KR20210040407A - Peg화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료 - Google Patents

Peg화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20210040407A
KR20210040407A KR1020217006098A KR20217006098A KR20210040407A KR 20210040407 A KR20210040407 A KR 20210040407A KR 1020217006098 A KR1020217006098 A KR 1020217006098A KR 20217006098 A KR20217006098 A KR 20217006098A KR 20210040407 A KR20210040407 A KR 20210040407A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tent
ile
peg
asn
leu
Prior art date
Application number
KR1020217006098A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 맥클린
피터 스모커
루크 노버리
피터 콜로에
러셀 콘듀잇
안소니 사세
Original Assignee
스노어톡스 피티와이 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2018902779A external-priority patent/AU2018902779A0/en
Application filed by 스노어톡스 피티와이 엘티디 filed Critical 스노어톡스 피티와이 엘티디
Publication of KR20210040407A publication Critical patent/KR20210040407A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24068—Tentoxilysin (3.4.24.68), i.e. tetanus neurotoxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT) 및 제2 TeNT를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다양한 PEG-TeNT에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조성물 또는 다양한 PEG-TeNT를 사용하여 근긴장저하를 치료하는 방법, 및 상기 조성물 또는 다양한 PEG-TeNT를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 근긴장저하는 폐쇄성 수면 무호흡증이다.

Description

PEG화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT) 및 제2 TeNT를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 사용하여 근긴장저하(hypotonia)를 치료하는 방법에 관한 것이다.
파상풍 신경독소(TeNT)는 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)에 의해 생성된다. TeNT는 척수에 작용하여 억제성 신경전달물질인, γ-아미노부티르산(GABA) 및 글리신의 척추 억제성 인터뉴런에서의 방출을 차단한다. 이로써, TeNT는 경련성 마비를 유발한다. TeNT는 다중 혈청형으로 발생하지 않는다.
치료를 위해, TeNT, 또는 적어도 TeNT의 단편의 생물학적 특성을 활용하는 것이 제안되었다. 그러나, 단백질 치료제를 사용한 장기간의 치료는 표적 면역 반응을 유도하는 경향이 있다. 알려진 TeNT의 혈청형은 단 하나뿐이므로, 면역을 우회하기 위한 혈청형 전환은 TeNT-기반 치료요법의 선택사항이 아니다. 더욱이, 많은 인구가 TeNT에 대해 백신접종되었기 때문에, TeNT-기반 치료요법이 배제된다.
US 2002/0197278 A1은 부적절한 근육 수축의 장애를 치료하기 위한 PEG화된 보툴리눔 독소의 용도를 개시한다. US 2002/0197278 A1은 또한 부적절한 근육 수축의 장애, 예를 들어 이동성 두통 또는 사시증을 치료하기 위해 PEG화된 TeNT를 사용할 것을 제안한다. 그러나, 위에서 언급했듯이, TeNT는 근육 수축을 유발하므로, 부적절한 근육 수축의 장애의 치료를 위한 그 사용은, PEG화 여부에 관계 없이, 배제된다.
Wan 등. Process Biochemistry (2017) 52: 183-191은 PEG화된 단백질의 투여에 따른 항-PEG 면역 반응에 대한 PEG화의 효과를 개시하지만, 그 결과를 어떠한 치료요법에도 활용하지 않는다.
WO 2016/001762 A1은 근육 질량을 증가시키기 위한 PEG화된 TeNT 단편 c(c)의 용도를 개시한다. 단편 c(50 kDa)는 TeNT가 파파인에 의해 효소적으로 절단될 때 생성되고 TeNT 중쇄의 C-말단에 있는 451 아미노산에 해당한다. 단편 c는 소화되지 않은 TeNT의 결합, 내재화(internalization) 및 시냅스 간 수송 능력을 유지하지만, 어떠한 신경 과정도 방해하지 않으므로, 무독성이다.
파상풍 변성독소 면역화된 대상체에서 기존의 항-TeNT 면역 반응을 피하는 TeNT-기반 치료요법에 대한 필요성이 존재한다.
임의의 선행 기술 간행물이 본 명세서에서 언급되는 경우, 이러한 참조문헌은 간행물이 호주 또는 기타 국가에서 해당 기술분야의 일반적인 통상의 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않음이 이해되어야 한다.
본 발명자들은 단백질 치료제 투여시, 항체 반응을 생성함으로써 단백질 치료제의 효능을 감소시키는, 적응성 면역계로 인해 TeNT의 활용이 충분히 실현되지 않았음을 인식하였다. 적응성 면역 반응은 TeNT에 대해 면역화된 많은 인구에 의해 입증된 바와 같이, 백신접종의 결과로서, 의도적일 수 있다. 대안적으로, 적응성 면역 반응은 단백질 치료제에 대한 반복적 노출로 인한 것으로서, 비의도적일 수 있다.
본 발명자들은 변형된 TeNT의 계열과 이러한 문제를 해결하는 치료 양생법을 만들어냈다. 구체적으로, 본 발명은 각각 면역계를 회피하는 PEG화된 TeNT의 계열(PEG-TeNT), 및 이전에 투여된 PEG-TeNT의 효능이 감소하는 경우 또는 환자의 면역학적 프로파일로 인해 다른 PEG-TeNT를 사용할 수 없는 경우 치료를 위해 다른, 대체 PEG-TeNT를 사용하는 계층화된 치료 양생법을 제공한다.
제1 구현예는 서열번호 1과 비교하여 하나 이상의 표면 세린에서 시스테인으로의 아미노산 치환을 포함하는, 파상풍 신경독소(TeNT) 또는 이의 단편을 제공한다.
제1 구현예의 일 실시양태에서, 치환된 시스테인은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된다.
제2 구현예는 서열번호 1과 비교하여: R1225K; R1225E; W1288A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; 또는 R1225del 및 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함하는 TeNT 또는 이의 단편으로서, 상기 TeNT 또는 단편은 불활성인 TeNT 또는 이의 단편을 제공한다.
제3 구현예는 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT;를 포함하는 조성물로서, 상기 제1 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 조성물을 제공한다.
제4 구현예는 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 및 제2 TeNT;를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근긴장저하의 치료 방법을 제공한다.
또한 제4 구현예는 제2 TeNT가 투여된 대상체에서 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)의 용도를 제공한다.
또한 제4 구현예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)가 투여된 대상체에서 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제2 파상풍 신경독소(TeNT)의 용도를 제공한다.
또한 제4 구현예는 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT의 용도를 제공한다.
또한 제4 구현예는 제2 TeNT가 투여된 대상체의 근긴장저하의 치료 방법에서 사용하기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)를 제공한다.
또한 제4 구현예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)가 투여된 대상체의 근긴장저하의 치료 방법에서 사용하기 위한 제2 파상풍 신경독소(TeNT)를 제공한다.
또한 제4 구현예는 근긴장저하의 치료 방법에서 사용하기 위한 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT를 제공한다.
제4 구현예의 실시양태에서, 조성물은 제1 PET-TeNT 및 제2 TeNT를 포함할 수 있다.
또한 제4 구현예는 근긴장저하의 치료 방법에서 사용하기 위한 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT;를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG화된 TeNT 경쇄(LC), PEG화된 TeNT 중쇄(HC), PEG화된 TeNT 중쇄(HC) 및 PEG화된 TeNT 경쇄(LC), 또는 PEG화된 TeNT 단편 c(c)를 포함한다. 일 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG-TeNT-LC-HC를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT-HC이다. 이 실시양태에서, LC는 PEG화되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG화된 LC 및 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT-LC-c이다. 이 실시양태에서, HN은 PEG화되지 않는다.
추가의 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT는 PEG-TeNT-HC이고, 제2 TeNT는 PEG-TeNT-LC-c이다.
일 실시양태에서, 제2 TeNT는 불활성화된 TeNT를 포함한다. 서열번호 1과 비교하여, 불활성화된 TeNT는: R1225K; R1225E; W1288A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; R1225del 또는 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374A; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 TeNT는 R1225E 및 W1288A를 포함하는 불활성화된 TeNT를 포함한다.
일 실시양태에서, 효능이 감소할 때까지 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 효능이 감소할 때까지 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 포함하는 조성물; 이후 PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)가 대상체에게 투여된다.
일 실시양태에서, 치료는 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 포함하는 조성물; 이후 PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)를 대상체에게 투여하여, 대상체의 항-TeNT 항체의 면역학적 프로파일을 결정하고 그 프로파일에 기초하여 PEG-TeNT의 효과적인 조성물을 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 근긴장저하는 폐쇄성 수면 무호흡증이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 치료학적 조성물이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 화장료 조성물이다.
또한, 서열번호 6을 포함하는 아미노산을 암호화하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, TeNT LC 및 TeNT HN(LC-HN)으로 구성된 단백질의 제조 방법이 개시된다.
제5 구현예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는, PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)를 제공한다.
일 실시양태에서, TeNT 경쇄(LC)가 PEG화되거나, TeNT 중쇄(HC)가 PEG화되거나, 또는 TeNT 단편 c(c)가 PEG화된다. 일 실시양태에서, LC가 PEG화되고 HC가 PEG화(PEG-TeNT-LC-HC)되거나, 또는 LC가 PEG화되고 c가 PEG화(PEG-TeNT-LC-c)된다.
또 다른 실시양태에서, PEG는 TeNT의 라이신 잔기에 접합된다. 또 다른 실시양태에서, PEG는 TeNT의 시스테인 잔기에 접합된다. 일 실시양태에서, PEG는 TeNT의 시스테인 잔기에 접합되고, 상기 시스테인 잔기는 서열번호 1과 비교하여 세린 잔기에 대해 네이티브(native) 또는 치환이다.
일 실시양태에서, PEG는 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa의 분자량을 갖는다.
제6 구현예는 상기 제5 구현예의 PEG-TeNT를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근긴장저하의 치료 방법으로서, 상기 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 방법을 제공한다.
또한 제6 구현예는 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 상기 제5 구현예의 PEG-TeNT의 용도로서, 상기 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 용도를 제공한다.
대안적으로, 제6 구현예는 PEG-TeNT를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근긴장저하의 치료 방법에서 사용하기 위한 상기 제5 구현예의 PEG-TeNT로서, 상기 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 PEG-TeNT를 제공한다.
일 실시양태에서, PEG화된 HC를 포함하는 제1 PEG-TeNT(PEG-TeNT-HC) 및 PEG화된 LC 및 PEG화된 c를 포함하는 제2 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-c)가 대상체에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서, PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 및/또는 PEG화된 HC를 포함하는 제1 PEG-TeNT(PEG-TeNT-HC) 및 PEG화된 LC-c를 포함하는 제2 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-c); 및/또는 PEG화된 HC 및 PEG화된 LC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)가 대상체에게 투여된다.
일 실시양태에서, 치료는 효능이 감소할 때까지 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 그 후에, 치료는 효능이 감소할 때까지 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그 후에, 치료는 PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 치료는 효능이 감소할 때까지 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 효능이 감소할 때까지 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c; 이후 PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC);를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 치료는 효능이 감소할 때까지 약 5 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 효능이 감소할 때까지 약 10 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 효능이 감소할 때까지 약 20 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 그 후에, 치료는, 효능이 감소할 때까지, 둘 중 하나 또는 둘 다 5 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c; 이후 효능이 감소할 때까지, 둘 중 하나 또는 둘 다 10 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c; 이후 효능이 감소할 때까지, 둘 중 하나 또는 둘 다 20 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그 후에, 치료는, 효능이 감소할 때까지, 둘 중 하나 또는 둘 다 5 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC); 이후 효능이 감소할 때까지, 둘 중 하나 또는 둘 다 10 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC); 이후 둘 중 하나 또는 둘 다 20 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는, PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 치료는 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 포함하는 조성물; 이후 PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)를 대상체에게 투여하여, 대상체의 항-TeNT 항체의 면역학적 프로파일을 결정하고 그 프로파일에 기초하여 PEG-TeNT의 효과적인 조성물을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, TeNT를 사용한 치료는 불활성화된 TeNT를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 서열번호 1과 비교하여, 불활성화되 TeNT는: R1225K; R1225E; W1228A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; R1225del 또는 W1288del을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 TeNT는 R1225E 및 W1288A; E270A; Y374A; E270A 및 Y374A; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함하는 불활성화된 TeNT를 포함한다.
일 실시양태에서, 근긴장저하는 폐쇄성 수면 무호흡증이다.
제7 구현예는 상기 제1 구현예의 TeNT, 상기 제2 구현예의 조성물 또는 상기 제5 구현예의 PEG-TeNT를 포함하는 키트를 제공한다.
일 실시양태에서, 조성물 또는 PEG-TeNT는 각각 제3 또는 제6 구현예의 방법에 따라 사용된다.
도 1은 본 발명의 실시예 PEG-TeNT의 개략도이다: A PEG-TeNT-c; B PEG-TeNT-HC, C PEG-TeNT-LC-c, D PEG-TeNT-LC-HC, 여기서 TeNT는 전부이고 활성이고, 즉 TeNT는 사슬을 둘 다 포함하고, PEG화는 각각 특정 영역, 즉 c, HC, LC-c, 또는 LC-HC에 존재한다.
도 2는 1314의 아미노산을 포함하는 성숙된 TeNT의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.
도 3은 TeNT를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 핵산 서열(서열번호 2)이다.
도 4는 TeNT를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 맵이다. TeNT는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 5는 서열번호 1의 아미노산 457 내지 1314를 포함하는 HC의 아미노산 서열(서열번호 3)이다.
도 6은 서열번호 1 의 아미노산 864 내지 1314를 포함하는 c의 아미노산 서열(서열번호 4)이다.
도 7은 c를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT-c의 핵산 서열(서열번호 5)이다.
도 8은 c를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT-c의 맵이다. c는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 9는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 863을 포함하는 LC-HN의 아미노산 서열(서열번호 6)이다.
도 10은 LC-HN을 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT-LC-HN의 핵산 서열(서열번호 7)이다.
도 11은 LC-HN을 암호화는 벡터 pRSET-TeNT-LC-HN의 맵이다. LC-HN은 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 12는 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 비-작용성 c의 아미노산 서열(서열번호 8)이다.
도 13은 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 도 12의 비-작용성 c(서열번호 8)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT-c의 핵산 서열(서열번호 9)이다.
도 14는 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 도 12의 비-작용성 c(서열번호 8)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT-c의 맵이다. 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는, c는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 15는 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 비-작용성 TeNT의 아미노산 서열(서열번호 10)이다.
도 16은 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 도 15의 비-작용성 TeNT(서열번호 10)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 아미노산 서열(서열번호 11)이다.
도 17은 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는 도 15의 비-작용성 TeNT(서열번호 10)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 맵이다. 서열번호 1과 비교하여 아미노산 치환 W1288A 및 R1225E를 포함하는, TeNT는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 18은 서열번호 1과 비교하여 표면 세린에서 시스테인으로의 아미노산 치환 S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 성숙된 1314 아미노산 TeNT의 아미노산 서열(서열번호 12)이다.
도 19는 도 18의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 성숙된 TeNT(서열번호 12)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 핵산 서열(서열번호 13)이다.
도 20은 도 18의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 성숙된 TeNT(서열번호 12)를 암호화하는 도 19의 벡터 pRSET-TeNT(서열번호 13)의 맵이다. 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 TeNT는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 21은 LC 및 c 영역에서, 서열번호 1과 비교하여, 표면 세린에서 시스테인으로의 아미노산 치환 S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 성숙된 1314 아미노산 TeNT의 아미노산 서열(서열번호 14)이다.
도 22는 도 21의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 성숙된 TeNT(서열번호 14)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 핵산 서열(서열번호 15)이다.
도 23은 도 21의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 성숙된 TeNT(서열번호 14)를 암호화하는 도 22의 벡터 pRSET-TeNT(서열번호 15)의 맵이다. 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 TeNT는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 24는 서열번호 1과 비교하여 HC 표면 세린에서 시스테인으로의 아미노산 치환 S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 TeNT의 아미노산 서열(서열번호 16)이다.
도 25는 도 24의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 성숙된 TeNT(서열번호 16)를 암호화하는 벡터 pRSET-TeNT의 아미노산 서열(서열번호 17)이다.
도 26은 도 24의 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 TeNT(서열번호 16)를 암호화하는 도 25의 벡터 pRSET-TeNT(서열번호 17)의 맵이다. 표면 세린에서 시스테인으로 치환된 TeNT는 N-말단 히스6-태그와 함께 발현된다. 핵산을 pRSET-A 벡터의 MCS 내에 삽입하고 T7 프로모터의 제어 하에 발현시켰다.
도 27은 단백질 데이터 뱅크(접근 ID PDB: 5N0B)에 예치된 결정학 데이터로부터 유래된 TeNT의 3차원 단백질 구조 모델로서, 디스커버리 스튜디오를 사용하여 상기 모델에 대해, da Silva Antunes 등 (2017) 및 Palermo 등 (2017)에 의해 식별된 바와 같이, 주요 인간 항체 클로노타입(clonotype)에 의해 인식되는 에피토프를 맵핑한다. 식별된 에피토프의 내부 또는 주변의 표면 세린 잔기는 후속 PEG화를 위해 시스테인으로의 돌연변이를 위해 선별되었다.
도 28은 분자량이 증가하는 PEG를 포함하는 PEG-TeNT의 SDS-PAGE 분석 사진 2개를 포함하고, (A) 쿠마시 블루를 사용하여 및 (A) 폴리클로날 항-TeNT 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. (B)는 면역원성이 PEG 분자량에 비례함을 보여준다. 왼쪽 가장자리에 kDa이 표시된 분자량 마커 레인 1, TeNT 레인 2, 2 kDa PEG-TeNT-HC-LC 레인 3, 5 kDa PEG-TeNT-LC-HC 레인 4, 10 kDa PEG-TeNT-LC-HC 레인 5, 20 kDa PEG-TeNT-LC-HC 레인 6.
도 29는 경쟁적 ELISA 분석을 나타내는 4개의 선 그래프를 포함한다. 각각 상이한 분자량의 PEG(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)를 포함하는, 4개의 PEG-TeNT 및 4개의 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 폴리클로날 항-TeNT 항체를 사용하여 TeNT에 대해 분석하였다. (A) TeNT를 ELISA 플레이트에 흡착시킨 후 각각 4개의 PEG-TeNT 항원(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)의 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. (B) 각각의 PEG-TeNT(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)를 별도의 ELISA 플레이트에 흡착시킨 후 TeNT 항원의 각각의 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. (C) TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 ELISA 플레이트에 흡착시킨 후 각각 4개의 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 항원(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)의 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. (D) 각각의 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)를 별도의 ELISA 플레이트에 흡착시킨 후 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 항원의 각각 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다.
도 30은 PEG-TeNT-LC-HC가 주사된 암컷 C57BL/6 마우스의 뒷다리의 국소적 다리 근육경련(tetany)을 보여주는 4개 사진을 포함한다. A 및 B는 나이브 마우스에서의 국소적 다리 근육경련을 보여준다. C는 파상풍 변성독소로 백신접종된 마우스에 100 단위(unit)의 TeNT를 주사한 후 다리 근육경련이 없음(lack)을 보여주는 반면, D는 파상풍 변성독소로 백신접종된 마우스에 80 단위의 PEG-TeNT LC-HC 20 kDa을 주사한 후 다리 근육경련이 유지되는 것을 보여준다.
도 31은 정의된 수의 단위의 TeNT, PEG-TeNT-LC-HC 20 kDa, TeNT-LC-c 세린 돌연변이, PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 2 kDa, 또는 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 20 kDa을 주사한 후 암컷 C57BL/6 마우스의 뒷다리에 나타난 임상적 근육경련 수준을 보여주는 2점 도표를 포함한다. A) 마우스에 TeNT 또는 PEG-TeNT-LC-HC 20 kDa을 주사하였다. B) 마우스에 TeNT, TeNT-LC-c 세린 돌연변이, PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 2 kDa 또는 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이 20 kDa을 주사하였다. 하나의 단위는 나이브 마우스에서 24시간 내에 단계 4의 근육경련을 일으키는 데 필요한 독소의 최소량이다.
도 32는 파상풍 변성독소로 백신접종된 마우스에서 임상적 근육경련의 진행을 보여주는 2개의 선 그래프를 포함한다. A는 비활성화된 TeNT 디코이가 있거나 없는 4000 단위의 TeNT를 주사한 후 근육경련의 진행을 보여준다. B는 비활성화된 TeNT 디코이가 있거나 없는 40 단위의 TeNT-PEG 20 kDa을 주사한 후 근육경련의 진행을 보여준다. 두 경우 모두에서, 디코이의 존재에 의해 진행이 명백히 개선된다.
도 33은 실시예 23에 따라 치료된 브리티시 불독의 호흡 장애 지수(RDI)에 대한 파상풍 독소의 투여량 증가의 효과를 보여주는 박스 플롯이다. 검은색 막대는 각각의 파상풍 독소의 투여량에서 6개 연구의 중앙 RDI를 나타낸다. 음영처리된 박스는 사분위수 범위를 나타내고 브래킷(bracket)은 각 투여량에서 최소 및 최대 RDI 샘플을 나타낸다. 파상풍 독소의 증가는 위약 투여 후 RDI에 비해 10 IU/㎏ 투여 후 감소된 RDI와 관련이 있다(P=0.043; 윌콕슨 부호 순위 검증). 위약 및 10 IU/㎏ 중앙값은 각각 o 및 *로 추가로 표시된다.
본 발명은 면역-회피 TeNT 및 PEG-TeNT 분자(도 1), 이의 조성물, 및 이들의 치료학적 및 화장 용도에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 본 발명은 근긴장저하, 선택적으로 폐쇄성 수면 무호흡증의 치료에 관한 것이다.
본 명세서에서 파상풍 변성독소에 대해 보호적 면역 반응을 가진 대상체에서 근긴장저하를 치료하기 위한 구체적으로 변형된 TeNT 및 TeNT 및 디코이(불활성 TeNT)의 조성물의 용도가 서술된다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 활성 TeNT는 파상풍-면역 환자의 근긴장도(muscle tone)를 증가시킬 수 있는 생물학적으로 활성인 화합물을 전달하기 위해서, PEG를 첨가하거나, 특정 돌연변이를 도입함으로써, 또는 이의 조합에 의해 변형된다.
활성은 변형된 독소, 또는 제제의 단위 정의 투여량의 투여에 의해 입증될 수 있으며, 여기서 동일한 단위 투여량 TeNT는 백신접종되는 대상체에서 활성을 나타내지 않을 것이다. TeNT의 3차원 구조 분석을 기초로, PEG 분자의 직접적인 부착을 위한 특정 표면 돌연변이의 도입은, 백신접종되는 대상체에서 보호적 항체 반응에 의해 표적화되는 것으로 알려진 특정 TeNT 에피토프의 마스킹을 허용하였다. PEG화, 부위-지정 돌연변이 및 디코이 분자 제제의 조합은 등가 단위의 투여되는 TeNT에 비해, 백신접종되는 포유동물류 모델에서 근긴장도 증가에 있어서 분자의 효과를 크게 증가시켰다.
US 2002/0197278은 부적절한 근육 수축의 장애를 치료하기 위한 일련의 PEG화된 보툴리눔 독소를 개시했으며 TeNT가 보툴리눔 독소의 대안으로서 사용될 수 있음을 제안하였다. 그러나, TeNT는 근육 수축을 치료하기 위해 사용될 수 없다. 또한, US 2002/0197278의 주장된 발명은 가능하지 않은 것으로 보이는데, 왜냐하면 개시된 방법은 에피토프의 부위 지정 마스킹을 포함하지 않고, 본 발명자들이 아는 한, TeNT 에피토프의 의도적 마스킹에 필요한 에피토프의 3차원 구조 및 식별은 US 2002/0197278의 우선일에 이용가능하지 않았기 때문이다.
Wan 등은 PEG화된 단백질의 투여로부터 생긴 항-PEG 면역 반응에 대한 PEG화의 효과에 관한 것이지만, 그 발견을 어떠한 치료에도 활용하지 않는다. Wan 등은 PEG화된 파상풍 변성독소가 비-PEG화된 파상풍 변성독소에 비해 감소된 면역원성을 입증함을 개시하지만, Wan 등은 치료학적으로 관련된 분자 또는 제제를 제시하지 않는다. 또한, 파상풍 변성독소는, TeNT의 포름알데히드 가교에 의해 생성될 수 있는, 백신접종에 사용된 생물학적으로 불활성의 TeNT이기 때문에, 파상풍 변성독소의 PEG화는 활성 TeNT의 변형과 관련이 없다. 즉, PEG화되거나 되지 않거나, 파상풍 변성독소는 활성 TeNT의 효소, 결합 및 전좌 활성의 조합을 보유하지 않는다.
WO 2016/001762 A1은 TeNT c-단편 단독에 관한 것으로, 이는 신경전달물질에 결합하고 뉴런에 들어가는 것 이상의 특정 활성을 갖지 않는 분자이다.
따라서, 파상풍 변성독소 면역화된 대상체에서 기존의 항-TeNT 면역력을 피하는 TeNT-기반 치료요법에 대한 필요가 존재한다. 마스킹된, 활성 및 치료학적으로 관련된 PEG화된 TeNT에 의해 부분적으로 제공되는, 이런 문제에 대한 해결책이 본 명세서에 개시된다.
파상풍 신경독소(TeNT)
TeNT는 대략 150 kDa이고 tetX 유전자에서 발현된다. 개시 메티오닌 코돈은 결여되어 있으나, tetX의 코딩 영역에 해당하는 코돈 최적화된 핵산 서열이 도 3의 벡터 서열(서열번호 2)에 제공된다. TeNT는 번역-후 절단되는 하나의 단백질로서 발현된다 - 먼저 개시 메티오닌이 제거된 후 두 부분으로 나뉜다: 절단되지 않은 단백질의 N-말단에서 유래된 50 kDa 경쇄(LC 또는 A-사슬) 및 절단되지 않은 단백질의 C-말단에서 유래된 100 kDa 중쇄(HC 또는 B-사슬). 두 사슬은 신경독성에 필수적인, 사슬간 이황화 결합에 의해 연결된다. 성숙된 TeNT의 1314 아미노산 서열은 도 2(서열번호 1)에 제공된다.
LC는 아연 엔도펩티다아제 활성을 가지며, 소포가 막에 융합하는 데 필요한 소포 관련 막 단백질(VAMP)을 공격함으로써, 신경전달물질의 방출을 방지한다.
파파인으로 소화되면, HC는 각각 50 kDa의, 두 도메인으로 절단될 수 있다: HN으로 명명된 N-말단 전좌 도메인; 및 단편 c(c)로 명명된 C-말단 강글리오사이드(막) 결합 도메인. c가 결여된 TeNT는 본 명세서에서 LC-HN으로 지칭된다.
c는 두 개의 폴리시알로강글리오사이드 결합 부위를 보유하고 뉴런 막 상의 폴리시알로강글리오사이드(GD2 GD1b, 및 GT1b)에 결합한다. 따라서, c는 말초 운동 축색의 시냅스전 막에 대한 TeNT의 결합을 매개하고 TeNT가 해당 막을 가로질러 뉴런으로 이동하는 것을 돕는다.
다음에 대한 아미노산 서열이 제공된다:
개시 메티오닌이 결여된 TeNT는 도 2(서열번호 1)에 제공되고;
HC는 도 5(서열번호 3)에 제공되고;
c는 도 6(서열번호 4)에 제공되며; 및
LC-HN은 도 9(서열번호 6)에 제공된다.
다음을 위한 벡터 암호화의 코돈-최적화 핵산 서열 및 벡터 맵이 제공된다:
c는 도 7(서열번호 5) 및 도 8에 제공되고; 및
LC-HN은 도 10(서열번호 7) 및 도 11에 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "TeNT"는 중쇄 및 경쇄로 구성된, 완전한(full) TeNT 분자와 관련하여 사용된다. 본 명세서에서 서브도메인 및 단편은 이들의 약어로 지칭된다: 경쇄 "LC"; 중쇄 "HC"; 중쇄 N-말단 도메인 "HN"; 중쇄 단편 c "c"; 경쇄 + 중쇄 N-말단 도메인 "LC-HN"(즉, c가 결여된 TeNT 분자). 임의의 서브도메인 또는 단편이 PEG화된 경우, 접두사 PEG가 사용된다: PEG-LC; PEG-HC; PEG-HN; PEG-c; PEG-LC-HN. PEG화된 단편 또는 서브도메인을 포함하는 완전한 TeNT 분자에서, 접두사 PEG를 사용하여 PEG화된 서브도메인 또는 단편이 지시된다: PEG-TeNT-LC; PEG-TeNT-HC; PEG-TeNT-LC-HC; PEG-TeNT-HN; PEG-TeNT-c; PEG-TeNT-LC-c; PEG-TeNT-LC-HN 등.
서브도메인 및 단편이 이들의 특정 기능으로 인해 완전한 TeNT와 호환가능하지 않음을 이해할 것이다.
본 명세서에 개시된 TeNT는 활성 또는 불활성일 수 있다. 활성 TeNT는 네이티브 TeNT와 동일한 생물학적 활성을 보유한다. 불활성 TeNT는 네이티브 TeNT의 하나 이상의 활성이 결여된다. 일 실시양태에서, 불활성 TeNT는 억제성 신경전달물질의 방출을 차단하지 않는다. 본 개시의 불활성 TeNT는 "디코이"로도 지칭될 수 있다. 불활성 TeNT는 파상풍 변성독소를 포함한다. 일 실시양태에서, 불활성 TeNT는 본 명세서에 개시된 불활성 TeNT이다.
일 실시양태에서, 2 이상의 TeNT가 접합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, TeNT는 접합되지 않는다. 본 명세서에 개시된 조성물, 방법 및 용도의 일 실시양태에서, 제1 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않는다.
본 명세서에 개시되고 도 1에 도시된 면역-회피 PEG-TeNT는 다음을 포함한다:
PEG화된 단편 c가 있는 TeNT(PEG-TeNT-c)(도 1a);
PEG화된 중쇄가 있는 TeNT(PEG-TeNT-HC)(도 1b);
PEG화된 경쇄 및 PEG화된 단편 c가 있는 TeNT(PEG-TeNT-LC-c)(도 1c); 및
완전히 PEG화된 TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)(도 1d).
유리하게는 PEG-TeNT-c는 백신접종된 대상체에서 적응성 면역계의 기존의 면역 반응을 회피한다. 일 실시양태에서, PEG-TeNT-c는 효능이 감소할 때까지 사용될 제1 단계 처리를 제공한다.
유리하게는 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c는 백신접종된 대상체에서 적응성 면역계의 기존의 면역 반응을 회피하고 PEG-TeNT-c에 대한 반복적 노출에 의해 초래된 적응성 면역계의 면역 반응 또한 회피한다.
일 실시양태에서, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c는 함께 그들의 효능이 감소할 때까지 사용될 제2 단계 치료를 제공한다.
유리하게는 PEG-TeNT-LC-HC는 백신접종된 대상체에서 적응성 면역계의 기존의 면역 반응을 회피하고 PEG-TeNT-c에 대한 및 PEG-TeNT-HC + PEG-TeNT-LC-c에 대한 반복적 노출에 의해 초래된 적응성 면역계의 면역 반응 또한 회피한다.
일 실시양태에서, PEG-TeNT-LC-HC는 그의 효능이 감소할 때까지 사용될 제3 단계 치료를 제공한다.
또한, PEG화된 경쇄를 갖는 TeNT(PEG-TeNT-LC), PEG화된 LC 및 HN을 갖는 TeNT(PEG-TeNT-LC-HN), 및 PEG화된 HN을 갖는 TeNT(PEG-TeNT-HN)가 개시된다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 PEG-TeNT의 특정 조합 및 이러한 PEG-TeNT 조합을 사용한 치료의 순서가 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)
PEG는, 예를 들어, TeNT의 라이신(예를 들어, 아미노-PEG화), 시스테인(예를 들어, 티올-PEG화 및 가교 PEG화), 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트 산, 아스파라긴(예를 들어, N-글리코-PEG화), 글루타민산, 글루타민(예를 들어, 트랜스글루타미나아제 매개된 PEG화), 세린(예를 들어, O-글리코-PEG화), 트레오닌(예를 들어, O-글리코-PEG화), 또는 티로신 잔기에 접합될 수 있다. PEG화의 예는 N-말단 PEG화 및 C-말단 PEG화도 포함한다.
PEG화는 PEG를 하이드록실-반응성인 작용기, 예를 들어 무수물, 산 염화물, 클로로포름산염 및 탄산염과 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 알데히드, 에스테르, 및 아미드와 같은 작용기로 PEG화가 달성될 수 있다.
PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다.
PEG는 변형된 PEG, 예를 들어, 폴리[올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트](POEGMA)일 수 있다.
PEG화는 부위-특이적 PEG화일 수 있다.
일 실시양태에서, TeNT 또는 TeNT 단편의 표면 세린 잔기는 표면 시스테인 잔기로 돌연변이되어 면역원성 에피토프에서 지정된 PEG 접합을 용이하게 한다. 이러한 맥락에서, 돌연변이는 예를 들어 세린에서 시스테인으로의 치환과 동의어이다. 이러한 돌연변이, 또는 치환은 다음 중 하나 이상을, 임의의 조합으로, 포함한다: S81C; S120C; S144C; S248C; S335C; S428C; S600C; S963C; S1041C; S1155C; 및 S1187C.
이종이작용성(heterobifunctional) PEG를 위한 작용기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카르복실산, 및 NHS 에스테르를 포함한다.
일 실시양태에서, PEG는 카르보디이미드-EDC 및 설포-NHS를 사용한 카르복실-투(to)-아민 가교를 사용하여 TeNT에 접합된다.
또한 본 발명은 TeNT의 상이한 서브도메인 또는 단편에 접합된 상이한 분자량의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT를 고려한다.
PEG는 예를 들어 4℃ 내지 25℃에서 2 내지 6시간 동안 본 개시의 TeNT에 접합되거나 부착될 수 있다. 일 실시양태에서, PEG를 실온에서 6시간 동안 TeNT에 접합시켰다.
적응증(indications)
본 명세서에 사용된 바와 같은, "근긴장저하"는 억제성 신경전달물질, 예를 들어 GABA 또는 글리신을 억제함으로써 치료될 수 있는 비자발적 근육 약화를 포함하는 임의의 장애를 지칭한다. 이와 같이, "근긴장저하"는 감소된 신경학적 드라이브 또는 감소되거나 부적절한 근긴장도, 강도 또는 신경학적 드라이브의 다른 원인 및 상태에 부차적인 감소된 근긴장도를 포함한다. 따라서, 일 실시양태에서, 근긴장저하는 신경학적 근긴장저하일 수 있다.
본 개시에 따른 PEG-TeNT, 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 근긴장저하 장애는 폐쇄성 수면 무호흡증, 무호흡증, 코골이, 척추측만증, 근육 이완에 의해 야기되는 사시증, 안검하수증, 호너 증후군, 근육 위축증, 신경학적으로 손상된 근육, 근위축성 측색 경화증(ALS), 운동성 뉴런 질환, 임의의 근병증, 다발성 경화증, 파킨슨 질환, 중증 근무력증, 안면 근긴장도의 감소, 선택적으로 외반증, 임의의 골격 또는 평활근의 임의의 원인의 이완성 마비 또는 쇠약, 인공호흡기-후 쇠약을 포함하는, 임의의 원인의 호흡기 근육 쇠약, 외상으로 유도된 근육 쇠약 또는 근육 이완에 의해 야기되는 자세 불량, 골반저 근육 이완 또는 쇠약, 또는 비강 또는 상부 호흡기 이완을 포함한다.
본 개시에 따른 PEG-TeNT, 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 다른 장애는 근육 위축증, 근육 이영양증, 근육량 감소, 비충혈, 발기부전, 탈모, 저혈압, 측두 하악 관절 증후군, 사경, 목 통증, 근육 내 신경 재생, 편두통, 두통, 이완불능, 비만, 경련성 결장, 항문 균열, 위산에 의해 영향을 받는 조직 또는 기관, 전립선 비대증, 비루, 타액분비, 폐 점막의 자극, 건선, 면역 내성, 면역 반응을 포함한다.
본 개시에 따라 치료될 장애가 그 자체로 근긴장저하 장애가 아닌 경우, 본 개시의 TeNT로 치료함으로써 근긴장도를 증가시키면 장애의 증상이 완화될 수 있다.
PEG-TeNT를 화장품에 적용하는 것은 복근의 조임, 흉근의 조임, 대둔근의 조임, 골격근의 조임, 또는 근육 이완에 의해 야기되는 안면 처짐의 치료를 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 PEG-TeNT, 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 평활근, 골격근, 조직 또는 기관은 상부 식도, 식도 벽, 식도 괄약근, 하부 식도 괄약근, 항문 괄약근, 방광, 방광 괄약근, 질 괄약근, 유문 괄약근, 오디 괄약근, 회장맹장 괄약근, 골반저 근육, 질벽 근육, 전립선, 악하선, 이하선, 설하선, 구강 점막의 소타액선, 성대 주름, 안면 근육, 저작 근육, 두피 근육, 가슴 근육, 등 근육, 상지 근육, 팔뚝 근육, 하지 근육, 손 근육, 발 근육, 위벽 근육, 결장 벽 근육, 목 근육, 인후 확장근, 교근, 내측 익돌근(ptygeroid), 측면 익돌근, 이설골근(geniohyoid), 이설근(genioglossus), 입천장긴장근(tensor veli palatine), 입천장올림근(levator veli palatini), 붓인두근(stylopharyngeus), 붓혀근(styloglossus), 악설골근(mylohyoid), 경돌설골근(stylohyoid), 목뿔혀근(hyoglossus), 악이복근(diagastricus), 목빗근(sternocleidomastoid muscle), 승모근, 측두근, 윤상인두근, 자궁근 및 자궁경부, 위 신경 공급, 비강내 점막, 폐 점막, 피부, 흉선, 뼈, 관상 동맥, 폐 평활근, 및 심장 근육을 포함한다.
조성물 및 투여
본 개시의 조성물은 치료학적 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다. 즉, 상기 조성물은 치료요법 또는 화장용 목적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료학적 조성물" 또는 "화장료 조성물"은 본 명세서에 서술된 바와 같이 대상체에서 근긴장저하를 억제하거나 치료하는 TeNT를 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제형화되었다. 일 실시양태에서, 상기 조성물은 무균이다. 일 실시양태에서, 상기 조성물은 무-발열성이다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 우수실험관리기준(Good Laboratory Practice, GLP) 또는 우수제조관리기준(Good Manufacturing Practice, GMP)에 따라 제조된다.
본 개시의 TeNT는 최대 10 mg/㎏ 이상으로 투여될 수 있다. 본 개시의 TeNT는 약 1 fg/㎏, 약 5 fg/㎏, 약 10 fg/㎏, 약 50 fg/㎏, 약 100 fg/㎏, 약 500 fg/㎏, 약 1 pg/㎏, 약 5 pg/㎏, 약 10 pg/㎏, 약 50 pg/㎏, 약 100 pg/㎏, 약 500 pg/㎏, 약 1 ng/㎏, 약 2 ng/㎏, 약 3 ng/㎏, 약 4 ng/㎏, 약 5 ng/㎏, 약 6 ng/㎏, 약 7 ng/㎏, 약 8 ng/㎏, 약 9 ng/㎏, 약 10 ng/㎏, 약 11 ng/㎏, 약 12 ng/㎏, 약 13 ng/㎏, 약 14 ng/㎏, 약 15 ng/㎏, 약 16 ng/㎏, 약 17 ng/㎏, 약 18 ng/㎏, 약 19 ng/㎏, 약 20 ng/㎏, 약 30 ng/㎏, 약 40 ng/㎏, 약 50 ng/㎏, 약 60 ng/㎏, 약 70 ng/㎏, 약 80 ng/㎏, 약 90 ng/㎏, 약 100 ng/㎏, 약 200 ng/㎏, 약 300 ng/㎏, 약 400 ng/㎏, 약 500 ng/㎏, 약 600 ng/㎏, 약 700 ng/㎏, 약 800 ng/㎏, 약 900 ng/㎏, 약 1 ㎍/㎏, 약 5 ㎍/㎏, 약 10 ㎍/㎏, 약 50 ㎍/㎏, 약 100 ㎍/㎏, 약 500 ㎍/㎏, 약 1 mg/㎏, 또는 약 10 mg/㎏으로 투여될 수 있다. 본 개시의 TeNT는 상기 나열된 임의의 투여량의 임의의 범위 내에서 투여될 수 있다.
본 개시의 TeNT는 최대 1000 IU/㎏ 이상으로 투여될 수 있다. 본 개시의 TeNT는 약 0.1 IU/㎏, 약 0.2 IU/㎏, 약 0.3 IU/㎏, 약 0.4 IU/㎏, 약 0.5 IU/㎏, 약 0.6 IU/㎏, 약 0.7 IU/㎏, 약 0.8 IU/㎏, 약 0.9 IU/㎏, 약 1 IU/㎏, 약 2 IU/㎏, 약 3 IU/㎏, 약 4 IU/㎏, 약 5 IU/㎏, 약 6 IU/㎏, 약 7 IU/㎏, 약 8 IU/㎏, 약 9 IU/㎏, 약 10 IU/㎏, 약 11 IU/㎏, 약 12 IU/㎏, 약 13 IU/㎏, 약 14 IU/㎏, 약 15 IU/㎏, 약 16 IU/㎏, 약 17 IU/㎏, 약 18 IU/㎏, 약 19 IU/㎏, 약 20 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 100 IU/㎏, 약 200 IU/㎏, 약 300 IU/㎏, 약 400 IU/㎏, 약 500 IU/㎏, 약 600 IU/㎏, 약 700 IU/㎏, 약 800 IU/㎏, 약 900 IU/㎏, 약 1 000 IU/㎏으로 투여될 수 있다. 본 개시의 TeNT는 상기 나열된 임의의 투여량의 임의의 범위 내에서 투여될 수 있다.
2개의 PEG-TeNT를 포함하는 조성물에서, 예를 들어 제1 PEG-TeNT[여기서 TeNT-HC가 PEG화됨(PEG-TeNT-HC)], 및 제2 PEG-TeNT[여기서 TeNT-LC가 PEG화되고 TeNT-c가 PEG화됨(PEG-TeNT-LC-c)]를 포함하는 조성물에서, 제1 PEG-TeNT 대 제2 PEG-TeNT의 비율은 달라질 수 있다. 예를 들어, 제1 PEG-TeNT 대 제2 PEG-TeNT의 비율은 약 1000:1, 약 500:1, 약 100:1, 약 50:1, 약 10:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1; 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:10, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:500, 또는 약 1:1000일 수 있다.
조성물은 TeNT의 임의의 조합을 포함할 수 있고 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c의 조합으로 제한되지 않는다. 조성물은 다음을 포함할 수 있다: PEG-TeNT-c 및 PEG-TeNT-HC; PEG-TeNT-c 및 PEG-TeNT-LC-c; PEG-TeNT-c 및 PEG-TeNT-LC-HC; PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-HC; 및 PEG-TeNT-LC-c 및 PEG-TeNT-LC-HC. 또한, 다음을 포함하는 조성물이 개시된다: PEG-TeNT-c, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c; PEG-TeNT-c, PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-HC; PEG-TeNT-c, PEG-TeNT-LC-c 및 PEG-TeNT-LC-HC; PEG-TeNT-HC, PEG-TeNT-LC-c 및 PEG-TeNT-LC-HC; 및 PEG-TeNT-c, PEG-TeNT-HC, PEG-TeNT-LC-c 및 PEG-TeNT-LC-HC. 조성물에서, 임의의 TeNT는 다음으로 대체될 수 있으며, 임의의 조성물은 다음을 추가로 포함할 수 있다: PEG-TeNT-LC, PEG-TeNT-LC-HN, 및/또는 PEG-TeNT-HN.
일 실시양태에서, 상기 조성물은 예를 들어 백신접종에 의해, TeNT에 대한 사전 노출에 의해 생성된 항-TeNT 항체에 대한 디코이로서 작용하는 불활성화된 TeNT를 추가로 포함한다. 불활성화된 TeNT는, 서열번호 1과 비교하여, 다음을 포함할 수 있다: R1225K; R1225E; W1228A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; 또는 R1225del 및 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374A; E270del; Y374del, 또는 이들의 조합. 일 실시양태에서, 제2 TeNT는 R1225E, W1288A, E270A 및 Y374A를 포함하는 불활성화된 TeNT를 포함한다.
적어도 하나의 PEG-TeNT 및 디코이 TeNT를 포함하는 조성물에서, 디코이 TeNT는 PEG-TeNT에 비해 몰 과잉일 것이다. 예를 들어, 디코이 TeNT 대 PEG-TeNT의 비율은 약 106:1; 105:1, 104:1, 1000:1, 약 500:1, 약 400:1, 약 300:1, 약 200:1, 약 100:1, 약 90:1, 약 80:1, 약 70:1, 약 60:1, 약 50:1, 약 40:1, 약 30:1, 약 20:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 또는 약 1:1일 수 있다.
본 개시의 PEG-TeNT는 주 1회, 2회 또는 3회, 월 1회, 2회 또는 3회, 분기당 1회, 2회 또는 3회, 6개월당 1회, 2회 또는 3회, 또는 일년에 1회, 2회 또는 3회 투여될 수 있다.
PEG-TeNT는 단일 투여량, 분할 투여량, 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 근육이 쌍으로 존재하는 경우, PEG-TeNT는 쌍의 한 근육에 단독으로 또는 쌍의 두 근육에 양측으로 투여될 수 있다.
본 개시의 2개 이상의 PEG-TeNT를 포함하는 조합에 대한 대안으로서, 이러한 2개 이상의 PEG-TeNT는 조합하여 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
PET-TeNT는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 주사, 외과 이식, 국부적 적용, 또는 비강내 투여에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, TeNT는 영향을 받는 근육에 주사에 의해 근육내 투여된다.
PEG-TeNT는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요소는 치료될 특정 유형의 근긴장저하, 치료될 특정 대상체, 대상체의 임상적 상태, 투여 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 치과를 포함하는 의료 종사자에 알려진 기타 요소를 포함한다. 투여되는 PEG-TeNT의 치료학적으로 유효량은 이러한 고려사항에 의해 관리될 것이다.
약학적으로 허용가능한 담체는 물, 완충 수, 식염수 용액 예컨대, 예를 들어, 일반 식염수 또는 균형 식염수 용액 예컨대 행크 또는 얼의 균형 용액, 글리신, 및 히알루론산을 포함한다.
상기 조성물은 근육내 투여용으로 제형화될 수 있다. 근육내 투여용 조성물은 약학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 뿐만 아니라 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비-수성 담체, 용매, 희석액 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 혼합물, 식물성 오일(예컨대 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스테르(예를 들어, 에틸 올리에이트)를 포함한다.
상기 조성물은 TeNT의 전달을 개선하기 위해 침투 개선제를 포함할 수 있다. 침투 개선제는 지방산 예컨대 올레산, 라우르산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 리클리니에이트(reclineate), 모노올레인, 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세릴 1-모노카프레이트, 모노 및 디-글리세리드 및 생리학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 킬레이트제 예컨대, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트, 호모바닐레이트)를 추가로 포함할 수 있다.
또한 PEG-TeNT 또는 PEG-TeNT를 포함하는 조성물을 포함하는 용기를 포함하는, 제조 물품 및/또는 키트가 제공된다. 상기 용기는 선택적으로 단위 투여 형태로, PEG-TeNT 또는 조성물을 포함하는 병, 유리병 또는 주사기일 수 있다. 예를 들어, PEG-TeNT 또는 조성물은 일회용 용기, 선택적으로 주사기 내의 주사가능한 용액의 형태일 수 있다. 제조 물품 및/또는 키트는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 대상체의 치료를 지시하는, 인쇄된 설명서 및/또는 라벨 등을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "치료학적으로 유효량"은 대상체에서 근긴장저하를 치료하는 데 효과적인 PEG-TeNT의 함량을 지칭한다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 치료학적 치료 및 예방 또는 예방적 조치를 모두 지칭하며, 여기서 목표는 대상체의 근긴장저하를 예방, 감소, 또는 개선하거나 대상체의 근긴장저하의 진행을 늦추는(줄이는) 것이다. 치료가 필요한 대상체는 이미 근긴장저하가 있는 이들과 근긴장저하를 예방하거나 개선해야 하는 이들을 포함한다.
용어 "예방하는", "예방", "예방의" 또는 "예방적"은 근긴장저하가 발생하지 못하게 하거나, 근긴장저하의 발생을 저해, 방어, 또는 보호하는 것을 지칭한다. 예방이 필요한 대상체는 근긴장저하가 생기기 쉬울 수 있다.
용어 "개선하다" 또는 "개선"은 근긴장저하의 감소, 감축 또는 제거를 지칭한다.
근긴장저하는 정량화될 수 있다. 근긴장저하는 예를 들어 0~5의 반-정량적 척도로 정량화될 수 있고, 여기서 0은 부존재를 나타내고 1 내지 4는 중증도의 식별가능한 증가를 나타내며, 5는 최대 중증도를 나타낸다. 대안적으로, 근긴장저하는 이원 사건, 즉 존재 또는 부존재, 0 또는 1로 정량화될 수 있다. 다른 반-정량적 척도는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 근긴장저하는 예를 들어 힘 게이지를 사용하여 정량적 규모로 정량화될 수 있다.
근긴장저하의 임의의 정량화는 대조군, 예를 들어 PEG-TeNT를 받지 않은 건강한 대조군 대상체, 근긴장저하에 대한 치료를 받고 있지만, PEG-TeNT로 치료하지 않은, 영향을 받은 대조군 대상체, 또는 집단과 비교될 수 있다.
PEG-TeNT를 투여함으로써 근긴장저하를 치료하는 것은 근긴장저하의 약 1% 감소, 약 2% 감소, 약 3% 감소, 약 4% 감소, 약 5% 감소, 약 6% 감소, 약 7% 감소, 약 8% 감소, 약 9% 감소, 약 10% 감소, 약 20% 감소, 약 30% 감소, 약 40% 감소, 약 50% 감소, 약 60% 감소, 약 70% 감소, 약 80% 감소, 약 90% 감소, 또는 약 100% 감소일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 포유동물류를 지칭할 수 있다. 포유동물류는 영장류, 특히 인간일 수 있거나, 또는 가축, 동물원 동물, 또는 반려 동물일 수 있다. 본 명세서에 개시된 PEG-TeNT, 조성물 및 방법은 인간의 의료적 치료에 적합하다고 특히 고려되지만, 말, 소 및 양과 같은 가축 동물, 개 및 고양이와 같은 반려 동물, 또는 고양이과 동물(felid), 개과 동물(canid), 소과 동물(vobid) 및 유제 동물(ungulate)과 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는, 수의학적 치료에도 적용가능하다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 및 간행물을 참조하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 지칭하고, 예를 들어 "한 TeNT(a TeNT)"는 하나 이상의 TeNT를 나타내는 것으로 이해된다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 "한" 또는 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
다음의 청구범위 및 본 발명의 설명에서, 문맥이 표현 언어 또는 필요한 함축으로 인해 달리 요구하는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 또는 "포함하고" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로, 즉 언급된 특징의 존재를 구체화하지만, 본 발명의 다양한 실시양태의 추가적인 특징의 존재 또는 첨가를 배제하지는 않도록 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 주어진 수에 대한 값의 범위로서 그 숫자의 크기의 ±25%를 고려한다. 다른 실시양태에서, 용어 "약"은 주어진 수의 값의 범위로서 그 숫자의 크기의 ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%를 고려한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, "약 3 그램"은 2.7 그램 내지 3.3 그램(즉, 3 그램 ± 10%) 등의 값을 나타낸다.
유사하게, 사건의 시간 또는 기간은 적어도 25%까지 변할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서 특정 사건이 하루 동안 지속되는 것으로 개시될 수 있지만, 그 사건은 하루 이상 또는 그 미만 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, "1일"은 약 18시간 내지 약 30시간의 기간을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 기간의 시간은 그 기간의 시간의 ±20%, ±15 %, ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%만큼 변할 수 있다.
실시예
실시예 1 - PEG-TeNT-c의 제조(도 1a)
이 실시예에서, TeNT-c의 표면 세린 잔기는 표면 시스테인 잔기로 돌연변이되어 면역원성 에피토프에서 지정된 PEG 접합을 용이하게 하여 도 1a의 분자를 생성할 것이다. 돌연변이는: S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C일 것이다.
표면 세린에서 시스테인으로의 치환 S963C, S1041C, S1155C 및 S1187C를 갖는 TeNT에 대한 유전자는, 예를 들어 인터그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies)와 같은 상업적 공급자에 의해 합성될 것이다. 유전자는 제한 소화에 의해 pRSET-A 발현 벡터로 서브-클로닝되어 벡터의 6x 히스티딘 태그가 돌연변이 단백질의 N-말단에 첨가될 것이다.
S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 TeNT가 실시예 5에 따라 발현되고, PEG화되고 정제되어 PEG-TeNT-c를 생성할 것이다.
실시예 2 - PEG-TeNT-HC의 제조(도 1b)
이 실시예에서, TeNT-HC의 표면 세린 잔기는 표면 시스테인 잔기로 돌연변이되어 면역원성 에피토프에서 지정된 PEG 접합을 용이하게 하여 도 1b의 분자를 생성할 것이다. 돌연변이는: S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C일 것이다(도 24 서열번호 16).
표면 세린에서 시스테인으로의 치환 S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 갖는 TeNT에 대한 유전자는, 예를 들어 인터그레이티드 DNA 테크놀로지와 같은 상업적 공급자에 의해 합성될 것이다. 유전자는 제한 소화에 의해 pRSET-A 발현 벡터(도 25 서열번호 17, 도 26)로 서브-클로닝되어 벡터의 6x 히스티딘 태그가 돌연변이 단백질의 N-말단에 첨가될 것이다.
S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 TeNT가 실시예 5에 따라 발현되고, PEG화되고 정제되어 PEG-TeNT-HC를 생성할 것이다.
실시예 3 - PEG-TeNT-LC-c의 제조(도 1c)
이 실시예에서, LC 및 c의 표면 세린 잔기는 표면 시스테인 잔기로 돌연변이되어 면역원성 에피토프에서 지정된 PEG 접합을 용이하게 하여 도 1c의 분자를 생성하였다. 돌연변이는: S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C였다(도 21 서열번호 14).
LC 및 c에서 표면 세린에서 시스테인으로의 치환 S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 갖는 TeNT에 대한 유전자는 상업적 공급자인 인터그레이티드 DNA 테크놀로지에 의해 합성되었다. 유전자는 제한 소화에 의해 pRSET-A 발현 벡터(도 22 서열번호 15, 도 23)로 서브-클로닝되어 벡터의 6x 히스티딘 태그가 돌연변이 단백질의 N-말단에 첨가되었다.
S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C를 포함하는 TeNT가 실시예 5에 따라 발현되고, PEG화되고 정제되어 PEG-TeNT-LC-c를 생성하였다.
내독소(endotoxin) 제거
실시예 4에 따라 TeNT-LC-c 세린 돌연변이로부터 내독소를 제거하였다.
시스테인 잔기에 PEG 부착.
1. PEG의 몰 과잉 - 말레이미드를, 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa 또는 약 20 kDa의 PEG와, pH 6.5~7.5에서 PBS 내에서 세린 돌연변이 TeNT-LC-c (0.5~2 ㎎/㎖)와 조합하였다.
2. 부착은 실온에서 6시간 동안 수행하였다.
3. 크기 배제 크로마토그래피로 과잉 PEG를 제거하였다.
단백질의 트립신 소화 활성화
TeNT-LC-c 세린 돌연변이의 활성화를 위한 트립신 소화는 실시예 4에 따라 수행하였다.
실시예 4 - PEG-TeNT-LC-HC의 제조(도 1d)(방법 1)
TeNT의 제조
1. 대장균 BL21 DE3 pLysS 균주를 pRSET-TeNT 벡터(도 3 및 4)로 전기형질전환하고 37℃에서 선별 항생제(암피실린 및 클로람페니콜)와 함께 LB 한천에서 밤새 성장시켰다.
2. 200 ㎖의 전-유도 브로스(pre-induction broth)에 선별 플레이트로부터 1개의 콜로니를 접종하였다. 전-유도 브로스 pH 7.2~7.4는 다음을 포함하였다: 1.2% 트립톤; 2.4% 효모 추출물; 2% 글루코오스; 0.4% 글리세롤; 17 mM의 KH2PO4; 72 mM의 K2HPO4; 및 선별 항생제(암피실린 및 클로람페니콜).
3. 배양액을 고속 진탕하면서 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
4. 10분 동안 4000 g으로 원심분리하여 상기 밤새 배양물을 수확하였다.
5. 펠렛을 1.2% 트립톤; 2.4% 효모 추출물; 0.4% 글리세롤; 1 mM IPTG; 17 mM KH2PO4; 72 mM K2HPO4; 100 ㎍/㎖ 암피실린; 및 10 μM ZnCl2;를 포함하는 200 ㎖ 발현 브로스 pH 7.2~7.4에 재현탁시켰다.
6. 단백질을 고속 진탕하면서 30℃에서 6시간 동안 발현시켰다.
7. 세포를 15분 동안 4500 g으로 원심분리하여 수확하고 펠릿을 pH 8에서 20 mM 이미다졸과 함께 30㎖의 TBS에 재현탁시켰다.
8. 세포는 초음파처리에 의해 용해되었다.
9. 세포 용해물을 20분 동안 4500 g으로 원심분리하여 제거하고 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다.
10. 단백질은 AKTA 퓨어 25 FPLC 시스템(GE)을 사용하여 히스-태그 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
11. 정제된 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 PBS로 완충액 교환을 거친 다음 수퍼덱스(Superdex) 200 증가 10/300 GL 컬럼으로 AKTA 퓨어 25 FPLC를 사용하여 겔 여과에 의해 제2 단계 정제를 거쳤다.
내독소 제거
1. 0.5 ㎖ 내독소 제거 스핀 컬럼을 실온으로 평형화하였다.
2. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 15 ㎖ 튜브에 배치한 후 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 용액을 폐기하였다.
3. 컬럼 하단 플러그를 교체하고, 컬럼 캡을 제거하고, 95% 에탄올 중 0.2N NaOH를 수지에 첨가하고, 컬럼 캡을 교체하고, 컬럼을 여러 번 뒤집어 수지를 재현탁한 후, 실온에서 1~2시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 15㎖ 튜브에 배치한 후 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 용액을 폐기하였다.
5. 컬럼 하단 플러그를 교체하고, 컬럼 캡을 제거하고, 내독소가 없는 2M NaCl을 수지에 첨가하고, 컬럼 캡을 교체하고, 컬럼을 여러 번 뒤집어 수지를 재현탁하였다.
6. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 15㎖ 튜브에 배치한 후 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 용액을 폐기하였다.
7. 컬럼 하단 플러그를 교체하고, 컬럼 캡을 제거하고, 내독소가 없는 초순수를 수지에 첨가하고, 컬럼 캡을 교체하고, 컬럼을 여러 번 뒤집어 수지를 재현탁하였다.
8. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 15㎖ 튜브에 배치하고, 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 용액을 폐기하였다.
9. 컬럼 하단 플러그를 교체하고, 컬럼 캡을 제거하고, 내독소가 없는 인산염 완충액을 수지에 첨가하고, 컬럼 캡을 교체하고, 컬럼을 여러 번 뒤집어 수지를 재현탁하였다.
10. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 15㎖ 튜브에 배치하고, 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 용액을 폐기하였다.
11. 컬럼을 인산염 완충액으로 2회 더 헹구고 용출액을 폐기하였다.
12. 컬럼 하단 플러그를 교체하고, 컬럼 캡을 제거하고, 샘플을 수지에 적용하고, 컬럼 캡을 교체하고, 컬럼을 여러 번 뒤집어 수지를 재현탁하였다.
13. 컬럼을 4℃에서 적어도 1시간 동안 엔드-오버-엔드 혼합하면서 인큐베이션하였다.
14. 컬럼 하단 플러그를 제거하고, 컬럼 캡을 풀고, 컬럼을 내독소가 없는 15㎖ 튜브에 배치하고, 500 g으로 1분 동안 원심분리하여 컬럼에서 용액을 제거하였다. 샘플은 유지되었다.
15. 샘플의 내독소 수준이 동일하거나 더 낮은 수준이 될 때까지 재생 스핀 컬럼으로 내독소 제거 절차를 반복하여 모든 투여량이 대상체의 킬로그램 당 5 EU 단위 미만의 내독소를 함유하도록 하였다.
PEG-TeNT-LC-HC의 제조.
1. 총 부피 500 ㎕의 PBS pH 7.4에서, 3 μmol 정제된 TeNT 및 0.5 mmol mpeg-NHS(SC)(나녹스)를 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 또는 30 kDa의 PEG 중 하나와 조합하였다.
2. 샘플을 실온에서 3시간 동안 혼합하였다.
3. 크기 배제 크로마토그래피로 과잉 PEG를 제거하였다.
단백질을 활성 형태로 트립신 소화
1. 단백질 1 mg을 0.1 M NH4HCO3 완충액, pH 8.0 또는 0.1 M 트리스 완충액 pH 8.5를 포함하는, 0.5 ㎖ 소화 완충액에 용해시켰다.
2. 0.10 ㎖ 내지 0.25 ㎖의 고정화된 TPCK 트립신을 3 × 500 ㎕의 소화 완충액으로 세척하였다. 각각의 세척 후 겔은 원심분리에 의해 완충액으로부터 분리되었다.
3. 겔을 약 0.2 ㎖의 소화 완충액에 재현탁시켰다.
4. 고정화된 TPCK 트립신을 단백질 샘플에 첨가하였다.
5. 반응 혼합물을 빠르게 진탕하는 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다.
6. 고정화된 TPCK 트립신을 원심분리에 의해 분리하였다.
실시예 5 - PEG-TeNT-LC-HC의 제조(도 1d)(방법 2)
이 실시예에서, TeNT-LC-HC의 표면 세린 잔기는 표면 시스테인 잔기로 돌연변이되어(S에서 C 돌연변이) 면역원성 에피토프에서 지정된 PEG 접합을 용이하게 하였다. TeNT 돌연변이는: 서열번호 1과 비교하여, S81C; S120C; S144C; S248C; S335C; S428C; S600C; S963C; S1041C; S1155C; 및 S1187C였다.
세린 돌연변이 TeNT-LC-HC의 제조
대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주를 S에서 C로의 돌연변이를 포함하는 도 18의 아미노산 서열(서열번호 12)을 암호화하는 pRSET-TeNT 벡터(도 19 및 20)로 전기형질전환하였다. S에서 C로의 돌연변이를 포함하는 TeNT-LC-HC는, 단계 10 및 11 사이에 15분 동안 0.5 mM DTT에 의한 처리를 추가하여, 실시예 4에 따라 발현 및 정제되었다.
내독소 제거
실시예 4에 따라 TeNT-LC-HC 세린 돌연변이로부터 내독소를 제거하였다.
시스테인 잔기에 PEG 부착.
1. PEG의 몰 과잉 - 말레이미드를, 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa 또는 약 20 kDa의 PEG와, pH 6.5~7.5에서 PBS 내에서 세린 돌연변이 TeNT-LC-HC (0.5~2 ㎎/㎖)와 조합하였다.
2. 부착은 실온에서 6시간 동안 수행하였다.
3. 크기 배제 크로마토그래피로 과잉 PEG를 제거하였다.
단백질의 트립신 소화 활성화
TeNT-LC-HC 세린 돌연변이의 활성화를 위한 트립신 소화는 실시예 4에 따라 수행하였다.
실시예 6 - 불활성 디코이 TeNT
이 실시예에서, 강글리오사이드 결합 영역에서, 서열번호 1과 비교하여, R1225E 및 W1288A 아미노산 치환을 불활성화시킨, 비-PEG화된, 재조합 c를 생성하였다. 불활성화된 c를 등몰량의 비-PEG화된 LC-HN과 조합하여 불활성 디코이 TeNT를 생성하였다. 생성된 불활성 TeNT는 파상풍 변성독소에 대해 백신접종된 대상체의 항체-기반 중화 반응에 대한 디코이로 사용될 것이다.
R1225E W1288A를 포함하는 c의 제조
R1225E 및 W1288A가 있는 c에 대한 유전자는 상업적 공급자인 인터그레이티드 DNA 테크놀로지에 의해 합성되었다. 유전자는 제한 소화에 의해 pRSET-A 발현 벡터로 서브-클로닝되어 벡터의 6x 히스티딘 태그가 돌연변이 단백질의 N-말단에 첨가된다.
대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주를 R1225E W1288A(도 12, 서열번호 8)를 포함하는 c를 암호화하는 pRSET-TeNT-c 벡터(도 13 (서열번호 9) 및 도 14)로 전기형질전환하고 37℃에서 선별 항생제(암피실린, 클로람페니콜)와 함께 LB 한천에서 밤새 성장시켰다. R1225E W1288A를 포함하는 c를 실시예 4에 따라 발현시키고 정제하였다.
내독소 제거
실시예 4에 따라 정제된 단백질로부터 내독소를 제거하였다.
LC-HN의 제조
대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주를 pRSET-TeNT-LC-HN 벡터(도 10 및 11)로 전기형질전환하고 37℃에서 선별 항생제(암피실린, 클로람페니콜)와 함께 LB 한천에서 밤새 성장시켰다. LC-HN은 실시예 4에 따라 발현 및 정제되었다.
내독소 제거
실시예 4에 따라 정제된 단백질로부터 내독소를 제거하였다.
E270A Y374A를 포함하는 LC-HN의 제조
대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주를 E270A Y374A를 포함하는 LC-HN을 암호화하는 pRSET-TeNT-LC-HN 벡터로 전기형질전환하고 37℃에서 선별 항생제(암피실린, 클로람페니콜)와 함께 LB 한천에서 밤새 성장시켰다. E270A Y374A를 포함하는 LC-HN은 실시예 4에 따라 발현 및 정제되었다.
내독소 제거
실시예 4에 따라 정제된 단백질로부터 내독소를 제거하였다.
실시예 7 불활성 디코이 TeNT
R1225E 및 W1288A를 포함하는 TeNT에 대한 유전자는 상업적 공급자인 인터그레이티드 DNA 테크놀로지에 의해 합성되었다. 유전자는 제한 소화에 의해 pRSET-A 발현 벡터로 서브-클로닝되어 벡터의 6x 히스티딘 태그가 돌연변이 단백질의 N-말단에 첨가되었다(도 15 서열번호 10, 도 16 서열번호 11, 및 도 17)
R1225E 및 W1288A를 포함하는 불활성화된 TeNT는 실시예 4에 따라 발현 및 정제되었다.
내독소 제거
실시예 4에 따라 정제된 단백질로부터 내독소를 제거하였다.
실시예 8 - PEG-TeNT 분석
실시예 4에 따라 TeNT를 제조하고 PEG화한 후, SDS-PAGE(도 28)로 분석하고 (A) 쿠마시 블루를 사용하여 및 (B) 폴리클로날 항-TeNT 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. (B)는 면역원성이 PEG 분자량에 비례함을 보여준다.
실시예 9 - PEG-TeNT 대 TeNT의 감소된 면역원성
실시예 4에 따라 각각 상이한 분자량의 PEG(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)를 포함하는 4개의 PEG-TeNT를 제조하고 PEG화하였다. PEG-TeNT는 TeNT에 대해 경쟁적 ELISA에 의해 분석하였다.
제1 분석(도 29a)에서, TeNT를 ELISA 플레이트에 흡착시켰다. 이후 흡착된 TeNT를 각각 4개의 PEG-TeNT 항원(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)의 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. 이 분석에서, 더 높은 반응(OD 450 nm)은 TeNT에 대한 더 큰 친화성을 나타내므로 PEG-TeNT에 대한 면역원성은 감소하였다.
제2 분석(도 29b)에서, 각각의 PEG-TeNT를 별도의 ELISA 플레이트에 흡착시켰다. 이후 각각의 흡착된 PEG-TeNT(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)는 TeNT 항원의 각각 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. 이 분석에서, 더 낮은 반응(OD 450 nm)은 TeNT에 대해 더 큰 친화성을 나타내므로 PEG-TeNT에 대한 면역원성은 감소하였다.
이 실시예는 항-TeNT 항체가 TeNT에 우선적으로 결합하였고 PEG화된 TeNT는 TeNT(즉, PEG화되지 않음)에 비해 감소된 면역원성을 가짐을 보여주었다.
실시예 10 - TeNT-LC-c 세린 돌연변이 대비 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이의 감소된 면역원성
TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 실시예 5에 따라 제조하였다. TeNT-LC-c 세린 돌연변이의 4개 샘플을 실시예 5에 따라 PEG화하였고, 각 샘플은 상이한 분자량의 PEG(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)를 포함하였다. 이후 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 TeNT-LC-c 세린 돌연변이에 대한 경쟁적 ELISA에 의해 분석하였다.
제1 분석(도 29c)에서, TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 ELISA 플레이트에 흡착시켰다. 이후 흡착된 TeNT 세린 돌연변이를 각각 4개의 PEG-TeNT 세린 돌연변이 항원(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)의 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. 이 분석에서, 더 높은 반응(OD 450 nm)은 TeNT 세린 돌연변이에 대한 더 큰 친화성을 나타내므로 PEG-TeNT 세린 돌연변이에 대한 면역원성은 감소하였다.
제2 분석(도 29d)에서, 각각의 PEG-TeNT-LC-c 세린 돌연변이를 별도의 ELISA 플레이트에 흡착시켰다. 이후 각각의 흡착된 PEG-TeNT 세린 돌연변이(2 kDa, 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa)는 TeNT 세린 돌연변이 항원의 각각 4개 농도(10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖)로 미리-인큐베이션된 폴리클로날 항-TeNT 항체로 프로빙하였다. 이 분석에서, 더 낮은 반응(OD 450 nm)은 TeNT 세린 돌연변이에 대해 더 큰 친화성을 나타내므로 PEG-TeNT 세린 돌연변이에 대한 면역원성은 감소하였다.
이 실시예는 항-TeNT 항체가 TeNT-LC-c 세린 돌연변이에 우선적으로 결합하였고 PEG화된 TeNT-LC-c 세린 돌연변이가 TeNT-LC-c 세린 돌연변이(즉, 비-PEG화됨)에 비해 감소된 면역원성을 가짐을 보여주었다.
실시예 11 - TeNT 대비 PEG-TeNT의 감소된 면역원성
경쟁적 ELISA 분석은 실시예 9에 따라 수행될 것이며, 단, 폴리클로날 항체는 앞서 12개월 내에 부스터 파상풍 변성독소 백신접종을 받은 한 명 이상의 대상체로부터 수집된 인간 혈청으로 대체될 것이다. 혈청 내 항체는 PEG-TeNT에 비해 TeNT(즉, 비-PEG화된 TeNT)에 대해 더 큰 친화성을 나타낼 것이다.
실시예 12 - 생체내 모델
실시예 4에 따라 재조합 TeNT의 표면 노출된 라이신 잔기에 PEG(약 5 kDa, 약 10 kDa 또는 약 20 kDa)를 부착하여 PEG-TeNT-LC-HC를 제조하였다.
15 ㎕의 PBS 내 하나 이상의 단위의 PEG-TeNT-LC-HC를 암컷 C57BL/6 마우스의 뒷다리에 주사하였다. 각 동물은 주사 후 48시간 이내에 국소적 사지 근육경련을 나타냈다(도 30a 및 30b).
실시예 13 - 생체내 모델
PEG-TeNT-LC-HC를, 실시예 4에 따라 TeNT의 표면 라이신 잔기에 부착된 5 kDa PEG와, 1:10의 몰비로, c 디코이(즉, R1225E W1288A에 의해 불활성화된 c)와 조합하였다. 5 ng의 PEG-TeNT를 함유하는, PBS 중의 15 마이크로리터의 조성물을 암컷 C57BL/6 마우스의 뒷다리 근육에 주사하였다. 각 동물은 48시간 이내에 국소적 사지 근육경련을 나타냈고, 증상 발생은 디코이가 존재하지 않는 PEG-TeNT-LC-HC로 처리된 동물과 구별가능하지 않았다.
실시예 14.
5 kDa, 10 kDa 또는 20 kDa의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT-LC-HC를 앞서 파상풍 변성독소로 면역화된 마우스의 뒷다리 근육에 50~500,000 ng/㎏으로 근육내 투여하였다. 근육 수축의 증가는 최대 3일 동안 주사된 근육에서 관찰되었으며, 동일한 단위의 TeNT를 투여한 마우스에서 관찰된 효과보다 컸다. 도 31a는 PEG-TeNT-LC-HC 20 kDa에 대한 결과를 보고한다.
실시예 15.
TeNT-LC-HC 및 실시예 6에 따라 생성된 10:1 또는 100:1 몰 과량의 디코이 TeNT를 포함하는 조성물을 앞서 파상풍 변성독소로 면역화된 마우스의 뒷다리 근육에 50~500,000 ng/㎏으로 근육내 투여하였다. 근육 수축의 증가는 최대 3일 동안 주사된 근육에서 관찰되었으며, TeNT가 투여된 마우스에서 관찰된 효과보다 컸다(도 32a).
실시예 16.
5 kDa, 10 kDa 또는 20 kDa의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT-LC-HC 및 실시예 6에 따라 생성된 10:1 또는 100:1 몰 과량의 디코이 TeNT를 포함하는 조성물을 앞서 파상풍 변성독소로 면역화된 마우스의 뒷다리 근육에 50~500,000 ng/㎏으로 근육내 투여하였다. 근육 수축의 증가는 최대 3일 동안 주사된 근육에서 관찰되었고, TeNT가 투여된 마우스에서 관찰된 효과보다 컸으며, PEG-TeNT를 단독으로 투여한 마우스에서 관찰된 효과보다 컸다(도 32b).
실시예 17.
20 kDa의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT-LC-HC를 앞서 파상풍 변성독소로 백신접종된 인간 대상체의 왼쪽 이설골근에 0.01~50,000 ng/㎏으로 근육내 투여할 것이다. 근육 수축의 증가는 최대 2주 동안 주사된 근육에서 관찰될 것이며, 동일한 대상체의 비히클 단독 투여된 오른쪽 이설골근에서 관찰된 효과보다 클 것이다.
실시예 18.
20 kDa의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT-LC-HC 및 실시예 6에 따라 생성된 10:1 ~ 1000:1 몰 과량의 디코이 TeNT를 포함하는 조성물을 앞서 파상풍 변성독소로 백신접종된 인간 대상체의 왼쪽 이설골근에 50 ng/㎏으로 근육내 투여할 것이다. 20 kDa의 PEG를 포함하는 PEG-TeNT-LC-HC를 동일한 인간 대상체의 오른쪽 이설골근에 50 ng/㎏으로 근육내 투여할 것이다.
근육 수축의 증가는 최대 2주 동안 왼쪽 및 오른쪽 이설골근 모두에서 관찰되지만, PEG-TeNT-LC-HC 단독에 비해 PEG-TeNT-LC-HC 및 디코이 TeNT를 포함하는 조성물로 처리된 왼쪽 이설골근에서 더 클 것이다.
실시예 19.
대략 30 ㎏의 불독에게 20 kDa의 PEG를 포함하는 25~50,000 ng/㎏ PEG-TeNT-c를 투여량을 왼쪽 및 오른쪽 이설골근으로 양측으로 나누어 근육 내로 투여할 것이다. 투여시, 폐쇄성 수면 무호흡증(OSA)은 비히클 단독으로 처리된 동물에 비해 PEG-TeNT 처리된 동물에서 감소할 것이다. OSA에 대해 불독을 매주 관찰하고 PEG-TeNT-c 투여량은, 비히클 단독으로 처리된 동물과 비슷한 OSA의 복귀(return)에 의해 결정된 바와 같이, 효능이 감소할 때까지 필요에 따라 반복될 것이다.
그 후, 불독에게 25~50,000 ng/㎏의 PEG-TeNT-HC 또는 25~50,000 ng/㎏의 PEG-TeNT-LC-c를 투여하되, 각각은 20 kDa의 PEG를 포함하며, 왼쪽 및 오른쪽 이설골근에 양측으로 나누어 투여할 것이다. 투여시, OSA는 비히클 단독으로 처리된 동물에 비해 PEG-TeNT 처리된 동물에서 감소할 것이다. OSA에 대해 불독을 매주 관찰하고 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c 투여량은 비히클 단독으로 처리된 동물과 비슷한 OSA의 복귀에 의해 결정된 바와 같이, 효능이 감소할 때까지 필요에 따라 반복될 것이다.
그 후, 불독에게 20 kDa의 PEG를 포함하는, 25~50,000 ng/㎏ PEG-TeNT-LC-HC를, 왼쪽 및 오른쪽 이설골근에 양측으로 나누어 투여할 것이다. 투여시, OSA는 비히클 단독으로 처리된 동물에 비해 PEG-TeNT 처리된 동물에서 감소할 것이다. OSA에 대해 불독을 매주 관찰하고 PEG-TeNT-LC-HC 투여량은 비히클 단독으로 처리된 동물과 비슷한 OSA의 복귀에 의해 결정된 바와 같이, 효능이 감소할 때까지 필요에 따라 반복될 것이다.
실시예 20
디스커버리 스튜디오를 사용하여 단백질 데이터 뱅크(접근 ID PDB: 5N0B)에 예치된 결정학 데이터로부터 유래된 TeNT의 3차원 단백질 모델에 대해, da Silva Antunes 등 (2017) PloS One, 12(1), e0169086 및 Palermo 등 (2017) Biotechnology Journal, 12(10), 1700197에 의해 식별된 바와 같이, 주요 인간 항체 클로노타입에 의해 인식되는 TeNT 에피토프를 맵핑하였다. 식별된 에피토프의 내부 또는 주변의 표면 세린 잔기는, 실시예 1 내지 3 및 5에 제시된 바와 같은 후속 PEG화를 위해 시스테인으로의 돌연변이를 위해 식별되었다.
실시예 21
PEG-TeNT(표면 라이신 또는 시스테인 잔기에 부착된 5 kDa, 10 kDa, 또는 20 kDa 분지형 또는 선형 PEG) 및 10~1000 몰 과량의 디코이 TeNT의 혼합물 1 나노그램 내지 64 마이크로그램을 파상풍 변성독소에 대해 백신접종된 마우스의 뒷다리 근육에 근육내 주사할 것이다. 국소적 파상풍은 네이티브 TeNT를 주사한 마우스에서 관찰된 효과보다 더 많은, 수시간 내지 수개월의 기간 동안 관찰될 것이다.
실시예 22
PEG-TeNT(표면 라이신 또는 시스테인 잔기에 부착된 5 kDa, 10 kDa, 또는 20 kDa 분지형 또는 선형 PEG) 및 10~1000 몰 과량의 디코이 TeNT의 혼합물 1 나노그램 내지 64 마이크로그램을 파상풍 변성독소에 대해 백신접종된 인간의 이설골근에 근육내 주사할 것이다. 국소적 파상풍은 네이티브 TeNT를 주사한 인간에서 관찰된 효과보다 더 많은, 수주 내지 수개월의 기간 동안 관찰된다.
실시예 23
수면과 관련된 호흡장애가 있는 브리티시 불독에게 0.001~10 IU/㎏의 TeNT를 근육내 투여했으며, 투여량은 왼쪽과 오른쪽 이설골근에 양측으로 나누어 투여하였다. 투여시, 폐쇄성 수면 무호흡증(OSA)이 최고 투여량에서 현저히 감소하는 것을 관찰하였다. 기준선 호흡 장애 지수(RDI) 점수는 19.9(사분위 범위 5.45)에서 10 IU/㎏ TeNT로 처리한 후 13.2(사분위 범위 4.45)로 감소했으며, 윌콕슨 부호 순위 검정에 의하면(P=.043으로) 위약 투여와 비교하여 유의한 것으로 결정되었다. 불독을 시험 4개월 후에 관찰한 결과, RDI 감소가 유지되었다; 중앙값 RDI=13.4, P=0.043; 윌콕슨 부호 순위 검정.
<110> Snoretox Pty Ltd <120> PEGYLATED TETANUS NEUROTOXINS AND TREATMENT OF HYPOTONIA <130> 2021-FPA-0539 <150> AU 2018902779 <151> 2018-07-31 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1314 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Ser 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys 850 855 860 Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser 885 890 895 Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln 900 905 910 Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu 915 920 925 Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp 930 935 940 Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 945 950 955 960 Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile 965 970 975 Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val 980 985 990 Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly 995 1000 1005 Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala 1010 1015 1020 Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu 1045 1050 1055 Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys 1060 1065 1070 Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe 1075 1080 1085 Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr 1090 1095 1100 Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser 1125 1130 1135 Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn 1140 1145 1150 Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu 1155 1160 1165 Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu 1170 1175 1180 Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser 1185 1190 1195 1200 Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu 1250 1255 1260 Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg 1265 1270 1275 1280 Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys 1285 1290 1295 Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr 1300 1305 1310 Asn Asp <210> 2 <211> 6816 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga ttaccatcaa taattttcgt 240 tattcagatc cggtgaataa tgataccatc atcatgatgg aaccaccgta ctgtaaaggg 300 ctggatattt attataaagc gttcaaaatc accgaccgca tctggatcgt gccggaacgc 360 tacgaattcg gcaccaaacc ggaagatttt aatccgccga gtagtctgat cgaaggtgca 420 tcggaatact acgatccgaa ttatctgcgt actgactctg ataaagatcg ctttctgcaa 480 acgatggtaa aactgttcaa tcgtatcaaa aacaatgtag caggcgaagc cctgctggat 540 aaaatcatca acgccattcc gtatctggga aacagttatt ctctgctgga taaattcgat 600 acaaactcga actctgtgtc attcaacctg ctggaacagg acccgagcgg cgcgaccact 660 aagagtgcga tgctgactaa cctgattatt ttcggtccgg gaccggtact gaataaaaat 720 gaagttcgcg gcattgtact gcgtgtcgat aataaaaact atttcccatg tcgtgatggc 780 ttcggcagca tcatgcagat ggccttttgt ccggaatatg tgccaacttt cgataatgtg 840 attgagaaca tcacctctct gacgattggt aaaagtaaat atttccagga tccggctctg 900 ctgctgatgc atgaactgat ccatgttctg catggcctgt atggcatgca ggtttcatcc 960 cacgaaatta tcccatccaa acaggaaatt tacatgcagc atacatatcc gattagtgcc 1020 gaagaactgt tcacttttgg cggccaggat gcgaacctga tttcgattga cattaaaaac 1080 gatctgtatg aaaaaactct gaacgattat aaagcgattg ccaacaaact gtctcaggta 1140 acctcctgta acgatccgaa tattgatatt gacagttata aacaaattta tcagcagaag 1200 tatcagttcg ataaagactc taatggccag tatattgtta acgaagataa attccagatt 1260 ctgtacaata gcattatgta tggctttact gagatcgaac tgggtaaaaa atttaacatc 1320 aagactcgtc tgagctattt tagcatgaat catgatccag tgaaaatccc gaatctgctg 1380 gatgatacga tttataatga taccgaagga tttaacatcg aaagcaagga tctgaaatcc 1440 gaatataaag ggcagaacat gcgcgttaat accaatgcat ttcgcaatgt tgatggttca 1500 ggcctggtgt cgaaactgat tgggctgtgt aagaaaatca ttccaccgac aaatattcgc 1560 gaaaatctgt acaaccgtac ggcgagcctg accgatctgg ggggagaact gtgtattaaa 1620 atcaaaaatg aagatctgac cttcattgct gagaagaata gcttttccga agagccattc 1680 caggacgaaa tcgtgtctta taacaccaag aataaaccgc tgaatttcaa ctactccctg 1740 gacaaaatca ttgtggatta caacctgcag agtaaaatta ccctgccgaa tgatcgtacc 1800 accccggtga cgaaaggcat cccttacgca ccagaatata aatcaaatgc agcctcgact 1860 atcgagatcc ataatattga tgacaacact atttaccagt acctgtatgc tcagaaatct 1920 ccgacgacgc tgcagcgcat caccatgact aacagcgtgg acgatgccct gattaatagc 1980 accaaaatct actcttactt tccgtcggtg atctctaagg ttaatcaggg cgcgcaaggt 2040 atcctgtttc tgcaatgggt gcgtgatatt attgatgatt tcactaatga atctagccag 2100 aaaacgacaa ttgataaaat ttcggatgtt tccaccatcg tgccttacat cggcccagcg 2160 ctgaacatcg tgaagcaggg ttatgagggt aactttatcg gagcactgga aacgaccggc 2220 gtggttctgc tgctggaata tattccggag attactctgc cagttattgc ggctctgtcg 2280 attgcagaga gctcaacgca gaaagaaaaa attattaaga cgatcgacaa tttcctggaa 2340 aagcgctacg aaaaatggat cgaagtgtat aagctggtga aagcgaaatg gctggggacc 2400 gtgaacaccc agttccaaaa acgttcctat caaatgtatc gtagcctgga atatcaggtg 2460 gacgccatta aaaagatcat cgattacgaa tataagatct actccggtcc ggacaaagaa 2520 cagattgcgg acgaaattaa caatctgaaa aataaactgg aggaaaaagc caacaaagcg 2580 atgattaata tcaatatttt catgcgtgaa agcagccgta gcttcctggt caatcagatg 2640 attaatgaag cgaagaaaca actgctggaa tttgatacgc aatctaaaaa tattctgatg 2700 caatacatca aagccaattc taaatttatt gggatcacgg aactgaaaaa gctggaatcg 2760 aaaatcaata aagtctttag caccccgatt ccgttctcct actcgaaaaa tctggattgt 2820 tgggttgaca atgaagaaga tattgatgtt attctgaaaa agagcacgat cctgaacctg 2880 gatattaata acgatattat ctctgatatc agtggtttta attcatcagt tattacttac 2940 ccagacgctc aactggtgcc gggaatcaat gggaaagcca ttcatctggt gaataatgaa 3000 tcaagtgaag tgatcgtgca taaagcgatg gatatcgagt acaacgatat gtttaataat 3060 ttcacggtgt cgttctggct gcgtgttccg aaagtgagtg cctcccacct ggaacaatat 3120 ggaaccaacg aatactcaat cattagcagc atgaagaaac attcgctgag tattggttca 3180 ggttggagcg tttccctgaa agggaacaat ctgatctgga cactgaagga ctcagcgggc 3240 gaagtgcgtc agattacgtt tcgtgatctg ccggataaat ttaatgcata cctggctaac 3300 aaatgggtgt tcatcacaat caccaatgac cgtctgtcgt ctgcaaacct gtatattaat 3360 ggggtactga tgggctcggc agaaattaca gggctgggcg ccattcgtga agataacaat 3420 attacgctga aactggatcg ttgtaataac aataatcagt atgtgagcat tgataaattt 3480 cgtattttct gcaaagcgct gaacccgaaa gaaattgaaa aactgtatac ctcgtatctg 3540 tcaattacgt ttctgcgcga tttctgggga aacccgctgc gttacgatac ggaatactac 3600 ctgatcccgg tagccagttc tagtaaagac gttcaactga aaaatattac cgactacatg 3660 tatctgacaa acgctccatc atacacaaac ggcaaactga acatctatta ccgtcgcctg 3720 tacaatgggc tgaaattcat cattaaacgt tataccccga ataacgaaat tgattccttt 3780 gtgaagtccg gtgacttcat taagctgtat gtatcctata acaataatga acacatcgtt 3840 ggctatccga aggatggcaa tgcctttaac aacctggatc gtattctgcg tgtaggttac 3900 aacgccccgg gtattccgct gtataagaaa atggaagcag tgaaactgcg tgatctgaaa 3960 acatattccg tgcaactgaa gctgtatgat gacaaaaatg ctagcctggg tctggtaggc 4020 acgcataacg gtcagattgg aaacgatcct aatcgtgaca tcctgatcgc ctctaactgg 4080 tattttaacc acctgaaaga taaaattctg ggctgcgatt ggtattttgt ccctaccgat 4140 gaaggctgga cgaacgatta aaagcttgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 4200 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 4260 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatctggcgt aatagcgaag 4320 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc 4380 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4440 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4500 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4560 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4620 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4680 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4740 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4800 attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 4860 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4920 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4980 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5040 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5100 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5160 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 5220 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 5280 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 5340 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5400 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5460 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5520 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5580 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 5640 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 5700 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5760 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5820 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 5880 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 5940 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6000 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6060 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6120 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 6180 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 6240 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6300 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 6360 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 6420 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6480 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6540 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6600 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 6660 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 6720 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 6780 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcag 6816 <210> 3 <211> 858 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu 1 5 10 15 Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe 20 25 30 Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe 35 40 45 Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys 50 55 60 Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro 65 70 75 80 Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His 85 90 95 Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser 100 105 110 Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala 115 120 125 Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser 130 135 140 Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg 145 150 155 160 Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile 165 170 175 Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 180 185 190 Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu 195 200 205 Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr 210 215 220 Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys 225 230 235 240 Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu 245 250 255 Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr 260 265 270 Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu 275 280 285 Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys 290 295 300 Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn 305 310 315 320 Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 325 330 335 Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met 340 345 350 Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys 355 360 365 Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile 370 375 380 Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr 385 390 395 400 Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn 405 410 415 Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu 420 425 430 Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser 435 440 445 Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys 450 455 460 Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys 465 470 475 480 Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser 485 490 495 Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr 500 505 510 Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu 515 520 525 Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile 530 535 540 Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg 545 550 555 560 Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe 565 570 575 Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn 580 585 590 Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg 595 600 605 Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn 610 615 620 Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn 625 630 635 640 Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe 645 650 655 Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr 660 665 670 Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile 675 680 685 Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys 690 695 700 Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile 705 710 715 720 Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly 725 730 735 Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val 740 745 750 Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu 755 760 765 Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu 770 775 780 Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu 785 790 795 800 Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly 805 810 815 Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp 820 825 830 Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe 835 840 845 Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp 850 855 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 20 25 30 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 35 40 45 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 50 55 60 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 85 90 95 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 100 105 110 Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 115 120 125 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 130 135 140 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg 165 170 175 Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala 180 185 190 Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu 195 200 205 Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys 210 215 220 Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn 245 250 255 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser 260 265 270 Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr 275 280 285 Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg 290 295 300 Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn 305 310 315 320 Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val 325 330 335 Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn 340 345 350 Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro 355 360 365 Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu 370 375 380 Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser 385 390 395 400 Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn 405 410 415 Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp 420 425 430 Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp 435 440 445 Thr Asn Asp 450 <210> 5 <211> 4234 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagaaaa atctggattg ttgggttgac 240 aatgaagaag atattgatgt tattctgaaa aagagcacga tcctgaacct ggatattaat 300 aacgatatta tctctgatat cagtggtttt aattcatcag ttattactta cccagacgct 360 caactggtgc cgggaatcaa tgggaaagcc attcatctgg tgaataatga atcaagtgaa 420 gtgatcgtgc ataaagcgat ggatatcgag tacaacgata tgtttaataa tttcacggtg 480 tcgttctggc tgcgtgttcc gaaagtgagt gcctcccacc tggaacaata tggaaccaac 540 gaatactcaa tcattagcag catgaagaaa cattcgctga gtattggttc aggttggagc 600 gtttccctga aagggaacaa tctgatctgg acactgaagg actcagcggg cgaagtgcgt 660 cagattacgt ttcgtgatct gccggataaa tttaatgcat acctggctaa caaatgggtg 720 ttcatcacaa tcaccaatga ccgtctgtcg tctgcaaacc tgtatattaa tggggtactg 780 atgggctcgg cagaaattac agggctgggc gccattcgtg aagataacaa tattacgctg 840 aaactggatc gttgtaataa caataatcag tatgtgagca ttgataaatt tcgtattttc 900 tgcaaagcgc tgaacccgaa agaaattgaa aaactgtata cctcgtatct gtcaattacg 960 tttctgcgcg atttctgggg aaacccgctg cgttacgata cggaatacta cctgatcccg 1020 gtagccagtt ctagtaaaga cgttcaactg aaaaatatta ccgactacat gtatctgaca 1080 aacgctccat catacacaaa cggcaaactg aacatctatt accgtcgcct gtacaatggg 1140 ctgaaattca tcattaaacg ttataccccg aataacgaaa ttgattcctt tgtgaagtcc 1200 ggtgacttca ttaagctgta tgtatcctat aacaataatg aacacatcgt tggctatccg 1260 aaggatggca atgcctttaa caacctggat cgtattctgc gtgtaggtta caacgccccg 1320 ggtattccgc tgtataagaa aatggaagca gtgaaactgc gtgatctgaa aacatattcc 1380 gtgcaactga agctgtatga tgacaaaaat gctagcctgg gtctggtagg cacgcataac 1440 ggtcagattg gaaacgatcc taatcgtgac atcctgatcg cctctaactg gtattttaac 1500 cacctgaaag ataaaattct gggctgcgat tggtattttg tccctaccga tgaaggctgg 1560 acgaacgatt aagaattcga agcttgatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga 1620 gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 1680 cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga tctggcgtaa tagcgaagag 1740 gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc 1800 tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 1860 gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 1920 ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 1980 cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 2040 tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 2100 ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 2160 ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 2220 tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 2280 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 2340 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 2400 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 2460 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 2520 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 2580 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 2640 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 2700 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 2760 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 2820 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 2880 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 2940 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 3000 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 3060 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 3120 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 3180 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 3240 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 3300 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 3360 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 3420 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 3480 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 3540 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 3600 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 3660 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 3720 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 3780 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 3840 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 3900 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 3960 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 4020 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 4080 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 4140 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 4200 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcag 4234 <210> 6 <211> 863 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Ser 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser 850 855 860 <210> 7 <211> 5479 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga ttaccatcaa taattttcgt 240 tattcagatc cggtgaataa tgataccatc atcatgatgg aaccaccgta ctgtaaaggg 300 ctggatattt attataaagc gttcaaaatc accgaccgca tctggatcgt gccggaacgc 360 tacgaattcg gcaccaaacc ggaagatttt aatccgccga gtagtctgat cgaaggtgca 420 tcggaatact acgatccgaa ttatctgcgt actgactctg ataaagatcg ctttctgcaa 480 acgatggtaa aactgttcaa tcgtatcaaa aacaatgtag caggcgaagc cctgctggat 540 aaaatcatca acgccattcc gtatctggga aacagttatt ctctgctgga taaattcgat 600 acaaactcga actctgtgtc attcaacctg ctggaacagg acccgagcgg cgcgaccact 660 aagagtgcga tgctgactaa cctgattatt ttcggtccgg gaccggtact gaataaaaat 720 gaagttcgcg gcattgtact gcgtgtcgat aataaaaact atttcccatg tcgtgatggc 780 ttcggcagca tcatgcagat ggccttttgt ccggaatatg tgccaacttt cgataatgtg 840 attgagaaca tcacctctct gacgattggt aaaagtaaat atttccagga tccggctctg 900 ctgctgatgc atgaactgat ccatgttctg catggcctgt atggcatgca ggtttcatcc 960 cacgaaatta tcccatccaa acaggaaatt tacatgcagc atacatatcc gattagtgcc 1020 gaagaactgt tcacttttgg cggccaggat gcgaacctga tttcgattga cattaaaaac 1080 gatctgtatg aaaaaactct gaacgattat aaagcgattg ccaacaaact gtctcaggta 1140 acctcctgta acgatccgaa tattgatatt gacagttata aacaaattta tcagcagaag 1200 tatcagttcg ataaagactc taatggccag tatattgtta acgaagataa attccagatt 1260 ctgtacaata gcattatgta tggctttact gagatcgaac tgggtaaaaa atttaacatc 1320 aagactcgtc tgagctattt tagcatgaat catgatccag tgaaaatccc gaatctgctg 1380 gatgatacga tttataatga taccgaagga tttaacatcg aaagcaagga tctgaaatcc 1440 gaatataaag ggcagaacat gcgcgttaat accaatgcat ttcgcaatgt tgatggttca 1500 ggcctggtgt cgaaactgat tgggctgtgt aagaaaatca ttccaccgac aaatattcgc 1560 gaaaatctgt acaaccgtac ggcgagcctg accgatctgg ggggagaact gtgtattaaa 1620 atcaaaaatg aagatctgac cttcattgct gagaagaata gcttttccga agagccattc 1680 caggacgaaa tcgtgtctta taacaccaag aataaaccgc tgaatttcaa ctactccctg 1740 gacaaaatca ttgtggatta caacctgcag agtaaaatta ccctgccgaa tgatcgtacc 1800 accccggtga cgaaaggcat cccttacgca ccagaatata aatcaaatgc agcctcgact 1860 atcgagatcc ataatattga tgacaacact atttaccagt acctgtatgc tcagaaatct 1920 ccgacgacgc tgcagcgcat caccatgact aacagcgtgg acgatgccct gattaatagc 1980 accaaaatct actcttactt tccgtcggtg atctctaagg ttaatcaggg cgcgcaaggt 2040 atcctgtttc tgcaatgggt gcgtgatatt attgatgatt tcactaatga atctagccag 2100 aaaacgacaa ttgataaaat ttcggatgtt tccaccatcg tgccttacat cggcccagcg 2160 ctgaacatcg tgaagcaggg ttatgagggt aactttatcg gagcactgga aacgaccggc 2220 gtggttctgc tgctggaata tattccggag attactctgc cagttattgc ggctctgtcg 2280 attgcagaga gctcaacgca gaaagaaaaa attattaaga cgatcgacaa tttcctggaa 2340 aagcgctacg aaaaatggat cgaagtgtat aagctggtga aagcgaaatg gctggggacc 2400 gtgaacaccc agttccaaaa acgttcctat caaatgtatc gtagcctgga atatcaggtg 2460 gacgccatta aaaagatcat cgattacgaa tataagatct actccggtcc ggacaaagaa 2520 cagattgcgg acgaaattaa caatctgaaa aataaactgg aggaaaaagc caacaaagcg 2580 atgattaata tcaatatttt catgcgtgaa agcagccgta gcttcctggt caatcagatg 2640 attaatgaag cgaagaaaca actgctggaa tttgatacgc aatctaaaaa tattctgatg 2700 caatacatca aagccaattc taaatttatt gggatcacgg aactgaaaaa gctggaatcg 2760 aaaatcaata aagtctttag caccccgatt ccgttctcct actcgtaagg taccatggaa 2820 ttcgaagctt gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac 2880 cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt 2940 gctgaaagga ggaactatat ccggatctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 3000 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta 3060 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 3120 cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 3180 gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 3240 aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 3300 cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 3360 acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 3420 tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 3480 acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 3540 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 3600 aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 3660 tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3720 atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 3780 agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 3840 tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 3900 tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 3960 atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 4020 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 4080 tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 4140 acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 4200 ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 4260 aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 4320 ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 4380 cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 4440 gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 4500 actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 4560 agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 4620 cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 4680 tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 4740 agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 4800 ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 4860 acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4920 ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 4980 gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 5040 gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 5100 gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 5160 tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 5220 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 5280 tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 5340 gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 5400 agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 5460 ggccgattca ttaatgcag 5479 <210> 8 <211> 451 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 20 25 30 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 35 40 45 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 50 55 60 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 85 90 95 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 100 105 110 Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 115 120 125 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 130 135 140 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg 165 170 175 Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala 180 185 190 Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu 195 200 205 Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys 210 215 220 Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn 245 250 255 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser 260 265 270 Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr 275 280 285 Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg 290 295 300 Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn 305 310 315 320 Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val 325 330 335 Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn 340 345 350 Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Glu Val Gly Tyr Asn Ala Pro 355 360 365 Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu 370 375 380 Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser 385 390 395 400 Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn 405 410 415 Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Ala Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp 420 425 430 Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp 435 440 445 Thr Asn Asp 450 <210> 9 <211> 4234 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagaaaa atttggattg ctgggtcgac 240 aatgaggagg acattgatgt gatattaaag aaatccacta tcttaaatct tgatataaac 300 aatgacatca tctcggatat atctgggttc aattcttccg tcataactta ccctgatgct 360 caactggtac cgggaattaa tgggaaggcc atacacttag tcaacaacga atcttccgag 420 gtgattgtac ataaggcaat ggacatagag tacaatgaca tgtttaataa ctttactgtc 480 tcgttctggt tacgcgtgcc caaagtatct gcctcacacc tggaacagta tggcacaaat 540 gaatattcta ttatcagtag tatgaagaaa cactcgcttt ctataggatc cggctggagt 600 gtttcgctga agggcaataa cttgatctgg acccttaaag attcagcggg agaagtaaga 660 caaataactt tccgggattt gcctgataag ttcaacgcat acctggccaa taagtgggtt 720 ttcataacta taacaaatga ccgcttgtct agcgccaact tatacatcaa tggagtattg 780 atgggttccg ctgagattac aggcttgggt gccataagag aggacaataa tatcaccctg 840 aaactggacc gctgcaataa taacaatcag tacgtgagca tagataaatt ccgtattttt 900 tgcaaagccc tgaacccgaa agaaatcgaa aaactgtata cttcatatct gagcataaca 960 tttctgcgtg atttttgggg taacccgctg cgttatgata ccgaatacta cctgattccg 1020 gttgccagca gcagcaaaga tgttcagctg aaaaatatta ccgactatat gtatctgaca 1080 aatgcgccgt cttataccaa tggcaaactg aatatttatt atcgccggtt gtacaacggg 1140 ctgaagttca ttattaaacg gtacaccccg aacaacgaaa tcgattcatt tgttaaatcc 1200 ggggatttca taaagttata cgtgagctat aataacaacg agcatattgt aggttatccg 1260 aaagacggta atgctttcaa caacttggat cggatactgg aagttggtta caacgcccca 1320 ggtattccac tgtataagaa aatggaagcc gtcaagttgc gtgatttaaa gacgtactca 1380 gtacagctta aattatacga cgataagaat gcaagccttg gattggttgg gacccacaat 1440 ggtcagattg gaaatgaccc caatcgggac attctgatag catccaacgc gtacttcaac 1500 catttgaaag ataaaatcct gggctgtgat tggtactttg taccgactga tgaaggatgg 1560 acgaatgact aagaattcga agcttgatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga 1620 gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 1680 cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga tctggcgtaa tagcgaagag 1740 gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc 1800 tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 1860 gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 1920 ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 1980 cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 2040 tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 2100 ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 2160 ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 2220 tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 2280 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 2340 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 2400 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 2460 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 2520 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 2580 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 2640 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 2700 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 2760 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 2820 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 2880 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 2940 tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 3000 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 3060 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 3120 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 3180 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 3240 tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 3300 aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 3360 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 3420 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 3480 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 3540 agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 3600 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 3660 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 3720 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 3780 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 3840 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 3900 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 3960 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 4020 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 4080 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 4140 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 4200 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcag 4234 <210> 10 <211> 1314 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Ser 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys 850 855 860 Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser 885 890 895 Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln 900 905 910 Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu 915 920 925 Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp 930 935 940 Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 945 950 955 960 Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile 965 970 975 Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val 980 985 990 Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly 995 1000 1005 Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala 1010 1015 1020 Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu 1045 1050 1055 Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys 1060 1065 1070 Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe 1075 1080 1085 Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr 1090 1095 1100 Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser 1125 1130 1135 Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn 1140 1145 1150 Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu 1155 1160 1165 Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu 1170 1175 1180 Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser 1185 1190 1195 1200 Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Glu Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu 1250 1255 1260 Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg 1265 1270 1275 1280 Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Ala Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys 1285 1290 1295 Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr 1300 1305 1310 Asn Asp <210> 11 <211> 6816 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga tcaccatcaa caacttccgt 240 tactctgacc cggttaacaa cgacaccatc atcatgatgg aaccgccgta ctgcaaaggt 300 ctggacatct actacaaagc gttcaaaatc accgaccgta tctggatcgt tccggaacgt 360 tacgaattcg gtaccaaacc ggaagacttc aacccgccgt cttctctgat cgaaggtgcg 420 tctgaatact acgacccgaa ctacctgcgt accgactctg acaaagaccg tttcctgcag 480 accatggtta aactgttcaa ccgtatcaaa aacaacgttg cgggtgaagc gctgctggac 540 aaaatcatca acgcgatccc gtacctgggt aactcttact ctctgctgga caaattcgac 600 accaactcta actctgtttc tttcaacctg ctggaacagg acccgtctgg tgcgaccacc 660 aaatctgcga tgctgaccaa cctgatcatc ttcggtccgg gtccggttct gaacaaaaac 720 gaagttcgtg gtatcgttct gcgtgttgac aacaaaaact acttcccgtg ccgtgacggt 780 ttcggttcta tcatgcagat ggcgttctgc ccggaatacg ttccgacctt cgacaacgtt 840 atcgaaaaca tcacctctct gaccatcggt aaatctaaat acttccagga cccggcgctg 900 ctgctgatgc acgaactgat ccacgttctg cacggtctgt acggtatgca ggtttcttct 960 cacgaaatca tcccgtctaa acaggaaatc tacatgcagc acacctaccc gatctctgcg 1020 gaagaactgt tcaccttcgg tggtcaggac gcgaacctga tctctatcga catcaaaaac 1080 gacctgtacg aaaaaaccct gaacgactac aaagcgatcg cgaacaaact gtctcaggtt 1140 acctcttgca acgacccgaa catcgacatc gactcttaca aacagatcta ccagcagaaa 1200 taccagttcg acaaagactc taacggtcag tacatcgtta acgaagacaa attccagatc 1260 ctgtacaact ctatcatgta cggtttcacc gaaatcgaac tgggtaaaaa attcaacatc 1320 aaaacccgtc tgtcttactt ctctatgaac cacgacccgg ttaaaatccc gaacctgctg 1380 gacgacacca tctacaacga caccgaaggt ttcaacatcg aatctaaaga cctgaaatct 1440 gaatacaaag gtcagaacat gcgtgttaac accaacgcgt tccgtaacgt tgacggttct 1500 ggtctggttt ctaaactgat cggtctgtgc aaaaaaatca tcccgccgac caacatccgt 1560 gaaaacctgt acaaccgtac cgcgtctctg accgacctgg gtggtgaact gtgcatcaaa 1620 atcaaaaacg aagacctgac cttcatcgcg gaaaaaaact ctttctctga agaaccgttc 1680 caggacgaaa tcgtttctta caacaccaaa aacaaaccgc tgaacttcaa ctactctctg 1740 gacaaaatca tcgttgacta caacctgcag tctaaaatca ccctgccgaa cgaccgtacc 1800 accccggtta ccaaaggtat cccgtacgcg ccggaataca aatctaacgc ggcgtctacc 1860 atcgaaatcc acaacatcga cgacaacacc atctaccagt acctgtacgc gcagaaatct 1920 ccgaccaccc tgcagcgtat caccatgacc aactctgttg acgacgcgct gatcaactct 1980 accaaaatct actcttactt cccgtctgtt atctctaaag ttaaccaggg tgcgcagggt 2040 atcctgttcc tgcagtgggt tcgtgacatc atcgacgact tcaccaacga atcttctcag 2100 aaaaccacca tcgacaaaat ctctgacgtt tctaccatcg ttccgtacat cggtccggcg 2160 ctgaacatcg ttaaacaggg ttacgaaggt aacttcatcg gtgcgctgga aaccaccggt 2220 gttgttctgc tgctggaata catcccggaa atcaccctgc cggttatcgc ggcgctgtct 2280 atcgcggaat cttctaccca gaaagaaaaa atcatcaaaa ccatcgacaa cttcctggaa 2340 aaacgttacg aaaaatggat cgaagtttac aaactggtta aagcgaaatg gctgggtacc 2400 gttaacaccc agttccagaa acgttcttac cagatgtacc gttctctgga ataccaggtt 2460 gacgcgatca aaaaaatcat cgactacgaa tacaaaatct actctggtcc ggacaaagaa 2520 cagatcgcgg acgaaatcaa caacctgaaa aacaaactgg aagaaaaagc gaacaaagcg 2580 atgatcaaca tcaacatctt catgcgtgaa tcttctcgtt ctttcctggt taaccagatg 2640 atcaacgaag cgaaaaaaca gctgctggaa ttcgacaccc agtctaaaaa catcctgatg 2700 cagtacatca aagcgaactc taaattcatc ggtatcaccg aactgaaaaa actggaatct 2760 aaaatcaaca aagttttctc taccccgatc ccgttctctt actctaaaaa cctggactgc 2820 tgggttgaca acgaagaaga catcgacgtt atcctgaaaa aatctaccat cctgaacctg 2880 gacatcaaca acgacatcat ctctgacatc tctggtttca actcttctgt tatcacctac 2940 ccggacgcgc agctggttcc gggtatcaac ggtaaagcga tccacctggt taacaacgaa 3000 tcttctgaag ttatcgttca caaagcgatg gacatcgaat acaacgacat gttcaacaac 3060 ttcaccgttt ctttctggct gcgtgttccg aaagtttctg cgtctcacct ggaacagtac 3120 ggtaccaacg aatactctat catctcttct atgaaaaaac actctctgtc tatcggttct 3180 ggttggtctg tttctctgaa aggtaacaac ctgatctgga ccctgaaaga ctctgcgggt 3240 gaagttcgtc agatcacctt ccgtgacctg ccggacaaat tcaacgcgta cctggcgaac 3300 aaatgggttt tcatcaccat caccaacgac cgtctgtctt ctgcgaacct gtacatcaac 3360 ggtgttctga tgggttctgc ggaaatcacc ggtctgggtg cgatccgtga agacaacaac 3420 atcaccctga aactggaccg ttgcaacaac aacaaccagt acgtttctat cgacaaattc 3480 cgtatcttct gcaaagcgct gaacccgaaa gaaatcgaaa aactgtacac ctcttacctg 3540 tctatcacct tcctgcgtga cttctggggt aacccgctgc gttacgacac cgaatactac 3600 ctgatcccgg ttgcgtcttc ttctaaagac gttcagctga aaaacatcac cgactacatg 3660 tacctgacca acgcgccgtc ttacaccaac ggtaaactga acatctacta ccgtcgtctg 3720 tacaacggtc tgaaattcat catcaaacgt tacaccccga acaacgaaat cgactctttc 3780 gttaaatctg gtgacttcat caaactgtac gtttcttaca acaacaacga acacatcgtt 3840 ggttacccga aagacggtaa cgcgttcaac aacctggacc gtatcctgga agttggttac 3900 aacgcgccgg gtatcccgct gtacaaaaaa atggaagcgg ttaaactgcg tgacctgaaa 3960 acctactctg ttcagctgaa actgtacgac gacaaaaacg cgtctctggg tctggttggt 4020 acccacaacg gtcagatcgg taacgacccg aaccgtgaca tcctgatcgc gtctaacgcg 4080 tacttcaacc acctgaaaga caaaatcctg ggttgcgact ggtacttcgt tccgaccgac 4140 gaaggttgga ccaacgacta aaagcttgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 4200 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 4260 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatctggcgt aatagcgaag 4320 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc 4380 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4440 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4500 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4560 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4620 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4680 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4740 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4800 attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 4860 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4920 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4980 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5040 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5100 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5160 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 5220 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 5280 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 5340 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5400 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5460 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5520 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5580 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 5640 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 5700 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5760 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5820 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 5880 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 5940 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6000 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6060 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6120 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 6180 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 6240 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6300 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 6360 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 6420 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6480 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6540 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6600 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 6660 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 6720 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 6780 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcag 6816 <210> 12 <211> 1314 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Cys Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Cys Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Cys 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Cys His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Cys Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Cys Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Cys Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys 850 855 860 Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser 885 890 895 Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln 900 905 910 Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu 915 920 925 Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp 930 935 940 Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 945 950 955 960 Ser Ala Cys His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile 965 970 975 Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val 980 985 990 Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly 995 1000 1005 Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala 1010 1015 1020 Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Cys Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu 1045 1050 1055 Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys 1060 1065 1070 Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe 1075 1080 1085 Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr 1090 1095 1100 Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser 1125 1130 1135 Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn 1140 1145 1150 Ala Pro Cys Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu 1155 1160 1165 Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu 1170 1175 1180 Ile Asp Cys Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser 1185 1190 1195 1200 Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu 1250 1255 1260 Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg 1265 1270 1275 1280 Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys 1285 1290 1295 Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr 1300 1305 1310 Asn Asp <210> 13 <211> 6816 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga tcaccatcaa caacttccgt 240 tactctgacc cggttaacaa cgacaccatc atcatgatgg aaccgccgta ctgcaaaggt 300 ctggacatct actacaaagc gttcaaaatc accgaccgta tctggatcgt tccggaacgt 360 tacgaattcg gtaccaaacc ggaagacttc aacccgccgt cttctctgat cgaaggtgcg 420 tctgaatact acgacccgaa ctacctgcgt accgactgcg acaaagaccg tttcctgcag 480 accatggtta aactgttcaa ccgtatcaaa aacaacgttg cgggtgaagc gctgctggac 540 aaaatcatca acgcgatccc gtacctgggt aactgctact ctctgctgga caaattcgac 600 accaactcta actctgtttc tttcaacctg ctggaacagg acccgtgcgg tgcgaccacc 660 aaatctgcga tgctgaccaa cctgatcatc ttcggtccgg gtccggttct gaacaaaaac 720 gaagttcgtg gtatcgttct gcgtgttgac aacaaaaact acttcccgtg ccgtgacggt 780 ttcggttcta tcatgcagat ggcgttctgc ccggaatacg ttccgacctt cgacaacgtt 840 atcgaaaaca tcacctctct gaccatcggt aaatctaaat acttccagga cccggcgctg 900 ctgctgatgc acgaactgat ccacgttctg cacggtctgt acggtatgca ggtttcttgc 960 cacgaaatca tcccgtctaa acaggaaatc tacatgcagc acacctaccc gatctctgcg 1020 gaagaactgt tcaccttcgg tggtcaggac gcgaacctga tctctatcga catcaaaaac 1080 gacctgtacg aaaaaaccct gaacgactac aaagcgatcg cgaacaaact gtctcaggtt 1140 acctcttgca acgacccgaa catcgacatc gactcttaca aacagatcta ccagcagaaa 1200 taccagttcg acaaagactg caacggtcag tacatcgtta acgaagacaa attccagatc 1260 ctgtacaact ctatcatgta cggtttcacc gaaatcgaac tgggtaaaaa attcaacatc 1320 aaaacccgtc tgtcttactt ctctatgaac cacgacccgg ttaaaatccc gaacctgctg 1380 gacgacacca tctacaacga caccgaaggt ttcaacatcg aatctaaaga cctgaaatct 1440 gaatacaaag gtcagaacat gcgtgttaac accaacgcgt tccgtaacgt tgacggttgc 1500 ggtctggttt ctaaactgat cggtctgtgc aaaaaaatca tcccgccgac caacatccgt 1560 gaaaacctgt acaaccgtac cgcgtctctg accgacctgg gtggtgaact gtgcatcaaa 1620 atcaaaaacg aagacctgac cttcatcgcg gaaaaaaact ctttctctga agaaccgttc 1680 caggacgaaa tcgtttctta caacaccaaa aacaaaccgc tgaacttcaa ctactctctg 1740 gacaaaatca tcgttgacta caacctgcag tctaaaatca ccctgccgaa cgaccgtacc 1800 accccggtta ccaaaggtat cccgtacgcg ccggaataca aatctaacgc ggcgtctacc 1860 atcgaaatcc acaacatcga cgacaacacc atctaccagt acctgtacgc gcagaaatct 1920 ccgaccaccc tgcagcgtat caccatgacc aactctgttg acgacgcgct gatcaactct 1980 accaaaatct actcttactt cccgtctgtt atctgcaaag ttaaccaggg tgcgcagggt 2040 atcctgttcc tgcagtgggt tcgtgacatc atcgacgact tcaccaacga atcttctcag 2100 aaaaccacca tcgacaaaat ctctgacgtt tctaccatcg ttccgtacat cggtccggcg 2160 ctgaacatcg ttaaacaggg ttacgaaggt aacttcatcg gtgcgctgga aaccaccggt 2220 gttgttctgc tgctggaata catcccggaa atcaccctgc cggttatcgc ggcgctgtct 2280 atcgcggaat cttctaccca gaaagaaaaa atcatcaaaa ccatcgacaa cttcctggaa 2340 aaacgttacg aaaaatggat cgaagtttac aaactggtta aagcgaaatg gctgggtacc 2400 gttaacaccc agttccagaa acgttcttac cagatgtacc gttctctgga ataccaggtt 2460 gacgcgatca aaaaaatcat cgactacgaa tacaaaatct actctggtcc ggacaaagaa 2520 cagatcgcgg acgaaatcaa caacctgaaa aacaaactgg aagaaaaagc gaacaaagcg 2580 atgatcaaca tcaacatctt catgcgtgaa tcttctcgtt ctttcctggt taaccagatg 2640 atcaacgaag cgaaaaaaca gctgctggaa ttcgacaccc agtctaaaaa catcctgatg 2700 cagtacatca aagcgaactc taaattcatc ggtatcaccg aactgaaaaa actggaatct 2760 aaaatcaaca aagttttctc taccccgatc ccgttctctt actctaaaaa cctggactgc 2820 tgggttgaca acgaagaaga catcgacgtt atcctgaaaa aatctaccat cctgaacctg 2880 gacatcaaca acgacatcat ctctgacatc tctggtttca actcttctgt tatcacctac 2940 ccggacgcgc agctggttcc gggtatcaac ggtaaagcga tccacctggt taacaacgaa 3000 tcttctgaag ttatcgttca caaagcgatg gacatcgaat acaacgacat gttcaacaac 3060 ttcaccgttt ctttctggct gcgtgttccg aaagtttctg cgtgccacct ggaacagtac 3120 ggtaccaacg aatactctat catctcttct atgaaaaaac actctctgtc tatcggttct 3180 ggttggtctg tttctctgaa aggtaacaac ctgatctgga ccctgaaaga ctctgcgggt 3240 gaagttcgtc agatcacctt ccgtgacctg ccggacaaat tcaacgcgta cctggcgaac 3300 aaatgggttt tcatcaccat caccaacgac cgtctgtgct ctgcgaacct gtacatcaac 3360 ggtgttctga tgggttctgc ggaaatcacc ggtctgggtg cgatccgtga agacaacaac 3420 atcaccctga aactggaccg ttgcaacaac aacaaccagt acgtttctat cgacaaattc 3480 cgtatcttct gcaaagcgct gaacccgaaa gaaatcgaaa aactgtacac ctcttacctg 3540 tctatcacct tcctgcgtga cttctggggt aacccgctgc gttacgacac cgaatactac 3600 ctgatcccgg ttgcgtcttc ttctaaagac gttcagctga aaaacatcac cgactacatg 3660 tacctgacca acgcgccgtg ctacaccaac ggtaaactga acatctacta ccgtcgtctg 3720 tacaacggtc tgaaattcat catcaaacgt tacaccccga acaacgaaat cgactgcttc 3780 gttaaatctg gtgacttcat caaactgtac gtttcttaca acaacaacga acacatcgtt 3840 ggttacccga aagacggtaa cgcgttcaac aacctggacc gtatcctgcg tgttggttac 3900 aacgcgccgg gtatcccgct gtacaaaaaa atggaagcgg ttaaactgcg tgacctgaaa 3960 acctactctg ttcagctgaa actgtacgac gacaaaaacg cgtctctggg tctggttggt 4020 acccacaacg gtcagatcgg taacgacccg aaccgtgaca tcctgatcgc gtctaactgg 4080 tacttcaacc acctgaaaga caaaatcctg ggttgcgact ggtacttcgt tccgaccgac 4140 gaaggttgga ccaacgacta aaagcttgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 4200 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 4260 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatctggcgt aatagcgaag 4320 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc 4380 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4440 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4500 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4560 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4620 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4680 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4740 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4800 attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 4860 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4920 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4980 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5040 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5100 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5160 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 5220 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 5280 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 5340 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5400 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5460 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5520 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5580 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 5640 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 5700 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5760 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5820 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 5880 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 5940 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6000 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6060 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6120 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 6180 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 6240 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6300 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 6360 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 6420 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6480 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6540 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6600 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 6660 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 6720 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 6780 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcag 6816 <210> 14 <211> 1314 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Cys Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Cys Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Cys 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Cys His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Cys Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Cys Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys 850 855 860 Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser 885 890 895 Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln 900 905 910 Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu 915 920 925 Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp 930 935 940 Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 945 950 955 960 Ser Ala Cys His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile 965 970 975 Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val 980 985 990 Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly 995 1000 1005 Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala 1010 1015 1020 Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Cys Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu 1045 1050 1055 Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys 1060 1065 1070 Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe 1075 1080 1085 Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr 1090 1095 1100 Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser 1125 1130 1135 Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn 1140 1145 1150 Ala Pro Cys Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu 1155 1160 1165 Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu 1170 1175 1180 Ile Asp Cys Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser 1185 1190 1195 1200 Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu 1250 1255 1260 Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg 1265 1270 1275 1280 Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys 1285 1290 1295 Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr 1300 1305 1310 Asn Asp <210> 15 <211> 6816 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga tcaccatcaa caacttccgt 240 tactctgacc cggttaacaa cgacaccatc atcatgatgg aaccgccgta ctgcaaaggt 300 ctggacatct actacaaagc gttcaaaatc accgaccgta tctggatcgt tccggaacgt 360 tacgaattcg gtaccaaacc ggaagacttc aacccgccgt cttctctgat cgaaggtgcg 420 tctgaatact acgacccgaa ctacctgcgt accgactgcg acaaagaccg tttcctgcag 480 accatggtta aactgttcaa ccgtatcaaa aacaacgttg cgggtgaagc gctgctggac 540 aaaatcatca acgcgatccc gtacctgggt aactgctact ctctgctgga caaattcgac 600 accaactcta actctgtttc tttcaacctg ctggaacagg acccgtgcgg tgcgaccacc 660 aaatctgcga tgctgaccaa cctgatcatc ttcggtccgg gtccggttct gaacaaaaac 720 gaagttcgtg gtatcgttct gcgtgttgac aacaaaaact acttcccgtg ccgtgacggt 780 ttcggttcta tcatgcagat ggcgttctgc ccggaatacg ttccgacctt cgacaacgtt 840 atcgaaaaca tcacctctct gaccatcggt aaatctaaat acttccagga cccggcgctg 900 ctgctgatgc acgaactgat ccacgttctg cacggtctgt acggtatgca ggtttcttgc 960 cacgaaatca tcccgtctaa acaggaaatc tacatgcagc acacctaccc gatctctgcg 1020 gaagaactgt tcaccttcgg tggtcaggac gcgaacctga tctctatcga catcaaaaac 1080 gacctgtacg aaaaaaccct gaacgactac aaagcgatcg cgaacaaact gtctcaggtt 1140 acctcttgca acgacccgaa catcgacatc gactcttaca aacagatcta ccagcagaaa 1200 taccagttcg acaaagactg caacggtcag tacatcgtta acgaagacaa attccagatc 1260 ctgtacaact ctatcatgta cggtttcacc gaaatcgaac tgggtaaaaa attcaacatc 1320 aaaacccgtc tgtcttactt ctctatgaac cacgacccgg ttaaaatccc gaacctgctg 1380 gacgacacca tctacaacga caccgaaggt ttcaacatcg aatctaaaga cctgaaatct 1440 gaatacaaag gtcagaacat gcgtgttaac accaacgcgt tccgtaacgt tgacggttgc 1500 ggtctggttt ctaaactgat cggtctgtgc aaaaaaatca tcccgccgac caacatccgt 1560 gaaaacctgt acaaccgtac cgcgtctctg accgacctgg gtggtgaact gtgcatcaaa 1620 atcaaaaacg aagacctgac cttcatcgcg gaaaaaaact ctttctctga agaaccgttc 1680 caggacgaaa tcgtttctta caacaccaaa aacaaaccgc tgaacttcaa ctactctctg 1740 gacaaaatca tcgttgacta caacctgcag tctaaaatca ccctgccgaa cgaccgtacc 1800 accccggtta ccaaaggtat cccgtacgcg ccggaataca aatctaacgc ggcgtctacc 1860 atcgaaatcc acaacatcga cgacaacacc atctaccagt acctgtacgc gcagaaatct 1920 ccgaccaccc tgcagcgtat caccatgacc aactctgttg acgacgcgct gatcaactct 1980 accaaaatct actcttactt cccgtctgtt atctctaaag ttaaccaggg tgcgcagggt 2040 atcctgttcc tgcagtgggt tcgtgacatc atcgacgact tcaccaacga atcttctcag 2100 aaaaccacca tcgacaaaat ctctgacgtt tctaccatcg ttccgtacat cggtccggcg 2160 ctgaacatcg ttaaacaggg ttacgaaggt aacttcatcg gtgcgctgga aaccaccggt 2220 gttgttctgc tgctggaata catcccggaa atcaccctgc cggttatcgc ggcgctgtct 2280 atcgcggaat cttctaccca gaaagaaaaa atcatcaaaa ccatcgacaa cttcctggaa 2340 aaacgttacg aaaaatggat cgaagtttac aaactggtta aagcgaaatg gctgggtacc 2400 gttaacaccc agttccagaa acgttcttac cagatgtacc gttctctgga ataccaggtt 2460 gacgcgatca aaaaaatcat cgactacgaa tacaaaatct actctggtcc ggacaaagaa 2520 cagatcgcgg acgaaatcaa caacctgaaa aacaaactgg aagaaaaagc gaacaaagcg 2580 atgatcaaca tcaacatctt catgcgtgaa tcttctcgtt ctttcctggt taaccagatg 2640 atcaacgaag cgaaaaaaca gctgctggaa ttcgacaccc agtctaaaaa catcctgatg 2700 cagtacatca aagcgaactc taaattcatc ggtatcaccg aactgaaaaa actggaatct 2760 aaaatcaaca aagttttctc taccccgatc ccgttctctt actctaaaaa cctggactgc 2820 tgggttgaca acgaagaaga catcgacgtt atcctgaaaa aatctaccat cctgaacctg 2880 gacatcaaca acgacatcat ctctgacatc tctggtttca actcttctgt tatcacctac 2940 ccggacgcgc agctggttcc gggtatcaac ggtaaagcga tccacctggt taacaacgaa 3000 tcttctgaag ttatcgttca caaagcgatg gacatcgaat acaacgacat gttcaacaac 3060 ttcaccgttt ctttctggct gcgtgttccg aaagtttctg cgtgccacct ggaacagtac 3120 ggtaccaacg aatactctat catctcttct atgaaaaaac actctctgtc tatcggttct 3180 ggttggtctg tttctctgaa aggtaacaac ctgatctgga ccctgaaaga ctctgcgggt 3240 gaagttcgtc agatcacctt ccgtgacctg ccggacaaat tcaacgcgta cctggcgaac 3300 aaatgggttt tcatcaccat caccaacgac cgtctgtgct ctgcgaacct gtacatcaac 3360 ggtgttctga tgggttctgc ggaaatcacc ggtctgggtg cgatccgtga agacaacaac 3420 atcaccctga aactggaccg ttgcaacaac aacaaccagt acgtttctat cgacaaattc 3480 cgtatcttct gcaaagcgct gaacccgaaa gaaatcgaaa aactgtacac ctcttacctg 3540 tctatcacct tcctgcgtga cttctggggt aacccgctgc gttacgacac cgaatactac 3600 ctgatcccgg ttgcgtcttc ttctaaagac gttcagctga aaaacatcac cgactacatg 3660 tacctgacca acgcgccgtg ctacaccaac ggtaaactga acatctacta ccgtcgtctg 3720 tacaacggtc tgaaattcat catcaaacgt tacaccccga acaacgaaat cgactgcttc 3780 gttaaatctg gtgacttcat caaactgtac gtttcttaca acaacaacga acacatcgtt 3840 ggttacccga aagacggtaa cgcgttcaac aacctggacc gtatcctgcg tgttggttac 3900 aacgcgccgg gtatcccgct gtacaaaaaa atggaagcgg ttaaactgcg tgacctgaaa 3960 acctactctg ttcagctgaa actgtacgac gacaaaaacg cgtctctggg tctggttggt 4020 acccacaacg gtcagatcgg taacgacccg aaccgtgaca tcctgatcgc gtctaactgg 4080 tacttcaacc acctgaaaga caaaatcctg ggttgcgact ggtacttcgt tccgaccgac 4140 gaaggttgga ccaacgacta aaagcttgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 4200 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 4260 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatctggcgt aatagcgaag 4320 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc 4380 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4440 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4500 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4560 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4620 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4680 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4740 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4800 attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 4860 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4920 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4980 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5040 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5100 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5160 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 5220 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 5280 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 5340 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5400 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5460 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5520 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5580 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 5640 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 5700 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5760 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5820 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 5880 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 5940 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6000 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6060 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6120 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 6180 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 6240 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6300 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 6360 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 6420 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6480 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6540 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6600 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 6660 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 6720 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 6780 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcag 6816 <210> 16 <211> 1314 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn Asp 1 5 10 15 Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr 20 25 30 Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg 35 40 45 Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser Leu 50 55 60 Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp 65 70 75 80 Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg 85 90 95 Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn 100 105 110 Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp 115 120 125 Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Ser 130 135 140 Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg 165 170 175 Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile 180 185 190 Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val 195 200 205 Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln 210 215 220 Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gln 245 250 255 Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu Phe 260 265 270 Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys Asn 275 280 285 Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn Lys 290 295 300 Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp Ser 305 310 315 320 Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser 340 345 350 Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile 355 360 365 Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile 370 375 380 Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn 385 390 395 400 Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg 405 410 415 Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val Ser 420 425 430 Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg 435 440 445 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu 450 455 460 Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys 465 470 475 480 Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr Asn 485 490 495 Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile Ile 500 505 510 Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg Thr 515 520 525 Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser Asn 530 535 540 Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile Tyr 545 550 555 560 Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr 565 570 575 Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr 580 585 590 Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Cys Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly 595 600 605 Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn 610 615 620 Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr 625 630 635 640 Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr 645 650 655 Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu 660 665 670 Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser 675 680 685 Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp 690 695 700 Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu 705 710 715 720 Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg 725 730 735 Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu 755 760 765 Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys 770 775 780 Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser 785 790 795 800 Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu 805 810 815 Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys 820 825 830 Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser 835 840 845 Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys 850 855 860 Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu 865 870 875 880 Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser 885 890 895 Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln 900 905 910 Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu 915 920 925 Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp 930 935 940 Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val 945 950 955 960 Ser Ala Cys His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile 965 970 975 Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val 980 985 990 Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly 995 1000 1005 Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala 1010 1015 1020 Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Cys Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu 1045 1050 1055 Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys 1060 1065 1070 Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe 1075 1080 1085 Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr 1090 1095 1100 Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro 1105 1110 1115 1120 Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser 1125 1130 1135 Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn 1140 1145 1150 Ala Pro Cys Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu 1155 1160 1165 Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu 1170 1175 1180 Ile Asp Cys Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser 1185 1190 1195 1200 Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala 1205 1210 1215 Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys 1235 1240 1245 Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu 1250 1255 1260 Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg 1265 1270 1275 1280 Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys 1285 1290 1295 Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr 1300 1305 1310 Asn Asp <210> 17 <211> 6816 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgcggggttc tcatcatcat 120 catcatcatg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtcggga tctgtacgac 180 gatgacgata aggatcgatg gggatccgag ctcgagccga tcaccatcaa caacttccgt 240 tactctgacc cggttaacaa cgacaccatc atcatgatgg aaccgccgta ctgcaaaggt 300 ctggacatct actacaaagc gttcaaaatc accgaccgta tctggatcgt tccggaacgt 360 tacgaattcg gtaccaaacc ggaagacttc aacccgccgt cttctctgat cgaaggtgcg 420 tctgaatact acgacccgaa ctacctgcgt accgactctg acaaagaccg tttcctgcag 480 accatggtta aactgttcaa ccgtatcaaa aacaacgttg cgggtgaagc gctgctggac 540 aaaatcatca acgcgatccc gtacctgggt aactcttact ctctgctgga caaattcgac 600 accaactcta actctgtttc tttcaacctg ctggaacagg acccgtctgg tgcgaccacc 660 aaatctgcga tgctgaccaa cctgatcatc ttcggtccgg gtccggttct gaacaaaaac 720 gaagttcgtg gtatcgttct gcgtgttgac aacaaaaact acttcccgtg ccgtgacggt 780 ttcggttcta tcatgcagat ggcgttctgc ccggaatacg ttccgacctt cgacaacgtt 840 atcgaaaaca tcacctctct gaccatcggt aaatctaaat acttccagga cccggcgctg 900 ctgctgatgc acgaactgat ccacgttctg cacggtctgt acggtatgca ggtttcttct 960 cacgaaatca tcccgtctaa acaggaaatc tacatgcagc acacctaccc gatctctgcg 1020 gaagaactgt tcaccttcgg tggtcaggac gcgaacctga tctctatcga catcaaaaac 1080 gacctgtacg aaaaaaccct gaacgactac aaagcgatcg cgaacaaact gtctcaggtt 1140 acctcttgca acgacccgaa catcgacatc gactcttaca aacagatcta ccagcagaaa 1200 taccagttcg acaaagactc taacggtcag tacatcgtta acgaagacaa attccagatc 1260 ctgtacaact ctatcatgta cggtttcacc gaaatcgaac tgggtaaaaa attcaacatc 1320 aaaacccgtc tgtcttactt ctctatgaac cacgacccgg ttaaaatccc gaacctgctg 1380 gacgacacca tctacaacga caccgaaggt ttcaacatcg aatctaaaga cctgaaatct 1440 gaatacaaag gtcagaacat gcgtgttaac accaacgcgt tccgtaacgt tgacggttct 1500 ggtctggttt ctaaactgat cggtctgtgc aaaaaaatca tcccgccgac caacatccgt 1560 gaaaacctgt acaaccgtac cgcgtctctg accgacctgg gtggtgaact gtgcatcaaa 1620 atcaaaaacg aagacctgac cttcatcgcg gaaaaaaact ctttctctga agaaccgttc 1680 caggacgaaa tcgtttctta caacaccaaa aacaaaccgc tgaacttcaa ctactctctg 1740 gacaaaatca tcgttgacta caacctgcag tctaaaatca ccctgccgaa cgaccgtacc 1800 accccggtta ccaaaggtat cccgtacgcg ccggaataca aatctaacgc ggcgtctacc 1860 atcgaaatcc acaacatcga cgacaacacc atctaccagt acctgtacgc gcagaaatct 1920 ccgaccaccc tgcagcgtat caccatgacc aactctgttg acgacgcgct gatcaactct 1980 accaaaatct actcttactt cccgtctgtt atctgcaaag ttaaccaggg tgcgcagggt 2040 atcctgttcc tgcagtgggt tcgtgacatc atcgacgact tcaccaacga atcttctcag 2100 aaaaccacca tcgacaaaat ctctgacgtt tctaccatcg ttccgtacat cggtccggcg 2160 ctgaacatcg ttaaacaggg ttacgaaggt aacttcatcg gtgcgctgga aaccaccggt 2220 gttgttctgc tgctggaata catcccggaa atcaccctgc cggttatcgc ggcgctgtct 2280 atcgcggaat cttctaccca gaaagaaaaa atcatcaaaa ccatcgacaa cttcctggaa 2340 aaacgttacg aaaaatggat cgaagtttac aaactggtta aagcgaaatg gctgggtacc 2400 gttaacaccc agttccagaa acgttcttac cagatgtacc gttctctgga ataccaggtt 2460 gacgcgatca aaaaaatcat cgactacgaa tacaaaatct actctggtcc ggacaaagaa 2520 cagatcgcgg acgaaatcaa caacctgaaa aacaaactgg aagaaaaagc gaacaaagcg 2580 atgatcaaca tcaacatctt catgcgtgaa tcttctcgtt ctttcctggt taaccagatg 2640 atcaacgaag cgaaaaaaca gctgctggaa ttcgacaccc agtctaaaaa catcctgatg 2700 cagtacatca aagcgaactc taaattcatc ggtatcaccg aactgaaaaa actggaatct 2760 aaaatcaaca aagttttctc taccccgatc ccgttctctt actctaaaaa cctggactgc 2820 tgggttgaca acgaagaaga catcgacgtt atcctgaaaa aatctaccat cctgaacctg 2880 gacatcaaca acgacatcat ctctgacatc tctggtttca actcttctgt tatcacctac 2940 ccggacgcgc agctggttcc gggtatcaac ggtaaagcga tccacctggt taacaacgaa 3000 tcttctgaag ttatcgttca caaagcgatg gacatcgaat acaacgacat gttcaacaac 3060 ttcaccgttt ctttctggct gcgtgttccg aaagtttctg cgtgccacct ggaacagtac 3120 ggtaccaacg aatactctat catctcttct atgaaaaaac actctctgtc tatcggttct 3180 ggttggtctg tttctctgaa aggtaacaac ctgatctgga ccctgaaaga ctctgcgggt 3240 gaagttcgtc agatcacctt ccgtgacctg ccggacaaat tcaacgcgta cctggcgaac 3300 aaatgggttt tcatcaccat caccaacgac cgtctgtgct ctgcgaacct gtacatcaac 3360 ggtgttctga tgggttctgc ggaaatcacc ggtctgggtg cgatccgtga agacaacaac 3420 atcaccctga aactggaccg ttgcaacaac aacaaccagt acgtttctat cgacaaattc 3480 cgtatcttct gcaaagcgct gaacccgaaa gaaatcgaaa aactgtacac ctcttacctg 3540 tctatcacct tcctgcgtga cttctggggt aacccgctgc gttacgacac cgaatactac 3600 ctgatcccgg ttgcgtcttc ttctaaagac gttcagctga aaaacatcac cgactacatg 3660 tacctgacca acgcgccgtg ctacaccaac ggtaaactga acatctacta ccgtcgtctg 3720 tacaacggtc tgaaattcat catcaaacgt tacaccccga acaacgaaat cgactgcttc 3780 gttaaatctg gtgacttcat caaactgtac gtttcttaca acaacaacga acacatcgtt 3840 ggttacccga aagacggtaa cgcgttcaac aacctggacc gtatcctgcg tgttggttac 3900 aacgcgccgg gtatcccgct gtacaaaaaa atggaagcgg ttaaactgcg tgacctgaaa 3960 acctactctg ttcagctgaa actgtacgac gacaaaaacg cgtctctggg tctggttggt 4020 acccacaacg gtcagatcgg taacgacccg aaccgtgaca tcctgatcgc gtctaactgg 4080 tacttcaacc acctgaaaga caaaatcctg ggttgcgact ggtacttcgt tccgaccgac 4140 gaaggttgga ccaacgacta aaagcttgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 4200 gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 4260 gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatctggcgt aatagcgaag 4320 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc 4380 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 4440 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 4500 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 4560 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 4620 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 4680 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 4740 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 4800 attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 4860 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 4920 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 4980 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 5040 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 5100 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 5160 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 5220 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 5280 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 5340 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 5400 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 5460 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 5520 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 5580 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 5640 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 5700 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 5760 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 5820 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 5880 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 5940 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6000 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6060 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 6120 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 6180 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 6240 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 6300 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 6360 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 6420 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 6480 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 6540 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 6600 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 6660 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 6720 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 6780 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcag 6816

Claims (36)

  1. 서열번호 1과 비교하여 하나 이상의 표면 세린에서 시스테인으로의 아미노산 치환을 포함하는 파상풍 신경독소(TeNT) 또는 이의 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 치환된 세린은 서열번호 1과 비교하여 S81C, S120C, S144C, S248C, S335C, S428C, S600C, S963C, S1041C, S1155C, 및 S1187C 중 하나 이상을 포함하는 TeNT.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 치환된 시스테인은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 TeNT.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 PEG는 약 2 kDa, 5 kDa, 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa인 TeNT.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    상기 PEG는 선형 또는 분지형인 TeNT.
  6. 서열번호 1과 비교하여: R1225K; R1225E; W1288A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; 또는 R1225del 및 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함하는 TeNT 또는 이의 단편으로서,
    상기 TeNT 또는 단편은 불활성인 TeNT 또는 이의 단편.
  7. (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT;를 포함하는 조성물로서,
    상기 제1 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제1 PEG-TeNT는 청구항 3 내지 5 중 어느 한 항의 TeNT를 포함하는 조성물.
  9. 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
    상기 제2 TeNT는 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 TeNT인 조성물.
  10. (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 및 제2 TeNT;를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근긴장저하(hypotonia)의 치료 방법.
  11. 제2 TeNT가 투여된 대상체에서 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)의 용도.
  12. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT)가 투여된 대상체에서 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제2 TeNT의 용도.
  13. 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (i) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는 제1 PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT); 및 (ii) 제2 TeNT의 용도.
  14. 청구항 7 내지 9 중 어느 한 항, 청구항 10, 또는 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG화된 TeNT 경쇄(LC), PEG화된 TeNT 중쇄(HC), 또는 PEG화된 TeNT 단편 c(c)를 포함하는 조성물, 방법, 또는 용도.
  15. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 PEG-TeNT 또는 제2 TeNT는 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT-HC이거나, 또는 PEG화된 LC 및 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT-LC-c인 조성물, 방법 또는 용도.
  16. 청구항 7 내지 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 PEG-TeNT는 PEG-TeNT-HC이고, 상기 제2 TeNT는 PEG-TeNT-LC-c인 조성물, 방법 또는 용도.
  17. 청구항 7 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 TeNT는 불활성화된 TeNT를 포함하는 조성물, 방법 또는 용도.
  18. 청구항 17에 있어서,
    서열번호 1과 비교하여, 상기 불활성화된 TeNT는: R1225K; R1225E; W1228A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; 또는 R1225del 및 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물, 방법 또는 용도.
  19. 청구항 9 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
    효능이 감소할 때까지 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후
    효능이 감소할 때까지 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c를 포함하는 조성물; 이후
    PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)가 대상체에게 투여되는 방법 또는 용도.
  20. 청구항 9 내지 19 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 근긴장저하는 폐쇄성 수면 무호흡증인 방법 또는 용도.
  21. 청구항 7 또는 14 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 치료학적 조성물인 조성물.
  22. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 파상풍 신경독소(TeNT)를 포함하는, PEG화된 파상풍 신경독소(PEG-TeNT).
  23. 청구항 22에 있어서,
    TeNT 경쇄(LC)가 PEG화되거나, TeNT 중쇄(HC)가 PEG화되거나, 또는 TeNT 단편 c(c)가 PEG화되는 PEG-TeNT.
  24. 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서,
    LC가 PEG화되고 HC가 PEG화(PEG-TeNT-LC-HC)되거나, 또는 LC가 PEG화되고 c가 PEG화(PEG-TeNT-LC-c)되는 PEG-TeNT.
  25. 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG는 라이신 잔기에 접합되는 PEG-TeNT.
  26. 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG는 시스테인 잔기에 접합되고, 선택적으로 시스테인 잔기는 서열번호 1과 비교하여 표면 세린이 시스테인으로 치환된 것인 PEG-TeNT.
  27. 청구항 22 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG는 약 5 kDa, 약 10 kDa 또는 약 20 kDa의 분자량을 갖는 PEG-TeNT.
  28. 청구항 22 내지 27 중 어느 한 항의 PEG-TeNT를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근긴장저하의 치료 방법으로서,
    상기 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 방법.
  29. 근긴장저하를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 청구항 22 내지 27 중 어느 한 항의 PEG-TeNT의 용도로서,
    상기 PEG-TeNT는 제2 TeNT에 접합되지 않은 용도.
  30. 청구항 28 또는 청구항 29에 있어서,
    PEG화된 HC를 포함하는 제1 PEG-TeNT(PEG-TeNT-HC) 및 PEG화된 LC 및 PEG화된 c를 포함하는 제2 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-c)가 대상체에게 투여되는 방법 또는 용도.
  31. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 및/또는
    PEG화된 HC를 포함하는 제1 PEG-TeNT(PEG-TeNT-HC) 및 PEG화된 LC-c를 포함하는 제2 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-c); 및/또는
    PEG화된 HC 및 PEG화된 LC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)가 대상체에게 투여되는 방법 또는 용도.
  32. 청구항 28 내지 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는:
    효능이 감소할 때까지 PEG화된 c를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-c); 이후
    효능이 감소할 때까지 PEG-TeNT-HC 및 PEG-TeNT-LC-c; 이후
    PEG화된 LC 및 PEG화된 HC를 포함하는 PEG-TeNT(PEG-TeNT-LC-HC)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법 또는 용도.
  33. 청구항 28 내지 32 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 불활성화된 TeNT를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법 또는 용도.
  34. 청구항 33에 있어서,
    서열번호 1과 비교하여, 상기 불활성화된 TeNT는: R1225K; R1225E; W1288A; W1288Y; W1288F; W1288L; R1225K 및 W1288A; R1225E 및 W1288A; R1225K 및 W1288Y; R1225E 및 W1288Y; R1225K 및 W1288F; R1225E 및 W1288F; R1225K 및 W1288L; R1225E 및 W1288L; R1225del; W1288del; 또는 R1225del 및 W1288del; E270A; Y374A; E270A 및 Y374; G270del; Y374del; 또는 이들의 조합을 포함하는 방법 또는 용도.
  35. 청구항 28 내지 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 근긴장저하는 폐쇄성 수면 무호흡증인 방법 또는 용도.
  36. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 TeNT, 청구항 7, 14 내지 18 또는 21 중 어느 한 항의 조성물, 또는 청구항 22 내지 27 중 어느 한 항의 PEG-TeNT를 포함하는 키트.
KR1020217006098A 2018-07-31 2019-07-30 Peg화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료 KR20210040407A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2018902779A AU2018902779A0 (en) 2018-07-31 Composition and method
AU2018902779 2018-07-31
PCT/AU2019/050793 WO2020024002A1 (en) 2018-07-31 2019-07-30 Pegylated tetanus neurotoxins and treatment of hypotonia

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210040407A true KR20210040407A (ko) 2021-04-13

Family

ID=69230503

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217006098A KR20210040407A (ko) 2018-07-31 2019-07-30 Peg화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210353724A1 (ko)
EP (2) EP4134133A1 (ko)
JP (2) JP2021533201A (ko)
KR (1) KR20210040407A (ko)
CN (1) CN112638937A (ko)
AU (1) AU2019315327B2 (ko)
BR (1) BR112021001520A2 (ko)
CA (2) CA3167665A1 (ko)
MX (1) MX2021001181A (ko)
NZ (1) NZ772266A (ko)
SG (1) SG11202100646SA (ko)
WO (1) WO2020024002A1 (ko)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9914861D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Imperial College Tetanus toxin polypeptides
CA2413301A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Ira Sanders Methods for using tetanus toxin for benificial purposes in animals (mammals)
AU2002320127A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 Surromed, Inc. Covalent coupling of botulinum toxin with polyethylene glycol
JP2005538954A (ja) * 2002-05-31 2005-12-22 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 分子の経上皮輸送用組成物及び方法
WO2008024879A1 (en) * 2006-08-25 2008-02-28 University Of Maryland, Baltimore Use of tetanus toxin to amplify inadequate voluntary muscle contraction or to improve muscle tone in an animal actively vaccinated against the toxin and a regimen for treatment
DK2547364T3 (en) * 2010-03-15 2017-02-27 Academisch Ziekenhuis Leiden Peptides, conjugates and methods for increasing the immunogenicity of a vaccine
WO2016001762A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Spherium Biomed S.L. Methods of increasing muscle mass using non-toxic tetanus toxin c fragment (ttc)
US11491239B2 (en) * 2017-12-15 2022-11-08 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Modified clostridial neurotoxins as vaccines and conjugate vaccine platforms

Also Published As

Publication number Publication date
EP3830110A1 (en) 2021-06-09
CA3108079A1 (en) 2020-02-06
EP3830110A4 (en) 2022-03-02
CA3108079C (en) 2023-10-10
JP2024014975A (ja) 2024-02-01
SG11202100646SA (en) 2021-02-25
WO2020024002A1 (en) 2020-02-06
NZ772266A (en) 2022-09-30
CN112638937A (zh) 2021-04-09
US20210353724A1 (en) 2021-11-18
EP4134133A1 (en) 2023-02-15
CA3167665A1 (en) 2020-02-06
JP2021533201A (ja) 2021-12-02
AU2019315327A1 (en) 2021-02-11
BR112021001520A2 (pt) 2021-04-20
MX2021001181A (es) 2021-04-19
AU2019315327B2 (en) 2024-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102550926B1 (ko) 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도
CN111269925B (zh) 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用
KR20190101410A (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
KR20210154176A (ko) 표적화된 생체내 후성유전학적 억제에 의한 장기지속성 진통
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN113980991B (zh) 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用
CN112342231A (zh) 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法
CN111304141B (zh) 产n-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN112877362A (zh) 构建高繁殖力、抗蓝耳病和系列腹泻病的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN109022487A (zh) 一种表达p65的基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物
KR20210040407A (ko) Peg화된 파상풍 신경독소 및 근긴장저하의 치료
KR20220058461A (ko) 모노머형 스트렙타비딘을 발현하는 균주 및 비오틴화된 화합물을 포함하는 암 세포 표적용 조성물
CN114292867B (zh) 芽孢杆菌表达载体及其构建方法和应用
CN114990157A (zh) 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
KR20240032025A (ko) 내이의 세포 유형-특이적 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
CN112725344B (zh) 密码子优化的smn1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物
KR20220142502A (ko) 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도
CN112522313B (zh) 用于构建TPH2基因突变的抑郁症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统
CN114686521A (zh) 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用
KR20220058460A (ko) 모노머형 스트렙타비딘을 발현하기 위한 컨스트럭트
CN114958758B (zh) 一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
KR20220104626A (ko) 예비표적화 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 생체 내 미생물 추적 플랫폼
CN114891776B (zh) 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法
CN112575033B (zh) Crispr系统及其在构建scn1a基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用
CN111500629B (zh) 一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination