JP2024014975A - Ｐｅｇ化破傷風神経毒素および筋緊張低下の治療 - Google Patents

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Abstract

Figure 2024014975000001
【課題】本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合された破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）および第二ＴｅＮＴを含む組成物に関する。本発明は、様々なＰＥＧ－ＴｅＮＴにも関する。本発明は、組成物または様々なＰＥＧ－ＴｅＮＴを使用する筋緊張低下の治療方法、および組成物または様々なＰＥＧ－ＴｅＮＴを含むキットにも関する。１つの実施形態では、筋緊張低下は、閉塞型睡眠時無呼吸である。
【解決手段】本発明者らは、これらの問題に対処するために、修飾ＴｅＮＴのファミリーおよび治療レジメンを作り出した。
【選択図】図１

Description

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）および第二ＴｅＮＴを含む組成物に関する。本発明は、前記組成物を使用する筋緊張低下の治療方法にも関する。
破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）は、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｉ）により産生される。ＴｅＮＴは脊髄において作用し、抑制性神経伝達物質であるγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびグリシンの脊髄抑制性介在ニューロンにおける放出を遮断する。そのように、ＴｅＮＴは、痙性麻痺を引き起こす。ＴｅＮＴは、複数の血清型では発生しない。
ＴｅＮＴ、あるいは少なくともＴｅＮＴフラグメントの、生物学的特性を治療に利用することが提案されている。しかしながら、タンパク質治療薬を用いた長期治療は、標的とされる免疫反応をもたらす傾向にある。ＴｅＮＴの血清型は1つしか知られていないため、ＴｅＮＴをベースとする治療において、免疫を回避するために血清型を切り替えることは選択肢にはない。さらに、多くの人々はＴｅＮＴに対してワクチン接種をしているため、ＴｅＮＴをベースとする治療は妨げられる。
特許文献１では、不適当な筋収縮の疾患治療のため、ＰＥＧ化ボツリヌス毒素の使用が開示されている。特許文献１は、不適当な筋収縮、例えば、転移性（migration）頭痛または斜視の疾患治療にＰＥＧ化ＴｅＮＴを使用することも示唆している。しかしながら、上記のように、ＴｅＮＴは筋収縮を引き起こすため、ＰＥＧ化されているかいないかに関わらず、不適当な筋収縮の疾患治療のためのその使用は妨げられる。
非特許文献１は、ＰＥＧ化タンパク質の投与から得られた抗ＰＥＧ免疫応答に対するＰＥＧ化の効果を開示しているが、その知見をいかなる治療のためにも利用していない。
特許文献２は、筋肉量を増加するためのＰＥＧ化ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）の使用を開示している。ＴｅＮＴがパパインによって酵素切断される場合に、フラグメントｃ（５０ｋＤａ）は生成され、ＴｅＮＴ重鎖のＣ末端における４５１アミノ酸に相当する。フラグメントｃは、消化されていないＴｅＮＴの結合、内部移行および経シナプス輸送能力を保持するが、いかなる神経細胞のプロセスも破壊せず、したがって、無毒である。
破傷風トキソイド免疫性を与えられた対象における既存の抗ＴｅＮＴ免疫応答を回避する、ＴｅＮＴをベースとする治療のためのニーズが存在する。
本明細書において従来技術出版物を参照する場合、かかる参照は、出版物がオーストラリアまたはいずれもの他国の当技術分野における常識の一部を形成すると認めることにはならない。
米国特許出願公開第２００２／０１９７２７８（Ａ１）号 国際公開第２０１６／００１７６２（Ａ１）号
Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１７）５２：１８３－１９１
本発明者らは、タンパク質治療薬を投与すると、適応免疫系が抗体反応を起こし、タンパク質治療薬の効果を低下させるため、ＴｅＮＴの利用が十分に実現されていないことを理解している。ＴｅＮＴに対して免疫を持つ多くの集団によって実証されるように、ワクチン接種の結果として、適応免疫応答は意図的であってよい。あるいは、適応免疫応答は意図されておらず、タンパク質治療薬に対する反復暴露に起因してもよい。
本発明者らは、これらの問題に対処するために、修飾ＴｅＮＴのファミリーおよび治療レジメンを作り出した。詳細には、本発明は、各々が免疫系を回避するＰＥＧ化ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）のファミリー、および以前に投与されたＰＥＧ－ＴｅＮＴの有効性が低下する場合や、患者の免疫プロファイルが別のＰＥＧ－ＴｅＮＴの使用を妨げる場合に、異なる代替のＰＥＧ－ＴｅＮＴを治療のために使用する段階的な治療レジメンを提供する。
第一態様は、配列番号１に対して、１つ以上の表面セリンからシステインへのアミノ酸置換を含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）またはそのフラグメントを提供する。
第一態様の１つの実施形態では、置換システインは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している。
第二態様は、ＴｅＮＴまたはそのフラグメントであって、配列番号１に対して、Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２８８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；もしくはＲ１２２５ｄｅｌおよびＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含み、ＴｅＮＴまたはそのフラグメントが不活性である、ＴｅＮＴまたはそのフラグメントを提供する。
第三態様は、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴに結合していない第二ＴｅＮＴを含む、組成物を提供する。
第四態様は、筋緊張低下の治療方法であって、該方法は、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴを、対象に投与することを含む、方法を提供する。
第四態様は、第二ＴｅＮＴを投与される対象における筋緊張低下治療のための医薬製剤における、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）の使用も提供する。
第四態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ
）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）を投与される対象における筋緊張低下治療のための医薬製剤における、第二破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）の使用も提供する。
第四態様は、筋緊張低下治療のための医薬製剤における、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴの使用も提供する。
第四態様は、第二ＴｅＮＴを投与された対象における筋緊張低下の治療方法において使用するための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）も提供する。
第四態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）を投与される対象における、筋緊張低下の治療方法において使用するための第二破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）の使用も提供する。
第四態様は、筋緊張低下の治療方法における使用のための、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴも提供する。
第四態様の実施形態では、組成物は、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴおよび第二ＴｅＮＴを含んでよい。
