JP2007319084A - 含硫アミノ酸残基が酸化された酸化型ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】システインおよびメチオニンからなる群から選ばれる含硫アミノ酸を含むポリペプチドを酸化して、システインスルホン酸もしくはその塩およびメチオニンスルフォキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1個の酸化型含硫アミノ酸を含む酸化型ポリ
ペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換宿主の培養物を酸化剤で処理し、酸化型ポリペプチドを回収することを特徴とする、酸化型ポリペプチドの製造方法。
【選択図】図1
Description
されたDJ-1またはその改変体の製造方法に関する。
変異(166番目のロイシンがプロリンに変異)産物と同一であることが判明した(非特許
文献2)。
目のシステインが酸化されてスルフィン酸(SO2H)になることを示唆している。また
、特許文献1は、106位のシステイン残基がシステインするフィン酸またはシステインス
ルホン酸に酸化された酸化型ヒトDJ-1を開示する。
みた。ところが、この方法では、106位のシステイン残基が酸化されたDJ-1はほとんど得
られなかった。
々検討した結果、意外にも組換えDJ-1を有する宿主を培養した培養物を酸化剤で処理することにより、106位のシステイン残基が酸化されたDJ-1が容易に得られることを見出した
。そしてこの方法は、DJ-1に限らず、システインまたはメチオニンを有するポリペプチドにおいて同様に適用可能であり、酸化型ポリペプチドが収率よく得られることを見出した。
1. システインおよびメチオニンからなる群から選ばれる含硫アミノ酸を含むポリペプチドを酸化して、システインスルホン酸もしくはその塩およびメチオニンスルフォキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1個の酸化型含硫アミノ酸を含む酸化型ポリペプチ
ドを生産する方法であって、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換宿主の培養物を酸化剤で処理し、酸化型ポリペプチドを回収することを特徴とする、酸化型ポリペプチドの製造方法。
2. 含硫アミノ酸を含むポリペプチドがDJ-1又はその改変体であり、酸化型ポリペプチドがDJ-1の106位に対応するシステイン残基がシステインスルホン酸残基に酸化された酸
化型DJ-1又はその改変体である、項1に記載の方法。
3. 酸化剤が過酸化水素である項1または2に記載の方法。
4. DJ-1がヒトDJ-1である、項2に記載の方法。
5. 形質転換宿主が、前記ポリペプチドをコードするDNAを保有する発現ベクターで形質転換された大腸菌である、項1〜4のいずれかに記載の方法。
6. 酸化剤の濃度が0.5〜500mMであることを特徴とする、項1〜5のいずれかに記載の方法。
のアミノ酸が置換、付加、欠失、挿入された改変体であってもよい。
残基から酸化することができ、1残基のみを酸化することも可能であり、2残基以上を酸化することも可能であり、酸化される残基の数は酸化の条件(酸化剤の種類、使用量、反応
時間、pHなど)に応じて変えることができる。
例示される。
に46位もしくは53位のシステイン残基が酸化されていてもよい。ヒト以外の哺乳動物由来のDJ-1の場合には、ヒトDJ-1の106位に対応するシステイン残基がシステインスルホン酸
に酸化されたものを酸化型DJ-1またはその改変体という。ヒトDJ-1の106位に対応するシ
ステイン残基がシステインスルホン酸に酸化されている限り、他のアミノ酸残基がさらに酸化されていてもよい。
、抗体により認識される立体構造を保持するように置換、付加、欠失または挿入されていてもよい。例えばDJ-1改変体は、46位及び/または53位のシステイン残基が他のアミノ酸(例えばSer)に置換されていてもよい。
酸化されて、酸化型のDJ-1誘導体となる。このDJ-1の酸化は生理的条件下で生じているものである。
ドの106位に対応するシステイン残基をシステインスルホン酸に酸化し、これを動物に投
与するなどの常法に従い該酸化型ペプチドを認識する抗体を得ることはできるが、該抗体はヒト生体内の酸化ストレスにより産生される酸化型DJ-1を十分に認識することはできない。一方、本発明の方法により得られた酸化型ヒトDJ-1またはその改変体を使用すれば、酸化型ヒトDJ-1を認識する抗体を容易に得ることができる。また、得られた抗体の酸化型DJ-1に対する特異性を評価する際にも、本発明の酸化型DJ-1またはその改変体を好ましく使用することができる。これにより、酸化型DJ-1抗体を使用したELISAキット、パーキン
ソン病やアルツハイマー病、動脈硬化など酸化ストレスが関連する疾患の診断薬を開発することが可能になる。
イン残基が選択的にシステインスルホン酸に酸化された酸化型ヒトDJ-1は、酸化ストレスに関連する疾患、特にパーキンソン病やアルツハイマー病、動脈硬化などの治療薬として有用である可能性がある。
材料と方法
細胞:ヒトDJ-1(ヒスチジンタグを付けたnativeまたはCys46とCys53をSerに変えたダブ
ルミュータント)をコードするプラスミドをトランスフェクトした大腸菌を使用した。大腸菌の培養には、LB培地を用いた。
実験方法:以下のプロトコールに従い、酸化型DJ-1を作製した。
ヒトDJ-1をトランスフェクトした大腸菌(蛋白量70μg/ml)に、0〜500mM過酸化水素を加え、37℃、15分間反応した。反応後、酸化剤処理した大腸菌を可溶化し、Ni-NTAカラムに添加した。カラムを洗浄後、イミダゾールで溶出し、溶出画分に含まれる蛋白質をSDS-PAGEで分離した。分離した蛋白質をゲルから切り出し、トリプシンを用いたゲル内消化によりペプチド断片とした。このペプチド混合物をナノスプレーイオン化LC-MS/MSシステムに導入し、Cys106を含むペプチドを同定・定量した。
実施例1
Cys46とCys53をSerに変えたダブルミュータントヒトDJ-1を発現した大腸菌を、0または500 mM過酸化水素で処理し、上記のプロトコールに従い精製した(図1)。認められた主要なバンドを切り出し、Cys106を含むペプチドを同定・定量した(図2)。500 mM過酸化水素処理により、Cys106が高度に酸化されていることがわかった。
実施例2
native DJ-1を発現した大腸菌に、0、50、500 mMの過酸化水素を加えて反応後、同様のプロトコールで、精製した。酸化型DJ-1に相当するバンドを切り出し、LC-MS/MS解析を行って、各Cysを含むペプチドを同定・定量した(図3)。Cys106は、50 mM過酸化水素でもCys106が高度に酸化されていることがわかった。
Claims (6)
- システインおよびメチオニンからなる群から選ばれる含硫アミノ酸を含むポリペプチドを酸化して、システインスルホン酸もしくはその塩およびメチオニンスルフォキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1個の酸化型含硫アミノ酸を含む酸化型ポリペプチドを生
産する方法であって、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換宿主の培養物を酸化剤で処理し、酸化型ポリペプチドを回収することを特徴とする、酸化型ポリペプチドの製造方法。 - 含硫アミノ酸を含むポリペプチドがDJ-1又はその改変体であり、酸化型ポリペプチドがDJ-1の106位に対応するシステイン残基がシステインスルホン酸残基に酸化された酸化型DJ-1又はその改変体である、請求項1に記載の方法。
- 酸化剤が過酸化水素である請求項1または2に記載の方法。
- DJ-1がヒトDJ-1である、請求項2に記載の方法。
- 形質転換宿主が、前記ポリペプチドをコードするDNAを保有する発現ベクターで形質転換された大腸菌である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 酸化剤の濃度が0.5〜500mMであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
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WO2005075513A1 (ja) * | 2004-02-04 | 2005-08-18 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | システイン残基が酸化されたdj-1誘導体 |
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