JP2003300906A - がん転移抑制因子の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトがん転移抑制遺伝子として同定されたKi
SS-1に関連したメタスチンあるいはメタスチン(45-54)
が有する癌転移抑制活性がどの様に制御されているの
か、特にどの様にして不活性化されるかを解明し、もっ
て癌細胞・癌組織に作用せしめて効率良く癌転移抑制を
達成することが求められている。 【解決手段】 MMPsが、KiSS-1タンパク質であるメタス
チンの118位グリシンと119位ロイシン間を切断するこ
と、この切断によってメタスチンの転移抑制機能が不活
性化されること、MMP阻害剤によるメタスチンの安定
化、MMP阻害剤で安定化したメタスチンによる癌転移抑
制、MMPsのメタスチン切断部位に変異を導入したMMPs耐
性メタスチンなどを提供でき、さらにMMPs耐性メタスチ
ンによる癌転移抑制が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、がん転移抑制因子
の安定化技術に関する。本発明は、安定化されたがん転
移抑制因子を使用するがんの浸潤・転移の阻害などに関
する医薬や治療法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】マトリックスメタロプロテアーゼ類(mat
rix metalloproteinases: MMPs) は、一群のZn²⁺依存性
の酵素で、細胞外マトリックス(extracellular matrix:
ECM)タンパク質を生理的あるいは病理的な状態下で切
断する。これまでに、数多くの哺乳類MMPsがcDNAクロー
ニングによりアミノ酸レベルまで解析されている。例え
ば、MMP-1 (collagenase); MMP-2 (gelatinase A); MMP
-3 (stromelysin-1); MMP-7 (matrilysin); MMP-8 (neu
trophil collagenase); MMP-9 (gelatinase B);MMP-10
(stromelysin-2); MMP-11 (stromelysin-3); MMP-12 (m
acrophage elastase); MMP-13 (collagenase-3); MMP-1
4 (MT1-MMP); MMP-15 (MT2-MMP); MMP-16(MT3-MMP); MM
P-17 (MT4-MMP); MMP-19; MMP-20 (enamelysin); MMP-2
4 (MT5-MMP); MMP-25 (MT6-MMP) などである。MMPは、
種々の悪性腫瘍で過剰発現し、ECM成分を分解すること
により腫瘍の浸潤・転移に貢献する。それゆえ、MMPの
発現レベルは、腫瘍の浸潤能あるいは悪性度と相関す
る。最近の研究によると、MMPはECM構成成分だけではな
く、細胞表面のリセプターやリガンドのような非マトリ
ックスタンパク質も切断することが示されてきた。

【０００３】ヒトがん転移抑制遺伝子として同定された
KiSS-1は、ヒトメラノーマや乳癌の転移を抑制する。Ki
SS-1遺伝子の発現により、ヒト悪性黒色細胞腫細胞やヒ
ト乳癌細胞の転移が抑制されることが知られているが、
その抑制作用のメカニズム等は不明であった。KiSS-1の
C-末端に位置する68位のグリシンから121位のフェニル
アラニンの、54個のアミノ酸残基からなるアミド化ペプ
チドが、ヒト胎盤からGタンパク質共役型オーファン受
容体(hOT7T175)の内因性リガンドとして単離され、これ
らがhOT7T175を導入したB16-BL6細胞の転移を抑制した
ことから「メタスチン(metastin)」と命名された(Natur
e, 411: 613 (2001)) 。メタスチンのC-末端側ペプチド
であるメタスチン(45-54) は、メタスチンのおよそ10倍
の癌転移抑制活性を示した。このメタスチン(45-54)
は、 KiSS-1(112-121) (J. Biol. Chem., 276, 28969-2
8969 (2001))、あるいは Kisspeptin-10 (J. Biol. Che
m.,276, 34631-34636 (2001))とも呼ばれている。

【０００４】メタスチンあるいはメタスチン(45-54)の
代謝に関する報告はなく、メタスチンあるいはメタスチ
ン(45-54)の有するがん転移抑制活性の維持に関する知
見もない。癌細胞・癌組織においては、MMPが過剰発現
していることが知られているが、タンパク質レベルでの
MMPとメタスチンあるいはメタスチン(45-54)の関連を示
す報告はなく、遺伝子レベルでKiSS-1がMMP-9の発現を
抑制するとの報告があるのみである(J. Biol. Chem., 2
76, 34631-34636 (2001)) 。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】癌細胞・癌組織では、
多様なプロテアーゼが発現していることが知られてい
る。特に、MMPsは、多くの癌細胞・癌組織で過剰発現
し、腫瘍の浸潤能あるいは悪性度と相関するする重要な
プロテアーゼ群である。メタスチンあるいはメタスチン
(45-54)が、その癌転移抑制活性を発揮するためには、
作用する癌細胞・癌組織の近傍に安定して到達、作用す
ることが必要であるが、この過程におけるMMPの関与は
明らかでなかった。メタスチンあるいはメタスチン(45-
54)の癌転移抑制活性を保持し、癌細胞・癌組織に作用
させることは、癌転移抑制を効率良く達成するために重
要な課題である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】発現クローニング法は、
MT1-MMPを介したプロMMP-2の活性化に関与する遺伝子の
検索だけではなく、プロMMP-2あるいはプロMMP-9に相互
作用する遺伝子のスクリーニングにも有効である。本発
明者らは、発現クローニング法を用いた研究の結果、Ki
SS-1遺伝子産物がMMPsと安定な複合体を形成することを
見出すことに成功した。さらに活性型MMPsが、KiSS-1タ
ンパク質の118位グリシンと119位ロイシン間を切断する
こと、この切断によってメタスチンの転移抑制機能が不
活性化されることを明らかにすることに成功した。これ
らの知見に基づき、MMP阻害剤 (MMP inhibitors: MMPI
s)の新規な用途、MMP阻害剤によるメタスチンの安定
化、MMP阻害剤で安定化したメタスチンによる癌転移抑
制、MMPsのメタスチン切断部位に変異を導入したMMPs耐
性メタスチン、さらにMMPs耐性メタスチンによる癌転移
抑制に関する発明を完成させた。

【０００７】本発明は、 〔１〕 がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、
メタスチン(45-54)及びそれと実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものに対するMMPsによる切断を阻害する
ものであることを特徴とする切断阻害剤； 〔２〕 切断阻害剤がMMP阻害剤であることを特徴とす
る上記〔１〕記載の阻害剤； 〔３〕 (1) MMP阻害剤及び(2) (i) がん転移抑制遺伝
子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそ
れと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものから成
る群から選ばれたものとを含有していることを特徴とす
るKiSS-1産物及びメタスチン並びにその誘導体の安定化
組成物； 〔４〕 (i) がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチ
ン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するものから成る群から選ばれたものを
MMP阻害剤により安定化することを特徴とするKiSS-1産
物並びにメタスチン及びその誘導体の安定化法； 〔５〕 (1) MMP阻害剤及び(2) (i) がん転移抑制遺伝
子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそ
れと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものから成
る群から選ばれたものとを含有しており、がん転移抑制
活性を有することを特徴とする安定化がん転移抑制剤； 〔６〕 (i) がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチ
ン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するものから成る群から選ばれたものを
MMP阻害剤により安定化することを特徴とするがん転移
抑制剤の安定化法； 〔７〕 がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、
メタスチン(45-54)及びそれと実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものから成る群から選ばれたものである
が、MMPsから成る群から選ばれたものの切断に対して抵
抗性が付与されているかあるいはMMPsから成る群から選
ばれたものの切断部位に変異を導入したものであること
を特徴とする変異KiSS-1タンパク質並びに変異メタスチ
ン及びその誘導体；

【０００８】〔８〕 配列番号:1のGly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ の間
でのMMP の切断に対して抵抗性であるかあるいは該切断
部位Gly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ に変異を有していることを特徴とす
る上記〔７〕記載の変異KiSS-1タンパク質並びに変異メ
タスチン及びその誘導体；

〔９〕 上記〔７〕又は〔８〕記載の変異KiSS-1タンパ
ク質並びに変異メタスチン及びその誘導体から成る群か
ら選ばれたものを有効成分として含有することを特徴と
する医薬； 〔10〕 がん転移抑制のためのものであることを特徴と
する上記

〔９〕記載の医薬；及び 〔11〕 (1) MMPsから成る群から選ばれたもの及び(2)
がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチ
ン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するものから成る群から選ばれたものに対するレセプ
ターとの共存下に、試験試料を、転移性細胞と接触せし
めることを特徴とするがん転移抑制剤のスクリーニング
方法並びにそのための試薬； 〔12〕 (1) MMPsから成る群から選ばれたもの及び(2)
がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチ
ン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するものから成る群から選ばれたものに対するレセプ
ターとを共発現する細胞に、試験試料を接触せしめるこ
とを特徴とする上記〔11〕記載のがん転移抑制剤のスク
リーニング方法並びにそのための試薬；及び 〔13〕 MMP阻害剤が、WO, A, 00/03703, WO, A, 00/03
734, WO, A, 01/092507及びそこに引用した文献に開示
のものから成る群から選ばれたものであることを特徴と
する上記〔２〕記載の阻害剤を提供している。

【０００９】本発明のその他の目的、特徴、優秀性及び
その有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明
白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実
施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ま
しい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されて
いるものであることを理解されたい。本明細書に開示し
た本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改
変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明
細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易
に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特
許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているも
ので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに
含めて解釈されるべきものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明で、(1) ヒト癌転移抑制遺
伝子KiSS-1産物は、MMP と相互作用して切断され、その
活性を失うこと、(2) 例えばMT3-MMP はKiSS-1タンパク
質をそのＣ末端のLRF 配列の前で切断すること、さらに
は(3) 該LRF 配列の前のアミノ酸残基（例えば、グリシ
ン）を、別のアミノ酸残基（例えば、ロイシンなど）に
置換した変異KiSS-1タンパク質（KiSS-1タンパク質変異
体）は、MT3-MMP による切断に対して抵抗性のものであ
ること、(4) メタスチン(metastin)レセプターを発現し
ている細胞では、メタスチンで処理することにより、細
胞運動の低下をまねくアクチンストレスファイバーとフ
ォーカルアドヒージョン(focal adhesion)形成が起こる
が、一方metastinレセプター及びMT1-MMP を発現させた
細胞では、メタスチンの効果がなくなることが見出され
た。こうした知見を利用する技術はすべて本発明の思想
の範囲内である。

【００１１】本発明で、潜在型MMP-9 とKiSS-1タンパク
質との複合体が、110 kDa のゼラチン分解活性に寄与し
ていること、KiSS-1タンパク質は潜在型MMP-2 とも複合
体を形成するが、一方活性型MMP-2 とはしていないこ
と、KiSS-1タンパク質のCys⁵³とMMP に存在するPRCGVPD
配列中のCys 残基がS-S 結合をすることが示唆されて
いること、MMP の作用によりKiSS-1タンパク質はGly¹¹⁸
-Leu¹¹⁹ の間で切断されること、さらにKiSS-1タンパク
質の68-121の54個のアミノ酸からなるＣ末端がアミド化
されたペプチド（Ｇ蛋白質共役型レセプター(G protein
-coupled receptor) hOT7T175 のリガンドとして同定さ
れていることが報告されている) であるメタスチンのＣ
末端の10個のアミノ酸からなるメタスチン(45-54)(meta
stin (45-54)) はさらに強力なリガンドと報告されてい
るが、そのペプチドもMMP の作用により効率良く分解さ
れること、これらのことからMMP による癌転移抑制因子
KiSS-1/metastin 分解活性は、転移に促進的に働くと推
測されること、さらに癌転移抑制因子KiSS-1/metastin
を安定化せしめる手法が開発できること、MMP阻害剤を
使用すれば癌転移抑制因子KiSS-1/metastin を安定化可
能であること、安定性に優れたKiSS-1/metastin 変異体
やKiSS-1/metastin 誘導体を開発でき、様々な医薬用途
などその生物活性などを利用した応用ができることを認
識している。したがって、こうした知見を利用する技術
もすべて本発明の思想の範囲内である。本発明で言及す
るメタスチン、メタスチン(45-54) 、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター hOT7T175 については、例えば Nature, 411:
613 (2001); J. Biol. Chem.,276: 28969 (2001);特開
平2000-312590 号公報; 特開平2001-340094 号公報など
を参照することができ、それらの中にある記載はそれを
参照することにより本明細書の開示に含められる。

【００１２】本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用
して所定の核酸を単離・配列決定したり、組換え体を作
製したり、所定のペプチドを得ることができる。本明細
書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で
知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook, E. F.
Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Labor
atory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor La
boratory Press, ColdSpring Harbor, New York (198
9); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning",2nd e
d., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series),
IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化
学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東
京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講
座２、核酸III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1
992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68
(Recombinant DNA), Academic Press, New York (198
0); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vo
l. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinan
t DNA, Part C), Academic Press, New York (1983);
R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 15
3 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA,
Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic
Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Method
s in Enzymology",Vol. 204, Academic Press, New Yor
k (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymolog
y", Vol. 218, Academic Press, New York (1993)など
に記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法
あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げら
れる（それらの中にある記載はそれを参照することによ
り本明細書の開示に含められる) 。

【００１３】本明細書で用いる用語「ポリペプチド」と
しては、以下に記載するような如何なるポリペプチドを
指すものであってもよい。ポリペプチドの基本的な構造
は周知であり、当該技術分野において非常に数多くの参
考書及びその他の刊行物に記載がある。こうしたことに
鑑み、本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプ
チド結合又は修飾したペプチド結合により互いに結合し
ているような２個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意の
ペプチド又は任意のタンパク質を意味する。本明細書で
用いる用語「ポリペプチド」としては、当該分野におい
て、例えばペプチド、オリゴペプチドあるいはペプチド
オリゴマーとも称せられる短い鎖のもの、及びタンパク
質と一般的に言われ、多くの形態のものが知られている
長い鎖のものの両方を通常意味してよい。ポリペプチド
は、しばしば、通常、天然型アミノ酸（天然に存在して
いるアミノ酸: あるいは遺伝子でコードされるアミノ
酸）と称されるアミノ酸以外のアミノ酸を含有していて
もよい。ポリペプチドは、また末端アミノ酸残基を含め
て、その多くのアミノ酸残基が翻訳された後にプロセッ
シング及びその他の改変（あるいは修飾）されるといっ
た天然の工程によるのみならず、当業者に周知の化学的
改変技術によっても、上記のポリペプチドはそれが改変
（修飾）できることは理解されよう。該ポリペプチドに
加えられる改変（修飾）については、多くの形態のもの
が知られており、それらは当該分野の基礎的な参考書及
びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記
載されており、これらは当業者に周知である。幾つかの
とりわけ常套的な改変・修飾としては、例えばアルキル
化、アシル化、エステル化、アミド化、グリコシル化、
脂質結合、硫酸化、リン酸化、グルタミン酸残基のγ−
カルボキシル化、水酸化及びADP-リボシル化等が挙げら
れ、例えばT. E. Creighton, Proteins-Structureand M
olecular Properties, Second Edition, W. H. Freeman
and Company, NewYork, (1993); B.C.Johnson (Ed.),
Posttranslational Covalent Modification of Protein
s, Academic Press, New York, (1983) (Wold, F., "Po
sttranslational Protein Modifications: Perspective
and Prospects", pp.1-12); Seifter et al., "Analys
is for Protein Modifications and nonprotein cofact
ors", Methods in Enzymology, 182: 626-646 (1990);
Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslation
al Modification and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci.,
663: p.48-62 (1992)等の記載を参照できる。

