CN107988258A - 一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法，属于生物技术和病毒学领域。本发明人构建了黑猩猩型腺病毒AdC7为复制缺陷型重组表达载体，该载体具有良好的免疫原性和遗传稳定性，并在该载体的基础上制备了新型寨卡病毒疫苗。该疫苗免疫小鼠后，能有效地诱导针对寨卡病毒的中和抗体，保护小鼠不受感染，同时能够保护小鼠组织器官不受损伤。

Description

一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法，属于生物技术和病毒学领域。

背景技术

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，是一种蚊媒病毒。寨卡病毒最早于1947年在乌干达寨卡森林里的猴子体内分离，在近70年的时间里没有大范围传播，人类感染病毒后的症状也较温和。在2015-2016年间爆发的寨卡病毒成为全球危机，截止目前疫情已蔓延至84个国家，也包括中国。越来越多的证据表明孕妇被寨卡病毒感染很可能会造成胎儿的大脑发育异常，导致小头畸形。寨卡病毒感染成年人可能会导致格林.巴利综合症。寨卡病毒主要由埃及伊蚊传播，也可通过母婴传播，血液传播和性传播。据报道寨卡病毒可以在精液中存留数月。在小鼠模型中，我们先前的研究发现寨卡病毒感染可以引起免疫缺陷小鼠睾丸炎及萎缩。但是目前仍没有寨卡病毒的特效药物及疫苗，开发出高效的寨卡疫苗刻不容缓。

寨卡病毒是一种单股正链RNA病毒，具有囊膜结构，结构蛋白envelop(E)主要介导病毒入侵及膜融合，是病毒中和抗体的主要表位。Precursor-membrane(prM)和E蛋白可以在未成熟病毒颗粒中形成异源二聚体，病毒复制过程中，prM被宿主的蛋白酶切割形成pr和M，pr被释放离开病毒颗粒。我们选择了全长的寨卡病毒M和E基因去构建疫苗。

腺病毒载体已经被开发用于多种病原体的疫苗设计，包括流感病毒、埃博拉病毒、登革病毒等。腺病毒疫苗的有点包括较强的免疫能力、维持周期长、免疫宿主广泛、不需要添加佐剂、易于工厂化生产。但是常用的5型人腺病毒(HuAd5)在人群中预存免疫高达74.2％(Wang Xiang,Xing Man,Zhang Chao et al.Neutralizing antibody responsesto enterovirus and adenovirus in healthy adults in China.Emerg MicrobesInfect,2014,3(5):e30.)，限制了这个载体的使用。另外，由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，使直接克隆重组腺病毒载体成为技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于黑猩猩腺病毒载体表达寨卡病毒M/E蛋白预防寨卡病毒的方法。

本发明的第一个目的是提供一种表达寨卡病毒M/E蛋白的方法，所述方法应用腺病毒表达寨卡M/E病毒全长蛋白。

在本发明的一种实施方式中，由腺病毒载体来形成所述的腺病毒，所述的腺病毒载体中包含表达寨卡病毒M/E蛋白的元件。

在本发明的一种实施方式中，形成所述腺病毒的腺病毒载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体作为骨架载体。

在本发明的一种实施方式中，所述的表达寨卡病毒M/E蛋白的元件按照5’→3’顺序依次包括：启动子，信号肽编码序列，寨卡病毒M/E基因序列，终止子。

在本发明的一种实施方式中，所述的信号肽是分泌信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽为JEV信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述的寨卡病毒M/E基因序列含有SEQ ID NO:2第1-1740位所示核苷酸片段。

在本发明的一种实施方式中，形成所述的腺病毒载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体作为骨架载体，所述的表达寨卡病毒M/E蛋白的元件被插入到该载体中被删除的E1区域。

本发明的第二个目的是提供一种腺病毒表达载体，该载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体作为骨架；且按照5’→3’顺序依次包括以下表达寨卡病毒M/E蛋白的元件：启动子，信号肽编码序列，寨卡病毒M/E蛋白编码序列，终止子。

在本发明的一种实施方式中，采用CMV作为启动子，其能够维持外源基因在肌肉中的持续表达；所述终止子为BGH poly A。

在本发明的一种实施方式中，所述表达寨卡病毒M/E蛋白的元件被插入到该载体中被删除的E1区域。

在本发明的一种实施方式中，所述的信号肽是分泌信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽为JEV信号肽，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述的寨卡病毒M/E含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体作为骨架载体时，所述腺病毒表达寨卡病毒M/E蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述AdC7载体可替换为黑猩猩型腺病毒AdC6、AdC68或人腺病毒AdHu26、AdHu36。

本发明的第三个目的是提供所述的腺病毒表达载体应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括用于制备腺病毒，所述的腺病毒能表达寨卡病毒M/E蛋白。

本发明的第四个目的是提供一种由所述腺病毒表达载体制备而成的腺病毒。

在本发明的一种实施方式中，将所述的腺病毒表达载体线性化后，转入病毒生产细胞制备腺病毒。

在本发明的一种实施方式中，所述病毒生产细胞为HEK 293细胞。

本发明的第五个目的是提供应用所述腺病毒制备的抗寨卡病毒的疫苗。

在本发明的一种实施方式中，所述抗寨卡病毒疫苗包括所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供一种用于表达寨卡病毒M/E蛋白的试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的腺病毒表达载体，或所述的腺病毒；或所述的抗寨卡病毒疫苗。

本发明的第七个目的是提供一种制备寨卡病毒疫苗的方法，所述方法包括：应用所述的寨卡病毒疫苗载体；将该表达载体转染病毒生产细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的寨卡病毒疫苗。

有益效果：本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效感染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低；本发明的腺病毒载体疫苗生产工艺简单、价格低廉；本发明的腺病毒载体抗寨卡病毒疫苗效果显著：在小鼠实验中，(1)只需要免疫一次；(2)能在1周内快速激活抗寨卡病毒的中和抗体产生；(3)中和抗体能够维持3个月甚至更久；(4)能够抵抗多个寨卡病毒株系；(5)能够实现清除性免疫，在小鼠感染寨卡病毒后，血液和器官中都检测不到病毒，保护组织器官不受损伤。

附图说明

图1、复制缺陷型腺病毒载体pAdC7-M/E构建示意图；

图2、复制缺陷型腺病毒载体pAdC7-M/E鉴定结果；(A)载体pAdC7-M/E的BglII酶切鉴定结果。M：DNA分子量标准；1-55个不同的克隆；(B)挑选阳性克隆3号和5号克隆的质粒凝胶电泳分析。

图3、重组腺病毒的包装。在HEK 293细胞中包装AdC7-M/E重组腺病毒过程中形成的噬斑。

图4、Western Blot检测重组腺病毒AdC7-M/E的E蛋白表达情况；A为检测细胞裂解物的结果；B为检测上清的结果。

图5、AdC7-M/E免疫的BALB/c小鼠血清中抗体检测；血清中结合寨卡病毒E蛋白的抗体效价(A)，中和抗体效价(B)；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹病毒颗粒(viral particles，vp)；AdC7-M/E-L：4x10¹⁰vp；Sham：注射PBS作为对照。

图6、AdC7-M/E免疫的Ifnar1^-/-小鼠血清中抗体检测；血清中结合寨卡病毒E蛋白的抗体水平(A)，中和抗体水平(B)，不同时间点的中和抗体效价(C)；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹vp；AdC7-M/E-L：4x10¹⁰vp；Sham：注射PBS作为对照。

图7、AdC7-M/E免疫的Ifnar1^-/-小鼠血清抗多株寨卡病毒中抗体效价检测；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹vp；AdC7-M/E-L：4x10¹⁰v[；Sham：注射PBS作为对照。

图8、AdC7-M/E免疫的Ifnar1^-/-小鼠保护效果评价；小鼠的存活状况(A)，体重变化(B)；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹vp；AdC7-M/E-L：4x10¹⁰vp；Sham：注射PBS作为对照。

图9、AdC7-M/E被动免疫免疫的Ifnar1^-/-小鼠保护效果评价；小鼠的存活状况(A)，体重变化(B)；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹vp；Sham：注射PBS作为对照。

图10、寨卡病毒感染Ifnar1^-/-小鼠后病毒载量检测；在分别免疫高剂量、低剂量的AdC7-M/E疫苗和PBS的三组Ifnar1^-/-小鼠腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1后，分别在注射病毒前及注射病毒后第3、6、9和16天取血检测血清中病毒量,PBS对照组结果如(A)所示，高剂量免疫组结果如(B)所示，低剂量免疫组结果如(C)所示。在分别免疫高剂量、低剂量的AdC7-M/E疫苗和PBS的三组Ifnar1^-/-小鼠腹腔注射5x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1后，分别在注射病毒前及注射病毒后第3、6、9和16天取血检测血清中病毒量,PBS对照组结果如(D)所示，高剂量免疫组结果如(E)所示，低剂量免疫组结果如(F)所示。(G)分别给两组Ifnar1^-/-小鼠免疫高剂量的AdC7-M/E疫苗和PBS，4周后通过腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1，每组半数的小鼠在感染后第8天安乐死，取出脑、脊髓、睾丸、脾和肝，对器官的寨卡病毒进行定量，每组另外半数的小鼠在感染后第16天安乐死，取出脑、脊髓、睾丸、脾和肝，对器官的寨卡病毒进行定量。高剂量(AdC7-M/E-H)：1.6x10¹¹vp；低剂量(AdC7-M/E-L)：4x10¹⁰vp；Sham：注射PBS作为对照。

图11、AdC7-M/E疫苗保护Ifnar1^-/-小鼠睾丸的效果评价；小鼠睾丸的形态大小(A)，睾丸质量(B)；AdC7-M/E-H：1.6x10¹¹vp；Sham：注射PBS作为对照；Mock：不做任何处理。d.p.i：感染后天数。

图12、组织切片染色检测AdC7-M/E保护Ifnar1^-/-小鼠睾丸效果；

通过切片和苏木精-伊红法染色，观察睾丸形态。A和D是Mock组，小鼠不做任何处理。B和E是Sham组，小鼠免疫PBS作为对照，之后感染寨卡病毒。C和F是AdC7-M/E疫苗组，小鼠免疫AdC7-M/E疫苗后感染寨卡病毒。A、B和C是感染寨卡病毒后第16天检测，D、E和F是感染寨卡病毒后第30天检测。A1、B1、C1、D1、E1和F1为低倍显微镜下拍照，A2、B2、C2、D2、E2和F2为相应的样品高倍显微镜下拍照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件

