, 250mg/dL 초과).
본원에서는 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상을 제시하는 대상체 또는 췌장 β-세포 장애 증상을 제시하지 않는 대상체(예로 미진단 및/또는 무증상 대상체))에서 췌장 β-세포 장애의 추가적인 진단 방법이 제공된다. 또한, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 추가적인 확인 방법이 제공된다. 또한 본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 방법이 제공된다.
중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)
본원에 기재된 가용성 MANF 단백질의 내인성 수준은 본원에 기재된 임의의 방법, 예로 췌장 β-세포 장애의 진단, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험 예측, 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체)에서 췌장 β-세포 기능 및 췌장 β-세포 물질의 모니터링, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 확인, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체의 선택, 임상 연구 참여를 위한 대상체의 선택 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출을 위한 마커로서 검출될 수 있다. 정제된, 단리된, 및/또는 재조합 가용성 MANF 단백질은 또한 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 및 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법에서 사용될 수 있다.
MANF 단백질은 이후 절단되고 세포(예로, 췌장 β-세포)로부터 가용성 단백질로 배출되는 전구체 단백질로 번역된다. 전장(전구체) 인간 MANF 단백질 및 인간 가용성 MANF 단백질을 아래에 나타낸다. 전구체 인간 MANF 단백질에서 25-아미노산 시그널 서열을 아래에서 밑줄 쳐 나타낸다. 또한 인간 전구체 MANF 단백질을 인코딩하는 mRNA를 아래에 나타낸다.
인간 전구체 MANF 단백질(서열 목록 번호 1)
Figure pct00001
인간 가용성 MANF 단백질(서열 목록 번호 2)
Figure pct00002
인간 MANF mRNA(서열 목록 번호 3)
Figure pct00003
Figure pct00004
소, 래트, 마우스, 돼지, 파리, 및 제브라다니오(zebrafish)의 가용성 MANF 단백질 서열도 기재되며, 아래에 나타낸다.
소 가용성 MANF(서열 목록 번호 4)
Figure pct00005
래트 가용성 MANF(서열 목록 번호 5)
Figure pct00006
마우스 가용성 MANF(서열 목록 번호 6)
Figure pct00007
돼지 가용성 MANF(서열 목록 번호 7)
Figure pct00008
초파리(Drosophila melanogaster) 가용성 MANF(서열 목록 번호 8)
Figure pct00009
제브라다니오 가용성 MANF(서열 목록 번호 9)
Figure pct00010
포유류 가용성 MANF 단백질은 고도로 보존되어 인간 및 소 가용성 MANF 단백질이 96% 동일성을, 인간 및 마우스 가용성 MANF 단백질이 99% 동일성을, 그리고 인간 및 돼지 가용성 MANF 단백질이 97% 동일성을 갖는다. 인간 가용성 MANF 단백질은 또한 제브라다니오 가용성 MANF 단백질과 72% 동일성 및 88% 유사성을 공유한다.
진단 방법
본원에서는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 진단 방법이 제공된다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것이 포함된다. 이들 방법에서, 가용성 MANF의 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에 췌장 β-세포 장애가 있음을 시사하며, 가용성 MANF의 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 대상체에 췌장 β-세포 장애가 없음을 시사한다.
본원에서 어디에서든 언급되는 "가용성 MANF의 기준 수준"은 가용성 MANF의 역치 수준, 대조군 대상체 또는 모집단(예로, 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은(건강한 대상체 또는 모집단), 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상을 갖지 않는 및/또는 췌장 β-세포 장애의 가족력을 갖지 않는 대상체 또는 모집단)에 존재하는 가용성 MANF의 수준 또는 더 이른 시점에서의 동일한 대상체의 가용성 MANF의 수준일 수 있다.
가용성 MANF의 수준은 당분야에 공지된 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF의 수준은 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 당분야에 공지된 여러 기법(예로, 효소 연관 면역흡착 분석)을 이용해서 검출될 수 있다. 인간 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 여러 항체가 시판된다(예로, Sigma-Aldrich 및 Proteintech에서 시판하는 토끼 항-인간 가용성 MANF 항체).
본원에 기재된 임의의 방법에는 대상체로부터의 표본(예로, 생물학적 유체, 예로 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 뇌척수액을 함유하는 생물학적 표본)의 수득 또는 수집이 추가로 포함될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 생물학적 표본은 가용성 MANF 수준이 결정되기 전에 일정 시기 동안(예로, 적어도 1시간 또는 적어도 24시간) 보관될 수 있다(예로 10℃ 이하에서 보관).
본원에 기재된 임의의 방법은 헬쓰 케어 시설(예로 병원, 의원 또는 보조 케어 시설)에 외래한 환자에서 수행될 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 추정될 수 있다. 대상체는 또한 증상을 나타내지 않거나(무증상 대상체) 또는 췌장 β-세포 장애의 단 하나의 증상을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다. 대상체는 또한 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가될 수 있다. 대상체는 유아, 어린이, 십대 청소년, 성인 또는 노령층일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다. 췌장 β-세포 기능의 검출 방법이 본원에 기재된다. 췌장 β-세포 물질은 대상체에서 췌장 β-세포 기능을 관찰하거나 당분야에 공지된 방법(예로, U.S. 특허 출원 공개 번호 20110123443에 기재된 방법)을 이용해서 간접적으로 검출될 수 있다.
본원에 기재된 진단 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 실험 기술자, 간호사, 의사 보조원, 및 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 진단 방법은 당분야에 공지되거나 본원에 기재된 하나 이상의 추가적 진단 평가 방법(예로 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상, 예로 혈당 모니터링, 당화 헤모글로빈 분석, 인슐린 수준, IAPP 수준, C-펩티드 수준, 또는 소변 중 케톤의 관찰 또는 평가)과 조합 이용될 수 있다. 본원에 기재된 진단 방법은 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체(예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체)에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 진단 방법은 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체에 대해 주기적으로(예로 매월, 2개월, 6개월 또는 1년 마다 적어도 1회) 수행될 수 있다. 일부 구현예에는 대상체로부터 생물학적 표본의 수집이 추가로 포함된다.
일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애를 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 확인된 대상체에 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질, 피오글리타존, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴, 빌다글립틴, 색사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 및 알로글립틴), 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 예로 서열 목록 번호 2에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)를 치료적 유효 용량으로 투여하는 것이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체에서 췌장 β-세포 장애를 확진하기 위한 추가 평가의 수행이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 주기적인 글루코오스 모니터링(예로, 혈당측정기를 이용한 주기적인 자가-글루코오스 모니터링) 또는 본원에 기재된 임의의 모니터링 방법을 위한 대상체의 선택이 포함된다. 일부 구현예에는 의사 또는 헬쓰 케어 전문가에 의한 주기적 의료 평가(예로, 매년 적어도 1회, 매 6개월 적어도 1회, 매 3개월 적어도 1회, 매 2개월 적어도 1회 또는 매월 적어도 1회의 주기적 방문)를 위한 대상체의 선택이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체의 의료 기록에 진단 평가 결과의 기록, 또는 본원에 기재된 방법을 이용하여 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단된 대상체의 하나 이상의 혈계 구성원에서 췌장 β-세포 장애에 대한 진단 평가의 수행이 추가로 포함된다.
췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측 방법
또한, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험의 예측 방법이 제공된다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것이 포함된다. 가용성 MANF의 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 증가된 수준은 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가됨을 시사하며, 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 감소되거나 유의미하지 않음을 시사한다. 본원에 기재된 가용성 MANF의 임의의 기준 수준이 이들 방법에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에는 대상체로부터 생물학적 표본의 수득이 추가로 포함된다.
가용성 MANF의 수준은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF의 수준은 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 당분야에 공지된 여러 기법(예로, 효소 연관 면역흡착 분석)을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법에는 대상체로부터 표본(예로, 생물학적 유체, 예로 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 뇌척수액을 함유하는 생물학적 표본)의 수득 또는 수집이 추가로 포함된다.
본원에 기재된 임의의 방법은 헬쓰 케어 시설(예로 병원, 의원 또는 보조 케어 시설)에 외래한 환자에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 헬쓰 케어 전문가에 의한 주기적 신체 검사의 일환으로 대상체에서 수행될 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 추정될 수 있다. 대상체는 또한 증상을 제시하지 않거나(무증상 대상체) 또는 췌장 β-세포 장애의 단 하나의 증상만을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다. 대상체는 유아, 어린이, 십대 청소년, 성인 또는 노령층일 수 있다.
본원에 기재된 이들 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 실험 기술자, 간호사, 의사 보조원, 및 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다. 이들 방법은 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체의 확인을 위해 당분야에 공지된 임의의 추가 방법(예로, 하나 이상의 하기 요인의 평가: 체중 증가, 무활동, 췌장 β-세포 장애의 가족력, 인종, 연령, 다낭성 난소 증후군의 진단, 고혈압, 감소된 고밀도 지단백질 수준(예로, 35mg/dL 미만), 및 고수준의 트리글리세리드(예로, 250mg/dL 초과))과 조합되어 이용될 수 있다. 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체는 본원에 기재된 임의의 방법(예로, 다음 섹션 참고)을 이용하여 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체에 대한 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질, 피오글리타존, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴, 빌다글립틴, 색사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 및 알로글립틴), 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 예로 치료적 유효 용량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 90% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)의 투여가 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 주기적인 글루코오스 모니터링(예로 혈당측정기를 이용한 주기적인 자가-글루코오스 모니터링)을 위한 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체의 선택이 포함된다. 일부 구현예에는 의사 또는 헬쓰 케어 전문가에 의한 주기적 의료 평가(예로, 매년 적어도 1회, 매 6개월 적어도 1회, 매 3개월 적어도 1회, 매 2개월 적어도 1회, 또는 매월 적어도 1회의 주기적 방문)를 위한 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체의 선택이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체의 의료 기록에 평가 결과의 기록, 또는 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체의 하나 이상의 혈계 구성원에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험을 결정하기 위한 유사한 평가 또는 임의의 당분야에 공지된 평가의 수행이 추가로 포함된다.
췌장 β-세포 기능이상 및 췌장 β-세포 물질의 모니터링 방법
또한, 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체, 췌장 β-세포 장애가 있는 대상체, 또는 췌장 β-세포 이식을 받은 대상체)에서 췌장 β-세포 기능이상의 모니터링 방법이 제공된다. 이들 방법에는 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 비교하는 것이 포함된다. 첫 번째 시점에서의 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에서 췌장 β-세포 기능의 감소(예로, 유의미하거나 관찰 가능하거나 또는 검출 가능한 감소) 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 시사한다. 첫 번째 시점에서의 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 변화 없음 또는 증가를 시사한다.
일부 구현예에서, 방법은 첫 번째 및 두 번째 시점에 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 첫 번째 및 두 번째 시점에 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 두 번째 시점은 첫 번째 시점 후 적어도 6시간(예로, 적어도 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년)일 수 있다. 일부 구현예에서, 첫 번째 시점은 췌장 β-세포 장애의 적어도 하나의 증상의 첫 번째 제시 후 1주 내 또는 의료 시설로의 입원 시일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법에는 하나 이상의 추가적인 이후 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 결정(분석)이 추가로 포함될 수 있다. 이들 방법에서, 이전(예로 직전) 표본(연대순 시간에서 더 일찍 수집된 것)에서의 가용성 MANF의 수준 대비 이후 표본(연대순 시간에서 더 늦게 수집된 것)에서 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에서 췌장 β-세포 기능의 감소(예로, 유의미하거나 관찰 가능하거나 또는 검출 가능한 감소) 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 시사한다. 마찬가지로 이전(예로 직전) 표본(연대순 시간에서 더 일찍 수집된 것)에서의 가용성 MANF의 수준 대비 이후 표본(연대순 시간에서 더 늦게 수집된 것)에서 가용성 MANF의 수준 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 변화 없음 또는 증가를 시사한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 첫 번째, 두 번째 및 하나 이상의 추가 시점에 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 첫 번째, 두 번째 및 하나 이상의 추가 시점에 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 대상체는 이들 방법이 부분적으로 대상체에 이식된 췌장 β-세포의 췌장 β-세포 기능 및 췌장 β-세포 물질을 모니터링하도록 이전에 수여받은 췌장 β-세포 이식을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식 췌장 β-세포이다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 장치 내에 존재하거나, 또는 생체적합성 중합체에 의해 둘러싸이거나 내에 배치된다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 췌장 이외의 조직(예로, 간 조직) 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 대상체에서 췌장 β-세포 이식의 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 내에 수행된다. 일부 구현예에서, 첫 번째 시점은 이식 절차의 직후(예로, 1주 또는 2주 내)이다.
가용성 MANF의 수준은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF의 수준은 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 당분야에 공지된 여러 기법(예로, 효소 연관 면역흡착 분석)을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법에는 대상체로부터 표본 또는 적어도 2개의 표본(예로, 생물학적 유체, 예로 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 뇌척수액을 함유하는 생물학적 표본)의 수득 또는 수집이 추가로 포함된다.
본원에 기재된 임의의 방법은 헬쓰 케어 시설(예로, 병원, 의원 또는 보조 케어 시설)에 외래한 환자에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 헬쓰 케어 전문가에 의한 주기적 검사의 일환으로 대상체에서 수행된다. 대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 또한 췌장 β-세포 장애의 증상을 제시하지 않거나(무증상 대상체) 또는 단 하나의 증상만을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다. 대상체는 유아, 어린이, 십대 청소년, 성인 또는 노령층일 수 있다.
이들 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 실험 기술자, 간호사, 의사 보조원, 및 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다. 췌장 β-세포 기능의 감소(예로, 유의미하거나 관찰 가능하거나 검출 가능한 감소) 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 것으로 확인된 대상체에는 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질, 피오글리타존, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴, 빌다글립틴, 색사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 및 알로글립틴), 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 예로 치료적 유효 용량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 90% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 예로 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
일부 구현예에는 대상체에서 췌장 β-세포 기능이상의 하나 이상의(예로, 2, 3 또는 4개의) 다른 마커(예로, 감소된 C-펩티드 생성 및 분비, 감소된 인슐린 생성 및 분비, 감소된 IAPP 생성 및 분비, 증가된 혈당 수준, 증가된 당화 헤모글로빈 수준, 및 대상체의 생물학적 유체 중(예로, 소변 중) 케톤의 존재)의 추가적인 검출 또는 평가가 추가로 포함된다. 췌장 β-세포 기능이상의 하나 이상의 추가적인 마커의 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에는 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 것으로 확인된 대상체에 대한 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질, 피오글리타존, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴, 빌다글립틴, 색사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 및 알로글립틴), 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 예로 치료적 유효 용량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 90% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)의 투여가 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 주기적인 글루코오스 모니터링(예로 혈당측정기를 이용한 주기적인 자가-글루코오스 모니터링)을 위한 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 것으로 확인된 대상체의 선택이 포함된다. 일부 구현예에는 의사 또는 헬쓰 전문가에 의한 주기적 의료 평가(예로, 매년 적어도 1회, 매 6개월 적어도 1회, 매 3개월 적어도 1회, 매 2개월 적어도 1회, 매월 적어도 1회, 또는 매주 적어도 1회의 주기적 방문)를 위한 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 것으로 확인된 대상체의 선택이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체의 의료 기록에 평가 결과의 기록, 또는 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 것으로 확인된 대상체의 하나 이상의 혈계 구성원에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질을 모니터링하기 위해 유사한 평가 또는 임의의 당분야에 공지된 평가의 수행이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 췌장 β-세포 이식을 위한 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 갖는 대상체의 선택이 추가로 포함된다.
췌장 β-세포 장애의 치료 유효성의 모니터링 방법
또한, 대상체(예로, 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단된 대상체)에서 췌장 β-세포 기능이상의 치료 유효성의 모니터링 방법이 제공된다. 이들 방법에는 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정(분석)하고, 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 비교하는 것이 포함되며, 여기서 (i) 첫 번째 시점은 치료 전이고 두 번째 시점은 치료 개시 후 임의의 시점이거나, (ii) 첫 번째 시점은 치료 개시 후이고 두 번째 시점은 치료 동안의 이후 시점 또는 치료 후이며; 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 감소된 수준은 치료가 대상체에서 효과적이었음을 시사한다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포 장애의 치료는 하나 이상의 인슐린(예로, 본원에 기재된 임의의 형태의 인슐린), 피오글리타존, 및 TUDCA의 투여이다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체(예로, 본원에 기재된 바와 같음) 내로의 췌장 β-세포의 이식이다.
첫 번째 시점에서의 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 감소된 수준은 대상체에서의 치료 유효성을 시사한다. 첫 번째 시점에서의 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 증가된 수준 또는 실질적인 수준 변화 없음은 치료가 효과적이 않았고/않았거나 현재 치료가 종료되어야 하고/하거나 대안적 치료제가 대상체에 투여되어야 함을 시사한다. 일부 구현예에서, 첫 번째 시점에서의 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 증가된 수준 또는 실질적인 수준 변화 없음은 증가된 투여량의 치료제가 대상체에 투여되어야 하거나 치료제가 증가된 빈도 및/또는 기간에 투여되어야 함을 시사한다.
일부 구현예에서, 방법은 첫 번째 및 두 번째 시점에 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 첫 번째 및 두 번째 시점에 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 췌장 β-세포 장애가 있는 것이 미리 확인되었거나 진단된 대상체에서 수행된다. 일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애가 있는 대상체의 선택이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체로부터의 표본 수득이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체에 대한 하나 이상의 용량의 치료제의 투여가 추가로 포함된다.
일부 구현예에서, 두 번째 시점은 첫 번째 시점 후 적어도 6시간(예로, 적어도 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년)일 수 있다. 일부 구현예에서, 첫 번째 시점은 췌장 β-세포 장애의 적어도 하나의 증상의 첫 번째 제시의 1주 내 또는 의료 시설로의 입원 시일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법에는 하나 이상의 추가적인 이후 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 결정(분석)이 추가로 포함될 수 있다. 이들 방법에서, 이전(예로 직전) 표본(연대순 시간에서 더 일찍 수집된 것)에서의 가용성 MANF의 수준 대비 이후 표본(연대순 시간에서 더 늦게 수집된 것)에서 가용성 MANF의 감소된 수준은 대상체에서의 치료 유효성을 시사한다. 마찬가지로 이전(예로 직전) 표본(연대순 시간에서 더 일찍 수집된 것)에서의 가용성 MANF의 수준 대비 이후 표본(연대순 시간에서 더 늦게 수집된 것)에서 가용성 MANF 수준의 증가 또는 유의미하지 않은 변화는 치료가 대상체에서 효과적이지 않았음을 시사한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 첫 번째, 두 번째 및 하나 이상의 추가 시점에 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 첫 번째, 두 번째 및 하나 이상의 추가 시점에 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 대상체는 이들 방법이 부분적으로 대상체에서 췌장 β-세포 이식의 유효성을 모니터링하도록 미리 수여받은 췌장 β-세포 이식을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식 췌장 β-세포이다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 장치 내에 존재하거나, 또는 생체적합성 중합체에 의해 둘러싸이거나 내에 배치된다. 일부 구현예에서, 이식된 췌장 β-세포는 췌장 이외의 조직(예로, 간 조직) 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 대상체에서 췌장 β-세포 이식의 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 내에 수행된다. 일부 구현예에서, 첫 번째 시점은 이식 절차의 직후(예로, 1주 또는 2주 내)이다.
가용성 MANF의 수준은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF의 수준은 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 당분야에 공지된 여러 기법(예로, 효소 연관 면역흡착 분석)을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법에는 대상체로부터 표본 또는 적어도 2개의 표본(예로, 생물학적 유체, 예로 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 뇌척수액을 함유하는 생물학적 표본)의 수득 또는 수집이 추가로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 방법은 헬쓰 케어 시설(예로, 병원, 의원 또는 보조 케어 시설)에 외래한 환자에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 헬쓰 케어 전문가에 의한 주기적 검사의 일환으로 대상체에서 수행된다. 대상체는 췌장 β-세포 장애로 이미 진단받았을 수 있고/있거나 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 유아, 어린이, 십대 청소년, 성인 또는 노령층일 수 있다.
이들 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 실험 기술자, 간호사, 의사 보조원, 및 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의(예로, 2, 3 또는 4개의) 다른 마커(예로, 증가된 C-펩티드 생성 및 분비, 증가된 인슐린 생성 및 분비, 증가된 IAPP 생성 및 분비, 감소된 혈당 수준, 감소된 당화 헤모글로빈 수준)의 추가적인 검출 또는 평가가 추가로 포함되며, 첫 번째 시점에서의 대응 수준 대비 두 번째 시점에 대상체의 생물학적 유체 중(예로 소변 중) 케톤의 부재 또는 유의미하지 않은 수준은 치료가 효과적임을 추가로 시사한다. 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 추가적인 마커의 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다.
치료를 위한 대상체의 선택 방법
또한, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체의 선택 방법이 제공된다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준의 결정(분석); 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준의 비교; 및 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준이 상승된 대상체의 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 선택이 포함된다. 이들 방법에서, 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화를 갖는 대상체는 췌장 β-세포 장애의 치료를 위해 선택되지 않는다.
일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 추가적인 마커의 수준 평가 또는 결정이 추가로 포함될 수 있으며, 여기서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 추가적인 마커의 검출은 대상체가 췌장 β-세포 장애의 치료를 위해 선택되어야 함을 시사한다. 췌장 β-세포 장애의 이러한 하나 이상의 추가적인 마커에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 C-펩티드의 수준 감소, 대상체로부터의 생물학적 표본 중 IAPP의 수준 감소, 대상체로부터의 생물학적 표본 중 인슐린의 수준 감소, 대상체에서 하나 이상의 혈당 수준(들)의 증가, 대상체에서 당화 헤모글로빈 수준의 증가, 또는 대상체로부터의 생물학적 표본 중(예로, 소변 중) 케톤의 검출이 포함된다. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 C-펩티드, IAPP, 인슐린, 혈당, 당화 헤모글로빈, 및 케톤의 수준 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다.
가용성 MANF의 수준은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF의 수준은 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 당분야에 공지된 여러 기법(예로, 효소 연관 면역흡착 분석)을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법에는 대상체로부터의 표본(예로, 생물학적 유체, 예로 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 뇌척수액을 함유하는 생물학적 표본)의 수득 또는 수집이 추가로 포함된다. 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 실험 기술자, 또는 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다.
대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 또한 췌장 β-세포 장애의 증상을 나타내지 않거나 단 하나의 증상만을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 추정될 수 있거나 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가될 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 미리 진단될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다.
대상체에 투여될 수 있는 췌장 β-세포 장애의 치료제에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 가용성 MANF(예로, 서열 목록 번호 2, 즉 서열 목록 번호 2의 전장에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질), 아포모르핀, 속효성 인슐린(예로, 아스파르트(aspart) 또는 리스프로(lispro) 인슐린), 단기 작용(예로, 정규 인슐린), 중기 작용 인슐린(예로, 중성 프로타민 Hagedorn 또는 NPH 인슐린), 장기 작용 인슐린(예로, 울트랄렌티(ultralente) 인슐린), 인슐린 글라르긴(glargine), 인슐린 데테미르(detemir), 프람린티드(pramlintide), 인크레틴(incretin) 모사체(예로, 엑세나티드(exenatide)), 설포닐우레아(예로, 클로르프로파미드, 글리피지드, 글리부리드, 및 글리메피리드), 메글리티니드(예로, 레파글리니드(repaglinide) 및 나테글리니드(nateglinide)), 비구아니드(biguanides)(예로, 메트포르민(metformin)), 티아졸리딘디온(예로, 로지글리타존(rosiglitazone) 및 피오글리타존(pioglitazone)), 알파-글루코시다아제 저해제(예로, 아카르보스(acarbose) 및 메글리톨(meglitol)), 및 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴 및 색사글립틴). 췌장 β-세포 장애의 치료는 임의의 조합으로 사용되는 하나 이상의(예로, 2, 3, 또는 4개의) 상기 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예로 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
이들 방법의 일부 구현예에는 대상체에 적어도 하나(예로, 2, 3 또는 4개)의 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 치료제)의 투여가 추가로 포함된다. 예를 들어, 이들 방법의 일부 구현예에는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물의 적어도 하나의(예로, 적어도 2, 4, 6, 8 또는 10개의) 용량의 투여가 추가로 포함된다. 췌장 β-세포 장애의 치료는 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 또는 10년의 시기에 걸쳐 계속될 수 있다. 치료제는 대상체에 주기적으로(예로 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1주 1회, 1주 2회, 1주 3회, 1주 4회, 1개월 1회, 1개월 2회, 1개월 3회, 또는 1개월 4회) 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 기준 수준 대비 가용성 MANF 수준이 상승된 대상체가 의사 또는 헬쓰 전문가의 주기적 의료 평가(예로 매년 적어도 1회, 매 6개월 적어도 1회, 매 3개월 적어도 1회, 매 2개월 적어도 1회, 매월 적어도 1회, 또는 매주 적어도 1회의 주기적 방문)를 위해 선택된다. 일부 구현예에는 대상체에 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 치료제(예로 본원에 기재된 임의의 예시적 치료제)가 투여되거나 처방되어야 함을 대상체의 의료 기록에 기록하는 것이 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 기준 수준 대비 가용성 MANF 수준이 상승된 대상체가 췌장 β-세포 이식을 위해 선택된다.
췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체의 확인 방법
또한, 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체의 확인 방법이 제공된다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고; 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것이 포함된다. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준이 기준 수준 대비 상승된 경우, 대상체는 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된다. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준이 기준 수준 대비 감소되거나 유의미하게 변화하지 않은 경우, 대상체는 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 감소된 것으로 확인된다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 위험 증가는 가용성 MANF 수준에 유의미하거나 관찰 가능한 상승이 없는 대상체(예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단되지 않은 대상체, 질환을 갖는 것으로 진단받지 않은 건강한 대상체, 또는 췌장 β-세포 장애의 증상이나 췌장 β-세포 장애의 가족력을 갖지 않는 대상체)에 대비한 것이다.
가용성 MANF의 수준은 표준 방법(예로, 당분야에 공지된 임의의 항체-기반 방법)을 이용하여 결정될 수 있다. 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 실험 기술자, 또는 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다.
대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 대상체는 또한 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 추정될 수 있다. 대상체는 또한 증상을 나타내지 않거나 또는 췌장 β-세포 장애의 단 하나의 증상만을 제시할 수 있다. 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 검출 가능하거나 관찰 가능한 췌장 β-세포 물질을 갖고/갖거나 검출 가능하거나 관찰 가능한 양의 췌장 β-세포 기능을 갖는 대상체(예로, 췌장 β-세포 물질 또는 췌장 β-세포 기능이 완전히 손실되지 않은 대상체)에서 수행된다.
췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체에는 췌장 β-세포 장애를 위한 치료제(예로, 본원에 기재된 임의의 치료제)가 투여될 수 있거나 췌장 β-세포 장애에 대한 신규하거나 대안적인 치료제가 투여될 수 있다. 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체는 또한 보다 공격적인 치료적 처리(예로, 의원 또는 병원 방문의 주기 증가)를 거칠 수 있다.