第四態様は、筋緊張低下の治療方法における使用のための、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴを含む組成物も提供する。
１つの実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）およびＰＥＧ化ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、またはＰＥＧ化ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）を含む。１つの実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含む。
別の実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣである。この実施形態では、ＬＣは、ＰＥＧ化されていない。別の実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃである。この実施形態では、ＨＮは、ＰＥＧ化されていない。
更なる実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣであり、第二ＴｅＮＴはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃである。
１つの実施形態では、第二ＴｅＮＴは、不活性化されたＴｅＮＴを含む。配列番号１に対して、不活性化されたＴｅＮＴは：Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２８８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌもしくはＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４Ａ；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含んでよい。１つの実施形態では、第二ＴｅＮＴは、Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａを含む不活性化されたＴｅＮＴを含む。
１つの実施形態では、対象に、効能が低下するまで、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を投与し；次いで、効能が低下するまで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物を投与し；次いで、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を投与する。
１つの実施形態では、治療は、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し、；次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物を対象に投与し、；次いで、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を対象に投与して、対象の抗ＴｅＮＴ抗体の免疫プロファイルを決定し、このプロファイルに基づいてＰＥＧ－ＴｅＮＴの有効組成物を決定することを含む。
１つの実施形態では、筋緊張低下は、閉塞型睡眠時無呼吸である。
別の実施形態では、組成物は、治療用組成物である。別の実施形態では、組成物は、美容用組成物である。
ＴｅＮＴ ＬＣおよびＴｅＮＴ ＨＮ（ＬＣ－ＨＮ）から成るタンパク質の製造方法であって、該方法は、配列番号６を含むアミノ酸をコードする核酸分子を宿主細胞内で発現することを含む、方法も開示する。
第五態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）を提供する。
１つの実施形態では、ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）がＰＥＧ化されている、ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）がＰＥＧ化されている、またはＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）がＰＥＧ化されている。１つの実施形態では、ＬＣはＰＥＧ化されており、かつ、ＨＣはＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）か、または、ＬＣはＰＥＧ化されており、かつ、ｃはＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）。
別の実施形態では、ＰＥＧは、ＴｅＮＴのリジン残基と結合している。別の実施形態では、ＰＥＧは、ＴｅＮＴのシステイン残基と結合している。１つの実施形態では、ＰＥＧはＴｅＮＴのシステイン残基と結合しており、該システイン残基は配列番号１に対して天然またはセリン残基に対する置換のいずれかである。
１つの実施形態では、ＰＥＧは、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。
第六態様は、筋緊張低下の治療方法であって、該方法は、第五態様のＰＥＧ－ＴｅＮＴを対象に投与することを含み、ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴと結合していない、方法を提供する。
第六態様は、筋緊張低下治療のための医薬製剤における第五態様のＰＥＧ－ＴｅＮＴの使用であって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴと結合していない、使用も提供する。
あるいは、第六態様は、筋緊張低下の治療方法における使用のための第五態様のＰＥＧ－ＴｅＮＴであって、該方法は、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを対象に投与することを含み、ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴと結合していない、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを提供する。
１つの実施形態では、対象に、ＰＥＧ化ＨＣを含む第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）ならびにＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ｃを含む第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を投与する。
別の実施形態では、対象に、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；ならびに／またはＰＥＧ化ＨＣを含む第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）およびＰＥＧ化ｃを含む第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）；ならびに／またはＰＥＧ化ＨＣおよびＰＥＧ化ＬＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を投与する。
１つの実施形態では、治療は、効能が低下するまで、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を、対象に投与することを含む。その後、治療は、効能が低下するまで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを、対象に投与することを含んでよい。その後、治療は、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を、対象に投与することを含んでよい。
１つの実施形態では、治療は、効能が低下するまで、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを対象に投与し；次いで、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を、対象に投与することを含む。