(1)质粒、菌株及细胞：穿梭载体pShuttle-CMV购自Clontech Laboratories,Inc；改造的pAdC7载体敲除了E1和E3基因，在前期已完成；携带有优化密码子的寨卡病毒(FSS13025，Genbank No.:JN860885.1)M/E基因重组质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成；感受态菌株Stbl2购自Invitrogen；腺病毒包装细胞系HEK293(293A)细胞购自ATCC。

实验动物：6-8周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Ifnar1^-/-小鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所。

主要试剂：

高保真DNA聚合酶购自赛默飞世尔科技公司，DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，大片段DNA凝胶回收试剂盒QIAEX II GelExtraction Kit购自Qiagen公司，限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司，Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司，转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自罗氏公司。

制备重组腺病毒：提前一天把HEK 293细胞铺在6孔板里，第二天细胞密度在80％左右可用于转染。用限制性内切酶PacI线性化重组腺病毒质粒pAdC7-M/E，65℃加热20分钟灭活内切酶。使用X-tremeGENE转染试剂转染HEK 293细胞。37℃5％CO₂条件下培养。第5天后开始每天用显微镜观察细胞，一般在第6-8天出现明显的噬斑。待50％左右的细胞已经变圆或者悬浮后收集细胞，反复冻融三次后离心取上清感染HEK 293细胞(75ml细胞培养瓶)，2天后收集细胞。重复以上步骤直至收集30个被腺病毒感染的150ml培养瓶的细胞，使用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，测定260nm的OD值，加入终浓度为10％的甘油保存在-80℃。提取重组腺病毒的基因组DNA，测序进一步鉴定目的片段的序列，结果如SEQ ID NO.2所示。

ELISA实验方法：将ZIKV E蛋白用ELISA包被液稀释至6μg/ml，96孔ELISA板每孔加入100μl，4℃放置过夜。第二天封闭ELISA板，血清按照3倍梯度稀释，加入到ELISA板中孵育，之后加入goat anti-mouse HRP二抗，加入TMB显色液显色，使用2M盐酸终止，在酶标仪上用OD450读值。

微量中和实验方法：在96孔板里铺VERO细胞，37℃培养。第二天按照3倍梯度稀释血清，同时稀释寨卡病毒至每孔100PFU，将血清与病毒等体积混合，在37度孵育2小时，之后加到培养VERO细胞的96孔板里，培养4天后进行固定、封闭，孵育Z6 anti ZIKV-E抗体和goat anti-human HRP二抗，加入TMB显色液显色，使用2M盐酸终止，在酶标仪上用OD450读值，数据进行非线性拟合，计算MN₅₀。

寨卡病毒感染实验

在Ifnar1^-/-小鼠免疫后第四周，腹腔注射5x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1病毒，注射当天及之后每天都称体重检测体重变化，记录小鼠死亡情况。在感染前及感染后第3、6、9、16天取120μl血液，分离血清，使用MagaBio Plus病毒RNA试剂盒在核酸自动提取仪Gene PurePlus(杭州博日科技有限公司)上提取RNA，之后使用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对寨卡病毒RNA进行定量。

被动免疫实验

将10只6-8周龄BALB/c小鼠分成2组，分别免疫AdC7-M/E-H(1.6x10¹¹vp)和PBS，第4周处死取出全部血液，分离出血清。将一只BALB/c小鼠的200μl血清腹腔注射到一只Ifnar1^-/-小鼠，6小时后给每只Ifnar1^-/-小鼠注射1x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1病毒，注射当天及之后每天都称体重检测体重变化，记录小鼠死亡情况。

组织病毒量检测

将24只Ifnar1^-/-小鼠分成2组，每组12只，分别免疫AdC7-M/E-H(1.6x10¹¹vp)和PBS。在免疫后第四周，腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1病毒，分别在第8天和第16天每组解剖6只，取出脑、脊髓、肝、脾、睾丸，称重，用电动组织研磨器磨碎组织，离心取出上清，使用MagaBio Plus病毒RNA试剂盒在核酸自动提取仪Gene Pure Plus上提取RNA，之后使用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒对寨卡病毒RNA进行定量。

寨卡病毒感染Ifnar1^-/-小鼠后睾丸损伤情况监测

将24只Ifnar1^-/-小鼠分成3组，每组8只，其中两组分别免疫AdC7-M/E-H(1.6x10¹¹vp)和PBS，另一组不做任何处理，即为Mock组。在免疫后第四周，AdC7-M/E-H组和PBS组腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1病毒，Mock组不做任何处理，分别在第16天、第30天每组解剖4只，拍照记录睾丸大小，称量每个睾丸质量，并且把每只鼠的一个睾丸放进4％多聚甲醛中，浸泡72小时，更换成60％乙醇溶液，之后进行石蜡包埋，苏木精-伊红法染色。

实施例1、构建pAdC7-M/E载体

目的基因的获得：蛋白表达使用来源于JEV的信号肽序列，M/E基因序列来源于FSS13025病毒株，信号肽及M/E基因序列都进行密码子优化，优化后的信号肽序列如SEQ IDNO.1所示，优化后的M/E基因序列如SEQ ID NO.2所示，在苏州金唯智生物科技有限公司合成后克隆进pCAGGS载体，获得pCAGGS-M/E。

重组腺病毒穿梭载体的获得：以pCAGGS-M/E为模板，设计正向引物接入接入XbaI酶切位点和Kozak序列(GCCACC)，设计反向引物接入KpnI酶切位点，使用高保真DNA聚合酶进行PCR，PCR产物进行凝胶电泳，后用试剂盒回收纯化。将PCR产物和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV都经XalI和KpnI双酶切得到具有粘性末端的目的基因及载体，之后进行连接，转化DH5α感受态细胞，在含卡那霉素的抗性琼脂平板上筛选，在含卡那霉素的LB培养基中37℃过夜培养，提取质粒DNA。采用PCR、酶切方法进行鉴定，得到阳性克隆后将质粒交给北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果进行比对确定完全正确，得到的重组质粒命名为pShuttle-M/E。实验中PCR，DNA凝胶回收，酶切，连接，转化，质粒提取都按照说明书要求操作。

获重组腺病毒质粒的获得：将病毒株FSS13025的M/E基因序列经密码子优化后进行合成，克隆进pShuttle载体，挑阳性克隆对目的片段进行测序，选择结果正确的质粒，得到pShuttle-M/E(图1)。将质粒pShuttle-M/E经PI-SceI和I-CeuI双酶切，得到带有粘性末端的目的基因，之后进行凝胶电泳和DNA回收纯化。将pAdC7载体经PI-SceI和I-CeuI双酶切，得到带有粘性末端的线性载体，之后进行凝胶电泳，使用QIAEX II Gel ExtractionKit回收纯化。把目的基因与pAdC7线性载体混合，使用T4 DNA连接酶在16℃连接。转化Stbl2感受态细胞，涂在含氨苄抗性的琼脂平板上在30℃培养18小时，挑选氨苄抗性克隆在含氨苄青霉素的LB中，于30℃培养16小时，小量提取质粒，将质粒进行凝胶电泳分析。把重组质粒用BglII单酶切，比较分析酶切图谱。分析质粒酶切图谱(图2A)，挑选正确的克隆，即3和5号，再进行琼脂糖凝胶电泳，质粒条带正确(图2B)。将阳性重组腺病毒质粒按照1:1000比例，转接至200mlLB中培养，提取质粒DNA。得到的含寨卡M/E基因的重组腺病毒载体命名为pAdC7-M/E。

实施例2包装AdC7-M/E

将pAdC7-M/E使用PacI酶线性化后灭活，转染HEK 293细胞，7天左右可以见到噬斑(图3)，说明已成功包装出腺病毒，再等2-3天细胞全部脱落，收集细胞及上清于冻存管中。

实施例3Western blot检测蛋白表达

将HEK293T细胞提前一天铺在12孔板上，第二天分别每孔加入10⁹，10⁸，10⁷vpAdC7-M/E，48小时后分别收集细胞及上清，以GAPDH作为内参，Western blot检测E蛋白表达，发现在细胞及上清中，E蛋白的量都与加入的腺病毒量程正相关(图4A，B)。

实施例4、AdC7-M/E免疫BALB/c小鼠，测定血清中抗体水平

将18只BALB/c小鼠分成3组，分别免疫AdC7-M/E-H(1.6x10¹¹vp)、AdC7-M/E-L(4x10¹⁰vp)和PBS，4周后使用相同剂量进行二次免疫。分别在初次免疫和二次免疫后4周取血，4℃离心分离血清，进行ELISA实验和微量中和实验。

结果显示，在使用低剂量AdC7-M/E(4x10¹⁰vp，AdC7-M/E-L)和高剂量(1.6x10¹¹vp，AdC7-M/E-H)免疫BALB/c小鼠后，能诱导小鼠产生E蛋白抗体，ELISA检测滴定终点可以达到5x10³(图5A)，在进行二次免疫后，高剂量免疫组小鼠ELISA滴定值没有显著差异，低剂量组ELISA滴定值有略微升高，使用one-way ANOVA进行统计分析在统计学上没有显著性差异。同时我们测定了血清的中和抗体水平，在分别只一次免疫及共二次免疫情况下，高剂量与低剂量免疫组都可以检测到滴度将近1x10³的中和抗体水平，使用one-way ANOVA进行统计分析二者没有显著差异，结合ELISA检测的结果，后续的实验都只采用一次免疫。

实施例5、AdC7-M/E免疫Ifnar1^-/-小鼠，测定血清中抗体水平及时间进程变化。

将18只6-8周龄Ifnar1^-/-小鼠分成3组，分别免疫AdC7-M/E-H(1.6x10¹¹vp)、AdC7-M/E-L(4x10¹⁰vp)和PBS，4周后取血，4℃离心分离血清，检测血清检测ELISA和中和反应。

在使用低剂量AdC7-M/E(4x10¹⁰vp，AdC7-M/E-L)和高剂量(1.6x10¹¹vp，AdC7-M/E-H)免疫Ifnar1^-/-小鼠后，都能诱导小鼠产生E蛋白抗体，ELISA检测滴定终点平均值可以达到约1x10⁴(图6A)，中和抗体水平平均值达到约1x10³(图6B)，且高低剂量免疫没有显著差异，说明腺病毒疫苗在Ifnar1^-/-小鼠体内仍可以很好的工作。

之后我们检测了在免疫AdC7-M/E后，不同时间点小鼠血清中的中和抗体水平，发现在免疫后第一周即可达到1x10³的中和抗体水平(图6C)，在第8周达到高峰值，且在第12周时仍维持在较高的水平。

