JP5053516B2 - メタロプロテアーゼタンパク質 - Google Patents
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Description
本明細書で引用するすべての出版物、特許及び特許出願は、参照によって全部取り込まれる。
機能ゲノミクスの時代が成熟するにつれ、現在、創薬のプロセスが基本的変革を経験している。用語“機能ゲノミクス”は、バイオインファマティクス手段を利用して、機能を問題のタンパク質配列の結果とみなすアプローチに適用する。配列データの生成速度が、機能をこれらタンパク質配列に割り当てる研究所の能力を急速に追い越しているので、このような手段がますます必要になって来ている。
バイオインファマティクス手段の効力及び精度が増すにつれ、これら手段は、生化学的特徴づけの従来法を急速に置き換えている。実際、本発明を確認する際に使用する先端バイオインファマティクス手段は、今や高度の信頼を置ける結果を出力することができる。
配列データが入手可能になり、かつ進行中の基礎に基づいて重要な発見が為されているように、種々の施設や商業組織が配列データを調べている。しかし、さらに研究及び創薬用標的として遺伝子及び遺伝子がコードするポリペプチドを同定かつ特徴づけする継続的な必要が残っている。
細胞が細胞外タンパク質を合成かつ分泌する能力は、多くの生物学的プロセスにとって中心的である。酵素、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質及び信号発信分子はすべて細胞によって分泌される。これは、分泌小胞と原形質膜の融合による。すべてではないが、ほとんどの場合、タンパク質はシグナルペプチドによって小胞体及び分泌小胞中に方向づけられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞のような膜結合区画へのポリペプチド鎖の運搬に影響するシス作用配列である。分泌小胞を標的にするポリペプチドは、細胞外マトリックス中に分泌され、又は原形質膜内に保持される。原形質膜内に保持されるポリペプチドは、1つ以上の膜貫通ドメインを有する。細胞が機能するときに中心的役割を果たす分泌タンパク質の例は、サイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質(接着分子)、プロテアーゼ、並びに成長及び分化因子である。これらタンパク質のいくつかの説明を以下に述べる。
プロテアーゼは大ファミリーに分割できる。用語“ファミリー”を用いて、各メンバーが、全配列又は少なくとも触媒活性の原因である配列の一部にわたって少なくとも1つの他のメンバーに対して進化した関係を示すプロテアーゼの群を示す。各ファミリーの名称は、ファミリー内のプロテアーゼの触媒活性タイプを反映する。従って、セリンプロテアーゼはSファミリーに属し、スレオニンプロテアーゼはTファミリーに属し、アスパルチルプロテアーゼはAファミリーに属し、システインプロテアーゼはCファミリーに属し、メタロプロテアーゼはMファミリーに属する。メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼは、細胞外マトリックス内で普通に見られる。
メタロプロテアーゼは、亜鉛結合モチーフ(HEXXH)の存否によって2つの主要群に分割できる。
1.1 HEXXHモチーフの存在(22ファミリー):Prosite番号:PDOC00129
興味深いメンバーを有するファミリー:
M2:ぺプチジル-ジペプチダーゼA(アンギオテンシンI変換酵素:ACE)
M13:ネプリリシン(Neprilysin)(エンケファリナーゼA=中性エンドペプチダーゼ)、内皮変換酵素(ECE)
M10B:マトリキシン(Matrixin)(マトリックスメタロプロテアーゼ=MMPs)
M12B:レプロリシン(Reprolysin) (ADAM-10;ADAM-17=NF-α変換酵素=TACE)/デシンテグリン(Desintegrin )(他のADAMプロテアーゼ)。ADAMsは、細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用で複数の潜在的機能を有するタンパク質の大きく、広範に発現され、かつ発生的に制御されたファミリーである。これらのうち、TACEは、関節炎用の新興目標を代表する。
M41:このファミリーは、ATP-依存性メタロプロテアーゼ:FtsH、プロテアソームタンパク質を含む。
最小ドメインファミリー:マトリリジン(matrilysin)(PUMP-1、MMP-7)はプロテオグリカン、ラミニン及びフィブロネクチンを切断する。
ヘモペキシンドメインファミリー:
コラゲナーゼ:原繊維コラーゲンを切断するユニークな能力。軟骨退化におけるコラゲナーゼの役割のため、これらはリュウマチ性関節炎及び骨関節治療用のための魅力的な目標になっている。
・コラゲナーゼ線維芽細胞コラゲナーゼ(間質性コラゲナーゼ、MMP-1)
・好中球コラゲナーゼ(MMP-8)
・コラゲナーゼ-3(MMP-13)
メタロエラスターゼ:MME(MMP-12)
ストロメリシン-1(Stromelysin-1)(MMP-3)、2(MMP-10)及び3(MMP-11)。MMP-11は活性型として排出され、その機能は他のMMPsを活性化することができる。
フィブロネクチンドメインファミリー:多数のマトリックス基質(ゼラチン、エラスチン、IV型コラーゲン)を分解する。
ゼラチナーゼA(MMP-2);その癌における関与に加え(腫瘍浸潤)、血小板活性化で重要な役割を果しうるので、抗血小板薬発見の可能性のある目標として提案されている。
ゼラチナーゼB(MMP-9)
膜貫通ドメインファミリー:
MT-1-MMP、MT-4-MMP、MMP-14、MMP-17
MMPsの種々の特異性及びそのいくつかの病気での相対的関与に関する多くの研究が進行中である。
興味深いメンバーを有するファミリー:
M24A:メチオニルアミノペプチダーゼ、1型(原核及び真核MAP-1を含む)/Prosite番号:PDOC00575
M24C:メチオニルアミノペプチダーゼ、2型(真核MAP-2を含む)/Prosite番号:PDOC00575
従って、新規メタロプロテアーゼの同定は、これらタンパク質が関与する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解を高め、かつこれら障害を治療するために有効な遺伝子又は薬物療法を開発する際にも非常に重要である。
本発明は、INSP005a及びINSP005bタンパク質が分泌プロテアーゼ分子、さらにメタロプロテアーゼファミリーの分泌プロテアーゼ分子として機能するという発見に基づく。好ましくは、INSP005a及びINSP005bタンパク質は、メタロプロテアーゼのコリオリシン(choriolysin)/アスタシン様ファミリーのメンバーである。
本発明の第1局面の一実施形態では、
(i)配列番号:14に示されるアミノ酸配列を含み;
(ii)メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質としての機能を有するか、又は(i)のポリペプチドと共有する抗原決定基を有するその断片であり;或いは
(iii)(i)又は(ii)の機能等価物である;
ポリペプチドが提供される。
好ましくは、この実施形態のポリペプチドは、配列番号:14に示される配列から成る。配列番号:14に示される配列を有するポリペプチドは、以後“INSP005aポリペプチド”と称する。
(i)配列番号:34又は配列番号:36に示されるアミノ酸配列を含み;
(ii)メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質としての機能を有するか、又は(i)のポリペプチドと共有する抗原決定基を有するその断片であり;或いは
(iii)(i)又は(ii)の機能等価物である、
ポリペプチドが提供される。
好ましくは、この実施形態のポリペプチドは、配列番号:34又は配列番号:36に示される配列から成る。配列番号:34に示される配列を有するポリペプチドは、以後“INSP005bポリペプチド”と称する。
好ましくは、本発明の上述した局面のポリペプチドはメタロプロテアーゼとして機能する。用語“メタロプロテアーゼ”は、技術的によく理解されており、当業者は、技術的に周知の種々の検定法の1つを用いてメタロプロテアーゼ活性を容易に確認できるだろう。例えば、2つの一般的に適用される検定法は、定量的[3H]ゼラチンアッセイ(Martinら, Kidney Int. 36, 790-801)及びゼラチンザイモグラフィアッセイ(Herron G.S.ら, J. Biol. Chem. 1986, 261, 2814-2818)である。
さらに好ましくは、本発明の上記局面のポリペプチドは、メタロプロテアーゼのコリオリシン/アスタシン様ファミリーのメンバーである。
証拠は後述する実施例セクションで提示するが、劇症肝炎のインビボモデルにおけるINSP005b cDNA(以後IPAAA78836-2とも称する)の送達が血清中のTNF-α及びm-IL-6レベルを減じることが分かり、血清中で測定されるトランスアミナーゼの低減に重大な影響を及ぼした。
言及したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)レベルの低減は、低減したTNF-α及びIL-6レベルが原因かもしれない。TNF-αはConA注射後の肝臓損傷に関与する重要なサイトカインである。この肝炎のマウスモデルでは、TNF-αは、主に肝性マクロファージ、いわゆるKupfer細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は、病気に対する防御を与えることが分かっている(Seinoら 2001, Annals of surgery 234, 681)。従って、INSP005bポリペプチド及び機能的に関連する等価タンパク質は、自己免疫、ウィルス性又は急性肝疾患及びアルコール性肝不全の治療で有用であると考えられる。これらは、他の炎症性疾患の治療でも効果があると思われる。
本明細書では、INSP005aポリペプチド、INSP005bポリペプチド及びINSP005b成熟ポリペプチドを“INSP005ポリペプチド”と称する。
第3局面では、本発明は、本発明の第2局面の核酸分子と高い厳密条件下でヒドリド化する精製核酸分子を提供する。
第4局面では、本発明は、本発明の第2又は第3局面の核酸分子を含有する、発現ベクターのようなベクターを提供する。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、ベクターはPCR-TOPO-IPAAA78836-1ベクターである(図9及び配列番号:38参照)。本発明のこの局面のさらに好ましい実施形態では、ベクターはPCR-TOPO-IPAAA78836-2ベクターである(図12及び配列番号:39参照)。
第5局面では、本発明の第4局面のベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
第6局面では、本発明は、本発明の第1局面のポリペプチドに特異的に結合し、かつ好ましくは該ポリペプチドのメタロプロテアーゼ活性を阻害するリガンドを提供する。本発明のポリペプチドに対するリガンドは、天然又は修飾基質、酵素、受容体、2000Daまで、好ましくは800Da以下の小さい天然又は合成有機分子のような有機小分子、ペプチドミメティック、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、上記の構造的又は機能的ミメティックを含む種々の形態で出現しうる。
本発明の第7局面の化合物は、該遺伝子の発現レベル又はポリペプチドの活性を高め(アゴナイズ)又は低減(アンタゴナイズ)しうる。重要なことに、INSP005ポリペプチドの機能の同定は、病気の治療及び/又は診断で有効な化合物を同定しうるスクリーニング方法の設計を可能にする。このような方法を用いて本発明の第6及び第7局面のリガンド及び化合物を同定することができる。これら方法は、本発明の局面として包含される。
証拠は後述する実施例セクションで提示するが、INSP005bポリペプチドを用いて炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全を予防又は治療することができる。従って、INSP005bポリペプチドを立体配置的に模倣し、又はINSP005bポリペプチドのアゴニストである本発明の第7局面の化合物の規定は、このような化合物は上述したような炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全の予防又は治療での有用性を見出しうるので、特に好ましい。
本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分は、炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患(ウィルス性又は急性肝疾患を含む)及び肝不全(アルコール性肝不全を含む)の治療用薬物の製造で用いることが特に好ましい。
本発明の第9局面の方法で診断する好ましい病気は炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患(ウィルス性又は急性肝疾患を含む)又は肝不全(アルコール性肝不全を含む)である。
熟練読者は気づくように、ショートプローブによる核酸ハイブリダイゼーション、点突然変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅の方法及び抗体を用いて異常なタンパク質レベルを検出する方法のような多くの種々の本発明の第9局面の方法がある。同様の方法を短期又は長期ベースで用いて患者の病気の治療措置をモニターすることができる。本発明は、病気のこれら診断方法で有用なキットをも提供する。
第11局面では、本発明は、本発明の第1局面のポリペプチド、又は本発明の第2若しくは第3局面の核酸分子、又は本発明の第4局面のベクター、又は本発明の第5局面の宿主細胞、又は本発明の第6局面のリガンド、又は本発明の第7局面の化合物を、薬学的に許容しうる担体と共に含んでなる医薬組成物を提供する。
第12局面では、本発明は、気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害及び生殖障害又はメタロプロテアーゼが関係している他の病気のような病気の診断又は治療用薬物の製造で使用するための、本発明の第1局面のポリペプチド、又は本発明の第2若しくは第3局面の核酸分子、又は本発明の第4局面のベクター、又は本発明の第5局面の宿主細胞、又は本発明の第6局面のリガンド、又は本発明の第7局面の化合物を提供する。
本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分は、炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患及び肝不全の治療用薬物の製造で用いることが特に好ましい。
本発明の第1局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第1局面のポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルと比較して低い病気では、患者に投与するポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、リガンド又は化合物は、アゴニストでなければならない。反対に、本発明の第1局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第1局面のポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルと比較して高い病気では、患者に投与するポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、リガンド又は化合物は、アンタゴニストでなければならない。このようなアンタゴニストの例として、アンチセンス核酸分子、リボザイム及び抗体のようなリガンドが挙げられる。
病気が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
病気が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
本発明を役立たせるために使用しうる標準的技法及び手順の概要は後述する。この発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されるだろう。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のためであることも理解され、この専門用語は本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
本発明の実施は、別に指定しない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の通常の技法を利用し、これらは当該技術の当業者のスキルの範囲内である。
このような技法は、文献で完全に説明されている。参考のために特に好適なテキストの例として以下の文献が挙げられる:Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and 酵素s (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) タンパク質 Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)。
上述したように、本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質の形態でよく、或いはプレ-、プロ-又はプロプレ-タンパク質の切断によって活性化して活性な成熟ポリペプチドを生成しうるプレ-、プロ-又はプロプレ-タンパク質でよい。このようなポリペプチドではプレ-、プロ-又はプロプレ-配列はリーダー又は分泌配列であり、或いは成熟ポリペプチド配列の精製で利用される配列でよい。
本発明の第1局面のポリペプチドは、融合タンパク質の一部を形成しうる。例えば、分泌又はリーダー配列、プロ-配列、精製で補助する配列、又は例えば組換え体生産の間により高いタンパク質安定性を与える配列を含みうる1個以上の追加のアミノ酸配列を含むことが有利なことが多い。これとは別に、或いはこれに加え、成熟ポリペプチドは、ポリペプチドの半減期を増やすための化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合しうる。
ポリペプチドで起こる修飾は、該ポリペプチドがどうやって作られるかという相関であることが多い。組換え的に作られるポリペプチドでは、修飾の性質と範囲は大部分特定の宿主細胞の翻訳後修飾能力及び問題のポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって決まる。例えば、グリコシル化パターンは、宿主細胞の異なるタイプ間で変化する。
本発明のポリペプチドは、いずれかの適切な方法で調製することができる。このようなポリペプチドは、該ポリペプチドが天然に存在するポリペプチドである場合、単離された天然に存在するポリペプチド(例えば、細胞培養から精製された)及び組換え的に生成されるポリペプチド(融合タンパク質を含む)、合成的に生成されるポリペプチド又はこれら方法の組合せで生成されるポリペプチドが挙げられる。用語“単離された”は、該ポリペプチドが得られる方法又はその標本の純度レベルを示さない。従って、このような単離種は、組換え的に生成され、問題の細胞又は組織から直接単離され、或いは決定配列に基づいて合成的に生成されうる。
このような突然変異体は、1個以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドも包含する;
典型的に、2個のポリペプチド間で30%を超える同一性は、機能的等価の指標と考えられる。好ましくは、本発明の第1局面の機能的に等価のポリペプチドはINSP005ポリペプチド、又はその活性断片と80%を超える配列同一性の度合を有する。さらに好ましいポリペプチドは、それぞれ85%、90%、95%、98%、99%以上の同一性の度合を有する。