【００１４】本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチ
ド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド
配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖
を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互
いの適合関係において同一であると決定できるようなも
のの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二
つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意
味するものである。相同性は容易に算出できる。二つの
ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性
を測定する方法は数多く知られており、「相同性」
（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周
知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational
Molecular Biology, Oxford University Press, New Y
ork, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Info
rmatics and Genome Projects, Academic Press, New Y
ork, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.),
Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human
Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence
Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New
York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.),
Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New Yo
rk, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに
用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), G
uide to Huge Computers, Academic Press, San Diego,
(1994); Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied
Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。相同性
を測定するための好ましい方法としては、試験する二つ
の配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計し
たものが挙げられる。このような方法は、コンピュータ
ープログラムとして組み立てられているものが挙げられ
る。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコ
ンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパ
ッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Resea
rch, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (A
tschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1
990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでな
く、当該分野で公知の方法を使用することができるし、
市販のものを使用できる。本明細書で「高い相同性」と
いった場合当該対象配列の長さにもよるが、例えば 50%
以上、さらには60% 以上、好ましくは70% 以上、さらに
好ましくは80% 以上、そして特定の場合には95% 以上
で、特に好ましくは90% 以上であってよい。

【００１５】本明細書中、「オリゴヌクレオチド」と
は、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチド
で、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.28, p.716-734 (19
89) に記載されているような既知の方法、例えば、フォ
スフォトリエステル法、フォスフォジエステル法、フォ
スファイト法、フォスフォアミダイト法、フォスフォネ
ート法などの方法により化学合成されることができる。
通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行
うことができることが知られており、例えば、市販され
ている自動化された合成装置、例えば、model 381A DNA
synthesizer (Applied Biosystems) などを用いて行う
ことができる。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ
以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イ
ノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはト
リチル化された塩基などを含有していてよいし、場合に
よっては、マーカーの付された塩基を含有していてよ
い。

【００１６】本明細書中、「ポリメラーゼ・チェイン・
リアクション(polymerase chain reaction) 」又は「PC
R 」とは、一般的に、米国特許第 4,683,195号明細書な
どに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌク
レオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方
法を指している。一般に、PCR 法は、鋳型核酸と優先的
にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行
うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものであ
る。典型的には、PCR 法で用いられるプライマーは、鋳
型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補
的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅
されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的
であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列
に隣接しているものを好ましく使用することができる。
5'端側のプライマーとしては、少なくとも開始コドンを
含有するか、あるいは該開始コドンを含めて増幅できる
ように選択し、また3'端側のプライマーとしては、少な
くともストップコドンを含有するか、あるいは該ストッ
プコドンを含めて増幅できるように選択することが好ま
しい。プライマーは、好ましくは 5個以上の塩基、さら
に好ましくは10個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチ
ド、より好ましくは18〜25個の塩基からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。PCR 反応は、当該分野で公知の
方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により
行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Scien
ce, 230: 1350,1985; R. Saiki, et al., Science, 23
9: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCRTechnology, St
ockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA
Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approac
h Series), IRL Press, OxfordUniversity Press (199
5) ; M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a gui
de to methods and applications", Academic Press, N
ew York (1990)); M. J.McPherson, P. Quirke and G.
R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach,IRL Pre
ss, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載
された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に
従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適し
た市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業
者あるいはキット販売業者により明らかにされているプ
ロトコルに従って実施することもできる。

【００１７】PCR 反応は、代表的な場合には、例えば鋳
型（例えば、mRNAを鋳型にして合成されたDNA; 1st str
and DNA)と該遺伝子に基づいてデザインされたプライマ
ーとを、10×反応緩衝液 (Taq DNA ポリメラーゼに添付
されている) 、dNTPs ( デオキシヌクレオシド三リン酸
dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、Taq DNA ポリメラ
ーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例え
ば、GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus な
どの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なPCR サイ
クル条件下にそのサイクルを25〜60回繰り返すが、増幅
のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とす
ることができる。PCR サイクル条件としては、例えば、
変性90〜95℃ 5〜100 秒、アニーリング40〜60℃ 5〜15
0 秒、伸長65〜75℃ 30 〜300 秒のサイクル、好ましく
は変性 94 ℃ 15 秒、アニーリング58 ℃ 15 秒、伸長
72 ℃ 45 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリング
の反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択
できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想される
PCR 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニー
リングの反応温度は、通常プライマーと鋳型DNA とのハ
イブリッドのTm値に応じて変えることが好ましい。伸長
反応の時間は、通常1000bpの鎖長当たり1 分程度がおお
よその目安であるが、より短い時間を選択することも場
合により可能である。

【００１８】所定の核酸を同定したりするには、ハイブ
リダイゼーション技術を利用することができる。該ハイ
ブリダイゼーションは、上記「遺伝子組換え技術」を開
示する文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方
法や改変法により行うことができる。例えば、ハイブリ
ダイゼーションは、DNA などの核酸を含有しているサン
プルをナイロンフィルターなどの膜を含めた担体に転写
せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理な
どを施した後、その担体（例えば、膜など）に転写せし
められたものを、必要に応じ変成させた標識プローブDN
A 断片と、ハイブリダイゼーション用バッファ中で反応
させて行われる。ハイブリダイゼーション処理は、普通
約35℃〜約80℃、より好適には約50℃〜約65℃で、約15
分〜約36時間、より好適には約1 時間〜約24時間行われ
るが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例
えば、ハイブリダイゼーション処理は、約55℃で約18時
間行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとして
は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用
いることができ、例えば、Rapid hybridization buffer
（Amersham）などを用いることができる。転写した担体
（例えば、膜など）の変成処理としては、アルカリ変性
液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝
液で処理するのが好ましい。また担体（例えば、膜な
ど）の固定化処理としては、普通約40℃〜約 100℃、よ
り好適には約70℃〜約90℃で、約15分〜約24時間、より
好適には約1 時間〜約4 時間ベーキングすることにより
行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことがで
きる。例えば、フィルターなどの担体を約80℃で約2 時
間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写し
た担体（例えば、膜など）の洗浄処理としては、当該分
野で普通に使用される洗浄液、例えば1M NaCl 、1mM ED
TAおよび 0.1％ Sodium Dodecyl sulfate (SDS) 含有 5
0mM Tris-HC1緩衝液，pH8.0 などで洗うことにより行う
ことができる。ナイロンフィルターなどの膜を含めた担
体としては、当該分野で普通に使用されるものの中から
選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルター
［ハイボンド(Hybond)-N、Amersham］などを挙げること
ができる。

【００１９】上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液とし
ては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで
用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、
0.5MNaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げる
ことができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有
0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることがで
き、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、
20mM NaH₂PO₄および2mM EDTA）などを挙げることができ
る。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異
的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に
応じて転写した担体（例えば、膜など）はプレハイブリ
ダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイ
ブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイ
ゼーション溶液［50％ formamide、 5×Denhardt's溶液
（0.2 ％ウシ血清アルブミン、0.2 ％ polyvinyl pyrro
lidone）、 5×SSPE、0.1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性
サケ精子DNA ］などに浸し、約35℃〜約50℃、好ましく
は約42℃で、約 4〜約24時間、好ましくは約 6〜約8 時
間反応させることにより行うことができるが、こうした
条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好まし
い条件を決めることができる。ハイブリダイゼーション
に用いる標識プローブDNA 断片の変成は、例えば、約70
℃〜約100 ℃、好ましくは約100 ℃で、約1 分間〜約60
分間、好ましくは約 5分間加熱するなどして行うことが
できる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公
知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができる
が、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナ
トリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜
約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度について
は約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好まし
くは約60〜約65℃の条件を示す。

【００２０】ハイブリダイゼーション完了後、フィルタ
ーなどの担体を十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダ
イゼーション反応をした標識プローブDNA 断片以外の標
識プローブを取り除くなどしてから検出処理をすること
ができる。フィルターなどの担体の洗浄処理は、当該分
野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うこ
とができ、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M
NaCl、15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施
できる。ハイブリダイズした核酸は、代表的にはオート
ラジオグラフィーにより検出することができるが、当該
分野で用いられる方法の中から適宜選択して検出に用い
ることもできる。検出したシグナルに相当する核酸バン
ドを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液(100mM NaCl およ
び10mM MgSO₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.5）など
に懸濁し、ついでこの懸濁液を適度に希釈して、所定の
核酸を単離・精製、そしてさらなる増幅処理にかけるこ
とができる。ハイブリダイゼーション処理により遺伝子
ライブラリーやcDNAライブラリーなどを含めた核酸サン
プルから目的核酸をスクリーニングする処理は、繰り返
して行うことができる。

【００２１】所定の核酸を保有する、ファージ粒子、組
換えプラスミドなどは、当該分野で普通に使用される方
法でそれを精製分離することができ、例えば、グリセロ
ールグラジエント超遠心分離法（Molecular cloning, a
laboratory manual, ed. T.Maniatis, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989）などにより精製
することができる。ファージ粒子などからは、当該分野
で普通に使用される方法でDNA を精製分離することがで
き、例えば、得られたファージなどをTM溶液（10mM MgS
O₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、
DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50
μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加
え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽
出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄
後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝
液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的
としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に
得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿
主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて
行うことができる。こうしたサブクローニングにより得
られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール
抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離でき
る。

【００２２】本明細書において、核酸は、一本鎖DNA 、
二本鎖DNA 、RNA 、DNA:RNA ハイブリッド、合成DNA な
どの核酸であり、またヒトゲノムDNA 、ヒトゲノミック
DNAライブラリー、ヒト組織・細胞由来のcDNA、合成DNA
のいずれであってもよい。核酸の塩基配列は、修飾
（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、
そうした修飾されたものも包含されてよい。核酸は、本
発明で記載するペプチドあるいはその一部をコードする
ものであってよく、好ましいものとしてはDNA が挙げら
れる。また核酸は、対象ポリペプチド（タンパク質）、
例えば各種MMP 、KiSS-1/metastin 、あるいはそれらの
部分配列と同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生
物学的活性を有するペプチド（それと実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するものを含むし、それと高い相同性
を有するものも含まれてよい）をコードするといったそ
れと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるも
のであってもよい。ヒト、チンパンジー、サル、マウ
ス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、
ウサギなどの哺乳動物由来のものも包含されてもよい。
該「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな
条件で問題の配列を有するものにハイブリダイズするも
のであってよく、例えば当該塩基配列のうちの連続した
５個以上の塩基配列、好ましくは10個以上の塩基配列、
より好ましくは15個以上の塩基配列、さらに好ましくは
20個以上の塩基配列とハイブリダイズし、当該ポリペプ
チドと実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものな
どが挙げられる。核酸は、化学合成によって得ることも
可能である。その場合断片を化学合成し、それらを酵素
により結合することによってもよい。

【００２３】本明細書において、得られたPCR 産物は、
通常 1〜2% アガロースゲル電気泳動にかけて、特異な
バンドとしてゲルから切り出し、例えば、gene clean k
it (Bio 101)などの市販の抽出キットを用いてDNA を抽
出する。抽出されたDNA は適当な制限酵素で切断し、必
要に応じ精製処理したり、さらには必要に応じ5'末端を
T4ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した
後、pUC18 などのpUC 系ベクターといった適当なプラス
ミドベクターにライゲーションし、適当なコンピテント
細胞を形質転換する。クローニングされたPCR 産物はそ
の塩基配列を解析される。PCR 産物のクローニングに
は、例えば、p-Direct (Clontech), pCR-Script^TM SK
(+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp^TM (Gibco-
BRL)などの市販のプラスミドベクターを用いることが出
来る。宿主細胞の形質転換をするには、例えばファージ
ベクターを使用したり、カルシウム法、ルビジウム／カ
ルシウム法、カルシウム／マンガン法、TFB 高効率法、
FSB 凍結コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレク
トロポレーションなど当該分野で知られた方法あるいは
それと実質的に同様な方法で行うことができる（D. Han
ahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983 など）。目的と
するDNA を単離するためには、逆転写PCR (polymerase
chain reaction coupled reverse transcription; RT-P
CR) 、RACE (rapidamplification of cDNA ends) を適
用することが出来る。RACEは、例えば、M. A. Innis et
al. ed., "PCR Protocols" (M. A. Frohman, "a guide
to methodsand applications"), pp.28-38, Academic
Press, New York (1990) などに記載された方法に従っ
て行うことができる。

【００２４】DNA は、必要に応じてクローニングでき、
例えば、プラスミド、λファージ、コスミド、P1ファー
ジ、Ｆ因子、YAC などが利用できる。好ましくはλファ
ージ由来のベクターが挙げられ、例えばCharon 4A 、Ch
aron 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII 、λEM
BL3 、λZAPII ^TM (Stratagene) などが利用できる。ま
た得られたDNA を、下記で詳しく説明するような適当な
ベクター、例えば、プラスミドpEX 、pMAMneo 、pKG5な
どのベクターに組込み、下記で詳しく説明するような適
当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、CHO 細胞、COS
細胞などで発現させることができる。また、該DNA 断片
は、そのままあるいは適当な制御配列を付加したDNA 断
片として、または適当なベクターに組込み、そして動物
に導入して、所定の遺伝子を発現するトランスジェニッ
ク動物を作成することができる。動物としては、哺乳動
物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モル
モット、ウシなどが挙げられる。好ましくは、マウスな
どの動物の受精卵に該DNA断片を導入して、トランスジ
ェニック動物を作成することができる。外来遺伝子を哺
乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野
で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行
うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、F.
L. Graham et al., Virology, 52: 456, 1973など）、
DEAE-デキストラン法（例えば、D. Warden et al., J.
Gen. Virol., 3: 371, 1968など）、エレクトロポレー
ション法（例えば、E. Neumann et al., EMBO J, 1: 84
1, 1982 など）、マイクロインジェクション法、リボソ
ーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子法などが挙げら
れる。こうして所定の遺伝子をトランスフェクションさ
れた動物細胞の産生する遺伝子産物は、それを解析する
こともできる。