实施例6、AdC7-M/E免疫Ifnar1^-/-小鼠血清抗多株寨卡病毒中和抗体效价检测

寨卡病毒分为亚洲系和非洲系，亚洲系又有两个分支：此次爆发之前的东南亚系2007-1012和此次爆发的流行株2015-2016，我们构建腺病毒疫苗是使用的东南亚系(FSS13025病毒株)的基因序列，为了检测疫苗AdC7-M/E能有激活抗体的产生中和东南亚系2007-2012和非洲系，我们增加了MR766(非洲系)和FSS13025(东南亚系)进行中和抗体活性检测。

在使用低剂量AdC7-M/E(4x10¹⁰vp，AdC7-M/E-L)和高剂量(1.6x10¹¹vp，AdC7-M/E-H)免疫Ifnar1^-/-小鼠后第四周取血，分别使用SMGC，MR766，FSS13025，进行微量中和实验检测实验，发现AdC7-M/E激活的抗体能够很好的中和MR766，FSS13025(图7)，并且中和MR766和FSS13025病毒的抗体滴度值与SMGC-1相比无显著性差异。

实施例7、Ifnar1^-/-小鼠免疫后攻毒保护试验

我们以Ifnar1^-/-小鼠为模型，以肌肉注射方式免疫了低剂量AdC7-M/E(4x10¹⁰vp，AdC7-M/E-L)和高剂量(1.6x10¹¹vp，AdC7-M/E-H)的疫苗，注射PBS作为Sham对照。4周后腹腔注射5x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1，可见对照组从第4天体重开始逐渐降低，(图8B)，8只小鼠都在注射病毒后的8天内死亡(图8A)，而免疫组小鼠体重没有下降(图8B)，也都没有死亡(图8A)，证明了AdC7-M/E免疫能够很好的保护小鼠抵抗寨卡病毒感染。

实施例8、Ifnar1^-/-小鼠被动免疫试验

为了检测在BALB/c小鼠中是否可以在免疫AdC7-M/E后产生足够中和病毒的抗体，我们对5只BALB/c高剂量免疫了AdC7-M/E，另外5只注射PBS作为对照。4周后安乐死，取出血液。将一只BALB/c的200μl血清经腹腔注射到一只Ifnar1^-/-小鼠体内。6小时候注射致死剂量的1x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1，每天监测小鼠状态及体重，可见对照组从第4天开始体重明显下降(图9B)，并从第5天开始出现死亡(图9A)，直至第8天，5只对照组小鼠全部死亡。而接受疫苗免疫小鼠血清的Ifnar1^-/-小鼠在第4天没有出现明显的体重下降(图9B)，但是仍然在第8天体重下降了一部分，之后迅速回升，免疫组小鼠没有出现死亡情况(图9A)。实验结果说明AdC7-M/E疫苗免疫BALB/c能很好的激活免疫，保护小鼠抵抗寨卡病毒的感染。

实施例9病毒载量检测

为了检测疫苗能否保护小鼠病毒感染后引起的病毒血症，在分别免疫高剂量、低剂量的AdC7-M/E疫苗和PBS的三组Ifnar1^-/-小鼠腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1后，分别在注射病毒前及注射病毒后第3、6、9和16天取血检测血清中病毒量，对照组小鼠在感染后第3天达到较高的病毒滴度，每毫升血清可检测约1x10⁷病毒拷贝数(图10A)，而所有免疫小鼠在感染后血清里都检测不到病毒(图10B和10C)，说明疫苗能够很好的保护小鼠抵抗病毒血症。

为了检测在更高病毒量感染的情况下，疫苗能否保护小鼠被感染后引起的病毒血症，在分别免疫高剂量、低剂量的AdC7-M/E疫苗和PBS的三组Ifnar1^-/-小鼠腹腔注射5x10⁶PFU ZIKV-SMGC-1后，分别在注射病毒前及注射病毒后第3、6、9和16天取血检测血清中病毒量，对照组小鼠在感染后第3天达到较高的病毒滴度，每毫升血清可检测约8.6x10⁷病毒拷贝数(图10D)，并且在6-8天死亡时仍维持较高病毒滴度，而所有免疫小鼠在感染后血清里都检测不到病毒(图10E和10F)，说明疫苗能够很好的保护小鼠抵抗高病毒量引起的病毒血症。

为了检测疫苗能够保护小鼠器官不受感染，Ifnar1^-/-小鼠免疫高剂量疫苗，一组小鼠注射PBS作为对照，4周后腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1，分别在第8天和第16天取组织器官提RNA进行病毒定量，对照组小鼠的脑、脊髓、睾丸、脾脏、肝都能检测到较高的病毒量(图10G)，尤其是睾丸组织从感染后第8天到第16天，病毒量上升到每克组织约10⁹病毒拷贝数，而免疫组小鼠在所有实验检测的5个器官中都检测不到病毒(图10G)，说明AdC7-M/E疫苗一次免疫就能够实现清除性免疫，保护小鼠组织器官不受感染。

实施例10AdC7-M/E疫苗对小鼠睾丸的保护作用

我们之前的研究已经发现寨卡病毒感染Ifnar1^-/-小鼠能够引起严重的睾丸损伤，包括睾丸炎及睾丸萎缩，睾丸内部组织细胞被破坏死亡。因此我们试图检测疫苗能否保护Ifnar1^-/-小鼠睾丸不受寨卡病毒感染的损伤。第一组(Mock组)不做任何处理，第二组(Sham组)注射PBS作为对照，第三组Ifnar1^-/-小鼠免疫高剂量AdC7-M/E，4周后AdC7-M/E组和Sham组腹腔注射5x10⁴PFU ZIKV-SMGC-1，Mock注射PBS。分别在16天和30天解剖取出睾丸检测质量和进行组织切片分析。结果可见Sham组小鼠睾丸与Mock组相比，在第16天形状变小(图11A)，质量下降(图11B)，第30天时更加明显(图11A和11B)。而免疫组小鼠能保持正常的大小，质量也没有下降(图11A和11B)。

组织形态分析可见Sham组小鼠在感染后第16天睾丸已经有明显的损伤，形态被破坏，生精小管损失(图12B1和12B2)，睾丸内填充了纤维组织和炎症细胞，在第30天几乎完全破坏(图12E1和12E2)。而免疫组小鼠能够和未感染病毒小鼠一样维持正常的睾丸形态，没有任何损伤(图12A1，12A2，12C1，12C2，12D1，12D2，12F1和12F2)，说明AdC7-M/E疫苗能够完全保护小鼠睾丸不受寨卡病毒感染的损伤。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcaaga ggagcgccgg cagcatcatg tggctggcca gcctggccgt ggtgattgcc 60

tgtgccggag cc 72

<210> 2

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccgtgaccc tgccttccca ctccaccagg aagctccaaa caaggagcca gacctggtta 60

gaaagcaggg agtacaccaa gcacctgatc agggtcgaaa actggatctt caggaatccc 120

ggcttcgctc tggctgctgc cgctatcgct tggctgctcg gctccagcac ctcccagaag 180

gtgatctacc tggtgatgat cctgctgatc gcccctgctt attccatcag gtgcatcggc 240

gtgtccaaca gggattttgt cgaaggaatg tccggcggca catgggtcga cgtggtgtta 300

gaacatggcg gctgcgtgac agtgatggcc caggacaaac ccaccgtgga catcgaactc 360

gtgaccacca ccgtgtccaa catggccgag gtgagaagct actgctacga ggccagcatc 420

tccgacatgg ccagcgacag cagatgcccc acacagggcg aagcctacct ggacaagcag 480

agcgacaccc agtatgtgtg taagaggacc ctggtggaca ggggctgggg aaatggctgc 540

ggcctgtttg gaaagggctc cctggtgacc tgcgccaagt ttgcctgcag caagaagatg 600

accggcaaaa gcatccagcc tgagaacctg gaatacagga tcatgctcag cgtgcatggc 660

tcccagcact ccggcatgat cgtgaacgat accggccacg aaaccgacga aaacagagcc 720

aaggtggaga tcacccctaa ttcccccaga gccgaagcta cactgggcgg ctttggctcc 780

ctgggactgg actgcgaacc cagaaccggc ctggacttta gcgacctcta ctacctgaca 840

atgaacaaca agcattggct ggtgcataag gagtggttcc atgacatccc tctgccctgg 900

cacgccggcg ccgacaccgg aaccccccac tggaataaca aggaagccct cgtggagttt 960

aaggacgccc acgctaaaag gcagaccgtg gtggtgctgg gatcccagga aggcgctgtg 1020

cacaccgctc tcgctggcgc tctggaggct gagatggatg gcgccaaagg aaggctctcc 1080

tccggccatc tgaaatgcag actgaagatg gacaagctga ggctgaaggg cgtgagctat 1140

tccctgtgca ccgccgcctt caccttcaca aagatccccg ccgagaccct ccacggcaca 1200

gtgacagtgg aggtccaata tgccggaacc gacggcccct gtaaagtgcc tgcccagatg 1260

gctgtggata tgcagaccct gacacccgtg ggcaggctca ttaccgctaa ccccgtgatt 1320

acagagagca ccgagaactc caagatgatg ctggagctgg accccccctt tggcgactcc 1380

tacatcgtga ttggcgtggg cgagaagaaa atcacccacc attggcatag gagcggcagc 1440

accattggca aggccttcga ggccaccgtg agaggagcca agaggatggc cgtgctggga 1500

gacacagctt gggatttcgg cagcgtgggc ggagccctca atagcctggg caagggaatc 1560

catcagatct tcggcgctgc cttcaagagc ctgttcggcg gcatgagctg gttctcccag 1620

atcctgatcg gcaccctgct ggtgtggctg ggcctgaaca caaagaacgg cagcatctcc 1680

ctgatgtgtc tcgccctggg aggagtgctg atctttctgt ccacagctgt gagcgcttaa 1740

<210> 3

<211> 34274

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 60

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 120

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 180

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 240

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca aagctcacgc tgtaggtatc 300

