KR20040086247A - 분비 단백질 - Google Patents

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KR20040086247A
KR20040086247A KR10-2004-7009758A KR20047009758A KR20040086247A KR 20040086247 A KR20040086247 A KR 20040086247A KR 20047009758 A KR20047009758 A KR 20047009758A KR 20040086247 A KR20040086247 A KR 20040086247A
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patient
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리차드조셉 파간
크리스토퍼벤자민 펠프릇
알렉스 거트리지
크리스틴 파워
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아레스 트레이딩 에스.에이.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 4개 나선 번들 사이토킨 족의 한 성분인 신규한 단백질 INSP037, 질병의 진단, 예방 및 치료에 인코딩 유전자의 핵산과 단백질을 이용하는 것에 관계한다.

Description

분비 단백질{SECRETED PROTEIN}
약물 개발 과정은 기능적 유전체학 시대가 도래하여 근본적으로 혁명 과정을 겪고 있다. "기능적 유전체학"이란 관심이 있는 단백질 서열에 기능을 부여하기 위해 생체 정보 도구를 이용하는 접근 방법에 이용된다. 이와 같은 도구는 서열 데이터를 만드는 속도가 단백질 서열에 기능을 부여하기 위한 연구실의 능력을 너무 빨리 앞지르기 때문에 그 필요성이 점차 증가되고 있다.
생체 정보 도구는 능력 및 정확도가 크기 때문에, 생화학적 특징을 가지는 통상의 기술에 신속하게 대체되고 있다. 또한, 본 발명을 확인하는데 이용되는 진보된 생체 정보 도구는 더 높은 신뢰도를 부여할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.
다양한 연구 기관 및 상업 조직에서는 이들이 이용할 수 있는 서열을 검사하고, 진행 단계에서 상당한 발견을 하고 있다. 그러나, 연구 및 약물 개발을 목적으로 유전자 및 이들이 인코드하는 폴리펩티드를 확인하고 추가 특징화하는 작업이 지속적으로 요구된다.
분비 단백질 소개
많은 생물학적 공정의 중심에는 세포에 의한 세포외 단백질을 제조 및 분비하는 능력이 있다. 효소, 생장 인자, 세포외 매트릭스 단백질 및 시그날 형성 분자들 모두 세포가 분비하는 것이다. 혈장 막과 분비 소포가 융합되어 분비된다. 그러나 전부는 아니지만 대부분 경우 단백질은 망상 내피로 향하고, 시그날 펩티드에 의해 분비성 소포로 된다. 시그날 펩티드는 세포질로부터 분비 소포와 같은 막에 결합된 격실로 폴리펩티드 쇄를 운반하는데 영향을 주는 cis-작용 서열이다. 분비성 소포를 표적으로 하는 폴리펩티드는 세포외매트릭스로 분비되거나 혈장 막에 유지된다. 혈장 막에 유지되는 폴리펩티드는 한 가지 이상의 막통과 도메인을 가진다. 세포의 기능에 중요하는 역할을 하는 분비 단백질의 예로는 사이토킨, 호르몬, 세포외 매트릭스 단백질(흡착 단백질), 프로테아제, 생장 및 분화 인자등이 있다. 이들 단백질의 일부 성질에 대한 설명을 다음에서 제공한다.
사이토킨 소개
사이토킨은 백혈구로부터 주로 분비되는 생장 인자 족으로, 나노몰 농도이하에서 세포 공정에 영향을 줄 수 있는 잠재적인 조절물질로 작용하는 메신저 단백질이다. 인터루킨, 뉴로트로핀, 생장인자, 인터페론, 케모킨은 모두 세포 수용체와 연합하여 작용하여, 세포 증식 및 분화를 조절하는 사이토킨 족이다. 이들 크기 때문에 사이토킨이 신체 주변으로 신속하게 이동하게 하고, 필요에 따라서는 분해되도록 한다. 광범위한 세포 기능 특히 면역 반응 및 세포 생장을 조절하는데 있어서 사이토킨 키증은 지난 20년간 상당히 많이 연구되어 왔다(Boppana, S.B (1996) Indian. J. Pediatr. 63(4):447-52). 다른 생장 인자로써 사이토킨은 한가지 특정 조직 또는 선(gland)로부터 생산된다기 보다는 상이한 여러 세포형에 의해 생산되는 사실로부터 통상의 호르몬으로부터 분화되고, 표적 세포에 위치하는 친화력이 높은 특정 수용체와 상호작용을 통하여 광범위한 세포에 영향을 줄 수도 있다.
모든 사이토킨 교통(communication) 시스템에서 다기능성(한 가지 메신져가 다중 효과를 생산하고) 및 중복성(redundancy-이와 같은 효과는 한가지 이상의 메신져에 의해 만들어짐)을 보인다(Tringali, G. et al (2000) Therapie. 55(l):171-5; Tessarollo, L. (1998) Cytokine Growth Factor Rev. 9(2):125-137). 세포에 개별 사이토킨 효과는 이의 농도, 다른 사이토킨의 농도, 사이토킨의 일시적인 서열, 세포내부의 상태(세포 사이클, 이웃 세포의 존제, 암 생성성 등)에 따라 달라진다.
비록 사이토킨은 큰 전구물질로부터 해독후 절단과정을 거쳐 일반적으로 작은 소단백질이다(200개 아미노산 이하). mRNA 교차 절단 과정에 추가하여, 다양한 각 사이토킨을 제공하는데, 이들 각 사이토킨은 생물학적 효과가 실질적으로 상이하다. 많은 사이토킨이 연합되어 있는 막 및 세포외 매트릭스도 분리된 바 있다(Okada-Ban, M. et al (2000) Int. J. Biochem. Cell Biol. 32(3):263-267; Atamas, S.P. (1997) Life Sci. 61.12):1105-1112).
사이토킨은 단위 군(family)으로 분류할 수 있는데, 대부분은 서로 관련이없다. 서열 유사성은 매우 낮기 때문에 2차 구조 조성을 근거하여 통상 분류한다. 이들 족은 전형적인 구성성분의 이름을 따는데, 예를 들면, IFN-형, IL2-형, IL1-형, Il-6 형, TNF-형(Zlotnik, A. et al., (2000) Immunity. 12(2):121-127)등과 같이 된다.
사이토킨은 면역 반응 조절(Nishihira, J. (1998) Int. J. Mol. Med. 2.l):17-28), 염증(Kim, P.K. et al., (2000) Surg. Clin. North. Am. 80(3):885894), 상처 치유(Clark, R.A. (1991) J. Cell Biochem. 46(l):1-2), 배형성 및 발생, 아포프톱시스(Flad, H.D. et al., (1999) Pathobiology. 67(5-6):291-293)와 같은 다중-세포 유기체에서 많은 중요한 반응에 관련된다. HIV 및 카포치 육종 바이러스와 같은 병인성 유기체(바이러스성 및 박테리아성)는 항-사이토킨 인자 뿐만 아니하 사이토킨 유사체를 인코드하여 사이토킨 수용체와 상호작용하여 세포의 면역 반응을 조절하도록 한다(Sozzani, S. et al., (2000) Pharru. Acta. Helv. 74(2-3):305-312; Aoki, Y. et al., (2000) J. Hernatother. Stem Cell Res. 9(2):137-145). 바이러스성 인코드된 사이토킨, 비로킨(virokines)은 숙주 면역계와 닮아서 숙주 면역계를 무력하게 하는 능력 때문에 바이러스의 병인성에 요구되는 것으로 보여진다.
사이토킨은 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 체장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증,바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염과 같은 감염을 포함하는 질환 및 질병의 치료, 예방 및 진단에 유용할 수 있다.
실제 바이러스에 의해 인코드된 사이토킨, 대식세포 저해성 단백질-Ⅱ은 Th2-형 세포의 선택성 모집 및 세포독성 면역 반응으로부터 이탈을 중재하는 능력이 있는 것으로 나타났다(Weber KS et al., (2001), Eur J Immunol. 2001 31(8):2458-66). 이와 같은 자료들은 Th1-형으로부터 염증성 세포 모집이 Th2-형 반응으로 향하게 하고, 따라서 세포 독성 반응으로부터 탈출을 할 수 있는vMIP-Ⅱ 면역 조절 역할을 한다는 증거를 제공한다. 따라서, 이 단백질을 이용하여, Th1-형 면역 반응이 과다하게 자극된 것과 연루된 과민성 대장 증후군 질환을 조절하는데 이용될 수 있다. 또 다른 연구에 따르면(Kawamoto S et al.,(Int 1 5 Immunol. 2001 13(5):685-94), vIL-10이 자가면역성 당뇨병 치료에 세포 IL-1O보다는 우수하다는 결과를 제시하였다. 이와 같은 결과에서 바이러스 인코드된 사이토킨은 바이러스 제거를 넘어선 강력한 치료요법적 장점을 가지고 있다는 것이다.
임상적으로 사이토킨을 이용하는 것은 면역계 조절 물질로써 이들의 역할에집중되어왔는데,(Rodriguez, F.H. et al., (2000) Curr. Pharm. Des. 6(6):665-680) 예를 들면, 갑상성 남에 대한 반응을 촉진시키는 것등이 될 수 있다(Schmutzler, C. et al., (2000) 143(l):15-24). 세포 생장 및 분화 조절이 사이토킨을 항암 표적으로 만든다(Lazar-Molnar, E. et al., (2000) Cytokine. 12(6):547-554; Gado, K. (2000) 24(4):195209). 사이토킨 및 사이토킨 수용체에 신규한 돌연변이체가 일부 경우에 질병 저항성을 부여하는 것으로 나타났다(van Deventer, S.J. et al., (2000) Intensive Care Med. 26 (Suppl. 1):S98:SI02). 잠재적인 부작용을 제거하고 활성을 조절하기 위한 합성 사이토킨(뮤테인(muteins))을 만드는 것이 연구의 중요한 방법중에 하나가 되었다(Shanafelt, A.B. et al., (1998) 95(16):9454-9458).
상기에서 설명한 것과 같이, 사이토킨 분자는 다양한 생리학적 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났는데, 이들중 많은 것들이 질병 진행과정에 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 활성의 변화는 질병의 표현형을 변화시키는 수단이 되고, 상기 확인된 질환 뿐만 아니라 다른 질병에 사이토킨이 중요한 역할을 하기 때문에 이들 질환 치료에 이용될 수 있어, 신규한 사이토킨 분자 동정이 상당히 연관이 있다.
인터페론 소개
인터페론은 4개 나선 번들의 사이토킨 족의 구성성분이다. 인터페론은 이들 구조와 산성 매체에서의 안정성에 따라서 타입 Ⅰ 또는 Ⅱ로 나뉜다. 타입 I 인터페론은 이들 서열에 근거하여, 5개 군으로 분류한다; 인터페론-알파(IFN-α), 인터페론-베타(IFN-β), 인터페론-오메가(IFN-θ), 인터페론-타우(IFN-τ); 지금까지 확인된 타입 Ⅱ인터페론은 활성화된 T 세포 및 NK 세포에 의해 만들어지는 인터페론-감마(IFN-γ).
타입 Ⅰ 인터페론 유전자는 사람 염색체 9번에 뭉쳐져 있다. 사람의 경우에, 적어도 14개 IFN-α 비-대립형질 유전자가 있고, 자연 발생적인 IFN-α 단백질의 수는 IFN-α유전자의 대립형질 모양에 따라 증가된다는 것이다(Jussain et al, 1996, J. Interferon Cytokine Res 16: 853-9).
인터페론은 세포 표면에 있는 특정 막 수용체에 결합하여 세포 활성을 발휘하게 하여, 세포내 일련의 복합적인 과정이 개시된다. 타입 I 인터페론이 다양한 생물학적 반응을 유도하는데, 예를 들면, 항-바이러스성, 면역 조절, 항-증식성 효과가 포함되는데, 이 결과로 다양한 질병 및 질환 치료에 효과가 있다는 것이 증명되었다.
인터페론은 강력한 항-바이러스성 물질이고 알파-인터페론인데, 특히 사람의 파필로마바이러스 감염, 간염 B, 간염 C 감염(Jaeckel et al, 2001, 345(2): 1452-7)을 포함하는 다양한 바이러스 감염 치료에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 타입 I 인터페론은 또한 세포 증식을 저해하고, 알파-인터페론은 수년간 모(毛)세포 백혈병, 다발성 골수종, 만성 임파세포 백혈병, low-grade 임파종, Kaposi's 육종, 만성 골수성 백혈병, 신장 세포 암종, 난소암과 같은 다양한 악성 종양 치료에 임상적으로 이용되었다. 또한, 타입 I 인터페론은 자가면역 질환 치료에 유용하고, 인터페론-베타는 다발성 경색 치료 사용에 승인을 받았다.
인터페론-타우(τ)는 반추동물의 태반 균질물질에서 처음으로 확인되었고, 그 이후에 사람에서도 확인되었다(W096/35789). 인터페론-타우는 다른 타입 I 인터페론과 유사한 활성을 가지나 일부 상이한 효과를 발휘한다. 특히, 인터페론-타우는 착상을 촉진시키고 임신을 유지시키는 항-황체화 효과를 가진다(Martal et al, Reprod. Fertil Dev., 1997, 9(3): 355-80). 또한, 인터페론-알파와 인터페론-베타의 바이러스 유도는 일시적이어서 몇 시간 지속되나 인터페론-타우의 바이러스 발현 유도는 수일간 지속될 수 있기 때문에 HIV-1에 대한 항-레트로바이러스 효과를 가진는 것으로 밝혀졌다(Dereuddre-Bosquet et al, J. Acquir. Immune Defic Syndr. Hum. Retrovirol, 1996, 11(3): 241-6).
4가지 나선 번들 사이토킨 족의 구성성분인 분비 단백질은 다양한 생리학적 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌고, 역할중 대부분은 질병 진행에 중요한 역할을 할 수 있다. 특히, 인터페론은 다양한 생리학적 공정에 중요한 역할을 하고, 그 결과 광범위한 질병에 중요한 역할을 한다는 것이다. 그러나, 질병의 치료 및 예방을 위한 신규 약물을 개발하는데 이용될 수 있는 신규한 분비 단백질 및 신규한 인터페론을 확인할 필요성은 여전히 남아있다.
본 발명은 분비 단백질로 확인된 신규한 단백질 INSP037 특히, 4개 나선형 번들 사이토킨 폴드, 바람직하게는 인터페론-감마형 분자에 관계하고, 질병의 진단, 예방 및 치료에서 인코딩 유전자에서 이 단백질 및 핵산 서열을 이용하는 것에 관계한다.
여기에서 언급되고 있는 모든 공보, 특허 및 출원은 참고문헌으로 첨부된다.
도 1: Inpharmatica Genome Threader query SEQ ID NO:36의 결과.
도 2: SEQ ID NO:36과 관련 구조식에 Inpharmatica Genome Threader을 이용한 배열
도 3: INSP037 예상 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:35) 및 해독 서열(SEQ ID NO:36).
도 4: INSP037 클론된 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:35) 및 해독 서열(SEQ ID NO:36), INSP037의 예상 뉴클레오티드 및 클론 서열이 동일하다는 것을 설명한다.
도 5: PCRII-TOPO-IPAAA44548의 유전자 지도.
도 6: 발현벡터 pEAK12d 유전자 지도.
도 7: 플라스미드 pDONR201의 유전자 지도.
도 8: 발현벡터 pEAK12d-IPAAA44548-6HIS의 유전자 지도.
도 9: 대장균 발현벡터 pDEST14의 유전자 지도.
도 10: 플라스미드 pDEST14-IPAAA44548-6HIS의 유전자 지도.
도 11: PCRII-TOPO-IPAAA44548의 뉴클레오티드 서열.
도 12: pDEST1 4-IPAAA44548-6HIS의 뉴클레오티드 서열.
도 13: pEAK12D4PAAA44548-6HIS의 뉴클레오티드 서열.
도 14: INSP037 폴리펩티드(SEQ ID NO:36)의 NCBI-NR 결과-100% 일치가 되지 않는다는 것을 나타내고, 이는 INSP037이 신규하다는 것을 설명하는 것이다.
도 15: INSP037 폴리펩티드(SEQ ID NO:36)의 NCBI-month-aa -100% 일치가 되지 않는다는 것을 나타내고, 이는 INSP037이 신규하다는 것을 설명하는 것이다.
도 16: INSP037 폴리펩티드(SEQ ID NO:36)의 해독된 뉴클레오티드 데이터베이스 NCBI-month-nt 결과 - 100% 일치가 되지 않는다는 것을 나타내고, 이는 INSP037이 신규하다는 것을 설명하는 것이다.
본 발명은 INSP037 단백질이 4개 나선 번들 사이토킨 류의 구성원인 분리 단백질이라는 발견에 근거한 것이다. 좀더 구체적으로는 INSP037 단백질이 4개 나선 번들 사이토킨 폴드 특히 인터페론-감마 형 단백질 구성원이라는 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 다음과 같은 폴리펩티드를 제공한다;
(i) 폴리펩티드는 SEQ ID NO:36에서 언급하고 있는 아미노서열로 구성되고;
(ii) 폴리펩티드는 분비 단백질 기능을 가지는 단편으로 특히 4개 나선 번들 사이토킨 기능을 가지는 단편, 좀더 구체적으로는 인터페론 감마형 기능을 가지는 단편 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 가지는 단편이거나;
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가체로 구성된다.
SEQ ID NO:36에서 언급하고 있는 폴리펩티드는 여기에서 "INSP037 폴리펩티드"라고 명명한다. INSP037는 IPAAA44548으로도 명명한다.
바람직하게는 본 발명의 제 1 특징에 따른 INSP037 폴리펩티드는 4개 나선 번들 사이토킨 폴드, 특히 인터페론-감마 형 분자의 폴리펩티드 구성원으로써 기능을 한다. 두 번째 특징은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코드하는 정제된 핵산 분자를 제공한다. 적절하게는 SEQ ID NO:35(INSP037 폴리펩티드를 인코드하는)에서 언급하는 핵산 서열로 구성된 정제된 핵산 분자이다. 적절하게는 정제된 핵산 분자는 SEQ ID NO:35(INSP037 폴리펩티드를 인코드하는)에서 언급하는 것과 같은 핵산 서열로 구성되거나 또는 이 서열의 축중 등가체가 될 수 있다.
"4개 나선 번들 사이토킨 부류의 구성원"이란 용어는 당업자는 당분야에 알려진 다양한 검사법을 이용하여 사이토킨 부류의 구성원으로써 폴리펩티드가 기능을 하는지를 확인할 수 있을 것이고, 당분야에서 통상적으로 인지할 수 있을 정도의 용어이다. 예를 들면, 인터페론 활성은 암 세포에서 항-바이러스 활성 또는 항증식 활성을 측정하여 나타낸다. 검사 방법은 Schiller J.H., J Interferon Res 1986; 6(6):615-25 and Gibson, U.E. et aL, J Immunol Methods (1989) 20;125(12):105-13에서 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 제 3 특징에서 본 발명은 매우 높은 스트린젼트 조건하에서 본 발명의 제 2 특징의 핵산 분자와 하이브리드할 수 있는 정제된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제 4 특징에서 본 발명은 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터와 같은 벡터를 제공한다. 본 발명의 적절한 벡터에는 pDEST14-IPAAA44548-6HIS(도 10), PCRIITOPO-IPAAA44548(도 11), pDEST14-IPAAA44548-6HIS(도 12), pEAK12D-IPAAA44548-6HIS(도 13)이 포함된다.
본 발명의 제 5 특징에서 본 발명은 본 발명의 제 4 특징 벡터로 형질도입된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 제 6 특징에서 본 발명은 분비 단백질에 특이적으로 결합하여 적절하게는 분비 단백질 활성을 저해하고, 좀더 구체적으로는 4개 나선 번들 사이토킨 활성을 저해하고, 좀더 바람직하게는 본 발명의 제 1 특징의 인터페론-감마형 활성을 저해하는 리간드를 제공한다.
본 발명의 제 7 특징에서 본 발명은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코드하는 자연 유전자 발현을 변경시키는데 또는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드 활성을 조절하는데 효과적인 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 폴리펩티드의 활성 또는 유전자의 발현 수준을 증가(항진제) 또는 감소(길항제)시킬 수 있다. 중요한 것은, INSP037 폴리펩티드의 기능을 확인하면 질병의 치료 또는 진단에 효과적인 화합물을 확인하는 스크리닝 방법을고안할 수 있다는 것이다.
본 발명의 제 8 특징에서, 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드; 본 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자; 제 4 특징인 벡터; 제 5 특징인 숙주 세포; 제 6 특징인 리간드; 제 7 특징인 화합물을 치료 또는 진단에 사용하기 위해 제공하는 것이다. 이와 같은 분자들을 이용하여, 세포 증식성 질환, 자가면역/염증 질환, 심장맥관 질환, 신경 질환, 발생 질환, 대사 질환, 감염 및 다른 병인성 질환 치료용 약물을 제조하는데 이용할 수 있을 것이다. 특히 치료될 수 있는 질환에는 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 췌장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증, 바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염과 같은 감염을 포함하는 질환 및 질병등이 포함될 수 있으나 이에 국한되지는 않는다.
제 9 특징에서 본 발명은 환자에서 질병을 진단하는 방법을 제공하는데, 이방법은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코드하는 전연 유전자 발현 수준을 평가하거나 환자의 조직에서 제 1 특징의 폴리펩티드 활성을 평가하고, 기준과 발현 수준 또는 활성 수준을 비교하여, 기준과 차이가 있다는 것은 질병이 있다는 것을 암시하는 것이다. 이와 같은 방법은in vitro에서 적절하게 실시할 수 있다. 환자에서 질병 치료 효과를 모니터하는데 이용될 수도 있는데, 이 경우 폴리펩티드 활성 또는 발현 수준이 시간이 경과함에 따라 기준 수치에 가깝에 감소되는 경우에 질병으로부터 회복되고 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 감지하는 적절한 방법은 (a)본 발명의 제 6 특징인 항체와 같은 리간드를 생물학적 시료와 접촉시키는데, 이때 접촉 조건은 리간드-폴리펩티드 복합체가 형성할 수 있는 적절한 조건하에서 실시한다; (b) 복합체를 감지하는 단계로 구성된다.
본 발명의 제 9 특징에 따라 이와 같은 방법에도 여러 가지 차이가 있을 수 있는데, 단백질 수준의 이상을 감지하기 위해 짧은 프로브와의 핵산 하이브리드 반응, 점 돌연변이 분석; 폴리메라제 사슬 연장 반응(PCR), 항체를 이용하는 방법등이 있다는 것은 당업자는 인지할 수 있을 것이다. 환자에서 질병의 치료요법적인 치료 방법을 모니터하기 위해 단기적인 또는 장기적인 계획하에 유사한 방법을 이용할 수도 있을 것이다. 본 발명은 또한 질병을 진단하는데 이용할 수 있는 키트도 제공한다.
본 발명의 제 10 특징에서, 본 발명은 제 1 특징의 폴리펩티드를 4개 나선 번들 사이토킨 폴드의 폴리펩티드 구성원, 적절하게는 인터페론 감마형 분자의 용도를 제공한다.
제 11 특징으로, 본 발명은 제 1 특징의 폴리펩티드, 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 제 4 특징의 벡터, 제 6 특징의 리간드 또는 제 7 특징의 화합물과 제약학적으로 수용가능한 운반체로 구성된 약학 조성물을 제공한다.
제 12 특징으로, 본 발명은 제 1 특징의 폴리펩티드, 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 제 4 특징의 벡터, 제 5 특징의 숙주 세포, 제 6 특징의 리간드 또는 제 7 특징의 화합물을 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 췌장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증, 바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염과 같은 감염을 포함하는 질환 및 질병을 치료 또는 진단하기 위한 약물을 제조하는데 이용하는 용도를 제시한다.
제 13 특징에서, 본 발명은 제 1 특징의 폴리펩티드, 제 2 또는 제 3 특징의핵산 분자, 제 4 특징의 벡터, 제 5 특징의 숙주 세포, 제 6 특징의 리간드 또는 제 7 특징의 화합물을 환자에게 투여하는 것으로 구성된 환자의 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현 또는 제 1 특징의 폴리펩티드 활성이 건강한 상태의 사람 것과 비교하였을 때, 질병을 가진 환자에서 감소되는 질병의 경우, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산분자, 리간드 화합물은 항진제가 된다. 역으로, 제 1 특징인 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현 또는 제 1 특징의 폴리펩티드 활성이 건강한 상태의 사람 것과 비교하였을 때, 질병을 가진 환자에서 더 높은 질병의 경우, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산분자, 리간드 화합물은 길항제가 된다. 이와 같은 길항제로는 안티센스 핵산 분자, 리보자임, 항체와 같은 리간드가 포함된다.
제 14 특징으로, 본 발명은 제 1 특징인 폴리펩티드의 발현 수준을 더 높게, 또는 더 낮게 또는 발현이 없도록 형질변환된 유전자 전이 또는 녹아웃된 사람이 아닌 동물을 제공한다. 이와 같은 유전자 전이 동물은 질병 연구에 매우 유용한 모델이며, 질병의 치료 또는 진단에 효과적인 화합물을 확인하는 스크리닝 방법에도 이용할 수 있을 것이다.
본 발명을 이용하기 위해 사용할 수 있는 표준 기술 및 과정은 다음에 요약하였다. 본 발명에서 설명하고 있는 방법, 프로토콜, 세포 주, 벡터 및 시약에 국한시키지는 않는다는 것을 인지해야 한다. 여기에서 사용하는 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위를 이에 한정하고자 함이아니라는 것을 인지해야 한다.
명세서에서는 뉴클레오티드 및 핵산에 대해 표준 약어를 이용하였다.
본 발명에서는 다른 언급이 없는 한, 당분야에서 이용되는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학의 통상적인 기술을 이용한다.
이와 같은 기술은 문헌에서 충분히 설명하는 것들이다. 적절한 참고서적으로 Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and 11 (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)등이 포함된다.
여기에서 사용된 것과 같이, "폴리펩티드"는 두 개 이상의 아미노산이 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합(가령, peptide isosteres)에 의해 서로 연결된임의 펩티드 또는 단백질로 구성된 것이다. 폴리펩티드 용어에는 짧은 쇄(펩티드 및 올리고펩티드)와 긴 쇄(단백질)가 모두 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 성숙한 단백질형태가 될 수도 있고 또는 pre-, pro- , prepro- 단백질 형태가 되어, pre-, pro-, prepro- 부분을 절단하여 활성화시키면 활성을 가진 성숙한 폴리펩티드를 만들 수 있다. 이와 같은 폴리펩티드에서, pre-, pro-, prepro- 서열은 리더, 분비 서열이 될 수도 있고 성숙한 폴리펩티드 서열을 정제하는데 이용되는 서열이 될 수도 있다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드는 융합 단백질 형태를 취할 수도 있다. 예를 들면, 정제에 도움에 될 수 있는 분비 또는 리더 서열 또는 pro-서열을 포함하는 한가지 이상의 추가 아미노산을 포함하거나 또는 재조합에 의해 단백질을 생산하는 경우에, 단백질의 안정성을 높이는 수열이 추가 포함되면 유익할 수도 있다. 또는, 성숙한 폴리펩티드를 다른 화합물 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있는 화합물(가령 폴리에틸렌 글리콜)과 융합시킬 수도 있다.
폴리펩티드에는 20개 유전자를 인코드하는 아미노산 이외의 아미노산도 포함될 수 있는데, 이들 아미노산은 자연적인 공정 예를 들면 해독후 프로세싱에 의해 변형되거나 당분야에 공지된 화학적 변형기술을 이용하여 변형될 수도 있다. 이와본 발명의 폴리펩티드에 존재할 수 있는 이와 같은 공지의 변형 기술로는 글리코실화반응, 지질 부착, 설페이션, 글루타민산 잔기의 감마-카르복실화반응, 수산화반응, ADP-리보실화반응등이 포함된다. 다른 가능한 변형기술에는 아세틸화반응, 아실화반응, 아미데이션, 플라빈 공유결합에 의한 부착, 헤미(haeme) 잔기 공유결합에 의한 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 유도체의 공유적 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유적 부착, 교차-연결, 고리화반응, 이황화결합 형성, 디메틸화반응, 공유 교차 링크 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화반응, GPI 고정기 형성, 요오드화반응, 메틸화반응, 미리스톨화반응, 산화, 단백질 분해 공정, 포스포릴화반응, 프레닐화반응, 라셈화반응, 세리노일화반응, 아르기닐화 및 유비퀴닌화반응과 같이 단백질에 t-RNA 중개된 아미노산 추가 등이 이용될 수 있다.
폴리펩티드의 어느 위칭에도 변형이 일어날 수 있는데, 예를 들면, 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단에서도 변형이 있을 수 있다. 사실, 자연 발생 및 합성 폴리펩티드를 만들 수 있는 가장 흔한 방법으로는 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양단 모두를 공유결합 변형에 의해 차단하는 것이고, 이와 같은 변형도 본 발명에 존재한다.
폴리펩티드에서 일어날 수 있는 변형은 폴리펩티드가 어떻게 만들어졌냐에 따라 달라진다. 재조합에 의해 폴리펩티드가 만들어지는 경우에, 대부분에서 변형의 성질과 변형 정도는 특정 숙주 세포의 해독후 변형 능력과 문제의 폴리펩티드 아미노산 서열에 존재하는 변형 시그날에 의해 결정된다. 예를 들면, 상이한 숙주 세포간에 글리고실화 반응 패턴이 다양하다.
본 발명의 폴리펩티드는 임의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 이와 같은 폴리펩티드에는 자연 발생 폴리펩티드(예를 들면 세포 배양물로부터 정제된 분리 폴리펩티드), 재조합에 의해 만들어진 폴리펩티드(융합 단백질 포함), 합성에 의해만들어진 폴리펩티드 또는 이들 방법을 복합하여 만든 폴리펩티드등이 포함된다.
본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드에 기능적으로 등가인 폴리펩티드는 INSP037 폴리펩티드에 상동성인 폴리펩티드이다. 폴리펩티드의 한 서열이 다른 폴리펩티드의 서열과 동일하거나 유사성이 충분히 많은 경우에, 이들 두 폴리펩티드를 "상동성"이라고 한다. "동일성"이란 배열된 서열에서 서열간에 임의 지점에서 아미노산 잔기가 동일한 것을 말한다. "유사성"이란 서열간에 배열된 임이 지점에 아미노산 잔기가 유사한 형인 경우를 나타낸다. 서열의 동일성 및 유사성 정도는 바로 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1. Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
따라서, 상동성 폴리펩티드에는 천연 생물학적 변이체(가령, 폴리펩티드가 유도된 종내에 대립형질 변이체 또는 지형적 변이체), INSP037 폴리펩티드의 돌연변이체(아미노산 치환, 결손 및 삽입을 포함하는 돌연변이체)등이 포함된다. 이와 같은 돌연변이체에는 보존형 또는 비-보존형 아미노산(바람직하게는 보존형 아미노산에 의해)에 의해 한 가지 이상의 아미노산이 치환된 것으로써, 이와 같은 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코되되거나 인코드되지 않을 수도 있다.
전형적으로 이와 같은 치환은 다음의 군내에서 이루어진다; Ala, Val, Leu, Ile; Ser, Thr; 산성 아미노산 잔기 Asp, Glu; Asn, Gln; 염기성 잔기 Lys, Arg; 방향족 잔기 Phe, Tyr. 특별히 적절한 것으로는 5와 1O사이, 1과 5사이, 1과 3사이, 1과 2사이 또는 1개 아미노산이 치환, 결손 또는 추가된 변이체이다. 특별히 적절한 것으로는 단백질의 성질 및 활성에 변화를 주지 않는 침묵 치환, 추가 및 결손된 변이체이다. 또한 보존성 치환이 바람직하다.
이와 같은 돌연변이체에는 한가지 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다.
일반적으로, 두 개 폴리펩티드간에 80%이상 상동성을 가지는 경우에 기능적으로 등가라고 간주한다. 적절하게는 본 발명의 제 1 특징의 기능적으로 등가의 폴리펩티드는 INSP037 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편과 80%이상의 상동성 서열을 가진다. 폴리펩티드가 90%, 95%, 98%, 99%이상의 상동성을 가지는 경우에 더 바람직하다.
본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드에 기능적으로 등가의 폴리펩티드는 한 가지 이상의 구조적 배열 기술을 이용하여 확인된 폴리펩티드가 될 수 있다. 예를 들면, Biopendium. search database를 만드는 조사 도구를 만드는 Inpharmatica Genome Threader 기술을 이용하여(PCT patent application PCT/GBO1/01105) 현재 기능이 알려지지 않은 폴리펩티드를 확인할 수 있는데, INSP037 폴리펩티드와 비교하였을 때 상동성이 낮은 서열을 가지는 폴리펩티드의 경우도 INSP037 폴리펩티드 서열과 구조적 상동성이 상당히 큰 경우에 4개 나선 번들 사이토킨 활성, 적절하게는 인터페론 감마형 활성을 가지는 것으로 예상할 수 있다. "구조적 상동이 상당하다"는 것은 Inpharmatica Genome Threader에 의해 두 단백질의 구조적 상동성이 10% 또는 그 이상이라는 것을 말한다.
본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드에는 INSP037 폴리펩티드의 단편 또는 이들 폴리펩티드의 기능적 등가체의 단편이 포함되는데, 단, 이들 단편이 분비 단백질 활성, 적절하게는 4개 나선 번들 사이토킨 활성, 좀더 바람직하게는 인터페론 감마형 활성을 보유하거나 이들 폴리펩티드와 공통되는 항원 결정부위를 가지는 단편이어야 한다.
여기에서 사용된 용어로써, "단편"이란 INSP037 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전부는 아니지만 일부분이 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가체를 의미한다. 단편은 특정 서열에 따라 달라지지만, 적어도 n개의 연속 아미노산으로 구성되는데, 이때 n은 7 또는 그 이상(예를 들면, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 그 이상)이 된다. 소단편은 항원 결정부위를 형성할 수 있다.
이와 같은 단편은 "free-standing" 즉, 다른 아미노산 또는 폴리펩티드와 융합되거나 일부분으로 남아있지 않을 수 있고, 또는 이런 단편이 더 큰 폴리펩티드의 일부분으로 구성될 수도 있다. 더 큰 폴리펩티드의 일부분으로 구성되는 경우에, 본 발명의 단편은 가장 적절하게는 단일 연속 부분을 형성하게 된다. 예를 들면, 특정 적절한 구체예는 단편의 카르보닐 단부에 융합된 또는 단편의 아미노 단부에 융합된 Pre- 또는 pro-폴리펩티드를 가지는 단편에 관계한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편(적어도 한 개의 항원 결정부위로 구성된)을 이용하여, 폴리펩티드에 면역 특이적인 다클론 또는 단클론성 항체와 같은 리간드를 만들 수 있다. 이와 같은 항체를 이용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 클론을 확인하거나 친화성 크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 항체를 치료 또는 진단 목적으로 이용할 수도 있는데, 이는 당업자에게 명백한 사항이다.
"면역특이적"이란 선행기술에서 다른 관련 폴리펩티드에 대한 친화력보다 본 발명의 폴리펩티드에 더 큰 친화성을 항체가 가진다는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 것과 같이, "항체"란 고유 분자 및 이의 단편 예를 들면 문제의 항원 결정부위에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2, Fv와 같은 단편을 말한다. 이와 같은 항체는 본발명의 제 1 특징인 폴리펩티드에 결합한다.
다클론 항체가 바람직한 경우에, 생쥐, 토끼, 염소 또는 말과 같은 선택된 동물에 본 발명의 폴리펩티드를 면역주사한다. 동물을 면역주사하는데 이용되는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용하여 유도하거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 필요에 따라서 폴리펩티드에 운반체 단백질을 연결시킬 수 있다. 폴리펩티드에 화학적으로 결합시키는데 흔히 이용되는 운반체는 소혈청 알부민, 티로글로블린, 키홀 림펫 헤모시아닌등이 포함된다. 결합된 폴리펩티드를 이용하여 동물에 면역주사할 수 있다. 면역주사를 맞은 동물에서 혈청을 취하여 공지의 과정 가령 면역 친화성 크로마토그래피와 같은 공정을 이용하여 처리한다.
본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드에 대한 단클론 항체는 당업자가 바로 만들 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여 단클론항체를 만드는 일반적인 방법은 잘 알려져 있다(Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (I 985).
본 발명의 폴리펩티드에 대한 단클론 항체 패널을 다양한 설질, 가령, 이소타입, 에피토드, 친화력등으로 선별할 수 있다. 단클론 항체는 이들의 개별 폴리펩티드를 정제하는데 특히 유용하다. 또는 관심 대상의 단클론 항체를 인코드하는 유전자를 당분야에 공지의 기술인 PCR을 이용하여 하이브리도마에서 분리하고, 클론시켜, 적절한 벡터에서 발현시킬 수 있다.
사람의 항상성 부분에 결합 또는 융합된 사람이외의 동물에서 취한 다양한 부분으로 구성된 키메라 항체를 이용할 수도 있다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 1 5 (1987)).
항체는 개인에서 항원성을 적게 가질 수 있도록 예를 들면 인화(humanisation)반응을 통하여 변형시킬 수 있다(Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). 여기에서 사용된 용어인 "인화 항체"는 사람이 아닌 기능자 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 선별된 아미노산와 CDR 아미노산을 사람 항체에 있는 등가의 아미노산 잔기에 대체시킨 항체분자를 말한다. 따라서, 인화항체는 사람의 항체와는 상당히 닮았지만, 기증자 항체의 결합 능력을 가지고 있게 된다.
또 다른 것으로, 항체는 "이중-특이성" 항체가 될 수도 있는데, 이는 항체에 두가지 상이한 항원 결합 도메인을 가지는 것을 말하는데, 각 도메인은 상이한 에피토프에 관련된다.
파아지 디스플레이 기술을 이용하여, 관련 항체를 보유하는지에 대해 스크리닝되는 사람의 PCR 증폭된 V-유전자 레퍼토리 또는 고유 라이브러리의 레퍼토리에 있는 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 가지는 항체를 인코드하는 유전자를 선별할 수 있다. (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화력은 체인 셔플링(chain shuffling)을 이용하여 개선시킬 수 있다(Clackson, T. et al., (1991) Nature 352@ 624-628).
상기 기술에 의해 만들어지는 단클론 또는 다클론 항체는 면역검사, 방사능면역검사(RIA), 효소-연결된 면역 흡착 검사(ELISA)에 시약으로 이용될 수 있는 추가 용도를 가진다. 이와 같은 분야에서, 항체는 방사능동위원소, 형광 분자 또는 효소와 같은 분석적으로 감지가능한 시약으로 라벨될 수 있다.
본 발명의 제 2 또는 제 3 특징인 적절한 핵산 분자는 SEQ ID NO:36에서 언급하는 폴리펩티드 서열을 인코드하거나 이의 기능상 등가 폴리펩티드를 인코드하는 것이다. 이들 핵산 분자들은 여기에서 설명하는 분야에 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 특정 서열에 따라 달라지지만, 여기에서 설명하는 서열중 적어도n개 연속 뉴클레오티드로 구성되는데, 이때 n은 10 또는 그 이상이 된다(예를 들면, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 또는 그 이상).
본 발명의 핵산에는 상기에서 설명하는 핵산에 상보적인 서열(가령 안티센스 또는 프로브 목적)도 포함된다.
본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA 또는 cDNA, 합성 DNA, 게놈 DNA와 같은 DNA형이 될 수 있다. 클로닝, 화학적 합성 기술, 또는 이의 복합 기술을 이용하여 이와 같은 핵산 분자을 얻을 수 있다. 유기체로부터 분리하거나 또는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 상 포스포아미다트 화학적 합성과 같은 화학적 합성 방법을 이용하여 핵산 분자를 만들 수 있다. DNA 서열을in vitro또는in vivo전사에 의해 RNA 분자를 일반적으로 만들 수 있다.
핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥으로 되어 있다. 단일 가닥 DNA는 센스 가닥으로 알려진 코딩 가닥이거나 안티-센스 가닥으로도 알려진 넌-코딩 가닥이 될 수도 있다.
"핵산 분자"에는 변형된 골격구조를 포함하는 DNA와 RNA 유사체와 펩드티 핵산(PNA)을 포함할 수도 있다. 여기에서 설명하는 것과 같이, "PNA"는 리신으로 종료되는 아미노산 잔기의 펩티드 골격에 연결된 적어도 길이가 5개 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 분자 또는 항-유전자 물질을 말하는 것이다. 말단의 리신은 조성물에 안정성을 부여한다. PNA는 세포에서 이들의 수명을 연장시키기 위해 페길화(pegylation)될 수 있고, 이들은 상보적인 단일 가닥의 DNA 및 RNA에 선호적으로 결합할 수도 있고, 전사 연장을 종료시킬 수도 있다(Nielsen, P.E. et al. (1 993)Anticancer Drug Des. 8:53-63).
SEQ ID NO:36의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:35에서 볼 수 있는 핵산 분자의 코딩 서열과 동일할 수도 있다.
이들 분자는 유전자 코돈의 축중성으로 인하여 SEQ ID NO:36을 인코드하는 서열과는 상이한 서열을 가질 수도 있다. 이와 같은 핵산 분자에는 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드와 추가 코딩 서열, 가령 pro-, pre-, prepro- 폴리펩티드 서열과 같은 리더 또는 분비 서열을 인코드하는 코딩 서열에 대한 코딩 서열; 상기 언급한 추가 코딩 서열존재하에 또는 없이, 전사에 중요한 열할을 하나 해독되지 않은 서열과 같은 넌-코딩 5' & 3' 서열(종료 시그날 포함), 리보좀 결합, mRNA 안정성과 같은 추가적인 넌 코딩 서열에 대한 코딩 서열을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 핵산 분자에는 추가 기능을 제공하는 추가 아미노산을 인코드하는 추가 서열이 포함될 수도 있다.
본 발명의 제 2 및 제 3 특징이 되는 핵산 분자는 제 1 특징의 폴리펩티드의 단편 또는 기능적 등가체를 인코드할 수 있다. 이와 같은 핵산 분자는 자연-발생적인 대립형질 변이체와 같은 자연 발생 변이가 되거나 자연상태에서는 발생하지 않은 변이체가 될 수 있다. 이와 같은 비-자연적인 핵산 변이체는 핵산 분자, 세포 또는 유기체에 이용될 수 있는 돌연변이형성 기술에 의해 만들어질 수 있다.
이와 같은 변이체 중에 치환, 결손 또는 삽입에 의해 상기 핵산 분자와는 상이한 분자도 포함된다. 치환, 결손 또는 삽입은 한 가지 이상의 뉴클레오티드가 관계한다. 변이체는 코딩 또는 넌-코딩 또는 두 가지 모두에서 변경될 수도 있다.코딩 서열에서 변화는 보존성 또는 비-보전성 아미노산 치환, 결손 또는 삽입을 만들어낼 수 있다.
본 발명의 핵산 분자를 당분야에 공지된 일반적인 방법을 이용하여 만들수도 있는데, 예를 들면, 유전자 생성물(폴리펩티드)의 클로닝, 프로세싱, 발현을 변경시키는 것을 포함하는 다양한 방법으로 만들 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 조작하는데 이용될 수 있는 기술에는 무작위 절단와에 의한 DNA 셔플링, 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드의 PCR 재조합등이 포함된다. 부위-직접적인 돌연변이생성을 이용하여, 새로운 제한효소 부위를 추가시키거나 글리코실화 패턴을 변경시키거나 코돈 선호도를 변화시켜, 절단 변이체를 만들고, 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
본 발명의 제 1 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 이형 서열에 결찰시키면, 복합된 핵산 분자는 융합 단백질을 인코드하게 된다. 이와 같은 복합된 핵산 분자도 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징에 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드 활성 저해물질을 위한 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 복합된 핵산 분자를 이용하여, 상업적으로 이용할 수 있는 항체에 의해 인지될 수 이는 융합단백질을 발현시키는 것도 유용할 수 있다. 융합 단백질에는 본 발명의 폴리펩티드 서열과 이형 단백질의 서열사이에 절단 부위가 위치하도록 조작하여, 이형단백질로부터 폴리펩티드를 절단하여 정제할 수 있도록 한다.
본 발명의 핵산 분자에는 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자에 부분적으로 상보적인 안티센스 분자가 포함되어, 인코드되는 핵산 분자에 하이브리드될 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 표적 핵산을 특이적으로 인지하여, 특이적으로 결합함으로써 핵산의 전사를 방해해도록 고안할 수도 있다(see, for example, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56. 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991).
여기에서 언급되는 "하이브리드 반응"은 수소 결합에 의해 두 개 핵산이 서로 연합된 것을 말한다. 일반적으로 한 분자는 고형 서포트에 고정되고, 다른 분자는 용액에 자유로운 형태로 존재한다. 그 다음 수소 결합이 일어나기 좋은 조건하에서 두 개 분자를 서로 접촉시킨다.
이와 같은 결합에 영향을 주는 인자는 다음과 같다; 용매의 형태와 용적, 반응 온도; 하이브리드 반응 시간; 교반; 고형 서포트에 액상 분자의 비 특이적 결합을 차단다는 물질(Denhardt's reagent or BLOTTO); 분자의 농도; 분자 연합 속도를 증가시키는 화합물의 이용(덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜); 하이브리드 반응 후에 세척 조건의 엄격성(Sambrook et al. [supra]).
표적 분자에 완전하게 상보적인 분자의 하이브리드 반응 방해는 당분야에 공지된 방법인 하이브리드 반응 검사를 이용하여 검사할 수 있다(Sambrook et al .,supral). 실질적인 상동성 분자는 다양한 스트린트 조건하에 표적 분자에 완전한 상동성 분자가 결합하는데 경쟁을 할 것이다(Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987;Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)).
"스트린젼트"란 상이한 분자가 연합하기 보다는 매우 유사한 분자들이 연합을 더 잘하게 되는 하이브리드 반응 조건을 말한다. 높은 스트린젼트 조건은 다음과 같이 정의할 수 있다;
50% 포름아미드, 5XSSC(150mM NaCl, 15mM 구연산3나트륨), 5OmM 인산나트륨 (pH7.6), 5xDenhardts 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 20㎍/㎖ 변성, 전단된 연어 정자 DNA로 구성된 용액에 42℃에서 하룻밤동안 배양하고, 65℃에서 0.1XSSC에서 필터를 세척하는 것이다. 낮은 스트린젼트 조건은 35℃에서 실행하는 하이브리드 반응이다(Sambrook et al. [supra]). 바람직하게는 하이브리드 반응에 이용되는 조건은 높은 스트린젼트 조건이다.
본 발명의 적절한 구체예는 INSP037 폴리펩티드(SEQ ID NO:36)를 인코드하는 핵산 분자에 전체 길이의 적어도 70% 동일한 핵산 분자 및 이와 같은 핵산 분자에 실제 상보적인 핵산 분자가 된다. 좀더 바람직하게는, INSP037 폴리펩티드(SEQ ID NO:35)를 인코드하는 핵산 분자에 전체 길이의 적어도 80% 동일한 핵산 분자 및 이와 같은 핵산 분자에 실제 상보적인 핵산 분자가 된다. 이에 대해, 전체 길이의 적어도 90%, 적절하게는 적어도 95%, 좀더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 동일한 것이 특별히 바람직하다.
이에 대해 바람직한 구체예는 INSP037 폴리펩티드와 동일한 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자가 된다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 감지하는 공정을 제공하는데, 이 공정은 다음의 단계로 구성된다;
(a) 이중나선을 형성할 수 있는 조건하에서 생물학적 시료와 본 발명의 핵산을 접촉시키고;
(b) 임의 이중나선이 형성되었는지를 감지한다.
본 발명에 이용될 수 있는 검사와 연관하여 추가 설명되는 것과 같이, 상기에서 설명하는 핵산 분자는 INSP037 폴리펩티드를 인코드하는 전장 cDNA 또는 게놈 클론을 분리하고, 이 폴리펩티드를 인코드하는 유전자와 상당한 유사성을 가지는 상동성 유전자의 게놈 또는 cDNA 클론을 분리하기 위해, 본 발명의 핵산 분자를 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 하이브리드 반응 프로브로 이용할 수도 있다.
이에 대해, 당분야에 공지된 기술중 다음의 기술을 이용하고, 하기에서는 설명을 위한 목적으로 설명한다. DNA 서열과 방법 및 분석 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 일반적으로 이용할 수 있으며, 여기에서 설명하는 본 발명의 많은 구체예를 실행하는데도 이용된다. 이와 같은 방법은 DNA 폴리메라제 I의 클리노우 단편(Klenow fragment), Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq 폴리메라제(Perkin Elmer), 열안정성 T7 폴리메라제(Amersham, Chicago, IL), ELONGASE Amplification System(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)에서 볼 수 있는 폴리메라제와 푸르프-리딩 엑소뉴클레아제를 복합한 효소등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 서열화 공정은 Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV), Peltier ThermalCycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA), ABI Catalyst and 373 and 377 DNA Sequencers(Perkin Elmer)와 같은 기계를 이용한 자동화공정이다.
INSP037 폴리펩티드와 등가의 기능을 가지는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 분리해내는 한 가지 방법은 당분야에서 인지하는 표준 과정을 이용하여 천연 또는 인위적으로 고안된 프로브로 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 프로브시키는 것이다("Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989,1992). 적절한 코딩 유전자(SEQ ID NO:35)에 상응하는 또는 이에 상보적인 핵산에 대해 적어도 15개, 적절하게는 30개, 좀더 바람직하게는 적어도 50개 연속 염기로 구성된 프로브가 특별히 유용한 프로브가 된다. 이와 같은 프로브에는 확인을 위한 분석적으로 감지가능한 물질을 라벨시킬 수 있는데, 이용할 수 있는 시약으로는 방사능동위원소, 형광 염료 및 감지가능한 생성물 형성을 촉매할 수 있는 효소등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 프로브를 이용하면 당업자는 사람, 포유류 또는 다른 동물종에 있는 관심 대상이 되는 단백질을 인코드하는 게놈 DNA, cDNA, RNA의 상보적인 복사체를 분리하고, 족, 타입, 서브타입과 같은 관련 서열에 대해 추가 스크리닝할 수도 있다.
많은 경우에, 분리된 cDNA 서열에는 폴리펩티드를 인코드하는 부분이 보통 5' 부분에서 잘려나가 불완전하다. 몇 가지 방법을 이용하여 전장 cDNA 또는 짧아진 cDNA를 연장시킬 수 있다. 프로모터 및 조절 원소와 같은 상류 서열을 감지하는 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 그리고 부분적인 뉴클레오티드 서열을이용하여 서열을 연장할 수 있다. 이용할 수 있는 한 가지 방법을 예를 들면, cDNA 말단의 신속한 증폭 방법이다(RACE; see, for example, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988).
MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)를 이용하는 것과 같은 최근 변형된 기술로 더 긴 cDNA를 서치하는 것이 상당히 단순화되었다. 이와는 약간 다른 기술인 "제한부위" PCR은 범용 프라이머를 이용하여 공지된 위치에 인접하는 알려지지 않은 핵산 서열을 찾는다(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). 역 PCR을 이용하여 공지된 부분에 근간을 둔 다변 프라이머를 이용하여 서열을 연장 또는 증폭시킬 수 있다(Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). 이용할 수 있는 또 다른 방법은 사람 및 이스트 인위적인 염색체 DNA에 있는 공지 서열에 인접한 DNA단편을 PCR 증폭시키는 캡쳐 PCR이다(Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). 미지 서열을 확인하는데 사용할 수 있는 또 다른 방법은 Parker, J.D. et al.,의 방법이다 (1991); Nucleic Acids Res. 19:30553060). 또한, PCR, nested 프라이머, 게놈 DNA를 걸을 수 있는 PromoterFinderTM 라이브러리를 이용할 수도 있다(Clontech, Palo Alto, CA). 이와 같은 공정은 라이브러리를 스크리닝을 하지 않아도 되게 하고, 인트론/엑손 결합부분을 찾는데도 유용하다.
전장 cDNAs를 스크리닝하는 경우에, 더 큰 cDNA를 포함하도록 크기-선별된 라이브러리를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자의 5' 부분을 포함하는 서열을 더 많이 보유하는 무작위-프라임된 라이브러리를 이용하는 것이 바람직하다. 무작위 프라임된 라이브러리는 올리고 d(T)가 전장 cDNA를 만들지 못하는 경우에 특별히 유용하다. 게놈 라이브러리는 서열을 5'비-전사된 조절 부분으로 연장하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 핵산을 이용하여 염색체 위치 혹인을 할 수 있다. 이와 같은 기술에서, 핵산 분자는 개인 염색체상에 특정 위치로 특이적으로 표적화시키고, 하이브리드할 수 있다. 본 발명에 따른 염색체에 관련 서열의 매핑은 유전자-연합 질환에서 이들 서열과의 상관성을 확인하는데 중요한 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 매핑된 후에, 염색체상의 서열의 물리적인 위치는 유전자 지도 자료와 연계할 수 있다. 이와 같은 데이터는 실시예 5, McKusick, Mendelian Inheritance in Man(available on-line through Johns Hopkins University Welch Medical Library)에서 볼 수 있다. 연계 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동 유전)을 통하여 동일한 염색체 부분에 매핑된 유전자와 질병의 상관관계를 확인할 수 있다. 위치 클로닝 또는 다른 유전자 발견 기술을 이용하여 질병 유전자를 조사하는데 귀중한 정보를 제공한다. 특정 게놈 부분에 유전적으로 연결되어 질병 또는 증후군이 위치하는 경우에, 이부분 매핑 서열은 조절 부분과 연관이 있는 것을 나타낸다. 정상, 운반체 또는 질병이 있는 개체간에 전위, 역전 등으로 인하여, 핵산 분자를 염색체상 위치를 감지하는데도 이용할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 또는 조직 위치 측정(localisation)에도 가치가 있다. 이와 같은 기술을 이용하면 폴리펩티드를 인코드하는 mRNA를 감지하여 조직에서 폴리펩티드의 발현 패턴을 결정할 수 있다. 이와 같은 기술에는in situ하이브리드 반응 기술, PCR과 같은 뉴클레오티드 증폭 기술등이 포함된다. 이와 같은 연구 결과로부터 유기체내 폴리펩티드의 정상적인 기능을 제시할 수 있다. 또한, mRNA의 정상 발현 패턴과 돌연변이 유전자에 의해 인코드된 mRNA의 발현 패턴을 비교 연구하면 질병에서 돌연변이 폴리펩티드의 역할에 대한 중요한 정보를 제공한다. 부적절한 발현이 일시적이거나, 지엽적이거나 정성적인 특징을 가질 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 유전자의 내생 발현을 하향 조절하기 위한 유전자 침묵 접근 방법을 실시할 수도 있다. RNA 간섭(RNAi)(Elbashir, SM et al.,Nature 2001, 411, 494-498)이 이용할 수 있는 서열 특이적인 전사후 유전자 침묵화 방법중에 하나이다. 짧은 dsRNA 올리고뉴클레오티드를in vitro에서 합성하여 세포내로 도입시킬 수 있다. 이들 dsRNA 올리고뉴클레오티드의 서열 특이적인 결합이 표적 mRNA 분해를 자극하여, 표적 단백질 발현을 감소시키거나 발현되지 않도록 할 수 있다.
상기에서 평가한 유전자 침묵화 방법의 효과는 폴리펩티드 발현(웨스턴 블랏팅)으로 측정하여 평가할 수 있고, RNA 수준에서는 TaqMan-근거한 방법을 이용할 수도 있다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산 분자로 구성되는데, 클로닝 또는 발현벡터가 될 수도 있다. 본 발명의 숙주 세포는 벡터에 의해 형질변환, 형질 감염 또는 형질유도된 진핵 또는 원핵 세포이다.
본 발명의 폴리펩티드는 숙주내에 포함된 벡터에 있는 인코딩된 핵산 분자를 발현시켜 생성된 재조합 형태로 만들어질 수도 있다. 이와 같은 발현 방법은 당분야에 공지된 것으로, 대부분은 Sambrook et al (supra) and Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto)에서 설명하고 있다.
일반적으로, 요구되는 숙주에서 폴리펩티드를 만들기 위해 핵산 분자를 유지, 증폭 또는 발현시키는데 적절한 임의 시스템 또는 벡터를 이용한다. 적절한 뉴클레오티드 서열을 당분야에 공지된 일반적인 기술 가령, Sambrook et al., (supra)에서 설명하는 다양한 기술중 임의의 것을 이용하여 발현 시스템내로 도입시킨다. 일반적으로 인코딩된 유전자는 프로모터, 리보좀 결합 부분(박테리아 발현의 경우), 선택적으로 오퍼레이트와 같은 조절 요소의 제어하에 두고, 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열이 형질도입된 숙주 세포내에서 RNA로 전사된다.
적절한 발현 시스템으로는 크로모좀, 에피좀, 바이러스-유도된 시스템등이 포함되는데, 예를 들면, 세균성 플라스미드, 박테리오파아지, 트랜스포존, 이스트 에피좀, 삽입 요소, 이스트 염색체 원소; 베큘로바이러스, SV40과 같은 파포바 바이러스, 우두 바이러스 , 아데노바이러스 , 가금류 폭스 바이러스, 가사공수병 바이러스, 레트로바이러스 또는 플라스미드, 코스미드 및 파아지미드를 포함하는 박테리오파아지 유전자 요소와 복합된 바이러스등이 포함된다. 사람의 인위적 염색체(HACs)를 이용하여 플라스미드내에 보유되어 발현시킬 수 있는 것보다 훨씬 큰 DNA단편을 운반할 수 있다.
특히 적절한 발현 시스템에는 재조합 박테리오파아지, 플라스미드, 코스미드 발현 벡터로 형질변환된 박테리아; 이스트 발현벡터에 의해 형질변환된 이스트; 바이러스 발현 벡터(베큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터에 의해 형질도입된 식물 세포(가령, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현벡터(Ti 또는 pBR322 플라스미드)에 의해 형질도입된 식물 세포 또는 동물 세포 시스템이 포함된다. 무-세포 해독 시스템을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 만들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 숙주 세포로 도입하는 방법은 많은 실험 매뉴얼에서 설명하는 방법에 의해 영향을 받을 수 있다;Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (I 986) and Sambrook et al.,[supra]. 특별히 적절한 방법에는 인산 칼륨 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 중개된 트랜스펙션, 트랜스백션, 마이크로인젝션, 양이온 지질 중개된 트랜스펙션, 전기천공, 트랜스백션, 스크레이트 로딩, 발리스틱 도입(ballistic introduction) 또는 감염(Sambrook et al., 1989 [supra]; Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald 1998)등이 포함된다. 진핵 세포에서 발현 시스템은 일시적(에피좀)이거나 영구적(염색체 결합)인 형태의 것이 될 수 있는데, 필요에 따라 달라진다.
인코딩 핵산 분자에는 망상 내피세포 관강, 세포질 공간 또는 세포외 환경으로 해독된 폴리펩티드를 분비시키기 위한 시그날 펩티드 또는 리더 서열과 같은 기준 서열을 인코드하는 서열이 포함될 수도 또는 포함되지 않을 수도 있다. 이와같은 시그날은 폴리펩티드에 내생이거나 이형 시그날이 될 수도 있다. 리더 서열은 해독후 프로세싱과정에서 세균성 숙주에 의해 제거될 수 있다.
기준 서열에 추가하여, 숙주 세포 생장과 연관하여 폴리펩티드 발현 조절을 허용할 수 있는 조절 서열을 추가시키는 것도 바람직하다. 조절 서열로는 조절 화합물의 존재, 다양한 온도 또는 대사 조건을 포함하는 화학적 또는 물리적인 자극에 반응하여 유전자 발현이 증가 또는 감소될 수 있도록 하는 서열이 될 수 있다.
조절 서열은 벡터의 비-해독 부분이 될 수 있는데, 예를 들면, 인헨서, 프로모터, 5' 및 3' 비-해독 부분이 된다. 이들은 숙수 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 해독을 실행한다. 이와 같은 조절 서열은 이들의 강도 및 특이성이 상당히 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 구성 및 유도성 프로모터를 포함하는 많은 임의 적절한 전사 및 해독 요소를 이용할 수 있다. 예를 들면, 세균 시스템에 클로닝되는 경우에, Bluescript phagemid의 하이브리드 lacZ 프로모터(Stratagene, LaJolla, CA), pSportITM 플라스미드(Gibco BRL) 및 이와 유사한 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 곤충 세포에는 베큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 이용할 수 있다. 식물 세포의 게놈에서 유도한 프로모터 또는 인헨서(역쇼크, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스(예를 들면, 바이러스성 프로모터 또는 리더 서열)에서 유도한 프로모터 또는 인헨서를 벡터내로 클론시킬 수도 있다. 포유류 세포 시스템에서는 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스의 프로모터가 적절하다. 다중 복사체 서열을 포함하는 세로주를 만들 필요가 있는 경우에, 적절한 선택성 표식과 함께 SV40 또는 EBV계 벡터를 이용할 수 있다.
적절한 조절 서열을 가지고 있는 벡터에 특정 핵산을 인코드하는 서열을 위치시키는데, 코딩 서열이 조절 서열의 "제어"하에서 전사될 수 있도록, 예를 들면 조절 서열에서 DNA 분자에 결합된 RNA 폴리메라제가 코딩 서열을 전사할 수 있도록, 조절 서열에 대해 코딩 서열의 위치 및 방향이 맞도록 발현벡터를 만든다. 일부 경우에, 리딩 프레임이 유지될 수 있도록 적절한 방향으로 조절 서열에 부착시키기 위해, 서열의 변형도 필요할 수 있다.
벡터로 코딩 서열을 도입시키기 전에 조절 서열 및 다른 조절 서열을 핵산 코딩 서열에 결찰시킬 수도 있다. 또는 코딩 서열을 조절 서열과 적절한 제한효소 부위를 이미 포함하고 있는 발현벡터에 바로 클론시킬 수 있다.
재조합 폴리펩티드를 장기간 다량 생산하고자 하는 경우에, 발현을 안정화시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 관심 대상 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키는 세포주에 동일 또는 별개의 벡터에 바이러스 복제 원점 또는 선택적 표식 유전자,발현 요소를 포함하는 발현벡터로 형질변환시킬 수 있다. 벡터로 도입시킨 후에, 세포를 선택성 배지로 옮기기 전 풍부한 배지에서 1-2일간 생장시킨다. 선택석 표식을 사용하는 목적은 선별에 대한 저항성을 부여하고, 이것이 있음으로써 도입된 서열이 성공적으로 발현된 세포의 생장 및 회수가 가능하다.
안정적으로 형질도입된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적합안 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다.
발현을 위한 숙주로 이용할 수 있는 포유류 세포주는 당분야에 공지되어 있는데, Chinese hamster ovary(CHO), HeLa, 아기 헴스터 신장(BHK), 원숭이 신장(COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes 흑색종, 사람 헤파토세로 육종(Hep G2) 세포, 다른 다수 세포주를 포함하나 이에 국한되지 않은 American Type Culture Collection(ATCC)에서 이용할 수 있는 많은 불사화 세포주등이 포함된다.
베큘로바이러스 시스템의 경우에, 베큘로바이러스 /곤충 세포 발현 시스템의 재료는 키트 형태로 시판되고 있다(Invitrogen, San Diego CA(the "MaxBac" kit)). 이와 같은 기술은 당업자에 공지된 것으로 Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)에서 설명하고 있다. 이와 같은 시스템을 이용하는데 특히 유용한 숙주 세포에는 초파리(Drosophila) S2와 Spodoptera Sf9 세포와 같은 곤충 세포가 포함된다.
당분야에 공지된 많은 식물 세포 배양물 및 전체 식물 유전자 발현 시스템이 있다. 적절한 식물 세포 유전자 발현 시스템의 예로는 US 5,693,506; US 5,659,122; US 5,608,143에서 설명하는 것등이 포함된다. 식물 세포 배양물에서 유전자 발현을 위한 추가예는 Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991)에서 설명하고 있다.
특히, 모든 식물에서 원생동물을 분리할 수 있고, 배양하여 온전한 재생된 식물을 이용할 수 있으며, 전이된 유전자를 보유하는 식물을 회수할 수 있다. 실제, 배양된 세포 또는 조직으로부터 식물을 재생시킬 수 있는데, 사탕수수, 사탕무, 목화, 과일, 다른 나무, 콩과식물, 채소등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
특히 적절한 세균성 숙주 세포로는 연쇄상구균(streptococci), 포도상구균(staphylococci), 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스 서브틸리스 세포(Bacillus subtilis)등이 포함된다.
곰팡이 발현을 위한 적절한 숙주세포로는 이스트(S. cerevisiae) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포등이 포함된다.
당분야에 공지된 선별 시스템을 이용하여 형질변환된 세포주를 회수할 수 있다. 예를 들면, tk- 세포 또는 aprtㅁ 세포에서 각각 이용할 수 있는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제 유전자(Wigler, M. et al.,(1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy, 1. et al. (1980) Cell 22:817-23) 유전자가 포함된다.
또한, 선별을 위한 기초물질로써 항-대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 메토트렛세이트에 저항성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G418에 저항성을 부여하는 npt (Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 클로로설퓨론 및 포스포나트로신 아세틸트란스퍼라제에 각각 저항성을 부여하는 als 또는 pat등이 포함된다. 추가적인 선별 유전자에 대해서도 설명하고 있으며, 당업자가 인지할 수 있다.
표식 유전자 발현 유무로 관심 대상이 되는 유전자가 존재한다는 것을 암시하지만, 표식 유전자의 유무를 확인할 필요는 있다. 예를 들면, 관련 서열이 표식 유전자내로 삽입되는 경우에, 표식 유전자 기능이 없어짐으로써 적절한 서열을 포함하는 형질도입된 서열을 확인할 수 있다. 또는, 단일 프로모터 조절하에 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 서열과 나란하게 표식 유전자를 위치시킬 수 있다. 유도 또는 선별에 반응하여 표식 유전자가 발현되면 나란히 있는 유전자가 발현되었다는 것을 의미한다.
또는, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함하고, 이 폴리펩티드가 발현되는 숙주는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 이와 같은 공정에는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드반응 및 단백질 바이오에세이 예를 들면, 형광 활성화된 세포 소팅(FACS) 또는 면역검사 기술(효소-연결된 면역흡착 검사[ELISA] 및 방사능면역검사[RIA])등이 포함되는데, 이들은 핵산 또는 단백질의 감지 및 정량화를 근거한 막, 용액, 칩 등이 포함된다(Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, D.E. et al. (I 983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216).
다양한 라벨 및 접합 기술이 당분야에 공지되어 있고, 다양한 핵산 및 아미노산 검사에 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자와 연관하여 서열을 감지하기 위한 PCR 프로브 또는 라벨된 하이브리드 반응을 만드는 수단에는 라벨된 폴리뉴클레오티드를 올리고라벨링, 니크 해독, 엔드-라벨링 또는 를 이용한 PCR 증폭등이 포함된다.
또는, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 서열을 mRNA 프로브를 만들기 위해 벡터내로 클론시킬 수 있다. 이와 같은 벡터는 당분야에 공지된 것으로 상업적으로 시판되는 것을 이용할 수 있으며, T7, T3, SP6와 같은 적절한 RNA 폴리메라제와 라벨된 뉴클레오티드를 추가하여in vitro에서 RNA 프로브를 합성할 수 있다. 이와 같은 과정은 시판되는 키트(Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI); Promega (Madison WI); and U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH))를 이용하여 실행할 수 있다.
용이한 감지를 위해 이용할 수 있는 적절한 리포터 분자에는 방사능뉴클리드, 효소, 형광, 화학발광 또는 발색 물질, 기질, 공인자, 저해물질, 자성 입자등을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자를 이용하여 유전자 전이 동물, 특히 설치류 동물을 만들 수 있다. 이와 같은 유전자 전이 동물도 본 발명의 특징이 된다. 체세포를 변형시키거나 생식주 요법을 이용하여 유전되는 변형을 만들어서 유전자 전이 동물을 만들 수 있다. 이와 같은 유전자 전이 동물은 특히 본 발명의 폴리펩티드의 조절물질로 효과적인 약물 분자를 위한 동물 모델을 만드는데 이용될 수 있다.
공지의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하고 정제할 수 있는데, 이용할 수 있는 방법으로는 암모늄 설페이트 침천 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피등이 포함된다. 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 특히 정제에는 유용하다. 단백질을 재폴팅하는데 이용되는 공지 기술을 이용하여, 정제 또는 분리 과정동안에 폴리펩티드가 변성되는 경우에 활성형으로 재생할 수 있다.
특화된 벡터 작제를 이용하여, 가용성 단백질을 정제시킬 수 있는 폴리펩티드 도메인을 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 본 발명의 폴리펩티드 서열을 결합시켜, 원하는 단백질 정제를 할 수 있다. 이와 같은 정제-실행 도메인으로는 고정된 금속상에서 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속-킬레이트된 도메인, 고정된 면역글로블린상에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인; FLAGS 연장/찬화력 정제 시스템에 이용되는 도메인(Immunex Corp., Seattle, WA)등이 포함된다. 정제 도메인과 본 발명의 폴리펩티드 사이에 Factor XA 또는 엔테로키나제 (Invitrogen, San Diego, CA)와 같은 절단가능한 링커 서열을 포함시켜, 정제시킬 수 있다. 티오레독신 또는 엔테로카이나제 절단부위에 앞에 몇 개 히스티딘 잔기에 본 발명의 폴리펩티드를 융합시킨 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. IMAC(고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피 Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)에 의해 히스티딘 잔기 정제가 실행되고, 티오레독신 또는 엔테로카이나제 절단부위가 융합 단백질로부터 폴리펩티드를 정제하기 위한 수단으로 제공된다. 융합 단백질을 포함하는 벡터에 대한 설명은 Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12.441-453)에서 제공한다.
스크리닝 검사에 이용하기 위해 폴리펩티드가 발현되는 경우에, 일반적으로 폴리펩티드 발현되는 숙주 표면에서 생산되는 것이 적절하다. 이 경우에, 스크리닝 검사전에 형광 활성화된 세포 소트(FACS) 또는 면역친화력 기술을 이용하여 숙주 세포를 수득할 수 있다. 폴리펩티드가 배지내로 분비되는 경우에, 발현된 폴리펩티드를 회수, 정제하기 위해 배지를 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 만들어지는 경우에, 세포를 우선 용해시키고, 폴리펩티드를 회수한다.
본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 약물 스크리닝 기술을 이용하여 화합물 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이와 같은 화합물은 본 발명의 폴리펩티드 유전자 발현 수준 또는 활성 수준을 증가(항진제) 또는 저해(길항제)시킬 수 있고, 이 또한 본 발명의 특징이 된다. 적절한 화합물은 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현을 변경시키거나 본 발명의 폴리펩티드 활성을 조절하는데 효과가 있다.
항진제 또는 길항제 화합물은 세포, 무세포 침전물, 화학 라이브러리 또는 천연 생성물 혼합물로부터 분리시킬 수 있다. 이와 같은 항진제 또는 길항제는 천연 또는 변형된 기질, 리간드, 효소, 리포터, 구조적 또는 기능적 모방체등이 될 수 있다. 이와 같은 스크리닝 기술에 대해서는 Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)에서 설명하고 있다.
우수한 길항체로 이용할 수 있는 화합물은 결합시에 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않고 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 분자가 된다. 가능성있는 항진제로는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여, 활성을 저해 또는 제거할 수 있는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 등이 포함된다. 이와 같은 방식에서, 정상적인 세포 결합 분자에 폴리펩티드가 결합하는 것을 방해하여, 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 방해받는다.
이와 같은 스크리닝 기술에 이용되는 본 발명의 폴리펩티드는 용액내에 자유형, 고형 서포트에 고착된 형, 세포 표면에서 생성되는 형 또는 세포내에 위치하는형들이 있을 수 있다. 일반적으로 이와 같은 스크리닝 과정은 폴리펩티드를 발현시키는 적절한 세포 또는 세포막을 시험 화합물과 접촉시켜, 결합이 있는 지를 관찰하고, 기능 반응이 자극 또는 저해되었는지를 관찰한다. 시험 화합물과 접촉된 세포의 기능적 반응을 시험 화합물과 접촉하지 않은 기준 세포의 것과 비교한다. 이와 같은 검사에서는 적절한 감지 시스템을 이용하여 시험 화합물로 인하여, 폴리펩티드 활성화에 따라 생성되는 시그날을 만드는지를 평가한다. 공지의 항진제 존재하에서 활성 저해물질을 일반적으로 검사하는데, 시험 화합물 존재하에서 항진제에 의한 활성화 효과를 관찰한다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 적절한 방법은 다음과 같다;
(a) 본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드를 세포 표면에서 발현시키는 세포에 시험되는 화합물을 폴리펩티드와 결합이 가능하도록 한 조건하에서 접촉시키는데, 이때 폴리펩티드는 폴리펩티드에 화합물이 결합할 경우에 감지가능한 시그날을 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되어 있고,
(b) 폴리펩티드와 화합물의 상호작용에 의해 생성되는 시그날 수준을 측정함으로써 화합물이 폴리펩티드에 결합되어 활성화시키는지 또는 저해시키는지를 결정한다.
본 발명 폴리펩티드의 항진제 또는 길항체를 확인하는 추가 적절한 방법은 다음과 같다;
(a) 본 발명의 제 1 특징인 폴리펩티드를 세포 표면에서 발현시키는 세포에시험되는 화합물을 폴리펩티드와 결합이 가능하도록 한 조건하에서 접촉시키는데, 이때 폴리펩티드는 폴리펩티드에 화합물이 결합할 경우에 감지가능한 시그날을 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되어 있고,
(b) 폴리펩티드와 화합물의 상호작용에 의해 생성되는 시그날 수준을 폴리펩티드가 없을 경우에 시그날 수준과 비교함으로써 화합물이 폴리펩티드에 결합되어 활성화시키는지 또는 저해시키는지를 결정한다.
또 다른 구체예에서, 상기에서 설명하는 일반적인 방법은 폴리펩티드에 대한 라벨된 또는 라벨안된 리간드 존재하에서 항진제 또는 길항체를 확인하는 것으로 구성된다.
본 발명 폴리펩티드의 항진제 또는 길항체를 확인하는 또 다른 구체예의 방법은 다음과 같다;
폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서 후보 화합물 존재하에 세포 표면에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 이와 같은 폴리펩티드를 포함하는 세포 막에 리간드 결합을 저해하는지를 결정하고;
폴리펩티드에 결합된 리간드 양을 결정하는 단계로 구성된다. 리간드 결합을 감소시키는 화합물이 항진제 또는 길항제로 간주한다. 리간드에 라벨을 하는 것이 바람직하다.
특히, 폴리펩티드 길항제 또는 항진제 화합물을 스크리닝하는 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다;
(a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 전체 세포 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 세포 표면에 라벨된 리간드를 배양시키고;
(b) 전체 세포 또는 세포 막에 결합된 라벨된 리간드 양을 측정하고;
(c) (a) 단계의 전체 세포 또는 세포막과 라벨된 리간드 혼합물에 후보 화합물을 첨가하여 혼합물이 평형에 이르도록 하고;
(d) (c)단계후에 전체 세포 또는 세포 막에 결합된 라벨된 리간드 양을 측정하고;
(e) (b)와 (d) 단계에 라벨된 리간드 양의 차이를 비교하고, (d) 단계에서 결합을 감소시키는 화합물을 항진제 또는 길항체로 간주한다.
상기 설명된 검사에서 약량-의존적인 방법으로 폴리펩티드는 다양한 생리적인 그리고 병인 과정을 조절하는 것을 발견할 수 있다. 따라서, 본 발명 폴리펩티드의 "기능적 등가체"에는 약량 의존적인 방식으로 상기에서 설명하는 동일한 조절 활성을 나타내는 폴리펩티드가 포함된다. 약량-의존적인 활성이 본 발명의 폴리펩티드와 동일한 필요는 없지만, "기능적 등가체"는 본 발명의 폴리펩티드와 비교하였을 때 주어진 활성 검사에서 실재 유사한 약량-의존성을 나타낼 것이다.
상기에서 설명하는 특정 구체예에서, 간단한 결합 검사를 이용할 수 있는데, 이때 검사에서 폴리펩티드를 보유하는 표면에 시험 화합물이 흡착된 것은 시험 화합물과 직-간접으로 연합된 수단에 의해 감지되거나 라벨된 경쟁물질과 경쟁되는 검사에 의해 감지될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 경쟁적인 약물 스크리닝 검사를 이용할 수 있는데, 이때 이 방법에서는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 시험 화합물과 결합에 대해 특이적으로 경쟁한다. 이와 같은 방식으로 항체는 폴리펩티드에 특이적인 결합 친화성을 가지는 임의 시험 화합물이 존재하는지를 감지하는데 이용될 수 있다.
세포에서 폴리펩티드를 인코드하는 mRNA 생산에서 첨가된 시험 화합물 의 효과를 감지할 수 있도록 검사 방법을 만들 수 있다. 예를 들면, 당분야에 공지된 표준 방법에 따라 단클론 또는 다클론 항체를 이용하여 분비된 또는 세포와 연합되어 있는 폴리펩티드 수준을 측정하는 ELISA를 실시할 수 있고, 이 방법을 이용하여 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드 생산을 유도 또는 저해하는 시험 화합물을 조사할 수 있다. 폴리펩티드와 화합물간에 복합체가 형성되었는지를 측정할 수 있다.
본 발명에 포함되는 임의 검사 방법은 과도 발현 또는 제거 검사에서 본 발명의 유전자 및 폴리펩티드를 이용하는 것이다. 이와 같은 검사는 세포에서 이들 유전자/폴리펩티드 수준을 조절하고, 조절된 세포의 생리에서 이와 같은 조정 과정의 충격을 평가하는 것과 관계한다. 예를 들면, 이와 같은 실험은 시그날 생성 및 대사 과정의 세부적인 내용을 밝히는데, 이때 관련된 특정 유전자/폴리펩티드는 연구된 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드 실체에 대한 정보를 만들고, 이는 관련된 유전자 및 단백질이 어떤 방법의해 조절되는지에 단서를 제공한다.
또는, 간단한 결합 검사를 이용할 수 있는데, 이때 검사는 폴리펩티드를 포함하는 표면에 시험 화합물이 있는 지를 시험 화합물에 직-간접적으로 연합된 라벨을 이용하여 또는 라벨된 경쟁물질과 연관된 검사 방법을 이용하여 감지한다. 또 다른 구체예에서, 경쟁적인 약물 스크리닝 검사를 이용할 수 있는데, 이때 이 방법에서는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 시험 화합물과 결합에 대해 특이적으로 경쟁한다. 이와 같은 방식으로 항체는 폴리펩티드에 특이적인 결합 친화성을 가지는 임의 시험 화합물이 존재하는지를 감지하는데 이용될 수 있다.
세포에서 폴리펩티드를 인코드하는 mRNA 생산에서 첨가된 시험 화합물의 효과를 감지할 수 있도록 검사 방법을 만들 수 있다. 예를 들면, 당분야에 공지된 표준 방법에 따라 단클론 또는 다클론 항체를 이용하여 분비된 또는 세포와 연합되어 있는 폴리펩티드 수준을 측정하는 ELISA를 실시할 수 있고, 이 방법을 이용하여 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드 생산을 유도 또는 저해하는 시험 화합물을 조사할 수 있다. 폴리펩티드와 화합물간에 복합체가 형성되었는지를 측정할 수 있다.
약물 스크리닝 기술이 관심 대상인 폴리펩티드에 적절한 친화성을 가지는 화합물을 다량 스크리닝하는 방법으로 제공될 수도 있다(International patent application WO84/03564). 이 방법에서, 다량의 상이한 작은 시험 화합물을 고형 기질상에 합성하여, 본 발명의 폴리펩티드와 반응시키고, 세척한다. 폴리펩티드를 고정시키는 한 방법으로 비-중화 항체를 이용하는 것이다. 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 결합된 폴리펩티드를 감지한다. 상기 설명한 약물 스크리닝 기술에 이용할 수 있도록 정제된 폴리펩티드를 플레이트상에 바로 피복히시킬 수도 있다.
당분야에 공지된 리간드 결합 및 교차 결합 기술과 같은 표준 수용체 결합 기술을 이용하여, 막-결합된 또는 가용성 수용체를 확인하는데 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는데, 이때 폴리펩티드는 방사능동위원소로 라벨시키고, 화학적으로 변형시켜, 감지, 정제를 실행할 수 있는 펩티드 서열에 융합하고, 가상 수용체(가령, 세포, 세포 막, 세포 현탁액, 조직 추출물, 체약과 같은 조성물)과 배양시켰다. 표면 플라스몬 공명 및 스펙트로스코피(surface plasmon resonance and spectroscopy)와 같은 생체물리적 기술을 이용하여, 결합 효과를 측정할 수 있다. 수용체의 정제 및 클로닝에 결합 검사를 이용할 수도 있지만, 수용체에 대해 폴리펩티드와 결합하는 것을 경쟁하는 폴리펩티드의 항진제 또는 길항체를 확인할 수도 있다. 스크리닝 검사를 실행하는 표준 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에는 상기에서 설명하는 것과 같은 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소를 확인하는데 유용한 스크리닝 키트도 포함된다.
본 발명에는 상기에서 설명하는 방법에 의해 발견되는 본 발명 폴리펩티드의 활성 또는 항원성을 조절할 수 있는 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소가 포함된다.
본 발명은 적절한 약학적 운반체와 복합된 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물로 구성된 약학 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 여기에서 설명하는 다른 면역 조성물 또는 백신 또는 진단 또는 치료 시약으로 적합할 수 있다.
여기에서 사용된 용어에 따르면, 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물[X]를 포함하는 조성물에서 화합물[x]과 불순물[Y]의 합의 중량의 적어도 80%가 X인 경우에, "실질적으로 불순문[Y]이 없는" 조성물이라고 할 수 있다. 적절하게는 X는 조성물에서 X+Y의 총 중량에 적어도 90%로 구성되고, 좀더 바람직하게는 총 중량의 약 95%, 98%, 99%로 구성된다.
약학 조성물은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물의 치료요법적 효과량으로 구성되는 것이 바람직하다.
"치료요법적 효과량"이란 표적으로 하는 질병 또는 질환을 치료, 경감 또는 예방하는데 또는 감지가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 말한다. 임의 화합물의 경우에, 치료요법적 효과 약량을 생쥐, 토끼, 개 또는 돼지의 신조직 형성 세포의 초기 세포 배양 검사에서 측정할 수 있다.
동물 모델을 이용하여 적절한 농도 범위와 투여 경로를 결정할 수 있다. 이와 같은 정보를 이용하여 사람에서 유용한 약량 및 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
사람의 경우에 질병의 심각성, 개체의 전반적인 건강 상태, 나이, 체중, 성별, 음식, 투여 빈도 및 시간, 약물 복합, 반응 감응도, 치료법에 대한 내성/감응성에 따라 정확한 효과량이 달라질 것이다. 통상적인 실험을 통하여, 이와 같은 양을 결정할 수 있는데, 이는 임상의사의 판단 범주에 속한다. 일반적으로, 효과 약량은 0.01mg/kg 내지 50mg/kg, 적절하게는 0.05mg/kg 내지 10mg/kg 범위가 된다. 조성물을 환자에 개별적으로 투여할 수 있고, 다른 약물, 물질 또는 호르몬과 복합하여 투여할 수도 있다.
약학 조성물에는 치료제 투여를 위한 약학적으로 수용가능한 담체가 포함될 수 있다. 이와 같은 담체에는 항체, 다른 폴리펩티드, 유전자, 리포좀과 같은 다른 치료제가 포함될 수 있는데, 담체는 조성물을 제공받는 개체에 유해한 항체 생산을 유도하지 않아야 하고, 과도한 독성없이 투여할 수 있는 것이어야 한다.
적절한 운반체로는 크고 대사가 느린 거대분자 예를 들면, 단백질, 폴리사카라이드, 플로라틱산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 고분자 및 비활성 바이러스 입자등이 될 수 있다.
약학적으로 수용가능한 염에는 염화수소, 브롬화수소, 인산염, 황산염등과 같은 미네랄 산염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 및 이와 유사한 유기산 염등이 포함된다. 약학적으로 이용할 수 있는 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)을 참고로 하면 된다.
치료 조성물에서 약학적으로 수용가능한 담체에 물, 염, 글리세롤, 에탄올이 추가 포함될 수 있다. 또한, 가습제 또는 에멸젼화제, pH 완충제와 같은 보조 물질이 조성물에 포함될 수 있다. 이와 같은 담체를 이용하면 약학 조성물을 정제, 알략, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등 환자가 복용할 수 있는 형태로 만들 수 있다.
일반 조제되면, 본 발명의 조성물을 환자에게 직간접적으로 투여할 수 있다. 치료 대상은 동물 특히, 사람이 된다.
본 발명에서 이용할 수 있는 약학 조성물은 정맥, 근육, 동맥, 골수, 포막내, 심실내, 경피내 또는 경피하(W098/20734), 피하, 복막, 비강, 장, 국소, 혀밑, 질내, 직장내 등으로 투여될 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 유전자 총 또는 하이포스프레이(hyposprays)를 이용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수도 있다. 일반적으로 치료 조성물을 액체 용액 또는 현탁액 형태의 주사액으로 만들 수도 있고, 주사하기 전에 용액, 현탁액 또는 액체 비이클에 사용하기에 적합한 고형으로만들 수도 있다.
본 조성물을 바로 운반하는 방법은 주사, 피하, 복막, 정맥, 근육으로 투여하거나 조직내 간질(間質)성 공간으로 운반하는 것이다. 조성물을 병소로 투여할 수도 있다.
1회 약량 투여 과정 또는 다회 약량 일정으로 약량을 제공할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드 활성이 특정 질병 상태에서 과도하게 나타나는 경우에 몇 가지 방법을 이용할 수 있다. 한 가지 방법은 상기에서 설명한 것과 같은 저해 화합물(길항제)과 폴리펩티드 기능을 저해하는데 효과적인 약학적으로 수용가능한 운반체와 함께 개체에 투여하여, 리간드, 기질, 효소, 수용체 결합을 차단하거나 제 2 시그날을 저해하여, 비정상 상태를 경감시키는 것이다. 이와 같은 길항제가 항체가 되는 것이 바람직하다. 이와 같은 항체는 이미 설명한 것과 같이 이들의 면역원성을 최소화시키기 위해 인화된 또는 키메라 항체가 되는 것이 더욱 바람직하다.
또 다른 방법에서, 리간드, 기질, 효소, 수용체에 결합 친화력을 보유하는 가용성 형태의 폴리펩티드를 투여할 수도 있다. 관련 부분을 보유하는 단편 형태로 폴리펩티드를 투여하는 것이 일반적이다.
또 다른 방법에서, 내부적으로 생성된 또는 별도로 투여된 안티센스 핵산 분자를 이용하는 것과 같은 발현 저해 기술을 이용하여, 폴리펩티드를 인코드하는 유전자 발현을 저지시킬 수도 있다.
폴리펩티드를 인코드하는 유전자의 조절, 5' 또는 조절 부분(시그날 서열,프로모터, 인헨서, 인트론)에 상보적인 또는 안티센스 분자(DNA, RNA, PNA)를 고안하여 유전자 발현을 변형시킬 수 있다. 유사하게, "삼중 나선" 염기쌍 방법을 이용하여 저해시킬 수 있다. 삼중 나선" 염기쌍 형성 기술은 이중 나선이 폴리메라제, 전사 인자, 조절 분자 결합을 위해 나선을 개방하는 능력을 저해하기 때문에 유용할 수 있다. 문헌에서는 삼중 나선 DNA를 이용한 최근 치료법의 발전에 대해 설명하고 있다(Gee, J.E. et al. (1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). 상보적인 서열 또는 안티센스 분자를 고안하여, 전사체가 리보좀에 결합하는 것을 막아서 mRNA의 전사를 차단할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 투여여하거나in vivo에서 발현되어,in situ생성되도록 할 수 있다.
또한, 인코딩 mRNA 서열에 특이적인 리보자임을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 발현을 막을 수도 있다. 리보자임은 천연 또는 합성형의 촉매적으로 활성을 가진 RNA이다(Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). 선택된 위치에서 mRNA를 특이적으로 절단할 수 있도록 합성 리보자임을 고안하여, mRNA가 기능을 가진 폴리펩티드로 해독되는 것을 방지한다. RNA 분자에서 정상적으로 발견되는 천연 리보즈 포스페이트 골격과 천연 염기를 리보자임이 가지도록 만들수도 있다. 또는 리보자임이 비-천연 골격 예를 들면, 2'-O-메틸 RNA를 가지도록 합성하여, 리보뉴클레아제 분해되지 않도록 하고, 변형된 염기를 가질 수도 있다.
RNA 분자를 변형시켜, 세포내 안정성과 반감기를 증가시킬 수도 있다. 가능한 변형 방법으로는 분자의 5' 및 3' 말단에 인접 서열을 추가하거나, 분자의 골격내에 포스포디에스테라제 연결보다는 포스포로티오에이트 또는 2'O-메틸을 이용하는 것등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 개념은 PNA 생산에 고유적인 것으로, 내생 엔도뉴클레아제가 용이하게 인지할 수 없는 이노신, 퀘노신, 부토신 뿐만 아니라 아세틸-, 메틸-, 티오-, 그리고 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민, 우리딘과 유사한 변형태 등의 비-전통적인 염기를 포함하는 것도 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드의 과소 발현과 이의 활성과 연관된 비정상 상태를 치료에는 몇 가지 방법이 이용가능하다. 한 가지 방법으로는 비정상적인 상태를 경감시키기 위해 상기에서 설명하는 것과 같은 항진제로써 폴리펩티드를 활성화시키는 화합물 효과량을 개체에 투여하는 것이다.
또는, 적절한 약학 담체와 복합하여 치료요법적 폴리펩티드 효과량을 투여하여 관련 폴리펩티드의 생리학적 균형을 복원시킨다.
유전자 치료법을 이용하여 개체에 관련 세포에 의한 폴리펩티드 내부 생산에 영향을 줄 수도 있다. 유전자 요법을 이용하여 결함이 있는 유전자를 결함이 교정된 치료 유전자로 대체하여 부적절한 폴리펩티드 생산을 영구적으로 치유할 수도 있다.
본 발명의 유전자 요법은in vivo또는ex vivo상태에서 실시할 수 있다.Ex vivo유전자 요법은 환자의 세포를 분리 정제하고, 치유 유전자와 유전적으로 변경된 세포를 다시 환자에게로 복귀시키는 것이다. 대조적으로,in vivo유전자 요법에서는 환자 세포 분리와 정제 과정이 필요하지 않는다.
치료 유전자는 일반적으로 환자에 투여하기 위해 "포장한" 상태로 만든다.유전자 운반용 비이클은 리포좀과 같은 비-바이러스성 물질이나 또는 복제-결함 바이러스 예를 들면, Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)에서 설명하는 아데노 바이러스 또는 Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) and U.S. Patent No. 5.252,479에서 설명하는 아데노-연합된 바이러스(AAV) 벡터를 이용할 수 있다. 이와 같은 발현 구조체를 분리시켜, 폴리펩티드를 인코드하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스성 플라스미드로 형질도입된 포장 세포내로 도입시켜, 포장된 세포가 관심의 대상이 되는 감염성 바이러스성 입자를 생산한다. 이들 생산 세포를 개체에 투여하여,in vivo상태에서 세포를 생산하고, 폴리펩티드를 발현하도록 한다(see Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (and references cited therein) in Human Molecular Genetics (I 996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).
또 다른 방법은 "naked DNA"를 투여하는 것인데, 치료 유전자를 혈류 또는 근육 조직에 바로 주사한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 질병-원인 물질인 경우에, 본 발명은 이들 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 질병 원인 물질에 대한 항체를 만드는 백신에 사용할 수 있도록 한다.
본 발명의 백신은 예방(감염 방지) 또는 치료(감염후 질병 치유)를 위한 것이 된다. 이와 같은 백신은 면역용 항원, 이뮤노겐, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 분자와 통상 상기에서 설명하는 약학적으로 수용가능한 담체(조성물을 제공받은 개체에서 유해한 항체 생산을 유도하지 않은 것 포함)와 복합된 것으로 구성된다. 이들 운반체는 면역자극 물질("어쥬번트")로 기능을 할 수도 있다. 또한, 항원 또는 이뮤노겐을 디프테리아, 파상풍(테타누스), 콜레라,H. pylori및 다른 병인균과 같은 세균성 독소에 결합시킬 수도 있다.
폴리펩티드가 위에서 분해되기 때문에, 폴리펩티드로 구성된 백신을 장관외(가령, 피라, 근육, 정맥, 경피 주사) 투여하는 것이 바람직하다. 장관외 투여에 적합한 조성물에는 항산화제, 완충제, 정균제, 개체의 혈액과 조성물이 등장성을 부여하는 용액, 현탁제 및 농후제를 포함하는 수용성 및 비-수용성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 단위 약형 또는 다중 약형 용기에 담을 수 있다. 예를 들면, 밀봉 앰플 및 바이알을 냉동 건조 상태에 보관하고, 사용하기 직전에 멸균 액상 담체를 추가하면 된다.
약량은 백신의 특이 활성에 따라 달라지는데, 통상적인 실험으로 결정할 수 있다.
본 발명은 또는 핵산 분자를 진단 시약으로 이용하는 것과 관련한다. 이상 기능과 연관된 본 발명의 핵산 분자 특징을 가진 유전자의 돌연변이체를 감지하는 방법을 진단 도구로 하여, 유전자의 과소 발현, 과다 발현, 유전자의 공간적 변경 발현 또는 일시적인 발현등으로 인한 질병을 정의, 진단 또는 질병에 대한 민감성을 진단할 수 있다. 다양한 기술을 이용하여, DNA 수준에서 유전자에 돌연변이가 있는 개체를 확인할 수 있다.
진단용 핵산 분자는 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 또는 부검 물질과 같은 개체 세포에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA를 감지에 직접적으로 이용하거나 분석하기 전에 PCR, 리게이즈 사슬 연장 반응(LCR), 스트랜드 치환 증폭(SDA) 또는 다른 증폭 기술을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다(Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); BeJ, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (I 99 1); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)).
한 구체예에서 본 발명에서는 혼자에 질병을 진단하는 방법을 제공하는데, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 수준을 평가하고, 기준 수준과 발현된 수준을 비교하고, 이때 기준과 차이가 나는 경우에 질병이 있다는 것을 말하는 것으로 구성된다. 이 방법은 다음의 단계로 구성된다;
a) 본 발명의 핵산 분자와 프로브간에 하이브리드 복합체 형성이 가능한 스트린젼트 조건하에서 환자에서 얻은 조직 시료와 핵산 프로브를 접촉시키고;
b) (a) 단계에서 이용된 조건하에서 프로브와 기준 시료와 접촉시키고;
c) 시료내에 하이브리드 복합체가 존재하는지 감지하고, 환자 시료에 있는 하이브리드 복합체의 감지 수준과 기준에서 확인된 감지수준이 상이한 경우에 질병이 있음을 나타낸다.
본 발명은 다음의 단계로 구성된 진단 방법을 제공하는데;
a) 질병을 테스트하기 위해 환자의 조직에서 시료를 얻고;
b) 조직 시료로부터 본 발명의 핵산 분자를 분리시키고;
c) 질병과 연관이 있는 핵산 분자에 돌연변이가 있는 지를 확인하여 질병에 대해 환자를 진단한다.
상기에서 설명하는 방법에서 핵산 분자 감지를 돕기위해, PCR을 이용하는 증폭 단계가 포함될 수 있다.
정상 유전자 형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기에 변화를 이용하여 결손 및 삽입을 확인할 수 있다. 증폭된 DNA를 본 발명의 라벨된 RNA에 하이브리드시켜 또는 본 발명의 라벨된 안티센스 DNA 서열에 하이브리드시켜, 점 돌연변이를 확인할 수 있다. RNase 절단에 의해 또는 용융 온도에서 차이를 확인하여 미스매취된 이중나선으로부터 완전하게 매취되는 서열을 구별해낼 수 있다. 하이브리드-이중나선 분자를 형성하기 하는 스트린젼트 조건하에서 DNA에 하이브리드할 수 있는 핵산 프로브와 DNA를 접촉시키고, 하이브리드안된 부분을 가지는 하이브리드 이중 나선 분자는 질병과 연관이 있는 돌연변이에 상응하는 임의 부분이 되고, DNA 가닥의 상응하는 부분에 질병과 연합된 돌연변이체가 존재하는지의 유무로 하이브리드안된 부분이 있는지를 확인하면, 환자에서 돌연변이 유무를 확인할 수 있다.
이와 같은 진단은 태아에서 그리고 신생아에서도 유용하게 사용될 수 있다.
기준 유전자와 "돌연변이 유전자"사이에 임의 서열 차이 및 점 돌연변이를 확인하는 방법은 공지의 기술로 가능한데, 예를 들면, 직접적인 DNA 서열화 또는 단일 가닥 배좌 다형성(see Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989))과 같은 것이 포함된다. 예를 들면, 서열화 작업 프라이머를 이중 가닥 PCR 생성물 또는 변형된 PCR에 의해 생성되는 단일-가닥 주형 분자와 함께 사용할 수 있다. 서열 결정은 방사능라벨된 뉴클레오티드를 이용한 통상의 과정으로 실행하거나 형광-테그를 이용한 자동화 서열화 과정으로 실행한다.
클론된 DNA 단편을 프로브로 이용하여 특정 DNA 단편을 찾을 수 있다. PCR과 복합할 경우에 이 방법의 감응성을 상당히 증가시킬 수 있다. 점 돌연변이 및 다형성과 같은 다른 서열 변이로 상기에서 설명하는 것과 같이 찾을 수 있는데, 예를 들면, 한 개 뉴클레오티드가 다른 서열의 PCR 증폭을 위한 대립형질-특이적인 올리고뉴클레오티드를 이용하면 된다.
변성제 유무에 관계없이 겔상의 DNA 전기 영동 이동성에 변화를 이용하여 DNA 서열 차이를 확인할 수 있고 또는 직접적인 DNA 서열화를 이용하여 확인할 수 있다(Myers et al., Science (1985) 230:1242). 특정 위치에 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 검사 또는 화학적 절단 방법을 이용하면 알 수 있다(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401).
통상의 겔 전기영동 및 DNA 서열과 방법에 추가하여, 마이크로딜리션(microdeletions), 에뉴플로이디즈(aneuploidies), 전치(translocations), 역위(inversion)과 같은 돌연변이 기술을 이용하여,in situ분석으로 감지할 수 있다. (Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA (1993)) 즉, 세포에서의 DNA 또는 RNA 서열은 막에 고정하거나 분리할 필요없이 돌연변이에 대해 분석할 수 있다.
형광in situ하이브리드 반응(FISH)이 현재 가장 흔히 사용되는 방법이고, 이 방법에 대한 설명은 여러 곳에서 제공한다(Trachuck et al., Science, 250,559-562 (1990), and Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)).
본 발명의 또 다른 구체예에서는 본 발명의 핵산 분자로 구성된 올리고뉴클레오티드 프로브 어레이를 만들어서 유전자 변이, 돌연변이, 다형성을 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다. 어레이 기술은 공지된 것으로 일반적으로 이용할 수 있는데, 유전자 발현, 유전적 연결, 유전자 다양성을 포함하는 분자 유전학에서 다양한 문제를 해결해주고 있다(M.Chee et al., Science(1996), Vol 274, pp 610-613).
한 구체예에서, 어레이는 PCT 출원 W095/11995(Chee et al); Lockhart, D. J. et al. (I 996) Nat. Biotech. 14. 1675.1680); and Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)에서 설명하는 것과 같은 방법으로 준비하고 이용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 쌍은 2 내지 1만개 범위가 된다. 올리고머는 광-직접적인 화학 공정을 이용하여 기질상에 지정된 부위에서 합성할 수 있다.
기질은 종이, 나일론 또는 다른 종류의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 다른 적절한 고형 서포트가 될 수 있다. 또 다른 측면에서, PCT 출원 W095/251116(Baldeschweiler et al)에서 설명하는 화학 결합 과정 및 잉크젯 장치 이용하여 기질 표면상에서 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 도트(또는 슬롯) 블랏에 유사한 "gridded" 어레이를 이용하고, 진공 시스템, 열, UV, 기계적 또는 화학적 결합 공정에 따라 지질 표면상에 cDNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 배열, 연결할 수 있다. 여기에서 설명하는 어레이는 이용가능한 장치(슬롯 블랏 또는 도트 블랏 장치), 재료(임의 적절한 고형 서포트), 기계(로봇장치)를 사용하여 만들 수 있는데, 8개, 24개, 96개, 384개, 1536개, 6144개 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 시판되는 장치를 효과적으로 이용할 수 있을 정도 범위의 2 내지 1만개 이상의 올리간뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
상기에서 논의된 방법에 추가하여, 개체에서 유도된 샘플로부터 폴리펩티드 또는 mRNA의 비정상적인 증가 또는 감소를 결정하여 개체의 질병을 진단할 수 있다. 폴리펩티드의 정량를 위해 당분야에 공지된 임의 방법을 이용하여 RNA 수준에서 발현의 증가 또는 감소를 결정할 수 있는데, 예를 들면, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블랏, 다른 하이브리드 방법과 같은 핵산 증폭을 통하여 실시한다.
숙주에서 유도한 시료내에 본 발명의 폴리펩티드 수준을 결정하는데 이용되는 검사 기술은 당분야에 공지되어 있고, 일부의 경우(방사능면역검사, 경쟁-결합 검사, 웨스턴 블랏 분석, ELISA 검사)에는 상세하게 논의되어 있다. 본 발명의 이러한 특징은 다음의 단계로 구성된 진단 방법을 제공한다;
(a) 리간드-폴리펩티드 복합체를 형성하는데 적절한 조건하에서 생물학적 시료와 상기에서 설명하는 리간드를 접촉시키고; 그리고
(b) 이 복합체를 감지한다.
폴리펩티드 수준을 측정하기 위한 ELISA, RIA, FACS와 같은 과정으로 폴리펩티드 발현 수준의 변화 또는 비정상을 진단하는 기초 자료를 제공할 수 있다. 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서 폴리펩티드에 대한 항체와 정상적인 포유류 개체, 바람직하게는 사람에서 취한 세포 추출물 또는 체액을 복합시켜, 폴리펩티드 발현의 정상 또는 표준 값을 얻을 수 있다. 포토메트릭 수단과 같은 다양한 방법을 이용하여 표준 복합체 형성 양을 정량화할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 폴리펩티드 발현과 연관된 질병 또는 상태를 진단할 수 있거나 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드, 본 발명의 다른 화합물로 치료를 한 환자를 모니터할 수 있다. 치료요법에서 사용된 동일한 방식으로 진단 목적에 유용한 항체를 만들 수 있다.
폴리펩티드용 진단 검사에는 사람의 체액 또는 세포 또는 조직 추출물에서 폴리펩티드를 감지하기 위한 라벨과 항체를 이용하는 방법이 포함된다. 변형된 또는 변형안된 항체를 이용할 수 있고, 리포터 분자와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시켜 라벨링할 수도 있다. 당분야에 공지된 다양한 리포터 분자를 이용할 수 있으며, 일부는 상기에서 설명된 것과 같다.
개체, 기준 및 생검조직에서 얻은 질병이 있는 시료에서 발현된 폴리펩티드의 양을 표준 치와 비교한다. 표준과 개체에서 얻은 값의 편차는 질병 진단을 위한 변수로 만든다. 진단 검사를 이용하여 폴리펩티드 발현 유무, 과다 발현을 구별하고, 치료 과정 동안에 폴리펩티드 수준 조절을 모니터할 수 있다. 이와 같은 검사를 이용하여 동물 연구, 임상 시도, 개인 환자에서 치료를 모니터하는데 치료 섭생의 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 다음과 같은 구성으로 되어 있다;
(a) 본 발명의 핵산 분자;
(b) 본 발명의 폴리펩티드;
(c) 본 발명의 리간드.
한 구체예에서, 진단 키트에는 본 발명의 핵산과 스트린젼트 조건하에서 하이브리드할 수 있는 핵산을 포함하는 제 1 용기; 핵산 분자를 증폭시키는데 유용한 프라이머를 포함하는 제 2 용기; 질병 진단에 이용할 수 있는 프로브와 프라이머 사용 방법을 포함한다. 키트에는 하이브리드안된 RNA를 절단하는 물질이 포함된 제 3 용기가 추가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 진단 키트에는 핵산 분자 어레이가 포함되는데, 이중 적어도 하나는 본 발명의 핵산 분자가 된다.
본 발명의 폴리펩티드를 감지하기 위해, 진단 키트에는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 한 가지 이상의 항체; 항체와 폴리펩티드 간에 결합 반응을 감지하는데 이용할 수 있는 시약으로 구성된다.
이와 같은 키트는 질병을 진단 또는 질병에 감응성, 특히 세포 증식성 질환, 자가면역/염증 질환, 심장맥관 질환, 신경 질환, 개발 질환, 대사 질환, 감염 및 다른 병인 질환의 진단 및 민감성 진단에 이용할 수 있다. 특히, 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 체장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증, 바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
본 발명의 다양한 특징 및 구체예는 INSP037 폴리펩티드를 이용한 실시예를 통하여 상세하게 설명될 것이다.
상세한 설명에서 본 발명에 범위내에서 변형이 가능함을 인지할 것이다.
실시예 1: INSP037
INSP037의 엑손을 해독한 것을 나타내는 SEQ ID NO:36에서 유도된 폴리펩티드 서열을 PBD 데이다베이스에 있는 구조에 대해 Inpharmatica Genome Threader 도구의 문제로 사용하였다. 가장 메치(일치)가 잘되는 것이 4개 나선 번들 사이토킨 페밀리 성분이다. 가장 메치가 잘되는 것을 Genome Threader 84% 신뢰도를 가진 문제 서열에 배열하였다(도 1). 도 2에서는 4개 나선 번들 사이토킨 족의 한 성분이되는 소 인터페론-감마(PDB- ld9g)의 서열에 INSP037 문제 서열을 배열을 한 것을 나타낸다(Randal et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Jan;56(Pt 1):14-24). 도 2에서는 INSP037 폴리펩티드 서열을 "IPAAA445"로 명명하였다. 단백질이 4개 나선 번들 사이토킨 족이 성분은 치료요법적으로 중요하다.
1. cDNA 라이브러리로부터 IPAAA44548 클로닝
1.1 cDNA 라이브러리
사람 cDNA 라이브러리(박테이로파아지 람다(λ) 벡터)는 Stratagene 또는 Clontech에서 구입하거나 Serono Pharmaceutical Research Institute에서 λZAP 또는 λGTIO 벅터에서(제조자의 지시에 따라) 만들 수 있다. 제조업자의 지시에 따라(Promega, Corporation, Madison WI.), Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템을 이용하여 감염된 대장균 숙주 균주의 소규무 배양물에서 박테리오파아지 λDNA를 준비할 수 있다. 이용된 라이브러리와 균주 목록을 표 1에 나타내었다.
1.2 파아지 라이브러리 DNA에서 가상 cDNA PCR
IPAAA44548을 인코드하는 전장 가상 cDNA(도 3)는 유전자 특이적 클로닝 프라이머(CP1 & CP2, 도 3, 표 2)를 이용하여 264bp의 PCR 증폭 생성물(도 4)로 얻을 수 있다. IX AmpliTaqTM완충액, 200μM dNTPs, 50pmoles의 각 클로닝 프라이머, 2.5 Units AmpliTaqTM(Perkin Elmer), 100ng 각 파아지 라이브러리 DNA를 포함하는 최종 용적 50㎕에서 PCR을 다음과 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 실시하였다: 94℃, 1분; 94℃ 1 분, x℃ y분, 72℃(이때 x는 최저 Tm -5℃이고, y는 생성물 kb당 1분)을 40회; 72℃에서 7분, 4℃에서 홀딩 사이클.
증폭 생성물은 1X TAE 완충액을 이용한 0.8% 아가로즈 겔(Life Technologies)상에서 볼 수 있고, Wizard PCR Preps DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 예상 분자량 위치로 이용된 PCR 생성물을 겔로부터 정제하였다. 50㎕ 멸균 수로 융출된 PCR 생성물을 바로 서브클론시키거나 -20℃에 보관하였다.
1.3 PCR을 위한 유전자 특이적 클로닝 프라이머
Primer Designer Software (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)을 이용하여 가상 cDNA의 전장을 증폭시키기 위해, 18 내지 25개 염기사이 길이를 가진 PCR 프라이머 쌍을 고안하였다. PCR 프라이머는 Tm이 55+10℃에 근접하도록 하고, GC 함량이 40-60%가 되도록 최적화시켰다. 표적 서열 IPAAA44548(특이적 프라이밍은 없다)에 높은 선택성을 가지는 프라이머를 선별하였다.
1.4 PCR 생성물의 서브클로닝
Invitrogen Corporation에서 구입한 TOPO TA 클로닝 키트(cat.No. K4600-01, K4575-01)를 이용하여, 제조업자가 권유하는 조건하에서 PCR 생성물을 토포이소메라제 I 변형된 클로닝 벡터(pCR Ⅱ TOPO)으로 서브클로닝시켰다. 간략하게 설명하면, 사람의 뇌하수체 라이브러리(라이브러리 번호 3)으로부터 겔에서 정제한 PCR 생성물 4㎕를 실온에서 TOPO 벡터 1㎕와 염용액 1㎕와 함께 15분간 배양하였다. 반응 생성물을 다음과 같은 방법으로 대장균 TOP10(Invitrogen)으로 형질도입시켰다; 50㎕ One Shot TOPIO 세포를 얼음 위에서 녹인 후에, 2㎕ TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 15분간 배양시키고, 정확하게 30초간 42℃에서 배양하여 열쇼크를 가하였다. 샘플을 얼음으로 다시 가져온 후 250㎕ 따뜻한 SOC 배지(실온)을 첨가하였다. 시료는 37℃에서 1시간동안 교반(220rpm)하면서 배양시켰다. 형질변환 혼합물을 암피실린(100㎍/㎖)을 포함하는 L-broth(LB)상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. cDNA 삽입물을 포함하는 암피실린 저항물질을 콜로니 PCR을 이용하여 확인하였다.
1.5 콜로니 PCR
멸균된 이쑤시개를 이용하여 콜로니를 50㎕ 멸균수에 접종하였다. 접종물 10㎕을 총 반응 용적 20㎕에서 상기에서 설명하는 PCR(단, 이용된 프라이머 쌍은 SP6이고(5', T7)을 실시하였다. 사이클링 조건은 다음과 같다: 94℃, 2분; 94℃, 30초, 47℃, 30초, 72℃, 1분을 30회; 72℃, 7분 1회. 그 다음 추가 분석하기 전에 샘플을 4℃에서 유지시킨다(홀딩 사이클).
1X TAE 완충액을 이용하여 1% 아가로즈 겔상에서 PCR 반응 생성물을 분석하였다. 예상되는 PCR 크기(264bp cDNA + 187 bp -다중 클로닝 부위 또는 MCS으로 인함)을 가지는 콜로니는 암피실린(50㎍/㎖)을 포함하는 L-broth(LB)에서 37℃, 220rpm으로 교반시키면서 하룻밤동안 배양하였다.
1.6 플라스미드 DNA 준비 및 서열화 작업
Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 제조업자의 지시에 준하여, 5㎖ 배양물로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비할 수 있다. 플라스미드 DNA를 100㎕ 멸균수로용출시켰다. Eppendorf BO photometer를 이용하여 DNA 농도를 측정하였다.
BigDyeTerminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여, 플라스미드 DNA(200-500ng)를 T7 프라이머와 SP6 프라이머를 이용한 DNA 서열화작업을 실시하였다. Dye-Ex columns(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 클린업 플레이트(Millipore cat. no. LSKS09624)를 이용하여 서열화 반응물을 정제하고, Applied Biosystems 3700 sequencer에서 분석하였다.
2. HEK293/EBNA 세포에서 IPAAA44548 발현을 위한 플라스미드 작제.
DNA 서열하 작업에 의해 확인된 IPAAA44548의 전체 코딩 서열(ORF)(도 5)를 포함하는 pCRII-TOPO 클론을 이용하여, GatewayTm 클로닝 방법(Invitrogen)에 따라 포유류 세포 발현벡터pEAK12d(도 6)내로 삽입체를 서브클로닝시켰다. 클론된 서열에는 단일 뉴클레오티드 치환된 A134G를 포함한다(도 4).
2.1 in frame 6HIS tag 서열에 융합된 Gateway 호환 IPAAA44548 ORF 생성
Gateway 클로닝 프로세스의 제 1 단계는 2단계 PCR 반응으로써 attB1 제조합 무위와 Kozak 서열 옆 5'단부에 측면과 in frame 6 히스티딘(6HIS) tag, 종료 코돈, attB2 재조합 부위(Gateway 호환 cDNA)를 인코드하는 서열 옆 3' 단부에 측면에 IPAAA44548의 ORF를 만든다. 처음 PCR 반응(최종 용적 50㎕)에는 25ng pCR Ⅱ TOPO-IPAAA44548(플라스미드 13124, 도5), 2㎕ dNTPs(5mM), 5㎕ 1O X Pfx 폴리메라제 완충액, 0.5㎕ 각각 유전자 특이적 프라이머(100μM)(EX1 전방, EXI 역방 프라이머), 0.5㎕ Platinum Pfx DNA 폴리메라제(Invitrogen)를 포함한다. 95℃ 2분간 초기 변성 단계, 94℃, 15초, 68℃ 30초를 12회하여 PCR 반응을 실시하였다.Wizard PCR prep DNA 정제 시스템(Promega)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 PCR 생성물을 반응 혼합물로부터 직접 정제하였다. 제 2 PCR 반응물(최종 용적 50㎕)에는 10㎕ 정제된 PCR 생성물, 2㎕ dNTPs(5mM), 5㎕ 1O X Pfx 폴리메라제 완충액, 0.5㎕ Gateway 호환 프라이머(100μM)(GCP 전방, GCP 역방 프라이머), 0.5㎕ Platinum Pfx DNA 폴리메라제(Invitrogen)를 포함한다. 2번째 PCR 반응 조건은 다음과 같다; 95℃, 1분; 94℃, 150초, 45℃, 30초, 68℃, 3.5분을 4회; 94℃, 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 3.5분을 25회. PCR 생성물은 상기에서 설명하는 것과 같이 정제하였다.
대장균에서 IPAAA44548 발현을 위해,제 1 PCR에서 유전자 특이적인 프라이머(EX3-전방, EX2-역방)를 이용하고, 상기에서 설명하는 동일한 조건에서 프라이머 GCPF, GCPR을 이용하여 개시 메티오닌 코돈의 상류 Shine Dalgrno 서열을 포함하도록 ORF를 만들었다. 생성된 PCR 산물을 SD-IPAAA44548이라고 하였다.
2.2 Gatewu entry 벡터 pDONR201와 발현벡터 pEAK122d내로 Gateway 호환 IPAAA44548 ORF의 서브클로닝
Gateway 클로닝 공정의 제 2 단계는 Gateway entry vector pDONR201 (Invitrogen, 도 7)내로 Gateway 변형 PCR 생성물을 다음과 같이 서브클로닝시키는 것이다; 5㎕ 정제된 PCR 생성물을 1.5㎕ pDONR201 벡터(0.1㎍/㎕), 2㎕ BP 완충액, 1.5㎕ BP 클로나제 효소 혼합물(Invitrogen)과 함께 실온에서 1시간동안 배양시켰다.
proteinase K(2㎍)을 추가하여 반응을 종료시키고, 추가 10분간 37℃에서 배양시켰다. Biorad Gene Pulser를 이용한 전기천공으로 반응물(2㎕)를 E. coli DHIOB 세포내로 형질도입시켰다. LB-카나마이신 플레이트상에 형질변환체를 도말하였다. Wizard Plus SV Minipreps kit(Promega)를 이용하여 생성된 콜로니 1-4로부터 플라스미드 mini-prep DNA를 준비하였고, 1.5㎕ 플라스미드 용출액을 재조합 반응에 이용하는데, 반응물에는 1.5㎕ pEAK12d 벡터(도 6)(0.1㎍/㎕), 2㎕ LR 완충액, 1.5㎕ LR 클로나제(Invitrogen)가 최종 용적 10㎕로 포함되었다. 혼합물은 실온에서 1시간 배양시키고, proteinase K(2㎍)을 첨가시켜 반응을 종료시키고, 37℃에서 추가 10분 더 배양시켰다. 반응물(1㎕)를 이용하여 전기천공으로 대장균(E. coli) DH1OB 세포를 형질변환시켰다.
상기에서 설명하는 콜로니 PCR(단 PCR에는 pEAK12d 프라이머(pEAK12d F 및 pEAK12d R가 이용)를 이용하여 정확한 삽입체를 포함하는 클론을 확인하였다. Qiaprep Turbo 9600 로봇 시스템(Qiagen)을 이용하거나 또는 Wizard Plus SV minipreps kit(Promega)를 이용하여 수작업으로 정확한 삽입체를 가지는 플라스미드 mini prep DNA를 분리하였고, pEAK12d F 및 pEAK12d R 프라이머를 이용하여 서열을 확인하였다.
플라스미드 pEAK12d-IPAAA44548-6HIS(플라스미드 ID 번호 11775, 도 8)의 CsCl 구배정제된(gradient purified) maxi-prep DNA를 서열 확인된 클론 500㎖ 배양물로부터 만든다음(Sambrook J. et al., in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2 d 1 5 edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1㎍/멸균수 ㎕ 농도로 재현탁시키고, -20℃에 보관한다.
2.3 Gateway entry 벡터 pDONR201과 대장균 발현벡터 pDEST14내로 Gateway 호환 SD-IPAAA44548 ORF의 서브클로닝
BP 클로나제를 이용하여, in frame 3' 6HIS tag 서열과 5' 상류 Shine Dalgarno 서열을 포함하는 Gateway 호환 SD-IPAAA44548 ORF를 pDONR201으로 서브클론시켰다. 그 다음 생성된 플라스미드는 상기에서 설명하는 LR 클로나제를 이용하여 대장균(E.coli) 발현벡터 pDEST14(Invitrogen, 도 9)화 함께 재조합반응에 이용하였다. 생성된 발현 플라스미드(pDEST14-IPAAA445486HIS)(도 10, 플라스미드 ID 12896)는 상기에서 설명하는 것과 같이 서열 확인하였다. 대장균에 발현을 위해, CsCl 정제된 maxi-prep DNA를 대장균 숙주 균주 BL21으로 다시 형질도입시켰다. T7 프로모터 제어하에 삽입된 cDNA를 발현시켰다.
2.4 발현 벡터 pEAK12d 작제
벡터 pEAK12d는 포유류 세포 발현 벡터PEAK12(Edge Biosystems에서 구입)의 Gateway 클로닝 시스템 호환 버전으로, 관심대상 cDNA는 사람의 EF1α 프로모터 제어하에서 발현된다. pEAK12d는 다음에서 설명하는 방식으로 만들 수 있다;
pEAK12를 제한효소 HindIll and Notl으로 절단하고, Klenow(New England Biolabs)를 이용하여 블런트 단부를 만들고, 송아지 내장 알칼리 포스포타제(Roche)를 이용하여 디포스포릴화시켰다. 디포스포릴화 후에, 벡터를 블런트 단부를 가지는 Gateway reading frame cassette C(Gateway vector conversion system, Invitrogen cat no. 11828-019)- ccdB 유전자와 클로람페니콜 유전자 옆에 AttR 재조합 부위를 포함))에 결찰시키고, 대장균(E.coli) DB3.1 세포(ccdB 유전자를 포함하는 벡터의 증식을 허용)에 형질도입시킨다. Wizard Plus SV Minipreps 키트 (Promega)를 이용하여 몇 가지 생성된 콜로니로부터 Mini prep DNA를 분리시키고, AseⅠ/EcoRⅠ으로 절단하여, 670bp 단편을 만드는 클론을 확인하는데, 이는 카세트가 정확한 방향으로 삽입되었다는 것을 말한다. 생성된 플라스미드를 pEAK12d(도 6)라고 명명하였다.
3. IPAAA44548를 포함하는 cDNA 라이브러리 확인
CP1 및 CP2로 수득하고, 정확한 크기 부위(264bp)로 이용되는 PCR 생성물이 라이브러리 3, 8, 12(각가 뇌하수체, 대뇌피질, 태아 신장의 라이브러리)에서 확인되었다.
밑줄친 서열 = Kozak 서열
굵은 글씨 = 종료 코돈
이태리체 서열 = His tag
그림자 서열 = Shine Dalgarno 서열(리보좀 결합 부위)
4. 클론된 IPAAA44548-S-6HIS(플라스미드 no. 12118)의 포유류 세포에서 발현
4.1 세포 배양
Epstein-Barr 바이러스 핵 항원(HEK293-EBNA, Invitrogen)을 발현시키는 세포 배양물 사람 배아 신장 293 세포는 Ex-cell VPRO 무-혈청 배지(seed stock, maintenance medium, JRH) 현탁액에 유지시켰다. 트랜스펙션(D-1)전 16 내지 20시간전에 2x T225 플라스크(50㎖/flask DMEM/F12(1:1)- 2%FBS 접종 배지(JRH))에서 세포를 2X105세포/㎖ 밀도로 접종하였다. 그 다음날(트랜드펙션하는 날), JetPEITM시약(2㎕/㎍ plasmid DNA, PolyPlus-transfection)을 이용하여 트랜스펙션을 실시하였다. 각 플라스크에서, 113㎍ 플라스미드(No. 12118)를 2.3㎍ GFP(형광 리포터 유전자)와 함께 공동 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 혼합물을 2xT225 플라스크에 혼합하고, 6일간 37℃(5% CO2)에서 배양시켰다.
1일과 6일째에 정량 형광 검사를 통하여 양성 트랜스펙션를 확인한다(Axiovert 1O Zeiss).
6일째에(수득하는 날), 두 개 플라스크로부터 상청액(100㎖)을 모아서, 원심분리한후(4℃, 400g), 독특한 확인물질을 포함하는 포트에 둔다.
6His-태그 단백질(internal bioprocessing QC)의 QC를 위해 약간의 용액을 보관한다(500㎕).
Polysciences사의 폴리에틸렌아민을 트랜스펙션 물질로 사용하여 다음의 프로토콜레 따라 스케일-업 베치(batch) 과정을 실시하였다-"PEI transfection of suspension cells" referenced BP/PEI/HH/02/04.
이와 같은 프로토콜은 다음을 기초한다;
400㎖ spinner: IE6 hek293EBNA 세포/㎖ 200㎖ FEME 1% FBS
400㎍(플라스미드 No. 12118) 10㎖ FEME 1%에 희석, 800㎍ PEI 추가
트랜스펙션 90분후, FEME 1% 배지 추가하여 400㎖ 총용적으로 함.
수득할 때까지 spinner에 배양물을 6일간 방치.
4.2 정제 공정
C-말단 6His tag를 가지는 재조합 단백질을 포함하는 배양 배지 시료(100 또는 400㎖)를 1배 용적의 냉각 완충액 A(50mM NaH2PO4; 600mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, pH 7.5)으로 희석하여 최종 용적이 각각 200㎖ 및 800㎖이 되도록 한다. 샘플을 0.22㎛ 멸균 필터(Millipore, 500㎖ 필터 단위)를 통과시켜 여과시킨 후, 몇균된 사각 배지 병(Nalgene)에서 4℃로 유지시킨다.
자동 샘플 적하장치(Labomatic)가 연결된 VISION workstation(Applied Biosystems)상에서 4℃ 정제과정을 실시하였다. 정제 과정은 두 단계로 구성되는데, Ni 이온이 충전된 Poros 20 MC(Applied Biosystems) 컬럼(4.6x50 mm, 0.83㎖)상에서 금속 친화성 크로마토그래피후에 Sephadex G-25 배지(Amersharn Pharmacia) 컬럼(1.0 x 10cm)상에서 겔 여과한다.
제 1 크로마토그래피 단계에서, 금속 친화력 크로마토그래피는 EDTA 용액(100mM EDTA; 1M NaCl; pH 8.0)의 30 컬럼 용적으로 재생시키고, 15 컬럼 용적의 100mM NiSO4용액으로 세척하여, Ni 이온을 충전하고, 10배 용적의 완충액 A로 세척하고, 7배 용적의 완충액 B(50mM NaH2PO4; 600mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, 400mM;이미다졸, pH 7.5)로 세척하고, 최종 15mM 이미다졸을 포함하는 완충액 A 15컬럼 용적으로 균형을 맞춘다. 샘플은 Labomatic sample loader를 이용하여, 200㎖ 샘플 루프로 옮기고, 연속하여 Ni 금속 친화성 컬럼으로 분당 10㎖ 속도로 충전시켰다. 400㎖ 스케일업 샘플의 경우에, 이동 및 충전 과정을 4회 반복하였다. 컬럼은 연속하여 완충액 A의 12 컬럼 용적으로 세척하고, 20mM 이미다졸을 포함하는 완충액 A 28 컬럼 용적으로 세척하였다. 20mM 이미다졸로 세척하는 동안에 느슨하게 결합된 오염 단백질이 컬럼으로부터 용출된다.
최종적으로 분당 2㎖ 속도로 완충액 B의 10 컬럼 용적으로 용출시키면, 재조합 His-tagged 단백질이 용출되고, 용출된 단백질은 1.6㎖씩 콜렉트한다.
두 번째 크로마토그래피 단계에서, Sephadex G-25 겔-여과 컬럼은 2㎖ 완충액 D(1.137M NaCl; 2.7mM KCI; 1.5mM KH2PO4; 8mM Na2HP04; pH 7.2)으로 만들고, 완충액 C(137mM NaCl; 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4; 8mM Na2HP04; 20%(w/v) 글리세롤; pH 7.4) 4컬럼 용적으로 균형을 맞춘다. Ni-컬럼으로부터 용출되는 피크 부분은 Sephadex G-25 컬럼상에 있는 VISION상의 샘플 로더를 통하여 자동적으로 모집되고, 단백질은 분당 2㎖ 속도로 완충액 C와 함께 용출된다. 염을 제거한 샘플을 2.2㎖ 부분에서 회수하였다. 해당 부분은 0.22㎛ 멸균 원심분리 필터(Millipore)를 통하여 여과시키고, 냉동시킨후 -80℃에서 보관하였다. 샘플 소량을 SDS-PAGE(4-12 % NuPAGE gel; Novex)에서 코마시블루 착색한후 분석하고, 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블랏하였다.
코마시 착색: NuPAGE 겔을 0.1% 코마시블루 R250 착색 용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)으로 실온에서 1시간동안 착색한 후에, 20% 메탄올, 7.5% 아세트산으로 배경부분이 깨끗하게 탈색되어, 단백질 밴드가 선명하게 보일 때까지 탈색시켰다.
웨스턴 블랏: 전기영동후에, 겔의 단백질을 니트로셀룰로오즈 막으로 290mA에서 4℃에서 1시간동안 전기적으로 이동시킨다. 막은 5% 우유 분말/완충액 E(137mM NaCl; 2.7mM KCl; 1.5mM KH2PO4; 8mM Na2HP04; 0.1% Tween 20, pH 7.4)으로 1시간동안 실온에서 차단시키고, 두 가지 토끼 다클론 항-His 항체(G-18 및 H-15, 0.2㎍/㎖ 각각; Santa Cruz)/2.5% 우유 분말/완충액 E에서 4℃, 하룻밤동안 배양시켰다.
실온에서 추가 1시간 배양 후에, 막을 완충액 E(3x10분)으로 세척한 후, 2.5% 우뮤 분말을 포함하는 완충액 E에서 1/3000으로 희석된 2차 HRP-결합된 항-토끼 항체(DAKO, HR.P 0399)를 실온에서 2시간동안 배양시켰다. 완충액 E(3 x 10 minutes)로 세척한 후에 ECL키트(Amersham Pharmacia)을 이용하여 1분간 디벨럽시킨다. 막을 연속하여 Hyperfilm(Amersham Pharmacia)에 노출시키고, 필름을 현상한 후, 웨스턴 블랏을 눈으로 분석하였다.
단백질 검사: BCA 단백질 검사 키트(Pierce)를 이용하여, 샘플에서 코마시 블루 착색 시에 감지 가능한 단백질 밴드를 나타내는 표준으로 소 혈청 알부민과 함께 단백질 농도를 결정하였다.
4.3 세균 세포에서 IPAAA44548-SEC-6HIS 발현(플라스미드 No. 12896)
하기에서 설명하는 방법은 단백질을 생산하기 위해 대장균(E. coli) BL-21 DE3 세균 균주를 사용하는 것에 대한 것이다. "BL21 DE3"은 재조합 단백질을 과다발현시키는데 흔히 이용되는 T7 RNA 폴리메라제 기초한 발현시스템의 일부이다.
4.4 세균 균주 BL21(DE3)의 형질전환
TSS 방법을 이용하는데, 이 프로토콜은 Chung, C.T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:2175에서 구한 것이다.
10-100ng DNA(2㎕) 재조합 플라스미드 No.12896을 TSS 방법의 컴피펀트 BL21에 추가하여, 얼음위에 20분간 둔다. SOC 배지(0.8㎖)를 추가하고, 튜브는 37℃, 200rpm에서 1시간동안 배양시킨다. 배양물로부터, 20㎕ 및 200㎕ 샘플링하고, 암피실린(40㎕/㎖ 농도)을 포함하는 LB 플레이트상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 둔다.
그 다음날, 3개 콜로니를 분리하여, 글리세롤 스탁을 만드는데 이용하고, shake flasks 실험에서 발현 테스트를 한 후, 발효기로 생성물을 이동시킨다(이들 모두 shake flask에서 동일하게 진행되기 때문에, 3개중 하나를 대규모로 사용하기 위해 선택한다)
4.5 재조합 대장균을 장기간 보관하기 위한 씨드 스탁(stock)을 준비
암피실린 40㎕/㎖을 포함하는 LB 배지를 가진 5㎖ 뷰트에 새로 준비한 한천 플레이트에서 얻은 단일 콜로니를 접종하였다. 세균은 37℃, 200rpm으로 하롯밤동안 배양시켰다. 그 다음날 아침 밤새 배양된 배양물 50㎕를 샘플링하여, 새로 준비한 5㎖ LB 튜브(+ 항생제)에 접종하고, 37℃, 200rpm에서 2-3시간 배양하여, 세균이 exponential growth phase에 도달하도록 한다.
20% 글리세롤 5㎖을 배양물에 추가하여 혼합하였다. 1.5㎖씩을 -80℃에서 저장된 씨드 스탁(internal Glycerol stock)으로 구성된 5개 극저온 바이알에 분배한다
4.6. 5ℓ규모에서 발현.
재조합 균주는 T7 프로모터가 사전 유도되지 않도록 적절한 항생제(최종 농도 40㎕/㎖)와 0.5% 포도당과 함께 5ℓ Biolafitte 교반된 탱크 반응기(5ℓ ECPM 1 배지-표 1에서 보고된 조성을 가짐)에서 증식시켰다. 연구용 등급 2464만 준비하고, 정제하였다.
글리세롤 씨드 스탁 바이알중 하나에서 긁어낸 냉동 세균을 시작으로 500㎖ LB(+항생제, 0.5% 포도당) 쉐이크 플라스크에서 접종하고, 자동 접종 전에 9시간 생장시켰다. 세포의 OD가 10에 도달하면(통상 7-9시간 생장 후에 도달), IPTG:1mM 최종 농도를 이용하여, 단백질 생산을 유도한다. 유도는 3시간 지속한다.
생장 및 유도 동안에 발효기 세팅 조건은 다음과 같다; 50% 용존 산소, pO2에 따라 300 내지 700rpm. pO2는 분당 25㎖씩 +/- 02를 공기살포하여 유지시킨다. 5㎖ 샘플을 매시간 취하여, 600㎚에서 광학 밀도를 측정하였다.
세포를 수득하여, 4000rpm(Sorvall RC 3B)에서 원심분리시켰다. 펠렛은 추가 처리할 때까지 -20℃로 유지시킨다.
SDS PAGE의 코마시 블루 착색을 이용하여 세포 추출물에 단백질이 존재하는 지를 평가한다.
Anfifoam PPG P2000를 약간 첨가하였다.
각 성분은 별도로 HCl에 용해시켰다.
4.7 정제 과정
67g 냉동 세균 덩어리를 270㎖ 완충액 A(50mM NaH2PO4; 600mM NaCl; 1mMPMSF; 1mM 벤자미딘; 8.7%(w/v) 글리세롤, pH 7.5)(완전한 EDTA-없는 프로테아제 저해물질(Roche)/50㎖ 보충된)에 현탁시켰다. Z-plus 세포 분쇄기(Constant Cell Disruption Systems)로 1300bar에서 2회 통과시켜 세균을 분쇄시켰다.
샘플은 연속하여 36,000xg에서 30분간 원심분리시켰다. 상청액(300㎖)을 분당 4㎖ 유속으로 Ni-NTA-Agarose 컬럼(2.5 x 3.0 cm)(완충액 A로 균형을 맞춤)에 적하시켰다.
컬럼은 100㎖ 완충액 A로 세척한 후 85㎖ 20mM 이미다졸/완충액 A로 세척하였다. 20 내지 250mM 구배 농도 범위의 이미다졸/완충액 A를 이용하여 분당 3㎖ 유속으로 단백질을 용출시켜, 7.5㎖ 부분을 콜렉트한다. 매초마다 콜렉트된 샘플을 환원 SDS-샘플 완충액으로 1/6 희석시키고, 4-12% NuPage 겔(Novex)에 웰당 15㎕씩 적하시킨 다음, 전기영동후에 겔을 코마시 블루로 착색시켰다.
IPAAA44548 농도가 가장 높은 부분(fractions 36-42)을 모우고, 총 용적이 53㎖(Pool N1)이 되었다. pool N1의 양쪽 부분(순도 및 농도가 낮음:32-35 + 43-44)을 pool N2에 용적이 44㎖이 되도록 모은다.
Ni-컬럼에서 얻은 pool은 Q-Sepharose Fast flow 컬럼(1.5 x 12 cm)(완충액 B(50mM Tris-HCI, 1mM 벤자이미딘, pH 7.5)으로 균형을 이룸)에서 추가 정제하였다. 52㎖ pool N1은 300㎖ 완충액 B와 648㎖ H20로 희석시켜, 최종 용적이 1000㎖이 되도록 한다. 샘플을 분당 5㎖씩 컬럼에 적하시키고, 컬럼을 150㎖ 완충액 B로 세척한 후에, 0 내지 400mM의 구배 NaCl/완충액 B를 이용하여 단백질을 용출시켰다.2㎖ 분취물을 수득하고, 상기에서 설명하는 코마시 착색된 SDS-PAGE으로 분석하였다. 분취물28-30(Pool Ql)에는 예상 분자량이 9.6kDa인 위치에 있는 한 가지 단백질 밴드를 포함하였다. 분취물 31-33 (Pool Q2)에는 추가로 약 20kDa위치에 또 다른 단백질 밴드가 나타났는데, 이는 이량체가 형성되었다는 것을 나타낸다.
Ni 컬럼으로부터 43㎖ pool N2를 300㎖ 완충액 B와 657㎖ H20로 희석하여 1000㎖이 되도록 한다. 샘플을 Q-Sepharose 컬럼에 적하시키고, pool N1에서 설명한 것과 같이 단백질을 용출시키고, 분석하였다. 분취물 28-30(Pool Q3)에는 예상 분자량이 9.6kDa인 위치에 있는 한 가지 단백질 밴드를 포함하였다. 각 Q-pool은 약 5.5㎖ 용적을 가진다.
Q-Sepharose 컬럼의 pool은 Superdex G75 겔 여과 컬럼(HiLoad 16/60, Pharmacia)을 통과시킨다. 컬럼을 0.5M NaOH로 세척시키고, PBS로 평형을 이루도록 한다. 컬럼은 분당 1㎖ 유속으로 실시하고, 컬럼에는 5㎖ pool을 적하시켰다. 2㎖ 분취물을 수집하고, 상기에서 설명하는 것과 같이,코마시 착색된 SDS-PAGE으로 분석하였다.
분취물 31-35(9.5㎖)(S1)에서 용출된 pool Q1, pool Q2에서 IPAAA44548가 용출되었고, 분취물 31-34(7.5㎖)(S2)와 분취물 26-28(5.8㎖)(S3)의 두 피크로부터 단백질이 용출되었고, 분취물 32-35(7.5㎖)(S4)에서 용출된 pool Q3에서 단백질이 용출되었다. 비-변성 SDS-PAGE에서 분석하면, pool S3에서 약 80%이상의 단백질이 이량체로 존재하고, 다른 pool에서는 약간의 미량 이량체가 있다는 것을 알수 있다. pool S1과 S2에는 비교적 순수한 농도를 가지고 있어, 이를 pool S1b (9.5+7.5=17㎖)로 모았다.
몰 흡광 상수를 7,090 및 분자량을 9,625로 계산하여 280㎚에서 흡수도를 측정하여 단백질 농도를 결정하였다. 질량 스펙트로스코피를 이용하여 결정한 단백질의 분자량은 S1b와 S4에서 9,624.6이었고, pool P3에서 분자량은 19,252.2이었다. 이는 이황화결합으로 연결된 이량체라는 것을 보여주는 것이다. LPS를 위해 pool을 검사하고, 1.1 내지 3.4U/mg을 보유하였다.
정제된 pool 요약.
Pool 농도 전체 양 Lot 번호
Pool S1b 2.1mg/㎖ 35.7mg 2
Pool S3 1.7mg/㎖ 9.8mg 3
Pool S4 0.95mg/㎖ 7.1mg 6
전체 52mg 순수 단백질을 회수하였고, 0.77mg/g 세균 덩어리를 회수하였다. 세 가지 pool 모두 RP-HPLC상에서 순도가 97%이상이었다.
서열 리스트 SEQ ID NO:35(INSP037의 뉴클레오티드 서열)
1 ATGACTTCAC CAAACGAACT AAATAAGCTG CCATGGACCA ATCCTGGAGA
51 AACAGAGATA TGTGACCTTT CAGACACAGA ATTCAAAATA TCTGTGTTGA
101 AGAACCTCAA AGAAATTCAA GATAACACAG AGAAGGAATC CAGAATTCTA
151 TCAGACAAAT ATAAGAAACA GATTGAAATA ATTAAAGGGA ATCAAGCAGA
201 AATTCTGGAG TTGAGAAATG CAGATGGCAC ACTTTAG
SEQ ID NO:36(INSP037의 단백질 서열)
1 MTSPNELNKL PWTNPGETEI CDLSDTEFKI SVLKNLKEIQ DNTEKESRIL
51 SDKYKKQIEI IKGNQAEILE LRNADGTL
추가 질환에는 전이성 흑색종(Vaishampayan U, Clin Cancer Res 2002 Dec:8(12):3696-701), 만성 간염(Semin Liver Dis 2002:22 Suppl 1:7), 항균 면역성과 연관된 질환(Bogdan, Current Opinion in Immunology 2000, 12:419-424), HIV 감염(Dereuddre-Bosquet N., et al., J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retroviol 1996 Mar 1: 11(3):241-6), 사람의 암 및 바이러스 기원의 질환(Pfeffer LM, Semin Oncol 1997 Jun 24:S9 69), 페로니 질환(Lacy et al., Int J Impot Res 2002 Oct:14(5):336-9), 결핵(Dieli et al., J Infect Dis 2002 Dec 15;186(12):1835-9), 만성 폐 질환(Oei J et al., Acta Paediatr 2002:91(11):1194-9), 침투성 만성적 치주염(Gonzales JR, et al., J clin Periodontol 2002 Sep:29(9):816-22), 건선(Kimball et al., Arch Dermatol 2002 Oct:138(10):1341-6), 이식편-숙주 질환(Miura Y., et al., Blood 2002 Oct 1:100(7):2650-8), Sjogren 질환(Anaya et al., J Rheumatol 2002 Sep; 29(9):1874-6), Crohn 질환(Schmit A. et al., Eur Cytokine Netw 2002 Jul-Sep:13(3):298-305) 등이 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ARES TRADING S.A. <120> SECRETED PROTEIN <130> P032630WO <140> PCT/GB02/005914 <141> 2002-12-23 <150> GB 0130720.6 <151> 2001-12-21 <160> 54 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <211> 237 <212> DNA <213> <220> <221> Nucleotide sequence of INSP037 <400> 35 atgacttcac caaacgaact aaataagctg ccatggacca atcctggaga aacagagata 60 tgtgaccttt cagacacaga attcaaaata tctgtgttga agaacctcaa agaaattcaa 120 gataacacag agaaggaatc cagaattcta tcagacaaat ataagaaaca gattgaaata 180 attaaaggga atcaagcaga aattctggag ttgagaaatg cagatggcac actttag 237 <210> 36 <211> 78 <212> PRT <213> <220> <221> Protein sequence of INSP037 <400> 36 Met Thr Ser Pro Asn Glu Leu Asn Lys Leu Pro Trp Thr Asn Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Glu Ile Cys Asp Leu Ser Asp Thr Glu Phe Lys Ile Ser Val 20 25 30 Leu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Gln Asp Asn Thr Glu Lys Glu Ser Arg 35 40 45 Ile Leu Ser Asp Lys Tyr Lys Lys Gln Ile Glu Ile Ile Lys Gly Asn 50 55 60 Gln Ala Glu Ile Leu Glu Leu Arg Asn Ala Asp Gly Thr Leu 65 70 75 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 gcatcaacaa catccagtaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 cattctaaag tgtgccatct 20 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccacc 37 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcaatggtga tggtgatggt g 51 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggaga 39 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 gcaggcttcg ccaccatgac ttcaccaaac gaactaa 37 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 gtgatggtga tggtgaagtg tgccatctgc atttct 36 <210> 44 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 aaagcaggct tcgaaggaga tatacatatg acttcaccaa acgaact 47 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 gccagcttgg cacttgatgt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 gatggaggtg gacgtgtcag 20 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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ctgctggaga tggcggacgc gatggatatg ttctgccaag 3900 ggttggtttg cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt cttggagtgg 3960 tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc ggctccatgc 4020 accgcgacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa tccatgccaa 4080 cccgttccat gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat 4140 cgaagttagg ctggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc 4200 tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg aagcgagaag 4260 aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga cgtagcccag 4320 cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg 4380 accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc 4440 gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg 4500 cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat 4560 gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgatc 4620 gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt 4680 tgagcaccgc cgccgcaagg 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gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcaagcta gagtttaaac 600 ttgacagatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaaaagtat 660 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 720 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgca gaagatcact tgggtgcgcg 780 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 840 agaacgtttc ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 900 tattgatgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 960 tgaatactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 1020 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caactatcgg 1080 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1140 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1200 tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgaaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1260 ccggcaacaa ctaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1320 ggcacttccg gctggctggt ttattgctga taaatcagga gccggtgagc gtgggtcacg 1380 cggtatcatt gcagcactgg ggccggatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1440 tacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1500 actgattaag cattggtaag gataaatttc tggtaaggag gacacgtatg gaagtgggca 1560 agttggggaa gccgtatccg ttgctgaatc tggcatatgt gggagtataa gacgcgcagc 1620 gtcgcatcag gcattttttt ctgcgccaat gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttt 1680 cggcataact agtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc 1740 cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg 1800 gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa 1860 ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga 1920 acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct 1980 tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg 2040 gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct 2100 tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc 2160 gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg 2220 acgctttttt tctggcaaga 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aagcagaaat tctggagttg agaaatgcag atggcacact 3120 tcaccatcac catcaccatt gaaacccagc tttcttgtac aaagtggttc gatggccgca 3180 ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc 3240 tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctcagg 3300 tctgcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggtcg tggaaggtgc 3360 tactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtttgacta 3420 ggtgtccttg tataatatta tggggtggag gcgggtggta tggagcaagg ggcccaagtt 3480 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 3540 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 3600 tatcatgtct ggatccgctt caggcaccgg gcttgcgggt catgcaccag gtgcgcggtc 3660 cttcgggcac ctcgacgtcg gcggtgacgg tgaagccgag ccgctcgtag aaggggaggt 3720 tgcggggcgc ggaggtctcc aggaaggcgg gcaccccggc gcgctcggcc gcctccactc 3780 cggggagcac gacggcgctg cccagaccct tgccctggtg gtcgggcgag acgccgacgg 3840 tggccaggaa ccacgcgggc tccttgggcc ggtgcggcgc caggaggcct tccatctgtt 3900 gctgcgcggc cagcctggaa 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ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat 4800 gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tctgtatccg ggtagcatat 4860 gctatcctca tgcatataca gtcagcatat gatacccagt agtagagtgg gagtgctatc 4920 ctttgcatat gccgccacct cccaaggaga tccgcatgtc tgattgctca ccaggtaaat 4980 gtcgctaatg ttttccaacg cgagaaggtg ttgagcgcgg agctgagtga cgtgacaaca 5040 tgggtatgcc caattgcccc atgttgggag gacgaaaatg gtgacaagac agatggccag 5100 aaatacacca acagcacgca tgatgtctac tggggattta ttctttagtg cgggggaata 5160 cacggctttt aatacgattg agggcgtctc ctaacaagtt acatcactcc tgcccttcct 5220 caccctcatc tccatcacct ccttcatctc cgtcatctcc gtcatcaccc tccgcggcag 5280 ccccttccac cataggtgga aaccagggag gcaaatctac tccatcgtca aagctgcaca 5340 cagtcaccct gatattgcag gtaggagcgg gctttgtcat aacaaggtcc ttaatcgcat 5400 ccttcaaaac ctcagcaaat atatgagttt gtaaaaagac catgaaataa cagacaatgg 5460 actcccttag cgggccaggt tgtgggccgg gtccaggggc cattccaaag gggagacgac 5520 tcaatggtgt aagacgacat tgtggaatag caagggcagt tcctcgcctt aggttgtaaa 5580 gggaggtctt actacctcca tatacgaaca caccggcgac ccaagttcct tcgtcggtag 5640 tcctttctac gtgactccta gccaggagag ctcttaaacc ttctgcaatg ttctcaaatt 5700 tcgggttgga acctccttga ccacgatgct ttccaaacca ccctcctttt ttgcgcctgc 5760 ctccatcacc ctgaccccgg ggtccagtgc ttgggccttc tcctgggtca tctgcggggc 5820 cctgctctat cgctcccggg ggcacgtcag gctcaccatc tgggccacct tcttggtggt 5880 attcaaaata atcggcttcc cctacagggt ggaaaaatgg ccttctacct ggagggggcc 5940 tgcgcggtgg agacccggat gatgatgact gactactggg actcctgggc ctcttttctc 6000 cacgtccacg acctctcccc ctggctcttt cacgacttcc ccccctggct ctttcacgtc 6060 ctctaccccg gcggcctcca ctacctcctc gaccccggcc tccactacct cctcgacccc 6120 ggcctccact gcctcctcga ccccggcctc cggcacctcc tccagcccca gcacctccac 6180 cagccccagc tcccccagct ccagccccac cagcaccagc ccctccagcc ccaccagccc 6240 cagcccctcc ggcacctcct ccagccccag cacctccacc agccccagct cccccagctc 6300 cagccccacc agcaccagcc cctccagccc caccagcccc agcccctcct gttccaccgt 6360 gggtcccttt gcagccaatg caacttggac gtttttgggg tctccggaca ccatctctat 6420 gtcttggccc tgatcctgag ccgcccgggg ctcctggtct tccgcctcct cgtcctcgtc 6480 ctcttccccg tcctcgtcca tggttatcac cccctcttct ttgaggtcca ctgccgccgg 6540 agccttctgg tccagatgtg tctcccttct ctcctaggcc atttccaggt cctgtacctg 6600 gcccctcgtc agacatgatt cacactaaaa gagatcaata gacatcttta ttagacgacg 6660 ctcagtgaat acagggagtg cagactcctg ccccctccaa cagccccccc accctcatcc 6720 ccttcatggt cgctgtcaga cagatccagg tctgaaaatt ccccatcctc cgaaccatcc 6780 tcgtcctcat caccaattac tcgcagcccg gaaaactccc gctgaacatc ctcaagattt 6840 gcgtcctgag cctcaagcca ggcctcaaat tcctcgtccc cctttttgct ggacggtagg 6900 gatggggatt ctcgggaccc ctcctcttcc tcttcaaggt caccagacag agatgctact 6960 ggggcaacgg aagaaaagct gggtgcggcc tgtgaagcta agatctgtcg acatcgatgg 7020 gcgcgggtgt acactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 7080 cctcatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 7140 ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctaatt 7200 c 7201

Claims (41)

  1. (i) 폴리펩티드는 SEQ ID NO:36에서 언급하고 있는 아미노서열로 구성되고;
    (ii) 폴리펩티드는 분비 단백질 기능을 가지는 단편으로 특히 4개 나선 번들 사이토킨 기능을 가지는 단편, 좀더 구체적으로는 인터페론 감마형 기능을 가지는 단편 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 가지는 단편이거나;
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가체로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 분비 단백질은 4개 나선 번들 사이토킨 폴드, 특히 인터페론-감마 형 분자인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 따른 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 폴리펩티드에 있어서, 이 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36의 것과 유사하고, 4개 나선 번들 사이토킨 활성 특히 인터페론 감마 형 활성을 가지는 분비 단백질인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. SEQ ID NO:36의 아미노산 서열가 80%이상 상동성을 가지거나 또는 바람직하게는 90%, 95%, 98%, 99%이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편인 것을 특징으로 하는 전술한 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 기능적 등가체 또는 활성 단편.
  5. SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 상당한 구조적 유사성을 나타내는 것을 특징으로 하는 전술한 어느 한항에 따른 기능적 등가체.
  6. 제 1, 2 또는 4 항중 어느 한 항에서 언급된 단편에 있어서, 청구항 1의 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 가지고, SEQ ID NO:36의 서열중 7 또는 그 이상(예를 들면, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 그 이상)의 아미노산 잔기로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 단편.
  7. 전술한 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  8. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO:35에 언급된 핵산 서열 또는 이의 축중 등가체 또는 이의 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 따른 핵산 분자와 매우 스트린젼트가 높은 조건하에서 하이브리드할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  10. 제 7 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제 10 항에 따른 벡터로 형질 변환된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  12. 제 1 내지 6항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 4개 나선형 번들 사이토킨 활성을 가지는 더욱 바람직하게는 인터페론 감마 형 활성을 가지는 분비된 단백질에 특이적으로 결합하여, 활성을 적절하게 저해하는 것을 특징으로 하는 리간드.
  13. 제 12 항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 리간드.
  14. 제 1 내지 6 항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드의 발현 또는 활성 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 14 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 6항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드에 결합하고, 결합시에 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 14 또는 제 15 항에 있어서, 화합물은 천연 또는 변형된 기질, 리간드, 효소, 리포터, 구조적 또는 기능적 모방체 등이 되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 질병의 치료 또는 진단에 사용하는 것을 특징으로 하는제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 7 항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 10 항에 따른 벡터, 제 11 항에 따른 숙주 세포, 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 리간드, 제 14 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 따른 화합물.
  18. 환자에서 질병을 진단하는 방법에 있어서,
    환자의 조직에서 제 1 항 내지 6 항중 어느 한항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현 수준을 측정하거나 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 활성을 평가하고;
    기준 수준의 발현 또는 활성과 비교하고;
    기준 수준과 차이가 있는 경우에 질병이 있다는 것을 암시하는 것으로 질병 진단하는 것을 진단 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,in vivo로 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 또는 19 항에 있어서,
    (a) 제 12 또는 제 13 항에 따른 리간드를 리간드-폴리펩티드 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서 생물학적 시료에 접촉시키고;
    (b) 복합체를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  21. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    (a) 제 7 내지 9 항에 따른 핵산 분자와 프로브간에 하이브리드 복합체가 형성될 수 있는 스트린젼트 조건하에서 핵산 프로브와 환자에서 취한 조직 시료를 접촉시키고;
    b) a) 단계에서 이용된 조건하에서 기준 시료와 프로브를 접촉시키고;
    c) 시료내에 하이브리드 복합체가 존재하는 지를 감지하고; 환자 시료에서 하이브리드 복합체 수준이 기준 시료에서 감지되는 수준과 차이가 나는 경우에 질병이 있다는 것을 나타내는 방법.
  22. 제 18 또는 제 19 항에 있어서,
    a) 제 7 항 내지 9 항에 따른 핵산 분자와 프로브간에 하이브리드 복합체 형성이 가능한 스트린젼트 조건하에서 환자에서 얻은 조직 시료와 핵산 프로브를 접촉시키고;
    b) (a) 단계에서 이용된 조건하에서 프로브와 기준 시료와 접촉시키고;
    c) 시료내에 하이브리드 복합체가 존재하는지 감지하고, 환자 시료에 있는 하이브리드 복합체의 감지 수준과 기준에서 확인된 감지수준이 상당히 상이한 경우에 질병이 있음을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서
    a) 질병을 테스트하기 위해 환자의 조직에서 시료를 얻고;
    b) 조직 시료로부터 제 7 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 분리시키고;
    c) 질병과 연관이 있는 핵산 분자에 돌연변이가 있는 지를 확인하여 질병에 대해 환자를 진단하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 핵산 분자를 증폭시켜 증폭 산물을 만들고, 증폭된 산물에서 돌연변이 유무를 확인하는 단계가 추가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 또는 제 24 항에 있어서,
    하이브리드-이중나선 분자를 형성하기 하는 스트린젼트 조건하에서 DNA에 하이브리드할 수 있는 핵산 프로브와 DNA를 접촉시키고, 하이브리드안된 부분을 가지는 하이브리드 이중 나선 분자는 질병과 연관이 있는 돌연변이에 상응하는 임의 부분이 되고, DNA 가닥의 상응하는 부분에 질병과 연합된 돌연변이체가 존재하는지의 유무로 하이브리드안된 부분이 있는지를 확인하면, 환자에서 돌연변이 유무를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 18 내지 25 항중 어느 한 항에 있어서, 질병은 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 체장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증, 바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염과 같은 감염을 포함하는 질환 및 질병에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 분비 단백질은 4개 나선 번들 사이토킨 폴드, 특히 인터페론-감마 형 분자인 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
  28. 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 7 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 10 항에 따른 벡터, 제 11 항에 따른 숙주 세포, 제 11 항 또는 12항에 따른 리간드 또는 제 14 내지 16 항중 어느 한 항에 따른 화합물로 구성된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  29. 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 7 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  30. 자가면역질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증과 같은 면역계 질환; 알레르기, 비염, 결막염, 사구체신염, 포도막염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 체장염, 소화계 염증, 폐혈증, 내독소 쇼크, 폐혈증 쇼크, 악액질, 근육통, 경직성 척추염, 중증성 근무력증, 바이러스 감염후 피로 증후군, 폐질환, 호흡기 통증 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 기도 염증, 상처 치료, 자궁내막증, 피부 질환, Behcet's 질환과 같은 염증성 질환; 흑색종, 육종, 신종 종양, 결장 종양과 같은 신조직형성 질환; 혈액 질환, 골증식증 질환, Hodgkin's 질환, 골다공증, 비만, 당뇨, 통풍, 심장맥관 질환, 재환류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 심장 마비, 발작, 간 질환, AIDS, AIDS 관련 복합, 신경성 질환, 남성 불임, 노화, 말라리아 감염, 세균 감염, 바이러스 감염 특히, 사람 허피스바이러스 5(사이토메갈로바이러스) 감염과 같은 감염을 포함하는 질환과 같은 세포 증식성 질환, 자가면역/염증 질환, 심장맥관 질환, 신경 질환, 발생 질환, 대사 질환, 감염 및 다른 병인성 질환 치료용 약물을 제조하는데 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 7 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 10 항에 따른 벡터, 제 11 항에 따른 숙주 세포, 제 11 항 또는 12항에 따른 리간드 또는 제 14 내지 16 항중 어느 한 항에 따른 화합물.
  31. 환자에서 질병을 치료하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 7 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 10 항에 따른 벡터, 제 11 항에 따른 숙주 세포, 제 11 항 또는 12항에 따른 리간드 또는 제 14 내지 16 항중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 28 항에 따른 약학 조성물을 환자에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현 또는 폴리펩티드 활성이 건강한 상태의 사람 것과 비교하였을 때, 질병을 가진 환자에서 감소되는 질병의 경우, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산분자, 리간드 화합물은 항진제가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 폴리펩티드를 인코드하는 천연 유전자 발현 또는 폴리펩티드 활성이 건강한 상태의 사람 것과 비교하였을 때, 질병을 가진 환자에서 더 높은 질병의 경우, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산분자, 리간드 화합물은 길항제가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 환자에서 질병의 치료요법적 처리를 모니터하는 방법에 있어서,
    일정 시간동안 환자의 조직에서 제 1 항 내지 제 6 항의 따른 폴리펩티드의 발현 수준 또는 활성; 제 7 항 내지 9항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 발현 수준을 모니터하고, 이때 일정 시간동안 발현 수준 또는 활성 수준이 기준 치에 근접하게되면 질병이 치유된다는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 질병의 진단 또는 치료에 효과적인 화합물을 확인하는 방법에 있어서,
    제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 7 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자에 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 친하성을 가지는 것으로 보이는 한 가지 이상의 화합물을 접촉시키고, 이들 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물을 선별하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 화합물 확인 방법.
  36. 질병을 진단하는데 이용할 수 있는 키트에 있어서,
    제 7 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산과 스트린젼트 조건하에서 하이브리드할 수 있는 핵산을 포함하는 제 1 용기; 핵산 분자를 증폭시키는데 유용한 프라이머를 포함하는 제 2 용기; 질병 진단에 이용할 수 있는 프로브와 프라이머 사용 방법을 포함하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  37. 제 36 항에 있어서, 하이브리드안된 RNA를 절단하는 물질을 보유하는 제 3 용기가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  38. 제 7 항 내지 9 항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자들의 어레이로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  39. 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에서 언급하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 한 가지 이상이 항체, 항체와 폴리펩티드산에 결합 반응을 감지하는데 유용한 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  40. 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현 수준을 더 높인 또는 더 낮춘 또는 발현이 되지 않도록 형질변환된 것을 특징으로 하는 유전자 전이 또는 녹아웃된 사람이 아닌 동물.
  41. 질병을 치료하는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서, 제 40 항에 따른 사람이 아닌 유전자 전이된 동물과 후보 화합물을 접촉시키고, 동물의 질병에 화합물이 효과가 있는 지를 결정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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