本発明の第1局面の機能的に等価のポリペプチドは、1種以上の構造アラインメント法を用いて同定されたポリペプチドでもよい。例えば、Biopendium検索データベース(PCT 特許出願WO 01/69507参照)を生成するために使用する検索ツールの1局面を形成するInpharmatica Genome Threaderテクノロジーを用いて、INSP005ポリペプチドに比べて低い配列同一性を有するが、INSP005ポリペプチド配列と有意な構造相同性を共有することによって、分泌分子活性を有すると予測される、現在未知の機能を同定することができる。“有意な構造相同性”は、Inpharmatica Genome Threaderが、2個のタンパク質が10%以上の確実性で構造相同性を共有すると予測することを意味する。
本明細書では、用語“断片”は、INSP005ポリペプチド又はその機能等価物の1つのアミノ酸配列と全部ではないが部分的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。断片は、該配列由来の少なくともn個の連続したアミノ酸を含なければならず、特定配列によって、nは好ましくは7以上である(例えば、8、10、12、14、16、18、20又はそれ以上)。小断片は抗原決定基を形成しうる。
このような断片は“独立”、すなわち他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部でなく、他のアミノ酸若しくはポリペプチドに融合しておらず、或いは該断片は、それらが部分又は領域を形成する大きいポリペプチド内に包含されうる。大きいポリペプチド内に包含されている場合、本発明の断片は、最も好ましくは単一の連続領域を形成する。例えば、特定の好ましい実施形態は、断片のアミノ末端に融合しているプレ-、及び/又はプロ-ポリペプチド領域及び/又は断片のカルボキシル末端に融合しているさらなる領域を有する断片に関する。しかし、数個の断片が単一の大きいポリペプチド内に包含されうる。
本発明のポリペプチド又はその免疫原性断片(少なくとも1個の抗原決定基を含む)を用いて、該ポリペプチドに免疫特異的なポリクロナール又はモノクロナール抗体のようなリガンドを生じさせることができる。このような抗体を利用して本発明のポリペプチドを発現するクローンを同定し、或いはアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドを精製することができる。熟練読者には明かなように、他の応用の中でもとりわけ、本抗体を診断又は治療助剤として利用することもできる。
用語“免疫特異的”は、本抗体が、先行技術の他の関連ポリペプチドに対するそのアフィニティーより本発明のポリペプチドに対するアフィニティーが実質的に高いことを意味する。本明細書では、用語“抗体”は、Fab、F(ab')2及びFvのような、問題の抗原決定基に結合できる完全分子及びその断片を指す。従って、このような抗体は本発明の第1局面のポリペプチドに結合する。
好ましくは、アフィニティーは、既知の分泌タンパク質に対するアフィニティーより本発明のポリペプチドに対して少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍又は106倍高い。
ポリクロナール抗体が望ましい場合、マウス、ウサギ、ヤギ又はウマのような選択した哺乳類を本発明の第1局面のポリペプチドで免疫化することができる。動物を免疫化するために使用するポリペプチドは、組換えDNA技術で誘導することができ、或いは化学的に合成することができる。所望により、ポリペプチドを担体タンパク質と結合することができる。ポリペプチドを化学的に結合しうる通常用いられる担体として、ウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリムペットヘモシアニンが挙げられる。結合ポリペプチドを用いて動物を免疫化する。免疫化した動物由来の血清を収集し、既知手順、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーによって処理する。
本発明の第1局面のポリペプチドに対するモノクロナール抗体は、当業者によって容易に製造することができる。ハイブリドーマ技術によるモノクロナール抗体を製造する一般的方法論は周知である(例えば、Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozborら, Immunology Today 4: 72 (1983); Coleら, 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)参照)。
モノクロナール抗体は、それらが向けられる個々のポリペプチドの精製で特に有用である。代わりに、例えば技術的に周知のPCR法で、問題のモノクロナール抗体をコードする遺伝子を単離し、クローン化し、適切なベクター中で発現させることができる。
非ヒト可変部がヒト定常部に結合又は融合しているキメラ抗体(例えば、Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)参照)も使用しうる。
例えばヒト化によって、抗体を修飾して個体内で免疫原性を弱くすることができる(Jonesら, Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyenら, Science, 239, 1534 (1988); Kabatら, J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queenら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gormanら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991);及びHodgsonら, Bio/Technology, 9, 421 (1991)参照)。本明細書では、用語“ヒト化抗体”は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変部内のCDRアミノ酸及び選択された他のアミノ酸が、ヒト抗体中の等価アミノ酸の代わりに置換されている抗体分子を指す。従って、ヒト化抗体はヒト抗体に密接に似ているが、ドナー抗体の結合能を有する。
さらなる代替では、抗体は、2つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインが異なるエピトープに方向づけされている“二重特異性”抗体でよい。
上記技術で生成される抗体は、ポリクロナール又はモノクロナールであれ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ(RIA)又はエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)で試薬として利用しうるという点でさらなる用途がある。これら用途では、ラジオアイソトープ、蛍光分子又は酵素のような分析的に検出可能な試薬で標識することができる。
本発明の核酸分子は、上述した核酸分子に相補的な核酸をも包含する(例えば、アンチセンス又は探索目的のため)。
本発明の核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態、又は例えばcDNA、合成DNA若しくはゲノムDNAを含むDNAの形態でよい。このような核酸分子は、クローニング、化学合成法又はその組合せによって得ることができる。核酸分子は、ゲノム又はcDNAライブラリーから例えば、固相ホスホラミダイト化学合成のような技法を用いる化学合成によって、或いは生物から分離によって調製することができる。RNA分子は、一般的にDNA配列のインビボ又はインビトロ転写によって生成しうる。
用語“核酸分子”は、修飾骨格鎖を含有するもののようなDNA及びRNAの類似体、及びペプチド核酸(PNA)をも包含する。本明細書では、用語“PNA”は、好ましくはリジンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格鎖に結合した少なくとも5ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗-遺伝子物質を指す。末端リジンは、この組成物に溶解性を与える。PNAsは、それらが相補一本鎖DNA及びRNAに優先的に結合し、かつ転写伸長を停止する場合、ペギレイト(pegylated)してその細胞内での寿命を延ばすことができる(Nielsen, P.E.ら (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63)。
これら分子は、遺伝コードの縮重の結果として、配列番号:14、配列番号:34又は配列番号:36のポリペプチドをコードする異なる配列を有することもある。このような核酸配列として、限定するものではないが、それ自体で成熟ポリペプチドのコーディング配列;成熟ポリペプチドのコーディング配列とリーダー又は分泌配列をコードするもののような追加のコーディング配列、例えばプロ-、プレ-又はプロプレ-ポリペプチド配列;転写、リボソーム結合及びmRNA安定性で役割を果たす転写された非翻訳配列(末端シグナルを含む)のような転写非コーディング5'及び3'配列を含む非コーディング配列と共に、上述した追加のコーディング配列があるか又はない成熟ポリペプチドのコーディング配列が挙げられる。核酸分子は、追加の機能性を与えるアミノ酸のような追加のアミノ酸をコードする追加配列をも包含しうる。
この点の変異体には、ヌクレオチド置換、欠失又は挿入によって、上述した核酸分子と異なる変異体がある。置換、欠失又は挿入は、1個以上のヌクレオチドを巻き込みうる。変異体は、コーディング若しくは非コーディング又は両者が変わりうる。コーディング領域の変化が保存又は非保存アミノ酸置換、欠失又は挿入を生じさせうる。
遺伝子産物(ポリペプチド)のクローニング、プロセシング、及び/又は発現の修飾を含む種々の理由のため、当該技術で一般的に知られている方法を用いて、本発明の核酸分子を操作することができる。核酸分子を操作するために使用しうる技術として、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化及びPCR再構築によるDNAシャッフリングが挙げられる。部位特異的突然変異誘発を用いて新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドン選択を変え、スプライス変異体を生成し、突然変異を導入するなどができる。
本発明の核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に部分的に相補的であり、それゆえそのコードしている核酸分子にハイブリダイズする(ハイブリダイゼーション)アンチセンス分子をも含む。オリゴヌクレオチドのような該アンチセンス分子は、当該技術の当業者には分かるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、特異的に結合してその転写を妨げるように設計することができる(例えば、Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Leeら, Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooneyら, Science 241, 456 (1988); Dervanら, Science 251, 1360 (1991))。
完全相補分子の標的分子へのハイブリダイゼーションの阻害は、技術的に周知なようにハイブリダイゼーションアッセイで試験しうる(例えば、Sambrookら[前出]参照)。実質的に相同性の分子は、Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)に教示されているように、厳密さの種々の条件下で、標的分子に対する完全相同分子と競合し、かつその結合を阻害する。
“厳密さ”は、異なる分子の結合の間中、非常に類似の分子の結合を好む、ハイブリダイゼーション反応における条件を指す。高い厳密さのハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5XSSC(150mM NaCl,15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート溶液、10%硫酸デキストラン、及び20μg/mlの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中42℃で終夜インキュベーション後、0.1X SSC中でフィルターを約65℃で洗浄するとして定義される。低い厳密さの条件は、35℃で行うハイブリダイゼーション反応を含む(Sambrookら[前出]参照)。好ましくは、ハイブリダイゼーションで使用する条件は高い厳密さの条件である。
本発明によって利用しうるアッセイと関連してさらに後述するように、上述したような核酸分子はRNA、cDNA又はゲノムDNA用ハイブリダイゼーションプローブとして用いてINSP005ポリペプチドをコードする全長cDNAs及びゲノムクローンを単離し、かつこれらポリペプチドをコードする遺伝子に対して高い配列類似性を有する相同又は定向進化遺伝子のcDNA及びゲノムクローンを単離することができる。
この点に関しては、技術的に周知の他の方法の中でとりわけ次の方法を利用することができ、例示目的のため以下に述べる。DNAのシークエンシング及び分析の方法は周知かつ当該技術で一般的に利用可能であり、実際に、本明細書で述べる本発明の多くの実施形態を実施するために使用しうる。このような方法は、DNAポリメラーゼI、Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland, OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago, IL)、又はGibco/BRL(Gaithersburg, MD)販売のELONGASE増幅システムで見つけられるもののようなポリメラーゼとプルーフ-リーディングエキソヌクレアーゼの組合せのクレノウ断片として該酵素を利用しうる。好ましくは、シークエンシング法はHamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA)及びABI Catalystと373及び377 DNAシークエンサー(Perkin Elmer)のような機械を用いて自動化することができる。
本発明の一実施形態では、本発明の核酸分子を染色体局所化に使用することができる。この技術では、核酸分子が個体のヒト染色体上の特定位置に特異的に標的にされ、かつそれとハイブリダイズすることができる。本発明の染色体に対する関連配列のマッピングは、遺伝子関連疾患との当該配列の関係確認で重要な工程である。一度配列を正確な染色体の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝子マップデータと相関させることができる。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで入手可能)で見られる。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係は、連鎖分析(物理的に隣接する遺伝子の共遺伝)を通じて同定する。これは、位置クローニング又は他の遺伝子発見法を用いて病気遺伝子を検索する調査員に有益な情報を与える。一旦、病気又は症候群を遺伝的連鎖によって特定のゲノム領域に天然のまま局所化すると、当該領域へのいずれの配列マッピングもさらなる調査用の関連遺伝子又は調節遺伝子を表現しうる。核酸分子を用いて、正常個体、保因者、又は患者間の転位、逆位などによる染色体位置の差異を検出することもできる。
遺伝子スプライシングアプローチを行っても本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内因性発現を下方制御することができる。RNA干渉(RNAi)(Elbashir, SMら, Nature 2001, 411, 494-498)は、利用しうる配列特異的な転写後遺伝子スプライシングの1つの方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドをインビトロ合成して細胞中に導入する。これらdsRNAオリゴヌクレオチドの配列特異的結合が標的mRNAの分解を誘発し、標的タンパク質発現を減少又は除去する。
上で評価した遺伝子スプライシングアプローチの効率は、ポリペプチド発現の測定(例えば、ウエスタンブロット法によって)を通じ、かつTaqManベース方法論を用いてRNAレベルで評価することができる。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中のそのコード化核酸分子の発現によって組換え型で調製することができる。このような発現方法は、当該技術の当業者に周知であり、Sambrookら(前出)及びFernandez & Hoeffler(1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto)によって多くのことが詳述されている。
適切な発現系の例として、例えば、染色体系、エピソーム系及び例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母菌エピソーム、挿入要素、酵母菌染色体要素、バキュロウィルスのようなウィルス、SV40のようなパポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス及びレトロウィルスから誘導されるベクター、又は例えばプラスミドと、コスミド及びファージミドを含むバクテリオファージ遺伝要素とから誘導されるもののようなそれらの組合せを含むウィルス誘導系が挙げられる。人工のヒト染色体(human artificial chromosomes)(HACs)を利用して含みうるより大きいDNA断片を送達してプラスミド内で発現させることもできる。
特に好適な発現系として、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物;酵母菌発現系で形質転換した酵母菌;ウィルス発現系(例えば、バキュロウィルス)で形質転換した昆虫細胞系;ウィルス発現系(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)又は細菌発現系(例えば、Ti若しくはpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系;又は動物細胞系が挙げられる。細胞フリー翻訳系を利用して本発明のポリペプチドを生じさせることもできる。
コード化核酸分子は、所望により、例えば翻訳されたポリペプチドの細胞小胞体の内腔中、又は細胞周辺腔中、又は細胞外環境中への分泌のための、シグナルペプチド又はリーダー配列のような制御配列をコードする配列を含んでも含まなくてもよい。これらシグナルペプチドはポリペプチドに内因性であり、或いはそれらは外因性シグナルでありうる。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて細菌宿主によって除去されうる。
ベクター中への挿入前に制御配列及び他の調節配列を核酸コーディング配列に結合することができる。代わりに、既に制御配列及び他の適切な制限部位を含む発現ベクター中に直接コーディング配列をクローン化することができる。
組換えポリペプチドの長期的な高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、問題のポリペプチドを安定して発現する細胞系は、同一又は別個ベクター上にウィルス複製起点及び/又は内因性発現要素及び選択可能マーカーを含みうる発現ベクターを用いて形質転換させうる。ベクターの導入後、培地を選択培地に交換する前に細胞を1〜2日間富化培地内で成長させてよい。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在が、導入された配列をうまく発現する細胞の成長と回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