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 360

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 420

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 480

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 540

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 600

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 660

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 720

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 780

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 840

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 900

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 960

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 1020

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 1080

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 1140

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 1200

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 1260

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 1320

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 1380

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 1440

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 1500

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 1560

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 1620

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 1680

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 1740

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 1800

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 1860

tgacattaac ctataaaaat agttaattaa catcatcaat aatatacctc aaacttttgg 1920

tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga atttggggag ggaggaaggt gattggccga 1980

gagacgggcg accgttaggg gcggggcggg tgacgttttt aatacgtggc cgtgaggcgg 2040

agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg 2100

aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag 2160

tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg 2220

cgtttatggc agggaggagt atttgccgag ggccgagtag actttgaccg attacgtggg 2280

ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt 2340

ttacgtataa ctataacggt cctaaggtag cgaaagctca gatctcccga tcccctatgg 2400

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatct gctccctgct 2460

tgtgtgttgg aggtcgctga gtagtgcgcg agcaaaattt aagctacaac aaggcaaggc 2520

ttgaccgaca attgcatgaa gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgcgat 2580

gtacgggcca gatatacgcg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 2640

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 2700

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 2760

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa 2820

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 2880

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 2940

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 3000

tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 3060

gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 3120

aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 3180

agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact 3240

cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacgggc cctctagagc caccatgggc 3300

aagaggagcg ccggcagcat catgtggctg gccagcctgg ccgtggtgat tgcctgtgcc 3360

ggagccgccg tgaccctgcc ttcccactcc accaggaagc tccaaacaag gagccagacc 3420

tggttagaaa gcagggagta caccaagcac ctgatcaggg tcgaaaactg gatcttcagg 3480

aatcccggct tcgctctggc tgctgccgct atcgcttggc tgctcggctc cagcacctcc 3540

cagaaggtga tctacctggt gatgatcctg ctgatcgccc ctgcttattc catcaggtgc 3600

atcggcgtgt ccaacaggga ttttgtcgaa ggaatgtccg gcggcacatg ggtcgacgtg 3660

gtgttagaac atggcggctg cgtgacagtg atggcccagg acaaacccac cgtggacatc 3720

gaactcgtga ccaccaccgt gtccaacatg gccgaggtga gaagctactg ctacgaggcc 3780

agcatctccg acatggccag cgacagcaga tgccccacac agggcgaagc ctacctggac 3840

aagcagagcg acacccagta tgtgtgtaag aggaccctgg tggacagggg ctggggaaat 3900

ggctgcggcc tgtttggaaa gggctccctg gtgacctgcg ccaagtttgc ctgcagcaag 3960

aagatgaccg gcaaaagcat ccagcctgag aacctggaat acaggatcat gctcagcgtg 4020

catggctccc agcactccgg catgatcgtg aacgataccg gccacgaaac cgacgaaaac 4080

agagccaagg tggagatcac ccctaattcc cccagagccg aagctacact gggcggcttt 4140

ggctccctgg gactggactg cgaacccaga accggcctgg actttagcga cctctactac 4200

ctgacaatga acaacaagca ttggctggtg cataaggagt ggttccatga catccctctg 4260

ccctggcacg ccggcgccga caccggaacc ccccactgga ataacaagga agccctcgtg 4320

gagtttaagg acgcccacgc taaaaggcag accgtggtgg tgctgggatc ccaggaaggc 4380

gctgtgcaca ccgctctcgc tggcgctctg gaggctgaga tggatggcgc caaaggaagg 4440

ctctcctccg gccatctgaa atgcagactg aagatggaca agctgaggct gaagggcgtg 4500

agctattccc tgtgcaccgc cgccttcacc ttcacaaaga tccccgccga gaccctccac 4560

ggcacagtga cagtggaggt ccaatatgcc ggaaccgacg gcccctgtaa agtgcctgcc 4620

cagatggctg tggatatgca gaccctgaca cccgtgggca ggctcattac cgctaacccc 4680

gtgattacag agagcaccga gaactccaag atgatgctgg agctggaccc cccctttggc 4740

gactcctaca tcgtgattgg cgtgggcgag aagaaaatca cccaccattg gcataggagc 4800

ggcagcacca ttggcaaggc cttcgaggcc accgtgagag gagccaagag gatggccgtg 4860

ctgggagaca cagcttggga tttcggcagc gtgggcggag ccctcaatag cctgggcaag 4920

ggaatccatc agatcttcgg cgctgccttc aagagcctgt tcggcggcat gagctggttc 4980

tcccagatcc tgatcggcac cctgctggtg tggctgggcc tgaacacaaa gaacggcagc 5040

atctccctga tgtgtctcgc cctgggagga gtgctgatct ttctgtccac agctgtgagc 5100

gcttaaggta ccaagcttaa gtttaaaccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 5160

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 5220

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 5280

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 5340

gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gcagatctgc 5400

agatctgaat tcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc atatgctggc 5460

caccgtgcat gtgacctcgc acccccgcaa gacatggccc gagttcgagc acaacgtcat 5520

gacccgatgc aatgtgcacc tggggtcccg ccgaggcatg ttcatgccct accagtgcaa 5580

catgcaattt gtgaaggtgc tgctggagcc cgatgccatg tccagagtga gcctgacggg 5640

ggtgtttgac atgaatgtgg agctgtggaa aattctgaga tatgatgaat ccaagaccag 5700

gtgccgggcc tgcgaatgcg gaggcaagca cgccaggctt cagcccgtgt gtgtggaggt 5760

gacggaggac ctgcgacccg atcatttggt gttgtcctgc aacgggacgg agttcggctc 5820

cagcggggaa gaatctgact agagtgagta gtgtttgggg gaggtggagg gcttgtatga 5880

ggggcagaat gactaaaatc tgtgtttttc tgtgtgttgc agcagcatga gcggaagcgc 5940

ctcctttgag ggaggggtat tcagccctta tctgacgggg cgtctcccct cctgggcggg 6000

agtgcgtcag aatgtgatgg gatccacggt ggacggccgg cccgtgcagc ccgcgaactc 6060

ttcaaccctg acctacgcga ccctgagctc ctcgtccgtg gacgcagctg ccgccgcagc 6120

tgctgcttcc gccgccagcg ccgtgcgcgg aatggccctg ggcgccggct actacagctc 6180

tctggtggcc aactcgactt ccaccaataa tcccgccagc ctgaacgagg agaagctgct 6240

gctgctgatg gcccagctcg aggccctgac ccagcgcctg ggcgagctga cccagcaggt 6300

ggctcagctg caggcggaga cgcgggccgc ggttgccacg gtgaaaacca aataaaaaat 6360

gaatcaataa ataaacggag acggttgttg attttaacac agagtcttga atctttattt 6420

gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga tcattgagca cccggtggat 6480

tttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg tacatgggca tgagcccgtc 6540

ccgggggtgg aggtagctcc attgcagggc ctcgtgctcg ggggtggtgt tgtaaatcac 6600

ccagtcatag caggggcgca gggcgtggtg ctgcacgatg tccttgagga ggagactgat 6660

ggccacgggc agccccttgg tgtaggtgtt gacgaacctg ttgagctggg agggatgcat 6720

gcggggggag atgagatgca tcttggcctg gatcttgaga ttggcgatgt tcccgcccag 6780

atcccgccgg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg gtgtatccgg tgcacttggg 6840

gaatttgtca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat ttggagacgc ccttgtgacc 6900

gcccaggttt tccatgcact catccatgat gatggcgatg ggcccgtggg cggcggcctg 6960

ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc gtagttgtgg tcctgggtga gctcgtcata 7020

ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gcccgactgg gggacgaagg tgccctcgat 7080

cccgggggcg tagttgccct cgcagatctg catctcccag gccttgagct cggagggggg 7140

gatcatgtcc acctgcgggg cgatgaaaaa aacggtttcc ggggcggggg agatgagctg 7200

ggccgaaagc aggttccgga gcagctggga cttgccgcag ccggtggggc cgtagatgac 7260

cccgatgacc ggctgcaggt ggtagttgag ggagagacag ctgccgtcct cgcggaggag 7320

gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac atgcatgttc tcgcgcacga gttccgccag 7380

gaggcgctcg ccccccagcg agaggagctc ttgcagcgag gcgaagtttt tcagcggctt 7440

gagyccgtcg gccatgggca ttttggagag ggtctgttgc aagagttcca gacggtccca 7500

gagctcggtg atgtgctcta gggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt tcgcgggttg 7560

gggcgactgc gggagtaggg caccaggcga tgggcgtcca gcgaggccag ggtccggtcc 7620

ttccagggtc gcagggtccg cgtcagcgtg gtctccgtca cggtgaaggg gtgcgcgccg 7680

ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc tggtcgagaa ccgctcccgg 7740

tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgagcatga gttcgtagtt gagcgcctcg 7800

gccgcgtggc ccttggcgcg gagcttacct ttggaagtgt gtccgcagac gggacagagg 7860

agggacttga gggcgtagag cttgggggcg aggaagacgg actcgggggc gtaggcgtcc 7920

gcgccgcagc tggcgcagac ggtctcgcac tccacgagcc aggtgaggtc gggccggttg 7980

gggtcaaaaa cgaggtttcc tccgtgcttt ttgatgcgtt tcttacctct ggtctccatg 8040

agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt ccccgtagac cgactttatg 8100

ggccggtcct cgagcggggt gccgcggtcc tcgtcgtaga ggaaccccgc ccactccgag 8160

acgaaggccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt gggaggggta gcggtcgttg 8220

tccaccagcg ggtccacctt ctccagggta tgcaagcaca tgtccccctc gtccacatcc 8280

aggaaggtga ttggcttgta agtgtaggcc acgtgaccgg gggtcccggc cgggggggta 8340

taaaaggggg cgggcccctg ctcgtcctca ctgtcttccg gatcgctgtc caggagcgcc 8400

agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gctggcataa cctcggcact caggttgtca 8460

gtttctagaa acgaggagga tttgatattg acggtgccgt tggagacgcc tttcatgagc 8520

ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt cgagcttggt ggcgaaggag 8580

ccgtagaggg cgttggagag gagcttggcg atggagcgca tggtctggtt cttttccttg 8640

tcggcgcgct ccttggcggc gatgttgagc tgcacgtact cgcgcgccac gcacttccat 8700

tcggggaaga cggtggtgag ctcgtcgggc acgattctga cccgccagcc gcggttgtgc 8760

agggtgatga ggtccacgct ggtggccacc tcgccgcgca ggggctcgtt ggtccagcag 8820

aggcgcccgc ccttgcgcga gcagaagggg ggcagcgggt ccagcatgag ctcgtcgggg 8880

gggtcggcgt ccacggtgaa gatgccgggc agaagctcgg ggtcgaagta gctgatgcag 8940

gtgtccagat cgtccagcgc cgcttgccag tcgcgcacgg ccagcgcgcg ctcgtagggg 9000

ctgaggggcg tgccccaggg catggggtgc gtgagcgcgg aggcgtacat gccgcagatg 9060

tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggacg ccgatgtagg tggggtagca gcgccccccg 9120