１つの実施形態では、治療は、効能が低下するまで、約５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、約１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を、対象に投与することを含む。その後、治療は、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを、対象に投与することを含んでよい。その後、治療は、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を対象に投与し；次いで、効能が低下するまで、これらのいずれかまたは両方が２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含むＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を、対象に投与することを含んでよい。
１つの実施形態では、治療は、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物を対象に投与し；次いで、ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥ
Ｇ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）を対象に投与して、対象の抗ＴｅＮＴ抗体の免疫プロファイルを決定し、このプロファイルに基づいてＰＥＧ－ＴｅＮＴの有効組成物を決定することを含む。
別の実施形態では、ＴｅＮＴを用いた治療は、不活性化されたＴｅＮＴを投与することを更に含む。配列番号１に対して、不活性化されたＴｅＮＴは：Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２２８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌもしくはＷ１２８８ｄｅｌを含んでよい。１つの実施形態では、第二ＴｅＮＴは、Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４Ａ；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含む。
１つの実施形態では、筋緊張低下は、閉塞型睡眠時無呼吸である。
第七態様は、第一態様のＴｅＮＴ、第二態様の組成物または第五態様のＰＥＧ－ＴｅＮＴを含むキットを提供する。
１つの実施形態では、それぞれ、第三または第六態様の方法に従って、組成物またはＰＥＧ－ＴｅＮＴを使用する。
図１は本発明の実施例ＰＥＧ－ＴｅＮＴの略図である。図１Ａは ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、図１Ｂは ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、図１Ｃは ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ、図１Ｄは ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを示し、ＴｅＮＴは完全であり活性である、すなわち、ＴｅＮＴは両方の鎖を含み、ＰＥＧ化は特定の領域、すなわち、それぞれ、ｃ、ＨＣ、ＬＣ－ｃ、またはＬＣ－ＨＣに存在する。 図２は、１３１４アミノ酸を含む成熟ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１）である。 図３は、ＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴの核酸配列（配列番号２）である。 図４は、ＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。ＴｅＮＴは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図５は、配列番号１のアミノ酸４５７～１３１４を含むＨＣのアミノ酸配列（配列番号３）である。 図６は、配列番号１のアミノ酸８６４～１３１４を含むｃのアミノ酸配列（配列番号４）である。 図７は、ｃをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ｃの核酸配列（配列番号５）である。 図８は、ｃをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ｃのマップである。ｃは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図９は、配列番号１のアミノ酸１～８６３を含むＬＣ－ＨＮのアミノ酸配列（配列番号６）である。 図１０は、ＬＣ－ＨＮをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮの核酸配列（配列番号７）である。 図１１は、ＬＣ－ＨＮをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮのマップである。ＬＣ－ＨＮは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図１２は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む非機能性のｃのアミノ酸配列（配列番号８）である。 図１３は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む図１２（配列番号８）の非機能性のｃをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ｃの核酸配列（配列番号９）である。 図１４は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む図１２（配列番号８）の非機能性のｃをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ｃのマップである。配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む、ｃは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図１５は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む非機能性のＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１０）である。 図１６は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む図１５（配列番号１０）の非機能性のＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴの核酸配列（配列番号１１）である。 図１７は、配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む図１５（配列番号１０）の非機能性のＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。配列番号１に対し、アミノ酸置換Ｗ１２８８ＡおよびＲ１２２５Ｅを含む、ＴｅＮＴは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図１８は、配列番号１に対し、表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含む成熟１３１４アミノ酸ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１２）である。 図１９は、図１８（配列番号１２）の表面セリンからシステインへ置換された成熟ＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴの核酸配列（配列番号１３）である。 図２０は、図１８（配列番号１２）の表面セリンからシステインへ置換された成熟ＴｅＮＴをコードする図１９（配列番号１３）のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。