CN113234691A - 一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明所述生物荧光探针(CCK探针)带有能够特异性识别携带Cre‑蛋白酶的神经元的元件，使得所述生物荧光探针能够表达在特异性的神经元；所述CCK探针通过比较所述生物荧光探针荧光强度的变化，能够探索神经元突触CCK神经递质的释放规律。本发明所述CCK探针能够在特定神经元中标记胆囊收缩素并且动态检测其在神经元突触后释放的过程，其能特异性识别突触前后的胆囊收缩素，检测灵敏性高，抗干扰能力强，并且创伤性低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用。
背景技术
胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)，是消化系统中的一种必须的蛋白类激素，可以刺激胃分泌胃酸，肝脏分泌胆汁，抑制回肠吸收钠和水，刺激胰岛释放胰岛素和胰高血糖素，最终促进脂肪和蛋白质的消化。同时，胆囊收缩素也是一种食欲抑制剂，缺少胆囊收缩素会引起过度饮食从而导致肥胖。最近的研究指出，胆囊收缩素同时存在于大脑系统，包括大脑皮层、海马体、下丘脑和杏仁核等部位，但其中枢作用还不明确，初步显示胆囊收缩素与学习与记忆有密切的关系。
目前的研究多集中在胆囊收缩素在海尔默兹症的作用与治疗用途，以及其在情绪疾病，例如抑郁，创伤后应激障碍等患者中的治疗作用。由于胆囊收缩素在脑中的含量十分少，且十分容易降解，因此不容易检测到脑中胆囊收缩素的含量以及其释放的条件，大大影响脑疾病的研究治疗进程。
传统的胆囊收缩素检测技术，例如鼠脑脊液穿刺透析技术合并液相色谱法-质谱连用技术(LC-MS)，其耗时长，灵敏度低，成功率低，且其检测的胆囊收缩浓度维持在皮摩尔级别，大大低于其在脑中的含量(纳摩尔)级别。并且，大多数胆囊收缩素于检测过程中被透析所用的人工脑脊液稀释，不能反映正常或者患病鼠体下胆囊收缩素的含量变化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用，所述生物荧光探针能够在特定神经元中标记胆囊收缩素并且动态检测其在神经元突触后释放的过程，其能特异性识别突触前后的胆囊收缩素，检测灵敏性高，抗干扰能力强，并且创伤性低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针，所述荧光探针包括重组腺病毒探针，所述重组腺病毒探针的制备方法包括：将pH感应性胆囊收缩素蛋白分子插入能够识别特异性Cre-蛋白酶的腺相关病毒的特异位点。
优选的，所述腺相关病毒中能够识别特异性Cre-蛋白酶的元件包括DIO元件。
优选的所述腺相关病毒中还包括特异性标记CCK蛋白分子的元件，所述元件包括CCK-pHluorin元件。
优选的，所述腺相关病毒中还包括感应CCK蛋白分子所处环境的pH变化的元件，所述元件包括CCK-pHluorin元件。
优选的，所述生物荧光探针的结构从3’端至5’端依次包括：AAV9-EF1A-DIO-CCK-pHluorin。
优选的，所述生物荧光探针的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明还提供了上述生物荧光探针在制备动态监测胆囊收缩素释放的工具中的应用。
优选的，所述生物荧光探针的荧光激发波长为470nm，还包括利用515nm的带通滤波器过滤。
本发明提供了一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针(简称CCK探针)，通过比较所述生物荧光探针荧光强度的变化，探索神经元突触CCK神经递质的释放规律，神经元突触前为酸性环境，pH低于7，探针显示高强度荧光；神经元突触后间隙为碱性环境，pH高于7，探针的荧光强度减弱。
本发明所述生物荧光探针带有能够特异性识别携带Cre-蛋白酶的神经元的元件，使得所述生物荧光探针能够表达在特异性的神经元；所述生物荧光探针带有CCK蛋白分子的pH检测元件，使得所述生物荧光探针能够特异性标记CCK蛋白分子，并且根据CCK蛋白分子所处的环境的酸碱变化，呈现出其特定的荧光强度的变化。所述生物荧光探针需要用470nm的荧光激发，用515nm的带通滤波器过滤，显示出绿色荧光；所述生物荧光探针为pH敏感性探针，在pH低的时候，显示高亮度绿色荧光；在pH高的时候，减弱荧光强度。基于上述原理，本发明所述生物荧光探针能够在特定神经元中标记胆囊收缩素并且动态检测其在神经元突触后释放的过程，其能特异性识别突触前后的胆囊收缩素，检测灵敏性高，抗干扰能力强，并且创伤性低。
附图说明
图1为本发明所述生物荧光探针的病毒架构；
图2为包含pH感应性CCK蛋白分子的质粒结构图；
图3为生物荧光探针在不同的条件老鼠上的显色和变化；
图4为生物荧光探针在不同的条件老鼠上的显色和变化，图中HFS表示运用光遗传方法实施的高频率刺激，光遗传方法是使用一种新的光控方法选择并打开了某种生物的一类细胞；在本发明中，使用探针AAV9-Syn-ChrimsonR-tdt(1×1012vg/ml)，在神经元中转入ChrimsonR光控蛋白，后使用激发波长为560nm的激光激活该光控蛋白，从而使神经元产生神经冲动。
具体实施方式
本发明提供了一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针，所述荧光探针包括重组腺病毒探针，所述重组腺病毒探针的制备方法包括：将pH感应性胆囊收缩素蛋白分子(图2)插入能够识别特异性Cre-蛋白酶的腺相关病毒的特异位点。
本发明所述pH感应性胆囊收缩素蛋白分子优选利用图2所述质粒，通过酶切的方法，利用限制性内切酶BspQI和BstBI，将Pish-Cck和pUV-15PhGFP组合在一起，形成CCK-pHluorin。组合后的CCK-pHluorin运用酶切(限制性内切酶BmtI和EcoRI)的方法，插入进AAV9-EF1a-DIO元件中。本发明所述腺相关病毒中还包括CCK-pHluorin元件，能够根据CCK蛋白分子的存在环境的酸碱变化，特异性检测CCK蛋白分子在神经元突触的释放规律。本发明所述Pish-Cck可提供CCK序列，pISH-Cck质粒优选购自Addgene(质粒号105989)，且所述CCK的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示：cgatgggtattcgtagtcctcggcactgcgccggccaaaatccatccagcccatgtagtcccggtcacttattctatggctggggtccaggctctgcaggttcttaagaacggacatgcggccagaaggagctttgcggacctgctggatgtatcgcgctagcagtgcgcccaggcgcgctcggggctcgccgtccgtccggagcacagcccgcagctgccttcggggcgcctcttgcgcccgctgctccacggggtccgtagcttctgcagggactaccggctgcgccagggcgccagcagctaggactgccatcaccacgcacagacatacgccgctcttcat。本发明所述pUV-15PhGFP(Addgene，质粒号70045)可提供pHluorin元件，且所述pHluorin元件的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：ttatttgtatagttcatccatgccatgtgtaatcccagcagctgttacaaactcaagaaggaccatgtggtctctcttttcgttgggatctttcgaaagggcagattgtgtgtgcaggtaatggttgtctggtaaaaggacagggccatcgccaattggagtattttgttgataatggtctgctagttgaacgcctccatcttcaatgttgtggtgaacttgaaagatagctttggtaccattcttttgtttgtctgccatgatgtacaccaagtgctcgttatagttgtattccaatttgtgtccaagaatgtttccatcatctttaaaatcaataccttttaactcgattctattaacaagggtatcaccttcaaacttgacttcagcacgtgtcttgtagttcccgtcatctttgaaaaatatagttctttcctgtacataaccttcgggcatggcactcttgaaaaagtcatgccgtttcatatgatctgggtatcttgaaaagcattgaacaccataagagaaagtagtgacaagtgttggccatggaacaggtagttttccagtagtgcaaataaatttaagggtaagttttccgtatgttgcatcaccttcaccctctccactgacagaaaatttgtgcccattaacatcaccatctaattcaacaagaattgggacaactccagtgaaaagttcttctcctttactcat。由于本发明所述生物荧光探针内包含有pHluorin元件，所以所述生物荧光探针为pH敏感性探针。
本发明所述腺相关病毒(AAV)中能够识别特异性Cre-蛋白酶的元件优选包括DIO元件，所述DIO元件优选来自pJ241-Flex质粒(Addgene，质粒序号18925)，所述DIO元件的的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：gtgtcgtgaggtaccggatcctctagagtcgactccggaataacttcgtataggatactttatacgaagttatgcagaatggtagctggattgtagctgctattagcaatatgaaacctcttaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggcgcgcc。
本发明所述生物荧光探针的结构从3’端至5’端优选依次包括：AAV9-EF1A-DIO-CCK-pHluorin(图1)；且所述生物荧光探针的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。在本发明所述生物荧光探针中，EF1A优选来自于MXS_EF1a质粒(Addgene，质粒号62421)，且所述EF1A的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示：tcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcag。
本发明对所述生物荧光探针的合成方法并没有特殊限定，可由生物公司进行直接合成，在本发明实施例中，所述生物荧光探针委托香港科技大学旗下的病毒制造公司有偿合成。
在本发明中，神经元突触前为酸性环境，pH低于7，所述生物荧光探针显示高强度荧光；神经元突触后间隙为碱性环境，pH高于7，所述生物荧光探针的荧光强度减弱。基于此原理，通过比较CCK探针荧光强度的变化，可以探索神经元突触CCK神经递质的释放规律。本发明所述生物荧光探针优选在470nm的荧光下激发，用515nm的带通滤波器过滤，显示出绿色荧光。本发明所述胆囊收缩素的释放可以通过电刺激神经元，或者通过光遗传技术，搭配特殊的光感基因(ChR2,ChrimsonR等)使用。本发明所述CCK探针，使用前必须存放在-80℃，使用过程必须存放在冰盒中，CCK探针一旦取出融化，不可重用。
本发明还提供了上述生物荧光探针在制备动态监测胆囊收缩素释放的工具中的应用。
本发明所述生物荧光探针的荧光激发波长为470nm，还包括利用515nm的带通滤波器过滤。
本发明还提供了一种利用所述CCK探针动态监测胆囊收缩素释放的方法，包括以下步骤：将所述CCK探针的溶液与光遗传探针的溶液等体积混合，得探针混合液；将所述探针混合液注入脑组织，缝合伤口后一个月，进行荧光观察。
本发明所述光遗传探针的溶液可激发神经元神经活动，本发明所述光遗传探针优选包括AAV9-Syn-ChrimsonR-tdt(1×1012vg/ml)探针，购于美国的Addgene公司；该光感应探针的激发荧光为560nm，搭配用590nm的带通滤波器过滤，显示出红色荧光。本发明所述CCK探针的溶液中所述CCK探针的浓度优选为1×1013vg/ml。
本专利中，使用探针AAV9-Syn-ChrimsonR-tdt(1×1012vg/ml)，在神经元中转入ChrimsonR光控蛋白后，使用激发波长为560nm的激光激活该光控蛋白后，神经元产生神经冲动，产生红色荧光。红色荧光用于标记光感蛋白，绿色荧光用于标记胆囊收缩素；如果没有红色荧光，意味着光感蛋白没有转入成功，也意味着没有神经冲动，胆囊收缩素无法释放。
在本发明实施例中，利用小鼠进行所述动态监测，在进行所述注入前，优选还包括：在距离小鼠大脑脑壳前囟点正中尖端点的位置，向后5.5～6.6mm，向左以及向右3mm位置，分别开一个1mm的洞，刺穿硬脑膜，但不累及脑组织；制造一个玻璃导管，导管尖端为0.1mm，尖端导管长度至少为3cm；抽取液体硅油，充满整个玻璃导管，使用电子注射器，先放出3500nl的硅油，再抽取3500nl的探针混合液；调整电子注射器角度，使得玻璃导管与小鼠大脑的角度为向前8度。本发明所述注入优选包括：借助显微镜，设定玻璃导管的尖端触碰到小鼠的大脑软组织的平面为0mm，以50nl/min的速度分别在大脑两边的脑组织深度为3mm/3.5mm/4mm的位置(此位置为小鼠大脑的第二和第三层的内嗅皮层)，分别注入病毒混合液500nl。
在本发明中，所述CCK探针能够识别特定神经元上的Cre-蛋白酶，使得所述CCK探针只表达在CCK神经元上，并且从位于内嗅皮层的CCK神经元细胞体扩散到大脑的其他区域，包括海马体，其扩散方向跟内嗅皮层CCK神经元的投射方向一致。利用本发明所述CCK探针对CCK进行动态监测，证实CCK的释放受突触前的NMDA受体的控制，并且必须突触前的NMDA受体被激活，才能引起后续的CCK释放。
下面结合实施例对本发明提供的一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.委托香港科技大学旗下的病毒制造公司构建如图2所示的AAV9-EF1A-DIO-CCK-pHluorin，形成图1所示病毒架构的生物荧光探针，溶于水中，得1×1013vg/ml的CCK探针溶液；取出10μL的CCK探针，放于冰盒中。
2.取出等量10μL的光遗传探针，放于冰盒中。本实验使用的光感探针是AAV9-Syn-ChrimsonR-tdt(1×1012vg/ml)探针，购买于美国的Addgene公司。该光感应探针的激发荧光为560nm，搭配用590nm的带通滤波器过滤，显示出红色荧光。
3.将这两种探针1：1(v：v)混合，混匀，共20μL的探针混合液。
4.该实验的对象为6～8周的Grin1fl/fl和CCK-Cre杂交而得出的纯合子小鼠，所用转基因小鼠均购买于美国的Jackson Lab公司。该小鼠的CCK神经元携带Cre-蛋白酶，一旦与Grin1条件性敲除小鼠结合，能够翻转Flox配对元件中间的基因序列，实现CCK神经元上G基因的完全敲除。
5.小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(5.0～9.0mg/100g)进行麻醉，放于实验动物定位仪，进行小鼠头颅固定。
6.小鼠开颅。在距离小鼠大脑脑壳前囟点正中尖端点的位置，向后5.5～6.6mm，向左以及向右3mm位置，分别开一个1mm的洞，刺穿硬脑膜，但不累及脑组织。
7.制造一个玻璃导管，导管尖端为0.1mm，尖端导管长度至少为3cm。
8.抽取液体硅油，充满整个玻璃导管。
9.使用微量电子注射器，先放出3500nl的硅油，再抽取3500nl的探针混合液。
10.调整电子注射器角度，使得玻璃导管与小鼠大脑的角度为向前8度。
11.借助显微镜，设定玻璃导管的尖端触碰到小鼠的大脑软组织的平面为0mm，以50nl/min的速度分别在大脑两边的脑组织深度为3mm、3.5mm和4mm的位置(此位置为第二和第三层的内嗅皮层)，分别注入病毒混合液500nl。
12.缝合小鼠大脑，等待1个月的恢复期。
13.小鼠开脑，活切带有海马体的脑切片，培养在带氧气的人工脑脊液中。
14.应用尼康的双激光荧光显微镜，观察活脑切片的荧光活动。
由于注射用的探针为腺病毒探针，能够设别Cre-蛋白酶，使得探针只表达在CCK神经元上，并且从位于内嗅皮层的CCK神经元细胞体扩散到大脑的其他区域，包括海马体，其扩散方向跟内嗅皮层CCK神经元的投射方向一致。用470nm激光激发海马体上的CCK神经元突触上的CCK探针，显示出绿色的荧光信号；用高频率560nm激光激活海马体上广泛神经元突触的光感基团，显示出红色的荧光信号。
通过绿色荧光信号的强弱对比，可以探测出神经递质CCK的释放情况，CCK探针在不同的条件老鼠上的显色和变化如图3和图4所示，所述CCK探针特异性地标记了海马的CCK蛋白(来源于内嗅皮层的CCK神经元)，且CCK的释放受突触前的NMDA受体的控制，并且必须突触前的NMDA受体被激活，才能引起后续的CCK释放。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黄燕婷
<120> 一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6659
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtaagct ttgcaaagat ggataaagtt 180
ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 240
tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 300
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 360
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 420
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 480
cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 540
tacttccact ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 600
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 660
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 720
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 780
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 840
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 900
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 960
ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 1020
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 1080
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 1140
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 1200
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1260
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1320
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1380
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gtaccggatc ctctagagtc 1440
gactccggaa taacttcgta taggatactt tatacgaagt tatgcagaat ggtagctgga 1500
ttgtagctgc tattagcaat atgaaacctc ttaataactt cgtatagcat acattatacg 1560
aagttatggc gcgccttatt tgtatagttc atccatgcca tgtgtaatcc cagcagctgt 1620
tacaaactca agaaggacca tgtggtctct cttttcgttg ggatctttcg aaagggcaga 1680
ttgtgtgtgc aggtaatggt tgtctggtaa aaggacaggg ccatcgccaa ttggagtatt 1740
ttgttgataa tggtctgcta gttgaacgcc tccatcttca atgttgtggt gaacttgaaa 1800
gatagctttg gtaccattct tttgtttgtc tgccatgatg tacaccaagt gctcgttata 1860
gttgtattcc aatttgtgtc caagaatgtt tccatcatct ttaaaatcaa taccttttaa 1920
ctcgattcta ttaacaaggg tatcaccttc aaacttgact tcagcacgtg tcttgtagtt 1980
cccgtcatct ttgaaaaata tagttctttc ctgtacataa ccttcgggca tggcactctt 2040
gaaaaagtca tgccgtttca tatgatctgg gtatcttgaa aagcattgaa caccataaga 2100
gaaagtagtg acaagtgttg gccatggaac aggtagtttt ccagtagtgc aaataaattt 2160
aagggtaagt tttccgtatg ttgcatcacc ttcaccctct ccactgacag aaaatttgtg 2220
cccattaaca tcaccatcta attcaacaag aattgggaca actccagtga aaagttcttc 2280
tcctttactc atcgatgggt attcgtagtc ctcggcactg cgccggccaa aatccatcca 2340
gcccatgtag tcccggtcac ttattctatg gctggggtcc aggctctgca ggttcttaag 2400
aacggacatg cggccagaag gagctttgcg gacctgctgg atgtatcgcg ctagcagtgc 2460
gcccaggcgc gctcggggct cgccgtccgt ccggagcaca gcccgcagct gccttcgggg 2520
cgcctcttgc gcccgctgct ccacggggtc cgtagcttct gcagggacta ccggctgcgc 2580
cagggcgcca gcagctagga ctgccatcac cacgcacaga catacgccgc tcttcatgct 2640
agcataactt cgtataaagt atcctatacg aagttatttg ccttaaccca gaaattatca 2700
ctgttattct ttagaatggt gcaaagaata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 2760
tgaattcgat atcaagctta tcgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 2820
gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 2880
tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 2940
gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 3000
tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 3060
cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 3120
ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 3180
atcatcgtcc tttccttggc tgctcgccta tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 3240
cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 3300
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 3360
ggccgcctcc ccgcatcgat accgagcgct gctcgagaga tctacgggtg gcatccctgt 3420
gacccctccc cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt 3480
gtcctaataa aattaagttg catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg 3540
gggtggaggg gggtggtatg gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc 3600
ggggtctatt gggaaccaag ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc 3660
gcctcctggg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca 3720
tgcatgacca ggctcagcta atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg 3780
gccaggctgg tctccaactc ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg 3840
ctgggattac aggcgtgaac cactgctccc ttccctgtcc ttctgatttt gtaggtaacc 3900
acgtgcggac cgagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc 3960
gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 4020
gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt 4080
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc 4140
gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 4200
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 4260
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 4320
tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc 4380
gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 4440
cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg 4500
gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 4560
gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc 4620
tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 4680
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 4740
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg 4800
cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 4860
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 4920
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 4980
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ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5100
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agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 5220
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 5280
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 5340
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 5400
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 5460
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 5520
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 5580
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 5640
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 5700
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 5760
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 5820
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5880
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 5940
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6000
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6060
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6120
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 6180
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 6240
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 6300
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 6360
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 6420
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 6480
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cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 6600
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 6659
<210> 2
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gtgtcgtgag gtaccggatc ctctagagtc gactccggaa taacttcgta taggatactt 60
tatacgaagt tatgcagaat ggtagctgga ttgtagctgc tattagcaat atgaaacctc 120
ttaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatggc gcgcc 165
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ttatttgtat agttcatcca tgccatgtgt aatcccagca gctgttacaa actcaagaag 60
gaccatgtgg tctctctttt cgttgggatc tttcgaaagg gcagattgtg tgtgcaggta 120
atggttgtct ggtaaaagga cagggccatc gccaattgga gtattttgtt gataatggtc 180
tgctagttga acgcctccat cttcaatgtt gtggtgaact tgaaagatag ctttggtacc 240
attcttttgt ttgtctgcca tgatgtacac caagtgctcg ttatagttgt attccaattt 300
gtgtccaaga atgtttccat catctttaaa atcaatacct tttaactcga ttctattaac 360
aagggtatca ccttcaaact tgacttcagc acgtgtcttg tagttcccgt catctttgaa 420
aaatatagtt ctttcctgta cataaccttc gggcatggca ctcttgaaaa agtcatgccg 480
tttcatatga tctgggtatc ttgaaaagca ttgaacacca taagagaaag tagtgacaag 540
tgttggccat ggaacaggta gttttccagt agtgcaaata aatttaaggg taagttttcc 600
gtatgttgca tcaccttcac cctctccact gacagaaaat ttgtgcccat taacatcacc 660
atctaattca acaagaattg ggacaactcc agtgaaaagt tcttctcctt tactcat 717
<210> 4
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt 60
ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 120
ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt 180
caaagttttt ttcttccatt tcag 204
<210> 5
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cgatgggtat tcgtagtcct cggcactgcg ccggccaaaa tccatccagc ccatgtagtc 60
ccggtcactt attctatggc tggggtccag gctctgcagg ttcttaagaa cggacatgcg 120
gccagaagga gctttgcgga cctgctggat gtatcgcgct agcagtgcgc ccaggcgcgc 180
tcggggctcg ccgtccgtcc ggagcacagc ccgcagctgc cttcggggcg cctcttgcgc 240
ccgctgctcc acggggtccg tagcttctgc agggactacc ggctgcgcca gggcgccagc 300
agctaggact gccatcacca cgcacagaca tacgccgctc ttcat 345
Claims (8)
1.一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针，其特征在于，所述生物荧光探针包括重组腺病毒探针，所述重组腺病毒探针的制备方法包括：将pH感应性胆囊收缩素蛋白分子插入能够识别特异性Cre-蛋白酶的腺相关病毒的特异位点。
2.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于，所述腺相关病毒中能够识别特异性Cre-蛋白酶的元件包括DIO元件。
3.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于，所述腺相关病毒中还包括特异性标记CCK蛋白分子的元件，所述元件包括CCK-pHluorin元件。
4.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于，所述腺相关病毒中还包括感应CCK蛋白分子所处环境的pH变化的元件，所述元件包括CCK-pHluorin元件。
5.根据权利要求1～4任一项所述生物荧光探针，其特征在于，所述生物荧光探针的结构从3’端至5’端依次包括：AAV9-EF1A-DIO-CCK-pHluorin。
6.根据权利要求5所述生物荧光探针，其特征在于，所述生物荧光探针的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
7.权利要求1～6任一项所述生物荧光探针在制备动态监测胆囊收缩素释放的工具中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述生物荧光探针的荧光激发波长为470nm，还包括利用515nm的带通滤波器过滤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110516825.9A CN113234691B (zh) | 2021-05-12 | 2021-05-12 | 一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| CN113234691B CN113234691B (zh) | 2024-05-28 |
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ID=77133602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN109880807A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-14 | 中国科学院武汉物理与数学研究所 | 神经细胞稀疏高亮度标记重组腺相关病毒的包装方法及其应用 |
| KR102070176B1 (ko) * | 2018-08-09 | 2020-01-28 | 재단법인대구경북과학기술원 | 신경회로 연결망을 검출할 수 있는 이중표지 바이러스 벡터 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-05-12 CN CN202110516825.9A patent/CN113234691B/zh active Active
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113234691B (zh) | 2024-05-28 |
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