cggatgctgg cgcgcacgta gtcgtacagc tcgtgcgagg gcgcgaggag ccccgtgccg 9180

aggttggagc gttgcggctt ttcggcgcgg tagacgatct ggcggaagat ggcgtgggag 9240

ttggaggaga tggtgggcct ctggaagatg ttgaagtggg cgtggggcag gccgaccgag 9300

tccctgatga agtgggcgta ggagtcctgc agcttggcga cgagctcggc ggtgacgagg 9360

acgtccaggg cgcagtagtc gagggtctct tggatgatgt cgtacttgag ctggcccttc 9420

tgcttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt ccttccagta ctcttcgagg 9480

gggaacccgt cctgatcggc acggtaagag cccaccatgt agaactggtt gacggccttg 9540

taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaagctt gtgcggcctt gcgcagggag 9600

gtgtgggtga gggcgaaggt gtcgcgcacc atgaccttga ggaactggtg cttgaagtcg 9660

aggtcgtcgc agccgccctg ctcccagagc tggaagtccg tgcgcttctt gtaggcgggg 9720

ttgggcaaag cgaaagtaac atcgttgaag aggatcttgc ccgcgcgggg catgaagttg 9780

cgagtgatgc ggaaaggctg gggcacctcg gcccggttgt tgatgacctg ggcggcgagg 9840

acgatctcgt cgaagccgtt gatgttgtgc ccgacgatgt agagttccac gaatcgcggg 9900

cggcccttaa cgtggggcag cttcttgagc tcgtcgtagg tgagctcggc ggggtcgctg 9960

agcccgtgct gctcgagggc ccagtcggcg acgtgggggt tggcgctgag gaaggaagtc 10020

cagagatcca cggccagggc ggtctgcaag cggtcccggt actgacggaa ctgctggccc 10080

acggccattt tttcgggggt gacgcagtag aaggtgcggg ggtcgccgtg ccagcggtcc 10140

cacttgagct ggagggcgag gtcgtgggcg agctcgacga gcggcgggtc cccggagagt 10200

ttcatgacca gcatgaaggg gacgagctgc ttgccgaagg accccatcca ggtgtaggtt 10260

tccacatcgt aggtgaggaa gagcctttcg gtgcgaggat gcgagccgat ggggaagaac 10320

tggatctcct gccaccagtt ggaggaatgg ctgttgatgt gatggaagta gaaatgccga 10380

cggcgcgccg agcactcgtg cttgtgttta tacaagcgtc cgcagtgctc gcaacgctgc 10440

acgggatgca cgtgctgcac gagctgtacc tgggttcctt tgacgaggaa tttcagtggg 10500

cagtggagcg ctggcggctg catctggtgc tgtactacgt cctggccatc ggcgtggcca 10560

tcgtctgcct cgatggtggt catgctgacg agcccgcgcg ggaggcaggt ccagacttcg 10620

gctcggacgg gtcggagagc gaggacgagg gcgcgcaggc cggagctgtc cagggtcctg 10680

agacgctgcg gagtcaggtc agtgggcagc ggcggcgcgc ggttgacttg caggagcttt 10740

tccagggcgc gcgggaggtc cagatggtac ttgatctcca cggcgccgtt ggtggcgacg 10800

tccacggctt gcagggtccc gtgcccctgg ggcgccacca ccgtgccccg tttcttcttg 10860

ggcgctgctt ccatgccggt cagaagcggc ggcgaggacg cgcgccgggc ggcaggggcg 10920

gctcgggacc cggaggcagg ggcggcaggg gcacgtcggc gccgcgcgcg ggcaggttct 10980

ggtactgcgc ccggagaaga ctggcgtgag cgacgacgcg acggttgacg tcctggatct 11040

gacgcctctg ggtgaaggcc acgggacccg tgagtttgaa cctgaaagag agttcgacag 11100

aatcaatctc ggtatcgttg acggcggcct gccgcaggat ctcttgcacg tcgcccgagt 11160

tgtcctggta ggcgatctcg gtcatgaact gctcgatctc ctcctcctga aggtctccgc 11220

ggccggcgcg ctcgacggtg gccgcgaggt cgttggagat gcggcccatg agctgcgaga 11280

aggcgttcat gccggcctcg ttccagacgc ggctgtagac cacggctccg tcggggtcgc 11340

gcgcgcgcat gaccacctgg gcgaggttga gctcgacgtg gcgcgtgaag accgcgtagt 11400

tgcagaggcg ctggtagagg tagttgagcg tggtggcgat gtgctcggtg acgaagaagt 11460

acatgatcca gcggcggagc ggcatctcgc tgacgtcgcc cagggcttcc aagcgctcca 11520

tggcctcgta gaagtccacg gcgaagttga aaaactggga gttgcgcgcc gagacggtca 11580

actcctcctc cagaagacgg atgagctcag cgatggtggc gcgcacctcg cgctcgaagg 11640

ccccgggggg ctcctcttct tccatctctt cctcctccac taacatctct tctacttcct 11700

cctcaggagg cggcggcggg ggaggggccc tgcgtcgccg gcggcgcacg ggcagacggt 11760

cgatgaagcg ctcgatggtc tccccgcgcc ggcgacgcat ggtctcggtg acggcgcgcc 11820

cgtcctcgcg gggccgcagc gtgaagacgc cgccgcgcat ctccaggtgg ccgccggggg 11880

ggtctccgtt gggcagggag agggcgctga cgatgcatct tatcaattgg cccgtaggga 11940

ctccgcgcaa ggacctgagc gtctcgagat ccacgggatc cgaaaaccgc tgaacgaagg 12000

cttcgagcca gtcgcagtcg caaggtaggc tgagcccggt ttcttgttct tcggggattt 12060

cgggaggcgg gcgggcgatg ctgctggtga tgaagttgaa gtaggcggtc ctgagacggc 12120

ggatggtggc gaggagcacc aggtccttgg gcccggcttg ctggatgcgc agacggtcgg 12180

ccatgcccca ggcgtggtcc tgacacctgg cgaggtcctt gtagtagtcc tgcatgagcc 12240

gctccacggg cacctcctcc tcgcccgcgc ggccgtgcat gcgcgtgagc ccgaacccgc 12300

gctggggctg gacgagcgcc aggtcggcga cgacgcgctc ggcgaggatg gcctgctgta 12360

tctgggtgag ggtggtctgg aagtcgtcga agtcgacgaa gcggtggtag gctccggtgt 12420

tgatggtata ggagcagttg gccatgacgg accagttgac ggtctggtgg ccgggtcgca 12480

cgagctcgtg gtacttgagg cgcgagtagg cgcgcgtgtc gaagatgtag tcgttgcagg 12540

tgcgcacgag gtactggtat ccgacgagga agtgcggcgg cggctggcgg tagagcggcc 12600

atcgctcggt ggcgggggcg ccgggcgcga ggtcctcgag catgaggcgg tggtagccgt 12660

agatgtacct ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt ggaggcgcgc gggaactcgc 12720

ggacgcggtt ccagatgttg cgcagcggca ggaagtagtt catggtggcc gcggtctggc 12780

ccgtgaggcg cgcgcagtcg tggatgctct agacatacgg gcaaaaacga aagcggtcag 12840

cggctcgact ccgtggcctg gaggctaagc gaacgggttg ggctgcgcgt gtaccccggt 12900

tcgaatctcg aatcaggctg gagccgcagc taacgtggta ctggcactcc cgtctcgacc 12960

caagcctgct aacgaaacct ccaggatacg gaggcgggtc gttttttggc cttggtcgct 13020

ggtcatgaaa aactagtaag cgcggaaagc gaccgcccgc gatggctcgc tgccgtagtc 13080

tggagaaaga atcgccaggg ttgcgttgcg gtgtgccccg gttcgagcct cagcgctcgg 13140

cgccggccgg attccgcggc taacgtgggc gtggctgccc cgtcgtttcc aagacccctt 13200

agccagccga cttctccagt tacggagcga gcccctcttt ttcttgtgtt tttgccagat 13260

gcatcccgta ctgcggcaga tgcgccccca ccctccacct caaccgcccc taccgccgca 13320

gcagcagcaa cagccggcgc ttctgccccc gccccagcag cagccagcca ctaccgcggc 13380

ggccgccgtg agcggagccg gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg gcgaggggct 13440

ggcgcggctg ggggcgtcgt cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc 13500

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ggagatgcgc gcctcccgct tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa 13620

gcgggtgctg agggacgagg atttcgaggc ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg 13680

cgcgcacgtg gccgcggcca acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag 13740

caacttccaa aaatccttca acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg aggaggtgac 13800

cctgggcctg atgcacctgt gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc ccacgagcaa 13860

gccgctgacg gcgcagctgt ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg agacgttcag 13920

ggaggcgctg ctgaatatca ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat 13980

tctgcagagc atcgtggtgc aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc tggcggctat 14040

caacttctcg gtgctgagcc tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca agaccccgta 14100

cgtgcccata gacaaggagg tgaagatcga cgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt 14160

gctgaccctg agcgacgatc tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc gcgcggtgag 14220

cgccagccgc cggcgcgagc tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc agcgggccct 14280

gaccggggcc gggaccgagg gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc tgcgctggca 14340

gcccagccgc cgggccttgg aagctgccgg cggttccccc tacgtggagg aggtggacga 14400

tgaggaggag gagggcgagt acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg 14460

cagcaacagc caccgcctcc tgatcccgcg atgcgggcgg cgctgcagag ccagccgtcc 14520

ggcattaact cctcggacga ttggacccag gccatgcaac gcatcatggc gctgacgacc 14580

cgcaatcccg aagcctttag acagcagcct caggccaacc ggctctcggc catcctggag 14640

gccgtggtgc cctcgcgctc gaaccccacg cacgagaagg tgctggccat cgtgaacgcg 14700

ctggtggaga acaaggccat ccgcggcgac gaggccgggc tggtgtacaa cgcgctgctg 14760

gagcgcgtgg cccgctacaa cagcaccaac gtgcagacga acctggaccg catggtgacc 14820

gacgtgcgcg aggcggtgtc gcagcgcgag cggttccacc gcgagtcgaa cctgggctcc 14880

atggtggcgc tgaacgcctt cctgagcacg cagcccgcca acgtgccccg gggccaggag 14940

gactacacca acttcatcag cgcgctgcgg ctgatggtgg ccgaggtgcc ccagagcgag 15000

gtgtaccagt cggggccgga ctacttcttc cagaccagtc gccagggctt gcagaccgtg 15060

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gaccgcgcga cggtgtcgag cctgctgacg ccgaactcgc gcctgctgct gctgctggtg 15180