【００２５】所定の遺伝子など（本発明で得られたDNA
など）を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用
される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞
宿主、酵母、293T細胞、CHO 細胞、COS 細胞等の真核細
胞宿主、Sf21等の昆虫細胞宿主）中で該DNA が発現でき
るプラスミドであればどのようなプラスミドでもよい。
こうした配列内には、例えば選択した宿主細胞で発現す
るのに好適に修飾されたコドンが含まれていることがで
きるし、制限酵素部位が設けられていることもできる
し、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配
列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに役
立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐性
などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに有
用な配列（ハイブリドタンパク質や融合タンパク質をコ
ードするものも含む）等を含んでいることができる。好
ましくは、適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主と
するプラスミドでは、トリプトファンプロモーター(tr
p) 、ラクトースプロモーター(lac) 、トリプトファン
・ラクトースプロモーター(tac) 、リポプロテインプロ
モーター(lpp) 、λファージ P_L プロモーター等を、動
物細胞を宿主とするプラスミドでは、SV40レートプロモ
ーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTR プロモータ
ー、CMV プロモーター、SRαプロモーター等を、酵母を
宿主とするプラスミドでは、GAL1、GAL10 プロモーター
等を使用し得る。さらにCYC1, HIS3, ADH1,PGK, PHO5,
GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN0, TP1, AOX1等の
制御系を使用することもできる。

【００２６】所望ポリペプチドをコードするDNA のトラ
ンスクリプションを促進するためエンハンサーをベクタ
ーに挿入することができ、そうしたエンハンサーとして
はプロモーターに働いてトランスクリプションを促進す
る作用を持つ、通常おおよそ10〜100 bpの cis作用を持
つエレメントのものが挙げられる。多くのエンハンサー
が、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α- フェト
プロテイン、インシュリンなどの哺乳動物遺伝子から知
られている。代表的には、真核細胞感染性ウイルスから
得られるエンハンサーが好適に使用でき、例えばレプリ
ケーションオリジンのレート領域にあるSV40エンハンサ
ー (100-270 bp), サイトメガロウイルスの初期プロモ
ーターのエンハンサー, ポリオーマのレプリケーション
オリジンのレート領域にあるエンハンサー, アデノウイ
ルスのエンハンサーなどの例が挙げられる。また、必要
に応じて、宿主にあったシグナル配列を付加することも
でき、それらは当業者によく知られているものを使用で
きる。

【００２７】大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、
例えばpBR322、pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64,
pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-
4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KS^TM
(Stratagene) などが挙げられる。大腸菌での発現に適
したプラスミドベクターとしては、例えばpAS, pKK223
(Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invi
trogen) なども挙げられる。動物細胞を宿主とするプラ
スミドとしては、例えばSV40ベクター、ポリオーマ・ウ
イルスベクター、ワクシニア・ウイルスベクター、レト
ロウイルスベクターなどが挙げられ、具体的にはpcD, p
cD-SRα, CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5 (Strat
agene) などが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミ
ドとしては、YIp型ベクター、YEp型ベクター、YRp型ベ
クター、YCp型ベクターなどが挙げられ、例えばpGPD-2
などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸
菌の場合、例えば大腸菌K12 株に由来するものが挙げら
れ、例えばNM533, XL1-Blue,C600, DH1, DH5, DH11S, D
H12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B
834株由来としては、BL21(DE3)pLysSなどが挙げられ
る。宿主細胞が酵母の場合、例えば Saccharomyces cer
evisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichiapastori
s, Kluyveromyces 株, Candida, Trichoderma reesia,
その他の酵母株などが挙げられる。

【００２８】宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリ
カミドリザル線維芽細胞由来のCOS-7 細胞、COS-1 細
胞、CV-1細胞、ヒト腎細胞由来 293細胞、ヒト表皮細胞
由来A431細胞、ヒト結腸由来 205細胞、マウス線維芽細
胞由来のCOP 細胞、MOP 細胞、WOP 細胞、チャイニーズ
・ハムスター細胞由来のCHO 細胞、CHO DHFR^- 細胞、ヒ
トHeLa細胞、マウス細胞由来C127細胞、マウス細胞由来
NIH 3T3 細胞、マウスL細胞、9BHK、HL-60 、U937、HaK
、Jurkat細胞、その他の形質転換されて得られたセル
ライン、通常の二倍体細胞、インビトロの一次培養組織
から誘導された細胞株などが挙げられる。昆虫細胞とし
ては、カイコ核多角体病ウイルス (Bombyxmori nuclear
polyhedrosis virus) 、それに由来するものあるいは
その他の適切なものをベクターとし、Spodoptera frugi
perda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aed
es albopictus (mosquito), Drosophila melangaster
(fruitfly), カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例
えばBM-N細胞などを用いることが挙げられる (例えば、
Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47-55 (1988); Se
tlow, J. K. et al. (eds), Genetic Engineering, Vo
l. 8, pp.277-279, Plenum Publishing, 1986; Maeda e
t al., Nature, 315, pp.592-594 (1985)) 。 Agrobact
erium tumefaciensなどを利用して、植物細胞を宿主細
胞として使用することも可能であり、それに適するベク
ターと共に、それらは当該分野で広く知られている。本
発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られ
たあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、DNA
断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりある
いは変換するための酵素であるDNA 修飾・分解酵素、DN
A ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出来る。

【００２９】本発明に従い、ポリペプチドをコードする
核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換
体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返
しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定し
て有する細胞株を得ることができる。例えば、宿主細胞
として動物細胞を用いた形質転換体において、dhfr遺伝
子を選択マーカーとして利用した場合、MTX 濃度を徐々
に上げて培養し、耐性株を選択することにより、本発明
のポリペプチドをコードするDNA を増幅させ、より高い
発現を得られる細胞株を得ることができる。本発明の形
質転換体は、本発明のポリペプチドをコードする核酸が
発現可能な条件下で培養し、目的物を生成、蓄積せしめ
ることができる。該形質転換体は、当該分野で汎用され
ている培地中で培養することができる。例えば、大腸
菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母などを宿主としてい
る形質転換体は、液体培地を好適に使用することができ
る。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、
窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源とし
ては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱
粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウ
ム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として
は，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられ
る。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因
子などを添加してもよい。また、必要によりプロモータ
ーを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリ
ル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。培
地のpHは約５〜８が望ましい。

【００３０】培養は、例えば大腸菌では通常約15〜約45
℃で約３〜約75時間行い、必要により、通気や攪拌を加
えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、たとえば約５〜約20％の胎
児牛血清を含むMEM 培地、PRMI1640培地、DMEM培地など
が用いられる。pHは約６〜約８であるのが好ましい。培
養は通常約30℃〜約40℃で約15〜約72時間行い、必要に
応じて通気や攪拌を加える。所定の遺伝子産物を発現し
ている形質転換体はそのまま利用可能であるが、その細
胞ホモジュネートとしても利用できるが、所定の遺伝子
産物を単離して用いることもできる。上記培養細胞から
抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるい
は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、
リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あ
るいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽
出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液
の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、ト
リトン X-100（商品名）、ツウィーン-20 （商品名）な
どの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的
生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公
知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を
集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽
出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、
例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデッ
クスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチ
ル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを
用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル
基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体な
どを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロ
マトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ア
フィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマト
グラフィー法などにより精製して得ることができる。好
ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンド
などを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィー
などで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−
アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘ
パリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げら
れる。

【００３１】さらに、本発明に係わる遺伝子の塩基配列
を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることによ
り、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、１個
ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移
あるいは付加したごとき変異を導入した相当するポリペ
プチドを製造することができる。こうした変異・変換・
修飾法としては、例えば日本生化学会編、「続生化学実
験講座１、遺伝子研究法 II 」、p105（広瀬進）、東京
化学同人(1986); 日本生化学会編、「新生化学実験講座
２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、p233（広瀬進）、
東京化学同人(1992); R. Wu, L. Grossman, ed., "Meth
ods in Enzymology", Vol. 154, p. 350& p. 367, Acad
emic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, e
d., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p.
468, Academic Press, New York (1983); J. A. Wells
et al., Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et a
l., Nucleic Acids Res., 13: 3305, 1985; J. Taylor
et al., Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu
ed., "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Ac
ademic Press, New York （1987); A. R. Oliphant et
al., Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げら
れる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位
置指定変異導入法（部位特異的変異導入法) (Zoller et
al., Nucl.Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et a
l., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), カセット変
異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al., Gen
e, 34:315, 1985), 制限部位選択変異導入法 (restrict
ion selection mutagenesis: Wells et al., Philos. T
rans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986),アラニ
ン・スキャンニング法 (Cunningham & Wells, Science,
244: 1081-1085, 1989), PCR 変異導入法, Kunkel法,
dNTP[αS]法（Eckstein),亜硫酸や亜硝酸などを用いる
領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。

【００３２】また、遺伝子組換え法で製造する時に融合
ポリペプチド（融合タンパク質）として発現させ、生体
内あるいは生体外で、所望のポリペプチドと実質的に同
等の生物学的活性を有しているものに変換・加工しても
よい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いるこ
とができるが、こうした融合ポリペプチドはその融合部
を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製
することも可能である。こうした融合ポリペプチドとし
ては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるい
は、β-ガラクトシダーゼ（β-gal) 、マルトース結合
タンパク (MBP),グルタチオン-S-トランスフェラーゼ
(GST)、チオレドキシン (TRX)又は Cre Recombinaseの
アミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられ
る。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピ
トープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合
する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラ
フィーによる精製をなし得るようにすることもできる。
より適した実施態様においては、ポリヒスチジン(poly-
His)又はポリヒスチジン-グリシン(poly-His-Gly)タ
グ、また該エピトープタグとしては、例えば AU5, c-My
c, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, H
A, Ha.11, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma-A
ldrich), Omni-probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16,
GAL4, VSV-G などが挙げられる (Field et al., Molec
ular and Cellular Biology, 8: pp.2159-2165 (1988);
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J. Biol. Chem., 266: pp.15163-15166 (1991); Lutz-F
reyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
pp.6393-6397 (1990) など) 。酵母を利用した two-hyb
rid 法も利用できる。

【００３３】さらに融合ポリペプチドとしては、検出可
能なタンパク質となるようなマーカーを付されたもので
あることもできる。より好適な実施態様においては、該
検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン
系のBiotin Avi Tag、螢光を発する物質などであってよ
い。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ (Aequ
orea victorea)などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパ
ク質(green fluorescent protein: GFP)、それを改変し
た変異体(GFPバリアント) 、例えば、EGFP (Enhanced-h
umanized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 黄色螢光タン
パク質 (yellowfluorescent protein: YFP), 緑色螢光
タンパク質 (green fluorescent protein: GFP),藍色螢
光タンパク質 (cyan fluorescent protein: CFP), 青色
螢光タンパク質 (blue fluorescent protein: BFP), ウ
ミシイタケ (Renilla reniformis) 由来のGFP などが挙
げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代
の実験講座３−GFP とバイオイージング、羊土社 (2000
年))。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モ
ノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用
して検出を行うこともできる。こうした融合ポリペプチ
ドの発現及び精製は、それに適した市販のキットを用い
て行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売
業者により明らかにされているプロトコルに従って実施
することもできる。得られたタンパク質（ペプチドある
いはポリペプチドを包含していてよい）は、それを酵素
免疫測定法など知られた手法で、適当な担体あるいは固
相に結合せしめて固相化することができる。固相化タン
パク質、固相化ペプチドは、便利に結合アッセイや物質
のスクリーニングに使用できる。

【００３４】該ポリペプチドは、化学的な手法でその含
有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプ
チダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイ
ン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチ
ダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したり
してその誘導体などにすることができる。場合によって
は、該ポリペプチドは、in vivo あるいは in vitro グ
ルコシレーション又は脱グルコシレーションをしたり、
グルコシル化される位置を変えることもできる (WO87/0
5330; Apin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p
p.259-306 (1981); Hakimuddin et al., Arch, Bioche
m. Biophys., 259: pp.52 (1987); Edge etal., Anal.
Biochem., 118: pp.131 (1981); "Methods in Enzymolo
gy", Vol.138, pp. 350, Academic Press, New York（1
987) 等) 。該ポリペプチドは、C 末端が通常カルボキ
シル基(-COOH) またはカルボキシレート (-COO^-) であ
るが、C 末端がアミド(-CONH₂ あるいは-CONHRなど) ま
たはエステル(-COOR) であってもよい。ここでアミドや
エステルにおけるR としては、例えば、メチル、エチ
ル、n-プロピル、イソプロピルもしくはn-ブチルなどの
C_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ_3-8 シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのC_6-12 アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−C_1-2アルキル基も
しくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル-C_1-2 ア
ルキル基などのC_7-14 アラルキル基のほか、経口用エス
テルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが
用いられる。該ポリペプチドが C末端以外にカルボキシ
ル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カ
ルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも
のも本発明に従った所望ポリペプチドに含まれてよい。
この場合のエステルとしては、例えば上記したC 末端の
エステルなどが用いられる。該ポリペプチドは、上記し
たポリペプチドにおいて、N 末端にメチオニン残基を持
つものであってよく、さらに該メチオニン残基のアミノ
基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ
_1-5 アルキル−カルボニル基などのC_1-6アシル基など）
で保護されているもの、N 端側が生体内で切断され生成
したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH 、-COOH 、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ル基などのC_1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複
合タンパク質なども含まれてよい。

【００３５】本発明の所定のペプチドは、天然に存在す
る形態に加えて、そのペプチドの機能と同等、又はより
強力な、又はよりプラスの機能を有するペプチド類縁体
のような他のポリペプチドも含む。該類縁体は、加水分
解に対してより安定なもの（それ故、天然のものよりも
顕著な、又は長期の効果を有し得る）又は一つ以上の潜
在的なO-グリコシル化及び/ 又はN-グリコシル化部位を
除去又は付加するように改変されたものが含まれていて
よい。本発明のペプチドは、少なくとも一部分が天然で
なくてもよいペプチド模擬化合物であってよい。ペプチ
ド模擬化合物は、当該アミノ酸配列の一部を模擬した小
分子であってよい。該化合物は、それを模擬するため
に、増加した安定性、効力、効果(potency) 、生物学的
利用性を有していてよい。さらに、該化合物は、減少し
た毒性を有していてよい。該ペプチド模擬化合物は、増
大した腸粘膜透過性を有していてよい。該化合物は、合
成的に調製することができる。本発明の化合物には、L
-、D-、DL- 又は非天然アミノ酸、α,α-二置換アミノ
酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸が含まれていてよい。該
化合物のペプチド骨格は、PSI-[CH=CH] で置換された少
なくとも一つの結合を有してもよい。さらに、該化合物
には、トリフルオロチロシン、p-Cl-フェニルアラニ
ン、p-Br-フェニルアラニン、ポリ-L-プロパルギルグリ
シン、ポリ-D,L-アリルグリシン、あるいはポリ-L-アリ
ルグリシンが含まれていてよい。また、該化合物は、MM
P によるKiSS-1関連産物の不活性化、MMP とKiSS-1関連
産物との相互作用、さらにはそれらに起因した生物学的
活性を調整するペプチド模擬化合物であり、該化合物
は、適切な模擬体で置換された結合、ペプチド骨格、又
はアミノ酸成分を有する。適切なアミノ酸模擬物であっ
てよい非天然アミノ酸としては、例えばβ-アラニン、L
-α-アミノ酪酸、L-γ-アミノ酪酸、L-α-アミノイソ酪
酸、L-ε-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、L-
アスパラギン酸、L-グルタミン酸、N-ε-Boc-N-α-CBZ-
L-リジン、N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-リジン、L-メチオニ
ンスルフォン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、N-α-B
oc-N-δ-CBZ-L-オルニチン、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-オル
ニチン、Boc-p-ニトロ-L-フェニルアラニン、Boc-ヒド
ロキシプロリン、Boc-L-チオプロリンなどが挙げられ
る。

【００３６】さらに、本発明では、がん転移抑制遺伝子
KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそれ
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものから成る
群から選ばれたものに基づいて分子設計を施して、MMPs
による各種タンパク質のプロセッシング（特には、配列
番号:1のGly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ の間でのMMP の切断) を抑制あ
るいは阻害する活性を有するより好ましい物質を得るの
に使用できる。こうして得られる物質も本発明の思想の
範囲内のものであるし、本発明の活性成分として扱うこ
とができる。該配列から特定の特徴部分を選択し、(i)
そのうちの薬理作用団をイソスターで置き換えることに
よりなされるか、(ii) 構成アミノ酸残基の少なくとも
１個をＤ体のアミノ酸残基に置き換えるか、(iii) アミ
ノ酸残基の側鎖を修飾するか、(iv) 該配列に存在する
アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を配置して連結す
るか、(v) 立体構造を解析してmimic 体をデザインする
ことなど、当該分野で採用される技術を駆使して行うこ
とができる（例えば、首藤紘一 編 医薬品の開発７巻
（分子設計）、平成２年６月25日発行、株式会社廣川書
店及びそこで引用している文献や論文など) 。そうした
技術の一部は、上記で説明したものを含んでいる。タン
パク質・ポリペプチドの構造の修飾・改変などは、例え
ば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質
VII、タンパク質工学」、東京化学同人(1993)を参考に
し、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記
載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行う
ことができる。またその生物学的活性のうちには、免疫
的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれて
よい。該修飾・改変のうちには、脱アミノ化、ヒドロキ
シル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、開環、閉
環、含有糖鎖の種類を違うものに変えること、含有糖鎖
の数を増減すること、D-体アミノ酸残基への置換などで
あってもよい。それらの方法は、当該分野で知られてい
る（例えば、T. E. Creighton, Proteins: Structure a
nd Molecular Properties, pp.79-86 W.H. Freeman & C
o., San Francisco, USA (1983),等) 。

【００３７】本明細書において、「実質的に同等」とは
ポリペプチドの活性、例えば、MMPsによる切断に対して
の抵抗性、MMPsによるがん転移抑制因子不活性化阻害活
性、それに対応する生理的な活性、生物学的な活性が実
質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用
語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を
包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、例
えば、MMPsとがん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチ
ン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するものとの間での複合体の形成を阻害
する性質、がん転移抑制因子のMMPsによる切断を阻害す
る性質、配列番号:1のGly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ の間でのMMP の切
断によるがん転移抑制因子不活性化に関連する細胞の移
動、浸潤及び／又は転移を抑制及び／又は阻害する活性
などを挙げることができる。該実質的に同質の活性と
は、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例
えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質
であることを示す。例えば、該複合体形成を阻害する活
性とか、がん転移抑制因子不活性化阻害活性などの活性
が、同等 (例えば、約 0.0001 〜10000 倍、好ましくは
約0.001 〜1000倍、より好ましくは約 0.01 〜200 倍、
さらに好ましくは約 0.5〜10倍) であることが好ましい
が、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量
的な要素は異なっていてもよい。

【００３８】本発明のペプチドの合成には、当該ペプチ
ド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合
成法などの化学合成法を使用することができる（Stewar
t etal., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Free
man Co., San Francisco, CA, USA, 1969; Merrifeld,
J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154, 1963; J. Org.Che
m., 37, 3404, 1972; G. B. Fields (ed.), "Methods i
n Enzymology", Vol. 289 (Solid-Phase Peptide Synth
esis), Academic Press, New York (1997))。こうした
方法では、例えばペプチド合成用樹脂を用い、適当に保
護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により
所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。
当該ペプチド合成用樹脂樹脂としては、例えば、クロロ
メチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルア
ミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジ
ルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、PAM樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-(2',
4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキ
シ樹脂、4-(2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエ
チル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。縮合
反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を
用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキ
シルカルボジイミド(DCC) 、N,N'-ジイソプロピルカル
ボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリ
ル）カルボジイミドなどのカルボジイミド類を好ましく
使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保
護基を除去することにより目的のものを得ることができ
る。必要に応じて分子内ジスルフィド結合形成反応を実
施してもよい。溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に
使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう
る。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド，N,N-ジメチル
アセトアミド，N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、
塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素
類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメ
チルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジ
オキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセ
トニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸
メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの
適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチ
ド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲
から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜
選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5 〜
４倍過剰で用いられる。場合により、縮合反応を繰り返
すことにより十分な縮合を行なうことができる。また、
無水酢酸またはアセチルイミダゾールなどのアセチル化
剤などを用いて未反応アミノ酸をアセチル化するなどし
て、後の反応に影響を与えないようにすることもでき
る。

【００３９】原料アミノ酸のアミノ基の保護基として
は、当該分野で知られたものを使用することができ、例
えば、Ｚ、Boc、tert-ペンチルオキシカルボニル、イソ
ボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-
ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチ
オイル、Fmocなどが挙げられる。また原料アミノ酸のカ
ルボキシル基の保護基も、当該分野で知られたものを使
用することができ、例えば、アルキルエステル（例え
ば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、tert- ブチ
ル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチ
ル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分
枝状もしくは環状アルキルエステル）、アラルキルエス
テル（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエ
ステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジ
ルエステル、ベンズヒドリルエステル）、フェナシルエ
ステル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド体、tert
- ブトキシカルボニルヒドラジド体、トリチルヒドラジ
ド体などが挙げられる。アミノ酸の水酸基は、例えば、
エステル化またはエーテル化によって保護することがで
きる。このエステル化に適する基としては、例えば、ア
セチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基など
のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシ
カルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら
れる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、
ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、tert- ブチル基
などである。フェノール性水酸基の保護基としては、例
えば、Bzl、Cl２-Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、tert-
ブチルなどが挙げられる。イミダゾール基の保護基とし
ては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベ
ンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、
Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。原料アミノ酸のカル
ボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応
する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例
えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェ
ノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコ
ール、p-ニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシ
ミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステ
ル〕などが挙げられる。原料アミノ酸のアミノ基の活性
化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミド
が用いられる。

【００４０】保護基の除去（脱離）方法としては、例え
ば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素
気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタン
スルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフル
オロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、
ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペ
リジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アン
モニア中ナトリウムによる還元などが挙げられる。上記
酸処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温度
で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソー
ル、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パ
ラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオ
ール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉
剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾー
ル保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチ
オフェノール処理により除去され、トリプトファンのイ
ンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,
2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在
下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶
液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除
去される。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護
ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与
する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段か
ら適宜選択しうる。ポリペプチドのアミド体を得る方法
としては、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペ
プチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペ
プチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた
ポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを
除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチド
を上記したような混合溶媒中で縮合させることで達成で
きる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮
合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記
方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプ
チドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の
各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥す
ることで所望のポリペプチドのアミド体を得ることがで
きる。ポリペプチドのエステル体を得るには、例えば、
カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望の
アルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリ
ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド
のエステル体を得ることができる。上記方法で得られる
ポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によっ
て適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られ
た場合は、公知の方法によって遊離体に変換することが
できる。

【００４１】本発明の一つの態様では、活性化合物及び
活性ペプチド（本発明の活性成分）は、がん転移抑制遺
伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及び
それと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものから
成る群から選ばれたものであるが、MMPsから成る群から
選ばれたものの切断に対して抵抗性が付与されているか
あるいはMMPsから成る群から選ばれたものの切断部位に
変異を導入したペプチド及びその誘導体から成る群から
選ばれたもので、例えばKiSS-1タンパク質は配列番号:1
で示されることが知られており、その構成する連続した
アミノ酸配列から選択された２〜145 個の連続したアミ
ノ酸配列、好ましくは２〜126 個、２〜78個、２〜50
個、２〜40個、２〜30個、２〜20個、２〜10個及び２〜
５個から成る群から選ばれたものに相当するアミノ酸配
列を有する変異ペプチド及びその誘導体又はその塩から
成る群から選ばれたものを含んでいてよい。該ペプチド
は、Ｃ末端がアミド化されたものであってよいし、好ま
しい場合もある。該ペプチドは、ペプチド模擬物、合成
ペプチド、又はペプチド類縁体であり得る。該ペプチド
は、天然には見出されない旋光性を有する非天然ペプチ
ド、すなわちD-アミノ酸(D-amino acid)又は非天然型L-
アミノ酸であることもできる。該アミノ酸は、ペプチド
の半減期が増加するように、又はペプチドの効力が増大
するように、又は生物利用度が増大するように改変され
た合成アミノ酸によって置換されていてもよい。「ペプ
チド」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書を
通じて、互換的に使用する。該ペプチドは、Ｇ蛋白質共
役型レセプター hOT7T175 結合部位を模擬するのに必要
なアミノ酸領域を保持したもの、配列番号:1のGly¹¹⁸-L
eu ¹¹⁹ の間でのMMP の切断に対して抵抗性であるかある
いは該切断部位に変異を有しているものが挙げられる。
本発明のペプチドは、ペプチドの機能にマイナス方向の
影響を与えず、ペプチド機能をプラス方向に増加させる
ことができるような変更（例えば、ペプチドの効力を増
加させる変更）を配列中に含んでいることができる。

【００４２】代表的な変異KiSS-1タンパク質及びそのペ
プチド断片としては、配列番号:1のGly¹¹⁸を非極性（疎
水性）アミノ酸で置き換えたもの、例えばアラニン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プ
ロリン、トリプトファン、メチオニンなどから成る群か
ら選ばれたもので置き換えたもの、配列番号:1のGly^{1 18}
を極性（中性）アミノ酸で置き換えたもの、例えばセリ
ン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギ
ン、グルタミンなどから成る群から選ばれたもので置き
換えたもの、配列番号:1のGly¹¹⁸を陽電荷をもつアミノ
酸（塩基性アミノ酸）で置き換えたもの、例えばアルギ
ニン、リジン、ヒスチジンなどから成る群から選ばれた
もので置き換えたもの、配列番号:1のGly¹¹⁸を陰電荷を
もつアミノ酸（酸性アミノ酸）で置き換えたもの、例え
ばアスパラギン酸、グルタミン酸などから成る群から選
ばれたもので置き換えたもの、同様に配列番号:1のLeu
¹¹⁹を非極性（疎水性）アミノ酸で置き換えたもの、同L
eu¹¹⁹を極性（中性）アミノ酸で置き換えたもの、同Leu
¹¹⁹を塩基性アミノ酸で置き換えたもの、同Leu¹¹⁹を酸
性アミノ酸置き換えたものなどが挙げられる。また、L-
グリシンをD-グリシンに置き換えたり、L-ロイシンをD-
ロイシンに置き換えたりしたものであってもよい。代表
的な変異KiSS-1タンパク質及びそのペプチド断片として
は、KiSS-1(20-145)、KiSS-1(68-145)、KiSS-1(20-12
1)、そのアミド体: メタスチンやメタスチン(45-54) に
おいて、該Gly¹¹⁸が、ロイシンあるいはアラニンに置き
換えられたものの他、バリン、イソロイシン、セリン、
スレオニン、システインなどに置き換えられたもの、該
Leu¹¹⁹がグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、
セリン、スレオニン、システイン、フェニルアラニンな
どに置き換えられたもの、該Gly¹¹⁸が、D-グリシンに置
き換えられたり、該Leu¹¹⁹が、D-ロイシンに置き換えら
れたものである。

【００４３】本発明のペプチドは、それが遊離型のもの
として得られた場合には、それ自体公知の方法あるいは
それに準じた方法で塩に変換することができ、またそれ
らは塩として得られた場合には、それ自体公知の方法あ
るいはそれに準じた方法で遊離型のものあるいは他の塩
に変換することができる。本発明のペプチドの塩として
は、生理的に許容されるものあるいは医薬として許容さ
れるものが好ましいが、これらに限定されない。こうし
た塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、
リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイ
ン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リン
ゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホ
ン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙
げられる。さらに該塩としては、アンモニウム塩、例え
ばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、
ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙
げられる。

【００４４】本明細書において、「実質的に同一のアミ
ノ酸配列」とは、(1) 対比される当該アミノ酸配列中の
１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、より好
ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは数個（１個ま
たは２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 対
比される当該アミノ酸配列に１または２個以上（好まし
くは、１〜30個程度、より好ましくは１〜10個程度、さ
らに好ましくは数個（１個または２個）のアミノ酸が付
加したアミノ酸配列、(3) 対比される当該アミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜30個程度、よ
り好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは数個（１
個または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され
たアミノ酸配列、または(4) それらを組み合わせたアミ
ノ酸配列を意味する。具体的には、例えば、対比される
当該アミノ酸配列として配列番号:1、KiSS-1(20-145)、
KiSS-1(68-145)、KiSS-1(68-121)、KiSS-1(20-121)、Ki
SS-1(112-121) 又はKiSS-1(112-145) におけるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番
号:1またはその他の当該KiSS-1フラグメントのアミノ酸
配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、さらに好ま
しくは約90％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。

【００４５】本発明で開示のMMPsから選ばれたものに対
して抵抗性のもの（例えば、MMP による切断に対して天
然型のものに対してより安定性を持つもの) であるよう
な変異KiSS-1タンパク質及びそのペプチド断片、さらに
は変異メタスチン、変異メタスチン(45-54) 及びそれと
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものなど（以
下、単に「変異KiSS-1産物誘導体」という）は、癌転移
抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃
癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、
卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用
である。該変異KiSS-1産物誘導体は、そのレセプター蛋
白質との関係からみて、胎盤機能調節作用を有すると期
待され、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発
育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予
防または治療薬に有用である。さらに、該変異KiSS-1産
物誘導体は、細胞の転移を抑制する活性を有することか
ら、望ましくない細胞の移動・転移に起因する病的な症
状、例えば炎症、アレルギーなどの予防または治療薬に
有用である。

【００４６】本明細書中、「マトリックスメタロプロテ
アーゼ阻害剤」あるいは「MMP 阻害剤 (MMPI) 」は、マ
トリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害する活性を
有しているもので、有用な活性を持つものであれば制限
されることがなく含まれてよいが、例えば公知の様々な
種類のものを包含していてよい。マトリックスメタロプ
ロテアーゼ阻害剤としては、MMP ファミリーに対するイ
ンヒビター活性を有するもの、例えば天然に存在するタ
ンパク質、例えばティシュ インヒビター オブ マト
リックスメタロプロテアーゼ類 (Tissue Inhibitors of
Metalloproteinases: TIMPs) であってもよいし、ある
いは特には合成化合物を含んでいてよく、ヒドロキサム
酸、カルボン酸、ホスホン酸、チオールの誘導体などを
包含していてよく、例えばTIMP-2などのほか、WO, A, 0
0/03703, WO, A, 00/03734, WO,A, 01/092507及びそこ
に引用した文献に開示のもの、さらには表１、表２、表
３及び表４に列挙されたようなものが包含される。該メ
タロプロテイナーゼ阻害剤は、例えば、表１〜４に記載
された特許公報の実施例（なお、表では、具体的には実
施例番号として示してある）に開示のものが挙げられ
る。表１、表２、表３及び表４に挙げられた特許公報に
開示の内容は、そこに開示の特定の実施例並びに当該実
施例に具体的に示された化合物を含めて、当該文献を参
照することにより本明細書の開示の一部となっているも
のである。各種のMMP 阻害剤を開示し、代表的な癌転移
抑制遺伝子KiSS-1産物（KiSS-1, metastin, metastin
(45-54)を包含する) 切断阻害MMPI化合物は、例えば国
際公開第WO 97/27174 号（WO 97/27174), WO 97/20824,
英国特許公開明細書第2268934 号 (GB 2268934 A, 又は
米国特許明細書第5310763 号 (US 5310763)), US 52683
84, US 5455258, WO 96/11209, WO 97/18207, WO 97/32
846, WO 98/17643,特開平7-101925号公報, US 5614625,
WO 98/30551, WO 98/43963, WO 96/15096,WO 96/3396
8, WO 99/31052, WO 00/69812などに開示されている。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【表２】

【００４９】

【表３】

【００５０】

【表４】

【００５１】MMP 阻害剤は、がん転移抑制遺伝子KiSS-1
産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するものに作用してその
ペプチド結合を切断するのを抑制あるいは阻害する効果
が期待でき、がん転移抑制活性の不活性化を抑制あるい
は阻止できる。したがって、がん転移抑制遺伝子KiSS-1
産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するものの有する生物活
性及び／又は生理活性を安定化する。細胞の移動を抑制
あるいは阻止する場合にも利用できると考えられる。か
くして、(1) MMP阻害剤及び(2) (i) がん転移抑制遺伝
子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) 及びそ
れと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものから成
る群から選ばれたものとを含有している、KiSS-1産物及
びメタスチン並びにその誘導体の安定化組成物は、医薬
などとして有用である。MMP 遺伝子発現細胞におけるMM
PsによるKiSS-1タンパク質のプロセッシングが関連する
障害、異常及び／又は疾患の予防あるいは治療に有用で
ある。また、MMPsが関与する腫瘍細胞などの移動、浸
潤、遊走及び／又は転移の制御、例えば抑制に有用であ
ると期待される。さらに、悪性腫瘍、すなわち癌の移
動、浸潤及び／又は転移の阻止及び／又は抑制するのに
有用で、血管新生阻害剤、抗腫瘍剤及び／又は癌転移抑
制剤として期待できる。また、血液系細胞の、MMPsによ
るプロセッシングに関連する障害、異常及び／又は疾患
の予防あるいは治療にも有用で、消炎剤及び／又は免疫
抑制剤としても期待できる。さらに、アルツハイマー治
療剤、関節破壊治療剤などとしても期待できる。

【００５２】本発明の活性成分〔KiSS-1遺伝子産物とMM
P(例えば、MT1-MMP, MT3-MMP, MT5-MMP, MMP-2, MMP-9
など) との相互作用を阻害する物質、例えば、(a)(i)配
列番号:1の118位のグリシンと119位のロイシンとの間で
の切断に対して抵抗性をもつペプタイド、(ii)配列番
号:1の118位のグリシンと119位のロイシンのいずれか一
方あるいは双方において少なくとも変異を有するKiSS-1
タンパク質、そのフラグメントペプチド、さらにはそれ
らの誘導体又はその塩等、あるいは(iii) KiSS-1変異体
タンパク質又はその一部のペプチド断片などをコードす
るDNA などの核酸等、(c) MMP 阻害剤、(d) KiSS-1遺伝
子産物とMMP との相互作用に関連した生物学的活性を抑
制及び／又は阻害する化合物またはその塩、KiSS-1遺伝
子産物の分解を制御する化合物またはその塩、(f) 本発
明を使用して見出された活性物質など〕は、(1) 炎症細
胞の移動に起因した疾患あるいは病気の発症及び／又は
進展、及び(2) 腫瘍（がんを含む）の転移、浸潤及び／
又は拡散から成る群から選ばれた病的な状態あるいは症
状のための医薬として期待できる。本発明の活性成分を
医薬として用いる場合、例えば配列番号:1の118位のグ
リシンと119位のロイシンに関して少なくとも一つの変
異を有するKiSS-1タンパク質関連ペプチドまたはそれら
の塩、あるいはMMP 阻害剤またはそれらの塩等は、通常
単独或いは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合し
て、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与すること
ができる。好ましくは、経口投与、局所投与、または非
経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与さ
れ、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは
直腸投与も包含される）によってもよい。

【００５３】また、本発明の活性成分は、抗腫瘍剤（抗
がん剤）、腫瘍移転阻害剤、血栓形成阻害剤、アルツハ
イマー治療剤、関節破壊治療剤、抗生物質、抗ウイルス
剤、抗アレルギー剤、消炎剤及び／又は免疫抑制剤と配
合して使用することもでき、それらは、有利な働きを持
つものであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知
られたものの中から選択することができる。抗腫瘍剤
（抗がん剤）としては、アルキル化剤系、フルオロピリ
ミジン系、ピリミジンヌクレオシド系、プリン系、白金
アナログ系、アントラサイクリン系／アントラセンジオ
ン系、ポドフィロトキシン系、カンプトテシン系、ホル
モン及びホルモンアナログ系、ビンカアルカロイド系、
タキサン系、酵素系、抗体系などに分類されるものが挙
げられ、アルキル化剤系のものとしては、例えばナイト
ロジェンマスタード-N-オキシド、サイクロホスファミ
ド、イホスファミド、塩酸ニムスチン、ラニムスチンな
ど;フルオロピリミジン系のものとしては、例えば5-フ
ルオロウラシル(5-FU)、フルオロデオキシウリジン、フ
トラフール、カルモフール、テガフール、5'- デオキシ
フルオロウリジン、UFT 、S-1 、カペシタビンなど; ピ
リミジンヌクレオシド系のものとしては、例えばデオキ
シシチジン、シタラビン、エノシタビン、サイクロシチ
ジン、5-アザシトシン、5-アザシトシンアラビノシドな
ど; プリン系のものとしては、例えば6-メルカプトプリ
ン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリンリボシド、ア
ザチオプリン、アロプリノール、クラドリビン、フルダ
ラビン、ペントスタチン、2-クロロアデノシンなど; 白
金アナログ系のものとしては、例えばシスプラチン、カ
ルボプラチン、オキザリプラチン、テトラブラチン、Pt
-DACH 、CI-973、JM-216など; アントラサイクリン系／
アントラセンジオン系のものとしては、例えばドキソル
ビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシ
ン、ミトキサントロンなど; ポドフィロトキシン系のも
のとしては、例えばエトポシド、テニポシドなど; カン
プトテシン系のものとしては、例えばイリノテカン、ト
ポテカン、9-アミノカンプトテシン、10,11-メチレンジ
オキシカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシンなど;
ホルモン及びホルモンアナログ系のものとしては、例え
ばジエチルスチルベストロール、タモキシフェン、トレ
ミフェン、トルムデックス(Tolmudex)、チミタック(Thy
mitaq)、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、
エストラジオール、トリオキシフェン、ドロルオキシフ
ェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロ
ール、アミノグルテチミド、テストラクトンなど; ビン
カアルカロイド系のものとしては、例えばビンクリスチ
ン、ビンブラスチン、ビンオレルビン、ビンデシンな
ど; タキサン系のものとしては、例えばパクリタキセ
ル、ドセタキセルなど; 酵素、タンパク質、抗体系のも
のとしては、例えばアスパラギナーゼ、インターロイキ
ン類、インターフェロン類、リュープロリドなどが挙げ
られ、その他、メトトレキセート、トリメトプリム、ダ
カルバジン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダクチ
ノマイシン、ペントスタチン、チオテパ、メルファラン
なども挙げることができる。

【００５４】そして、非経口的な投与形態としては、局
所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内
投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、
またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む
哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、
組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔
内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点
鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することがで
きる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、
分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製
剤などが挙げられ、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施
した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル
剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒
剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョ
ン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニ
メント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、
吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ
剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸
坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳
剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、
凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。医薬用の組
成物は通常の方法に従って製剤化することができる。例
えば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、
医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、
補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防
腐剤、安定化剤、結合剤、pH調節剤、緩衝剤、界面活性
剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化
剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲ
ル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩
壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩
和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わ
せて用い、それとともに本発明のタンパク質等を混和す
ることによって、一般に認められた製剤実施に要求され
る単位用量形態にして製造することができる。

【００５５】非経口的使用に適した製剤としては、活性
成分と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体
との無菌性溶液、または懸濁液剤など、例えば注射剤等
が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロー
ス水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリ
コール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられ
る。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理
食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び
懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶
液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製
する。注射用の水性液としては、例えば生理食塩液、ブ
ドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-
マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液など
が挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助剤、た
とえばアルコール（たとえばエタノールなど）、ポリア
ルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（たとえば
ポリソルベート80^TM, HCO-50など）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は浸透圧調節
のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、ア
スコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進剤などと配合
してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプル
に充填される。

【００５６】非経口投与には、界面活性剤及びその他の
薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えず
に、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容
される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化され
る。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤として
は、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジ
あるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成
の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、例えばピーナッ
ツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が
挙げられる。例えば、この注射剤は、通常本発明化合物
を0.1 〜10重量％程度含有するように調製されることが
できる。局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した
製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、
吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯
科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯
科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて慣用
の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤として
は、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担
体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解
させるかあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与で
きる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基
剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴ
ール400 、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の
方法により調製される。

【００５７】歯、皮膚への局所塗布用の薬品は、適切に
殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤
することができる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素
ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムのような緩衝
剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウ
ムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤
を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が
挙げられる。坐剤は、当該分野において周知の担体、好
ましくは非刺激性の適当な補形剤、例えばポリエチレン
グリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセ
ライド等の、好ましくは常温では固体であるが腸管の温
度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを
使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明
化合物を0.1 〜95重量％程度含有するように調製され
る。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤
に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻
酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に
溶解可能である。経口的使用に適した製剤としては、例
えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トロー
チのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤の
ような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、
当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び
丸剤はさらにエンテリックコーティングされて製造され
ることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。

【００５８】本発明の活性成分は、検出可能なマーカー
物質と結合さたもの（例えば、¹²⁵Iで放射能ラベルされ
たもの、又はビオチン化されたもの) として、そのラベ
ルされたものをその受容体を有する細胞、又は組織、及
び血液、脳脊髄液、又は尿のような液体試料における検
出及び定量に有用な試薬とすることも可能である。ペプ
チドのような物質は、投与されるとしばしば体内循環か
ら速やかに除去されるので、比較的短時間においてのみ
その薬理学的活性を示すこととなる。その結果、治療に
有効とする状態を維持するためには、生物活性のある物
質を比較的大量且つ頻繁に投与することが必要とされ
る。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール
の共重合体、及びポリプロピレングリコール、カルボキ
シメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのよう
な水溶性ポリマーを共有結合せしめてそれを修飾した物
質は、対応する未修飾の物質と比べて、静脈内投与後の
血中においてより長い半減期を示すことが知られてい
る。このような修飾は、水溶液への物質の溶解度を増大
させ、凝集を阻止し、物質の物理的及び化学的安定性を
増大させ、物質の免疫原性及び反応性も著しく減少させ
る場合がある。その結果、未修飾の物質に比べてより少
ない頻度で、あるいはより少ない用量で、このようなポ
リマー−物質付加体を投与することによって、所望のイ
ンビボ生物活性を達成することができる。

【００５９】ポリエチレングリコール（PEG)は、哺乳動
物中で極めて毒性が低いことから、それを結合させるこ
とは特に有用である。また、PEG を結合せしめると、異
種性化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少せしめ
ることができる場合がある。該化合物は、マイクロカプ
セル装置の中に入れて与えてもよい。PEG のようなポリ
マーは、アミノ末端のアミノ酸のα-アミノ基、リジン
側鎖のε-アミノ基、アスパラギン酸又はグルタミン酸
側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端のアミノ酸のα
-カルボキシル基、又はある種のアスパラギン、セリン
又はトレオニン残基に付着したグリコシル鎖の活性化さ
れた誘導体に、簡便に付着させることができる。タンパ
ク質との直接的な反応に適した多くの活性化された形態
のPEG が知られている。タンパク質のアミノ基と反応さ
せるのに有用なPEG 試薬としては、カルボン酸、カルボ
ネート誘導体の活性エステル、特に、脱離基がN-ヒドロ
キシスクシンイミド、p-ニトロフェノール、イミダゾー
ル、又は1-ヒドロキシ-2-ニトロベンゼン-4-スルフォネ
ートであるものが挙げられる。同様に、アミノヒドラジ
ン又はヒドラジド基を含有するPEG 試薬は、タンパク質
中の過ヨウ素酸酸化によって生成したアルデヒドとの反
応に有用である。さらに、本発明のDNA などの核酸を治
療及び／又は予防剤として用いる場合、該核酸はそれを
単独で用いることもできるし、あるいは上記したような
遺伝子組換え技術で使用される適当なベクター、例えば
レトロウイルス由来ベクターなどウイルス由来のベクタ
ーなどに結合させるなどして用いることができる。本発
明のDNA などの核酸は通常の知られた方法で投与でき、
そのままで、あるいは、例えば細胞内への摂取が促進さ
れるように、適当な補助剤あるいは生理的に許容される
担体などと共に、製剤化されて用いることができ、上記
したような、医薬組成物又は医薬調製物などとして投与
することができる。また遺伝子治療として知られた方法
を適用することもできる。本発明の活性成分は、その投
与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投
与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体
重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄
速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっ
ている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因
を考慮して決められる。

【００６０】医薬品製造にあたっては、その添加剤等や
調製法などは、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、
第十四改正 日本薬局方解説書、平成13年６月27日発
行、株式会社廣川書店；一番ヶ瀬 尚 他編 医薬品の
開発12巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年10月15日発行、
株式会社廣川書店；同、医薬品の開発12巻（製剤素材
〔II〕）平成２年10月28日発行、株式会社廣川書店など
の記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜
選択して適用することができる。本発明の活性成分は、
がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチ
ン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するもののMMP による切断などの相互作用を抑制ある
いは阻害するといった生物学的活性をもつものであれば
特に限定されないが、好ましくは有利な作用を持つもの
が挙げられる。キット 本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分を１又はそ
れ以上を充填した１又はそれ以上の容器を含む医薬分野
（臨床検査などの分析・測定分野も包含する）で許容さ
れるパック及びキットにも関する。このような (単一あ
るいは複数の)容器と一緒に、医薬又は生物学的産物の
製造、使用又は販売を規制する政府機関により指示され
た形態の注意書（文書）であって、ヒトへの投与用の製
品の製造、使用又は販売に関する該政府機関の承認を示
している注意書（添付文書）が添付されていてよいもの
である。

【００６１】本発明に従えば、KiSS-1と各種MMP との関
係が明らかにされたので、DNA 配列は、例えばKiSS-1と
各種MMP 及び関連タンパク質をコードする、哺乳動物、
特に好ましくはヒトの、ゲノムDNA 及びcDNAのスクリー
ニング及び両者の相関性検知のためのプローブの設計な
どに使用できる。該DNA 配列は、例えばKiSS-1あるいは
各種MMP 及び関連タンパク質をコードする、哺乳動物、
特に好ましくはマウス、ラットやヒトの、ゲノムDNA 及
びcDNAのスクリーニング及び両者の相関性検知のために
広く利用できる。プローブは、必要に応じて、当該分野
で広く利用されている標識を付与しておくことができ
る。遺伝子の単離にあたっては、PCR 法、さらには逆転
写酵素 (RT) を用いたPCR 法 (RT-PCR) を利用すること
が出来る。例えば、KiSS-1と各種MMP の両者のmRNAのヒ
ト組織中での発現を各種の組織由来poly (A)⁺ RNA に対
するノーザンブロット分析により検討することができ
る。所定のcDNAをプローブとして用いれば、例えばノー
ザン・ブロティング、サザン・ブロティング、in situ
ハイブリダイゼーションなどによりヒト組織中でのKiSS
-1と各種MMP のmRNAの共発現や両遺伝子自体の制御系な
どを検出・測定でき、ヒト組織における細胞の移動能の
獲得、細胞の移動の制御、および組織マトリックスや骨
の改変を含む、多くの正常な細胞のプロセスに関与す
る、KiSS-1と各種MMP との間の相互作用における役割、
がんの浸潤・転移の様な多くの疾患等の研究の発展に貢
献できる。KiSS-1と各種MMP の両者に関連した疾患の遺
伝子診断にも利用できる。そうした診断は、当該タンパ
ク質及び関連タンパク質をコードする核酸の異常、例え
ば損傷、突然変異、発現低下、発現過多などを診断する
ものであることができる。

【００６２】本発明に従えば、KiSS-1と各種MMP との間
の相互作用に関連する遺伝子診断法（検出方法）が提供
できる。該遺伝子診断法では、(a) 核酸試料を得る工
程、(b) 工程(a) にて得られた核酸試料を、例えばPCR
法、RNA ポリメラーゼを利用した核酸増幅法、鎖置換増
幅法などで遺伝子増幅し、例えば該KiSS-1のMMP 感受性
部位などを含む領域並びに各種MMP のPRCGVPD などを含
む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び(c) 工程
(b) の核酸断片についてそれぞれ調べる工程を含む態様
が挙げられる。増幅の対象となる、当該部位を含む領域
としては、配列番号:1のGly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ の間などのKiSS
-1のMMP 感受性部位や、各種MMP のKiSS-1産物結合部位
領域遺伝子の塩基配列を含んでいる領域が挙げられるが
これには特に限定されない。上記工程(c) においては、
当該分野で当業者に知られている検出方法の中から適切
な方法を選んでそれを適用でき、特には限定されない
が、例えばASPCR (allele-specific PCR) 法により得ら
れたDNA 断片長を調べるなどが挙げられる。DNA 断片長
を調べる方法は、特に限定されるものではないが、例え
ば螢光DNA シークエンサーなどを使用して行うことがで
きる。本工程は、変異検出法を利用することもでき、例
えば制限酵素断片長多型 (restriction fragmentlength
polymorphism: RFLP) を検出して調べる方法なども挙
げられる。また、変異の検出には、例えば変異部位を含
む適当なDNA 片をプローブに用いるハイブリダイゼーシ
ョン法や、SSCP法（単鎖高次構造多型）のような公知の
変異検出法を使用してよい。本発明の遺伝子診断に従
い、KiSS-1と各種MMP との間の相互作用に関係した遺伝
子診断が可能であり、例えばがん、アレルギーなどへの
罹患抵抗性・感受性決定の一素因と考えられる遺伝子及
びその制御機構を含めて所定遺伝子の発現や多型などを
遺伝子診断し、さらに、当該診断結果に基づき関連疾患
罹病へのリスクを下げるような遺伝子治療を行うことが
可能となる。

【００６３】さらに、本明細書中で開示したKiSS-1と各
種MMP との間の相互作用を解析するため、KiSS-1と各種
MMP 及びそれに関連したタンパク質、そのフラグメン
ト、さらにはDNA を含めた核酸(mRNA やオリゴヌクレオ
チドを含む) は、それらを単独あるいは有機的に使用
し、更には当該分野で広く知られた技術（アンチセンス
法、モノクローナル抗体を含めた抗体、トランスジェニ
ク動物など）とも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプ
ロテオミックス技術に応用できる。例えば、KiSS-1変異
体あるいは各種MMP のうちの特定のドメイン領域など
は、ドミナントネガティブ効果を利用した機能解析にも
利用可能である。また、二本鎖RNA (dsRNA) を使用して
のRNAi (RNA interference) 技術への応用の途もある。
かくして、一塩基多型(SNP; single nucleotide polymo
rphisms)を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タ
ンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能
解析、タンパク質間相互作用解析、関連疾患解析、疾患
治療薬解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレ
イ技術では、cDNAライブラリーを使用したり、PCR 技術
で得たDNA を基板上にスポッティング装置で高密度に配
置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析
が行われる。該アレイ化は、針あるいはピンを使用し
て、あるいはインクジェトプリンティング技術などでも
って、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレ
ートなどの基板のそれぞれ固有の位置にDNA が付着せし
められることによりそれを実施することができる。該核
酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られる
シグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、
螢光色素などの標識（例えば、Cy3, Cy5, BODIPY, FIT
C, AlexaFluor dyes（商品名), Texas red（商品名) な
ど) より得られるものであってよい。検知にはレーザー
スキャナーなどを利用することもでき、得られたデータ
は適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコン
ピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク
質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク
質産物を利用してよく、二次元電気泳動(2-DE)、酵素消
化フラグメントを含めての質量分析 (MS)(これにはエレ
クトロスプレーイオン化法(electrospray ionization:
ESI), マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(matri
x-assisted laser desorption/ionization: MALDI)など
の技術が含まれ、MALDI-TOF 分析計、ESI-3 連四重極分
析計、ESI-イオントラップ分析計などを使用してよい)
、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術など
が利用されることができる。したがって、本発明には上
記で得られるあるいは利用できる所定の物質に関連した
ソフトウエア、データベースなども含まれてよい。

【００６４】当該問題の遺伝子のDNA （例えば、hOT7T1
75と各種MMP をコードするDNA)を対象動物に転移させる
にあたっては、それをDNA 断片としてあるいは該DNA を
動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して
用いるのが一般に有利である。たとえば、マウスに当該
DNA を導入する場合、これと相同性が高い動物由来の当
該DNA を動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下
流に結合した遺伝子コンストラクトを、対象動物の受精
卵、たとえばマウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって所定の問題としている遺伝子産物を高
産生する遺伝子導入（トランスジェニック）マウスを作
出できる。マウスとしては、特に純系のマウスに限定さ
れないが、例えば、C57BL/6 、Balb/C、C3H 、(C57BL/6
×DBA/2)F₁(BDF₁)などが挙げられる。このプロモーター
としては、例えばウイルス由来プロモーター、メタロチ
オネイン等のユビキタスな発現プロモーターなどが好ま
しく使用しうる。また該DNA を導入する場合、組換えレ
トロウイルスに組み換えて、それを用いて行うこともで
きる。好適には対象DNA を導入されたマウス受精卵は、
例えば、ICR のような仮親のマウスを使用して生育せし
めることができる。受精卵細胞段階における当該DNA
（例えば、hOT7T175をコードするDNA と各種MMP をコー
ドするDNA)の転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞
の全てに存在するように確保される。DNA 転移後の作出
動物の胚芽細胞において当該DNA 、例えば、hOT7T175や
各種MMP をコードするDNA が存在することは、作出動物
の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに当該遺
伝子産物をコードするDNA を有することを意味する。遺
伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞お
よび体細胞の全てにおいて、該遺伝子産物を発現できる
可能性を有している。

【００６５】当該問題の遺伝子DNA 導入動物は、交配に
より遺伝子を安定に保持することを確認して、該DNA 保
有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことがで
きる。さらに、目的DNA を保有する雌雄の動物を交配す
ることにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホ
モザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配する
ことによりすべての子孫が該DNA を有するように繁殖継
代することができる。該DNA が導入された動物は、該所
定タンパク質が高発現させられているので、該所定タン
パク質に関連した活性物質のスクリーニング用の動物な
どとして有用である。また当該遺伝子の発現を阻害する
ことのできるアンチセンス オリゴヌクレオチド、例え
ば、アンチセンスDNA などのスクリーニング用の動物な
どとして有用である。この遺伝子導入動物を、組織培養
のための細胞源として使用することもできる。こうした
手法で、hOT7T175遺伝子と各種MMP 遺伝子とを共発現す
るものを得ることができる。例えば、遺伝子導入マウス
の組織中のDNA もしくはRNA を直接分析するかあるいは
遺伝子により発現されたタンパク質・組織を分析するこ
とにより、KiSS-1と各種MMP との間の相互作用に関連し
たタンパク質などについて分析することができる。該hO
T7T175と各種MMP との両者を産生する組織の細胞を標準
組織培養技術により培養し、これらを使用して、たとえ
ば脳、胸腺、血管内皮細胞などの血管細胞、血液細胞、
精巣、脳、腸、腎臓やその他の組織由来の細胞について
その機能を研究することができる。また、その細胞を用
いることにより、たとえば各種組織の機能を高めるよう
な医薬開発に資することも可能である。トランスジェニ
ック マウスなどに関連した技術は、例えば、Brinste
r, R. L., et al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
4438, 1985; Costantini, F. & Jaenisch, R. (eds):
Genetic manipulation of the early mammalian embry
o, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985などの文献に
記載の方法あるいはそこに引用された文献に記載の方
法、さらにはそれらの改変法により行うことができる。

【００６６】当該問題の遺伝子に変異をもち、所定の遺
伝子産物を全く発現しない変異マウス（ノックアウトマ
ウス）を作出することができる。たとえば、該遺伝子の
翻訳開始コドンの前後4kb を含むおよそ8kb のゲノムDN
A の中央近傍に位置し翻訳開始コドンに近いエクソンに
neo 耐性遺伝子-polyA付加シグナルからなる遺伝子カセ
ットを挿入した変異遺伝子を持つターゲティングベクタ
ーを構築することができる。挿入する遺伝子カセットは
neo 耐性遺伝子カセット以外にDT-Aカセット、tkカセッ
ト、lacZカセットなどが挙げられる。ターゲティングベ
クターを直鎖状に開き、樹立したマウス胚性幹細胞（em
bryonic stem cells: ES細胞）にエレクトロポレーショ
ンで導入、さらに培養してneo 耐性を獲得したES細胞を
選別する。ES細胞は129 、C57BL/6 、F1(C57BL/6×CBA)
マウスなどのマウス系統から選択して調製することがで
きる。neo 耐性を獲得したES細胞は、例えば、当該遺伝
子領域において遺伝子カセットを挿入したターゲティン
グベクターと相同組換えを起こしていると想定され、少
なくとも問題の遺伝子アレルのうち一つは破壊され、所
定の遺伝子産物を正常に発現できなくなる。選別には挿
入した遺伝子カセットによりそれぞれ適当な方法が選択
され、また、変異の導入はPCR 、サザンハイブリダイゼ
ーションあるいはノーザンハイブリダイゼーションなど
の方法を用いて確認することができる。

【００６７】変異を導入したES細胞は、C57BL/6 、BALB
/c、ICR マウスなどから取り出した８細胞期胚に注入、
１日培養し胚盤胞に発生したものをICR のような仮親に
移植することで個体まで生育させることができる。生ま
れる仔マウスは変異をもつES細胞と正常な宿主胚に由来
するキメラマウスで、ES細胞に由来する細胞がどの程度
含まれるかは個体の毛色で判断する。従って、ES細胞と
宿主胚は毛色の異なった系統の組合わせが望ましい。得
られたキメラマウスの変異はヘテロであり、これらを適
宜交配することでホモ変異マウスを得ることができる。
このようにして得られたホモ変異マウスは生殖細胞およ
び体細胞の全てにおいて、問題の遺伝子のみが破壊さ
れ、所定の遺伝子産物を全く発現せず、繁殖継代される
子孫もまた同様の表現系をもつ。このノックアウトマウ
スは正常マウスとの比較において、発生、成長、生殖、
老化および死など個体のライフサイクルにおけるKiSS-1
と各種MMP の相互作用の役割や各臓器、組織におけるKi
SS-1と各種MMP の機能を解析するのに有用である。ま
た、KiSS-1と各種MMP との間の相互作用に関連した医薬
品開発にも応用できる。ノックアウトマウスはこれらモ
デル動物としてだけではなく、組織培養のための細胞源
として使用することもでき、細胞レベルでのKiSS-1と各
種MMP の機能解析などに供することができる。ノックア
ウトマウス等に関連した技術は、例えば、Mansour, S.
L., et al.,; Nature, 336: 348-352, 1988; Joyner,
A. L.,ed.; Gene targeting, IRL Press, 1993; 相沢慎
一, ジーンターゲティングES細胞を用いた変異マウスの
作成，羊土社，1995などの文献に記載の方法あるいはそ
こに引用された文献に記載の方法、さらにはそれらの改
変法により行うことができる。

【００６８】一つの典型的な態様では、本発明の目的
は、KiSS-1 と各種MMPとの相互作用を効率的に検知・分
析・定量したり、その相互作用に影響を与える因子・化
合物などの物質を測定できる系、被検試料中のそれらの
物質などを検知・分別定量する優れた方法及びその為の
試薬キットを提供することにある。本発明はこうした試
薬キットのうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに
含むと理解される。さらに本発明の目的は、上記方法を
用いてKiSS-1 と各種MMPとの相互作用を検知・分別定量
することにより、細胞の移動・転移( 特にはがんや炎症
細胞などの移動・転移) 、細胞内タンパク質代謝、ホル
モン前駆体の活性化、および組織マトリックスあるいは
骨の改変など、多くの正常な細胞のプロセスに関与する
その相互作用の役割、アレルギー疾患、炎症性疾患、神
経変性疾患およびがんの浸潤・転移の様な多くの疾患な
どをモニターし得る方法並びに試薬あるいは診断剤を提
供することにある。したがって、医学的・生理学的分野
における上記試薬の各種利用、KiSS-1 と各種MMPとの相
互作用に起因する応答・症状・疾患の研究・解析・測
定、診断、予防、治療などの目的で上記試薬を使用する
ことは、すべて本発明のその実施態様のうちに含まれる
と理解される。

【００６９】本発明では、例えばhOT7T175と各種MMPと
の両者を含有しているスクリーニング試薬（各種MMPとh
OT7T175を共発現している細胞(KiSS-1を共発現している
ものを含めてよい) あるいはその細胞ホモジュネートな
ど）を使用して、KiSS-1 と各種MMPとの間の相互作用
（結合を含む）により生ずる、生物学的活性などの機能
（例えば、KiSS-1の不活性化、各種MMPとKiSS-1との結
合を抑制あるいは阻害する活性など）を抑制又は阻害す
る化合物又はそれらの塩をスクリーニングすることがで
き、それは試薬として有用である。また、本発明では、
例えばhOT7T175及び/ 又はKiSS-1と各種MMPとの両者を
含有しているスクリーニング試薬（各種MMPとhOT7T175
及び/ 又はKiSS-1を共発現している細胞あるいはその細
胞ホモジュネートなど）を使用して、がん転移抑制因子
などをスクリーニングする方法も提供される。該スクリ
ーニングでは、例えばhOT7T175と各種MMPとの共存下
（該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいてもよ
い、以下同様）などに変異KiSS-1産物、変異メタスチ
ン、変異メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するものなどの試験試料を接触させ
た場合と、そうでない場合との比較を行う。具体的に
は、上記スクリーニングでは、当該生物学的活性（例え
ば、KiSS-1 と各種MMPとの相互作用に関連した活性な
ど）を測定して、比較する。試験試料としては、例えば
タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、植物抽出物、動物などの組織抽出物、
細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試
験化合物の例には、好ましくは抗KiSS-1抗体、抗MMP 抗
体、KiSS-1産物、メタスチン及びその誘導体と各種MMP
との結合阻害剤（切断阻害剤を含む) 、MMPsインヒビタ
ー活性を有する化合物、特には合成化合物などを含んで
いてよい。これら化合物は、新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。

【００７０】該スクリーニングは、通常の結合活性の測
定法に準じて実施することができ、例えば当該分野で公
知の方法などを参考にして行うことができる。また、各
種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を使用したり、そ
こで説明した操作等に準じて行うことができる。測定は
通常トリス塩酸緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応に悪
影響を与えないような緩衝液等の中で、例えば、pH約４
〜約10 (好ましくは、pH約６〜約８）において行うこと
ができる。これら個々のスクリーニングにあたっては、
それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の
通常の技術的配慮を加えて、本発明のKiSS-1 と各種MMP
との間の相互作用あるいはそれと実質的に同等な活性を
有する系に関連した測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる〔例えば、Methods in Enzymolog
y, Academic Press 社 (USA)発行) など参照〕。本発明
のスクリーニング方法又はスクリーニングキットを用い
て得られる化合物又はその塩は、上記した試験化合物、
例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動
物組織抽出液などから選ばれた化合物であり、本発明の
KiSS-1関連ペプチドと各種MMPとの間の相互作用を抑制
あるいは阻害する化合物で、有利にはがん転移抑制活性
を持つものである。該化合物の塩としては、例えば、薬
学的に許容される塩などが挙げられる。例えば、無機塩
基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との
塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられ
る。

【００７１】明細書及び図面において、用語は、IUPAC-
IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる
か、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語
の意味に基づくものである。代表的な用語の意味を以下
に示す。 タンパク質、ペプチドなどのアミノ酸配列に関しては: A:アラニン (Ala) M:メチオニン (Met) C:システイン (Cys) N:アスパラギン (Asn) D:アスパラギン (Asp) P:プロリン (Pro) E:グルタミン酸(Glu) Q:グルタミン (Gln) F:フェニルアラニン(Phe) R:アルギニン (Arg) G:グリシン(Gly) S:セリン (Ser) H:ヒスチジン(His) T:スレオニン (Thr) I:イソロイシン(Ile) V:バリン (Val) K:リジン(Lys) W:トリプトファン (Trp) L:ロイシン(Leu) Y:チロシン (Tyr) ヌクレオチド配列に関しては: A:アデニン G: グアニン C:シトシン T: チミン

【００７２】

【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具
体的な態様の参考のために提供されているものである。
これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明する
ためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定
したり、あるいは制限することを表すものではない。本
発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可
能であることは理解されるべきである。全ての実施例
は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用
いて実施したもの、又は実施することのできるものであ
り、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。な
お、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、
具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニング
では J. Sambrook, E. F. Fritsch & T.Maniatis, "Mol
ecular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Labor
atory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 及び D. M.
Glover et al. ed., "DNACloning", 2nd ed., Vol. 1
to 4, (The Practical Approach Series), IRLPress, O
xford University Press (1995) ; 特にPCR 法では、H.
A. Erliched., PCR Technology, Stockton Press, 198
9 ; D. M. Glover et al. ed.,"DNA Cloning", 2nd e
d., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRLPr
ess, Oxford University Press (1995) 及び M. A. I
nnis et al. ed.,"PCR Protocols", Academic Press, N
ew York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、ま
た市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれら
に添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用して
いる。以下の実施例で使用した材料につき説明する。Du
lbecco's modified Eagles's medium (DMEM)は日水より
入手した。プライマーはGensetにより合成し、ヒト胎盤
cDNAライブラリーはEdgeBio Systems より入手した。次
に、MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MMP-2, MMP-9 及びTI
MP-2発現プラスミド、さらにMT1-MMP, MT2-MMP及び MT3
-MMPに対するモノクローナル抗体は、文献: Sato, H.,
et al., Nature, 370 (6484): 61-65 (1994); Takino,
T., etal., J. Biol. Chem., 270: 23013-23020 (199
5);およびTanaka M., et al., FEBS Lett., 402: 219-2
22 (1997)の記載に従って得られた。細胞培養に関し
て、FHEK293T細胞および COS-1細胞は５％ウシ胎児血清
含有DMEM培地中で培養した。

【００７３】実施例１ 〔発現クローニング〕J. Biol. Chem., 276, 28204-282
11 (2001) 記載の方法に従って、発現クローニングを実
施した。ヒト胎盤由来発現プラスミドライブラリーの発
現プラスミドを、MMP-2, MMP-9およびMT1-MMP の発現プ
ラスミドと共にヒト胎児腎臓(human embryonic kidney)
由来293T細胞(HEK 293T)に導入した。発現ベクターpEAK
8 上に構築されたヒト胎盤cDNAライブラリー(EdgeBio S
ystems, Gaithersburg, MD) は、非増幅の大腸菌クロー
ンとして得た。30のバクテリアクローンを２mlの MMI培
地(4mM Tris-HCl, pH 7.2, 1.25%トリプトン, 2.5%酵母
抽出物, 125 mM NaCl, 0.4% グリセロール) で37℃で一
晩培養し、プラスミドDNA をアルカリSDS 法で抽出、ポ
リエチレングリコールによる沈殿として精製した。これ
をヒト胎盤由来発現プラスミドライブラリーの発現プラ
スミドDNA として使用した。遺伝子導入の24時間前に、
HEK 293T細胞を５％牛胎児血清含有DMEMで、96穴（ウエ
ル）マイクロタイタープレート 1穴あたり 5 x 10⁴個/
0.1 ml でまき込んだ。proMMP-2、proMMP-9、MT1-MMP
の全長cDNAをpSG5(Stratagene)のクローニングサイトに
挿入した発現ベクターを作成し、１穴あたりproMMP-2発
現プラスミド20ng、proMMP-9発現プラスミド3ng 、MT1-
MMP 発現プラスミド30ngを、そしてヒト胎盤由来発現プ
ラスミドライブラリーから調製したプラスミドDNA(100
ng) とともにトランスフェクション試薬TransIT LT1(Mi
rus, Madiso, WI)を用い、その使用書に従って、導入し
た。遺伝子導入後37℃で48時間培養した後、培地を除
き、細胞を１穴あたり50マイクロリットルの SDS-PAGE
サンプルバッファー (50 mMTris-HCl pH6.8, 10% グリ
セロール, 0.1% bromophemol blue, 2% SDS)中で穏やか
な超音波破砕をかけ、可溶化した。細胞可溶化物はゼラ
チンザイモグラフィー(Kadono, Y., et al., Cancer Re
s., 58: 2240-2244 (1998)) により分析した。その細胞
可溶化物は37℃で30分加温後、５マイクロリットルをゼ
ラチンザイモグラフィーに供した。結果を、図１に示
す。

【００７４】MMP-2 、MMP-9 およびMT1-MMP cDNAの遺伝
子導入により、潜在型MMP-9(proMMP-9) の92kDa のバン
ド、潜在型MMP-2(proMMP-2) の68kDa のバンド、中間型
MMP-2 、および活性型MMP-2 の64kDa のバンドを生じ、
発現プラスミドライブラリーから調製したプラスミドDN
A の共導入により、MT1-MMPを介したMMP-2活性化を促進
する遺伝子が同定された一方、プロMMP-2あるいはプロM
MP-9より大きい分子量側にシフトしたところに、新しい
約110 kDaのバンドが観察された（図１) 。該110 kDaバ
ンドを発生させた、プラスミドに挿入されたcDNAは、65
0 bpで、その配列を解析した。該cDNAは、該プラスミド
を大腸菌株 XL1-Blue (Stratagene)に導入し、そして大
腸菌コロニーは、2 ml MMI培地で生育せしめ、プラスミ
ドDNA を精製した。該cDNA配列は、LI-COR DNAシークエ
ンサーModel4200L(S)-2 を使用し、その塩基配列を決定
した。核酸配列のホモロジー解析により、このクローン
が、転移抑制遺伝子 KiSS-1 (GeneBank^TM accession nu
mber NM#002256)の一部であることが明らかになった。G
eneBank^TM accession number NM#002256 記載のKiSS-1
アミノ酸配列を配列番号: 1 に記載した。以下、KiSS-1
タンパク質、メタスチンおよびそれぞれの変異タンパク
質のアミノ酸配列番号は、配列番号:1の記載に基づく。 Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly Gln 〔配列番号:1〕

【００７５】実施例２ 〔組換えKiSS-1タンパク質の作成〕 His-6および終止コドンをコードするDNAフラグメント
は、 GATCTCATCATCATCATCATCATTGAG 〔配列番号:2〕 GATCCATGATGATGATGATGATGATGA 〔配列番号:3〕 のオリゴDNAをアニールさせ作成し、FLAG-CTCプラスミ
ド(IBI FLAG Biosystems,NY)のBgl IIサイトに挿入し
た。これをHis-6-CTCと称した。ヒト胎盤のトータルRNA
から8 mer のランダムプライマーとReverTra Ace逆転
写酵素(TOYOBO, Japan) を用いてcDNAを合成し、それを
鋳型にし、以下のプライマーを用いて、組換えKiSS-1を
コードするKiSS-1 cDNA を得た。KiSS-1のアミノ酸20位
から145位をコードするKiSS-1 cDNAは ACCTCGAGGAGCCATTAGAAAAGGTGGCCT 〔配列番号:4〕 ATAGATCTGCCCCGCCCAGCGCTTCTGCCG 〔配列番号:5〕 をプライマーとするPCRで作成した。フォワードプライ
マー〔配列番号:4〕には、Xho Iサイト、リバースプラ
イマー〔配列番号:5〕にはBgl IIサイトを付加した(下
線部)。発現したタンパク質をKiSS-1(20-145)と称し
た。KiSS-1のアミノ酸68位から145位をコードするKiSS-
1 cDNAは GAGCCTCGAGGGGACCGCTCTGTCCCCGCC 〔配列番号:6〕 ATAGATCTGCCCCGCCCAGCGCTTCTGCCG 〔配列番号:5〕 をプライマーとするPCRで作成した。フォワードプライ
マー〔配列番号:6〕には、Xho Iサイト、リバースプラ
イマー〔配列番号:5〕にはBgl IIサイトを付加した(下
線部)。発現したタンパク質をKiSS-1(68-145)と称し
た。KiSS-1のアミノ酸20位から121位をコードするKiSS-
1 cDNAは ACCTCGAGGAGCCATTAGAAAAGGTGGCCT 〔配列番号:4〕 CGAGATCTGAAGCGCAGGCCGAAGGAGTTC 〔配列番号:7〕 をプライマーとするPCRで作成した。フォワードプライ
マ〔配列番号:4〕には、Xho Iサイト、リバースプライ
マー〔配列番号:7〕にはBgl IIサイトを付加した(下線
部)。発現したタンパク質をKiSS-1(20-121)と称した。
それぞれの増幅DNA断片は、Xho IおよびBgl IIで切断
し、His-6-CTCベクターのXho IおよびBgl IIサイトに挿
入した。大腸菌株BL20は、これらのプラスミドで形質転
換され、0.5 mM IPTGでタンパク質の発現が誘導され
た。細胞を集め、0.5% Triton X-100含有のPBS中で超音
波破砕した。His-6タグタンパク質は、Ni²⁺chelating s
epharose (Amerhsam Pharmacia Biotech)によって、上
清から精製し、TNC buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM N
aCl, 10 mM CaCl₂, 0.02 % NaN₃)で透析した（図２) 。

【００７６】実施例３ 〔MMPによる組換えKiSS-1タンパク質の切断〕実施例２
で作成した16 kDaの組換えKiSS-1(20-145)タンパク質を
MT3-MMPとインキュベートした結果、6 kDaと10 kDaの2
つの断片に開裂した。また、MT3-MMPとインキュベート
した結果、14 kDaのKiSS-1(20-121)は4 kDaと10 kDaの2
つの断片に開裂し、11 kDaのKiSS-1(68-145)も切断さ
れ、6 kDaの分解産物が観察された（図３) 。16 kDaの
組換えKiSS-1(20-145)タンパク質を種々のMMP とインキ
ュベートした。KiSS-1(20-145)タンパク質の切断は、MT
1-MMP、MT5-MMP、MMP-2 およびMMP-9でも観察された
（図４) 。

【００７７】実施例４ 〔KiSS-1タンパク質切断部位の決定〕組換えKiSS-1(20-
145)タンパク質(200 ng)を組換えMT3-MMP活性ドメイン
(20 ng)と50μLのTNC buffer中で37℃、3時間インキュ
ベートし、得られた断片をPVDFメンブレンにブロットし
た。それぞれのN-末端アミノ酸配列は、Beckman Coulte
r LF300アミノ酸シークエンサーで決定した。6 kDa断片
のN-末端側の配列から、KiSS-1タンパク質は、配列番
号:1の118位のグリシンと119位のロイシンとの間で切断
されることが示された。KiSS-1(20-121)およびKiSS-1(6
8-145)の切断も同一のサイトで起こることが確認され
た。

【００７８】実施例５ 〔MMPによるKiSS-1(112-121)の切断〕メタスチンは、G
タンパク質共役型受容体(hOT7T175)のリガンドとして同
定されたもので、C-末端側がアミド化したKiSS-1タンパ
ク質の68位から121位のアミノ酸からなる。リセプター
に高い親和性を持つ最も短いKiSS-1タンパク質は、10ア
ミノ酸残基のアミド化ペプチドで、KiSS-1タンパク質の
112位から121位のアミノ酸(KiSS-1(112-121))からな
る。KiSS-1(112-121)ペプチドとそのMT3-MMP切断産物
を、ヒドロキシアパタイトカラムC18MG(Shiseido Fine
Chemicals, Tokyo,Japan)によるHPLC(Hitachi)で分析し
た。KiSS-1(112-121)もまた、MT3-MMP(図5)および他のM
MPsでも切断された。

【００７９】実施例６ 〔MMPsによるKiSS-1(112-121)機能の不活性化〕メタス
チンリセプター(hOT7T175)のcDNAは、ヒト胎盤cDNAライ
ブラリーを鋳型とし、次のプライマー: GCGAATTCATGCACACCGTGGCTACGTCCG 〔配列番号:8〕 CAGATCTGAGAGGGGCGTTGTCCTCCCCCA 〔配列番号:9〕 によるRT-PCRによって得た。PCR産物はプライマーに導
入したEco RIとBgl II制限酵素サイト(下線部)で発現ベ
クターpSG5にクローン化した。HeLa細胞はGFPとhOT7T17
5 cDNAを共導入、48時間培養した後、100 nMのKiSS-1(1
12-121)と1時間反応させ、ローダミン ファロイジンで
染色した。細胞は、倒立共焦点レーザー顕微鏡(Carl Ze
iss, Inc.)で観察した。hOT7T175遺伝子を導入したHeLa
細胞をKiSS-1(112-121)有無の条件下で処理し、細胞の
運動性を低下させるアクチンストレスファイバーとフォ
ーカルアドヒージョンの発生を観察した。メタスチン処
理すると、hOT7T175を発現した細胞のみでアクチンスト
レスファイバーとフォーカルアドヒージョン形成を誘導
した。KiSS-1(112-121)の効果は、hOT7T175とMT1-MMPの
共発現させた細胞には無効であった（図６) 。また、MT
3-MMP で切断したKiSS-1(112-121)は、その効果を失っ
た。

【００８０】実施例７ 〔MMPによる変異KiSS-1タンパク質の切断〕KiSS-1(68-1
45)タンパク質の118位のグリシンをロイシンに置換した
KiSS-1変異タンパク質をコードするcDNAは、下線の変異
を導入した次なるオリゴヌクレオチド配列: GGAACTCCTTCGGCGGGCGCTTCGGCAAGC 〔配列番号:10 〕 GCTTGCCGAAGCGCCCGCCGAAGGAGTTCC 〔配列番号:11 〕 をプライマーとするPCRで作成した。増幅DNA断片は、Xh
o IおよびBgl IIで切断し、His-6-CTCベクターのXho I
およびBgl IIサイトに挿入した。大腸菌株BL20は、この
プラスミドで形質転換され、0.5 mM IPTGでタンパク質
の発現が誘導された。細胞を集め、0.5% Triton X-100
含有のPBS中で超音波破砕した。His-6タグタンパク質
は、Ni²⁺ chelating sepharose (Amerhsam Pharmacia B
iotech)によって、上清から精製し、TNC buffer (50 mM
Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02 % NaN3)
で透析した。得られた変異タンパク質をKiSS-1(68-145)
G118Lと称した。実施例3と同様に11 kDaのKiSS-1(68-14
5)およびKiSS-1(68-145)G118LをMT3-MMPとインキュベー
トした。KiSS-1(68-145)からは6 kDaの分解産物が観察
されたが、KiSS-1(68-145)G118L では分解が見られず、
KiSS-1(68-145)G118L は、MMPに対して耐性を獲得した
ことが示された（図７) 。

【００８１】実施例８ 〔MMPによるメタスチンの切断〕実施例７で作成したMMP
耐性KiSS-1(68-145)G118Lと同じ変異を導入したC-末端
アミド化ペプチドKiSS-1(112-121)G118Lを合成した。Ki
SS-1(112-121)G118Lのアミノ酸配列を配列番号12に記載
した。 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Leu Leu Arg Phe 〔配列番号:12 〕 このペプチドもMT3-MMPとインキュベートしたが、分解
は観察されずMMPに対して耐性を獲得したことが示され
た。また、118位のグリシンをアラニンに置換したC-末
端アミド化ペプチドKiSS-1(112-121)G118Aを合成した。
KiSS-1(112-121)G118Aのアミノ酸配列を配列番号13に記
載した。 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Ala Leu Arg Phe 〔配列番号:13 〕 このペプチドも耐性のあるがん転移抑制剤として期待で
きる。

【００８２】

【発明の効果】本発明により、がん転移抑制遺伝子KiSS
-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54) などの不活性
化機構を解明する途が開かれ、がん転移抑制因子の活性
を調整し、様々ながん転移抑制因子や薬剤に有用な物質
などが提供でき、それにより癌の転移・浸潤などを含め
た疾患、病気の予防・治療用の薬剤（医薬品、診断薬な
ども含む）が提供できる。本発明は、MMPsによるKiSS-1
関連物質、特にはがん転移抑制因子の不活性化に起因す
る疾患の診断、該不活性化に付随する病的な状態の原因
究明、診断・リスク予知などに有用である。該MMPsによ
るがん転移抑制因子の切断に抵抗性の変異KiSS-1あるい
は変異メタスチン並びにその誘導体ペプチドなどの活性
物質を作製し、癌の浸潤及び／又は転移を含む病体病的
な状態あるいは症状の予防及び／又は治療のための医
薬、これを用いた測定系、生物活性調整系を開発するこ
とが可能で、がんの転移、浸潤の診断などにも有用であ
る。本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以
外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑
みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従っ
てそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものであ
る。

【００８３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI FINE CHEMICAL CO., LTD. <120> Stabilization of Metastasis Suppressors <130> P-02NF383 <140> <141> <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15 His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg 20 25 30 Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu 35 40 45 Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser 65 70 75 80 Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala 85 90 95 Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr 100 105 110 Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly 130 135 140 Gln 145 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 gatctcatca tcatcatcat cattgag 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 gatccatgat gatgatgatg atgatga 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 acctcgagga gccattagaa aaggtggcct 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 atagatctgc cccgcccagc gcttctgccg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 gagcctcgag gggaccgctc tgtccccgcc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 7 cgagatctga agcgcaggcc gaaggagttc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 8 gcgaattcat gcacaccgtg gctacgtccg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 9 cagatctgag aggggcgttg tcctccccca 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 10 ggaactcctt cggcgggcgc ttcggcaagc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 11 gcttgccgaa gcgcccgccg aaggagttcc 30 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide resistant to MMP <400> 12 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Leu Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed peptide resistant to MMP <400> 13 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Ala Leu Arg Phe 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト胎児腎臓由来293T細胞中に、ヒト胎盤由
来発現プラスミドライブラリーからの発現プラスミド
と、MMP-9 、MMP-2 およびMT1-MMP の発現プラスミドと
を共に導入し、得られた細胞可溶化物についてゼラチン
ザイモグラフィーを行った結果の電気泳動写真である。
レーン２、７、16及び19で潜在型MMP-9並びに潜在型、
中間型及び活性型MMP-2 のバンド以外に110 kDa の新し
いゼラチン分解のバンド（←）が観察された。

【図２】 PCR で作成した各種KiSS-1 cDNA をHis-6-CT
C ベクターに挿入し、それでもって大腸菌を形質転換せ
しめ、次に発現により得られたHis-6-タグタンパク質を
アフィニティークロマトグラフィーで分離した結果の電
気泳動写真である。レーン１は、KiSS-1 (20-145) 、レ
ーン２は、KiSS-1 (20-121) 、そしてレーン３は、KiSS
-1 (68-145) の作成された組換えKiSS-1タンパク質を示
している。

【図３】 各種組換えKiSS-1タンパク質（KiSS-1 (20-1
45), KiSS-1 (20-121)及びKiSS-1 (68-145))をMT3-MMP
とインキュベートした結果の電気泳動写真である。16 k
Daの組換えKiSS-1(20-145)タンパク質をMT3-MMPとイン
キュベートした結果、6 kDaと10 kDaの2つの断片に開裂
した。また、14 kDaのKiSS-1(20-121)は4 kDaと10 kDa
の2つの断片に開裂し、11 kDaのKiSS-1(68-145)も切断
され、6kDaの分解産物が観察された。

【図４】 組換えKiSS-1 (20-145) タンパク質を種々の
MMPs (MT1-MMP, MT3-MMP, MT5-MMP, MMP-2及びMMP-9)と
インキュベートした結果の電気泳動写真である。KiSS-1
(20-145)タンパク質の切断は、MT3-MMP 以外のMT1-MM
P、MT5-MMP、MMP-2 およびMMP-9でも観察された。

【図５】 KiSS-1(112-121)ペプチドとそのMT3-MMP切断
産物を、ヒドロキシアパタイトカラムC18MG(Shiseido F
ine Chemicals, Tokyo, Japan)によるHPLC(Hitachi)で
分析した結果を示す。KiSS-1 (112-121)は、MT3-MMP で
切断されている。

【図６】 MT1-MMP及びhOT7T175遺伝子を共導入したHeL
a細胞及びhOT7T175遺伝子のみを導入したHeLa細胞を、K
iSS-1(112-121)有無の条件下で処理し、細胞の運動性を
低下させるアクチンストレスファイバーとフォーカルア
ドヒージョンの発生を観察した結果を示している細胞の
形態を示す写真である。細胞は、ローダミン ファロイ
ジンで染色し、倒立共焦点レーザー顕微鏡(Carl Zeiss,
Inc.)で観察した。KiSS-1(112-121)処理は、hOT7T175
を発現した細胞のみでアクチンストレスファイバーとフ
ォーカルアドヒージョン形成を誘導したが、hOT7T175と
MT1-MMPの共発現させた細胞には無効であった。

【図７】 11 kDaの組換えKiSS-1(68-145)及び118位の
グリシンをロイシンに置換した変異タンパク質KiSS-1(6
8-145)G118LをMT3-MMPとインキュベートした結果の電気
泳動写真である。KiSS-1(68-145)からは6 kDaの分解産
物が観察されたが、KiSS-1(68-145)G118L では分解が見
られず、KiSS-1(68-145)G118L は、MMPに対して耐性を
獲得したことが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/64 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 GA11 4B063 QA05 QA18 QQ08 QQ20 QR16 QR48 QR51 QR77 4C084 AA02 AA17 BA44 CA18 CA29 DC32 NA03 NA05 NA14 ZB261 ZB262 ZC022 ZC202 4H045 AA10 BA10 CA46 EA28 FA72 FA74 HA05

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタス
   チン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のア
   ミノ酸配列を含有するものに対するMMPsによる切断を阻
   害するものであることを特徴とする切断阻害剤。
2. 【請求項２】 切断阻害剤がMMP阻害剤であることを特
   徴とする請求項１記載の阻害剤。
3. 【請求項３】 (1) MMP阻害剤及び(2) (i) がん転移抑
   制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54)
   及びそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するもの
   から成る群から選ばれたものとを含有していることを特
   徴とするKiSS-1産物及びメタスチン並びにその誘導体の
   安定化組成物。
4. 【請求項４】 (i) がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メ
   タスチン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一
   のアミノ酸配列を含有するものから成る群から選ばれた
   ものをMMP阻害剤により安定化することを特徴とするKiS
   S-1産物並びにメタスチン及びその誘導体の安定化法。
5. 【請求項５】 (1) MMP阻害剤及び(2) (i) がん転移抑
   制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、メタスチン(45-54)
   及びそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するもの
   から成る群から選ばれたものとを含有しており、がん転
   移抑制活性を有することを特徴とする安定化がん転移抑
   制剤。
6. 【請求項６】 (i) がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メ
   タスチン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一
   のアミノ酸配列を含有するものから成る群から選ばれた
   ものをMMP阻害剤により安定化することを特徴とするが
   ん転移抑制剤の安定化法。
7. 【請求項７】 がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタス
   チン、メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のア
   ミノ酸配列を含有するものから成る群から選ばれたもの
   であるが、MMPsから成る群から選ばれたものの切断に対
   して抵抗性が付与されているかあるいはMMPsから成る群
   から選ばれたものの切断部位に変異を導入したものであ
   ることを特徴とする変異KiSS-1タンパク質並びに変異メ
   タスチン及びその誘導体。
8. 【請求項８】 配列番号:1のGly¹¹⁸-Leu¹¹⁹ の間でのMM
   P の切断に対して抵抗性であるかあるいは該切断部位Gl
   y¹¹⁸-Leu¹¹⁹ に変異を有していることを特徴とする請求
   項７記載の変異KiSS-1タンパク質並びに変異メタスチン
   及びその誘導体。
9. 【請求項９】 請求項７又は８記載の変異KiSS-1タンパ
   ク質並びに変異メタスチン及びその誘導体から成る群か
   ら選ばれたものを有効成分として含有することを特徴と
   する医薬。
10. 【請求項１０】 がん転移抑制のためのものであること
    を特徴とする請求項９記載の医薬。
11. 【請求項１１】 (1) MMPsから成る群から選ばれたもの
    及び(2) がん転移抑制遺伝子KiSS-1産物、メタスチン、
    メタスチン(45-54) 及びそれと実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するものから成る群から選ばれたものに対す
    るレセプターとの共存下に、試験試料を、転移性細胞と
    接触せしめることを特徴とするがん転移抑制剤のスクリ
    ーニング方法。