バキュロウィルス系内では、バキュロウィルス/昆虫細胞発現系用の材料は、とりわけInvitrogen, San Diego CAのキット形態(“MaxBac”キット)で商業的に入手可能である。これらの方法は当該技術の当業者に一般的に知られており、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)に完全に記載されている。この系で使用するための特に好適な宿主細胞として、Drosophila S2及びSpodoptera Sf9細胞のような昆虫細胞が挙げられる。
特に、原形質体を単離かつ培養して完全再生植物を与えうるすべての植物を利用できるので、その伝達された遺伝子を含有する完全植物が回収される。実用的に、すべての植物を培養細胞又は組織から再生することができ、限定するものではないが、サトウキビ、テンサイ、綿、果実及び他の木、豆果及び野菜が挙げられる。
特に好ましい細菌宿主細胞の例として、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス及び枯草菌細胞が挙げられる。
真菌発現用の特に好適な宿主細胞の例として、酵母菌細胞(例えば、S. cerevisiae)及びアスペルギルス細胞が挙げられる。
形質転換した細胞系を回収するために使用しうるいくつかの選択系が知られている。例として、それぞれtk-又はaprt-細胞内で利用しうる単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(Wigler, M.ら (1977) Cell 11:223-32)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I.ら (1980) Cell 22:817-23)遺伝子が挙げられる。
また、代謝拮抗物質、抗生物質又は除草剤耐性を選択の基礎として使用することができ;例えば、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)(Wigler, M.ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70);アミノグリコシドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与えるnpt(Colbere-Garapin, F.ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)及びそれぞれクロルスルホラン及びフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与えるals又はpat。さらなる選択遺伝子が記載されており、当業者にはその例が明かだろう。
これとは別に、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の手順で確認することができる。この手順として、限定するものではないが、DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば、蛍光活性化細胞分取(FACS)又はイムノアッセイ法(エンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ[ELISA]及びラジオイムノアッセイ[RIA]のような)が挙げられ、核酸又はタンパク質の検出及び/又は定量のための膜、溶液、又はチップベース技術を含む(Hampton, R.ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN及びMaddox, D.E.ら (1983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216参照)。
当業者には種々多様な標識及び結合法が知られており、種々の核酸及びアミノ酸アッセイで使用しうる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション又はPCRプローブを製造する手段として、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化又は標識化ポリヌクレオチドを用いるPCR増幅が挙げられる。代わりに、本発明のポリペプチドをコードする配列をmRNAプローブの製造用ベクター中にクローン化することができる。このようなベクターは技術的に周知で、商業的に入手可能であり、これを用いてT7、T3又はSP6のような適切なRNAポリメラーゼと標識化ヌクレオチドの付加によってRNAプローブをインビトロ合成することができる。これら手順は、種々の商業的に入手可能なキット(Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI);Promega (Madison WI);及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)を用いて行うことができる。
検出を容易にするために使用しうる適切なリポーター分子又は標識として、放射性核種、酵素及び蛍光、化学発光又は発色剤並びに基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
硫酸アンモニウム又はエタノール沈降法、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法で組換え細胞培養から本ポリペプチドを回収かつ精製することができる。精製には、高速液体クロマトグラフィーが特に好ましい。ポリペプチドが単離及び/又は精製の際に変性される場合、タンパク質の周知のリフォールディング法を利用して活性コンホメーションを再生することができる。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング法で化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。このような化合物は、本発明の遺伝子の発現又はポリペプチドの活性のレベルを活性化(アゴナイズ)又は阻害(アンタゴナイズ)することができ、本発明のさらなる局面を形成する。好ましい化合物は、本発明の第1局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現を変え、或いは本発明の第1局面のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
最も良いアンタゴニストと思われる化合物は、本発明のポリペプチドに結合する分子であって、該ポリペプチドに結合しても該ポリペプチドの生物学的効力を誘発しない分子である。可能性のあるアンタゴニストとして、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害し、或いは失わせる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体が挙げられる。この様式では、ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止するように、ポリペプチドの正常細胞結合分子に対する結合を阻害することができる。
このようなスクリーニング法で利用する本発明のポリペプチドは溶液内で遊離し、固体支持体に添付され、細胞表面上で支えられ、或いは細胞内に位置しうる。一般的に、このようなスクリーニング手順は、結合を観察するための試験化合物と接触しているポリペプチドを発現する適宜の細胞又は細胞膜の使用、或いは機能的応答の刺激又は阻害を含みうる。試験化合物に接触している細胞の機能的応答を試験化合物に接触していなかった対照細胞と比較する。このようなアッセイは、適切な検出システムを用いて、試験化合物がポリペプチドの活性化によってシグナルを生成するかを評価することができる。一般に、既知アゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイし、試験化合物の存在下、活性化に及ぼす該アゴニストによる効果を観察する。
本発明のINSP005ポリペプチドは、卵成熟又は受精のような生殖プロセスを含む種々の生理学的及び病理学的プロセスを調節することができる。従って、種々の適切なアッセイを用いてこのような調節活性の研究を可能にするシステム内でINSP005ポリペプチドの生物学的活性を試験することができる。例えば、可能なアッセイとして、排卵誘発後の卵母細胞受精及び/又は妊娠率の測定、胚移植率の測定、又は男性不妊の場合、精子運動率の測定が挙げられる(Luo C.W.ら, J. Biol. Chem. 276 (10), 6913-6921 (2001))。
(a)本発明の第1局面のポリペプチドであって、該ポリペプチドへの化合物の結合に応答して検出可能シグナルを与えうる第2成分と会合しているポリペプチドをその表面上で発現する細胞を、前記ポリペプチドへの結合を許容する条件下、スクリーニングすべき化合物と接触させる工程;及び
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定することによって、前記化合物が前記ポリペプチドに結合し、かつ前記ポリペプチドを活性化又は阻害するかを決定する工程;を含む。
(a)本発明の第1局面のポリペプチドであって、該ポリペプチドへの化合物の結合に応答して検出可能シグナルを与えうる第2成分と会合しているポリペプチドをその表面上で発現する細胞を、前記ポリペプチドへの結合を許容する条件下、スクリーニングすべき化合物と接触させる工程;及び
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを、前記化合物の非存在下のシグナルのレベルと比較することによって、前記化合物が前記ポリペプチドに結合し、かつ前記ポリペプチドを活性化又は阻害するかを決定する工程;を含む。
さらに好ましい実施形態では、上記一般的方法は、さらに、ポリペプチド用の標識化又は非標識化リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を行う工程を含むことができる。
本発明のポリペプチドへの結合を許容する条件下で候補化合物の存在下、該ポリペプチドを有する細胞、又は該ポリペプチドを含有する細胞膜へのリガンドの結合の阻害を決定する工程、及び前記ポリペプチドに結合したリガンドの量を決定する工程;を含む。
リガンドの結合を減少させうる化合物は、アゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくは、リガンドを標識化する。
(a)本発明のポリペプチドを細胞表面上で発現する完全細胞、又は本発明のポリペプチドを含有する細胞膜と共に標識化リガンドをインキュベートする工程、
(b)前記完全細胞又は前記細胞膜に結合している標識化リガンドの量を測定する工程;
(c)工程(a)の標識化リガンドと完全細胞又は細胞膜との混合物に候補化合物を添加し、かつ前記混合物を平衡に至らしめる工程;
(d)工程(c)後、前記完全細胞又は前記細胞膜に結合している標識化リガンドの量を測定する工程;及び
(e)工程(d)で結合を減少させる化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであるとみなすように、工程(b)と(d)で結合している標識化リガンドの差異を比較する工程;を含む。
特定の上記実施形態では、簡単な結合アッセイを使用することができ、本ポリペプチドを有する表面への試験化合物の付着を、試験化合物と直接又は間接的に会合している標識という手段によって、或いは標識化コンペティターとの競合を伴うアッセイで検出する。別の実施形態では、競合薬スクリーニングアッセイを使用することができ、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、結合について試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体を用いて、本ポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有するいずれの試験化合物の存在をも検出することができる。
本発明の用語内にも包含されるアッセイ方法は、過剰発現又はアブレーションアッセイでの本発明の遺伝子及びポリペプチドの使用を含む。このようなアッセイは、細胞内のこれら遺伝子/ポリペプチドのレベルの操作と、操作した細胞の生理機能に及ぼすこの操作事象の影響の評価を含む。例えば、このような実験は、特定の遺伝子/ポリペプチドが関係する信号発信及び代謝経路の詳細を明らかにし、研究したポリペプチドが相互作用するポリペプチドのアイデンティティーに関する情報を生成し、かつ関連遺伝子及びタンパク質を調節する方法について手がかりを与える。
本発明のポリペプチドを用いて、リガンド結合及び架橋結合アッセイのような技術的に周知の標準的受容体結合法で膜結合型又は可溶性受容体を同定することができ、このアッセイでは、本ポリペプチドを放射性同位体で標識し、又は化学修飾し、又はその検出若しくは精製を容易にするペプチド配列に融合し、かつ推定受容体の起源(例えば、細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、又は体液の成分)と共にインキュベートする。結合の効力は、表面プラズモン共鳴(Biacore AB, Uppsala, Sweden供給)及び分光法のような生物物理学的方法で測定しうる。受容体の精製及びクローニングには結合アッセイを使用しうるが、その受容体への本ポリペプチドの結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを行う標準的方法は技術的によく理解されている。
本発明は、上記方法で発見された本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素、及び他の化合物を包む。
本発明は、適切な医薬担体と組み合わせて本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を含んでなる医薬組成物をも提供する。これら組成物は、詳細に後述するように、治療若しくは診断試薬、ワクチン、又は他の免疫原性組成物として好適である。
本明細書で使用する用語法では、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物[X]を含有する組成物は、不純物[本明細書ではY]が“実質的にない”(該組成物中のX+Yの合計の少なくとも85質量%がXの場合)。好ましくは、該組成物中のX+Yの合計の少なくとも約90質量%、さらに好ましくは少なくとも約95質量%、98質量%又は99質量%をXが占める。
ヒト被験者に対する正確な有効量は、病気状態の重症度、被験者の通常の健康状態、被験者の年齢、体重、及び性別、食事制限、投与の時間と頻度、薬物の併用、反応感受性、及び療法に対する耐性/応答によって決まる。この量は、日常的な実験で決定することができ、臨床医の判断力の範囲内である。一般的に、有効な用量は、0.01mg/kg〜50mg/kg、好ましくは0.05mg/kg〜10mg/kgである。組成物は、患者に別個に投与してよく、或いは他の物質、薬物又はホルモンと組み合わせて投与することができる。
本明細書では、薬学的に許容しうる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩;酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩を使用することができる。薬学的に許容しうる担体の通し議論はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)で入手可能である。
治療薬中の薬学的に許容しうる担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を含むことができる。さらに、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が該組成物中に存在しうる。このような担体は、患者が摂取するための錠剤、丸剤、ドラギー(dragee)剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして医薬組成物を製剤化できるようにする。
製剤化すると、本発明の組成物は被験者に直接投与することができる。治療すべき被験者は動物でよく;特に、ヒト被験者を治療することができる。
本組成物の直接送達は一般的に注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内で達成され、或いは組織の間質腔に送達される。本組成物を病変中に投与することもできる。投薬治療は単用量スケジュール又は多用量スケジュールでよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の病気状態で過度な場合、いくつかのアプローチを利用しうる。1つのアプローチは、上述したようなインヒビター化合物(アンタゴニスト)を薬学的に許容しうる担体と共に、ポリペプチドの機能を阻害するために有効な量で、リガンド、基質、酵素、受容体の結合を遮断することによって、或いは第2シグナルを阻害することによってのように被験者に投与する工程と、それによって異常な状態を軽減する工程を含む。好ましくは、このようなアンタゴニストは抗体である。最も好ましくは、該抗体はキメラであり、及び/又は前述したようにその免疫原性を最小限にするためヒト化される。
代替アプローチでは、本ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、内部に産生され、又は別個に投与されるアンチセンス核酸分子(上述したような)の使用のような発現遮断法で阻害することができる。本ポリペプチドをコードする遺伝子の制御、5'又は調節領域(シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン)に対する相補配列又はアンチセンス分子(DNA、RNA、又はPNA)を設計することによって遺伝子発現の変化を得ることができる。同様に、“三重らせん”塩基対合方法論を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子の結合のため十分に開く二重らせんの能力の阻害を引き起こすので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療進歩は文献に記載されている(Gee, J.E.ら (1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY)。転写物がリボソームに結合するのを妨げることによって、相補配列又はアンチセンス分子を設計してmRNAの翻訳を遮断することもできる。このようなオリゴヌクレオチドは投与することができ、或いはインビボ発現からインサイツ生成しうる。
RNA分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を増やしうる。可能な修飾として、限定するものではないが、該分子の5'及び/又は3'末端でのフランキング配列の付加或いは該分子の骨格鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりはむしろホスホロチオエート又は2' O-メチルの使用が挙げられる。この概念はPNAsの産生に固有であり、これら分子のすべてでイノシン、キューオシン(queosine)及びブトシン(butosine)のような非伝統的塩基、並びにアセチル-、メチル-、チオ-及び内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同じように修飾した形態を包含することによって拡張することができる。
遺伝子療法を利用して被験者内の関連細胞によって本ポリペプチドの内因性生産を果たすことができる。遺伝子療法を用い、欠陥遺伝子を修正治療用遺伝子で置換することによって、ポリペプチドの不適切な生産を永久的に治療する。
本発明の遺伝子療法はインビボ又はエキソビボで存在しうる。エキソビボ遺伝子療法は患者の細胞の単離と精製、治療用遺伝子の導入及び遺伝的に変化した細胞を患者に戻すことが必要である。対照的に、インビボ遺伝子療法は患者の細胞の単離と精製を必要としない。