表面セリンからシステインへ置換されたＴｅＮＴは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図２１は、ＬＣおよびｃ領域において、配列番号１に対し、表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含む成熟１３１４アミノ酸ＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１４）である。 図２２は、図２１（配列番号１４）の表面セリンからシステインへ置換された成熟ＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴの核酸配列（配列番号１５）である。 図２３は、図２１（配列番号１４）の表面セリンからシステインへ置換された成熟ＴｅＮＴをコードする図２２（配列番号１５）のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。表面セリンからシステインへ置換されたＴｅＮＴは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図２４は、配列番号１に対し、ＨＣ表面セリンからシステインへのアミノ酸置換Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴのアミノ酸配列（配列番号１６）である。 図２５は、図２４（配列番号１６）の表面セリンからシステインへ置換された成熟ＴｅＮＴをコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴの核酸配列（配列番号１７）である。 図２６は、図２４（配列番号１６）の表面セリンからシステインへ置換されたＴｅＮＴをコードする図２５（配列番号１７）のベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴのマップである。表面セリンからシステインへ置換されたＴｅＮＴは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと共に発現される。核酸は、ｐＲＳＥＴ－ＡベクターのＭＣＳ内に挿入され、Ｔ７プロモーターの制御下発現される。 図２７は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏを使用するモデルに、ｄａ Ｓｉｌｖａ Ａｎｔｕｎｅｓら（２０１７）およびＰａｌｅｒｍｏら（２０１７）により同定された主要ヒト抗体クローン型によって認められたタンパク質データバンク（受託ＩＤ ＰＤＢ：５Ｎ０Ｂ）マッピングエピトープに寄託された結晶構造解析データから誘導されたＴｅＮＴの三次元タンパク質構造モデルである。同定されたエピトープ中または周囲の表面セリン残基を、その後のＰＥＧ化のためのシステインへの変異のために選択した。 図２８は、分子量が増加したＰＥＧを含み、（Ａ）クーマシーブルーおよび（Ｂ）ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体を使用するウエスタンブロットによって検出されたＰＥＧ－ＴｅＮＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の２枚の写真である。（Ｂ）は、免疫原性がＰＥＧ分子量に比例することを示している。左端がｋＤａで表した分子量マーカー １列目、ＴｅＮＴ ２列目、２ｋＤａ ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ－ＬＣ ３列目、５ｋＤａ ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ４列目、１０ｋＤａ ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ５列目、２０ｋＤａ ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ６列目である。 図２９は、競合ＥＬＩＳＡアッセイを表す４つの折れ線グラフである。それぞれが異なる分子量ＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を含む４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴおよび４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を、ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体を使用してＴｅＮＴに対してアッセイした。（Ａ）ＴｅＮＴをＥＬＩＳＡプレートに吸着し、次いで、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。（Ｂ）各ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着し、次いで、ＴｅＮＴ抗原の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。（Ｃ）ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体をＥＬＩＳＡプレートに吸着し、次いで、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。（Ｄ）各ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着し、次いで、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体抗原の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。 図３０は、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを注射した雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢において後肢局在性筋強縮を示す４枚の写真である。図３０Ａおよび図３０Ｂは、ナイーブマウスにおける後肢局在性筋強縮を示す。図３０Ｃは、破傷風トキソイドをワクチン接種されたマウスにおいて１００ユニットのＴｅＮＴの注射後に後肢筋強縮がないことを示すが、図３０Ｄは、破傷風トキソイドをワクチン接種されたマウスにおいて８０ユニットのＰＥＧ－ＴｅＮＴ ＬＣ－ＨＣ ２０ｋＤａの注射後に後肢筋強縮が持続していることを示す。 図３１は、規定ユニットのＴｅＮＴ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ２０ｋＤａ、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体体、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体 ２ｋＤａ、またはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体 ２０ｋＤａの注射後の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢において示された破傷風臨床レベルを示す２ドットプロットである。図３１Ａ）マウスに、ＴｅＮＴまたはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ２０ｋＤａを注射した。図３１Ｂ）マウスに、ＴｅＮＴ、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体 ２ｋＤａまたはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体 ２０ｋＤａを注射した。１ユニットは、ナイーブマウスにおいて２４時間以内にステージ４の筋強縮を引き起こすのに必要な毒素の最小量である。 図３２は、破傷風トキソイドをワクチン接種されたマウスにおける臨床筋強縮の進行を示す２つの折れ線グラフである。図３２Ａは、不活性化されたＴｅＮＴデコイを有するまたは有しない４０００ユニットのＴｅＮＴを注射後の筋強縮の進行を示す。図３２Ｂは、不活性化されたＴｅＮＴデコイを有するまたは有しない４０ユニットのＴｅＮＴ－ＰＥＧ ２０ｋＤａを注射後の筋強縮の進行を示す。両方の場合に、進行は、デコイの存在によって明らかに促進される。 図３３は、実施例２３に従って治療されたブリティッシュブルドッグの呼吸障害指数（ＲＤＩ）に対する破傷風毒素の投与量増加の効果を示す箱ひげ図である。黒色棒は、破傷風毒素の各投与量における６試験のＲＤＩのメジアンを表す。網掛けボックスは、四分位範囲を表し、ひげは、各投与量における最小および最大ＲