KR102209869B1

KR102209869B1 - 키스펩틴을 포함하는 항노화 또는 항염증 조성물

Info

Publication number: KR102209869B1
Application number: KR1020180125412A
Authority: KR
Inventors: 정수경; 모상현; 윤석균; 이경은; 경서연; 강승현; 김연준; 박명삼; 이정훈; 서효현
Original assignee: 코스맥스 주식회사; 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2021-02-01
Also published as: KR20190070253A

Abstract

키스펩틴을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 키스펩틴 또는 그의 활성 단편에 의하면, MMP-1 또는 염증성 사이토카인의 억제 활성을 가져, 피부 노화, 피부 손상, 피부 상태, 또는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

키스펩틴을 포함하는 항노화 또는 항염증 조성물{Composition for anti-aging or anti-inflammation comprising kisspeptin}

키스펩틴을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

기능성 화장품은 피부노화를 지연시켜 피부의 주름개선에 도움을 주는 제품, 자외선 및 외부환경으로부터 피부를 보호하는 제품, 또는 피부의 미백에 도움을 주는 제품을 포함할 수 있다. 이러한 기능성 화장품의 개발을 위해서는 피부 내에서 생리적으로 효능을 나타낼 수 있는 기능성 원료의 개발이 선행되어야 한다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 된다. 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

피부 노화 현상에 대한 자세한 메커니즘으로는 각질형성세포 및 섬유아세포의 분열 감소, 콜라겐 합성의 감소, MMP (Matrix metalloproteinase)생성의 증가, 멜라닌 생성의 신호 전달 증가 등이 발생하게 되고, 이로 인하여 주름은 증가하게 되고 피부의 탄력은 감소하며, 기미, 주근깨 및 검버섯 등은 증가하게 된다. 특히, 40대 전후로 호르몬의 균형이 깨져 세포 재생 능력, 콜라겐의 합성 능력, 피부 보습에 중요한 역할을 하는 피부 지질의 생성 능력이 크게 저하된다. 또한, 폐경 후 첫 5년 동안 콜라겐은 약 30％ 감소하며, 이들 콜라겐 섬유들의 비정상적인 엉킴 현상이 증가하여 피부 탄력이 현저히 저하되며, 피부 속의 수분을 담당하는 히아루론산과 당단백질의 일종인 글리코스아미노글리칸의 생성량이 현저히 저하된다고 알려져 있다.

한편, 자외선은 반복적으로 스트레스 호르몬을 활성화하여 피부에 해를 입힌다. 이는 스테로이드를 피부에 과량 도포하였을 시와 동일하게 진피 섬유 조직의 붕괴와 같은 피부 부작용을 가져올 수 있다. 자외선 자극은 사람 피부에서 코티졸 과 같은 스트레스 호르몬으로 알려져 있는 글루코코르티코이드 활성의 주요 원인이다. 또한 이는 코티졸 을 활성화하는 인체 내 효소인 11β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 타입 1(11β-HSD1)의 발현을 증가시킨다. 자외선에 의한 11β-HSD1의 활성 및 발현 증가는 피부 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 피부 노화 억제를 위한 새로운 타겟으로 주목되고 있다.

염증은 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응인데, 과도한 염증 반응 또한 피부 손상의 주요 원인이다. 염증이 발생하면, 여러 종류의 다핵형 백혈구(PMNs)와 면역 물질의 증가를 초래하고, 이들 세포들은 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해효소(엘라스테이스, 히알루리니데이스 및 리폭시게네이스 등)와 사이토카인(cytokine)을 분비하게 된다. 이후 이들의 작용은 인접해 있는 조직 세포와 비 조직세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키고, 만성염증의 심각한 조직 손상을 가져올 수 있다. 또한, 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 되어 빠른 피부노화를 초래하게 된다.

이와 같은 피부 노화 현상 및 염증을 개선하기 위한 다양한 방법이 응용되고 있는데, 최근 다양한 단백질들이 상기와 같은 피부 손상 회복을 위해 연구되어 오고 있다. 최근 키스펩틴 단백질은 성적 성숙 조절 치료제 및 암 억제제로 연구가 활발히 진행되어 왔으나 키스펩틴 발현에 따른 피부 노화와 염증에 미치는 연구와 실험은 미미한 실정이다.

일 양상은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 예방, 개선 또는 치료용, 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 노화의 억제 또는 개선용, 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 포함하는 피부 상태의 예방 개선 또는 치료용, 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

일 양상은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

용어 "키스펩틴(Kisspeptin)"은 메타스틴(metastin) 또는 KISS-1 펩티드와 상호교환적으로 사용되며, KISS1 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 의미할 수 있다. 키스펩틴은 GPR54에 대한 G-단백질 결합 수용체 리간드이며 흑색 종 및 유방암 전이를 억제하는 능력을 가진 인간 전이 억제 유전자로 알려져 있다. 키스펩틴-GPR54 시그널링은 사춘기에 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)의 분비를 시작하는데 중요한 역할을 하며, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬은 시상 하부에서 방출되어 뇌하수체 전엽에 작용하여 황체 형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 유발한다. 키스펩틴은 직접적으로 GnRH 방출을 자극할 수 있으므로 스테로이드 호르몬의 부정 및 긍정적인 피드백 신호를 GnRH 신경 세포(neurons)에 전달하고, 사춘기의 개시에 대한 게이트키퍼(gatekeeper)로서 역할을 하며, 중계(relaying) 및 광주기성(photoperiodic) 정보를 전달할 수 있다. 상기 키스펩틴은 서열번호 1의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.

상기 활성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 27번째 내지 54번째, 45번째 내지 49번째, 또는 45 번째 내지 54번째의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 활성 단편의 C 말단은 아미드화(amidation)된 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 활성 단편은 서열번호 2 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.

용어 "치료 또는 개선"은 질환, 장애, 상태 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애, 상태 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다. 상기 유효량(또는 투여량)은 0.0001mg 내지 10,000mg, 0.001mg 내지 1000mg, 1.0mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 상기 키스펩틴 또는 그의 활성 단편은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 키스펩틴 또는 그의 활성 단편은 MMP(Matrix metalloproteinase), 11β-HSD1 또는 염증 인자, 예를 들면 염증성 사이토카인, IL-6, 또는 IL-8을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 키스펩틴 또는 그의 활성 단편은 피부 노화, 피부 손상, 피부 상태 또는 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

따라서, 상기 조성물은 노화, 예를 들면, 피부 노화, 피부 손상, 피부 상태 또는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다. 상기 키스펩틴 또는 그의 활성 단편은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

상기 피부 상태 또는 피부와 관련된 상태의 예는, 피부 노화, 피부 광노화, 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 또는 여드름, 구진인설질환, 곤충 및 기생충 매개 질환, 표재성 피부 진균증, 세균 감염 질환, 바이러스 질환, 성인성 질환, 자가면역 수포성 질환, 결체조직 질환, 색소이상증, 색소성 건피증 등을 포함할 수 있다.

상기 피부 손상은 외부의 물리적 손상, 화학 물질, 세균, 곰팡이, 바이러스 등의 침투, 자외선에 대한 노출, 피부의 수분 손실, 노화 등에 의한 주름, 자유라디칼(활성산소) 등에 의한 산화, 피부 색소 침착, 피부 염증, 지루성 피부염, 붉어짐(발적, 홍반), 부종, 태선화, 습진, 소양감(가려움), 및 아토피 피부염 등을 포함하는 피부 조직 또는 세포의 임상적 및 미용적 관점에서의 손상을 포함할 수 있다.

상기 피부는 얼굴, 손, 팔, 다리, 발, 가슴, 배, 등, 엉덩이, 및 두피를 포함하는 신체의 모든 피부 부위를 포함한다.

상기 염증성 질환 또는 염증과 관련된 상태의 예는 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 및 급성 및 만성 염증 질환을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 노화 예방 또는 개선용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 피부 주름 예방 또는 개선용, 피부 손상 예방 또는 개선용, 또는 피부 염증 예방 또는 개선용인 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 피부외용제 조성물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 의약외품 조성물일 수 있다.

용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 상태 또는 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함할 수 있다.

상기 키스펩틴 또는 그의 활성 단편을 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 제라니올을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 개인위생용품, 피부외용제, 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제을 포함한다. 상기 개인위생용품은 비누, 물티슈, 휴지, 샴푸, 치약, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 조성물은 건강기능식품 조성물을 일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 키스펩틴 또는 그의 활성 단편 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태 또는 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

일 양상에 따른 키스펩틴 또는 그의 활성 단편에 의하면, MMP-1 또는 염증성 사이토카인의 억제 활성을 가져, 피부 노화, 피부 손상, 피부 상태, 또는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 키스펩틴의 활성 단편에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 키스펩틴의 활성 단편에 대한 화학구조와 삼차원 예상 구조 모델을 나타낸 도면이다; 키스펩틴-1(C₆₃H₈₃N₁₇O₁₄)의 (a)화학구조; (b) 삼차원 예상 구조 모델; 키스펩틴-E(C₃₁H₃₉N₉O₉)의 (c)화학구조; (d)삼차원 예상 구조.
도 3은 일 구체예에 따른 키스펩틴-1과 키스펩틴-E가 MMP-1의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 키스펩틴-1과 키스펩틴-E가 IL-6의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 5은 일 구체예에 따른 키스펩틴-1과 키스펩틴-E가 IL-8의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 키스펩틴-1과 키스펩틴-E가 11β-HSD1의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 키스펩틴 활성 단편의 제조

서열번호 1로 표시되는 키스펩틴으로부터 키스펩틴 활성 단편, Kisspeptin-1 (전체 키스펩틴의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 45번째 내지 54번째 아미노산 서열(서열번호 3))과 서열번호 2 및 4를 다음과 같이 제조하였다.

[합성 Scheme]

우선, 1) 고체상 펩타이드 합성법(Solid-Phase Peptide Synthesis;SPPS)에 의해 NH2-보호된 아미노산 잔기-레진을 수득하는 단계; 2) Cleavage 용액을 이용하여 레진으로부터 보호기가 제거된 펩타이드를 수득하는 단계; 3) 얻어진 정제되지 않은 펩타이드를 HPLC를 이용하여 정제하는 단계를 포함하여 상기 키스펩티의 활성 단편을 제조할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 2는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법에 의해 합성하였으며, 레진은 Fmoc으로 아미노기가 보호된 페닐알라닌이 결합된 Wang레진을 사용하였다. 아미노산 잔기의 연장은 N-히드록시벤조트리아졸(Nhydroxybenzotriazole;HOBt)과 N.N'-디이소프로필카보다이이미드(N,N'-Diisopropyl carbodiimide; DIC)를 활성제로 사용하여 반응시켰다. 각 단계별 결합시 사용된 아미노산과 HOBt, DIC는 레진의 5당량을 사용하였고, 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 반응 종료 후 DMF(Dimethylformamide)로 6회 세척 후 DCM(Dichloromethane)으로 6회 세척한 다음 레진을 건조 시켰다. 건조된 서열번호 1-Resin을 트리플루오로아세트산:트리아이소프로필실란:물(90:5:5(v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2시간 동안 반응시켜 펩타이드를 레진으로부터 분리시킨 다음 차가운 에테르(Ether)로 상기 펩타이드를 침전시켜 원심분리기를 이용하여 crude peptide를 얻었다. 수득한 서열번호 1의 펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 (Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography, column: Kromasil, C18, 5 μ, 110Å, 250*21.2mm)로 분리 정제하였다(수율 : 34.8%). 서열번호 3, 4 및 5도 상기와 동일한 방법으로 합성하였고, 수율은 각각 32.4%, 38.0% 및 35%이었다.

실험예 1. 키스펩틴의 MMP-1 저해능 평가

키스펩틴 모사 펩타이드가 피부 노화 및 피부 손상 억제 활성을 갖는지 확인하기 위해, 키스펩틴의 MMP-1 저해능을 평가하였다.

구체적으로, 키스펩틴은 Kisspeptin 1 (전체 키스펩틴의 아미노산 서열(서열번호 1)의 N-말단으로부터 45번째 내지 54번째 아미노산 서열에서 NH2가 캡핑된 것(서열번호 3))과 Kisspeptin E(전체 키스펩틴의 아미노산 서열(서열번호 1)의 N-말단으로부터 45번째 내지 49번째 아미노산 서열에서 NH2가 캡핑된 것(서열번호 5))를 사용하여 MMP-1 저해 여부를 확인하였다.

키스펩틴의 자외선에 의해 증가하는 콜라게나아제(MMP-1)에 대한 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 웰 플레이트에 4x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm²의 UVB를 조사하였다. 다음에, 양성 대조군으로서 아스코르브산 (Ascorbic acid, AA), 및 실험군으로서 키스펩틴 모사 펩타이드를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 나노드롭(nanodrop)을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 프라이머과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 실시간 PCR(real-time PCR) 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. PCR을 위한 프라이머의 서열과 반응 조건은 하기 표 1에 나타내었다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

주형(primer)	서열	반응 조건
MMP-1 정방향 프라이머	서열번호 8	94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃30초, 55 ℃30초, 72 ℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
MMP-1 역방향 프라이머	서열번호 9
β-actin 정방향 프라이머	서열번호 10
β-actin 역방향 프라이머	서열번호 11

도 1은 일 구체예에 따른 키스펩틴이 MMP-1의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 MMP-1 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 키스펩틴 처리군에서 그 발현량이 감소하는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과는, 키스펩틴이 MMP-1의 발현량을 억제함으로써 피부 노화와 피부 손상을 억제하다는 것을 의미한다.

실험예 2. 키스펩틴의 전염증성 인자 저해능 평가

키스펩틴이 항염증 활성을 갖는지 확인하기 위해, 키스펩틴의 전-염증성(pro-inflammatory) 인자인 IL-6 및 IL-8의 저해능을 평가하였다.

구체적으로, 섬유아세포주 Hs68을 6 웰 플레이트에 4x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm²의 UVB를 조사한 후, 키스펩틴을 농도별(1 nM, 10 nM, 100 nM, 및 1000 nM)로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 아래 표 2의 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로, UVB에 의해 과발현된 IL-6 및 IL-8의 발현 정도를 평가하였고, 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.

주형(primer)	서열	반응 조건
IL-6 정방향 프라이머	서열번호 12	94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃30초, 55 ℃30초, 72 ℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
IL-6 역방향 프라이머	서열번호 13
IL-8 정방향 프라이머	서열번호 14
IL-8 역방향 프라이머	서열번호 15

도 2는 일 구체예에 따른 키스펩틴이 IL-6의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.

도 3은 일 구체예에 따른 키스펩틴이 IL-8의 발현을 억제함을 나타낸 그래프이다.

도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 키스펩틴 처리군에서 LPS 유도된 IL-6 및 IL-8의 발현이 무처리 대조군에 비해 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 특히 IL-6의 발현량은 정상 대조군과 유사한 수준까지 발현량이 감소하였다. 이상의 결과는 일 구체예에 따른 키스펩틴이 항염증 활성을 가져, 염증, 예를 들면 피부 염증 또는 피부 손상의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

실험예 3. 키스펩틴의 스트레스 인자 저해능 평가

자외선에 의한 11β-HSD1의 활성 및 발현 증가는 피부 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 피부 노화 억제를 위한 새로운 타겟으로 주목되고 있다.

이에, 본 실험예에서는 키스펩틴 모사 펩타이드가 UVB로 유도된 11β-HSD1의 mRNA 발현을 저해하는지 확인하였다.

구체적으로, 사람 섬유아세포를 6 well 세포 배양 접시에 4 X 10⁵의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 12mJ 조사한 후 다음에, 양성 대조군으로서 아스코르브산, 및 실험군으로서 키스펩틴 모사 펩타이드를 농도별로 첨가하여 24 시간 동안 배양하였다. 이후에 세포를 회수하여 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 그 후 아래 표 3의 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로, UVB에 의해 과발현된 11

-HSD1의 발현 정도를 평가하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

프라이머	서열	반응 조건
11β-HSD1 정방향 프라이머	서열번호 16	94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95℃ 30초, 50℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응
11β-HSD1 역방향 프라이머	서열번호 17	94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95℃ 30초, 50℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응

도 4는 일 구체예에 따른 키스펩틴의 11β-HSD1 발현 억제 정도를 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 키스펩틴-1 및 키스펩틴-E 처리군에서 스트레스 호르몬 전환 효소인 11β-HSD1 발현이 무처리 대조군에 비해 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 특히 키스펩틴-E의 경우에는 양성대조군인 아스코르브산에 비해서도 11β-HSD1의 발현을 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 결과는 일 구체예에 따른 키스펩틴이 항염증 활성뿐만 아니라 피부 스트레스 호르몬 유발 효소 발현을 억제함으로써 외부 자극으로부터 야기될 수 있는 피부 노화를 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.

SEQUENCE LISTING <110> Coxmax Co., Ltd BIO-FD&C <120> Composition for anti-aging or anti-inflammation comprising kisspeptin <130> PN123675 <150> KR10-2017-170450 <151> 2017-12-12 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15 His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg 20 25 30 Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu 35 40 45 Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser 65 70 75 80 Pro Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala 85 90 95 Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr 100 105 110 Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly 130 135 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspetin fragment 1 <400> 2 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspeptin fragment 2, Amidation at C-terminal <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION at C-terminal <400> 3 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspeptin fragment 3 <400> 4 Tyr Asn Trp Asn Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspeptin fragment 4, Amidation at C-terminal <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> AMIDATION at C-terminal <400> 5 Tyr Asn Trp Asn Ser 1 5 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspeptin fragment 5 <400> 6 Ile Pro Ala Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Asn Trp Asn Ser Gly Leu Arg Phe 20 25 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kisspeptin fragment 6, Amidation at C-terminal <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> AMIDATION at C-terminal <400> 7 Ile Pro Ala Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Asn Trp Asn Ser Gly Leu Arg Phe 20 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MMP1 <400> 8 cgaattgccg acagagatga 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MMP1 <400> 9 gtccctgaac agcccagtac tt 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for b-actin <400> 10 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for b-actin <400> 11 gagaccttca acaccccagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL6 <400> 12 tacccccagg agaagattcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL6 <400> 13 ttttctgcca gtgcctcttt 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL8 <400> 14 ccaacacaga aattattgta aagc 24 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL8 <400> 15 tgaattctca gccctcttca a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 11b-HSD1 <400> 16 aagcagagca atggaagcat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 11b-HSD1 <400> 17 gaagaaccca tccaaagcaa 20

Claims

삭제
서열번호 2 내지 5으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키스펩틴의 활성 단편을 포함하는 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 피부 주름 예방 또는 개선용, 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
청구항 2에 있어서, 상기 키스펩틴은 MMP(Matrix metalloproteinase)를 억제하는 것인 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
서열번호 2 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 키스펩틴의 활성 단편을 포함하는 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 피부 주름 예방 또는 개선용, 또는 피부 노화 억제용 건강기능식품.