CN112552380A - 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用 - Google Patents

一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白中的至少一者，其中，PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变而形成的，PreS蛋白具有免疫性强、可诱导产生高滴度中和抗体的优点。由所述免疫原可以衍生出包括编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子、包括所述核酸分子的表达盒、包括所述核酸分子或所述表达盒的表达载体、包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体的转化体、由所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体转染腺病毒包装细胞并进行细胞培养而获得的重组腺病毒，以及包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体或所述转化体的药物组合物。

Description

一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用
技术领域
本申请涉及生物制药领域，具体涉及一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)的新发呼吸道病原体。SARS-CoV-2具有较强的传染性和较长的潜伏期。对于COVID-19，目前尚无证实有效的治疗方法和预防疫苗。
目前有研究发现，新型冠状病毒SARS-CoV-2包括棘突蛋白(Spike,S蛋白)、包膜蛋白 (Envelope,E蛋白)、膜蛋白(Membrane/matrix,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白) 四个结构蛋白。其中，S蛋白包括S1亚基，所述S1亚基上具有RBD结构域(Receptorbinding domain,RBD)，通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合，使得SARS-CoV-2 感染人体细胞，即：SARS-CoV-2的S蛋白是决定SARS-CoV-2入侵人体细胞的关键蛋白。因此，针对S蛋白的中和抗体可阻断SARS-CoV-2入侵人体细胞，S蛋白、S蛋白的亚基或RBD可作为靶抗原用于制备疫苗。
COVID-19疫苗是预防COVID-19、防止COVID-19疫情蔓延的有效措施之一。当前，快速研制出能够提升群体免疫水平，并且阻断COVID-19传播的疫苗已成为最为紧迫的重大需求。
发明内容
本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用，所述免疫原可以诱导产生高滴度的中和抗体，能够应用于制备治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物。
第一方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者。
在一些实施方式中，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
在一些实施方式中，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合之前，SARS-CoV-2病毒的S蛋白呈现融合前的PreS构象，但PreS构象存在时间非常短暂，即：一旦所述S蛋白与所述ACE2受体蛋白相结合，所述PreS构象迅速转变成融合后的构象，而拥有PreS构象的S蛋白具有更强的免疫原性，可以诱导产生高滴度的中和抗体。本申请的所述PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变而形成，能够稳定呈现S蛋白融合前的PreS构象。
第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括：编码PreS蛋白的核苷酸序列，以及编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者。
在一些实施方式中，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
在一些实施方式中，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
第三方面，本申请提供了一种表达盒，所述表达盒包括如第二方面中所述的核酸分子。
第四方面，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体，以及如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒。
作为本申请的一种优选实施方案，所述载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的黑猩猩腺病毒68型(chimpanzee adenovirus type68,AdC68)，其不能在正常人体细胞中复制生产，只能在HEK293、Vero等细胞中复制生产，具有高度的安全性。此外，AdC68型黑猩猩腺病毒在人体中不含有预存抗体，从而排除预存抗体对疫苗功效的抑制作用。
进一步地，所述载体可以为pAdC68XY3。
第五方面，本申请提供了一种转化体，所述转化体包括表达系统，以及如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体；所述表达系统为真核生物或原核生物。
作为所述表达系统的真核生物例如可以是酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞，所述哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞和人类细胞等。作为所述表达系统的原核生物例如可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
第六方面，本申请提供了一种重组腺病毒，所述重组腺病毒是将如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养获得的。所述重组腺病毒是基于同源重组而产生的，具有高度的安全性。
第七方面，本申请提供了一种重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：
构建重组穿梭载体，所述重组穿梭载体装载有编码PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码 SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列；
对所述重组穿梭载体进行双酶切，回收目的基因片段，所述目的基因片段包括编码所述PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码所述全长S蛋白的核苷酸序列；
制备复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架；
将所述目的基因片段与所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架连接，获得表达载体；
对所述表达载体进行线性化处理；以及
将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养，获得所述重组腺病毒；
在一些实施方式中，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
在一些实施方式中，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
在一些实施方式中，所述重组穿梭载体还包括基因表达调控元件，所述基因表达调控元件包括启动子和/或终止子。
该方法制备的重组腺病毒可以诱发机体产生针对SARS-CoV-2病毒的体液免疫应答和细胞免疫应答。
第八方面，本申请提供了一种药物组合物，包括如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的重组腺病毒。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。
其中，佐剂是指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应，参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。佐剂能增强药物组合物的特异性免疫反应，从而提升药物组合物的免疫效果。可与本申请的药物组合物共同施用的佐剂包括但不限于干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白和白细胞介素。
辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。
在一些实施方式中，所述药物组合物适用于肌内、皮下或粘膜施用。
在一些实施方式中，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种。
在一些实施方式中，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。
本领域技术人员可以理解的是，本申请还提供了所述药物组合物的治疗方式或免疫方式，包括：鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射、口服给药等。优选采用鼻喷给药的治疗方式或免疫方式。
第九方面，本申请提供了如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子，或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的重组腺病毒、或如第七方面中所述的制备方法制得的重组腺病毒、或如第八方面中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。
本申请还提供了一种治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的方法，包括：给予对象有效量的如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子，或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的重组腺病毒、或如第七方面中所述的制备方法制得的重组腺病毒、或如第八方面中所述的药物组合物，以达到治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的目的，所述给予包括鼻喷、滴鼻、气溶胶吸入、肌肉注射、皮下注射以及口服中的一种或多种给药方式。
本申请提供了一种SARS-CoV-2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者，其中，PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变而形成的，PreS蛋白具有免疫性强、可诱导产生高滴度中和抗体的优点。由所述免疫原可以衍生出包括编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子、包括所述核酸分子的表达盒、包括所述核酸分子或所述表达盒的表达载体、包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体的转化体、由所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体转染腺病毒包装细胞并进行细胞培养而获得的重组腺病毒，以及包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体或所述转化体或所述重组腺病毒的药物组合物。
经免疫实验发现，PreS蛋白作为免疫原诱导产生的特异性IgG抗体滴度，是SARS-CoV-2 病毒的S蛋白作为免疫原诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上，充分说明本发明的免疫原在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中具有巨大优势。
附图说明
下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其有益效果显而易见。
图1为本申请实施例1中pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的结构示意图。
图2为本申请实施例2中PreS基因片段的鉴定电泳图谱，其中，泳道M代表 Marker(DL1000)，泳道1和泳道2均代表PreS基因片段的PCR产物，白色圆圈内的条带对应为PreS基因片段。
图3为本申请实施例3中HK293细胞培养上清液样品和实施例7中HK293细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道2代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白色圆圈内代表PreS蛋白的条带；泳道3代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道4代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白色方框内代表S蛋白的条带；泳道5至泳道8为阴性对照。
图4为本申请实施例3中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道2代表经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白色圆圈内代表PreS蛋白的条带。
图5为本申请实施例4中纯化后的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的电镜图。
图6为本申请实施例5中pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒的结构示意图。
图7为本申请实施例6中S基因片段的鉴定电泳图谱，其中，泳道M代表 Marker(DL1000)，泳道1至泳道3均代表S基因片段的PCR产物，白色方框内的条带对应为S基因片段。
图8为本申请实施例7中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表阴性对照，泳道2代表经rAdC68XY3-S 重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道3代表经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白色方框内代表S蛋白的条带。
图9为本申请实施例8中纯化后的rAdC68XY3-S重组腺病毒的电镜图。
图10为本申请实验例中各组试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度的数据图，其中，D0 表示各组试验小鼠免疫第0天，D21表示各组试验小鼠免疫第21天。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展，并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
本申请中使用的术语“S蛋白”可以来源于已知的任何SARS-CoV-2病毒株，在一些实施例中，野生型S蛋白来源于毒株SARS-CoV-2。
本申请中使用的术语“PreS蛋白”是指一种稳定呈现SARS-CoV-2病毒的S蛋白在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合前构象的蛋白，可以是已知的任何SARS-CoV-2病毒株的野生型 S蛋白经优化而形成的，所述优化例如可以是点突变，所述优化包括一个或多个氨基酸残基的缺失、增加或取代。在一些实施例中，PreS蛋白是来源于毒株SARS-CoV-2的野生型S蛋白经点突变而形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请中使用的术语“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸 (RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种，以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在一些实施例中，PreS 基因片段和S基因片段均属于核酸分子。
本申请中使用的术语“HEK293”是指人胚胎肾细胞293，其是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有极少表达细胞外配体所需的内生受体、易转染的特性，分为293A、293T等类型，其中，293A用来包装腺病毒。在一些实施例中，将HEK293细胞作为pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的转染细胞，以包装产生rAdC68XY3-PreS重组腺病毒；在一些实施方式中，将HEK293细胞作为rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的表达系统，以表达产生PreS蛋白。
本申请的术语“Vero”是指非洲绿猴肾细胞，其是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的异倍体细胞。在一些实施例中，将Vero细胞作为rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的表达系统，以表达产生PreS蛋白。
本申请的术语“表达盒”包含表达目的蛋白所需的必要元件，包括在表达系统中转录和翻译过程中所必需的元件，所述表达盒可以包括启动子、表达框和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现目的蛋白表达的启动子和终止子，其中启动子可以是原核的或真核的，例如可以是Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等。所述表达盒还可以任选地包括增强子或其他表达调控元件。
本申请的术语“表达框”是指开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，其包含一段可以编码目的蛋白的核苷酸序列，并且该核苷酸序列上具有起始密码子和终止密码子。
本申请的术语“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子，例如可以是质粒、病毒、粘粒等，所述病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等，所述腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。在一些实施例中，基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒为PreS基因片段或S基因片段的载体。在一些实施例中，所述AdC68型黑猩猩腺病毒载体是pAdC68XY3，是对基因组中缺失E1编码区和E3编码区的 AdC68型黑猩猩腺病毒进行改造而获得的骨架质粒，其中所述改造包括：将AdC68型黑猩猩腺病毒的早期区域4可读框6(E4-orf6区域)替换为人Ad5型腺病毒E4-orf6区域，以提高在HEK293、PER.C6等细胞中的扩增产量。
本申请的术语“表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的表达系统中表达。在一些实施例中，rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-S重组腺病毒均属于表达载体。
本申请的术语“表达系统”是指用于表达外源基因蛋白的一类宿主，例如可以是真核生物、原核生物、病毒等。在一些实施例中，HEK293细胞和Vero细胞均属于表达系统。
本申请的术语“转化体”是指接受了外源遗传物质(如：质粒DNA)而使遗传特性发生变化的一类表达系统。在一些实施例中，接受了外源的酶切基因片段的HEK293细胞属于转化体。
本申请的术语“免疫原”是指可以刺激机体产生免疫应答的一类物质，在一些实施例中， S蛋白和PreS蛋白均属于免疫原。
本申请的术语“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排出抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能，包括天然免疫和获得性免疫。在一些实施例中，通过对受试者注射rAdC68XY3-PreS重组腺病毒，而引起机体免疫系统针对免疫原(PreS蛋白)的免疫应答反应；以及，通过对受试者注射rAdC68XY3-S重组腺病毒，而引起机体免疫系统针对免疫原(S蛋白)的免疫应答反应。
本申请的术语“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物。所述治疗目的是指改善或减轻COVID-19的至少一种症状，可以延迟COVID-19的恶化或进展，或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或引起生物体产生免疫应答以达到预防SARS-CoV-2感染目的。所述药物组合物可以是包括一种或多种免疫原的组合物，例如：包括SARS-CoV-2的全长S蛋白和/或PreS蛋白。所述药物组合物还可以是包括核酸分子的组合物，所述核酸分子编码一种或多种的免疫原或免疫原性表位，并且所述核酸分子可以包括在载体(如：质粒、病毒)中而形成表达盒、表达载体、转化体等形式。所述药物组合物例如可以是疫苗，所述疫苗可以是mRNA疫苗、DNA疫苗、重组载体疫苗等类型。此外，所述药物组合物例如还可以是药物制剂。在一些实施例中，所述药物组合物包括rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和/或rAdC68XY3-S重组腺病毒。
本申请的术语“对象”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体，包括人类和其他哺乳类动物，还包括已被SARS-CoV-2感染且尚未治愈、曾被SARS-CoV-2感染且已治愈或具有 SARS-CoV-2感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在一些实施例中，对象为试验小鼠。在一些实施例中，所述对象优选为人类。
本申请的术语“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量，或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂量。有效量取决于众多因素，例如：药物的活性、采用的递送方式等，且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。
本申请的术语“湿转法”是通过将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的胶片浸入转印缓冲液中，使得经SDS-PAGE分离获得的蛋白质样品从胶片上转印至转印膜上而得以固定。在一些实施例中，将经SDS-PAGE分离获得的PreS蛋白从胶片上转印至转印膜上而得以固定。
除非另有说明，以下实施例中使用的培养基、试剂和溶液均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
一、本申请实施例中涉及培养基的说明
(1)MEM培养基购自美国的Hyclone实验室。
(2)DMEM培养基购自美国的Hyclone实验室。
(3)LB培养基
每100mL的LB液体培养基中，包括：1.0g的蛋白胨，0.5g的酵母粉，以及1.0g的NaCl。
对于LB固体培养基，是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。
二、本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明详见下表1:
表1.本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明
Figure RE-GDA0002940450440000091
三、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂以及溶液的说明：
本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。
本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如：NotI、KpnI和PacI)、归位内切酶(如：PI-SceI 和I-CeuI)、连接酶(如：T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)、PCR反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH2O)均购自宝生物工程(大连)有限公司。
本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒 RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。
本申请实施例中涉及的LipofectamineTM2000试剂盒和ECL显色液购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene-Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。
本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。
本申请实施例中涉及的S蛋白购自京天成公司。
本申请实施例中涉及的鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体购自美国的GeneTex公司。
本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。
下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1：构建rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
本实施例通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变，获得PreS蛋白以作为目的免疫原，其中，所述野生型S蛋白来源于毒株SARS-CoV-2，所述PreS蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。将经过人源密码子优化后获得的PreS基因片段作为重组腺病毒rAdC68XY3-PreS 的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PreS基因片段能够编码产生PreS蛋白。
在本实施例中，重组腺病毒rAdC68XY3-PreS的载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒， E1编码区的缺失使得重组腺病毒rAdC68XY3-PreS不能在普通细胞(如：人体细胞)内复制，具有很高的生物安全性，从而不能在正常人体细胞中复制生产，仅能在HEK293、Vero等细胞中复制。E3编码区的缺失使得重组腺病毒rAdC68XY3-PreS具有更强的包容性。
1.1构建pShuttle-PreS重组质粒
本实施例选择未插入外源基因的pShuttle-CMV质粒作为pShuttle-PreS重组质粒的载体。 pShuttle--CMV为穿梭型质粒，其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内含子和bGH poly(A)加尾信号，并具有NotI和KpnI双酶切位点，还具有卡那霉素(Kanamycin, Kana)抗性。
所述构建pShuttle-PreS重组质粒，具体包括如下步骤：
S1.11、在PreS基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列，并在其3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点，然后进行基因合成；
S1.12、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S1.11合成的基因片段进行双酶切，采用 1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为3769bp的目的基因片段，其中，双酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；
S1.13、采用NotI和KpnI限制性内切酶对pShuttle-CMV进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为4093bp的载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；
S1.14、将步骤S1.12获得的目的基因片段，与步骤S1.13获得的载体骨架相混合，在 T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pShuttle-PreS连接产物；
S1.15、将步骤S1.14获得的pShuttle-PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃静置培养过夜，获得多个单菌落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；
S1.16、挑取步骤1.15中的多个单菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得多个菌液；
S1.17、对步骤1.16中的多个菌液分别进行质粒提取操作，将提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pShuttle-PreS重组质粒，其中，质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施。
1.2构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒
在本实施例中，选择自行构建的pShuttle-PreS和商购的pAdC68XY3-GFP来构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒，pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的结构如图1所示。
所述构建pAdC68XY3-PreS重组腺病毒表达载体，具体包括如下步骤：
S1.21、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pShuttle-PreS进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为4246bp的目的基因片段，其中，回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施，目的基因片段包含PreS基因片段和PreS蛋白的表达调控元件；
S1.22、采用PI-SceI和I-CeuI归位内切酶对pAdC68XY3-GFP进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为33062bp的载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；
S1.23、将步骤1.21获得的目的基因片段，与步骤S1.22获得载体骨架混合，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pAdC68XY3-PreS连接产物；
S1.24、将pAdC68XY3-PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB平板上，37℃培养过夜，获得多个单菌落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；
S1.25、挑取步骤1.24中的多个单菌落分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB 液体培养基中，37℃培养过夜，获得多个菌液；
S1.26、对步骤1.25中的多个菌液分别进行质粒提取操作，然后对提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒，其中，质粒提取操作根据质粒提取试剂盒操作说明实施；
S1.27、将步骤1.26中测序结果正确的pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜；挑取多个培养获得的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，之后使用质粒提取试剂盒提取质粒后进行测序。
经测序，pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中， PreS基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。
1.3线性化处理pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒
采用PacI限制性内切酶对1.2中获得的所述pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒进行酶切，以使所述pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线性化，其中，酶切温度为37℃，酶切时间为三小时，酶切体系详见下表2：
表2 pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线性化的酶切体系
Figure RE-GDA0002940450440000121
Figure RE-GDA0002940450440000131
酶切完成后，采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，其中，回收的基因片段长度为 35556bp，实现pAdC68XY3-PreS重组腺病毒质粒线形化，并通过微量核酸定量仪对回收后的基因片段进行定量分析。
1.4制备rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
对1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)进行转染操作，采用LipofectamineTM2000试剂盒进行转染操作，并选择HEK293细胞作为表达系统。根据LipofectamineTM2000试剂盒的操作说明，将1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)转染于汇合度为60～70％的HEK293细胞内。
在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基，并在转染前两小时将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染五小时后，更换培养基为含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。
转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次，然后在1200×g的转速下离心五分钟，收集上清液，获得的上清液中包含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒，并将上清液分装后置于-80℃超低温冰箱保存备用。
实施例2：鉴定rAdC68XY3-PreS重组腺病毒基因组中的PreS基因片段
以rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的全基因组作为模板，采用PCR技术扩增PreS基因片段。针对PreS基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物R1如SEQ ID NO.6所示。采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上述1.4中获得的上清液进行全基因组提取操作，具体操作参照试剂盒操作说明进行。
其中，PCR反应体系详见下表3：
表3为PCR反应体系一览表
Figure RE-GDA0002940450440000132
Figure RE-GDA0002940450440000141
PCR反应程序具体为：①95℃预变性2min；②95℃变性15s；③45℃退火15s；④72℃延伸90s；⑤重复②～④30个循环；⑥72℃，5min。
PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，白色圆圈内的条带预估为PreS基因片段，然后切胶回收该条带并测序，测序结果显示该条带即为PreS基因片段。其中，所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行，具体操作参照胶回收试剂盒中的操作说明实施。
实施例3：rAdC68XY3-PreS重组腺病毒表达PreS蛋白
分别选择HK293细胞和Vero细胞作为表达系统，以分别检测rAdC68XY3-PreS重组腺病毒在HK293细胞和Vero细胞中PreS蛋白的表达。具体包括如下步骤：
S3.1、将表达系统按5×105个/孔的接种量接种于六孔板的孔内，选用MEM培养基培养表达系统，以使表达系统在孔内增殖；
S3.2、当孔内表达系统的汇合率达到90％时，将rAdC68XY3-PreS重组腺病毒接种于孔内，并设置阴性对照，在37℃的条件下静置培养；
S3.3、当37℃静置培养48h后，先将粘壁细胞刮于细胞培养液中，然后将细胞培养液离心，并收集上清液，将该上清液标记为细胞培养上清液；
S3.4、取80μL步骤S3.3中获得的细胞培养上清液，然后加入20μL五倍浓缩的SDS-PAGE 上样缓冲液(5×SDS-PAGE Loading Buffer)，并在100℃下煮沸五分钟，获得该细胞培养上清液的待检样品；
S3.5、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S3.4中获得的待检样品中的PreS蛋白表达。
其中，在所述步骤S3.2中，当所述表达系统为HK293细胞时，rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)0.2进行接种；当所述表达系统为Vero 细胞时，rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照MOI 20进行接种。
在所述步骤S3.3中，当所述表达系统为HK293细胞时，所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的HK293细胞；当所述表达系统为Vero细胞时，所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的Vero细胞。
在所述步骤S3.5中，结合SDS-PAGE和WB技术检测各个待检样品，具体包括如下步骤：
S3.51、将所述待检样品进行8％SDS-PAGE电泳；
S3.52、电泳结束后，利用湿转法将目的PreS蛋白转印至PVDF膜上；
S3.53、将附着有PreS蛋白的PVDF膜浸泡于含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中，在4℃下封闭过夜；
S3.54、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.53的所述PVDF膜两次，然后将所述PVDF膜浸泡于鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)中，在37℃下孵育一小时；
S3.55、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.54的所述PVDF膜两次，然后将所述PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中，在37℃下孵育一小时；
S3.56、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.55的所述PVDF膜两次，然后将ECL显色液加至于所述PVDF膜的附着有PreS蛋白的一面上，化学发光法显色。
其中，在所述步骤S3.51中，10％SDS-PAGE电泳的条件为：①保持电压100V二十分钟；②保持电压160V一小时二十分钟。
在所述步骤S3.54中，可用兔抗anti-RBD多克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)替代所述鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)。
在所述步骤S3.55中，可用HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(稀释比例为1:5000)替代所述HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)。
需要说明的是，利用WB技术检测各个待检样品也可通过商品化的Western BlotECL化学发光法显色试剂盒进行。
如图3和图4所示，经rAdC68XY3-PreS重组腺病毒感染后，HK293细胞和Vero细胞的所述细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到PreS蛋白的表达，表达的PreS蛋白分子量约为180～200KD，需要说明的是，表达的PreS蛋白存在高度的糖基化。
实施例4：rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的纯化及检定
4.1小规模扩增rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
首先，提供汇合度为90％的HEK293细胞；然后，将rAdC68XY3-PreS重组腺病毒按照MOI0.2接种于所述HEK293细胞中，并置于37℃、5％(体积百分比)CO2的培养箱内静置培养；待70％以上的细胞变圆、脱落时，使用细胞刮将粘壁细胞刮下，然后将细胞培养液2265×g离心十分钟，并分别收集上清液和细胞沉淀；最后，将收集的所述细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中，并在室温(25℃)与-80℃之间反复冻融三次，2265×g离心十分钟以收集上清液，将两次收集的上清液合并，并标记为rAdC68XY3-PreS重组腺病毒保存液以用于下一步纯化。
4.2纯化rAdC68XY3-PreS重组腺病毒
在生物安全柜中，向一50mL的离心管中缓慢加入12mL密度为1.4g/mL的氯化铯溶液，然后非常轻缓地加入9mL密度为1.2g/mL的氯化铯溶液，接着在不连续梯度的顶部加入13mL的所述rAdC68XY3-PreS重组腺病毒保存液，获得待纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒样品。
预冷离心转子至4℃，将待纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒样品于4℃、100000×g 离心一百二十分钟，对于SW28型号的转子需采用23000r/min的转速。离心后，小心抽吸病毒带，获得含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的溶液。将所述含rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的溶液转移至一无菌的15mL离心管内，向其中加入等体积的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH为7.9)，获得稀释的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒悬液。
取另一50mL的离心管，向其中加入20mL密度为1.35g/mL的氯化铯溶液，然后非常轻缓地在氯化铯溶液的顶部加入15mL所述稀释的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒悬液。平衡所述离心管后，在4℃、100000×g离心十八小时，对于SW28型号的转子需采用23000r/min 的转速。离心结束后，小心收集蓝白色病毒带。将获得的蓝白色病毒带置于10000道尔顿的纤维素酯膜中，4℃透析至PBS溶液中以去除氯化铯，获得纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒溶液。向纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒溶液中加入10％(体积百分数)甘油，分装后冻存于-80℃冰箱中以备用。
4.3 rAdC68XY3-PreS重组腺病毒的检定及分析
采用2％(质量百分比)磷钨酸溶液(pH为6.8)复染纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒，然后进行电镜检测，如图5所示，经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒颗粒。
此外，采用腺病毒滴度-TCID50法检测纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒，检测结果显示纯化的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒滴度在109TCID50/ml以上。其中，所述腺病毒滴度-TCID50法参考文献(
Figure RE-GDA0002940450440000161
G.,Archiv f experiment Pathol u Pharmakol,162:480-483,1931) 进行。
实施例5：构建rAdC68XY3-S重组腺病毒
本实施例对来源于毒株SARS-CoV-2的野生型S蛋白进行信号肽替换操作，获得的全长 S蛋白作为目的免疫原，所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。将经过人源密码子优化后获得的S基因片段作为重组腺病毒rAdC68XY3-S的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，S基因片段能够编码产生SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白。重组腺病毒rAdC68XY3-S的结构如图6所示。
重组腺病毒rAdC68XY3-S的构建参照实施例1进行，依次构建pShuttle-S重组质粒、构建pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒和制备rAdC68XY3-S重组腺病毒，在此不再赘述。
经测序，pAdC68XY3-S重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，S基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。
需要说明的是，对于构建pShuttle-S重组质粒，起始合成的基因片段(对应步骤S1.11)为：在S基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列，并在编码全长S蛋白的N端的核苷酸序列处添加编码Jev信号肽的核苷酸序列，最后在3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点。
实施例6：鉴定rAdC68XY3-S重组腺病毒基因组中的S基因片段
以rAdC68XY3-S重组腺病毒的全基因组作为模板，采用PCR技术扩增S基因片段。针对S基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F2和反向引物R2，所述正向引物F2如SEQ IDNO.9所示，所述反向引物R2如SEQ ID NO.10所示。
其中，提取rAdC68XY3-S重组腺病毒的全基因组、PCR反应体系以及PCR反应程序参照实施例2进行，在此不再赘述。
PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图7所示，白色方框内的条带预估为S基因片段，然后切胶回收该条带并测序，测序结果显示该条带即为S基因片段。其中，所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行，具体操作参照胶回收试剂盒中的操作说明实施，在此不再赘述。
实施例7：rAdC68XY3-S重组腺病毒表达S蛋白
具体参照实施例3进行，仅需将实施例3中的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3-S重组腺病毒，在此不再赘述。
如图3和图8所示，经rAdC68XY3-S重组腺病毒感染后，HK293细胞和Vero细胞的细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到S蛋白的表达，表达的S蛋白分子量约为 180～200KD，需要说明的是，表达的S蛋白存在高度的糖基化。
实施例8：rAdC68XY3-S重组腺病毒的纯化及检定
具体参照实施例4进行，仅需将实施例4中的rAdC68XY3-PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3-S重组腺病毒，在此不再赘述。
如图9所示，经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3-S重组腺病毒颗粒。采用腺病毒滴度-TCID50法检测纯化的rAdC68XY3-S重组腺病毒，检测结果显示纯化的rAdC68XY3-S重组腺病毒滴度在9.0TCID50/ml以上。
对比例：rAdC68XY3-GFP重组腺病毒的制备及纯化
本对比例提供了一种rAdC68XY3-GFP重组腺病毒，rAdC68XY3-GFP重组腺病毒的制备方法是：将商购的pAdC68XY3-GFP重组质粒线性化，并转染HEK293细胞，经细胞培养而获得rAdC68XY3-GFP重组腺病毒，具体操作参照实施例1中的1.3和1.4进行。
将制备获得的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒进行小规模扩增及纯化，具体操作参照实施例4中的4.1和4.2进行，将纯化获得的rAdC68XY3-GFP重组腺病毒留存备用。
实验例：比较rAdC68XY3-GFP重组腺病毒、rAdC68XY3-PreS重组腺病毒和rAdC68XY3-S 重组腺病毒的免疫活性
选取18只试验小鼠(约3～7天时间适应环境)，动物经检验检疫后随机分为三组，每组 6只，每组的具体情况详见下表3：
表3为实验例中分组的具体内容表
Figure RE-GDA0002940450440000181
对各组的试验小鼠进行腹腔注射免疫，每只每次注射为5微克，每周注射1次，共注射 3次，21天后眼眶取血。采用酶联免疫反应(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)法检测试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度，包括如下步骤：
S10、采用无菌碳酸钠缓冲液(pH为9.6)和商购的S蛋白配置S蛋白溶液，所述S蛋白溶液的浓度为0.5μg/mL，然后将所述S蛋白溶液按照100μL/孔加入至96孔酶标板，置于4℃包被过夜；
S20、次日，弃去酶标板孔内的液体，用PBST缓冲液洗板三次，然后每孔加入封闭液，置于37℃封闭一小时；
S30、封闭结束后，弃去所述酶标板孔内的封闭液，然后用封闭液对免疫后的试验小鼠血清进行系列梯度稀释，并将稀释后的血清按照100μL/孔加入至所述酶标板，每个稀释度血清设置三个平行样，设置封闭液作为空白对照，置于37℃孵育一小时；
S40、步骤S30的孵育结束后，用PBST缓冲液洗板三次，然后将过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(稀释比例为1:1000)按照100μL/孔加入至所述酶标板，置于37℃孵育一小时；
S50、步骤S40的孵育结束后，用PBST缓冲液洗板三次，按照100μL/孔加入作为生色底物的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，暗处放置15分钟；
S60、按照100μL/孔加入0.2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪在波长450nm和参比波长 620nm处测定吸光度。
对步骤S10至步骤S60需要说明的是，所述碳酸钠缓冲液(pH为9.6)的配方是：每1000mL 的碳酸钠缓冲液中，包括8.4g的碳酸氢钠(NaHCO3)和3.5g的碳酸钠(Na2CO3)。所述PBST 缓冲液为含有0.1％(质量百分数)吐温-20的PBS缓冲液，所述封闭液为含有10％(质量百分数)脱脂奶粉的PBS缓冲液，PBS缓冲液采用本领域常规技术手段配置。
实验结果如图10所示，其中，实验组1的特异性IgG抗体滴度几何平均值为8445，实验组2的特异性IgG抗体滴度几何平均值为2263，说明PreS蛋白和SARS-CoV-2病毒的S 蛋白均可以诱导产生特异性IgG抗体。其中，PreS蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度可以达到S蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上，这意味着免疫原PreS可以诱导产生高滴度的特异性IgG抗体，证明PreS蛋白在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中具有巨大优势。
以上对本发明所提供的一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 武汉博沃生物科技有限公司
<120> 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用
<130> WH200189-CN
<141> 2020-12-09
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1248
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr
20 25 30
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val
35 40 45
Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln
50 55 60
Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile
65 70 75 80
His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu
85 90 95
Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser
115 120 125
Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu
130 135 140
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn
145 150 155 160
Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn
165 170 175
Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu
180 185 190
Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn
195 200 205
Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu
210 215 220
Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp
225 230 235 240
Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu
245 250 255
His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala
260 265 270
Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu
275 280 285
Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala
290 295 300
Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val
305 310 315 320
Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
325 330 335
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
340 345 350
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
355 360 365
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
370 375 380
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
385 390 395 400
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
405 410 415
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
420 425 430
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
435 440 445
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
450 455 460
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
465 470 475 480
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
485 490 495
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
500 505 510
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
515 520 525
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
530 535 540
Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly
545 550 555 560
Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln
565 570 575
Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln
580 585 590
Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser
595 600 605
Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr
610 615 620
Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln
625 630 635 640
Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln
645 650 655
Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr
660 665 670
Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr
675 680 685
Gln Thr Asn Ser Pro Gly Ser Ala Ser Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
690 695 700
Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser
705 710 715 720
Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr
725 730 735
Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met
740 745 750
Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr
755 760 765
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val
770 775 780
Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile
785 790 795 800
Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln
805 810 815
Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
820 825 830
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln
835 840 845
Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala
850 855 860
Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu
865 870 875 880
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser
885 890 895
Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met
900 905 910
Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu
915 920 925
Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly
930 935 940
Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu
945 950 955 960
Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys
965 970 975
Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile
980 985 990
Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu
995 1000 1005
Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu
1010 1015 1020
Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys
1025 1030 1035 1040
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly
1045 1050 1055
Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val
1060 1065 1070
Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr
1075 1080 1085
Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu
1090 1095 1100
Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn
1105 1110 1115 1120
Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly
1125 1130 1135
Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
1140 1145 1150
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe
1155 1160 1165
Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile
1170 1175 1180
Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1185 1190 1195 1200
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly
1205 1210 1215
Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln
1220 1225 1230
Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
1235 1240 1245
<210> 2
<211> 3769
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggccgccgcc atgggcaaga ggtccgccgg cagcatcatg tggctggcct ccctggccgt 60
cgtgattgcc tgcgccggcg cttctcagtg tgtgaatctg acaacacgga cccagctgcc 120
tcccgcctat accaactcct tcaccagggg ggtgtactac cctgataagg tgtttcggtc 180
atctgtgctg catagcaccc aggatctgtt cctgcccttc tttagcaacg tgacttggtt 240
ccacgccatc cacgtgagtg gcacaaatgg aaccaagagg ttcgacaatc ctgtgctgcc 300
tttcaacgac ggagtgtact tcgccagcac tgaaaagtcc aatatcatta ggggctggat 360
ctttggcaca accctggact ccaaaaccca gtccctgctg atcgtgaaca acgccaccaa 420
cgttgtgatt aaggtgtgtg agtttcagtt ttgcaatgac cccttccttg gcgtgtatta 480
tcataagaat aataagtctt ggatggagtc tgagttcaga gtgtactcct cagccaataa 540
ttgcaccttc gaatacgtga gccagccatt cctgatggat ctggagggta aacagggcaa 600
ttttaagaac ctgcgcgaat ttgtgtttaa gaatattgat ggatatttca agatctactc 660
taaacatacc cccatcaatc tcgtgagaga tctgccacag ggctttagcg ccctggaacc 720
actcgtggac ctgccaatcg gcatcaatat tacacggttc cagacccttc tggccctgca 780
tcggtcttac ctgacccctg gcgatagttc ctccggctgg actgccgggg ccgccgccta 840
ttacgtggga tacctgcagc ccaggacatt tctcctgaaa tataatgaga acggcaccat 900
caccgacgca gtggattgtg ctctggaccc actgtccgag accaaatgca cactgaagtc 960
tttcacagtg gagaaaggca tctatcagac ttccaacttt cgcgttcagc ccacagagag 1020
catcgttagg tttcctaata tcactaacct gtgcccattc ggagaagtgt ttaatgccac 1080
caggttcgcc agtgtctacg cttggaaccg caagaggatt tctaactgcg tcgccgacta 1140
ctcagtgctg tacaacagcg ctagtttctc cacattcaaa tgttacggag tgtctccaac 1200
caagctgaat gacctgtgtt tcactaacgt gtacgccgat agtttcgtta tcagaggcga 1260
cgaggtgcgc cagatcgctc ccggacagac tggcaaaatt gctgactaca actacaagct 1320
ccctgacgac ttcaccgggt gcgtgattgc atggaacagc aacaatctgg attccaaagt 1380
aggagggaat tataactacc tgtaccgcct ctttagaaag tccaacctga aaccctttga 1440
aagggatatt tccacagaga tctatcaggc cggctctacc ccttgtaacg gcgtggaggg 1500
ctttaattgt tactttcctc tgcagagcta tgggttccag ccaacaaatg gcgtgggcta 1560
tcagccatat agggtggtgg tgctgagttt cgaactcctg catgcccctg ctaccgtgtg 1620
cggccctaag aagtctacca atctggtgaa aaataagtgc gtgaacttta acttcaatgg 1680
cctgacagga accggcgtgc tgacagaaag caacaaaaag ttcctgcctt tccagcaatt 1740
cggcagagat atcgccgata ccactgacgc tgtgagagac ccccagaccc tggagattct 1800
cgacataaca ccctgctcct tcggcggagt gagcgtcatt acaccaggaa caaacacttc 1860
caatcaggtg gccgtgctgt atcaggatgt gaactgtaca gaggtgcctg tggcaatcca 1920
cgctgaccag ctgaccccaa cctggcgggt ttatagtaca ggtagtaatg tgtttcagac 1980
aagagccggt tgcctgattg gggccgaaca cgttaacaat tcttacgaat gtgacatccc 2040
tatcggagcc ggcatttgcg cctcctatca aacccagacc aacagcccag gaagtgctag 2100
cagcgtggct agtcagtcca tcatcgcata tactatgagt ctgggagccg agaatagcgt 2160
ggcctactcc aataacagca ttgccatccc aaccaatttt accatctctg tgaccactga 2220
gattctgcca gtgtcaatga ctaaaacctc agttgattgc acaatgtata tctgtggcga 2280
ctctaccgag tgctctaacc tgctcctgca gtatgggtct ttttgtaccc agctgaacag 2340
ggctctgacc ggaattgccg tggagcagga taaaaacact caagaggtgt tcgcacaggt 2400
gaagcagatc tataagactc cccctatcaa ggatttcgga ggcttcaact tcagccagat 2460
cctgcctgac ccatccaaac ccagcaagag atcctttatt gaagatctgc tgttcaacaa 2520
ggtgaccctc gccgacgccg gctttatcaa gcagtacggt gactgcctgg gggacattgc 2580
cgctagagat ctcatttgcg ctcagaagtt taacggcctg accgtgctgc caccactcct 2640
caccgatgag atgatcgccc agtatacttc tgccctgctg gctggcacca tcacctccgg 2700
atggaccttc ggcgccggcg cagcactgca gatcccattc gccatgcaga tggcttatcg 2760
cttcaatggg atcggcgtga cccagaatgt gctgtacgag aatcagaagc tgatcgccaa 2820
ccagtttaat agcgccatcg gaaagatcca ggacagcctg agcagcactg ccagcgctct 2880
gggcaagctc caggacgttg tgaaccagaa cgctcaggcc ctgaacactc tggtgaaaca 2940
gctgtcatcc aattttggag ccatcagttc agtcctgaat gatatcctgt ctagactgga 3000
cccacccgag gctgaggttc agatcgaccg gctgatcacc ggcagactgc agagcctcca 3060
gacttatgtg acccagcagc tgatcagggc cgccgagatt agagccagcg ccaacctcgc 3120
tgctaccaaa atgagcgagt gcgttctggg acagtctaag cgcgtggact tttgtgggaa 3180
aggataccac ctgatgagct ttcctcagag cgctcctcat ggcgtggtgt tcctgcacgt 3240
gacttatgtg cctgcccagg aaaagaactt cacaacggcc cctgccattt gtcacgacgg 3300
aaaggcccac ttcccacgcg aaggcgtgtt tgtgtctaat ggaactcact ggttcgtgac 3360
tcagagaaat ttctatgagc cacagattat cacaactgat aacacctttg tgagcgggaa 3420
ttgtgacgtg gttatcggca ttgtgaataa taccgtctat gaccccctgc agccagaact 3480
ggacagcttt aaggaagagc tggataagta cttcaagaac cacacatccc cagacgtgga 3540
tctgggggac atcagtggca tcaacgcctc tgtggtgaat atccagaagg agatcgatcg 3600
gctgaatgag gtggccaaga acctgaacga gtctctgatc gacctgcagg agctggggaa 3660
atacgagcag ggcggctaca tccctgaggc ccccagggac ggccaggcct acgtgaggaa 3720
ggacggcgag tgggtgctgc tgtccacctt cctgtagtga taaggtacc 3769
<210> 3
<211> 38229
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcgagggat gagcgaccgt taggggcggg gcgagtgacg ttttgatgac gtggttgcga 60
ggaggagcca gtttgcaagt tctcgtggga aaagtgacgt caaacgaggt gtggtttgaa 120
cacggaaata ctcaattttc ccgcgctctc tgacaggaaa tgaggtgttt ctgggcggat 180
gcaagtgaaa acgggccatt ttcgcgcgaa aactgaatga ggaagtgaaa atctgagtaa 240
tttcgcgttt atggcaggga ggagtatttg ccgagggccg agtagacttt gaccgattac 300
gtgggggttt cgattaccgt gtttttcacc taaatttccg cgtacggtgt caaagtccgg 360
tgtttttacg tacgatatca tttccccgaa agtgccacct gaccgtaact ataacggtcc 420
taaggtagcg aaagctcaga tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct 480
ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 540
agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 600
atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt 660
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 720
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 780
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 840
ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 900
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 960
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 1020
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 1080
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 1140
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 1200
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 1260
aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 1320
gctagcgttt aaacgggccc ctgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc 1380
aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 1440
ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 1500
acaggcggcc gccgccatgg gcaagaggtc cgccggcagc atcatgtggc tggcctccct 1560
ggccgtcgtg attgcctgcg ccggcgcttc tcagtgtgtg aatctgacaa cacggaccca 1620
gctgcctccc gcctatacca actccttcac caggggggtg tactaccctg ataaggtgtt 1680
tcggtcatct gtgctgcata gcacccagga tctgttcctg cccttcttta gcaacgtgac 1740
ttggttccac gccatccacg tgagtggcac aaatggaacc aagaggttcg acaatcctgt 1800
gctgcctttc aacgacggag tgtacttcgc cagcactgaa aagtccaata tcattagggg 1860
ctggatcttt ggcacaaccc tggactccaa aacccagtcc ctgctgatcg tgaacaacgc 1920
caccaacgtt gtgattaagg tgtgtgagtt tcagttttgc aatgacccct tccttggcgt 1980
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caataattgc accttcgaat acgtgagcca gccattcctg atggatctgg agggtaaaca 2100
gggcaatttt aagaacctgc gcgaatttgt gtttaagaat attgatggat atttcaagat 2160
ctactctaaa cataccccca tcaatctcgt gagagatctg ccacagggct ttagcgccct 2220
ggaaccactc gtggacctgc caatcggcat caatattaca cggttccaga cccttctggc 2280
cctgcatcgg tcttacctga cccctggcga tagttcctcc ggctggactg ccggggccgc 2340
cgcctattac gtgggatacc tgcagcccag gacatttctc ctgaaatata atgagaacgg 2400
caccatcacc gacgcagtgg attgtgctct ggacccactg tccgagacca aatgcacact 2460
gaagtctttc acagtggaga aaggcatcta tcagacttcc aactttcgcg ttcagcccac 2520
agagagcatc gttaggtttc ctaatatcac taacctgtgc ccattcggag aagtgtttaa 2580
tgccaccagg ttcgccagtg tctacgcttg gaaccgcaag aggatttcta actgcgtcgc 2640
cgactactca gtgctgtaca acagcgctag tttctccaca ttcaaatgtt acggagtgtc 2700
tccaaccaag ctgaatgacc tgtgtttcac taacgtgtac gccgatagtt tcgttatcag 2760
aggcgacgag gtgcgccaga tcgctcccgg acagactggc aaaattgctg actacaacta 2820
caagctccct gacgacttca ccgggtgcgt gattgcatgg aacagcaaca atctggattc 2880
caaagtagga gggaattata actacctgta ccgcctcttt agaaagtcca acctgaaacc 2940
ctttgaaagg gatatttcca cagagatcta tcaggccggc tctacccctt gtaacggcgt 3000
ggagggcttt aattgttact ttcctctgca gagctatggg ttccagccaa caaatggcgt 3060
gggctatcag ccatataggg tggtggtgct gagtttcgaa ctcctgcatg cccctgctac 3120
cgtgtgcggc cctaagaagt ctaccaatct ggtgaaaaat aagtgcgtga actttaactt 3180
caatggcctg acaggaaccg gcgtgctgac agaaagcaac aaaaagttcc tgcctttcca 3240
gcaattcggc agagatatcg ccgataccac tgacgctgtg agagaccccc agaccctgga 3300
gattctcgac ataacaccct gctccttcgg cggagtgagc gtcattacac caggaacaaa 3360
cacttccaat caggtggccg tgctgtatca ggatgtgaac tgtacagagg tgcctgtggc 3420
aatccacgct gaccagctga ccccaacctg gcgggtttat agtacaggta gtaatgtgtt 3480
tcagacaaga gccggttgcc tgattggggc cgaacacgtt aacaattctt acgaatgtga 3540
catccctatc ggagccggca tttgcgcctc ctatcaaacc cagaccaaca gcccaggaag 3600
tgctagcagc gtggctagtc agtccatcat cgcatatact atgagtctgg gagccgagaa 3660
tagcgtggcc tactccaata acagcattgc catcccaacc aattttacca tctctgtgac 3720
cactgagatt ctgccagtgt caatgactaa aacctcagtt gattgcacaa tgtatatctg 3780
tggcgactct accgagtgct ctaacctgct cctgcagtat gggtcttttt gtacccagct 3840
gaacagggct ctgaccggaa ttgccgtgga gcaggataaa aacactcaag aggtgttcgc 3900
acaggtgaag cagatctata agactccccc tatcaaggat ttcggaggct tcaacttcag 3960
ccagatcctg cctgacccat ccaaacccag caagagatcc tttattgaag atctgctgtt 4020
caacaaggtg accctcgccg acgccggctt tatcaagcag tacggtgact gcctggggga 4080
cattgccgct agagatctca tttgcgctca gaagtttaac ggcctgaccg tgctgccacc 4140
actcctcacc gatgagatga tcgcccagta tacttctgcc ctgctggctg gcaccatcac 4200
ctccggatgg accttcggcg ccggcgcagc actgcagatc ccattcgcca tgcagatggc 4260
ttatcgcttc aatgggatcg gcgtgaccca gaatgtgctg tacgagaatc agaagctgat 4320
cgccaaccag tttaatagcg ccatcggaaa gatccaggac agcctgagca gcactgccag 4380
cgctctgggc aagctccagg acgttgtgaa ccagaacgct caggccctga acactctggt 4440
gaaacagctg tcatccaatt ttggagccat cagttcagtc ctgaatgata tcctgtctag 4500
actggaccca cccgaggctg aggttcagat cgaccggctg atcaccggca gactgcagag 4560
cctccagact tatgtgaccc agcagctgat cagggccgcc gagattagag ccagcgccaa 4620
cctcgctgct accaaaatga gcgagtgcgt tctgggacag tctaagcgcg tggacttttg 4680
tgggaaagga taccacctga tgagctttcc tcagagcgct cctcatggcg tggtgttcct 4740
gcacgtgact tatgtgcctg cccaggaaaa gaacttcaca acggcccctg ccatttgtca 4800
cgacggaaag gcccacttcc cacgcgaagg cgtgtttgtg tctaatggaa ctcactggtt 4860
cgtgactcag agaaatttct atgagccaca gattatcaca actgataaca cctttgtgag 4920
cgggaattgt gacgtggtta tcggcattgt gaataatacc gtctatgacc ccctgcagcc 4980
agaactggac agctttaagg aagagctgga taagtacttc aagaaccaca catccccaga 5040
cgtggatctg ggggacatca gtggcatcaa cgcctctgtg gtgaatatcc agaaggagat 5100
cgatcggctg aatgaggtgg ccaagaacct gaacgagtct ctgatcgacc tgcaggagct 5160
ggggaaatac gagcagggcg gctacatccc tgaggccccc agggacggcc aggcctacgt 5220
gaggaaggac ggcgagtggg tgctgctgtc caccttcctg tagtgataag gtaccaagct 5280
taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 5340
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 5400
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 5460
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 5520
tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagcagatc tgcagatctg aattcatcta 5580
tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggtattatgg gtattatggg tctgcattaa 5640
tgaatcggtc agatatcgac atatgctggc caccgtacat gtggcttccc atgctcgcaa 5700
gccctggccc gagttcgagc acaatgtcat gaccaggtgc aatatgcatc tggggtcccg 5760
ccgaggcatg ttcatgccct accagtgcaa cctgaattat gtgaaggtgc tgctggagcc 5820
cgatgccatg tccagagtga gcctgacggg ggtgtttgac atgaatgtgg aggtgtggaa 5880
gattctgaga tatgatgaat ccaagaccag gtgccgagcc tgcgagtgcg gagggaagca 5940
tgccaggttc cagcccgtgt gtgtggatgt gacggaggac ctgcgacccg atcatttggt 6000
gttgccctgc accgggacgg agttcggttc cagcggggaa gaatctgact agagtgagta 6060
gtgttctggg gcgggggagg acctgcatga gggccagaat aactgaaatc tgtgcttttc 6120
tgtgtgttgc agcagcatga gcggaagcgg ctcctttgag ggaggggtat tcagccctta 6180
tctgacgggg cgtctcccct cctgggcggg agtgcgtcag aatgtgatgg gatccacggt 6240
ggacggccgg cccgtgcagc ccgcgaactc ttcaaccctg acctatgcaa ccctgagctc 6300
ttcgtcgttg gacgcagctg ccgccgcagc tgctgcatct gccgccagcg ccgtgcgcgg 6360
aatggccatg ggcgccggct actacggcac tctggtggcc aactcgagtt ccaccaataa 6420
tcccgccagc ctgaacgagg agaagctgtt gctgctgatg gcccagctcg aggccttgac 6480
ccagcgcctg ggcgagctga cccagcaggt ggctcagctg caggagcaga cgcgggccgc 6540
ggttgccacg gtgaaatcca aataaaaaat gaatcaataa ataaacggag acggttgttg 6600
attttaacac agagtctgaa tctttatttg atttttcgcg cgcggtaggc cctggaccac 6660
cggtctcgat cattgagcac ccggtggatc ttttccagga cccggtagag gtgggcttgg 6720
atgttgaggt acatgggcat gagcccgtcc cgggggtgga ggtagctcca ttgcagggcc 6780
tcgtgctcgg gggtggtgtt gtaaatcacc cagtcatagc aggggcgcag ggcatggtgt 6840
tgcacaatat ctttgaggag gagactgatg gccacgggca gccctttggt gtaggtgttt 6900
acaaatctgt tgagctggga gggatgcatg cggggggaga tgaggtgcat cttggcctgg 6960
atcttgagat tggcgatgtt accgcccaga tcccgcctgg ggttcatgtt gtgcaggacc 7020
accagcacgg tgtatccggt gcacttgggg aatttatcat gcaacttgga agggaaggcg 7080
tgaaagaatt tggcgacgcc tttgtgcccg cccaggtttt ccatgcactc atccatgatg 7140
atggcgatgg gcccgtgggc ggcggcctgg gcaaagacgt ttcgggggtc ggacacatca 7200
tagttgtggt cctgggtgag gtcatcatag gccattttaa tgaatttggg gcggagggtg 7260
ccggactggg ggacaaaggt accctcgatc ccgggggcgt agttcccctc acagatctgc 7320
atctcccagg ctttgagctc ggaggggggg atcatgtcca cctgcggggc gataaagaac 7380
acggtttccg gggcggggga gatgagctgg gccgaaagca agttccggag cagctgggac 7440
ttgccgcagc cggtggggcc gtagatgacc ccgatgaccg gctgcaggtg gtagttgagg 7500
gagagacagc tgccgtcctc ccggaggagg ggggccacct cgttcatcat ctcgcgcacg 7560
tgcatgttct cgcgcaccag ttccgccagg aggcgctctc cccccaggga taggagctcc 7620
tggagcgagg cgaagttttt cagcggcttg agtccgtcgg ccatgggcat tttggagagg 7680
gtttgttgca agagttccag gcggtcccag agctcggtga tgtgctctac ggcatctcga 7740
tccagcagac ctcctcgttt cgcgggttgg gacggctgcg ggagtagggc accagacgat 7800
gggcgtccag cgcagccagg gtccggtcct tccagggtcg cagcgtccgc gtcagggtgg 7860
tctccgtcac ggtgaagggg tgcgcgccgg gctgggcgct tgcgagggtg cgcttcaggc 7920
tcatccggct ggtcgaaaac cgctcccgat cggcgccctg cgcgtcggcc aggtagcaat 7980
tgaccatgag ttcgtagttg agcgcctcgg ccgcgtggcc tttggcgcgg agcttacctt 8040
tggaagtctg cccgcaggcg ggacagagga gggacttgag ggcgtagagc ttgggggcga 8100
ggaagacgga ctcgggggcg taggcgtccg cgccgcagtg ggcgcagacg gtctcgcact 8160
ccacgagcca ggtgaggtcg ggctggtcgg ggtcaaaaac cagtttcccg ccgttctttt 8220
tgatgcgttt cttacctttg gtctccatga gctcgtgtcc ccgctgggtg acaaagaggc 8280
tgtccgtgtc cccgtagacc gactttatgg gccggtcctc gagcggtgtg ccgcggtcct 8340
cctcgtagag gaaccccgcc cactccgaga cgaaagcccg ggtccaggcc agcacgaagg 8400
aggccacgtg ggacgggtag cggtcgttgt ccaccagcgg gtccaccttt tccagggtat 8460
gcaaacacat gtccccctcg tccacatcca ggaaggtgat tggcttgtaa gtgtaggcca 8520
cgtgaccggg ggtcccggcc gggggggtat aaaagggtgc gggtccctgc tcgtcctcac 8580
tgtcttccgg atcgctgtcc aggagcgcca gctgttgggg taggtattcc ctctcgaagg 8640
cgggcatgac ctcggcactc aggttgtcag tttctagaaa cgaggaggat ttgatattga 8700
cggtgccggc ggagatgcct ttcaagagcc cctcgtccat ctggtcagaa aagacgatct 8760
ttttgttgtc gagcttggtg gcgaaggagc cgtagagggc gttggagagg agcttggcga 8820
tggagcgcat ggtctggttt ttttccttgt cggcgcgctc cttggcggcg atgttgagct 8880
gcacgtactc gcgcgccacg cacttccatt cggggaagac ggtggtcagc tcgtcgggca 8940
cgattctgac ctgccagccc cgattatgca gggtgatgag gtccacactg gtggccacct 9000
cgccgcgcag gggctcatta gtccagcaga ggcgtccgcc cttgcgcgag cagaaggggg 9060
gcagggggtc cagcatgacc tcgtcggggg ggtcggcatc gatggtgaag atgccgggca 9120
ggaggtcggg gtcaaagtag ctgatggaag tggccagatc gtccagggca gcttgccatt 9180
cgcgcacggc cagcgcgcgc tcgtagggac tgaggggcgt gccccagggc atgggatggg 9240
taagcgcgga ggcgtacatg ccgcagatgt cgtagacgta gaggggctcc tcgaggatgc 9300
cgatgtaggt ggggtagcag cgccccccgc ggatgctggc gcgcacgtag tcatacagct 9360
cgtgcgaggg ggcgaggagc cccgggccca ggttggtgcg actgggcttt tcggcgcggt 9420
agacgatctg gcggaaaatg gcatgcgagt tggaggagat ggtgggcctt tggaagatgt 9480
tgaagtgggc gtggggcagt ccgaccgagt cgcggatgaa gtgggcgtag gagtcttgca 9540
gcttggcgac gagctcggcg gtgactagga cgtccagagc gcagtagtcg agggtctcct 9600
ggatgatgtc atacttgagc tgtccctttt gtttccacag ctcgcggttg agaaggaact 9660
cttcgcggtc cttccagtac tcttcgaggg ggaacccgtc ctgatctgca cggtaagagc 9720
ctagcatgta gaactggttg acggccttgt aggcgcagca gcccttctcc acggggaggg 9780
cgtaggcctg ggcggccttg cgcagggagg tgtgcgtgag ggcgaaagtg tccctgacca 9840
tgaccttgag gaactggtgc ttgaagtcga tatcgtcgca gcccccctgc tcccagagct 9900
ggaagtccgt gcgcttcttg taggcggggt tgggcaaagc gaaagtaaca tcgttgaaga 9960
ggatcttgcc cgcgcggggc ataaagttgc gagtgatgcg gaaaggttgg ggcacctcgg 10020
cccggttgtt gatgacctgg gcggcgagca cgatctcgtc gaagccgttg atgttgtggc 10080
ccacgatgta gagttccacg aatcgcggac ggcccttgac gtggggcagt ttcttgagct 10140
cctcgtaggt gagctcgtcg gggtcgctga gcccgtgctg ctcgagcgcc cagtcggcga 10200
gatgggggtt ggcgcggagg aaggaagtcc agagatccac ggccagggcg gtttgcagac 10260
ggtcccggta ctgacggaac tgctgcccga cggccatttt ttcgggggtg acgcagtaga 10320
aggtgcgggg gtccccgtgc cagcgatccc atttgagctg gagggcgaga tcgagggcga 10380
gctcgacgag ccggtcgtcc ccggagagtt tcatgaccag catgaagggg acgagctgct 10440
tgccgaagga ccccatccag gtgtaggttt ccacatcgta ggtgaggaag agcctttcgg 10500
tgcgaggatg cgagccgatg gggaagaact ggatctcctg ccaccaattg gaggaatggc 10560
tgttgatgtg atggaagtag aaatgccgac ggcgcgccga acactcgtgc ttgtgtttat 10620
acaagcggcc acagtgctcg caacgctgca cgggatgcac gtgctgcacg agctgtacct 10680
gagttccttt gacgaggaat ttcagtggga agtggagtcg tggcgcctgc atctcgtgct 10740
gtactacgtc gtggtggtcg gcctggccct cttctgcctc gatggtggtc atgctgacga 10800
gcccgcgcgg gaggcaggtc cagacctcgg cgcgagcggg tcggagagcg aggacgaggg 10860
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gtgtgaccac cgtcccccgt ttcttcttgg gcggctgggg cgacgggggc ggtgcctctt 11100
ccatggttag aagcggcggc gaggacgcgc gccgggcggc aggggcggct cggggcccgg 11160
aggcaggggc ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggt aggttctggt actgcgcccg 11220
gagaagactg gcgtgagcga cgacgcgacg gttgacgtcc tggatctgac gcctctgggt 11280
gaaggccacg ggacccgtga gtttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatctcggt 11340
atcgttgacg gcggcctgcc gcaggatctc ttgcacgtcg cccgagttgt cctggtaggc 11400
gatctcggtc atgaactgct cgatctcctc ctcttgaagg tctccgcggc cggcgcgctc 11460
cacggtggcc gcgaggtcgt tggagatgcg gcccatgagc tgcgagaagg cgttcatgcc 11520
cgcctcgttc cagacgcggc tgtagaccac gacgccctcg ggatcgcggg cgcgcatgac 11580
cacctgggcg aggttgagct ccacgtggcg cgtgaagacc gcgtagttgc agaggcgctg 11640
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gcggagcggc atctcgctga cgtcgcccag cgcctccaaa cgttccatgg cctcgtaaaa 11760
gtccacggcg aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgag acggtcaact cctcctccag 11820
aagacggatg agctcggcga tggtggcgcg cacctcgcgc tcgaaggccc ccgggagttc 11880
ctccacttcc tcttcttcct cctccactaa catctcttct acttcctcct caggcggcag 11940
tggtggcggg ggagggggcc tgcgtcgccg gcggcgcacg ggcagacggt cgatgaagcg 12000
ctcgatggtc tcgccgcgcc ggcgtcgcat ggtctcggtg acggcgcgcc cgtcctcgcg 12060
gggccgcagc gtgaagacgc cgccgcgcat ctccaggtgg ccgggggggt ccccgttggg 12120
cagggagagg gcgctgacga tgcatcttat caattgcccc gtagggactc cgcgcaagga 12180
cctgagcgtc tcgagatcca cgggatctga aaaccgctga acgaaggctt cgagccagtc 12240
gcagtcgcaa ggtaggctga gcacggtttc ttctggcggg tcatgttggt tgggagcggg 12300
gcgggcgatg ctgctggtga tgaagttgaa ataggcggtt ctgagacggc ggatggtggc 12360
gaggagcacc aggtctttgg gcccggcttg ctggatgcgc agacggtcgg ccatgcccca 12420
ggcgtggtcc tgacacctgg ccaggtcctt gtagtagtcc tgcatgagcc gctccacggg 12480
cacctcctcc tcgcccgcgc ggccgtgcat gcgcgtgagc ccgaagccgc gctggggctg 12540
gacgagcgcc aggtcggcga cgacgcgctc ggcgaggatg gcttgctgga tctgggtgag 12600
ggtggtctgg aagtcatcaa agtcgacgaa gcggtggtag gctccggtgt tgatggtgta 12660
ggagcagttg gccatgacgg accagttgac ggtctggtgg cccggacgca cgagctcgtg 12720
gtacttgagg cgcgagtagg cgcgcgtgtc gaagatgtag tcgttgcagg tgcgcaccag 12780
gtactggtag ccgatgagga agtgcggcgg cggctggcgg tagagcggcc atcgctcggt 12840
ggcgggggcg ccgggcgcga ggtcctcgag catggtgcgg tggtagccgt agatgtacct 12900
ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt ggaggcgcgc gggaactcgc ggacgcggtt 12960
ccagatgttg cgcagcggca ggaagtagtt catggtgggc acggtctggc ccgtgaggcg 13020
cgcgcagtcg tggatgctct atacgggcaa aaacgaaagc ggtcagcggc tcgactccgt 13080
ggcctggagg ctaagcgaac gggttgggct gcgcgtgtac cccggttcga atctcgaatc 13140
aggctggagc cgcagctaac gtggtattgg cactcccgtc tcgacccaag cctgcaccaa 13200
ccctccagga tacggaggcg ggtcgttttg caactttttt ttggaggccg gatgagacta 13260
gtaagcgcgg aaagcggccg accgcgatgg ctcgctgccg tagtctggag aagaatcgcc 13320
agggttgcgt tgcggtgtgc cccggttcga ggccggccgg attccgcggc taacgagggc 13380
gtggctgccc cgtcgtttcc aagaccccat agccagccga cttctccagt tacggagcga 13440
gcccctcttt tgttttgttt gtttttgcca gatgcatccc gtactgcggc agatgcgccc 13500
ccaccaccct ccaccgcaac aacagccccc tccacagccg gcgcttctgc ccccgcccca 13560
gcagcaactt ccagccacga ccgccgcggc cgccgtgagc ggggctggac agagttatga 13620
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gacgaggccg gcctggtgta caacgcgctg ctggagcgcg tggcccgcta caacagcacc 15000
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cagggcctgt ggggcgtgca ggccccggtc ggggaccgcg cgacggtgtc gagcctgctg 15360
acgccgaact cgcgcctgct gctgctgctg gtggccccct tcacggacag cggcagcatc 15420
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cacgtggacg agcagaccta ccaggagatc acccacgtga gccgcgccct gggccaggac 15540
gacccgggca acctggaagc caccctgaac tttttgctga ccaaccggtc gcagaagatc 15600
ccgccccagt acgcgctcag caccgaggag gagcgcatcc tgcgttacgt gcagcagagc 15660
gtgggcctgt tcctgatgca ggagggggcc acccccagcg ccgcgctcga catgaccgcg 15720
cgcaacatgg agcccagcat gtacgccagc aaccgcccgt tcatcaataa actgatggac 15780
tacttgcatc gggcggccgc catgaactct gactatttca ccaacgccat cctgaatccc 15840
cactggctcc cgccgccggg gttctacacg ggcgagtacg acatgcccga ccccaatgac 15900
gggttcctgt gggacgatgt ggacagcagc gtgttctccc cccgaccggg tgctaacgag 15960
cgccccttgt ggaagaagga aggcagcgac cgacgcccgt cctcggcgct gtccggccgc 16020
gagggtgctg ccgcggcggt gcccgaggcc gccagtcctt tcccgagctt gcccttctcg 16080
ctgaacagta tccgcagcag cgagctgggc aggatcacgc gcccgcgctt gctgggcgaa 16140
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gggatagaaa gcctggtgga caagatgagc cgctggaaga cgtatgcgca ggagcacagg 16260
gacgatcccc gggcgtcgca gggggccacg agccggggca gcgccgcccg taaacgccgg 16320
tggcacgaca ggcagcgggg acagatgtgg gacgatgagg actccgccga cgacagcagc 16380
gtgttggact tgggtgggag tggtaacccg ttcgctcacc tgcgcccccg tatcgggcgc 16440
atgatgtaag agaaaccgaa aataaatgat actcaccaag gccatggcga ccagcgtgcg 16500
ttcgtttctt ctctgttgtt gttgtatcta gtatgatgag gcgtgcgtac ccggagggtc 16560
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cgctggaggc tccttacgtg cccccgcggt acctggcgcc tacggagggg cggaacagca 16680
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agtcggcgga catcgcctcg ctgaactacc agaacgacca cagcaacttc ctgaccaccg 16800
tggtgcagaa caatgacttc acccccacgg aggccagcac ccagaccatc aactttgacg 16860
agcgctcgcg gtggggcggc cagctgaaaa ccatcatgca caccaacatg cccaacgtga 16920
acgagttcat gtacagcaac aagttcaagg cgcgggtgat ggtctcccgc aagaccccca 16980
atggggtgac agtgacagag gattatgatg gtagtcagga tgagctgaag tatgaatggg 17040
tggaatttga gctgcccgaa ggcaacttct cggtgaccat gaccatcgac ctgatgaaca 17100
acgccatcat cgacaattac ttggcggtgg ggcggcagaa cggggtgctg gagagcgaca 17160
tcggcgtgaa gttcgacact aggaacttca ggctgggctg ggaccccgtg accgagctgg 17220
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tcctggatgt cgacgcctat gagaaaagca aggaggatgc agcagctgaa gcaactgcag 17460
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cagcggccga ggcggctgaa accgaaagta agatagtcat tcagccggtg gagaaggata 17580
gcaagaacag gagctacaac gtactaccgg acaagataaa caccgcctac cgcagctggt 17640
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cgcctgcttt gcagatcaat ggccctcaca tgccgccttc gcgttcccat tacgggctac 19860
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cagcgccact gagacacact tggaaacatc ttgtaataaa ccaatggact ctgacgctcc 20100
tggtcctgtg atgtgttttc gtagacagat ggaagacatc aatttttcgt ccctggctcc 20160
gcgacacggc acgcggccgt tcatgggcac ctggagcgac atcggcacca gccaactgaa 20220
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aatggcatga catcactggt actgatgaaa agtatggagg cagagctctt aagcctgata 21600
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acaactttat cgggctcatg tactacaaca gcactggcaa tatgggggtg ctggccggtc 21960
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ttaaatgtct ttaataaaca gcactttcat gttacacatg catctgagat gatttattta 24480
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gcctcggagc agcgactcgc ccaacttcgc attcgccagc agcaggagag agccgtcaag 30480
gagctgcagg atgcggtggc catccaccag tgcaagagag gcatcttctg cctggtgaaa 30540
caggccaaga tctcctacga ggtcactcca aacgaccatc gcctctccta cgagctcctg 30600
cagcagcgcc agaagttcac ctgcctggtc ggagtcaacc ccatcgtcat cacccagcag 30660
tctggcgata ccaaggggtg catccactgc tcctgcgact cccccgactg cgtccacact 30720
ctgatcaaga ccctctgcgg cctccgcgac ctcctcccca tgaactaatc acccccttat 30780
ccagtgaaat aaagatcata ttgatgatga ttttacagaa ataaaaaata atcatttgat 30840
ttgaaataaa gatacaatca tattgatgat ttgagtttaa caaaaaaata aagaatcact 30900
tacttgaaat ctgataccag gtctctgtcc atgttttctg ccaacaccac ttcactcccc 30960
tcttcccagc tctggtactg caggccccgg cgggctgcaa acttcctcca cacgctgaag 31020
gggatgtcaa attcctcctg tccctcaatc ttcattttat cttctatcag atgtccaaaa 31080
agcgcgtccg ggtggatgat gacttcgacc ccgtctaccc ctacgatgca gacaacgcac 31140
cgaccgtgcc cttcatcaac ccccccttcg tctcttcaga tggattccaa gagaagcccc 31200
tgggggtgtt gtccctgcga ctggccgacc ccgtcaccac caagaacggg gaaatcaccc 31260
tcaagctggg agagggggtg gacctcgatt cctcgggaaa actcatctcc aacacggcca 31320
ccaaggccgc cgcccctctc agtttttcca acaacaccat ttcccttaac atggatcacc 31380
ccttttacac taaagatgga aaattatcct tacaagtttc tccaccatta aatatactga 31440
gaacaagcat tctaaacaca ctagctttag gttttggatc aggtttagga ctccgtggct 31500
ctgccttggc agtacagtta gtctctccac ttacatttga tactgatgga aacataaagc 31560
ttaccttaga cagaggtttg catgttacaa caggagatgc aattgaaagc aacataagct 31620
gggctaaagg tttaaaattt gaagatggag ccatagcaac caacattgga aatgggttag 31680
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ttggatctgg ccttagcttt gacagtacag gagccataat ggctggtaac aaagaagacg 31800
ataaactcac tttgtggaca acacctgatc catcaccaaa ctgtcaaata ctcgcagaaa 31860
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aactctgaaa cacaaaataa aataaagttc aagtgtttta ttgattcaac agtttcacag 32460
aaccctagta ttcaacctgc cacctccctc ccaacacaca gagtacacag tcctttctcc 32520
ccggctggcc ttaaaaagca tcatatcatg ggtaacagac atattcttag gtgttatatt 32580
ccacacggtt tcctgtcgag ccaaacgctc atcagtgata ttaataaact ccccgggcag 32640
ctcacttaag ttcatgtcgc tgtccagctg ctgagccaca ggctgctgtc caacttgcgg 32700
ttgcttaacg ggcggcgaag gagaagtcca cgcctacatg ggggtagagt cataatcgtg 32760
catcaggata gggcggtggt gctgcagcag cgcgcgaata aactgctgcc gccgccgctc 32820
cgtcctgcag gaatacaaca tggcagtggt ctcctcagcg atgattcgca ccgcccgcag 32880
cataaggcgc cttgtcctcc gggcacagca gcgcaccctg atctcactta aatcagcaca 32940
gtaactgcag cacagcacca caatattgtt caaaatccca cagtgcaagg cgctgtatcc 33000
aaagctcatg gcggggacca cagaacccac gtggccatca taccacaagc gcaggtagat 33060
taagtggcga cccctcataa acacgctgga cataaacatt acctcttttg gcatgttgta 33120
attcaccacc tcccggtacc atataaacct ctgattaaac atggcgccat ccaccaccat 33180
cctaaaccag ctggccaaaa cctgcccgcc ggctatacac tgcagggaac cgggactgga 33240
acaatgacag tggagagccc aggactcgta accatggatc atcatgctcg tcatgatatc 33300
aatgttggca caacacaggc acacgtgcat acacttcctc aggattacaa gctcctcccg 33360
cgttagaacc atatcccagg gaacaaccca ttcctgaatc agcgtaaatc ccacactgca 33420
gggaagacct cgcacgtaac tcacgttgtg cattgtcaaa gtgttacatt cgggcagcag 33480
cggatgatcc tccagtatgg tagcgcgggt ttctgtctca aaaggaggta gacgatccct 33540
actgtacgga gtgcgccgag acaaccgaga tcgtgttggt cgtagtgtca tgccaaatgg 33600
aacgccggac gtagtcattt tcgtacttgc tgtagcagaa cctggtccgg gcgctgcaca 33660
ccgatcgccg gcggcggtct cggcgcttgg aacgctcggt gttgaaattg taaaacagcc 33720
actctctcag accgtgcagc agatctaggg cctcaggagt gatgaagatc ccatcatgcc 33780
tgatggctct gatcacatcg accaccgtgg aatgggccag acccagccag atgatgcaat 33840
tttgttgggt ttcggtgacg gcgggggagg gaagaacagg aagaaccatg attaactttt 33900
aatccaaacg gtctcggagt acttcaaaat gaagatcgcg gagatggcac ctctcgcccc 33960
cgctgtgttg gtggaaaata acagccaggt caaaggtgat acggttctcg agatgttcca 34020
cggtggcttc cagcaaagcc tccacgcgca catccagaaa caagacaata gcgaaagcgg 34080
gagggttctc taattcctca atcatcatgt tacactcctg caccatcccc agataatttt 34140
catttttcca gccttgaatg attcgaacta gttcctgagg taaatccaag ccagccatga 34200
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gatattctgc tcctggttca cctgcagcag attgacaagc ggaatatcaa aatctctgcc 34320
gcgatccctg agctcctccc tcagcaataa ctgtaagtac tctttcatat cctctccgaa 34380
atttttagcc ataggaccac caggaataag attagggcaa gccacagtac agataaaccg 34440
aagtcctccc cagtgagcat tgccaaatgc aagactgcta taagcatgct ggctagaccc 34500
ggtgatatct tccagataac tggacagaaa atcgcccagg caatttttaa gaaaatcaac 34560
aaaagaaaaa tcctccaggt ggacgtttag agcctcggga acaacgatga agtaaatgca 34620
agcggtgcgt tccagcatgg ttagttagct gatctgtaga aaaaacaaaa atgaacatta 34680
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ggggtctccg gcgcgaccct cgtaaaaatt gtcgctatga ttgaaaacca tcacagagag 34800
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acccgccccg cccctaacgg tcgcccgtct ctcagccaat cagcgccccg catccccaaa 35400
ttcaaacacc tcatttgcat attaacgcgc acaaaaagtt tgaggtatat tattgatgat 35460
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cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 35580
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gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 35700
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ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 35880
gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 35940
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 36000
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 36060
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 36120
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 36180
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 36240
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 36300
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 36360
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 36420
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 36480
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 36540
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 36600
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 36660
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 36720
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 36780
tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 36840
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 36900
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 36960
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 37020
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 37080
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 37140
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tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 37260
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 37320
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 37380
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 37440
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cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 37620
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gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 37740
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 37800
ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 37860
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cctcaaactt tttgtgcgcg ttaatatgca aatgaggcgt ttgaatttgg ggaggaaggg 38220
cggtgattg 38229
<210> 4
<211> 38340
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcgagggat gagcgaccgt taggggcggg gcgagtgacg ttttgatgac gtggttgcga 60
ggaggagcca gtttgcaagt tctcgtggga aaagtgacgt caaacgaggt gtggtttgaa 120
cacggaaata ctcaattttc ccgcgctctc tgacaggaaa tgaggtgttt ctgggcggat 180
gcaagtgaaa acgggccatt ttcgcgcgaa aactgaatga ggaagtgaaa atctgagtaa 240
tttcgcgttt atggcaggga ggagtatttg ccgagggccg agtagacttt gaccgattac 300
gtgggggttt cgattaccgt gtttttcacc taaatttccg cgtacggtgt caaagtccgg 360
tgtttttacg tacgatatca tttccccgaa agtgccacct gaccgtaact ataacggtcc 420
taaggtagcg aaagctcaga tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct 480
ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 540
agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 600
atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt 660
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 720
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 780
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 840
ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 900
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 960
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 1020
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 1080
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 1140
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 1200
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 1260
aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 1320
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aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 1440
ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 1500
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ggccgtcgtg attgcctgcg ccggcgcttc tcagtgtgtg aatctgacaa cacggaccca 1620
gctgcctccc gcctatacca actccttcac caggggggtg tactaccctg ataaggtgtt 1680
tcggtcatct gtgctgcata gcacccagga tctgttcctg cccttcttta gcaacgtgac 1740
ttggttccac gccatccacg tgagtggcac aaatggaacc aagaggttcg acaatcctgt 1800
gctgcctttc aacgacggag tgtacttcgc cagcactgaa aagtccaata tcattagggg 1860
ctggatcttt ggcacaaccc tggactccaa aacccagtcc ctgctgatcg tgaacaacgc 1920
caccaacgtt gtgattaagg tgtgtgagtt tcagttttgc aatgacccct tccttggcgt 1980
gtattatcat aagaataata agtcttggat ggagtctgag ttcagagtgt actcctcagc 2040
caataattgc accttcgaat acgtgagcca gccattcctg atggatctgg agggtaaaca 2100
gggcaatttt aagaacctgc gcgaatttgt gtttaagaat attgatggat atttcaagat 2160
ctactctaaa cataccccca tcaatctcgt gagagatctg ccacagggct ttagcgccct 2220
ggaaccactc gtggacctgc caatcggcat caatattaca cggttccaga cccttctggc 2280
cctgcatcgg tcttacctga cccctggcga tagttcctcc ggctggactg ccggggccgc 2340
cgcctattac gtgggatacc tgcagcccag gacatttctc ctgaaatata atgagaacgg 2400
caccatcacc gacgcagtgg attgtgctct ggacccactg tccgagacca aatgcacact 2460
gaagtctttc acagtggaga aaggcatcta tcagacttcc aactttcgcg ttcagcccac 2520
agagagcatc gttaggtttc ctaatatcac taacctgtgc ccattcggag aagtgtttaa 2580
tgccaccagg ttcgccagtg tctacgcttg gaaccgcaag aggatttcta actgcgtcgc 2640
cgactactca gtgctgtaca acagcgctag tttctccaca ttcaaatgtt acggagtgtc 2700
tccaaccaag ctgaatgacc tgtgtttcac taacgtgtac gccgatagtt tcgttatcag 2760
aggcgacgag gtgcgccaga tcgctcccgg acagactggc aaaattgctg actacaacta 2820
caagctccct gacgacttca ccgggtgcgt gattgcatgg aacagcaaca atctggattc 2880
caaagtagga gggaattata actacctgta ccgcctcttt agaaagtcca acctgaaacc 2940
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ggagggcttt aattgttact ttcctctgca gagctatggg ttccagccaa caaatggcgt 3060
gggctatcag ccatataggg tggtggtgct gagtttcgaa ctcctgcatg cccctgctac 3120
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gcaattcggc agagatatcg ccgataccac tgacgctgtg agagaccccc agaccctgga 3300
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aatccacgct gaccagctga ccccaacctg gcgggtttat agtacaggta gtaatgtgtt 3480
tcagacaaga gccggttgcc tgattggggc cgaacacgtt aacaattctt acgaatgtga 3540
catccctatc ggagccggca tttgcgcctc ctatcaaacc cagaccaaca gcccacggcg 3600
ggctcggagc gtggctagtc agtccatcat cgcatatact atgagtctgg gagccgagaa 3660
tagcgtggcc tactccaata acagcattgc catcccaacc aattttacca tctctgtgac 3720
cactgagatt ctgccagtgt caatgactaa aacctcagtt gattgcacaa tgtatatctg 3780
tggcgactct accgagtgct ctaacctgct cctgcagtat gggtcttttt gtacccagct 3840
gaacagggct ctgaccggaa ttgccgtgga gcaggataaa aacactcaag aggtgttcgc 3900
acaggtgaag cagatctata agactccccc tatcaaggat ttcggaggct tcaacttcag 3960
ccagatcctg cctgacccat ccaaacccag caagagatcc tttattgaag atctgctgtt 4020
caacaaggtg accctcgccg acgccggctt tatcaagcag tacggtgact gcctggggga 4080
cattgccgct agagatctca tttgcgctca gaagtttaac ggcctgaccg tgctgccacc 4140
actcctcacc gatgagatga tcgcccagta tacttctgcc ctgctggctg gcaccatcac 4200
ctccggatgg accttcggcg ccggcgcagc actgcagatc ccattcgcca tgcagatggc 4260
ttatcgcttc aatgggatcg gcgtgaccca gaatgtgctg tacgagaatc agaagctgat 4320
cgccaaccag tttaatagcg ccatcggaaa gatccaggac agcctgagca gcactgccag 4380
cgctctgggc aagctccagg acgttgtgaa ccagaacgct caggccctga acactctggt 4440
gaaacagctg tcatccaatt ttggagccat cagttcagtc ctgaatgata tcctgtctag 4500
actggacaaa gtcgaggctg aggttcagat cgaccggctg atcaccggca gactgcagag 4560
cctccagact tatgtgaccc agcagctgat cagggccgcc gagattagag ccagcgccaa 4620
cctcgctgct accaaaatga gcgagtgcgt tctgggacag tctaagcgcg tggacttttg 4680
tgggaaagga taccacctga tgagctttcc tcagagcgct cctcatggcg tggtgttcct 4740
gcacgtgact tatgtgcctg cccaggaaaa gaacttcaca acggcccctg ccatttgtca 4800
cgacggaaag gcccacttcc cacgcgaagg cgtgtttgtg tctaatggaa ctcactggtt 4860
cgtgactcag agaaatttct atgagccaca gattatcaca actgataaca cctttgtgag 4920
cgggaattgt gacgtggtta tcggcattgt gaataatacc gtctatgacc ccctgcagcc 4980
agaactggac agctttaagg aagagctgga taagtacttc aagaaccaca catccccaga 5040
cgtggatctg ggggacatca gtggcatcaa cgcctctgtg gtgaatatcc agaaggagat 5100
cgatcggctg aatgaggtgg ccaagaacct gaacgagtct ctgatcgacc tgcaggagct 5160
ggggaaatac gagcagtata tcaagtggcc ctggtacatc tggctggggt ttatcgctgg 5220
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accgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 5460
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gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 5940
gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 6000
atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 6060
ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 6120
caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt agtgttctgg 6180
ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat ctgtgctttt ctgtgtgttg 6240
cagcagcatg agcggaagcg gctcctttga gggaggggta ttcagccctt atctgacggg 6300
gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg tggacggccg 6360
gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctatgca accctgagct cttcgtcgtt 6420
ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcatc tgccgccagc gccgtgcgcg gaatggccat 6480
gggcgccggc tactacggca ctctggtggc caactcgagt tccaccaata atcccgccag 6540
cctgaacgag gagaagctgt tgctgctgat ggcccagctc gaggccttga cccagcgcct 6600
gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggagcag acgcgggccg cggttgccac 6660
ggtgaaatcc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt gattttaaca 6720
cagagtctga atctttattt gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga 6780
tcattgagca cccggtggat cttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg 6840
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ggggtggtgt tgtaaatcac ccagtcatag caggggcgca gggcatggtg ttgcacaata 6960
tctttgagga ggagactgat ggccacgggc agccctttgg tgtaggtgtt tacaaatctg 7020
ttgagctggg agggatgcat gcggggggag atgaggtgca tcttggcctg gatcttgaga 7080
ttggcgatgt taccgcccag atcccgcctg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg 7140
gtgtatccgg tgcacttggg gaatttatca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat 7200
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ggcccgtggg cggcggcctg ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc atagttgtgg 7320
tcctgggtga ggtcatcata ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gccggactgg 7380
gggacaaagg taccctcgat cccgggggcg tagttcccct cacagatctg catctcccag 7440
gctttgagct cggagggggg gatcatgtcc acctgcgggg cgataaagaa cacggtttcc 7500
ggggcggggg agatgagctg ggccgaaagc aagttccgga gcagctggga cttgccgcag 7560
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ctgccgtcct cccggaggag gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac gtgcatgttc 7680
tcgcgcacca gttccgccag gaggcgctct ccccccaggg ataggagctc ctggagcgag 7740
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cctcctcgtt tcgcgggttg ggacggctgc gggagtaggg caccagacga tgggcgtcca 7920
gcgcagccag ggtccggtcc ttccagggtc gcagcgtccg cgtcagggtg gtctccgtca 7980
cggtgaaggg gtgcgcgccg ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc 8040
tggtcgaaaa ccgctcccga tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgaccatga 8100
gttcgtagtt gagcgcctcg gccgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagtct 8160
gcccgcaggc gggacagagg agggacttga gggcgtagag cttgggggcg aggaagacgg 8220
actcgggggc gtaggcgtcc gcgccgcagt gggcgcagac ggtctcgcac tccacgagcc 8280
aggtgaggtc gggctggtcg gggtcaaaaa ccagtttccc gccgttcttt ttgatgcgtt 8340
tcttaccttt ggtctccatg agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt 8400
ccccgtagac cgactttatg ggccggtcct cgagcggtgt gccgcggtcc tcctcgtaga 8460
ggaaccccgc ccactccgag acgaaagccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt 8520
gggacgggta gcggtcgttg tccaccagcg ggtccacctt ttccagggta tgcaaacaca 8580
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cggagatgcc tttcaagagc ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt 8880
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cctgccagcc ccgattatgc agggtgatga ggtccacact ggtggccacc tcgccgcgca 9120
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ccagcatgac ctcgtcgggg gggtcggcat cgatggtgaa gatgccgggc aggaggtcgg 9240
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ccagcgcgcg ctcgtaggga ctgaggggcg tgccccaggg catgggatgg gtaagcgcgg 9360
aggcgtacat gccgcagatg tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggatg ccgatgtagg 9420
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cgagctcggc ggtgactagg acgtccagag cgcagtagtc gagggtctcc tggatgatgt 9720
catacttgag ctgtcccttt tgtttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt 9780
ccttccagta ctcttcgagg gggaacccgt cctgatctgc acggtaagag cctagcatgt 9840
agaactggtt gacggccttg taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaggcct 9900
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gggagggggc ctgcgtcgcc ggcggcgcac gggcagacgg tcgatgaagc gctcgatggt 12120
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ctcgagatcc acgggatctg aaaaccgctg aacgaaggct tcgagccagt cgcagtcgca 12360
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ccgcagctaa cgtggtattg gcactcccgt ctcgacccaa gcctgcacca accctccagg 13320
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ccgtcgtttc caagacccca tagccagccg acttctccag ttacggagcg agcccctctt 13560
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cgagcagacc gtgaaggagg agagcaactt ccaaaaatcc ttcaacaacc acgtgcgcac 14100
cctgatcgcg cgcgaggagg tgaccctggg cctgatgcac ctgtgggacc tgctggaggc 14160
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ttacatgcgc atgaccctga aagtgctgac cctgagcgac gatctggggg tgtaccgcaa 14520
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gatgcatagt ctgcagcggg ccctgaccgg ggccgggacc gagggggaga gctactttga 14640
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ctacgtagaa gaggtggacg atgaggtgga cgaggagggc gagtacctgg aagactgatg 14760
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caactacgcg ctgcatcctt ccatcatccc cacgccgggc taccgcggca cgcgcttcta 19740
ccgcggtcat accagcagcc gccgccgcaa gaccaccact cgccgccgcc gtcgccgcac 19800
cgccgctgca accacccctg ccgccctggt gcggagagtg taccgccgcg gccgcgcacc 19860
tctgaccctg ccgcgcgcgc gctaccaccc gagcatcgcc atttaaactt tcgcctgctt 19920
tgcagatcaa tggccctcac atgccgcctt cgcgttccca ttacgggcta ccgaggaaga 19980
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cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc 20100
gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 20160
tgagacacac ttggaaacat cttgtaataa accaatggac tctgacgctc ctggtcctgt 20220
gatgtgtttt cgtagacaga tggaagacat caatttttcg tccctggctc cgcgacacgg 20280
cacgcggccg ttcatgggca cctggagcga catcggcacc agccaactga acgggggcgc 20340
cttcaattgg agcagtctct ggagcgggct taagaatttc gggtccacgc ttaaaaccta 20400
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ctctacagtg gctaagcccc tgccgccggt ggccgtggcc cgcgcgcgac ccgggggcac 20880
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gtggagagcc caggactcgt aaccatggat catcatgctc gtcatgatat caatgttggc 33420
acaacacagg cacacgtgca tacacttcct caggattaca agctcctccc gcgttagaac 33480
catatcccag ggaacaaccc attcctgaat cagcgtaaat cccacactgc agggaagacc 33540
tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa agtgttacat tcgggcagca gcggatgatc 33600
ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc aaaaggaggt agacgatccc tactgtacgg 33660
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cgtagtcatt ttcgtacttg ctgtagcaga acctggtccg ggcgctgcac accgatcgcc 33780
ggcggcggtc tcggcgcttg gaacgctcgg tgttgaaatt gtaaaacagc cactctctca 33840
gaccgtgcag cagatctagg gcctcaggag tgatgaagat cccatcatgc ctgatggctc 33900
tgatcacatc gaccaccgtg gaatgggcca gacccagcca gatgatgcaa ttttgttggg 33960
tttcggtgac ggcgggggag ggaagaacag gaagaaccat gattaacttt taatccaaac 34020
ggtctcggag tacttcaaaa tgaagatcgc ggagatggca cctctcgccc ccgctgtgtt 34080
ggtggaaaat aacagccagg tcaaaggtga tacggttctc gagatgttcc acggtggctt 34140
ccagcaaagc ctccacgcgc acatccagaa acaagacaat agcgaaagcg ggagggttct 34200
ctaattcctc aatcatcatg ttacactcct gcaccatccc cagataattt tcatttttcc 34260
agccttgaat gattcgaact agttcctgag gtaaatccaa gccagccatg ataaagagct 34320
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gagctcctcc ctcagcaata actgtaagta ctctttcata tcctctccga aatttttagc 34500
cataggacca ccaggaataa gattagggca agccacagta cagataaacc gaagtcctcc 34560
ccagtgagca ttgccaaatg caagactgct ataagcatgc tggctagacc cggtgatatc 34620
ttccagataa ctggacagaa aatcgcccag gcaattttta agaaaatcaa caaaagaaaa 34680
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ttccagcatg gttagttagc tgatctgtag aaaaaacaaa aatgaacatt aaaccatgct 34800
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tgaaaaaaag cgcccgagga agcaataagg cactacaatg ctcagtctca agtccagcaa 35040
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tcaaaaaaat acgcgcactt cctcaaacgc ccaaaactgc cgtcatttcc gggttcccac 35400
gctacgtcat caaaacacga ctttcaaatt ccgtcgaccg ttaaaaacgt cacccgcccc 35460
gcccctaacg gtcgcccgtc tctcagccaa tcagcgcccc gcatccccaa attcaaacac 35520
ctcatttgca tattaacgcg cacaaaaagt ttgaggtata ttattgatga tggttaatta 35580
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gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 36660
ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 36720
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<212> DNA
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Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr
20 25 30
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val
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Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln
50 55 60
Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile
65 70 75 80
His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu
85 90 95
Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser
115 120 125
Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu
130 135 140
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn
145 150 155 160
Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn
165 170 175
Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu
180 185 190
Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn
195 200 205
Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu
210 215 220
Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp
225 230 235 240
Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu
245 250 255
His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala
260 265 270
Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu
275 280 285
Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala
290 295 300
Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val
305 310 315 320
Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
325 330 335
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
340 345 350
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
355 360 365
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
370 375 380
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
385 390 395 400
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
405 410 415
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
420 425 430
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
435 440 445
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
450 455 460
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
465 470 475 480
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
485 490 495
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
500 505 510
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
515 520 525
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
530 535 540
Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly
545 550 555 560
Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln
565 570 575
Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln
580 585 590
Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser
595 600 605
Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr
610 615 620
Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln
625 630 635 640
Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln
645 650 655
Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr
660 665 670
Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr
675 680 685
Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
690 695 700
Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser
705 710 715 720
Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr
725 730 735
Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met
740 745 750
Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr
755 760 765
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val
770 775 780
Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile
785 790 795 800
Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln
805 810 815
Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
820 825 830
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln
835 840 845
Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala
850 855 860
Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu
865 870 875 880
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser
885 890 895
Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met
900 905 910
Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu
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Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly
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Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu
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Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys
965 970 975
Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile
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Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu
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Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu
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Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys
1025 1030 1035 1040
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly
1045 1050 1055
Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val
1060 1065 1070
Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr
1075 1080 1085
Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu
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Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn
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Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly
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Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro
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Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe
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Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile
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Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
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Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly
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Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
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Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys
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Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser
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Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttatcactag gtgtagtgca 20

Claims (10)

1.一种SARS-CoV-2病毒的免疫原，其特征在于，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白中的至少一者；
优选地，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
优选地，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：编码PreS蛋白的核苷酸序列，以及编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者；
优选地，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
优选地，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
3.一种表达盒，其特征在于，包括：如权利要求2中所述的核酸分子。
4.一种表达载体，其特征在于，包括载体，以及如权利要求2中所述的核酸分子或如权利要求3中所述的表达盒；
优选地，所述载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病毒。
5.一种转化体，其特征在于，包括表达系统，以及如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体；所述表达系统为真核生物或原核生物。
6.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是将如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养获得的。
7.一种重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建重组穿梭载体，所述重组穿梭载体装载有编码PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码SARS-CoV-2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列；对所述重组穿梭载体进行双酶切，回收目的基因片段，所述目的基因片段包括编码所述PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码所述全长S蛋白的核苷酸序列；
制备复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架；
将所述目的基因片段与所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架连接，获得表达载体；
对所述表达载体进行线性化处理；以及
将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养，获得所述重组腺病毒；
优选地，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
优选地，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
优选地，所述重组穿梭载体还包括基因表达调控元件，所述基因表达调控元件包括启动子和/或终止子。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1中所述的免疫原、或如权利要求2中所述的核酸分子、或如权利要求3中所述的表达盒、或如权利要求4中所述的表达载体、或如权利要求5中所述的转化体、或权利要求6中所述的重组腺病毒；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型；
优选地，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种；
优选地，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。
10.根据权利要求1中所述的免疫原、或权利要求2中所述的核酸分子、或权利要求3中所述的表达盒、或权利要求4中所述的表达载体、或权利要求5中所述的转化体、或权利要求6中所述的重组腺病毒、或如权利要求7中所述的制备方法制得的重组腺病毒、或权利要求8或9中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113150085A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的组合物
CN113755421A (zh) * 2021-09-28 2021-12-07 萝芊细胞因子有限公司 一种用于covid-19的口服性疫苗及抗体加强剂
CN114150005A (zh) * 2022-02-09 2022-03-08 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
WO2022122036A1 (zh) * 2020-12-10 2022-06-16 武汉博沃生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用
CN114703147A (zh) * 2022-04-18 2022-07-05 扬州大学 一种抗SARS-CoV-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用
WO2023001259A1 (zh) * 2021-07-23 2023-01-26 神州细胞工程有限公司 一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
WO2023160654A1 (zh) * 2022-02-25 2023-08-31 神州细胞工程有限公司 一种可诱导广谱中和活性重组多组分新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
WO2024183687A1 (zh) * 2023-03-03 2024-09-12 上海蓝鹊生物医药有限公司 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282232A (zh) * 2015-06-05 2017-01-04 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法
CN107988258A (zh) * 2017-12-12 2018-05-04 中国科学院微生物研究所 一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法
WO2019012371A1 (en) * 2017-07-11 2019-01-17 Pfizer Inc. IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING CEA MUC1 AND TERT
CN109790548A (zh) * 2016-06-23 2019-05-21 牛津大学创新有限公司 腺病毒载体
CN109797168A (zh) * 2018-09-28 2019-05-24 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L
CN111088271A (zh) * 2019-12-26 2020-05-01 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗
WO2020063370A4 (zh) * 2018-09-27 2020-06-25 武汉博沃生物科技有限公司 免疫组合物及其制备方法与应用
CN111333704A (zh) * 2020-02-24 2020-06-26 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
CN111405907A (zh) * 2017-08-07 2020-07-10 考尔德生物科技有限公司 构象稳定的rsv预融合f蛋白
CN111718951A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 宁波毓昌生物技术有限公司 重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用
US10822379B1 (en) * 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
WO2020243328A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 University Of Washington Flexible resistive single walled carbon nanotube sensor for point or care screening of diseases

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282232A (zh) * 2015-06-05 2017-01-04 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法
CN109790548A (zh) * 2016-06-23 2019-05-21 牛津大学创新有限公司 腺病毒载体
WO2019012371A1 (en) * 2017-07-11 2019-01-17 Pfizer Inc. IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING CEA MUC1 AND TERT
CN111405907A (zh) * 2017-08-07 2020-07-10 考尔德生物科技有限公司 构象稳定的rsv预融合f蛋白
CN107988258A (zh) * 2017-12-12 2018-05-04 中国科学院微生物研究所 一种基于黑猩猩腺病毒载体的寨卡病毒疫苗及其制备方法
WO2020063370A4 (zh) * 2018-09-27 2020-06-25 武汉博沃生物科技有限公司 免疫组合物及其制备方法与应用
CN109797168A (zh) * 2018-09-28 2019-05-24 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L
WO2020243328A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 University Of Washington Flexible resistive single walled carbon nanotube sensor for point or care screening of diseases
CN111088271A (zh) * 2019-12-26 2020-05-01 广州佰芮慷生物科技有限公司 一种基于复制缺陷型重组腺病毒载体的寨卡病毒疫苗
CN111333704A (zh) * 2020-02-24 2020-06-26 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
US10822379B1 (en) * 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
CN111718951A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 宁波毓昌生物技术有限公司 重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHING-LIN HSIEH等: "Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes", 《SCIENCE》 *
DANIEL WRAPP等: "Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion", 《SCIENCE》 *
GENBANK: "Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate, complete genome", 《GENBANK》 *
GENBANK: "surface glycoprotein [Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]", 《GENBANK》 *
GIOVANNI SALVATORI等: "SARS-CoV-2 SPIKE PROTEIN an optimal immunological target for vaccines", 《JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
JIANDONG HUO等: "Neutralization of SARS-CoV-2 by destruction of the prefusion spike", 《CELL HOST & MICROBE》 *
RINKE BOS等: "Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses", 《NPJ VACCINES》 *
SHENGXUE LUO: "A high infectious simian adenovirus type 23 vector based vaccine efficiently protects common marmosets against Zika virus infection", 《PLOS NEGL TROP DIS》 *
TINGTING LI等: "Characterization of the SARS-CoV-2 Spike in an Early Prefusion Conformation", 《BIORXIV》 *
毛亚萍等: "SARS-CoV-2毒株S蛋白突变及其影响的生物信息学分析", 《病毒学报》 *
江明金等: "新型冠状病毒刺突蛋白及其受体的结构与功能", 《中国药理学通报》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022122036A1 (zh) * 2020-12-10 2022-06-16 武汉博沃生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用
CN113150085A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的组合物
WO2023001259A1 (zh) * 2021-07-23 2023-01-26 神州细胞工程有限公司 一种可诱导广谱中和活性重组多价新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
CN113755421A (zh) * 2021-09-28 2021-12-07 萝芊细胞因子有限公司 一种用于covid-19的口服性疫苗及抗体加强剂
CN113755421B (zh) * 2021-09-28 2024-04-12 梦芊细胞因子有限公司 一种用于covid-19的口服性疫苗及抗体加强剂
CN114150005A (zh) * 2022-02-09 2022-03-08 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
CN114150005B (zh) * 2022-02-09 2022-04-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗
WO2023160654A1 (zh) * 2022-02-25 2023-08-31 神州细胞工程有限公司 一种可诱导广谱中和活性重组多组分新冠病毒三聚体蛋白疫苗的制备及应用
CN114703147A (zh) * 2022-04-18 2022-07-05 扬州大学 一种抗SARS-CoV-2广谱中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、检测试剂盒和应用
WO2024183687A1 (zh) * 2023-03-03 2024-09-12 上海蓝鹊生物医药有限公司 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用

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