일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체에 췌장 β-세포 장애에 대한 치료제(예로, 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질, 피오글리타존, GLP-1, 또는 DPP-4 저해제(예로, 시타글립틴, 빌다글립틴, 색사글립틴, 리나글립틴, 듀토글립틴, 제미글립틴, 및 알로글립틴), 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 예로 치료적 유효 용량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 90% 동일한 서열을 함유하는 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)의 투여가 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 글루코오스 모니터링(예로, 혈당측정기를 이용한 자가-글루코오스 모니터링)을 위한 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 대상체의 선택이 포함된다. 일부 구현예에는 의사 또는 헬쓰 전문가에 의한 주기적 의료 평가(예로, 매년 적어도 1회, 매 6개월 적어도 1회, 매 3개월 적어도 1회, 매 2개월 적어도 1회, 또는 매월 적어도 1회의 주기적 방문)를 위한 대상체의 선택이 추가로 포함된다. 일부 구현예에는 대상체의 의료 기록에 평가 결과의 기록, 또는 본원에 기재된 방법을 이용하여 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가된 것으로 확인된 대상체의 하나 이상의 혈계 구성원에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험을 평가하기 위한 유사한 평가 또는 임의의 당분야에 공지된 평가의 수행이 추가로 포함된다.
임상 연구 참여를 위한 대상체의 선택 방법
또한 임상 연구 참여를 위한 대상체의 선택 방법이 제공된다. 이들 방법에는 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고; 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고; 임상 연구에 참여시키기 위한, 기준 수준(예로, 본원에 기재된 가용성 MANF의 임의의 기준 수준) 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 증가 또는 감소 또는 유의미하지 않은 변화를 갖는 대상체를 선택하는 것이 포함된다.
가용성 MANF의 수준은 표준 분자 생물학 방법(예로, 본원에 기재된 임의의 항체 기반 방법)을 이용하여 결정될 수 있다. 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 실험 기술자, 또는 간호사 보조원)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 임의의 증상)을 제시할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 또한 췌장 β-세포 장애의 증상을 나타내지 않거나 단 하나의 증상만을 제시할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 췌장 β-세포 장애(예로, 2형 당뇨병)의 가족력을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 췌장 β-세포 장애가 있는 것으로 진단될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 췌장 β-세포 장애에 대한 치료를 받고 있다. 일부 구현예에서, 대상체에는 임상 연구 동안 췌장 β-세포 장애에 대한 신규하거나 대안적인 치료제가 투여된다.
췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출 방법
또한, 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 수준을 결정하고, 생성되는 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준(예로, 본원에 기재된 가용성 MANF의 임의의 기준 수준)을 비교하는 것을 포함하는, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 검출 방법이 제공된다. 가용성 MANF의 기준 수준 대비 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 상승된 수준은 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 증가를 시사한다. 가용성 MANF의 기준 수준 대비 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 췌장 β-세포가 검출 가능한 수준의 소포체 스트레스를 경험하지 않았음을 시사한다.
가용성 MANF의 수준은 표준 분자 생물학 방법(예로, 본원에 기재된 임의의 항체 기반 방법)을 이용하여 결정될 수 있다. 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 실험 기술자, 또는 간호사 보조원) 또는 과학자에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 포유류(예로, 인간)에 있으며 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 수준은 포유류의 생물학적 표본(예로 혈액, 혈청, 또는 혈장을 함유하는 표본)으로부터 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 내인성 췌장 β-세포 또는 이식된 췌장 β-세포(예로, 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식 췌장 β-세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 유전적으로 개질된 자가이식 췌장 β-세포이다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 포유류의 췌장 내에 존재할 수 있거나 췌장 이외의 조직(예로 간)에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 장치, 또는 생체적합성 재료 또는 중합체 중에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 시험관 내(예로, 조직 배양 중)에 존재한다. 예를 들어, 포유류로부터 수확된 일차 췌장 β-세포는 생체 외에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양된 췌장 β-세포는 일차 포유류(예로, 인간, 래트, 원숭이, 소, 또는 돼지) 췌장 β-세포주이다. 일부 구현예에서, 배양된 포유류 췌장 β-세포는 유전적으로 조작되거나(예로, 하나 이상의 단백질을 발현하도록 유전적으로 개질되거나 하나 이상의 단백질 발현을 감소시키도록 유전적으로 개질됨) 또는 화학적으로 처리될 수 있다(예로, 하나 이상의 성장 인자로). 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 하나 이상의 생체적합성 중합체 또는 생합성 물질(예로, 포유류(예로, 인간) 내로 췌장 β-세포의 이식을 돕는 중합체 또는 물질)의 존재 하에 배양될 수 있다. 다양한 생체적합성 중합체 및 생합성 물질이 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 대상체 내에서 췌장 β-세포의 소포체 스트레스의 검출은 하기 중 하나 이상을 따른다: 자신의 췌장 β-세포에서 증가된 수준의 소포체 스트레스를 갖는 대상체의 확인, 치료학적 제제(예로, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스를 감소시킬 제제, 예로 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질 및/또는 아포모르핀)의 투여; 대상체에서 췌장 β-세포 기능의 모니터링(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 기능의 임의의 모니터링 방법); 및 대상체의 임상 방문 빈도 또는 헬쓰 모니터링 수준 증가(예로 증가된 빈도의 혈당 평가). 일부 구현예에서, 예로 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 시험관 내에서 췌장 β-세포의 증가된 소포체 스트레스의 검출은 췌장 β-세포와 치료학적 제제(예로, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스를 감소시킬 제제, 예로 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질 또는 아포모르핀)의 접촉 및/또는 췌장 β-세포 기능의 모니터링(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 기능의 임의의 모니터링 방법)을 따른다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 췌장 β-세포는 적어도 하나의 다른 세포 유형 또는 적어도 하나의 다른 세포주와 함께 시험관 내에서 배양될 수 있다(예로, 공동 배양 또는 영양세포 배양).
치료 방법
또한 대상체로의 유효량의 가용성 MANF(예로, 정제된, 단리된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질)) 및/또는 아포모르핀의 투여가 포함되는, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 증상(예로, 본원에 기재된 임의의 증상)의 수 감소 또는 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상(예로, 본원에 기재된 임의의 증상)의 중증도, 강도 또는 빈도 감소를 일으킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 하나 이상의 증상의 개시 지연(치료를 받는 대상체 대비 치료를 받지 않는 대상체에서 하나 이상의 증상의 실제 개시 시간의 증가)을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 치료는 하기 중 하나 이상을 일으킬 수 있다: 대상체에서 혈당 수준(들)의 감소, 대상체에서 당화 헤모글로빈의 수준 감소, 대상체에서 인슐린 생성의 손실 속도 감소, 대상체에서 췌장 β-세포 기능의 손실 속도 감소, 및 대상체에서 췌장 β-세포 물질의 손실 속도 감소. 일부 구현예에서, 예로 방법에 아포모르핀의 투여가 포함되는 경우, 대상체는 발기 부전 또는 파킨슨 질환을 갖지 않는다.
가용성 MANF
예를 들어 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 가용성 MANF는 서열 목록 번호 2 및 4-7중 임의의 하나, 즉 서열 목록 번호 2 또는 4-7의 전장에 적어도 80% 동일한(예로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유하고, 선택적으로 가용성 MANF 단백질의 생물학적 활성(본원에 기재됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 가용성 MANF는 서열 목록 번호 2(인간 가용성 MANF), 즉 서열 목록 번호 2의 전장에 적어도 95% 동일한(예로, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유하며, 선택적으로 가용성 MANF 단백질의 생물학적 활성(본원에 기재됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 가용성 MANF는 가용성 MANF의 내인성(야생형) 형태 또는 서열 목록 번호 2이다. 이들의 임의의 구현예에서, 가용성 MANF는 정제되거나 단리될 수 있다. 이들의 임의의 구현예에서, 가용성 MANF는 재조합 단백질일 수 있다.
두 서열 간 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행된다. 두 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 Needleman 및 Wunsch[J. Mol. Biol., 48:444-453, 1970)] 알고리즘을 이용하여 결정되며, 이는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16 그리고 길이 가중치 1을 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지(인터넷 gcg.com에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램에 도입되어 있다. 두 뉴클레오티드 서열 간 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 갭 가중치 40, 및 길이 가중치 1을 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지(또한 인터넷 gcg.com에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정된다.
일반적으로 본원에서 언급되는 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 공개적으로 이용 가능한 BLAST 2.0 프로그램을 이용하여 결정된다. 서열 비교는 갭을 포함하지 않는 정렬을 이용하고 기준 파라미터(Blossum 62 매트릭스, 갭 존재 코스트 11, 잔기 당 갭 코스트 1, 및 람다 비 0.85)를 이용하여 수행된다. BLAST 프로그램에서 이용되는 수학적 알고리즘은 [Altschul 등, Nucleic Acids Research 25:3389-3402, 1997]에 기재되어 있다.
본원에서 주지되는 바와 같이, 가용성 MANF의 포유류 형태는 고도의 서열 동일성을 갖는다. 당분야 숙련자는 일반적으로 말해서 생물학적 활성(예로, 대상체에서 췌장 β-세포 장애를 치료 또는 발병 지연시키거나, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스를 감소시키거나, 또는 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사를 감소시키거나 지연시키는 능력)을 갖는 가용성 MANF의 변이체를 수득하기 위해, 가용성 MANF의 다양한 포유류종 간에 보존되지 않은 잔기가 변경되거나 제거될 수 있는 반면 고도로 보존된 잔기는 변형되거나 제거되어서는 안 된다는 것을 인지할 것이다. 당분야에 공지된 바와 같이, 당분야 숙련자는 본원에 제공되는 포유류 가용성 MANF 단백질에 대한 다양한 서열을 정렬하여 고도로 보존된 잔기 및 보존되지 않은 잔기를 확인할 수 있다.
다양한 형태의 가용성 MANF의 생물학적 활성은 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 다양한 생물학적 활성 분석을 수행하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF 단백질의 생물학적 활성은 배양된 췌장 β-세포를 가용성 MANF(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질)의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 췌장 β-세포를 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 감작하여 평가될 수 있다. 생물학적 활성을 갖는 가용성 MANF는 가용성 MANF와 접촉되지 않고 제제로 처리된 세포 대비 가용성 MANF 및 제제와 접촉된 세포에서 관찰되는 소포체 스트레스 또는 소포체 스트레스-유도 아폽토시스의 양을 감소시킬 것이다. 예를 들어, 생물학적 활성을 갖는 가용성 MANF는 가용성 MANF와 접촉되지 않고 제제로 처리된 세포 대비 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 처리된 세포에서 소포체 스트레스의 하나 이상의 마커를 감소시킬 수 있다(예로, 글루코오스-조절 단백질-78(grp78 또는 BiP로도 알려져 있음) 또는 bcl-2-연관 아타노겐(athanogene)-1(bag-1) 발현의 유도를 감소시키고; 활성화 전사 인자 6(ATF6)의 활성화, 골지 (Golgi) 전위, 프로테아제 절단 또는 핵 전위를 감소시키고; 단백질 키나아제 RNA 유사 소포체 키나아제(PERK) 활성화, 올리고머화 또는 자가인산화를 감소시키고; IRE1의 활성화를 감소시키고; eIF2α의 인산화를 감소시키고; XBP1 mRNA의 인트론 처리를 감소시키고; JNK 신호전달 경로의 활성화를 감소시키고; 프로카스파아제 4의 활성화 및 절단을 예방하고; 소포체 산화환원 환경의 변화(예로, 실시예에 기재된 산화환원 감수성 eroGFP 단백질을 이용하여 측정됨)를 예방 또는 감소시킨다).
대상체에 투여되는 가용성 MANF는 또한 하나 이상의(예로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의) 삽입, 부가, 결실, 또는 개질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 가용성 MANF는 (예로, 보관 중에) 대상체에서 가용성 MANF의 반감기를 유의미하게 증가시키거나 가용성 MANF의 열 안정성을 증가시키는 화학적 부분(예로, 단백질(예로, 알부민), 당(예로, N-연결 글리칸 또는 O-연결 글리칸, 예로 만노오스)(예로, Sola 등, J. Pharm. Set 98: 1123-1245, 2009 참고), 또는 중합체(예로, 폴리에틸렌 글리콜))에 공유 부착될 수 있다. 이들 방법에서 사용되는 가용성 MANF 단백질에는 또한 HIV tat 단백질 또는 가용성 MANF 단백질의 세포 투과성을 증가시키는 임의의 다른 부분이 포함될 수 있다.
분자 생물학 및 세포 배양 기법을 이용한 재조합 단백질(예로, 재조합 가용성 MANF)의 생성을 위한 몇몇 방법이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, mRNA 서열(서열 목록 번호 3에 적어도 80% 동일한(예로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유하는 mRNA 서열)에 의해 인코딩되는 가용성 MANF가 형질감염된 세포에 의한 가용성 MANF의 발현을 허용하는 박테리아, 효모 또는 포유류 세포에 형질감염될 수 있다(단백질 발현 플라스미드 또는 바이러스 벡터 이용). 형질감염된 세포 또는 배양 배지가 수집될 수 있고, 재조합 가용성 MANF 단백질이 당분야에 공지된 방법을 이용하여 정제된다. 다른 포유류 가용성 MANF 단백질을 인코딩하는 여러 추가적인 핵산(mRNA)이 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 진단 방법 또는 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체의 임의의 예측 방법을 이용하여 치료를 위해 먼저 확인되거나 선택된다.
대상체에는 적어도 하나의(예로, 적어도 2, 3, 4, 또는 5개) 용량의 가용성 MANF(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질) 및/또는 아포모르핀이 투여될 수 있다. 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀은 1일 적어도 1회(예로 1일 2회, 1일 3회 및 1일 4회), 매주 적어도 1회(예로 1주 2회, 1주 3회, 1주 4회), 및/또는 매월 적어도 1회 대상체에 투여될 수 있다. 대상체는 연장된 시기(예로, 적어도 1개월, 2개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년) 동안 치료될 수 있다(예로, 가용성 MANF가 주기적으로 투여될 수 있다). 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 대상체에 투여될 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀의 투여량은 의사에 의해 대상체의 성별, 대상체의 체중, 대상체의 연령, 및 다른 의학적 상태의 존재를 비제한적으로 포함하는 여러 생리학적 요인을 고려하여 결정될 수 있다. 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀은 대상체에 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 두개내 또는 뇌척수액 내로의 주사를 통해 투여될 수 있다. 마찬가지로, 제제는 고체로서(예로 경구 투여를 위해) 또는 생리학적으로 허용 가능한 액체 담체(예로, 식염수)로(예로, 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 또는 뇌척수 투여를 위해) 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에는 적어도 하나의(예로, 2, 3, 4 또는 5개의) 췌장 β-세포 장애의 다른 치료제(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애를 위한 임의의 치료제, 예로 본원에 기재된 임의의 인슐린)가 추가로 투여된다. 일부 구현예에서, 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀은 췌장 β-세포 장애의 적어도 하나의(예로, 2, 3, 또는 4개의) 다른 치료제와 함께 제형화된다(예로, 전신 투여를 위해 생리학적으로 허용 가능한 완충액 또는 배지 중에 제형화된다)(예로, 본원에 기재된 임의의 약학 조성물).
췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소 방법
또한, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소 방법이 제공된다. 이들 방법에는 췌장 β-세포와 유효량의 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질, 예로 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 재조합, 정제된, 또는 단리된 가용성 MANF 단백질), 아포모르핀, 및 피오글리타존의 접촉이 포함된다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 시험관 내에 있다(조직 배양). 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 대상체에 있을 수 있다. 이들 실험에서 사용되는 췌장 β-세포는 본원에 기재된 임의의 췌장 β-세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존과 연장된 시기 동안(예로, 적어도 15분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 또는 24시간) 접촉될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 몇몇 용량의 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존과(예로, 적어도 2개 용량, 3개 용량, 4개 용량 또는 5개 용량과), 예로 일정 시간 간격으로(예로, 대략 1일 1회, 1주 1회 또는 1개월 1회) 접촉된다.
소포체 스트레스의 감소는 세포에서 소포체 스트레스의 검출을 위해 당분야에 공지된 임의의 방법(예로 본원에 기재된 소포체 스트레스의 임의의 마커의 검출 또는 평가)을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 소포체 스트레스의 감소는 세포에서 소포체 스트레스의 하나 이상의 마커의 감소에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 소포체 스트레스의 감소는 하기 이벤트 중 하나 이상에 의해 관찰될 수 있다: grp78(BiP) 또는 bag-1 발현의 유도 감소; ATF6의 활성화, 골지 전위, 프로테아제 절단 또는 핵 전위 감소; PERK 활성화, 올리고머화 또는 자가인산화 감소; IRE1의 활성화 감소; eIF2α의 인산화 감소; XBP1 mRNA의 인트론 처리 감소; JNK 신호전달 경로의 활성화 감소; 프로카스파아제 4의 활성화 및 절단 감소; 및 ER-스트레스 유도제에 대한 노출로 유도되는(ER-스트레스 유도제에 노출되었지만 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존으로 처리되지 않은 대조군 췌장 β-세포 대비) 소포체 산화환원 환경의 변화 감소. 소포체의 산화환원 환경의 변화 감소는 산화환원-감수성 염료 또는 단백질, 예로 실시예에 기재된 리포터 단백질을 이용하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소는 각각 하나 이상의 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존과 접촉되지 않은(예로, 시험관 내 또는 대상체에서) 췌장 β-세포에서 관찰되거나 검출되는 소포체 스트레스의 양과 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소는 가용성 MANF 단백질, 아포모르핀, 또는 피오글리타존과 접촉되지 않았지만 소포체 스트레스를 유도하는 제제(예로, 탑시가긴)와 접촉된 대조군 췌장 β-세포에 대비한 것이다.
이들 방법은 헬쓰 케어 전문가(예로, 본원에 기재된 임의의 헬쓰 케어 전문가) 또는 과학자에 의해 수행될 수 있다.
소포체 스트레스-유도 아폽토시스의 감소 또는 지연 방법
소포체 스트레스를 갖는 췌장 β-세포는 세포 내에서 아폽토시스성 경로를 활성화할 수 있다. 또한, 본원에서는 췌장 β-세포 모집단과 유효량의 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질), 아포모르핀, 및 피오글리타존의 접촉이 포함되는 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스의 감소 또는 지연 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 시험관 내에 있다(조직 배양). 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 대상체에(예로, 이식된 생체적합성 물질 또는 중합체 중에) 있을 수 있다. 이들 방법에서 사용되는 췌장 β-세포는 본원에 기재된 임의의 췌장 β-세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존과 연장된 시기 동안(예로, 적어도 15분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 또는 24시간) 동안 접촉될 수 있다. 일부 구현예에서, 췌장 β-세포는 몇몇 용량의 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 피오글리타존, 및 아포모르핀(예로, 적어도 2개 용량, 3개 용량, 4개 용량, 또는 5개 용량)과, 예로 일정 시간 간격으로 접촉된다.
췌장 β-세포 모집단에서 아폽토시스의 개시 및 타이밍은 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 췌장 β-세포 모집단과 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존의 접촉은 아폽토시스(예로, 소포체 스트레스-유도 아폽토시스)를 겪는 모집단 내에서의 췌장 β-세포의 백분율 감소를 매개하거나 췌장 β-세포 모집단에서 아폽토시스의 개시를 지연시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존으로 처리된 세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스의 감소 또는 지연은 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존으로 처리되지 않은 췌장 β-세포 모집단과 비교될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존으로 처리된 세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스의 감소 또는 지연은 하나 이상의(예로, 2 또는 3개의) 가용성 MANF, 아포모르핀, 및 피오글리타존으로 처리되지 않았지만 소포체 스트레스를 유도하는 제제(예로, 탑시가긴)와 접촉된 대조군 췌장 β-세포 모집단과 비교될 수 있다.
아폽토시스성 세포사의 검출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로, 세포성 카스파아제(예로, 프로카스파아제-3 및 프로카스파아제-4)의 절단, Hoescht 및 7-아미노-액티노마이신 흡수, TdT-매개 dUTP 닉 말단 표지 분석 및 아넥신 막 염색이 포함된다. 아폽토시스성 세포사를 검출하기 위한 다양한 키트가 시판된다
약학 조성물
또한 본원에서는 적어도 하나의 가용성 MANF(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질, 예로 정제된, 단리된, 또는 재조합 가용성 MANF) 및/또는 아포모르핀, 및 췌장 β-세포 장애의 적어도 하나의 다른 치료제(예로, 본원에 기재된 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 임의의 치료제, 예로 피오글리타존, TUDCA, 및 본원에 기재된 임의의 인슐린)를 함유하는 약학 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된다. 약학 조성물 및 제형물은 비경구, 경구 또는 국소 투여에 의해, 예컨대 에어로졸 또는 경피로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 임의의 방식으로 제형화될 수 있고, 상태 또는 질환 및 질병 정도, 각 환자의 일반적 의학 상태, 결과적으로 바람직한 투여 방법 등에 근거하여 다양한 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 약학제의 제형화 및 투여를 위한 기법의 상세내용은 과학 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있고, 예로 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005]를 참고하라.
본원에서 제공되는 약학 조성물은 인간 또는 수의학 의약에 사용하기 위해 임의의 편리한 방식으로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 수화제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 스테아르산 마그네슘뿐만 아니라 착색제, 박리제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형에는 피내, 흡입, 경구/비강, 국소, 및/또는 비경구 투여를 위해 적합한 것들이 포함된다. 제형물은 단위 투여형으로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여형을 제조할 수 있는 활성 성분(예로, 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀, 및 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 추가적인 치료제)의 양은 치료받는 숙주, 구체적 투여 방식, 예로 피내 또는 흡입에 근거하여 변할 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여형을 제조할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과(예로 본원에 기재된 하나 이상의 임의의 치료 효과)를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
본 발명의 약학 제형물은 약학제의 제조를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 약물은 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제를 함유할 수 있다. 제형물은 제조에 적합한 무독성의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 제형물은 하나 이상의 희석제, 유화제, 보존제, 완충제, 부형제 등을 포함할 수 있고, 액체, 분말, 에멀션, 동결건조 분말, 스프레이, 크림, 로션, 조절 방출 제형물, 정제, 알약, 겔, 패치 상, 이식물 중 등의 형태로 제공될 수 있다.
경구 투여를 위한 약학 제형물은 적절하고 적합한 투여량으로 당분야에 널리 공지된 약학적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 약학제가 환자에 의한 섭취에 적합한 정제, 알약, 분말, 당의정, 캡슐, 액체, 로젠지, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같은 단위 투여형으로 제형화될 수 있게 한다. 경구 용도를 위한 약학 제조물은 고체 부형제로 제형화되고 선택적으로 생성 혼합물을 분쇄하고 과립 혼합물을 가공하고, 적합한 추가 화합물을 첨가한 뒤 필요하다면 정제 또는 당의 코어를 수득할 수 있다. 적합한 고체 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제이며, 예로 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물의 전분; 셀룰로오스, 예컨대 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 또는 나트륨 카르복시-메틸셀룰로오스; 및 아라비아 및 트래거캔스를 포함하는 고무; 및 단백질, 예로 젤라틴 및 콜라겐이 포함된다. 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 이들의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다. 푸시-핏 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토오스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산 마그네슘, 그리고 선택적으로 안정화제와 함께 혼합된 활성 제제를 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 제제는 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 안정화제를 포함하거나 포함하지 않고 용해되거나 현탁화될 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조, 예로 수성 피내 주사에 적합한 부형제와의 혼합물로 활성 제제(예로, 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀, 및 췌장 β-장애의 하나 이상의 추가 치료)를 함유할 수 있다. 이러한 부형제에는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 고무 트래거캔스, 및 고무 아카시아, 그리고 분산제 또는 수화제, 예컨대 천연 생성 포스파티드(예로, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 산물(예로, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 산물(예로, 헵타데카에틸렌 옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르의 축합 산물(예로, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노-올레에이트) 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르의 축합 산물(예로, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트)이 포함된다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로오스, 아스파르탐 또는 사카린을 함유할 수 있다. 제형물은 삼투압에 대해 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 오일계 약학제가 투여를 위해 사용된다. 오일계 현탁액은 활성 제제를 식물성 오일, 예컨대 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일 중에 또는 광물성 오일, 예컨대 액체 파라핀 중에; 또는 이들의 혼합물 중 현탁하여 제형화될 수 있다. 예로, 경구 투여된 소수성 약학 화합물의 개인간 및 개인내 변동성을 감소시키고 생체이용률을 증가시키기 위한 에센셜 오일 또는 에센셜 오일 성분을 기재하는 U.S. 특허 번호 5,716,928을 참고하라(또한 U.S. 특허 번호 5,858,401 참고). 오일 현탁액은 증점제, 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 맛 좋은 경구 제조물을 제공하기 위해 감미제, 예컨대 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로오스가 첨가될 수 있다. 이들 제형물은 항산화제, 예컨대 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다. 주사 가능한 오일 전달체의 예로서, [Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, 1997]을 참고하라.
약학 제형은 또한 수중유 에멀션의 형태일 수 있다. 오일상은 상술된 바와 같은 식물성 오일 또는 광물성 오일이거나 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제에는 천연 생성 고무, 예컨대 고무 아카시아 및 고무 트래거캔스, 천연 생성 포스파티드, 예컨대 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레에이트, 및 이들 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트가 포함된다. 에멀션은 또한 시럽 및 엘릭서 제형에서와 같이 감미제 및 풍미제를 함유할 수 있다. 이러한 제형물은 또한 진통제, 보존제 또는 착색제를 함유할 수 있다. 대안적 구현예에서, 본 발명의 이러한 주사 가능한 수중유 에멀션은 파라핀 오일, 소르비탄 모노올레에이트, 에톡실화 소르비탄 모노올레에이트 및/또는 에톡실화 소르비탄 트리올레에이트를 포함한다.
약학 화합물은 또한 통기, 분말 및 에어로졸 제형을 포함하는 비강내 또는 안내 경로에 의해 투여될 수 있다(예를 들어 스테로이드 흡입제, 예로 [Rohatagi, J. Clin. Pharmacol. 35: 1187-1193, 1995; Tjwa, Ann. Allergy Asthma Immunol. 75: 107-111, 1995] 참고).
일부 구현예에서, 약학 화합물은 어플리케이터 스틱, 용액, 현탁액, 에멀션, 겔, 크림, 연고, 페이스트, 젤리, 페인트, 분말 및 에어로졸로 제형화되어 국소 경로에 의해 경피 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 화합물은 또한 체내에서 느린 방출을 위한 마이크로스피어로 전달될 수 있다. 예를 들어, 마이크로스피어는 피하로 느리게 방출되는 약물의 피내 주사에 의해 투여될 수 있다; [Rao, J. Biomater Set Polym. Ed. 7:623-645, 1995]를 참고하라; 생분해성 및 주사 가능한 겔 제형으로는, 예로 [Gao, Pharm. Res. 12:857-863, 1995]를 참고하라; 또는 경구 투여를 위한 마이크로스피어로는, 예로 [Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997]을 참고하라.
일부 구현예에서, 약학 화합물은 예컨대 정맥내(IV), 근육내, 복강내, 또는 피하 투여, 또는 대상체의 체강, 기관의 관강 또는 뇌척수액 내로의 투여에 의해 비경구 투여될 수 있다. 이들 제형물은 약학적으로 허용 가능한 담체에 용해된 활성 제제의 용액을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 전달체 및 용매는 물 및 링거 용액, 또는 등장성 염화 나트륨이다. 또한 멸균 고정 오일이 용매 또는 현탁화 매질로 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하는 임의의 배합 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 주사제의 제조에서 마찬가지로 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되어 있으며, 일반적으로 바람직하지 못한 물질이 없다. 이들 제형은 통상적인 널리 공지된 멸균 기법에 의해 멸균화될 수 있다. 제형물은 생리학적 조건의 근사에 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 독성 조절제, 예로 아세트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 젖산 나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형에서 활성 제제의 농도는 크게 변할 수 있고, 선택된 구체적 투여 방식 및 환자의 필요성에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 주로 근거하여 선택될 것이다. IV 투여를 위해, 제형물은 멸균 주사 가능한 제조물, 예컨대 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 수화제 및 현탁화제를 이용하여 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제조물은 또한 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 1,3-부탄디올 용액 중 현탁액일 수 있다. 투여는 볼루스에 의하거나 연속(예로 특정 시기 동안 혈관 내로 실질적으로 중단되지 않고 도입)될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 화합물 및 제형물은 동결건조될 수 있다. 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀, 및 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 안정한 동결건조 제형물은 가용성 MANF 및/또는 아포모르핀, 및 하나 이상의 추가 치료제 및 벌크화제, 예로 만니톨, 트레할로오스, 라피노오스 및 수크로오스, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액의 동결건조에 의해 제조될 수 있다. 안정한 동결건조 제형물의 제조 방법에는 약 2.5mg/mL의 단백질, 약 15mg/mL의 수크로오스, 약 19mg/mL의 NaCl, 및 pH 5.5 초과 6.5 미만인 시트르산 나트륨 완충액의 용액의 동결건조가 포함될 수 있다. 예로, US2004/0028670을 참고하라.