gcgcccttca cggacagcgg cagcgtgagc cgcgactcgt acctgggcta cctgcttaac 15240

ctgtaccgcg aggccatcgg gcaggcgcac gtggacgagc agacctacca ggagatcacc 15300

cacgtgagcc gcgcgctggg ccaggaggac ccgggcaacc tggaggccac cctgaacttc 15360

ctgctgacca accggtcgca gaagatcccg ccccagtacg cgctgagcac cgaggaggag 15420

cgcatcctgc gctacgtgca gcagagcgtg gggctgttcc tgatgcagga gggggccacg 15480

cccagcgccg cgctcgacat gaccgcgcgc aacatggagc ccagcatgta cgctcgcaac 15540

cgcccgttca tcaataagct gatggactac ttgcatcggg cggccgccat gaactcggac 15600

tactttacca acgccatctt gaacccgcac tggctcccgc cgcccgggtt ctacacgggc 15660

gagtacgaca tgcccgaccc caacgacggg ttcctgtggg acgacgtgga cagcagcgtg 15720

ttctcgccgc gccccgccac caccgtgtgg aagaaagagg gcggggaccg gcggccgtcc 15780

tcggcgctgt ccggtcgcgc gggtgctgcc gcggcggtgc ctgaggccgc cagccccttc 15840

ccgagcctgc ccttttcgct gaacagcgtg cgcagcagcg agctgggtcg gctgacgcgg 15900

ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtacctg aacgactcct tgttgaggcc cgagcgcgag 15960

aagaacttcc ccaataacgg gatagagagc ctggtggaca agatgagccg ctggaagacg 16020

tacgcgcacg agcacaggga cgagccccga gctagcagca gcgcaggcac ccgtagacgc 16080

cagcgacacg acaggcagcg gggtctggtg tgggacgatg aggattccgc cgacgacagc 16140

agcgtgttgg acttgggtgg gagtggtggt ggtaacccgt tcgctcactt gcgcccccgt 16200

atcgggcgcc tgatgtaaga atctgaaaaa ataaaaaacg gtactcacca aggccatggc 16260

gaccagcgtg cgttcttctc tgttgtttgt agtagtatga tgaggcgcgt gtacccggag 16320

ggtcctcctc cctcgtacga gagcgtgatg cagcaggcgg tggcggcggc gatgcagccc 16380

ccgctggagg cgccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg gcggaacagc 16440

attcgttact cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct ggtggacaac 16500

aagtcggcgg acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt cctgaccacc 16560

gtggtgcaga acaacgattt cacccccacg gaggccagca cccagaccat caactttgac 16620

gagcgctcgc ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat gcccaacgtg 16680

aacgagttca tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcgcg caagaccccc 16740

aatggggtcg cggtggatga gaattatgat ggtagtcagg acgagctgac ttacgagtgg 16800

gtggagtttg agctgcccga gggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga tctgatgaac 16860

aacgccatca tcgacaacta cttggcggtg gggcgtcaga acggggtgct ggagagcgac 16920

atcggcgtga agttcgacac gcgcaacttc cggctgggct gggaccccgt gaccgagctg 16980

gtgatgccgg gcgtgtacac caacgaggcc ttccaccccg acatcgtcct gctgcccggc 17040

tgcggcgtgg acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcatccg caagcggcag 17100

cccttccagg agggcttcca gatcctgtac gaggacctgg aggggggcaa catccccgcg 17160

ctcttggatg tcgaagccta tgagaaaagc aaggaggagg ccgccgcagc ggcgaccgca 17220

gccgtggcca ccgcctctac cgaggtgcgg ggcgataatt ttgctagcgc cgcggcagtg 17280

gccgaggcgg ctgaaaccga aagtaagata gtcatccagc cggtggagaa ggacagcaag 17340

gacaggagct acaacgtgct cgcggacaag aaaaacaccg cctaccgcag ctggtacctg 17400

gcctacaact acggcgaccc cgagaagggc gtgcgctcct ggacgctgct caccacctcg 17460

gacgtcacct gcggcgtgga gcaagtctac tggtcgctgc ccgacatgat gcaagacccg 17520

gtcaccttcc gctccacgcg tcaagttagc aactacccgg tggtgggcgc cgagctcctg 17580

cccgtctact ccaagagctt cttcaacgag caggccgtct actcgcagca gctgcgcgcc 17640

ttcacctcgc tcacgcacgt cttcaaccgc ttccccgaga accagatcct cgtccgcccg 17700

cccgcgccca ccattaccac cgtcagtgaa aacgttcctg ctctcacaga tcacgggacc 17760

ctgccgctgc gcagcagtat ccggggagtc cagcgcgtga ccgtcactga cgccagacgc 17820

cgcacctgcc cctacgtcta caaggccctg ggcgtagtcg cgccgcgcgt cctctcgagc 17880

cgcaccttct aaaaaatgtc cattctcatc tcgcccagta ataacaccgg ttggggcctg 17940

cgcgcgccca gcaagatgta cggaggcgct cgccaacgct ccacgcaaca ccccgtgcgc 18000

gtgcgcgggc acttccgcgc tccctggggc gccctcaagg gccgcgtgcg ctcgcgcacc 18060

accgtcgacg acgtgatcga ccaggtggtg gccgacgcgc gcaactacac gcccgccgcc 18120

gcgcccgcct ccaccgtgga cgccgtcatc gacagcgtgg tggccgatgc gcgccggtac 18180

gcccgcgcca agagccggcg gcggcgcatc gcccggcggc accggagcac ccccgccatg 18240

cgcgcggcgc gagccttgct gcgcagggcc aggcgcacgg gacgcagggc catgctcagg 18300

gcggccagac gcgcggcctc cggcagcagc agcgccggca ggacccgcag acgcgcggcc 18360

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gtgcgcgacg ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc tcgcacttga 18480

agatgctgac ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc aagcgcaaat 18540

acaaggaaga gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccccgcg gtgaaggagg 18600

aaagaaagcc ccgcaaactg aagcgggtca aaaaggacaa aaaggaggag gaagatgtgg 18660

acggactggt ggagtttgtg cgcgagttcg ccccccggcg gcgcgtgcag tggcgcgggc 18720

ggaaagtgaa accggtgctg cggcccggca ccacggtggt cttcacgccc ggcgagcgtt 18780

ccggctccgc ctccaagcgc tcctacgacg aggtgtacgg ggacgaggac atcctcgagc 18840

aggcggtcga gcgtctgggc gagtttgctt acggcaagcg cagccgcccc gcgcccttga 18900

aagaggaggc ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc cacgccgagc ctgaagccgg 18960

tgaccctgca gcaggtgctg ccgagcgcgg cgccgcgccg gggcttcaag cgcgagggcg 19020

gcgaggatct gtacccgacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaggacg 19080

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cctggatgcc ggcgccggct tccaccactc gccgaagacg caagtacggc gcggccagcc 19320

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cgcgcttcta ccgcggctac accagcagcc gccgcaagac caccacccgc cgccgccgtc 19440

gtcgcacccg ccgcagcagc accgcgactt ccgccgccgc cctggtgcgg agagtgtacc 19500

gcagcgggcg cgagcctctg accctgccgc gcgcgcgcta ccacccgagc atcgccattt 19560

aactctgccg tcgcctccta cttgcagata tggccctcac atgccgcctc cgcgtcccca 19620

ttacgggcta ccgaggaaga aagccgcgcc gtagaaggct gacggggaac gggctgcgtc 19680

gccatcacca ccggcggcgg cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg 19740

cgctgatccc catcatcgcc gcggcgatcg gggcgatccc cggcatagct tccgtggcgg 19800

tgcaggcctc tcagcgccac tgagacacag cttggaaaat ttgtaataaa aaaatggact 19860

gacgctcctg gtcctgtgat gtgtgttttt agatggaaga catcaatttt tcgtccctgg 19920

caccgcgaca cggcacgcgg ccgtttatgg gcacctggag cgacatcggc aacagccaac 19980

tgaacggggg cgccttcaat tggagcagtc tctggagcgg gcttaagaat ttcgggtcca 20040

cgctcaaaac ctatggcaac aaggcgtgga acagcagcac agggcaggcg ctgagggaaa 20100

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gggtggtgga cctggccaac caggccgtgc agaaacagat caacagccgc ctggacgcgg 20220

tcccgcccgc ggggtccgtg gagatgcccc aggtggagga ggagctgcct cccctggaca 20280

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agccgccccc gtacgaggag gcggtgaaac tgggtctgcc caccacgcgg cccgtggcgc 20400

ctctggccac cggggtgctg aaacccagca gcagcagcca gcccgcgacc ctggacttgc 20460

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cgcgcgcccc ccgaggccgc ccccaggcga actggcagag cactctgaac agcatcgtgg 20580

gtctgggagt gcagagtgtg aagcgccgcc gctgctatta aaagacactg tagcgcttaa 20640

cttgcttgtc tgtgtgtata tgtatgtccg ccgaccagaa ggaggaagag gcgcgtcgcc 20700

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acaggacgct tcggagtacc tgagtccggg tctggtgcag ttcgcccgcg ccacagacac 20820

ctacttcagt ctggggaaca agtttaggaa ccccacggtg gcgcccacgc acgatgtgac 20880

caccgaccgc agccagcggc tgacgctgcg cttcgtgccc gtggaccgcg aggacaacac 20940

ctactcgtac aaagtgcgct acacgctggc cgtgggcgac aaccgcgtgc tggacatggc 21000

cagcacctac tttgacatcc gcggcgtgct ggatcggggg cccagcttca aaccctactc 21060

cggcaccgcc tacaacagcc tggctcccaa gggagcgccc aacacttgcc agtggacata 21120

taaagctggt gatactgata cagaaaaaac ctatacatat ggaaatgcac ctgtgcaagg 21180

cattagcatt acaaaggatg gtattcaact tggaactgac agcgatggtc aggcaatcta 21240

tgcagacgaa acttatcaac cagagcctca agtgggtgat gctgaatggc atgacatcac 21300

tggtactgat gaaaaatatg gaggcagagc tcttaagcct gacaccaaaa tgaagccttg 21360

ctatggttct tttgccaagc ctaccaataa agaaggaggc caggcaaatg tgaaaaccga 21420

aacaggcggt accaaagaat atgacattga catggcattc ttcgataatc gaagtgcagc 21480

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actggcccga ccgccccatg gacaagaacc ccaccatgaa cttgctgacg ggggtgccca 24000

acggcatgct ccagtcgccc caggtggaac ccaccctgcg ccgcaaccag gaggcgctct 24060

accgcttcct caacgcccac tccgcctact ttcgctccca ccgcgcgcgc atcgagaagg 24120

ccaccgcctt cgaccgcatg aatcaagaca tgtaatccgg tgtgtgtatg tgaatgcttt 24180

attcatcata ataaacagca catgtttatg ccaccttctc tgaggctctg actttattta 24240

gaaatcgaag gggttctgcc ggctctcggc atggcccgcg ggcagggata cgttgcggaa 24300

ctggtacttg ggcagccact tgaactcggg gatcagcagc ttcggcacgg ggaggtcggg 24360

gaacgagtcg ctccacagct tgcgcgtgag ttgcagggcg cccagcaggt cgggcgcgga 24420

gatcttgaaa tcgcagttgg gacccgcgtt ctgcgcgcga gagttacggt acacggggtt 24480

gcagcactgg aacaccatca gggccgggtg cttcacgctc gccagcaccg tcgcgtcggt 24540

gatgccctcc acgtccagat cctcggcgtt ggccatcccg aagggggtca tcttgcaggt 24600

ctgccgcccc atgctgggca cgcagccggg cttgtggttg caatcgcagt gcagggggat 24660

cagcatcatc tgggcctgct cggagctcat gcccgggtac atggccttca tgaaagcctc 24720

cagctggcgg aaggcctgct gcgccttgcc gccctcggtg aagaagaccc cgcaggactt 24780

gctagagaac tggttggtgg cgcagccagc gtcgtgcacg cagcagcgcg cgtcgttgtt 24840

ggccagctgc accacgctgc gcccccagcg gttctgggtg atcttggccc ggtcggggtt 24900

ctccttcagc gcgcgctgcc cgttctcgct cgccacatcc atctcgatcg tgtgctcctt 24960

ctggatcatc acggtcccgt gcaggcaccg cagcttgccc tcggcctcgg tgcacccgtg 25020

cagccacagc gcgcagccgg tgctctccca gttcttgtgg gcgatctggg agtgcgagtg 25080

cacgaagccc tgcaggaagc ggcccatcat cgtggtcagg gtcttgttgc tggtgaaggt 25140

cagcggaatg ccgcggtgct cctcgttcac atacaggtgg cagatacggc ggtacacctc 25200

gccctgctcg ggcatcagct ggaaggcgga cttcaggtcg ctctccacgc ggtaccggtc 25260

catcagcagc gtcatcactt ccatgccctt ctcccaggcc gaaacgatcg gcaggctcag 25320

ggggttcttc accgttgtca tcttagtcgc cgccgccgaa gtcagggggt cgttctcgtc 25380

cagggtctca aacactcgct tgccgtcctt ctcggtgatg cgcacggggg gaaagctgaa 25440

gcccacggcc gccagctcct cctcggcctg cctttcgtcc tcgctgtcct ggctgatgtc 25500

ttgcaaaggc acatgcttgg tcttgcgggg tttctttttg ggcggcagag gcggcggcgg 25560

agacgtgctg ggcgagcgcg agttctcgct caccacgact atttcttctc cttggccgtc 25620

gtccgagacc acgcggcggt aggcatgcct cttctggggc agaggcggag gcgacgggct 25680

ctcgcggttc ggcgggcggc tggcagagcc ccttccgcgt tcgggggtgc gctcctggcg 25740

gcgctgctct gactgacttc ctccgcggcc ggccattgtg ttccctaggg agcaagcatg 25800

gagactcagc catcgtcgcc aacatcgcca tctgcccccg ccgccgccga cgagaaccag 25860

cagcagcaga atgaaagctt aaccgccccg ccgcccagcc ccacctccga cgccgcagcc 25920

ccagacatgc aagagatgga ggaatccatc gagattgacc tgggctacgt gacgcccgcg 25980

gagcacgagg aggagctggc agcgcgcttt tcagccccgg aagagaacca ccaagagcag 26040

ccagagcagg aagcagagag cgagcagaac caggctgggc tcgagcatgg cgactacctg 26100

agcggggcag aggacgtgct catcaagcat ctggcccgcc aatgcatcat cgtcaaggac 26160

gcgctgctcg accgcgccga ggtgcccctc agcgtggcgg agctcagccg cgcctacgag 26220

cgcaacctct tctcgccgcg cgtgcccccc aagcgccagc ccaacggcac ctgcgagccc 26280

aacccgcgcc tcaacttcta cccggtcttc gcggtgcccg aggccctggc cacctaccac 26340

ctctttttca agaaccaaag gatccccgtc tcctgccgcg ccaaccgcac ccgcgccgac 26400

gccctgctca acctgggccc cggcgcccgc ctacctgata tcgcctcctt ggaagaggtt 26460

cccaagatct tcgagggtct gggcagcgac gagactcggg ccgcgaacgc tctgcaagga 26520

agcggagagg agcatgagca ccacagcgcc ctggtggagt tggaaggcga caacgcgcgc 26580

ctggcggtcc tcaagcgcac ggtcgagctg acccacttcg cctacccggc gctcaacctg 26640

ccccccaagg tcatgagcgc cgtcatggac caggtgctca tcaagcgcgc ctcgcccctc 26700

tcggaggagg agatgcagga ccccgagagc tcggacgagg gcaagcccgt ggtcagcgac 26760

gagcagctgg cgcgctggct gggagcgagt agcacccccc agagcctgga agagcggcgc 26820

aagctcatga tggccgtggt cctggtgacc gtggagctgg agtgtctgcg ccgcttcttc 26880

gccgacgcgg agaccctgcg caaggtcgag gagaacctgc actacctctt cagacacggg 26940

ttcgtgcgcc aggcctgcaa gatctccaac gtggagctga ccaacctggt ctcctacatg 27000

ggcatcctgc acgagaaccg cctggggcag aacgtgctgc acaccaccct gcgcggggag 27060

gcccgccgcg actacatccg cgactgcgtc tacctgtacc tctgccacac ctggcagacg 27120

ggcatgggcg tgtggcagca gtgcctggag gagcagaacc tgaaagagct ctgcaagctc 27180

ctgcagaaga acctcaaggc cctgtggacc gggttcgacg agcgcaccac cgccgcggac 27240

ctggccgacc tcatcttccc cgagcgcctg cggctgacgc tgcgcaacgg gctgcccgac 27300

tttatgagcc aaagcatgtt gcaaaacttt cgctctttca tcctcgaacg ctccgggatc 27360

ctgcccgcca cctgctccgc gctgccctcg gacttcgtgc cgctgacctt ccgcgagtgc 27420

cccccgccgc tctggagcca ctgctacctg ctgcgcctgg ccaactacct ggcctaccac 27480

tcggacgtga tcgaggacgt cagcggcgag ggcctgctcg agtgccactg ccgctgcaac 27540

ctctgcacgc cgcaccgctc cctggcctgc aacccccagc tgctgagcga gacccagatc 27600

atcggcacct tcgagttgca aggccccggc gagggcaagg ggggtctgaa actcaccccg 27660

gggctgtgga cctcggccta cttgcgcaag ttcgtgcccg aggactacca tcccttcgag 27720

atcaggttct acgaggacca atcccagccg cccaaggccg agctgtcggc ctgcgtcatc 27780

acccaggggg ccatcctggc ccaattgcaa gccatccaga aatcccgcca agaatttctg 27840

ctgaaaaagg gccacggggt ctacttggac ccccagaccg gagaggagct caaccccagc 27900

ttcccccagg atgccccgag gaagcagcaa gaagctgaaa gtggagctgc cgccgccgcc 27960

ggaggatttg gaggaagact gggagagcag tcaggcagag gaggaggaga tggaagactg 28020

ggacagcact caggcagagg aggacagcct gcaagacagt ctggaggagg aagacgaggt 28080

ggaggaggca gaggaagaag cagccgccgc cagaccgtcg tcctcggcgg aggaggagaa 28140

agcaagcagc acggatacca tctccgctcc gggtcggggt cgcggcggcc gggcccacag 28200

tagatgggac gagaccgggc gcttcccgaa ccccaccacc cagaccggta agaaggagcg 28260

gcagggatac aagtcctggc gggggcacaa aaacgccatc gtctcctgct tgcaagcctg 28320

cgggggcaac atctccttca cccggcgcta cctgctcttc caccgcgggg tgaacttccc 28380

ccgcaacatc ttgcattact accgtcacct ccacagcccc tactactgtt tccaagaaga 28440

ggcagaaacc cagcagcagc agcagcagca gaaaaccagc ggcagcagct agaaaatcca 28500

cagcggcggc aggtggactg aggatcgcgg cgaacgagcc ggcgcagacc cgggagctga 28560

ggaaccggat ctttcccacc ctctatgcca tcttccagca gagtcggggg caagagcagg 28620

aactgaaagt caagaaccgt tctctgcgct cgctcacccg cagttgtctg tatcacaaga 28680

gcgaagacca acttcagcgc actctcgagg acgccgaggc tctcttcaac aagtactgcg 28740

cgctcactct taaagagtag cccgcgcccg cccacacacg gaaaaaggcg ggaattacgt 28800

caccacctgc gcccttcgcc cgaccatcat catgagcaaa gagattccca cgccttacat 28860

gtggagctac cagccccaga tgggcctggc cgccggcgcc gcccaggact actccacccg 28920

catgaactgg ctcagtgccg ggcccgcgat gatctcacgg gtgaatgaca tccgcgccca 28980

ccgaaaccag atactcctag aacagtcagc gatcaccgcc acgccccgcc atcaccttaa 29040

tccgcgtaat tggcccgccg ccctggtgta ccaggaaatt ccccagccca cgaccgtact 29100

acttccgcga gacgcccagg ccgaagtcca gctgactaac tcaggtgtcc agctggccgg 29160

cggcgccgcc ctgtgtcgtc accgccccgc tcagggtata aagcggctgg tgatccgagg 29220

cagaggcaca cagctcaacg acgaggtggt gagctcttcg ctgggtctgc gacctgacgg 29280

agtcttccaa ctcgccggat cggggagatc ttccttcacg cctcgtcagg ccgtcctgac 29340

tttggagagt tcgtcctcgc agccccgctc gggtggcatc ggcactctcc agttcgtgga 29400

ggagttcact ccctcggtct acttcaaccc cttctccggc tcccccggcc actacccgga 29460

cgagttcatc ccgaacttcg acgccatcag cgagtcggtg gacggctacg attgacggtc 29520

cgtcaccccc ttatccagtg aaataaatat catattgatg atgatttaaa taaaaaataa 29580

tcatttgatt tgaaataaag atacaatcat attgatgatt tgagttttaa aaaataaaga 29640

atcacttact tgaaatctga taccaggtct ctgtccatgt tttctgccaa caccacctca 29700

ctcccctctt cccagctctg gtactgcaga ccccggcggg ctgcaaactt cctccacacg 29760

ctgaagggga tgtcaaattc ctcctgtccc tcaatcttca ttttatcttc tatcagatgt 29820

ccaaaaagcg cgtccgggtg gatgatgact tcgaccccgt ctacccctac gatgcagaca 29880

acgcaccgac cgtgcccttc atcaaccccc ccttcgtctc ttcagatgga ttccaagaga 29940

agcccctggg ggtgctgtcc ctgcgactgg ctgaccccgt caccaccaag aacggggaaa 30000

tcaccctcaa gctgggagag ggggtggacc tcgactcctc gggaaaactc atctccaaca 30060

cggccaccaa ggccgccgcc cctctcagtt tttccaacaa caccatttcc cttaacatgg 30120

atacccctct ttataccaaa gatggaaaat tatccttaca agtttctcca ccgttaaaca 30180

tattaaaatc aaccattctg aacacattag ctgtagctta tggatcaggt ttaggactga 30240

gtggtggcac tgctcttgca gtacagttgg cctctccact cacttttgat gaaaaaggaa 30300

atattaaaat taacctagcc agtggtccat taacagttga tgcaagtcga cttagtatca 30360

actgcaaaag aggggtcact gtcactacct caggagatgc aattgaaagc aacataagct 30420

ggcctaaagg tataagattt gaaggtaatg gcatagctgc aaacattggc agaggattgg 30480

aatttggaac cactagtaca gagactgatg tcacagatgc atacccaatt caagttaaat 30540

tgggtactgg ccttaccttt gacagtacag gcgccattgt tgcttggaac aaagaggatg 30600

ataaacttac attatggacc acagccgacc cctcgccaaa ttgcaaaata tactctgaaa 30660

aagatgccaa actcacactt tgcttgacaa agtgtggaag tcaaattctg ggtactgtga 30720

ctgtattggc agtgaataat ggaagtctca acccaatcac aaacacagta agcactgcac 30780

tcgtctccct caagtttgat gcaagtggag ttttgctaag cagctccaca ttagacaaag 30840

aatattggaa cttcagaaag ggagatgtta cacctgctga gccctatact aatgctatag 30900

gttttatgcc taacataaag gcctatccta aaaacacatc tgcagcttca aaaagccata 30960

ttgtcagtca agtttatctc aatggggatg aggccaaacc actgatgctg attattactt 31020

ttaatgaaac tgaggatgca acttgcacct acagtatcac ttttcaatgg aaatgggata 31080

gtactaagta cacaggtgaa acacttgcta ccagctcctt caccttctcc tacatcgccc 31140

aagaatgaac actgtatccc accctgcatg ccaacccttc ccaccccact ctgtctatgg 31200

aaaaaactct gaagcacaaa ataaaataaa gttcaagtgt tttattgatt caacagtttt 31260

acaggattcg agcagttatt tttcctccac cctcccagga catggaatac accaccctct 31320

ccccccgcac agccttgaac atctgaatgc cattggtgat ggacatgctt ttggtctcca 31380

cgttccacac agtttcagag cgagccagtc tcgggtcggt cagggagatg aaaccctccg 31440

ggcactcccg catctgcacc tcacagctca acagctgagg attgtcctcg gtggtcggga 31500

tcacggttat ctggaagaag cagaagagcg gcggtgggaa tcatagtccg cgaacgggat 31560

cggccggtgg tgtcgcatca ggccccgcag cagtcgctgc cgccgccgct ccgtcaagct 31620

gctgctcagg gggtccgggt ccagggactc cctcagcatg atgcccacgg ccctcagcat 31680

cagtcgtctg gtgcggcggg cgcagcagcg catgcggatc tcgctcaggt cgctgcagta 31740

cgtgcaacac aggaccacca ggttgttcaa cagtccatag ttcaacacgc tccagccgaa 31800

actcatcgcg ggaaggatgc tacccacgtg gccgtcgtac cagatcctca ggtaaatcaa 31860

gtggcgctcc ctccagaaca cgctgcccac gtacatgatc tccttgggca tgtggcggtt 31920

caccacctcc cggtaccaca tcaccctctg gttgaacatg cagccccgga tgatcctgcg 31980

gaaccacagg gccagcaccg ccccgcccgc catgcagcga agagaccccg ggtcccggca 32040

atggcaatgg aggacccacc gctcgtaccc gtggatcatc tgggagctga acaagtctat 32100

gttggcacag cacaggcata tgctcatgca tctcttcagc actctcagct cctcgggggt 32160

caaaaccata tcccagggca cggggaactc ttgcaggaca gcgaaccccg cagaacaggg 32220

caatcctcgc acataactta cattgtgcat ggacagggta tcgcaatcag gcagcaccgg 32280

gtgatcctcc accagagaag cgcgggtctc ggtctcctca cagcgtggta agggggccgg 32340

ccgatacggg tgatggcggg acgcggctga tcgtgttcgc gaccgtgtca tgatgcagtt 32400

gctttcggac attttcgtac ttgctgtagc agaacctggt ccgggcgctg cacaccgatc 32460

gccggcggcg gtcccggcgc ttggaacgct cggtgttgaa attgtaaaac agccactctc 32520

tcagaccgtg cagcagatct agggcctcag gagtgatgaa gatcccatca tgcctgatag 32580

ctctgatcac atcgaccacc gtggaatggg ccagacccag ccagatgatg caattttgtt 32640

gggtttcggt gacggcgggg gagggaagaa caggaagaac catgattaac ttttaatcca 32700

aacggtctcg gagcacttca aaatgaaggt cgcggagatg gcacctctcg cccccgctgt 32760

gttggtggaa aataacagcc aggtcaaagg tgatacggtt ctcgagatgt tccacggtgg 32820

cttccagcaa agcctccacg cgcacatcca gaaacaagac aatagcgaaa gcgggagggt 32880

tctctaattc ctcaatcatc atgttacact cctgcaccat ccccagataa ttttcatttt 32940

tccagccttg aatgattcga actagttcct gaggtaaatc caagccagcc atgataaaga 33000

gctcgcgcag agcgccctcc accggcattc ttaagcacac cctcataatt ccaagatatt 33060

ctgctcctgg ttcacctgca gcagattgac aagcggaata tcaaaatctc tgccgcgatc 33120

cctaagctcc tccctcagca ataactgtaa gtactctttc atatcctctc cgaaattttt 33180

agccatagga ccaccaggaa taagattagg gcaagccaca gtacagataa accgaagtcc 33240

tccccagtga gcattgccaa atgcaagact gctataagca tgctggctag acccggtgat 33300

atcttccaga taactggaca gaaaatcacc caggcaattt ttaagaaaat caacaaaaga 33360

aaaatcctcc aggtgcacgt ttagagcctc gggaacaacg atgaagtaaa tgcaagcggt 33420

gcgttccagc atggttagtt agctgatctg taaaaaacaa aaaataaaac attaaaccat 33480

gctagcctgg cgaacaggtg ggtaaatcgt tctctccagc accaggcagg ccacggggtc 33540

tccggcgcga ccctcgtaaa aattgtcgct atgattgaaa accatcacag agagacgttc 33600

ccggtggccg gcgtgaatga ttcgacaaga tgaatacacc cccggaacat tggcgtccgc 33660

gagtgaaaaa aagcgcccga ggaagcaata aggcactaca atgctcagtc tcaagtccag 33720

caaagcgatg ccatgcggat gaagcacaaa atcctcaggt gcgtacaaaa tgtaattact 33780

cccctcctgc acaggcagcg aagcccccga tccctccaga tacacataca aagcctcagc 33840

gtccatagct taccgagcag cagcacacaa caggcgcaag agtcagagaa aggctgagct 33900

ctaacctgtc cacccgctct ctgctcaata tatagcccag atctacactg acgtaaaggc 33960

caaagtctaa aaatacccgc caaataatca cacacgccca gcacacgccc agaaaccggt 34020

gacacactca aaaaaatacg cgcacttcct caaacgccca aactgccgtc atttccgggt 34080

tcccacgcta cgtcatcgga attcgacttt caaattccgt cgaccgttaa aaacgtcacc 34140

cgccccgccc ctaacggtcg cccgtctctc ggccaatcac cttcctccct ccccaaattc 34200

aaacagctca tttgcatatt aacgcgcacc aaaagtttga ggtatattat tgatgatgtt 34260

aattaagcga tcgc 34274

Claims (10)

1.一种腺病毒表达载体，其特征在于，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体作为骨架；含有信号肽和编码寨卡病毒M/E蛋白的序列；所述编码寨卡病毒M/E蛋白的序列含有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的腺病毒表达载体，其特征在于，表达寨卡病毒M/E蛋白的元件按照5’→3’顺序依次包括：启动子、信号肽、寨卡病毒M/E基因、终止子。

3.根据权利要求1所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述的信号肽为JEV信号肽。

4.权利要求1-～3任一所述的腺病毒表达载体在表达病毒方面的应用。

5.一种基于黑猩猩腺病毒载体表达寨卡病毒M/E蛋白预防寨卡病毒的方法，其特征在于，应用权利要求1～3任一所述的腺病毒表达载体表达寨卡M/E病毒全长蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将含有编码寨卡病毒M/E蛋白的基因插入到E1和E3缺失的黑猩猩型AdC7载体中被删除的E1区域。

7.由权利要求1～3任一所述的腺病毒表达载体制备而成的腺病毒；其特征在于，是将所述的腺病毒表达载体线性化后，转入病毒生产细胞制备腺病毒。

8.应用权利要求7所述的腺病毒制备的抗寨卡病毒的疫苗。

9.一种用于表达寨卡病毒M/E蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1～3任一所述的腺病毒表达载体，或权利要求7所述的腺病毒；或权利要求8所述的抗寨卡病毒疫苗。

10.一种制备寨卡病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：应用将权利要求4所述的腺病毒表达载体转染病毒生产细胞，使病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的寨卡病毒疫苗。