治療用遺伝子は、典型的に、患者に投与するために“パッケージ”される。遺伝子送達媒体は、リポソームのような非ウィルス、又はBerkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)に記載されているような複製欠失ウィルス又はMuzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992)及び米国特許第5,252,479号に記載されているようなアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターでよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠失レトロウィルスベクター内での発現用に操作することができる。この発現構築物を単離し、該ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、該パッケージング細胞が問題の遺伝子を含有する感染性ウィルス粒子を産生するようにする。これらプロデューサー細胞を被験者に投与して細胞をインビボ操作し、かつ本ポリペプチドのインビボ発現を操作することができる(Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (及びこの中で引用している参考文献) in Human Molecular Genetics (1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd参照)。
別のアプローチは、“裸のDNA”の投与であり、治療用遺伝子を直接血流又は筋肉組織中に注入する。
本発明のワクチンは予防用(すなわち感染を阻止するため)又は治療用(すなわち感染後の病気を治療するため)のどちらかでよい。このようなワクチンは、通常、上述したような薬学的に許容しうる担体と組み合わせて免疫化抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を含む。担体として、それ自体該組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生を誘発しないいずれの担体も挙げられる。さらに、これら担体は免疫刺激薬(“アジュバント”)として機能しうる。さらに、ジフテリア、破傷風、コレラ、H. ピロリ、及び他の病原由来のトキソイドのような細菌性トキソイドに抗原又は免疫原を接合させうる。
本発明のワクチン製剤は、単服用量又は多服用量容器で提供することができる。例えば、使用直前に無菌液状担体の添加のみが必要な封止アンプル及びバイアルを凍結乾燥条件で貯蔵することができる。薬用量は、ワクチン特有の活性によって決まり、日常的実験で容易に決定することができる。
本発明のポリペプチドに結合する抗体の遺伝子送達は、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように達成することもできる。
ジェット式注射と呼ばれる技術(例えば、www.powderjet.com参照)もワクチン組成物の製剤化で有用である。
ワクチン接種及びワクチン送達システムに好適ないくつかの方法が国際特許出願WO00/29428に記載されている。
診断用核酸分子は、血液、尿、唾液、組織バイオプシー又は剖検材料のような被験者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAを直接検出に使用し、或いは分析前にPCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、又は他の増幅法(Saikiら, Nature, 324, 163-166 (1986); Bejら, Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyerら, J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)参照)を用いて酵素的に増幅することができる。
a)患者由来の組織試料を厳密条件下で核酸プローブと接触させる工程であって、前記厳密条件は、本発明の核酸分子と前記プローブとのハイブリッド複合体の形成を許容する工程;
b)工程a)と同一条件下で前記プローブを対照試料と接触させる工程;及び
c)前記試料中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程;
を含み、
前記対照試料中のハイブリッド複合体のレベルと異なる前記患者の試料中のハイブリッド複合体のレベルの検出が病気の指標である。
a)病気について調べる患者由来の組織試料を得る工程;
b)前記組織試料から本発明の核酸分子を単離する工程;及び
c)病気と関連する前記核酸分子中の突然変異の存在を検出することによって、病気について患者を診断する工程;
を含む診断方法を含む。
上記方法で核酸分子の検出を補助するため、例えばPCRを用いる増幅工程を含めることができる。
正常な遺伝子型と比べた増幅産物の大きさの変化によって欠失及び挿入を検出することができる。本発明の標識化RNA又は代わりに、本発明の標識化アンチセンスDNA配列に増幅DNAをハイブリダイズすることによって、点突然変異を確認することができる。RNアーゼ消化又は融解温度の差を評価することによって、完全に一致する配列をミスマッチ二重鎖と区別することができる。患者内の突然変異の存在又は非存在は、厳密条件下でDNAにハイブリダイズする核酸プローブとDNAを接触させて、ハイブリッド二重鎖分子であって、病気に関連する突然変異に対応するいずれかの部分に核酸プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二重鎖分子を形成し;かつDNA鎖の対応部分内における病気関連突然変異の存在又は非存在の指標としてプローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の存在又は非存在を検出することによって、患者内の突然変異の存在又は非存在を検出しうる。
このような診断法は特に出生前検査で有用であり、かつ新生児期検査でさえ役立つ。
DNA配列の差異は、変性剤があるか又は無いゲル中のDNA断片の電気泳動モビリティの変化によって、或いは直接DNAシークエンシングによっても検出しうる(例えば、Myersら, Science (1985) 230:1242)。特異的位置の配列変化は、RNアーゼ及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学的切断法によっても明らかにすることができる(Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401)。
本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して遺伝的変異体、突然変異及び多形性の効率的スクリーニングを行うことができる。アレイ技法は周知であり、一般的適用可能性を有し、かつ遺伝子発現、遺伝的連鎖、及び遺伝的変異性を含む分子遺伝学の種々の問題を処理するために使用することができる(例えば、M.Cheeら, Science (1996), Vol 274, pp 610-613参照)。
宿主由来の試料内の本発明のポリペプチドのレベルを決定するために使用可能なアッセイ法は当該技術の当業者に周知であり、ある程度詳細に上述した(ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析及びELISAアッセイ)。本発明のこの局面は、以下の工程:(a)上述したようなリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生体試料と接触させる工程;及び(b)前記複合体を検出する工程;を含む診断方法を提供する。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、該ポリペプチドの発現の特徴がある状態若しくは病気の診断、又は本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド及び他の化合物で治療する患者をモニターするためのアッセイで使用することができる。診断プロセスで有用な抗体は、治療薬について上述したのと同じ様式で調製することができる。本ポリペプチドの診断アッセイとして、該抗体と、ヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物内で該ポリペプチドを検出するための標識を利用する方法が挙げられる。抗体は修飾し、又は修飾せずに使用でき、かつそれらを共有結合的又は非共有結合的にリポーター分子と結合することによって標識化しうる。技術的に周知の種々多様なリポーター分子を用いることができ、そのいくつかについて上述した。
被験者、対照及びバイオプシー組織由来の病気試料内で発現されるポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と被験者の値の偏差が病気を診断するためのパラメーターを確立する。診断アッセイを用いてポリペプチドの非存在、存在、及び過剰発現と区別し、かつ治療措置中のポリペプチドレベルの規則をモニターすることができる。このようなアッセイを用い、動物研究、臨床治験又は個々の患者の治療のモニタリングにおける治療措置レジメの効率を評価することもできる。
(a)本発明の核酸分子;
(b)本発明のポリペプチド;又は
(c)本発明のリガンド;
を含みうる。
診断キットは、本発明の代替局面では、本発明の核酸分子の少なくとも1つの核酸分子のアレイを含むことができる。
本発明のポリペプチドを検出するため、診断キットは、本発明のポリペプチドに結合する1個以上の抗体;及び該抗体とポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むことができる。
このようなキットは、メタロプロテアーゼが関係する病気、特に気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害及び生殖障害、又はこれら病気に対する感受性の診断で役に立つ。
以下、本発明の種々の局面及び実施形態を、特にINSP005ポリペプチドを参照しながら例としてさらに詳述する。
本発明の範囲から逸脱することなく細部の変更を為しうることを理解すべきである。
実施例1:INSP005予測ポリペプチド
私有のバイオインファマティクス法で予測したINSP005ポリペプチド配列(配列番号:37)を以下のデータベースの検索用の質問(query)配列として使用した。
NCBI-nr NCBI-nt NCBI-pat-aa
NCBI-pat-nt NCBI-month-aa NCBI-month-nt
NCBI-est
これら検索の結果を図1に要約し、2つの関連配列アラインメントを示す。図1の表題は、使用した検索/アラインメントアルゴリズムと検索したデータベースを示す。これら結果は、INSP005予測ポリペプチド配列に最も近い関連マッチは日本ウナギ(日本ウナギ)由来の孵化酵素EHE4であることを示す。これら検索は、問題の3つの他の先行技術の配列も同定した。
上述したように、新規メタロプロテアーゼの同定は、これらタンパク質が関係する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解の向上、及びこれら障害を治療するための有効な遺伝子又は薬物療法の開発で非常に重要である。同様に、メタロプロテアーゼのアスタシン/コリオリジン様ファミリーのさらなるメンバーの同定は、これらタンパク質が関係する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解の向上、及びこれら障害を治療するための有効な遺伝子又は薬物療法の開発で非常に重要である。
1.1 cDNAライブラリー
ヒトcDNAライブラリー(バクテリオファージラムダ(λ)ベクター)はStratagene又はClontechから購入し、或いはSerono Pharmaceutical Research Instituteで、製造業者のプロトコロル(Stratagene)に従ってλ ZAP又はλ GT10ベクター中で調製した。バクテリオファージλ DNAは、大腸菌感染した宿主株の小スケール培養からWizard Lambda Preps DNA精製システムを用い、製造業者の説明書に従って調製した(Promega, Corporation, Madison WI.)。使用したライブラリー及び宿主株のリストを図2に示す。5つの異なるライブラリー(100ng/μlファージDNA)の8種のツール(A-H)を以後のPCR反応で使用した。
全RNAは、TrizolTM試薬(Invitrogen)を用い、製造業者の説明書に従って主要なヒト細胞、ヒト細胞系及びヒト組織から単離し、或いはClontech、Invitrogen又はAmbionから購入した。RNAの質と濃度は、Agilent 2100 Bioanalyzerで分析した。
cDNA合成のため、反応混合物は以下の成分を含む:12μ1の体積中、オリゴ(dT)15プライマー(500μg/ml,Promega cat. no. C 1101)、2μgの全RNA、1μlの10mM dNTPs。この混合物を65℃に5分間加熱してから氷上で冷却した。以下の試薬を添加し:4μlの5X第1鎖緩衝液、2μlのDTT(0.1M)、1μlのRNAseOut組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40単位/μl, Promega, cat. no. N 2511)、42℃で2分間インキュベート後、1μl(200単位)のSuperscript II(Invitrogen cat. no. 18064-014)を添加した。混合物を42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱した。RNA鋳型を除去するため、1μl(2単位)の大腸菌RNase H(Invitrogen cat. no.18021-014)を添加し、反応混合物を37℃でさらに20分間インキュベートした。最終反応混合物を無菌水で200μlに希釈し、-80℃で貯蔵した。同体積の5種のcDNA鋳型を混合してcDNAプールを生成した。
INSP005をコードする部分的cDNAは、遺伝子特異的クローニングプライマー(CP1及びCP2、図3及び図4)を用いて248bpのPCR増幅産物として得た。PCRは、1X AmpliTaqTM緩衝液、200μMのdNTPs、それぞれ50pmolesのクローニングプライマー、2.5単位のAmpliTaqTM(Perkin Elmer)及び100ngの各ファージライブラリープールDNAを含有する最終体積50μl中、MJ Research DNA Engineを用い、以下のように計画して行った:94℃、1分;94℃、1分、x℃、及びy分及び72℃の40サイクル(xは最低Tm-5℃、y=産物1kb当たり1分);次いで72℃で7分を1サイクルかつ4℃で保持サイクル。
1 X TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8%アガロースゲル上で増幅産物を可視化し、予測分子量で移動するPCR産物をWizard PCR Preps DNA Purification System (Promega)でゲルから精製した。50μlの無菌水中に溶出したPCR産物を直接サブクローン化し、或いは-20℃で貯蔵した。
Primer Designer Software (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を用い、仮想cDNAの全長及び部分的配列を増幅するため18〜25塩基の長さを有するPCRプライマーの対を設計した。55±10℃に近いTm及び40〜60%のGC含量を有するようにPCRプライマーを最適化した。標的配列INSP005に高い選択性を有するプライマーを選択した(非特異的プライミングがほとんど又は全くない)。
Invitrogen Corporationから購入したTAクローニングキットを用い、製造業者が指定した条件でPCR産物をトポイソメラーゼI修飾クローニングベクター(pCRII TOPO)中にサブクローン化した。要するに、ヒトライブラリープールN増幅からの4μlのゲル精製PCR産物を1μlのTOPOベクターと1μlの塩溶液と共に室温で15分間インキュベートした。以下のように反応混合物を大腸菌株TOP10(Invitrogen)中で形質転換させた:50μlずつのOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応を加えた。混合物を15分間氷上でインキュベートしてから42℃で正確に30秒間インキュベートして熱ショックを与えた。試料を氷に戻し、250μlの温SOC培養液(室温)を加えた。試料を振とうさせながら(220rpm)37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物を、アンピシリン(100μg/ml)を含有するL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩中インキュベートした。cDNA挿入断片を含有するアンピシリン耐性コロニーをコロニーPCRによって同定した。
無菌つまようじを用いて50μlの無菌水溶液中にコロニーを接種した。SP6及びT7プライマーを使用することを除き、上述したように全反応量20μl中10μlずつの接種材料をPCRに供した。サイクル条件は以下のとおりだった:94℃、2分;94℃、30秒、47℃、30秒及び1分間72℃の30サイクル;1サイクル、72℃、7分。さらなる分析前に試料を4℃(保持サイクル)で維持した。
PCR反応産物を1 X TAE緩衝液中1%アガロースゲル上で分析した。予想したPCR産物サイズ(248bp cDNA+複数のクローニング部位又はMCSのため185bp)を与えたコロニーを、37℃220rpmで振とうさせながら、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-Broth(LB)中37℃で一晩中成長させた。
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SV Miniprepsキット(Promega cat. no. 1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養からMiniprepプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを100μlの無菌水溶液中に溶出した。Eppendorf BO光度計でDNA濃度を測定した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystems cat. no. 4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってT7プライマー及びSP6プライマーによるDNAシークエンシングにプラスミドDNA(200〜500ng)を供した。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Millipore cat. no. LSKS09624)でシークエンシング反応を精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで分析した。
INSP005 ORFの予測配列を図3に示す。オープンリーディングフレーム内のM96における第2予測開始部位を使用する全長予測又はより短いバージョンを増幅するためのプライマー対を用い、PCRで全長コーディング配列を単離する試みは、試験したライブラリーについて失敗した。INSP005に最も近い関連配列は、日本ウナギのアスタシン様メタロペプチダーゼとメダカ(Oryzias latipes)のコリオリジンHである。INSP005は、コリオリジンHのヒトオルトログ(orthologue)である。コリオリジンは卵生魚卵の受精後の卵膜硬化に関係があり、子宮がINSP005 mRNAの適切な起源でありうることを示唆している。この組織の選択は、さらにヒト子宮腫瘍由来の単EST、BI061462の発見によって支持された。