조성물 및 제형물은 리포좀의 사용에 의해 전달될 수 있다. 리포좀을 사용함으로써, 특히 리포좀 표면이 표적 세포에 대해 특이적인 리간드를 수반하거나 다른 방식으로 특정 기관에 대해 우선적으로 지정되는 경우, 생체 내에서 표적 세포 내로의 활성 제제 전달에 초점을 맞출 수 있다. 예로, [U.S. 특허 번호 6,063,400 및 6,007,839; Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; 및 Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587, 1989]를 참고하라.
본 발명의 제형물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 용도를 위해, 조성물은 본원에 기재된 장애의 위험이 있거나 장애가 있는 대상체에 장애 또는 그 합병증의 임상적 발현을 치유, 완화 또는 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여된다; 이를 치료적 유효량으로 부를 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 증상의 수를 감소시키거나 하나 이상의 증상의 중증도, 기간, 또는 빈도를 감소시키기 충분한 양으로 투여된다.
이를 달성하기 위해 적절한 약학 조성물의 양이 치료적 유효 용량이다. 상기 용도를 위해 효과적인 투여 일정 및 양, 즉 투여 방식은 질환 또는 상태의 단계, 질환 또는 상태의 중증도, 환자 건강의 일반 상태, 환자의 신체 상태, 연령 등을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다. 환자를 위한 투여 요법의 계산에서는 투여 방식도 고려된다.
투여 요법은 또한 당분야에 널리 공지된 약동학 파라미터, 즉 활성 제제의 흡수 속도, 생체이용률, 대사, 제거 등을 고려한다(예로, Hidalgo-Aragones, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617, 1996; Groning, Pharmazie 51:337-341, 1996; Fotherby, Contraception 54:59-69, 1996; Johnson, J. Pharm. Sci. 84: 1144-1146, 1995; Rohatagi, Pharmazie 50:610-613, 1995; Brophy, Eur. J. Clin. Pharmacol. 24: 103-108, 1983; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005를 참고하라). 당분야의 수준은 의사가 각각의 개별 환자, 활성 제제, 및 치료받는 질환 또는 상태에 대한 투여 요법을 결정할 수 있도록 한다. 약학제로서 사용되는 유사 조성물에 대한 지침이 투여 방식, 즉 용량 일정 및 투여량 수준, 본 발명의 방법의 투여 수행이 정확하고 적절한지를 결정하기 위한 지침으로 이용될 수 있다.
제형물의 단회 또는 다회 투여가, 예를 들어 환자에게 필요하고 관용되는 투여량 및 빈도 등에 따라 주어질 수 있다. 제형물은 상태, 질환 또는 증상을 효과적으로 치료, 예방 또는 완화하기 충분한 양의 활성 제제를 제공해야 한다.
대안적 구현예에서, 경구 투여를 위한 약학 제형물은 약 1 내지 100 이상의 mg/체중kg/1일의 1일 양이다. 경구 투여와는 대조적으로, 혈류 내, 체강내 또는 기관의 관강 내로는 더 낮은 투여량이 이용될 수 있다. 실질적으로 더 높은 투여량이 국소 또는 경구 투여에서 또는 분말, 스프레이 또는 흡입에 의한 투여에 이용될 수 있다. 비경구적으로 또는 경구적으로 투여 가능한 제형물의 실제 제조 방법은 당분야 숙련자에게 공지되어 있거나 자명할 것이며, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed., 2005]와 같은 문헌에서 보다 상세히 기재된다.
키트
또한 가용성 MANF 단백질(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질)에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 항체 단편(예로, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, 또는 sdAb) 및 췌장 β-세포 장애의 다른 하나의 마커(예로, 인슐린, C-단백질, 및 IAPP)에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의(예로, 2, 3, 또는 4개의) 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 함유하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 키트에 포함된 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 기재 상에 편재된다(예로, 효소 연관 면역흡착 분석). 일부 구현예에서, 키트는 단리된, 정제된, 또는 재조합 가용성 MANF 단백질(예로, 본원에 기재된 임의의 가용성 MANF 단백질)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 항체 단편이 표지된다(예로, 방사선동위원소, 형광단, 또는 결합 단백질(예로, 애비딘)). 이들 키트는, 예로 췌장 β-세포 장애의 진단, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 있는 대상체의 확인 또는 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질의 모니터링에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침을 추가로 함유할 수 있다.
리포터 단백질
본원에서 제공되는 방법은 결합 단백질(BiP) 시그널 서열(예로, 마우스 또는 인간 BiP 시그널 서열), 산화환원-감수성 형광 단백질(예로, 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질 및 산화환원-감수성 황색 형광 단백질), 및 아미노산 서열 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)을 함유하는 리포터 단백질을 이용한다. 일부 구현예에서, BiP 시그널 서열은 N-말단에 있고, 산화환원-감수성 형광 단백질은 BiP 시그널 서열의 C-말단에 있고, 아미노산 서열 KDEL은 산화환원-감수성 형광 단백질의 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 리포터 단백질에 존재하는 둘 이상의 개별 단백질 요소(예로, BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질, 및 KDEL 서열) 간에는 1 내지 100 아미노산(예로, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 및 1 내지 10 아미노산)이 있다. 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질의 아미노산 서열이 아래에 기재된다.
산화환원 감수성 녹색 형광 단백질(서열 목록 번호 10)
Figure pct00011
본원에 기재된 리포터 단백질은 서열 목록 번호 10에 적어도 80%(예로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 동일한 서열을 함유할 수 있다(생성 단백질이 그 산화환원-감수성 형광 특성을 유지하는 한). 예를 들어, 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질 또는 산화환원-감수성 황색 형광 단백질 내로 도입되는 돌연변이는 시스테인에 돌연변이를 포함해서는 안 된다. 일부 구현예에서, 산화환원-감수성 형광 단백질은 산화환원-감수성 황색 형광 단백질이다(예로, rxYFP; [Ostergaard 등, EMBO J. 20:5853-5862, 2001]에 기재됨). 산화환원-감수성 형광 단백질의 추가적인 예는 [Merksamer 등(Cell 135:933-947, 2008) 및 Dooley 등(J. Biol. Chem. 279:22284-22293, 2004)]에 기재된다.
리포터 단백질에 존재할 수 있는 예시적인 인간 및 마우스 BiP 시그널 서열을 아래에 나타낸다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 리포터 단백질은 임의의 포유류 BiP 시그널 서열(예로, 인간 또는 마우스 BiP 시그널 서열)을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 단백질 및 이들 리포터 단백질을 인코딩하는 핵산은 온전한 췌장 β-세포 내에서 산화환원 환경의 미묘한 변동의 민감한(예로 크게 개선된) 검출 수단을 제공한다.
인간 BiP 시그널 서열(서열 목록 번호 12)
Figure pct00012
마우스 BiP 시그널 서열(서열 목록 번호 13)
Figure pct00013
일부 구현예에서, 리포터 단백질은 서열 목록 번호 14의 서열(아래에 나타냄)을 함유하는 리포터 단백질에 적어도 80% 동일한(예로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 리포터 단백질은 서열 목록 번호 15에 적어도 80% 동일한(예로, 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 서열을 함유하는 핵산에 의해 인코딩된다. 예를 들어, 서열 목록 번호 14의 리포터 단백질의 돌연변이는 시스테인에 돌연변이를 포함해서는 안 된다. 서열 목록 번호 14의 상이한 돌연변이체는 이 돌연변이체가 이들의 산화환원 의존적 형광 특성을 유지하는지를 결정하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 서열 목록 번호 14(MEROS-GFP)에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 단백질의 구체적인 산화환원 의존적 형광 특성은 실시예에 상세히 기재된다.
MEROS-GFP 단백질(서열 목록 번호 14)
Figure pct00014
Figure pct00015
MEROS-GFP mRNA(서열 목록 번호 15)
Figure pct00016
후보 제제의 스크리닝 방법
또한, 하기 중 하나 이상에 유용한 후보 화합물의 스크리닝 방법이 제공된다: 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스 감소, 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연. 이들 방법에는 췌장 β-세포의 제공, 췌장 β-세포와 후보 화합물의 접촉, 및 후보 화합물의 존재 하에 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준 결정, 및 췌장 β-세포에서 생성된 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준의 비교가 포함된다. 이들 방법에서, 기준 수준 대비 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 상승된 수준은 평가 화합물이 하기 중 하나 이상에 유용할 수 있음을 시사한다: 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소, 및 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연.
이들 방법에서 사용되는 췌장 β-세포(들)은 본원에 기재된 임의의 췌장 β-세포(예로, 췌장 β-세포주(예로, 본원에 기재된 임의의 췌장 β-세포주) 또는 일차 췌장 β-세포)일 수 있다.
가용성 MANF의 수준은 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 결정될 수 있다(예로, 본원에 기재된 임의의 항체 기반 방법). 방법은 임의의 헬쓰 케어 전문가(예로, 의사, 간호사, 의사 보조원, 실험 기술자, 또는 간호사 보조원) 또는 과학자에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 기준 수준은 후보 화합물의 부재 하에 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 수준이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 췌장 β-세포 장애를 갖지 않거나, 췌장 β-세포 장애의 증상, 또는 췌장 β-세포 장애의 가족력을 갖지 않는 대상체에 존재하는 가용성 MANF의 수준이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 포유류의 일차 췌장 β-세포 또는 포유류 췌장 β-세포주에서 생성되는 가용성 MANF의 수준이다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 가용성 MANF의 역치 수준이다.
또한, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝 방법이 제공된다. 이들 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질, 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 포유류 췌장 β-세포 또는 췌장 β-세포주)의 제공; 세포와 평가 화합물의 접촉; 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양 결정; 및 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양과 기준 수준의 비교가 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 산화된 리포터 단백질의 상승된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용할 수 있음을 시사한다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양이다. 일부 구현예에서, 세포는 후보 제제 및 ER 스트레스를 유도하는 제제 둘 다와 접촉되며, 기준 수준은 ER 스트레스를 유도하는 제제만으로 처리된 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 수준이다. ER 스트레스를 유도하는 제제의 비제한적 예가 본원에 기재된다. ER 스트레스를 유도하는 제제의 추가적인 예는 당분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 산화된 리포터 단백질의 역치 수준이다. 사용되는 세포는 인간, 마우스, 래트, 돼지, 원숭이, 또는 소 세포일 수 있다. 세포는 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 췌장 β-세포주일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 단백질은 서열 목록 번호 14, 또는 서열 목록 번호 14에 적어도 80%(예로, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한)인 서열을 함유하는 단백질이다.
또한, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝 방법이 제공된다. 방법에는 BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질, 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포(예로, 포유류 췌장 β-세포)의 제공; 세포와 평가 화합물의 접촉; 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양 결정; 및 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양과 기준 수준의 비교가 포함되며; 여기서 기준 수준 대비 세포에서 환원된 리포터 단백질의 증가된 수준은 후보 화합물이 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연, 췌장 β-세포의 소포체 스트레스 감소, 및/또는 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연에 유용할 수 있음을 시사한다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양이다. 일부 구현예에서, 세포는 후보 제제 및 ER 스트레스를 유도하는 제제 둘 다와 접촉되며, 기준 수준은 ER 스트레스를 유도하는 제제만으로 처리된 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 수준이다. ER 스트레스를 유도하는 제제의 비제한적 예가 본원에 기재된다. ER 스트레스를 유도하는 제제의 추가적인 예는 당분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 환원된 리포터 단백질의 역치 수준이다. 사용되는 세포는 인간, 마우스, 래트, 돼지, 원숭이, 또는 소 세포일 수 있다. 세포는 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 췌장 β-세포주일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 단백질은 서열 목록 번호 14, 또는 서열 목록 번호 14에 적어도 80%(예로, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한)인 서열을 함유하는 단백질이다.
일부 구현예에서, 결정은 세포에서 리포터 단백질의 하나 이상의 형광 특성의 검출(예로, 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태에 독특한 스펙트럼 특성의 검출)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태의 수준은 형광 플레이트 리더를 이용하여 또는 형광 보조 세포 정렬(FACS)을 이용하여 결정된다.
예를 들어, 리포터 단백질을 발현하는 췌장 β-세포(예로, INS-1 832/13)를 6-웰 플레이트에 접종하고, 후보 화합물과 접촉시킨 후 트립신 처리에 의해 수확할 수 있다. 인산염 완충 식염수로 세척 후, 세포를 적합한 배지(예로, 11mM 글루코오스-행크 완충 염 용액) 중에 현탁하고, LSRII(BD)로 FACS를 수행하여 세포에 존재하는 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태의 수준을 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 형광 플레이트 리더를 이용하여 세포에 존재하는 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태의 수준을 결정할 수 있다. 예를 들어, 췌장 β-세포주(예로, INS-1 832/13 세포)를 96-웰 플레이트에 접종하고 후보 제제로 처리할 수 있다. 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태의 수준은 형광 플레이트 리더를 이용하여 검출할 수 있다. 이러한 구현예에서, 배경 시그널의 감산은 리포터 단백질의 환원된 또는 산화된 형태의 수준 결정 전에 수행해야 한다.
일부 구현예에서, 리포터 단백질은 서열 목록 번호 14 또는 서열 목록 번호 14에 적어도 80% 동일한 서열을 함유하는 단백질을 함유한다. 이들 구현예에서, 리포터 단백질의 환원된 형태는 여기 파장 473nm 및 방출 파장 510nm를 가지며, 리포터 단백질의 산화된 형태는 여기 파장 394nm 및 방출 파장 510nm를 갖는다.
이들 방법의 일부 구현예에서, 세포에서 리포터 단백질의 환원된 형태의 수준 대 리포터 단백질의 산화된 형태의 수준의 비가 결정될 수 있다. 이들 방법에서, 계산된 비는 기준 비와 비교될 수 있다. 기준 비는 후보 제제로 처리되지 않은 세포로부터의 비일 수 있다. 기준 비는 또한 역치 비일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 후보 제제 및 ER 스트레스를 유도하는 제제와 접촉되며, 세포에서 리포터 단백질의 환원된 형태의 수준 대 리포터 단백질의 산화된 형태의 수준의 비가 결정되고, 세포에서의 비는 ER 스트레스를 유도하는 제제만으로 처리된 세포로부터의 기준 비와 비교된다. 이들 방법에서, 기준 비 대비 세포에서의 비를 감소시키는 후보 제제가 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 후보 제제로 확인된다.
상기 방법의 일부 구현예에는 췌장 β-세포 장애의 동물 모델에서 후보 화합물의 평가(예로, 후보 화합물의 투여가 동물 모델에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나(예로, 중증도, 빈도, 또는 기간을 감소시키거나) 동물 모델에서 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 지연시키는지를 결정)가 추가로 포함된다. 2형 당뇨병의 비제한적 동물 모델에는 Zucker 지방 래트(ZFR), ob/ob(비만) 마우스, cp(뚱뚱한) 래트, Zucker 당뇨병 지방(ZDF) 래트, 샌드(sand) 래트(Psammomys obesus), 비만 붉은털 원숭이, KK 마우스, 및 KK-Ay 마우스(Srinivasan 등, Indian J. Med. Res. 125:451-472, 2007에 기재됨)가 포함된다. 1형 당뇨병의 비제한적인 동물 모델에는 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스 및 BB(bio breeding) 래트(Rees 등, Diabetic Med. 22:359-370, 2005에 기재됨)가 포함된다. 췌장 β-세포 장애의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 개시는 본원에 기재된 방법 또는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 이들 동물에서 결정되거나 관찰될 수 있다.
상기 방법의 일부 구현예에는 후보 화합물이 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사를 감소 또는 지연시킬 것인지의 평가(예로, 후보 제제의 부재 하에 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 처리된 췌장 β-세포 모집단 대비 후보 제제 및 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 처리된 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스 세포사의 감소 또는 지연)가 추가로 포함된다. 아폽토시스성 세포사의 검출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 세포성 카스파아제(예로, 프로카스파아제-3 및 프로카스파아제-4)의 절단, Hoescht 및 7-아미노-액티노마이신 흡수, TdT-매개 dUTP 닉 말단 표지 분석 및 아넥신 막 염색이 포함된다. 아폽토시스성 세포사를 검출하기 위한 다양한 키트가 시판된다.
상기 방법의 일부 구현예에는 후보 화합물이 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 다른 마커의 유도를 예방 또는 지연하는지에 대한 평가(예로 후보 화합물이 grp78(BiP) 또는 bag-1 발현의 유도를 감소시키는지; ATF6의 활성화, 골지 전위, 프로테아제 절단 또는 핵 전위를 감소시키는지; PERK 활성화, 올리고머화 또는 자가인산화를 감소시키는지; IRE1의 활성화를 감소시키는지; eIF2α의 인산화를 감소시키는지; XBP1 mRNA의 인트론 처리를 감소시키는지; JNK 신호전달 경로의 활성화를 감소시키는지; 프로카스파아제 4의 활성화 및 절단을 예방하는지; 및/또는 소포체 산화환원 환경의 변화를 예방 또는 감소시키는지(예로 본원에 기재된 임의의 리포터 단백질을 이용하여 측정됨))가 추가로 포함된다. BiP 및 Bag-1의 발현 수준은 BiP 또는 Bag-1의 일부에 혼성화하도록 설계된 프라이머 세트로 정량적 실시간 PCR을 이용하여 결정될 수 있다. BiP, Bag-1, PERK, IRE1, eIF2α, XBP1, 및 ATF6의 발현 수준 또는 처리, 활성화, 인산화 또는 세포 편재는 또한 당분야에 공지된 방법을 이용하여 하나의 BiP, Bag-1, PERK, IRE1, eIF2α, XBP1, 또는 ATF6에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 소포체 스트레스의 하나 이상의 마커의 예방 또는 지연은 후보 제제의 부재 하에 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 처리된 췌장 β-세포(들) 대비 후보 제제 및 소포체 스트레스를 유도하는 제제로 처리된 세포에 대한 것이다.
임의의 유형의 후보 화합물이 상기 방법에서 이용될 수 있다. 후보 화합물은, 예로 단백질, 펩티드, 핵산(예로, RNA 또는 DNA), 무기 화합물, 지질, 올리고당, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 방법에서 이용될 수 있는 후보 화합물의 라이브러리는 시판된다. 스크리닝될 후보 화합물은 하기를 포함하여, 당분야에 공지된 조합 라이브러리 방법의 임의의 여러 접근을 이용하여 수득될 수 있다: 생물학적 라이브러리; 공간 지정가능 병렬 고상 또는 용액상 라이브러리; 디컨볼루션(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; "1-비드-1-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화도 크로마토그래피 선택을 이용하는 합성 라이브러리 방법. 생물학적 라이브러리 접근은 펩티드 라이브러리에 제한되는 반면, 다른 4가지 접근은 펩티드, 비펩티드 올리고머, 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용 가능하다(Lam, Anticancer Drug Des., 12: 145, 1997).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 문헌, 예를 들어 [DeWitt 등, Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A., 90:6909, 1993; Erb 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 91:11422, 1994; Zuckermann 등, J. Med . Chem ., 37:2678, 1994; Cho 등, Science 261:1303, 1993; Carrell 등, Angew . Chem . Int . Ed . Engl, 33:2059, 1994; Carell 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:2061, 1994; 및 Gallop 등, J. Med. Chem., 37: 1233, 1994]에서 찾아볼 수 있다.
화합물 라이브러리는 용액 중(예로, Houghten, Bio/Techniques, 13:412-421, 1992), 또는 비드(Lam, Nature, 354:82-84, 1991), 칩(Fodor, Nature 364:555-556, 1993), 박테리아(U.S. 특허 번호 5,223,409), 포자(U.S. 특허 번호 5,571,698; 5,403,484; 및 5,223,409), 플라스미드(Cull 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 1865-1869, 1992) 또는 파지(Scott and Smith, Science, 249:386-390, 1990; Devlin, Science, 249:404-406, 1990; Cwirla 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:6378-6382, 1990; 및 Felici, J. Mol. Biol., 222:301-310, 1991) 상에 제공될 수 있다.
실시예
실시예 1. 가용성 MANF 발현이 ER 스트레스 동안 췌장 β-세포에서 증가됨
가용성 MANF의 발현이 소포체 스트레스에 반응하여 췌장 β-세포에서 유도되는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 이들 실험은 설치류 췌장 β-세포주(INS-1 832/13 및 MIN6), 일차 마우스 및 인간 섬, 및 소포체 스트레스를 유도하는 2개의 상이한 화학 제제(탑시가긴 및 투니카마이신)를 이용하여 수행되었다. INS-1 832/13 세포를 10% 태아 소 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 피루브산 나트륨, 및 0.1% β-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 중에 배양하였다. 일차 섬을 Prodo에서 수득하여, 804G 세포에서 생성된 라미닌 V로 사전 코팅된 6-웰 플레이트 내로 접종하고, 태아 소 혈청, 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 및 항생제가 보충된 CMRL 배지 중에 배양하였다.
가용성 MANF 단백질을 탑시가긴(50nM) 처리 후 배양된 래트 췌장 β-세포주(INS-1 832/13)의 배지 중에서 검출하였다(도 1). 5μΜ 투니카마이신 또는 20nM 탑시가긴으로 24시간 동안 처리 후 동일한 세포주에서 MANF mRNA의 상승된 수준이 검출되었다(도 2).
마우스 일차 섬을 이용하여 수행된 실험의 데이터는 또한 6시간 동안 0.5μΜ 탑시가긴을 이용한 마우스 섬의 처리가 MANF mRNA 발현의 유의미한 증가를 일으킴을 나타낸다(도 3). 두 번째 실험 세트는 2명의 인간 공여자로부터의 인간 일차 섬을 이용하여 수행하였다. 이들 데이터도 탑시가긴(0.25 μΜ)을 이용한 인간 섬의 처리가 MANF mRNA 발현의 유의미한 증가(도 4), 그리고 가용성 MANF 단백질의 세포외 배지 내로의 생성 및 방출을 일으킴을 나타낸다(도 5 및 6).
가용성 MANF가 췌장 β-세포를 소포체 스트레스로부터 보호하는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험 세트에서, MANF mRNA를 표적화하는 3개의 상이한 siRNA 구축물 중 하나를 이용하여 MANF 발현을 녹아웃시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000을 이용하여 형질감염을 수행하였다. 이들 실험의 데이터는 대조군 siRNA로 형질감염시키고 동일한 수준의 투니카마이신으로 처리한 대조군 세포 대비 세포를 24시간 동안 투니카마이신(2μΜ)으로 처리한 경우 MANF 발현의 녹다운으로 소포체 스트레스가 증가됨(BiP mRNA 수준의 증가로 시사됨)을 나타낸다(도 7). 이들 데이터는 가용성 MANF가 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 예방 또는 감소에 관여함을 시사한다.
가용성 MANF가 소포체 스트레스-유도 화학 제제로 처리된 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스를 감소 또는 지연시킬지를 결정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 이들 실험의 데이터는 가용성 MANF를 이용한 마우스 췌장 β-세포주(MIN6)의 처리가 투니카마이신(1μΜ, 24시간)을 이용한 처리 후 세포에서 관찰되는 카스파아제-3의 절단량을 크게 감소시켰음을 나타낸다(도 8). 이들 데이터는 가용성 MANF가 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사를 예방 또는 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 2. ER에서의 산화환원 상태의 모니터링을 위한 시스템
세포에서 ER의 산화환원 상태의 모니터링을 위한 신규 시스템이 개발되었다. 상기 시스템에서, 마우스 BiP의 시그널 서열 및 포유류 ER 복구 시그널(KDEL)을 산화환원-감수성 녹색 형광 단백질(GFP)의 N- 및 C-말단에 각각 첨부하였다(도 9A). 재조합 단백질을 MEROS-GFP(포유류 소포체-편재 산화환원-감수성 GFP)로 명명하였다. 형광 현미경을 이용하여 MEROS-GFP가 ER에 편재된 것을 확인하였다(도 9B). MEROS-GFP는 NSC34 세포의 완전 산화 및 환원 종에서 394nm 및 473nm에서 최대로 뚜렷한 여기 스펙트럼을 나타내었다(도 10A). NSC 34 세포를 10% 태아 소 혈청, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에 배양하였다.
2개의 특징적인 여기 파장 508nm 및 510nm에서의 방출 스펙트럼은 비등하였다(도 10B 및 10C). 공초점 현미경 분석으로 강력한 환원제인 디티오트레이톨(DTT)로 처리된 세포에서 476nm 여기에서의 형광이 크게 증가한 반면 405nm에서의 형광은 약간 감소한 것을 확인하였다(도 11).
야생형 미처리 세포에 대해 표준화된 여기 473nm 대 394nm의 형광 간의 비를 MEROS-GFP 비로 부른다. MEROS-GFP 비를 형광 플레이트 리더를 이용하여 결정하였다. 이들 실험에서, INS-1 832/13 세포를 96-웰 플레이트 상에 50,000세포/웰로 접종하고, 세포를 30분 동안 다양한 농도의 H2O2 또는 DTT로 처리하고, 여기 파장 473nm 및 방출 파장 510nm에서(환원된 MEROS-GFP에 대해) 또는 여기 파장 394nm 및 방출 파장 510nm에서(산화된 MEROS-GFP에 대해) 형광을 측정하였다. 배경 시그널의 감산 후 MEROS-GFP 비를 결정하였다. 데이터는 산화제 H2O2가 MEROS-GFP 비를 변화시키지 않았음을 나타낸다-MEROS-GFP가 생체 내에서 거의 100% 산화되어 있음을 시사함(도 12). 대조적으로, DTT 처리는 용량 의존적 방식으로 MEROS-GFP 비를 증가시켰다(도 12).
MEROS-GFP 비가 생체 내에서 그 산화환원 상태의 변화를 반영하는지를 확인하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, MEROS-GFP의 산화환원 상태를 티올-알킬화 시약인 4-아세트아미도-4'-말레이미딜스틸벤-2, 2'-디설폰산(AMS)과 함께 비환원성 SDS-PAGE를 이용하여 모니터링하였다. 이들 실험에서, 미처리 상태로 두거나 2mM DTT로 처리한 INS-1 832/13 세포를 2-β-메르캅토에탄올을 포함하거나 포함하지 않는 25mM AMS를 함유하는 1x SDS-PAGE 표본 완충액으로 용해시키고, 10분 동안 95℃에서 끓이고, SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하고, 항-GFP 항체를 이용하여 면역블로팅하였다. 예측되는 바와 같이, DTT-처리 세포 용해액의 비환원성 SDS-PAGE는 느리게 이동하는 한 형태의 MEROS-GFP만을 나타내어 DTT 처리가 생체 내에서 MEROS-GFP를 완전 환원시켰음을 시사한다(도 13).
MEROS-GFP 비를 또한 상이한 시점에 DTT-처리 세포에서 모니터링하였다. 도 14는 ER이 DTT 처리 수 분 내에 환원될 수 있으며, DTT 세척 제거 후 1분 내에 산화된 환경으로 되돌아감을 나타낸다. 이들 결과는 MEROS-GFP가 포유류 세포의 ER 내에서 산화환원 상태의 살아 있는 실시간 모니터링을 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
생체 내에서 MEROS-GFP 비를 정밀 모니터링하기 위해 유세포 측정을 이용하였다. 이들 데이터는 DTT를 이용한 췌장 β-세포주, INS-1 832/13의 처리가 488nm 대 405nm에서의 여기로부터의 형광 비에서 용량 의존적 증가를 일으켰음을 나타낸다(도 15 및 16). 상기 관찰을 추가 분석하기 위해, DTT-처리 세포에서 중앙값 MEROS-GFP 비를 검사하였다. 데이터는 DTT 처리가 용량 의존적 방식으로 중앙값 MEROS-GFP 비를 증가시켰음을 나타낸다(도 17). 그러나, H2O2 처리는 MEROS-GFP 비를 변화시키지 않아서(도 18), MEROS-GFP가 기저 수준에서 ER에서 거의 완전 산화되었음을 시사한다. 중앙값 MEROS-GFP 비는 또한 투니카마이신, 탑시가긴, 브레펠딘 A, MG 132(도 19 및 20), 만성 고글루코오스(도 21), 혈청 결핍, 글루코오스 결핍(도 22), 팔미테이트, 인간 섬 아밀로이드 폴리펩티드(hIAPP), 및 염증성 시토카인(도 23 및 24)을 포함하는, ER 스트레스의 실험적 및 생리적 유도제 모두에 의해 증가되었다.
실시예 3. ER 스트레스를 받은 세포에서의 ER 산화환원 상태의 이종성
팔미테이트(췌장 β 세포에 대한 강력한 ER 유도제)를 이용한 INS-1 832/13 세포의 처리 후 유세포 측정에 의해 2개의 특징적인 세포 모집단: 산화된 ER 상태를 유지할 수 있는 것, 그리고 고도로 환원된 ER을 갖는 것을 관찰하였다(도 25 및 26). 이들 이종성 세포 모집단을 추가 연구하기 위해, 2 초과의 MEROS-GFP 비를 가진 세포를 "환원된 세포"로 분류하였다. 이들 두 상이한 세포 모집단을 또한 만성 고글루코오스(도 27), 혈청 결핍, 글루코오스 결핍(도 28), 및 인간 IAPP(도 29)를 포함하는 췌장 β-세포에 대한 다른 공지된 ER 스트레스 유도제로의 처리 후 관찰하였다. 스트레스 유도제 중에서 팔미테이트 처리는 고도로 환원된 ER을 갖는 세포 모집단의 가장 큰 증가로 이어진다. 흥미롭게도 이전에 팔미테이트-유도 세포 기능이상에 대해 보호적인 것으로 나타났던 불포화 지방산, 올레산 및 리놀레산이 환원된 ER을 생성하는 팔미테이트의 능력을 유의미하게 억제하였다(도 30). 이들 데이터는 ER-스트레스를 받은 세포의 이들의 산화환원 상태가 이종성임을 시사한다.
실시예 4. 환원된 ER 을 갖는 세포에서의 폴딩되지 않은 단백질 반응( UPR )의 활성화
UPR 및 산화환원 상태의 이종성 간 상관관계를 연구하기 위해 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, 산화환원 상태 및 UPR의 활성화 수준을 모두 동일한 세포에서 모니터링하였다. 이를 달성하기 위해, 인간 BiP 프로모터에 의해 유도되는 적색 형광 단백질, mCherry를 인코딩하는 UPR 리포터 유전자를 구축하였다. BiP 프로모터는 3개의 폴딩되지 않은 단백질 반응 요소(UPRE)를 함유하며 UPR의 활성화 수준을 효율적으로 반영하는 것으로 나타났다. 상기 BiP-mCherry 리포터 플라스미드를 MEROS-GFP를 발현하는 INS-1 832/13 세포 내로 형질감염시키고, FACS 분석을 이용하여 동일한 세포에서 MEROS-GFP 비 및 UPR의 활성화 수준을 BiP-mCherry를 통해 모니터링하였다(도 31). BiP-mCherry의 활성화 수준 및 MEROS-GFP 비를 ER 스트레스의 유도 후 모니터링하였다. 이들 실험에서, MEROS-GFP를 발현하는 TNS-1 832/13 세포를 6-웰 플레이트 상에 접종하고, 나타낸 시간 동안 각 화합물로 처리한 뒤 트립신 처리로 수확하였다. 인산염 완충 식염수로 세척 후, 세포를 11mM 글루코오스-행크 완충 염 용액 중에 재현탁하였다. 유세포 측정 분석을 LSRII(BD)로 수행하였다.
데이터는 환원된 ER(MEROS-GFP 비 > 2.0)을 갖는 세포 모집단이 산화된 ER을 유지할 수 있는 세포 대비 더 높은 BiP-mCherry의 활성화 수준을 가졌음을 나타내어, 고도로 환원된 ER 세포 모집단에서의 UPR의 활성화를 시사한다(도 32 및 33).
이들 데이터를 확인하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, 산화된 ER 및 고도로 환원된 ER을 갖는 세포를 팔미테이트로의 처리 후 FACS로 정렬하고(도 34 및 35), UPR 마커 BiP 및 스플라이스된 XBP-1의 발현을 실시간 PCR을 이용하여 측정하였다. 이들 실험에서, 환원된 및 산화된 세포를 FACS로 정렬하고, 전체 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하였다. SYBR 녹색 염료를 사용하는 BioRad iQ5를 이용해서 역전사효소 및 정량적 PCR을 수행하였다.
데이터는 BiP 및 스플라이스된 XBP-1의 발현 수준이 산화된 ER을 갖는 세포에서의 수준 대비 고도로 환원된 ER을 갖는 세포에서 증가되었음을 나타낸다(도 36). 이들 데이터는 환원된 ER 및 산화된 ER을 갖는 세포에서의 발현 프로파일링에 의해 추가 확인되었다(도 37). 24시간 동안 0.5mM 팔미테이트로 처리한 FACS-정렬 INS-1 832/13 세포를 이용하여 이들 실험을 수행하였다. 전체 RNA를 RNAeasy 키트(Qiagen)로 추출하였다. 이어서 정제된 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 GeneChip 래트 Gene 1.0 ST 어레이(Affymetrix)에 적용하였다. 이들 데이터는 고도로 환원된 ER을 수반하는 세포가 아마도 조절 기전으로서 고도로 활성화된 UPR을 또한 가짐을 시사한다.
실시예 5. ER을 환원성에서 산화성 환경으로 이동시키는 화합물에 대한 소분자 스크리닝
상술된 데이터는 ER을 산화성 환경으로 이동시키는 화학적 화합물 및 생물제가 ER 스트레스 및 ER 기능이상에 관련된 질환의 치료를 위해 효과적일 수 있음을 시사한다. 상기 가능성을 조사하기 위해, 2개의 FDA-승인 약물 피오글리타존(Actos) 및 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA)은 ER 산화환원 상태에 영향을 미치고 ER 질환의 세포 모델에서 세포사를 완화시킬 수 있었다. 피오글리타존은 2형 당뇨병 환자의 치료를 위해 승인되었으며, 볼프람 증후군의 마우스 모델에서 췌장 β-세포 기능을 보존하는 것으로 나타났다. 피오글리타존은 탑시가긴으로 처리된 췌장 β-세포에서 ER을 산화성 환경으로 이동시키고(도 38, 오른쪽 패널), 이들 세포를 세포사로부터 보호하는 것으로 나타났다(도 38, 왼쪽 패널). 또 다른 소분자인 TUDCA는 담석 및 담관 경화의 치료에 대해 사용되어 왔으며, 당뇨병의 마우스 모델에서 ER 스트레스를 완화하는 것으로 나타났다. TUDCA는 또한 ER을 산화성 환경으로 이동시키고(도 38, 오른쪽 패널) 세포를 ER 스트레스 조건 하에서의 사멸로부터 보호하는 것으로 나타났다(도 38, 왼쪽 패널).
ER을 산화성 환경으로 이동시키는 제제가 ER 스트레스에 대한 보호를 제공할 수 있다는 발견은 고처리량 접근을 이용하여 환원된 ER의 신규한 소분자 억제제를 동정하기 위한 신규 스크리닝 분석의 개발을 가능케 한다. 1,040개의 U.S. 약물 및 240개의 국제적 약물 컬렉션인 1280-화합물 라이브러리(MicroSource)의 파일롯 스크리닝(도 39)을 수행하였다. 상기 실험에서, MEROS-GFP를 안정적으로 발현하는 INS-1 832/13 세포를 검은색 광학 96-웰 플레이트에 접종하였다(20,000세포/웰). 24시간 후, 각각의 화합물 2㎕을 TeMo 액체 핸들링 로봇을 이용하여 첨가하였다. 추가 24시간 후, 세포에 강력한 환원제인 0.2mM DTT를 2시간 동안 감작한 후, MEROS-GFP 비를 계산하였다. 미처리 세포의 평균 비는 0.037(S.D. = 0.003)이었고, DTT-처리 세포의 평균 비는 0.069(S.D. = 0.006)였다. 양성 화합물은 0.05 미만의 MEROS-GFP 비를 유지할 수 있는 것들이었다. 상기 기준을 이용하여, 스크리닝에서 20개의 양성 화합물을 확인하였다.
ER 스트레스를 유도하기 위해 20mM 글루코오스와 함께 조합된 0.4mM 팔미테이트를 이용하여 두 번째 스크리닝을 수행하였다. 두 스크리닝 간에 9개의 공통 양성 화합물이 확인되었고, 이 중 5개는 자가형광으로 인해 제거되었다. 위양성을 추가 제거하기 위해, MEROS-GFP를 안정적으로 발현하는 INS-1 832/13 세포를 나머지 4개의 공통 화합물로 전처리하고, 24시간 동안 0.5mM 팔미테이트로 감작하고, FACS를 이용하여 MEROS-GFP 비를 측정하였다. 상기 추가 단계에서 2개 화합물을 위양성으로서 제거하였다. 나머지 2개 화합물은 임상적으로 사용되는 제제인 아포모르핀 및 그리세오풀빈이었다. 스크리닝 분석에서는 양성으로 확인되었지만, 그리세오풀빈은 INS-1 832/13 세포에서 강력한 독성 효과를 가졌다.
실시예 6. 아포모르핀이 ER을 산화성 환경으로 이동시키고 ER 스트레스에 대한 보호를 제공함
아포모르핀이 ER을 환원성에서 산화성 환경으로 이동시킬 수 있음을 확인하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, MEROS-GFP를 발현하는 INS-1 832/13 세포를 24시간 동안 아포모르핀으로 처리한 뒤 24시간 동안 팔미테이트로 감작하였다. 데이터는 아포모르핀 처리가 환원된 ER을 가진 세포 모집단을 감소시켰음을 나타낸다(도 40). 팔미테이트로 처리한 INS-1 832/13 세포에서 세포 생활성 및 미토콘드리아 막 전위를 각각 프로피디움 요오다이드(PI) 및 MitoProbe(Invitrogen) 염색을 이용하여 측정하였다. 아포모르핀은 더 낮은 미토콘드리아 막 전위를 갖는 모집단을 감소시켰으며(도 41) ER 스트레스-유도 세포사를 억제하였다(도 42). 아포모르핀은 또한 INS-1 832/13 세포를 강력한 ER 스트레스 유도제인 탑시가긴에 의해 유도되는 ER 스트레스-매개 세포사로부터 보호하였다(도 43). 종합적으로, 이들 데이터는 아포모르핀이 ER을 산화성 환경으로 이동시키고 ER 스트레스에 대한 보호를 제공함을 나타낸다.
실시예 7. ER 을 산화성 환경으로 이동시키는 소분자가 ER 스트레스 세포 모델의 병태를 완화시킬 수 있음
상기 데이터는 아포모르핀 및 피오글리타존이 ER을 산화성 환경으로 이동시키는 능력을 가지며 ER 스트레스에 대한 보호를 제공함을 나타낸다. 아포모르핀 및 피오글리타존이 ER 스트레스-매개 세포사로부터 인간 섬을 보호할 수 있는지를 결정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 데이터는 아포모르핀 및 피오글리타존이 모두 탑시가긴-매개 세포사로부터 인간 섬을 보호할 수 있음을 나타낸다(도 44, 왼쪽 패널).
볼프람 증후군의 세포 모델인 INS-1 832/13-유래 독시사이클린-유도성 WFS1 녹다운 세포를 이용하여 추가적인 실험을 수행하였다. 상기 모델을 이용하여 아포모르핀 및 피오글리타존이 세포사를 예방할 수 있는지를 평가하였다. 미리 보고된 바와 같이, shRNA-매개 WFS1 녹다운은 카스파아제-3의 절단이 수반되는 세포사로 이어졌다(Riggs 등, Diabetologia 48:2313-2321, 2005). 상기 모델에서, 아포모르핀 및 피오글리타존은 모두 카스파아제 3의 절단 및 카스파아제 3의 기질, 폴리(ADP)-리보실화 효소(PARP)의 절단을 억제하였고, WFS1-녹다운 β-세포를 세포사로부터 보호할 수 있었다(도 44, 오른쪽 패널). 종합하면, 이들 데이터는 ER을 산화성 환경으로 이동시키는 소분자가 ER 질환의 세포 모델의 병태를 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 가용성 MANF 가 췌장 β-세포를 ER 스트레스 및 ER 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사로부터 보호함
가용성 MANF가 소포체 스트레스를 유도하는 제제에 대한 노출 시 췌장 β-세포의 소포체에서 산화환원 환경의 변동을 예방할 수 있는지를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. MEROS-GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 INS-1 832/13 세포(췌장 β-세포주)를 이용하여 실험을 수행하였다. 세포를 0.5㎍/mL 가용성 MANF로 처리하거나 처리하지 않고 11mM 또는 25mM 글루코오스 중에 배양하였다. 이어서 세포를 형질감염된 세포에서 환원된 EroGFP로부터 형광 방출의 특이적 검출을 가능케 하는 460-495nm의 여기 스펙트럼 및 520-570nm의 방출 스펙트럼(FITC-A 광학 필터)을 이용하여, FACS 분석을 이용하여 분석하였다. 데이터는 가용성 MANF의 처리가 검출 가능한 수준의 환원된 MEROS-GFP를 함유하는 세포의 수를 감소시킴을 나타낸다(도 45; 하부 오른쪽 패널 대 하부 왼쪽 패널). 상기 데이터와 일관되게, 이들 데이터는 가용성 MANF를 이용한 췌장 β-세포 처리가 ER을 산화성 환경으로 이동시킬 수 있고, 대상체에서 췌장 β 세포 장애의 발생을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
다른 구현예
본 발명이 이들의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 상기 기재는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 이는 첨부되는 특허청구범위의 범위에 의해 정의됨이 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형은 하기 특허청구범위의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts <120> Soluble MANF in Pancreatic Beta-Cell Disorders <130> 07917-0346WO1 <150> 61/590,021 <151> 2012-01-24 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val 20 25 30 Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp 35 40 45 Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys 50 55 60 Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala 65 70 75 80 Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu 85 90 95 Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys 100 105 110 Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser 115 120 125 Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu 130 135 140 Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr 145 150 155 160 Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala 165 170 175 Ser Ala Arg Thr Asp Leu 180 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile 20 25 30 Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 100 105 110 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210> 3 <211> 969 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggaggcggtg cggcgcggcg ggtgcggttc agtcggtcgg cggcggcagc ggaggaggag 60 gaggaggagg aggaggagga ggatgaggag gatgtgggcc acgcaggggc tggcggtggc 120 gctggctctg agcgtgctgc cgggcagccg ggcgctgcgg ccgggcgact gcgaagtttg 180 tatttcttat ctgggaagat tttaccagga cctcaaagac agagatgtca cattctcacc 240 agccactatt gaaaacgaac ttataaagtt ctgccgggaa gcaagaggca aagagaatcg 300 gttgtgctac tatatcgggg ccacagatga tgcagccacc aaaatcatca atgaggtatc 360 aaagcctctg gcccaccaca tccctgtgga gaagatctgt gagaagctta agaagaagga 420 cagccagata tgtgagctta agtatgacaa gcagatcgac ctgagcacag tggacctgaa 480 gaagctccga gttaaagagc tgaagaagat tctggatgac tggggggaga catgcaaagg 540 ctgtgcagaa aagtctgact acatccggaa gataaatgaa ctgatgccta aatatgcccc 600 caaggcagcc agtgcacgga ccgatttgta gtctgctcaa tctctgttgc acctgagggg 660 gaaaaaacag ttcaactgct tactcccaaa acagcctttt tgtaatttat tttttaagtg 720 ggctcctgac aatactgtat cagatgtgaa gcctggagct ttcctgatga tgctggccct 780 acagtacccc catgagggga ttcccttcct tctgttgctg gtgtactcta ggacttcaaa 840 gtgtgtctgg gattttttta ttaaagaaaa aaaatttcta gctgtccttg cagaattata 900 gtgaatacca aaatggggtt ttgccccagg aggctcctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaa 969 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 4 Leu Arg Gln Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Ser Ile 20 25 30 Glu Lys Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Glu Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ser His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 100 105 110 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210> 5 <211> 101 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile 20 25 30 Glu Glu Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Gly Glu Cys Asp 100 <210> 6 <211> 158 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile 20 25 30 Glu Glu Glu Leu Ile Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 100 105 110 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Met Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210> 7 <211> 157 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 7 Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe 1 5 10 15 Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Ser Ile 20 25 30 Glu Lys Glu Leu Thr Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg 100 105 110 Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp 145 150 155 <210> 8 <211> 151 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 8 Leu Lys Glu Glu Asp Cys Glu Val Cys Val Lys Thr Val Arg Arg Phe 1 5 10 15 Ala Asp Ser Leu Asp Asp Ser Thr Lys Lys Asp Tyr Lys Gln Ile Glu 20 25 30 Thr Ala Phe Lys Lys Phe Cys Lys Ala Gln Lys Asn Lys Glu His Arg 35 40 45 Phe Cys Tyr Tyr Leu Gly Gly Leu Glu Glu Ser Ala Thr Gly Ile Leu 50 55 60 Asn Glu Leu Ser Lys Pro Leu Ser Trp Ser Met Pro Ala Glu Lys Ile 65 70 75 80 Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ala Gln Ile Cys Asp Leu Arg Tyr 85 90 95 Glu Lys Gln Ile Asp Leu Asn Ser Val Asp Leu Lys Lys Leu Lys Val 100 105 110 Arg Asp Leu Lys Lys Ile Leu Asn Asp Trp Asp Glu Ser Cys Asp Gly 115 120 125 Cys Leu Glu Lys Gly Asp Phe Ile Lys Arg Ile Glu Glu Leu Lys Pro 130 135 140 Lys Tyr Ser Arg Ser Glu Leu 145 150 <210> 9 <211> 158 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 9 Leu Lys Asp Gly Glu Cys Glu Val Cys Val Gly Phe Leu Gln Arg Leu 1 5 10 15 Tyr Gln Thr Ile Gln Glu Asn Asn Val Lys Phe Asp Ser Asp Ser Ile 20 25 30 Glu Lys Ala Leu Leu Lys Ser Cys Lys Asp Ala Lys Gly Lys Glu Asn 35 40 45 Arg Phe Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala Thr Ser Asp Ala Ala Thr Lys Ile 50 55 60 Thr Asn Glu Val Ser Lys Pro Met Ser Tyr His Val Pro Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys 85 90 95 Tyr Asp Lys Gln Val Asp Leu Ser Ser Val Asp Leu Lys Lys Leu Lys 100 105 110 Val Lys Asp Leu Lys Lys Ile Leu Glu Glu Trp Gly Glu Ser Cys Lys 115 120 125 Gly Cys Val Glu Lys Ser Asp Phe Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met 130 135 140 Pro Lys Tyr Ala Pro Ser Ala Ala Lys Ala Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210> 10 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein <220> <221> misc_feature <222> (65)..(65) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Val 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Xaa Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp 65 70 75 80 Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile 85 90 95 Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe 100 105 110 Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe 115 120 125 Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn 130 135 140 Ser His Cys Val Tyr Ile Val Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys 145 150 155 160 Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu 165 170 175 Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu 180 185 190 Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Cys Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp 195 200 205 Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala 210 215 220 Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Met Met Lys Phe Thr Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala Val 1 5 10 15 Arg Ala <210> 14 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEROS-Green Fluorescent Protein <400> 14 Met Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Val Arg Ala Glu Glu Glu Asp Pro Pro Val Ala Thr Met Ser Lys Gly 20 25 30 Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly 35 40 45 Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp 50 55 60 Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Ser Thr Thr Gly Lys 65 70 75 80 Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Val 85 90 95 Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe 100 105 110 Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe 115 120 125 Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly 130 135 140 Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Cys His 165 170 175 Lys Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn 180 185 190 Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp 195 200 205 His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro 210 215 220 Asp Asn His Tyr Leu Lys Thr Cys Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn 225 230 235 240 Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Arg Val Thr Ala Ala Gly 245 250 255 Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Ser Gly Gly Pro Pro 260 265 270 Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ser Glu Lys Asp Glu Leu 275 280 285 <210> 15 <211> 858 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MEROS-Green Fluorescent Protein <400> 15 atgatgaagt tcactgtggt ggcggcggcg ttgctgctgc tgggcgcggt gcgggccgag 60 gaggaggatc caccggtcgc caccatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 120 ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt cagtggagag 180 ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttccac tactggaaaa 240 ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttcagtt atggtgttca atgcttttca 300 agatacccag atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 360 gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat gacgggaact acaagacacg tgctgaagtc 420 aagtttgaag gtgataccct tgttaataga atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 480 gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa tacaactata actgccacaa ggtatacatc 540 atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gttaacttca aaattagaca caacattgaa 600 gatggaagcg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 660 gtccttttac cagacaacca ttacctgaag acatgctctg ccctttcgaa agatcccaac 720 gaaaagagag accacatggt ccttcttgag cgcgtaacag ctgctgggat tacacatggc 780 atggatgaac tatacaaaac tagtggaggc cctcccccaa ctggtgaaga ggatacatca 840 gaaaaagatg agttgtag 858

Claims (26)

  1. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 진단 방법으로서,
    기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에 췌장 β-세포 장애가 있음을 시사하는 방법.
  2. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하는 것을 포함하여, 대상체의 췌장 β-세포 장애의 발생 위험을 예측하는 방법으로서,
    기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 증가됨을 시사하고, 기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 차이는 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 발생 위험이 정상이거나 감소됨을 시사하는 방법.
  3. 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고;
    두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF 수준을 비교하는 것을 포함하여, 대상체에서 췌장 β-세포 기능 또는 췌장 β-세포 물질을 모니터링하는 방법으로서,
    첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준은 대상체에서 췌장 β-세포 기능의 감소 또는 췌장 β-세포 물질의 감소를 시사하고, 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준의 감소 또는 유의미하지 않은 변화는 대상체에서 췌장 β-세포 기능이 변화가 없거나 증가된 것을 또는 췌장 β-세포 물질이 변화가 없거나 증가된 것을 시사하는 방법.
  4. 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고;
    기준 수준 대비 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 상승된 수준을 갖는 대상체를 췌장 β-세포 장애의 치료를 위해 선택하는 것을 포함하여, 췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 대상체를 선택하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장 β-세포 장애가 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 및 볼프람 증후군 (Wolfram syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 수준이 가용성 MANF의 역치 수준인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 기준 수준이 건강한 대상체에서 가용성 MANF의 수준인 방법.
  8. 대상체에 유효량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF) 또는 아포모르핀을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연 방법.
  9. 췌장 β-세포를 유효량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF) 또는 아포모르핀과 접촉시키는 것을 포함하는, 췌장 β-세포에서 소포체 스트레스의 감소 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 췌장 β-세포가 대상체에 있는 방법.
  11. 췌장 β-세포 모집단을 유효량의, 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF) 또는 아포모르핀과 접촉시키는 것을 포함하는, 둘 이상의 췌장 β-세포 모집단에서 소포체 스트레스-유도 아폽토시스성 세포사의 감소 또는 지연 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 췌장 β-세포 모집단이 대상체에 있는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 4항, 제 8항, 제 10항 및 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  14. 첫 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    두 번째 시점에 대상체로부터의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 결정하고;
    두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준과 첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준을 비교하는 것을 포함하여, 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 유효성을 모니터링하는 방법으로서,
    (i) 첫 번째 시점은 치료 전이고 두 번째 시점은 치료 개시 후의 임의의 시점이거나, (ii) 첫 번째 시점은 치료 개시 후이고, 두 번째 시점은 치료 동안의 이후 시점 또는 치료 후이고;
    첫 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 수준 대비 두 번째 시점에서의 생물학적 표본 중 가용성 MANF의 감소된 수준은 치료가 대상체에서 효과적이었음을 시사하는 방법.
  15. 췌장 β-세포를 제공하고;
    췌장 β-세포와 평가 화합물을 접촉시키고;
    평가 화합물의 존재 하에 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 중뇌 별아교세포-유래 신경영양 인자(MANF)의 수준을 결정하고;
    평가 화합물의 존재 하에 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 (MANF)의 수준과 가용성 MANF의 기준 수준을 비교하고,
    기준 수준 대비 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 상승된 수준과 연관되는 화합물을 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연을 위한 후보 화합물로서 선택하는 것을 포함하는,
    대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 기준 수준이 후보 제제의 부재 하에 췌장 β-세포에 의해 생성되는 가용성 MANF의 수준인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 기준 수준이 가용성 MANF의 역치 수준인 방법.
  18. BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질, 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포를 제공하고;
    세포와 평가 화합물을 접촉시키고;
    세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양을 결정하고;
    세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양과 기준 수준을 비교하고;
    기준 수준 대비 세포에서 산화된 리포터 단백질의 상승된 수준과 연관되는 평가 화합물을 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연을 위한 후보 화합물로서 선택하는 것을 포함하는,
    대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물의 스크리닝 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 기준 수준이 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 산화된 리포터 단백질의 양인 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 기준 수준이 산화된 리포터 단백질의 역치 수준인 방법.
  21. BiP 시그널 서열, 산화환원-감수성 형광 단백질, 및 아미노산 서열 KDEL을 함유하는 리포터 단백질을 발현하는 포유류 세포를 제공하고;
    세포와 평가 화합물을 접촉시키고;
    세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양을 결정하고;
    세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양과 기준 수준을 비교하고;
    기준 수준 대비 세포에서 환원된 리포터 단백질의 감소된 수준과 연관되는 평가 화합물을 대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연을 위한 후보 화합물로서 선택하는 것을 포함하는,
    대상체에서 췌장 β-세포 장애의 치료 또는 발병 지연에 유용한 후보 화합물에 대한 스크리닝 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 기준 수준이 후보 제제의 부재 하에 포유류 세포에 존재하는 환원된 리포터 단백질의 양인 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 기준 수준이 환원된 리포터 단백질의 역치 수준인 방법.
  24. 가용성 MANF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편; 및
    인슐린, C-단백질, 및 섬 아밀로이드 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 단백질에 결합하는 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 키트.
  25. 서열 목록 번호 2에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 가용성 MANF 단백질 또는 아포모르핀; 및
    췌장 β-세포 장애의 치료를 위한 적어도 하나의 추가 제제를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 적어도 하나의 추가 제제가 인슐린인 조성물.
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