完全コーディング配列を同定するためGeneRacerキット(Invitrogen cat no. L1502-01)を用い、製造業者の説明書に従って、子宮RNA(Clontechから購入)から調製したcDNAについてRACE PCRを行った。3'末端の増幅のため、1μlのRACE Ready cDNA、5μlの10Xハイフィデリティー(High Fidelity)緩衝液、1μlのdNTPs(10mM)、2μlの50mM MgSO4、3μlのGeneRacer 3'プライマー(10μM)、1μlの遺伝子特異的プライマー(78836-GR1-3')(10μM)及び2.5単位(0.5μl)の白金Taq DNAポリメラーゼHi Fi(Invitrogen)を含有する50μlの溶液量で第1PCRを行った。サイクル条件は以下のとおりだった:94℃、2分;94℃、30秒及び72℃で2分の5サイクル;94℃、30秒及び70℃、5分の5サイクル;94℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、5分の25サイクル;68℃で10分間で最後の伸長。1μlの増幅反応を入れ子状PCRの鋳型として使用し、プライマー以外上記と同一の試薬で最終反応量50μlで行った。入れ子状PCRのプライマーは1μlのGeneRacer 3'入れ子状プライマー(10μM)と1μlの入れ子状遺伝子特異的プライマー(78836-GR1nest-3')(10μM)だった。サイクル条件は、94℃、2分;94℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、5分の25サイクル;68℃で10分間最終伸長及び4℃で保持サイクル。PCR産物をゲル精製し、pCR4-TOPOベクター中にサブクローン化し、上述したように配列決定した。使用したすべてのプライマーを図4に示す。3' RACE産物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を図5に示す。3' RACE産物によってコードされたアミノ酸配列は伸長したC-末端を有しており、ヌクレオチド位置85後の予測と異なり、二者択一的スプライス型を示唆している。
INSP005の推定全長コーディング配列をヒト子宮cDNA(セクション1.2で述べたように調製した)から2μlの子宮cDNA、5μlの10Xハイフィデリティー緩衝液、1μlのdNTPs(10mM)、2μlの50mM MgSO4、1μlの遺伝子特異的プライマー78836-FL-F(10μM)、1μlの逆遺伝子特異的プライマー78836-FL-R(10μM)及び2.5単位(0.5μl)の白金Taq DNAポリメラーゼHi Fi(Invitrogen)を含有する50μlのPCR反応混合物中PCRでクローン化した。サイクル条件は、94℃、2分;94℃、30秒、55℃、30秒及び68℃、1分30秒の40サイクル;68℃で10分間最終伸長及び4℃で保持サイクル。増幅産物を1 X TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8%アガロースゲル上で可視化し、予測分子量(1048bp)で移動するPCR産物をゲルからWizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)で精製した。セクション1.4で述べたように、PCR産物を50μlの無菌水に溶出し、pCR4 TOPOベクター中にサブクローン化した。増幅反応の伸長時間が2分であることを除き、セクション1.5で述べたとおりにいくつかのアンピシリン耐性コロニーをコロニーPCRに供した。正確な大きさの挿入断片(1048bp+MCSのための99bp)を含有するコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-Broth(LB)中、37℃220rpmで振とうさせながら37℃で一晩中成長させた。Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SV ミニプレップキット(Promega cat. no. 1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養からミニプレッププラスミドDNAを調製し、かつ200〜500ngのミニ-プレップDNAをセクション1.7で述べたようにT3及びT7プライマーで配列決定した(図6)。クローン化配列を図7に示す。予測配列と共にクローン化配列(INSP005a)のアミノ酸アラインメントを図13に示す。結果のプラスミドpCR4-TOPO-IPAAA78836-1(配列番号:38;プラスミド識別番号13164)の地図を図9に示す。
CP1及びCP2で得られ、かつ正しい大きさ(248bp)で移動するPCR産物をライブラリープールN(ライブラリー18、19、20及び21)内で同定した。78836-FL-F及び78836-FL-Rプライマーを用い、推定全長INSP005(INSP005a)をコードするcDNAを子宮cDNAから単離した。プライマー78836-FL-Fは、予測配列のエキソン3内に位置する。予測のエキソン1内にプライマーがある逆プライマー(78836-FL-R)ではPCR産物は得られなかった。
プライマー78836-FL2-F及び78836-FL-Rを用い、代替5'末端を含有するINSP005(INSP005b)の第2推定全長バージョンをヒトの主要な肺線維芽細胞、ケラチノサイト及び骨関節炎滑液由来のcDNAsのプールからクローン化したが、子宮内では検出されなかった。結果PCR産物(1313bp−図10)をTOPO-TAクローニングキット及びセクション1.5〜1.7で述べたとおりの配列を用いてpCR4 TOPOベクター中にサブクローン化した。結果のプラスミド、pCR4-TOPO-IPAAA78836-2(配列番号:39;プラスミド識別番号13296)の地図を図12に示す。
全長INSP005予測ポリペプチドをクローン化する試みは、本明細書でINSP005a及びINSP005bと称するINSP005予測ポリペプチドの2種の変異体を同定した(図13;それぞれ配列番号:14及び配列番号:34)。上述したように、INSP005a及びINSP005bポリペプチド(及びINSP005b成熟ポリペプチド)は、本明細書ではINSP005予測ポリペプチドと区別するようにINSP005ポリペプチドと称する。
INSP005a及びINSP005bポリペプチド内の予測エキソンのヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号1〜12及び配列番号15〜32に示す。上述したように、INSP005a及びINSP005bポリペプチドの推定全長ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号13及び33に示す。INSP005a及びINSP005bポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号14及び34に示す。
INSP005a及びINSP005bポリペプチド及びINSP005予測ポリペプチドと、問題の3つの先行技術の配列との間の関係を図13に示し、この図は配列の配列-レベルアラインメントを与える。以下、これらの結果を詳述する。
INSP005aは、子宮cDNAライブラリー由来のINSP005予測ポリペプチドの推定全長バージョンである。この配列は、元のINSP005予測ポリペプチドのメチオニン3で開始する、先端を切った5'末端を有する点で元のINSP005予測ポリペプチドと異なる(図13参照)。INSP005aは、INSP005予測ポリペプチドに対して余分のエキソンを組み入れる伸長した3'末端も有する。INSP005aは全部で6個の予測エキソンを有する。これらの差異は、他のメタロプロテアーゼに対する当該配列要素の低い相同性のため予測されなかった。さらに、INSP005予測ポリペプチドと比べてINSP005aの位置22で用いた択一的アミノ酸がある。INSP005aはシグナルペプチドを含むと予測されない。INSP005aは、上流STOPコドンの前にインフレーム択一的上流開始メチオニンを持たない。
INSP005bは、ヒトの主要肺線維芽細胞、ケラチノサイト及び骨関節炎滑液由来のcDNAのプールからクローン化したINSP005予測ポリペプチドの推定全長バージョンである。INSP005bは、2つの択一的アミノ酸が位置117と222で使用されるが、元のINSP005予測ポリペプチド配列を包含する。それは3つの新しい上流エキソンと1つの下流エキソンをも含み、INSP005bを9エキソンポリペプチドにしている。最後のエキソンはINSP005aと共有されている。INSP005bは子宮内で検出されなかった。当該配列要素の他のメタロプロテイナーゼに対する低い相同性のため、これら差異は予測されなかった。上述したように、INSP005bは、アミノ酸23と24との間に切断部位を有するシグナルペプチドを含むと予測される(配列番号35及び36;図14)。
INSP005bの最初の7個のエキソンは、取得番号AX443328が付与され、WO200216566-A2で開示されるヌクレオチド配列と一致するが(図1及び図13参照)、最後の3'エキソンはWO200216566-A2で開示されていない(Applera Corp)。本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、WO200216566-A2に開示されているものを明確に除外する。
さらなる先行技術の問題の配列は、INSP005aのエキソン1とINSP005bのエキソン2、3及び4をカバーする子宮腫瘍由来のスプライスドESTである(BI061462.1;図1参照)。ESTの方向は報告に与えられず、かつ翻訳から開始メチオニンの存在について結論を出すことは難しい。しかし、本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、EST BI061462.1に開示されている配列を明確に除外する。
取得番号AX526191(Lexicon)を有する別の先行技術の問題の配列は(図1及び13)、関連データベースエントリー(WO02/066624に開示されている)でcDNAとして記載され、生殖役割の可能性に言及されていない。それは、INSP005aと、INSP005bのエキソン2〜8を包含する。しかし、INSP005b及びAX526191(Lexicon)配列中の対応するアミノ酸と比較してINSP005aの位置127で択一的アミノ酸が使用されている。AX526191は開始メチオニン、上記子宮腫瘍ESTによってカバーされる。AX526191では0.875の確率でシグナル配列が予測される。本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、取得番号AX526191の配列を含むWO02/066624で開示されている配列を含まない。
また、図13は、示される各ポリペプチドで同一である活性部位残基を強調表示する。これは、INSP005a及びINSP005bポリペプチドがメタロプロテアーゼであるという抗し難いさらなる証拠を与える。
従って、INSP005a及びINSP005bポリペプチドは新しいメタロプロテアーゼを表し、それらがメタロプロテアーゼのコリオリジン/アスタシン様ファミリーのメンバーであるという強い証拠がある。それゆえにINSP005a及びINSP005bポリペプチドは、ヒトの生理学的及び病理学的プロセス、特に生殖プロセスで重要な役割を果たしうる。
3.1 発現
Epstein-Barrウィルス核抗原を発現するヒト胎児腎臓293細胞(HEK293-EBNA, Invitrogen)をEx-細胞VPRO血清フリー培地(種ストック、維持培地、JRH)中懸濁液内で維持した。トランスフェクションの16〜20時間前(日-1)、細胞を2xT225フレーク(1フレーク当たり50ml、2×105細胞/mlの密度で2% FBS接種培地(JRH)を含有するDMEM/F12(1:1)中)に接種した。次の日(トランスフェクション:日-0)、JetPEITM試薬(2μl/μgのプラスミドDNA, PolyPlus-transfection)を用いてトランスフェクションを行った。各フレークで113μgのcDNA(プラスミド番号13403)を2.3μgのGFP(蛍光リポーター遺伝子)と共に形質移入した。トランスフェクションミックスを2xT225フレークに加え、37℃(5%CO2)で6日間インキュベートした。材料の量を増やすため、この手順を2個の追加フレークで繰り返して全部で200ml生成した。ポジティブトランスフェクションの確認は、日-6に定性蛍光検査で行った(Axiovert 10 Zeiss)。
日-6(収穫日)に、4つのフレークから上清(200ml)をプールし、遠心分離し(4℃,400g)、ユニークなアイデンティファイヤーを有するポット内に置いた。
6His-標識タンパク質のQC(内部バイオプロセシングQC)のため1アリコート(500ul)を保った。対応する送達シートはT. Battleのノートブック11140 p28内で見つけられる。
追加生産目的のため、以下のような500mlのスピナートランスフェクションでバッチ2を生成した:
Epstein-Barrウィルス核核抗原を発現するヒト胎児腎臓293細胞(HEK293-EBNA, Invitrogen)をEx-細胞VPRO血清フリー培地(種ストック、維持培地、JRH)中懸濁液内で維持した。トランスフェクションの日に、細胞を数え、遠心分離し(低速)、ペレットを1% FCSで補充した所望量のFEME培地中で再懸濁させ(以下参照)、1XE6生細胞/mlの細胞濃度を得た。#13403 cDNAをFEME (200ml/リットル体積)中2mg/リットル体積(2% eGFPと共-形質移入)で希釈した。ポリエチレンイミントランスフェクション薬(4mg/リットル体積)をcDNA溶液に加え、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした(トランスフェクションミックス生成)。
このトランスフェクションミックスをスピナーに添加し、CO2インキュベーター(5%CO2かつ37℃)内で90分間インキュベートした。90分後、新鮮なFEME培地(1% FCS)を加え、最初のスピナー体積の2倍にした。スピナーを6日間インキュベートした。日-6(収穫日)に、スピナー上清(500ml)を遠心分離し(4℃,400g)、プラスミド番号と発酵番号を有するユニークなアイデンティファイヤーを有するポット内に置いた。
6His-標識タンパク質のQC(内部バイオプロセシングQC)のため1アリコート(500μl)を保った。
C末端6His標識を有する組換えタンパク質を含有する200mlの培養基試料を冷緩衝液A(50mM NaH2PO4;600mM NaCl;8.7%(w/v)グリセロール,pH7.5)で最終体積400mlに希釈した。試料を0.22um無菌フィルター(Millipore,500mlフィルター単位)でろ過し、500mlの無菌方形培地ボトル(Nalgene)内4℃で保持した。
この500mlの培養基試料を冷緩衝液Aで最終体積1000mlに希釈した。試料を0.22um無菌フィルター(Millipore,500mlフィルター単位)でろ過し、1000mlの無菌方形培地ボトル(Nalgene)内4℃で保持した。
精製は、自動試料装填機(Labomatic)に接続したVISIONワークステーション(Applied Biosystems)上4℃で行った。精製手順は、2つの連続工程、Niイオンで充填したPoros 20 MC(Applied Biosystems)カラム上(4.6×50mm,0.83ml)金属アフィニティークロマトグラフィー後、Sephadex G-25培地(Amersham Pharmacia)ゲルろ過カラム上(1,0×15cm)緩衝液交換で編成した。
第1クロマトグラフィー工程では、金属アフィニティーカラムを30カラム量のEDTA溶液(100mM EDTA;1M NaCl;pH8.0)で再懸濁させ、15カラム量の100mM NiSO4溶液による洗浄によってNiイオンで再充填し、10カラム量の緩衝液A、次に7カラム量の緩衝液B(50mM NaH2PO4;600mM NaCl;8.7%(w/v)グリセロール,400mM;イミダゾール,pH7.5)で洗浄し、最後に15mMのイミダゾールを含有する15カラム量の緩衝液Aで平衡化した。実験室試料装填機で試料を200mlの試料ループ中に写し、引き続き10ml/分の流速でNi金属アフィニティーカラム上に充填した。全試料体積(400又は1000ml)をNiカラム上に移すため、充填手順をそれぞれ2及び5回繰り返した。引き続きカラムを12カラム量の緩衝液A、次に20mMのイミダゾールを含有する28カラム量の緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール洗浄の間、ゆるく結合した混入タンパク質がカラムの溶出液だった。最後に2ml/分の流速で10カラム量の緩衝液Bによって組換えHis-標識タンパク質を溶出し、溶出したタンパク質を1.6mlフラクションに収集した。
クーマシー染色:NuPAGEゲルを0.1%クーマシーブルーR250染色溶液中(30%メタノール,10%酢酸)室温で1時間染色し、引き続き背景が澄み、タンパク質バンドが明らかに見えるまで20%メタノール、7.5%酢酸中で脱染した。
ウエスタンブロット:電気泳動後、ゲルからニトロセルロース膜に290mAで1時間4℃でエレクトロトランスファーさせた。膜を緩衝液E中(137mM NaCl;2.7mM KCl;1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4;0.1% Tween 20,pH7.4)5%ミルク粉末で1時間室温で遮断し、引き続き緩衝液E中2.5%ミルク粉末中2種のウサギポリクロナール抗-His抗体(G-18及びH-15,それぞれ0.2ug/ml;Santa Cruz)と共に4℃で一晩中インキュベートした。さらに室温で1時間のインキュベーション後、膜を緩衝液Eで洗浄(3×10分)してから、2.5%ミルク粉末を含有する緩衝液E中1/3000希釈した第2HRP-接合抗-ウサギ抗体(DAKO, HRP 0399)と共に室温で2時間インキュベートした。緩衝液E(3×10分)で膜を洗浄してからECLキット(Amersham Pharmacia)で膜を1分間現像した。引き続き膜をHyperfilm(Amersham Pharmacia)にさらし、このフィルムを現像し、ウエスタンブロット像を視覚分析した。
タンパク質アッセイ:標準物質としてウシ血清アルブミンを有するBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いてタンパク質濃度を決定した。200ml及び500mlの培養基試料からそれぞれ78及び90μgの精製タンパク質を回収した。
4.1 序文
INSP005bをインビボ特徴づけするため、筋肉エレクトロトランスファー法を用いてWT及びConA処理動物の循環内でINSP005bタンパク質を発現させた。WT動物内におけるINSP005bのエレクトロトランスファー後、血清トランスアミナーゼレベル又はTNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4若しくはMCP-1サイトカインレベルの有意な変化は観察されなかった。そこで、エレクトロポレートした動物をConAで誘発して血清サイトカインレベルとトランスアミナーゼレベル及びINSP005b効果を決定した。
4.2 背景−コンカナバリンA(ConA)-誘発肝炎
毒性肝臓病はヒトの世界中の健康問題を代表し、現在までに薬理学的治療が発見されている。例えば、肝硬変につながる活性慢性肝炎は、活性化T細胞によって肝実質細胞が進行的に破壊される病気状態である。ConA-誘発肝毒性は、マウスで述べられているT細胞依存性アポトーシス及び壊死性肝損傷の3種の実験モデルの1つである。活性化抗-CD3モノクロナールAB又は超抗原SEBで誘発したGal N(D-ガラクトースアミン)感作マウスは重大なアポトーシスと二次壊死性肝損傷を発生する(Kusters S, Gastroenterology. 1996 Aug;111(2):462-71)。T細胞ミトゲン植物レクチンConAの非感作マウスへの注射も、壊死に進行する肝アポトーシスをもたらす。ConAは全身的なTNF-αやIFN-γ及び種々の他のサイトカインの放出を誘発する。TNF-αとIFN-γは両方とも肝損傷の重大なメディエイターである。傷害8時間後のトランスアミナーゼ放出は重大な肝臓破壊を示す。
いくつかの細胞型、CD4 T細胞、マクロファージ及び天然キラーが肝障害に関与することが分かっている(Kaneko J Exp Med 2000, 191, 105-114)。抗-CD4抗体はT細胞の活性化、ひいては肝障害を遮断する(Tiegsら 1992, J Clin Invest 90, 196-203)。CD8に対するモノクロナール抗体で前処理したマウスは防御に失敗したが、マクロファージの欠失は肝炎の誘発を阻止した。
他の分子はConAモデル内で防御的であると記述されている。単投与のrhIL-6はトランスアミナーゼの放出を完全に阻害した(Mizuharaら 1994, J. Exp. Med. 179, 1529-1537)。
インビボ遺伝子転移の非ウィルス法のうち、筋線維中へのプラスミドDNAの直接注射及びその後のエレクトロポレーションが簡単で安価かつ安全である。筋線維の分裂終了特性と長寿はトランスフェクトされた遺伝子の安定した発現を許容するが、トランスフェクトされたDNAは、一般的に染色体の組込みを受けない(Somiariら 2000, Molecular Therapy 2,178)。いくつかの報告は、筋肉-産生タンパク質の血流中への分泌が、対応するcDNAのエレクトロポレーション後に達成しうることを実証している(Rizzutoら PNAS, 1996, 6417; Aihara Hら, 1998, Nature Biotech 16, 867)。さらに、病気モデル内における筋肉発現Epo及びIL-18BPのインビボ効率が示されている(Rizzuto, 2000, Human Gene Therapy 41, 1891; Mallat, 2001, Circulation research 89, 41)。
4.4.1 動物
すべての研究で、オスのC57/BL6(週齢8)を用いた。一般に、1実験群で10匹の動物を用いる。マウスを標準条件で12-時間の明暗サイクル下、照射食品と適宜の水を与えて維持した。
4.4.2 筋肉エレクトロトランスファー
4.4.2.1 ベクターの選択
His又はStrepII標識IL6及びINSP005b(IPAAA78836-2)遺伝子を、CMVプロモーターを含有するゲートウェイ適合pDEST12.2ベクター内でクローン化した。
4.4.2.2 エレクトロポレーションプロトコロル
マウスをガスで麻酔した(イソフランBaxter,Ref:ZDG9623)。後脚をそり、エコーグラフィックゲルを適用した。ヒアルロニダーゼを後脛骨筋内に(20U 50μlの無菌NaCl 0.9%中, Sigma Ref. H3631)と共に注入した。10分後、100μgのプラスミド(脚毎50μg,25μlの無菌NaCl 0.9%中)を同筋肉内に注入した。筋肉注射前Buffer PBS-L-Glutamate(6mg/ml;L-Glutamate Sigma P4761)中でDNAを調製した。エレクトロトランスファーのため、各足について、ElectroSquarePorator BTX ref ECM830により各パルスで20ms間75ボルトで、1秒間隔で10パルス、2ラウンド電極(直径0.5mmの大きさ)で単極法で電場を掛けた。
4.4.3 ConAモデル
4.4.3.1 ConA静脈内注射及び血液サンプリング
週齢8のメスのマウスC57/Bl6をIFFA CREDOから購入した。ConA(Sigma ref.C7275)を18mg/kgで静脈内注射し、注射の1.30及び8時間後に血液試料を取った。犠牲時、血液を心臓から取った。
4.4.3.2 血液試料中のサイトカイン及びトランスアミナーゼの検出
TH1/TH2 CBAアッセイでIL2、IL5、IL4、TNF-α及びIFN-γサイトカインレベルを測定した。炎症CBAアッセイでTNF-α、IL-6、MCP1、IFN-α、IL-10及びIL-12を検出した。COBAS機器(Hitachi)を用いてトランスアミナーゼ血液パラメーターを決定した。
4.4.3.3 INSP005b及びIL-6エレクトロトランスファー
日-0にpDEST12.2.INSP005b、pDEST12.2-hIL-6及び空ベクター対照(上記エレクトロトランスファープロトコロル参照)のエレクトロトランスファーを行った。エレクトロトランスファー後の日-5にConA(18mg/kg)を静脈内注射し、血液を2時点(1.30、8時間)でサンプリングした。上記と同様にサイトカイン及びASAT ALAT測定を行った。
4.5 結果
劇症肝炎を模したマウスモデルにおいて、INSP005bのエレクトロトランスファーによる全身送達後、このタンパク質が肝損傷から防御することを見いだした。図15A及び15Bは、INSP005b-エレクトロトランスファー動物がConA誘発後8時間の空ベクター対照動物に比べて減少したトランスアミナーゼレベルを示すことを示している。さらに、これら動物内では、TNF-αとIL-6の両サイトカインレベルが有意に減少している(図16A及び図16B)。効果はポジティブ対照ベクターpDEST12.2hIL-6-SIIで得られた結果と同様である。
4.6 結論
これら結果は、劇症肝炎のインビボモデル内でのINSP005b cDNAの送達が血清中のTNF-α及びm-IL-6レベルを下げ、かつ血清中で測定されるASAT及びALATレベルの低減に有意な効果を有することを示す。
ASAT及びALATレベルの減少は、TNF-α及びIL6レベルの減少のためだろう。TNF-αは、ConA注入後の肝障害に関与する重要なサイトカインである。肝炎のこのマウスモデルでは、TNF-αは主に肝マクロファージ、いわゆるKupfer細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は、病気に対する防御を与える(Seinoら 2001, Annals of surgery 234, 681)。
配列番号:1(INSP005A ヌクレオチド配列エキソン1)
1 ATGGGTGGTA GTGGTGTCGT GGAGGTCCCC TTCCTGCTCT CCAGCAAGTA
51 CG
1 MGGSGVVEVP FLLSSKYD
1 ATGAGCCCAG CCGCCAGGTC ATCCTGGAGG CTCTTGCGGA GTTTGAACGT
51 TCCACGTGCA TCAGGTTTGT CACCTATCAG GACCAGAGAG ACTTCATTTC
101 CATCATCCCC ATGTATGG
1 EPSRQVILEA LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYG
1 GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG GATGCAGGTG GTCTCCCTGG
51 CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA TTGTCCTTCA TGAGCTCATG
101 CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG CGGGCCGACC GGGACCGCTA
151 TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC AG
1 CFSSVGRSGG MQVVSLAPTC LQKGRGIVLH ELMHVLGFWH EHTRADRDRY
51 IRVNWNEILP G
1 GCTTTGAAAT CAACTTCATC AAGTCTCAGA GCAGCAACAT GCTGACGCCC
51 TATGACTACT CCTCTGTGAT GCACTATGGG AG
1 FEINFIKSQS SNMLTPYDYS SVMHYGR
1 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
51 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
101 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
151 GAGAG
1 LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG
51 RG
1 GGTCCCATGC CCACAGCACT GGTAGGAGCC CCGCCCCGGC CTCCCTATCT
51 CTGCAGCGGC TTTTGGAGGC ACTGTCGGCG GAATCCAGGA GCCCCGACCC
101 CAGTGGTTCC AGTGCGGGAG GCCAGCCCGT TCCTGCAGGG CCTGGGGAGA
151 GCCCACATGG GTGGGAGTCC CCTGCCCTGA AAAAGCTCAG TGCAGAGGCC
201 TCGGCAAGGC AGCCTCAGAC CCTAGCTTCC TCCCCAAGAT CAAGGCCTGG
251 AGCAGGTGCC CCCGGTGTTG CTCAGGAGCA GTCCTGGCTG GCCGGAGTGT
301 CCACCAAGCC CACAGTCCCA TCTTCAGAAG CAGGAATCCA GCCAGTCCCT
351 GTCCAGGGAA GCCCAGCTCT GCCAGGGGGC TGTGTACCTA GAAATCATTT
401 CAAGGGGATG TCCGAAGAT
1 SHAHSTGRSP APASLSLQRL LEALSAESRS PDPSGSSAGG QPVPAGPGES
51 PHGWESPALK KLSAEASARQ PQTLASSPRS RPGAGAPGVA QEQSWLAGVS
101 TKPTVPSSEA GIQPVPVQGS PALPGGCVPR NHFKGMSED
1 ATGGGTGGTA GTGGTGTCGT GGAGGTCCCC TTCCTGCTCT CCAGCAAGTA
51 CGATGAGCCC AGCCGCCAGG TCATCCTGGA GGCTCTTGCG GAGTTTGAAC
101 GTTCCACGTG CATCAGGTTT GTCACCTATC AGGACCAGAG AGACTTCATT
151 TCCATCATCC CCATGTATGG GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG
201 GATGCAGGTG GTCTCCCTGG CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA
251 TTGTCCTTCA TGAGCTCATG CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG
301 CGGGCCGACC GGGACCGCTA TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC
351 AGGCTTTGAA ATCAACTTCA TCAAGTCTCA GAGCAGCAAC ATGCTGACGC
401 CCTATGACTA CTCCTCTGTG ATGCACTATG GGAGGCTCGC CTTCAGCCGG
451 CGTGGGCTGC CCACCATCAC ACCACTTTGG GCCCCCAGTG TCCACATCGG
501 CCAGCGATGG AACCTGAGTG CCTCGGACAT CACCCGGGTC CTCAAACTCT
551 ACGGCTGCAG CCCAAGTGGC CCCAGGCCCC GTGGGAGAGG GTCCCATGCC
601 CACAGCACTG GTAGGAGCCC CGCCCCGGCC TCCCTATCTC TGCAGCGGCT
651 TTTGGAGGCA CTGTCGGCGG AATCCAGGAG CCCCGACCCC AGTGGTTCCA
701 GTGCGGGAGG CCAGCCCGTT CCTGCAGGGC CTGGGGAGAG CCCACATGGG
751 TGGGAGTCCC CTGCCCTGAA AAAGCTCAGT GCAGAGGCCT CGGCAAGGCA
801 GCCTCAGACC CTAGCTTCCT CCCCAAGATC AAGGCCTGGA GCAGGTGCCC
851 CCGGTGTTGC TCAGGAGCAG TCCTGGCTGG CCGGAGTGTC CACCAAGCCC
901 ACAGTCCCAT CTTCAGAAGC AGGAATCCAG CCAGTCCCTG TCCAGGGAAG
951 CCCAGCTCTG CCAGGGGGCT GTGTACCTAG AAATCATTTC AAGGGGATGT
1001 CCGAAGAT
1 MGGSGVVEVP FLLSSKYDEP SRQVILEALA EFERSTCIRF VTYQDQRDFI
51 SIIPMYGCFS SVGRSGGMQV VSLAPTCLQK GRGIVLHELM HVLGFWHEHT
101 RADRDRYIRV NWNEILPGFE INFIKSQSSN MLTPYDYSSV MHYGRLAFSR
151 RGLPTITPLW APSVHIGQRW NLSASDITRV LKLYGCSPSG PRPRGRGSHA
201 HSTGRSPAPA SLSLQRLLEA LSAESRSPDP SGSSAGGQPV PAGPGESPHG
251 WESPALKKLS AEASARQPQT LASSPRSRPG AGAPGVAQEQ SWLAGVSTKP
301 TVPSSEAGIQ PVPVQGSPAL PGGCVPRNHF KGMSED
1 ATGGAGGGTG TAGGGGGTCT CTGGCCTTGG GTGCTGGGTC TGCTCTCCTT
51 GCCAG
1 MEGVGGLWPW VLGLLSLPG
1 GTGTGATCCT AGGAGCGCCC CTGGCCTCCA GCTGCGCAGG AGCCTGTGGT
51 ACCAGCTTCC CAGATGGCCT CACCCCTGAG GGAACCCAGG CCTCCGGGGA
101 CAAGGACATT CCTGCAATTA ACCAAG
1 VILGAPLASS CAGACGTSFP DGLTPEGTQA SGDKDIPAIN QG
1 GGCTCATCCT GGAAGAAACC CCAGAGAGCA GCTTCCTCAT CGAGGGGGAC
51 ATCATCCGGC CG
1 LILEETPESS FLIEGDIIRP
1 AGTCCCTTCC GACTGCTGTC AGCAACCAGC AACAAATGGC CCATGGGTGG
51 TAGTGGTGTC GTGGAGGTCC CCTTCCTGCT CTCCAGCAAG TACG
1 SPFRLLSATS NKWPMGGSGV VEVPFLLSSK YD
1 ATGAGCCCAG CCGCCAGGTC ATCCTGGAGG CTCTTGCGGA GTTTGAACGT
51 TCCACGTGCA TCAGGTTTGT CACCTATCAG GACCAGAGAG ACTTCATTTC
101 CATCATCCCC ATGTATGG
1 EPSRQVILEA LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYG
1 GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG GATGCAGGTG GTCTCCCTGG
51 CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA TTGTCCTTCA TGAGCTCATG
101 CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG CGGGCCGACC GGGACCGCTA
151 TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC AG
1 CFSSVGRSGG MQVVSLAPTC LQKGRGIVLH ELMHVLGFWH EHTRADRDRY
51 IRVNWNEILP G
1 GCTTTGAAAT CAACTTCATC AAGTCTCGGA GCAGCAACAT GCTGACGCCC
51 TATGACTACT CCTCTGTGAT GCACTATGGG AG
1 FEINFIKSRS SNMLTPYDYS SVMHYGR
1 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
51 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
101 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
151 GAGAG
1 LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG
51 RG
1 GGTCCCATGC CCACAGCACT GGTAGGAGCC CCGCTCCGGC CTCCCTATCT
51 CTGCAGCGGC TTTTGGAGGC ACTGTCGGCG GAATCCAGGA GCCCCGACCC
101 CAGTGGTTCC AGTGCGGGAG GCCAGCCCGT TCCTGCAGGG CCTGGGGAGA
151 GCCCACATGG GTGGGAGTCC CCTGCCCTGA AAAAGCTCAG TGCAGAGGCC
201 TCGGCAAGGC AGCCTCAGAC CCTAGCTTCC TCCCCAAGAT CAAGGCCTGG
251 AGCAGGTGCC CCCGGTGTTG CTCAGGAGCA GTCCTGGCTG GCCGGAGTGT
301 CCACCAAGCC CACAGTCCCA TCTTCAGAAG CAGGAATCCA GCCAGTCCCT
351 GTCCAGGGAA GCCCAGCTCT GCCAGGGGGC TGTGTACCTA GAAATCATTT
401 CAAGGGGATG TCCGAAGAT
1 SHAHSTGRSP APASLSLQRL LEALSAESRS PDPSGSSAGG QPVPAGPGES
51 PHGWESPALK KLSAEASARQ PQTLASSPRS RPGAGAPGVA QEQSWLAGVS
101 TKPTVPSSEA GIQPVPVQGS PALPGGCVPR NHFKGMSED
1 ATGGAGGGTG TAGGGGGTCT CTGGCCTTGG GTGCTGGGTC TGCTCTCCTT
51 GCCAGGTGTG ATCCTAGGAG CGCCCCTGGC CTCCAGCTGC GCAGGAGCCT
101 GTGGTACCAG CTTCCCAGAT GGCCTCACCC CTGAGGGAAC CCAGGCCTCC
151 GGGGACAAGG ACATTCCTGC AATTAACCAA GGGCTCATCC TGGAAGAAAC
201 CCCAGAGAGC AGCTTCCTCA TCGAGGGGGA CATCATCCGG CCGAGTCCCT
251 TCCGACTGCT GTCAGCAACC AGCAACAAAT GGCCCATGGG TGGTAGTGGT
301 GTCGTGGAGG TCCCCTTCCT GCTCTCCAGC AAGTACGATG AGCCCAGCCG
351 CCAGGTCATC CTGGAGGCTC TTGCGGAGTT TGAACGTTCC ACGTGCATCA
401 GGTTTGTCAC CTATCAGGAC CAGAGAGACT TCATTTCCAT CATCCCCATG
451 TATGGGTGCT TCTCGAGTGT GGGGCGCAGT GGAGGGATGC AGGTGGTCTC
501 CCTGGCGCCC ACGTGTCTCC AGAAGGGCCG GGGCATTGTC CTTCATGAGC
551 TCATGCATGT GCTGGGCTTC TGGCACGAGC ACACGCGGGC CGACCGGGAC
601 CGCTATATCC GTGTCAACTG GAACGAGATC CTGCCAGGCT TTGAAATCAA
651 CTTCATCAAG TCTCGGAGCA GCAACATGCT GACGCCCTAT GACTACTCCT
701 CTGTGATGCA CTATGGGAGG CTCGCCTTCA GCCGGCGTGG GCTGCCCACC
751 ATCACACCAC TTTGGGCCCC CAGTGTCCAC ATCGGCCAGC GATGGAACCT
801 GAGTGCCTCG GACATCACCC GGGTCCTCAA ACTCTACGGC TGCAGCCCAA
851 GTGGCCCCAG GCCCCGTGGG AGAGGGTCCC ATGCCCACAG CACTGGTAGG
901 AGCCCCGCTC CGGCCTCCCT ATCTCTGCAG CGGCTTTTGG AGGCACTGTC
951 GGCGGAATCC AGGAGCCCCG ACCCCAGTGG TTCCAGTGCG GGAGGCCAGC
1001 CCGTTCCTGC AGGGCCTGGG GAGAGCCCAC ATGGGTGGGA GTCCCCTGCC
1051 CTGAAAAAGC TCAGTGCAGA GGCCTCGGCA AGGCAGCCTC AGACCCTAGC
1101 TTCCTCCCCA AGATCAAGGC CTGGAGCAGG TGCCCCCGGT GTTGCTCAGG
1151 AGCAGTCCTG GCTGGCCGGA GTGTCCACCA AGCCCACAGT CCCATCTTCA
1201 GAAGCAGGAA TCCAGCCAGT CCCTGTCCAG GGAAGCCCAG CTCTGCCAGG
1251 GGGCTGTGTA CCTAGAAATC ATTTCAAGGG GATGTCCGAA GAT
1 MEGVGGLWPW VLGLLSLPGV ILGAPLASSC AGACGTSFPD GLTPEGTQAS
51 GDKDIPAINQ GLILEETPES SFLIEGDIIR PSPFRLLSAT SNKWPMGGSG
101 VVEVPFLLSS KYDEPSRQVI LEALAEFERS TCIRFVTYQD QRDFISIIPM
151 YGCFSSVGRS GGMQVVSLAP TCLQKGRGIV LHELMHVLGF WHEHTRADRD
201 RYIRVNWNEI LPGFEINFIK SRSSNMLTPY DYSSVMHYGR LAFSRRGLPT
251 ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG RGSHAHSTGR
301 SPAPASLSLQ RLLEALSAES RSPDPSGSSA GGQPVPAGPG ESPHGWESPA
351 LKKLSAEASA RQPQTLASSP RSRPGAGAPG VAQEQSWLAG VSTKPTVPSS
401 EAGIQPVPVQ GSPALPGGCV PRNHFKGMSE D
1 GCGCCCCTGG CCTCCAGCTG CGCAGGAGCC TGTGGTACCA GCTTCCCAGA
51 TGGCCTCACC CCTGAGGGAA CCCAGGCCTC CGGGGACAAG GACATTCCTG
101 CAATTAACCA AGGGCTCATC CTGGAAGAAA CCCCAGAGAG CAGCTTCCTC
151 ATCGAGGGGG ACATCATCCG GCCGAGTCCC TTCCGACTGC TGTCAGCAAC
201 CAGCAACAAA TGGCCCATGG GTGGTAGTGG TGTCGTGGAG GTCCCCTTCC
251 TGCTCTCCAG CAAGTACGAT GAGCCCAGCC GCCAGGTCAT CCTGGAGGCT
301 CTTGCGGAGT TTGAACGTTC CACGTGCATC AGGTTTGTCA CCTATCAGGA
351 CCAGAGAGAC TTCATTTCCA TCATCCCCAT GTATGGGTGC TTCTCGAGTG
401 TGGGGCGCAG TGGAGGGATG CAGGTGGTCT CCCTGGCGCC CACGTGTCTC
451 CAGAAGGGCC GGGGCATTGT CCTTCATGAG CTCATGCATG TGCTGGGCTT
501 CTGGCACGAG CACACGCGGG CCGACCGGGA CCGCTATATC CGTGTCAACT
551 GGAACGAGAT CCTGCCAGGC TTTGAAATCA ACTTCATCAA GTCTCGGAGC
601 AGCAACATGC TGACGCCCTA TGACTACTCC TCTGTGATGC ACTATGGGAG
651 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
701 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
751 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
801 GAGAGGGTCC CATGCCCACA GCACTGGTAG GAGCCCCGCT CCGGCCTCCC
851 TATCTCTGCA GCGGCTTTTG GAGGCACTGT CGGCGGAATC CAGGAGCCCC
901 GACCCCAGTG GTTCCAGTGC GGGAGGCCAG CCCGTTCCTG CAGGGCCTGG
951 GGAGAGCCCA CATGGGTGGG AGTCCCCTGC CCTGAAAAAG CTCAGTGCAG
1001 AGGCCTCGGC AAGGCAGCCT CAGACCCTAG CTTCCTCCCC AAGATCAAGG
1051 CCTGGAGCAG GTGCCCCCGG TGTTGCTCAG GAGCAGTCCT GGCTGGCCGG
1101 AGTGTCCACC AAGCCCACAG TCCCATCTTC AGAAGCAGGA ATCCAGCCAG
1151 TCCCTGTCCA GGGAAGCCCA GCTCTGCCAG GGGGCTGTGT ACCTAGAAAT
1201 CATTTCAAGG GGATGTCCGA AGAT
1 APLASSCAGA CGTSFPDGLT PEGTQASGDK DIPAINQGLI LEETPESSFL
51 IEGDIIRPSP FRLLSATSNK WPMGGSGVVE VPFLLSSKYD EPSRQVILEA
101 LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYGC FSSVGRSGGM QVVSLAPTCL
151 QKGRGIVLHE LMHVLGFWHE HTRADRDRYI RVNWNEILPG FEINFIKSRS
201 SNMLTPYDYS SVMHYGRLAF SRRGLPTITP LWAPSVHIGQ RWNLSASDIT
251 RVLKLYGCSP SGPRPRGRGS HAHSTGRSPA PASLSLQRLL EALSAESRSP
301 DPSGSSAGGQ PVPAGPGESP HGWESPALKK LSAEASARQP QTLASSPRSR
351 PGAGAPGVAQ EQSWLAGVST KPTVPSSEAG IQPVPVQGSP ALPGGCVPRN
401 HFKGMSED
1 MLRLWDFNPG GALSDLALGL RGMEEGGYSC AGACGTSFPD GLTPEGTQAS GDKDIPAINQ
61 GLILEETPES SFLIEGDIIR PSPFRLLSAT SNKWPMGGSG VVEVPFLLSS KYDEPSHQVI
121 LEALAEFERS TCIRFVTYQD QRDFISIIPM YGCFSSVGRS GGMQVVSLAP TCLQKGRGIV
181 LHELMHVLGF WHEHTRADRD RYIRVNWNEI LPGFEINFIK SQSSNMLTPY DYSSVMHYGR
241 LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG RGEWHGRKVT
1 AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC
61 ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC
121 TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA
181 TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCA
241 GAATTAACCC TCACTAAAGG GACTAGTCCT GCAGGTTTAA ACGAATTCGC CCTTAGCCAC
301 AGGCTTAATC TTCGGACATC CCCTTGAAAT GATTTCTAGG TACACAGCCC CCTGGCAGAG
361 CTGGGCTTCC CTGGACAGGG ACTGGCTGGA TTCCTGCTTC TGAAGATGGG ACTGTGGGCT
421 TGGTGGACAC TCCGGCCAGC CAGGACTGCT CCTGAGCAAC ACCGGGGGCA CCTGCTCCAG
481 GCCTTGATCT TGGGGAGGAA GCTAGGGTCT GAGGCTGCCT TGCCGAGGCC TCTGCACTGA
541 GCTTTTTCAG GGCAGGGGAC TCCCACCCAT GTGGGCTCTC CCCAGGCCCT GCAGGAACGG
601 GCTGGCCTCC CGCACTGGAA CCACTGGGGT CGGGGCTCCT GGATTCCGCC GACAGTGCCT
661 CCAAAAGCCG CTGCAGAGAT AGGGAGGCCG GGGCGGGGCT CCTACCAGTG CTGTGGGCAT
721 GGGACCCTCT CCCACGGGGC CTGGGGCCAC TTGGGCTGCA GCCGTAGAGT TTGAGGACCC
781 GGGTGATGTC CGAGGCACTC AGGTTCCATC GCTGGCCGAT GTGGACACTG GGGGCCCAAA
841 GTGGTGTGAT GGTGGGCAGC CCACGCCGGC TGAAGGCGAG CCTCCCATAG TGCATCACAG
901 AGGAGTAGTC ATAGGGCGTC AGCATGTTGC TGCTCTGAGA CTTGATGAAG TTGATTTCAA
961 AGCCTGGCAG GATCTCGTTC CAGTTGACAC GGATATAGCG GTCCCGGTCG GCCCGCGTGT
1021 GCTCGTGCCA GAAGCCCAGC ACATGCATGA GCTCATGAAG GACAATGCCC CGGCCCTTCT
1081 GGAGACACGT GGGCGCCAGG GAGACCACCT GCATCCCTCC ACTGCGCCCC ACACTCGAGA
1141 AGCACCCATA CATGGGGATG ATGGAAATGA AGTCTCTCTG GTCCTGATAG GTGACAAACC
1201 TGATGCACGT GGAACGTTCA AACTCCGCAA GAGCCTCCAG GATGACCTGG CGGCTGGGCT
1261 CATCGTACTT GCTGGAGAGC AGGAAGGGGA CCTCCACGAC ACCACTACCA CCCATGGGCC
1321 ATTTGTTGCT GGTTGCTGAC AGAAGGGCGA ATTCGCGGCC GCTAAATTCA ATTCGCCCTA
1381 TAGTGAGTCG TATTACAATT CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC
1441 TGGCGTTACC CAACTTAATC GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG
1501 CGAAGAGGCC CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTATACG TACGGCAGTT
1561 TAAGGTTTAC ACCTATAAAA GAGAGAGCCG TTATCGTCTG TTTGTGGATG TACAGAGTGA
1621 TATTATTGAC ACGCCGGGGC GACGGATGGT GATCCCCCTG GCCAGTGCAC GTCTGCTGTC
1681 AGATAAAGTC TCCCGTGAAC TTTACCCGGT GGTGCATATC GGGGATGAAA GCTGGCGCAT
1741 GATGACCACC GATATGGCCA GTGTGCCGGT CTCCGTTATC GGGGAAGAAG TGGCTGATCT
1801 CAGCCACCGC GAAAATGACA TCAAAAACGC CATTAACCTG ATGTTCTGGG GAATATAAAT
1861 GTCAGGCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTCACGT AGAAAGCCAG
1921 TCCGCAGAAA CGGTGCTGAC CCCGGATGAA TGTCAGCTAC TGGGCTATCT GGACAAGGGA
1981 AAACGCAAGC GCAAAGAGAA AGCAGGTAGC TTGCAGTGGG CTTACATGGC GATAGCTAGA
2041 CTGGGCGGTT TTATGGACAG CAAGCGAACC GGAATTGCCA GCTGGGGCGC CCTCTGGTAA
2101 GGTTGGGAAG CCCTGCAAAG TAAACTGGAT GGCTTTCTCG CCGCCAAGGA TCTGATGGCG
2161 CAGGGGATCA AGCTCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCATGA TTGAACAAGA
2221 TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG CTATTCGGCT ATGACTGGGC
2281 ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC
2341 GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GAACTGCAAG ACGAGGCAGC
2401 GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC
2461 TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC TCCTGTCATC
2521 TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT GCAATGCGGC GGCTGCATAC
2581 GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGAGCACG
2641 TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT
2701 CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGAGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT
2761 CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATGGCC GCTTTTCTGG
2821 ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC
2881 CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCTTTACGG
2941 TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG
3001 AATTATTAAC GCTTACAATT TCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT
3061 TTCACACCGC ATACAGGTGG CACTTTTCGG GGAAATGTGC GCGGAACCCC TATTTGTTTA
3121 TTTTTCTAAA TACATTCAAA TATGTATCCG CTCATGAGAC AATAACCCTG ATAAATGCTT
3181 CAATAATATT GAAAAAGGAA GAGTATGAGT ATTCAACATT TCCGTGTCGC CCTTATTCCC
3241 TTTTTTGCGG CATTTTGCCT TCCTGTTTTT GCTCACCCAG AAACGCTGGT GAAAGTAAAA
3301 GATGCTGAAG ATCAGTTGGG TGCACGAGTG GGTTACATCG AACTGGATCT CAACAGCGGT
3361 AAGATCCTTG AGAGTTTTCG CCCCGAAGAA CGTTTTCCAA TGATGAGCAC TTTTAAAGTT
3421 CTGCTATGTG GCGCGGTATT ATCCCGTATT GACGCCGGGC AAGAGCAACT CGGTCGCCGC
3481 ATACACTATT CTCAGAATGA CTTGGTTGAG TACTCACCAG TCACAGAAAA GCATCTTACG
3541 GATGGCATGA CAGTAAGAGA ATTATGCAGT GCTGCCATAA CCATGAGTGA TAACACTGCG
3601 GCCAACTTAC TTCTGACAAC GATCGGAGGA CCGAAGGAGC TAACCGCTTT TTTGCACAAC
3661 ATGGGGGATC ATGTAACTCG CCTTGATCGT TGGGAACCGG AGCTGAATGA AGCCATACCA
3721 AACGACGAGC GTGACACCAC GATGCCTGTA GCAATGGCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA
3781 ACTGGCGAAC TACTTACTCT AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT GGAGGCGGAT
3841 AAAGTTGCAG GACCACTTCT GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG GCTGGTTTAT TGCTGATAAA
3901 TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG GTCTCGCGGT ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG
3961 CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT CTACACGACG GGGAGTCAGG CAACTATGGA TGAACGAAAT
4021 AGACAGATCG CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT
4081 TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTCATTTTT AATTTAAAAG GATCTAGGTG
4141 AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA
4201 GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA
4261 ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA
4321 GAGCTACCAA CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT
4381 GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA
4441 TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT
4501 ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG
4561 GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG
4621 CGTGAGCTAT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA
4681 AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT
4741 CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG
4801 TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGGC
4861 TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTTT CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC
4921 CGTATTACCG CCTTTGAGTG AGCTGATACC GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC
4981 GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC GGAAG
1 AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC
61 ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC
121 TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA
181 TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCA
241 GAATTAACCC TCACTAAAGG GACTAGTCCT GCAGGTTTAA ACGAATTCGC CCTTAGCCAC
301 AGGCTTAATC TTCGGACATC CCCTTGAAAT GATTTCTAGG TACACAGCCC CCTGGCAGAG
361 CTGGGCTTCC CTGGACAGGG ACTGGCTGGA TTCCTGCTTC TGAAGATGGG ACTGTGGGCT
421 TGGTGGACAC TCCGGCCAGC CAGGACTGCT CCTGAGCAAC ACCGGGGGCA CCTGCTCCAG
481 GCCTTGATCT TGGGGAGGAA GCTAGGGTCT GAGGCTGCCT TGCCGAGGCC TCTGCACTGA
541 GCTTTTTCAG GGCAGGGGAC TCCCACCCAT GTGGGCTCTC CCCAGGCCCT GCAGGAACGG
601 GCTGGCCTCC CGCACTGGAA CCACTGGGGT CGGGGCTCCT GGATTCCGCC GACAGTGCCT
661 CCAAAAGCCG CTGCAGAGAT AGGGAGGCCG GAGCGGGGCT CCTACCAGTG CTGTGGGCAT
721 GGGACCCTCT CCCACGGGGC CTGGGGCCAC TTGGGCTGCA GCCGTAGAGT TTGAGGACCC
781 GGGTGATGTC CGAGGCACTC AGGTTCCATC GCTGGCCGAT GTGGACACTG GGGGCCCAAA
841 GTGGTGTGAT GGTGGGCAGC CCACGCCGGC TGAAGGCGAG CCTCCCATAG TGCATCACAG
901 AGGAGTAGTC ATAGGGCGTC AGCATGTTGC TGCTCCGAGA CTTGATGAAG TTGATTTCAA
961 AGCCTGGCAG GATCTCGTTC CAGTTGACAC GGATATAGCG GTCCCGGTCG GCCCGCGTGT
1021 GCTCGTGCCA GAAGCCCAGC ACATGCATGA GCTCATGAAG GACAATGCCC CGGCCCTTCT
1081 GGAGACACGT GGGCGCCAGG GAGACCACCT GCATCCCTCC ACTGCGCCCC ACACTCGAGA
1141 AGCACCCATA CATGGGGATG ATGGAAATGA AGTCTCTCTG GTCCTGATAG GTGACAAACC
1201 TGATGCACGT GGAACGTTCA AACTCCGCAA GAGCCTCCAG GATGACCTGG CGGCTGGGCT
1261 CATCGTACTT GCTGGAGAGC AGGAAGGGGA CCTCCACGAC ACCACTACCA CCCATGGGCC
1321 ATTTGTTGCT GGTTGCTGAC AGCAGTCGGA AGGGACTCGG CCGGATGATG TCCCCCTCGA
1381 TGAGGAAGCT GCTCTCTGGG GTTTCTTCCA GGATGAGCCC TTGGTTAATT GCAGGAATGT
1441 CCTTGTCCCC GGAGGCCTGG GTTCCCTCAG GGGTGAGGCC ATCTGGGAAG CTGGTACCAC
1501 AGGCTCCTGC GCAGCTGGAG GCCAGGGGCG CTCCTAGGAT CACACCTGGC AAGGAGAGCA
1561 GACCCAGCAC CCAAGGCCAG AGACCCCCTA CACCCTCCAT GGTAGAAAGG GCGAATTCGC
1621 GGCCGCTAAA TTCAATTCGC CCTATAGTGA GTCGTATTAC AATTCACTGG CCGTCGTTTT
1681 ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC
1741 CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT
1801 GCGCAGCCTA TACGTACGGC AGTTTAAGGT TTACACCTAT AAAAGAGAGA GCCGTTATCG
1861 TCTGTTTGTG GATGTACAGA GTGATATTAT TGACACGCCG GGGCGACGGA TGGTGATCCC
1921 CCTGGCCAGT GCACGTCTGC TGTCAGATAA AGTCTCCCGT GAACTTTACC CGGTGGTGCA
1981 TATCGGGGAT GAAAGCTGGC GCATGATGAC CACCGATATG GCCAGTGTGC CGGTCTCCGT
2041 TATCGGGGAA GAAGTGGCTG ATCTCAGCCA CCGCGAAAAT GACATCAAAA ACGCCATTAA
2101 CCTGATGTTC TGGGGAATAT AAATGTCAGG CATGAGATTA TCAAAAAGGA TCTTCACCTA
2161 GATCCTTTTC ACGTAGAAAG CCAGTCCGCA GAAACGGTGC TGACCCCGGA TGAATGTCAG
2221 CTACTGGGCT ATCTGGACAA GGGAAAACGC AAGCGCAAAG AGAAAGCAGG TAGCTTGCAG
2281 TGGGCTTACA TGGCGATAGC TAGACTGGGC GGTTTTATGG ACAGCAAGCG AACCGGAATT
2341 GCCAGCTGGG GCGCCCTCTG GTAAGGTTGG GAAGCCCTGC AAAGTAAACT GGATGGCTTT
2401 CTCGCCGCCA AGGATCTGAT GGCGCAGGGG ATCAAGCTCT GATCAAGAGA CAGGATGAGG
2461 ATCGTTTCGC ATGATTGAAC AAGATGGATT GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA
2521 GAGGCTATTC GGCTATGACT GGGCACAACA GACAATCGGC TGCTCTGATG CCGCCGTGTT
2581 CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT
2641 GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG
2701 CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT
2761 GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC
2821 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC
2881 GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA
2941 TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG
3001 CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT
3061 GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG
3121 CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC
3181 TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA
3241 TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAATTAT TAACGCTTAC AATTTCCTGA TGCGGTATTT
3301 TCTCCTTACG CATCTGTGCG GTATTTCACA CCGCATACAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT
3361 GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG
3421 AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA
3481 CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC
3541 CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC
3601 ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT
3661 CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC
3721 GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA
3781 CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC
3841 ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG
3901 GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA
3961 CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG
4021 GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA
4081 TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG
4141 GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT
4201 GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT
4261 CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG
4321 CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT
4381 TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT
4441 TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT
4501 TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA
4561 GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC
4621 AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC
4681 AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT
4741 GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG
4801 GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC
4861 TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG
4921 AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG
4981 CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT
5041 GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC
5101 GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG
5161 TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC
5221 CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAG
Claims (16)
- (a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチド;
(b)前記(a)のポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含んでなる、急性肝疾患用のワクチン組成物。 - ポリペプチドを含む、急性肝疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記ポリペプチドが、
(a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドである、医薬組成物。 - 核酸分子を含む、急性肝疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記核酸分子が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
である、医薬組成物。 - ベクターを含む、急性肝疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記ベクターが、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含む、医薬組成物。 - 宿主細胞を含む、急性肝疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記宿主細胞が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含むベクターで形質転換した宿主細胞である、医薬組成物。 - ポリペプチドを含む、アルコール性肝不全を治療するための医薬組成物であって、
前記ポリペプチドが、
(a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドである、医薬組成物。 - 核酸分子を含む、アルコール性肝不全を治療するための医薬組成物であって、
前記核酸分子が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
である、医薬組成物。 - ベクターを含む、アルコール性肝不全を治療するための医薬組成物であって、
前記ベクターが、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含む、医薬組成物。 - 宿主細胞を含む、アルコール性肝不全を治療するための医薬組成物であって、
前記宿主細胞が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含むベクターで形質転換した宿主細胞である、医薬組成物。 - 急性肝疾患の治療用薬物の製造のための、ポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドが、
(a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドである、使用。 - 急性肝疾患の治療用薬物の製造のための、核酸分子の使用であって、
前記核酸分子が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
である、使用。 - 急性肝疾患の治療用薬物の製造のための、ベクターの使用であって、
前記ベクターが、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含む、使用。 - 急性肝疾患の治療用薬物の製造のための、宿主細胞の使用であって、
前記宿主細胞が、以下の精製核酸分子(b)又は(c):
(b)以下のポリペプチド:
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子
を含むベクターで形質転換した宿主細胞である、使用。 - 急性肝疾患の治療措置をモニタリングするための試薬の製造のための、ポリペプチド、又は核酸分子の使用であって、
前記ポリペプチドが、
(a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドであり;
前記核酸分子が、
(b)前記(a)のポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子である、
使用。 - 急性肝疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物の同定方法であって、ポリペプチド、又は核酸分子を、前記ポリペプチド又は核酸分子に対する結合アフィニティーを有すると推測される1種以上の化合物と接触させる工程、及び前記核酸分子又はポリペプチドに特異的に結合する化合物を選択する工程を含み、
前記ポリペプチドが、
(a)ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
配列番号:34に示されるアミノ酸配列を含み若しくは配列番号:34に示されるアミノ酸配列からなり、又は、
配列番号:36に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドであり;
前記核酸分子が、
(b)前記(a)のポリペプチドをコードする精製核酸分子;又は
(c)配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有する、前記(b)の精製核酸分子である、
方法。 - 前記病気が、アルコール性肝不全である、請求項10〜13のいずれか1項に記載の使用。
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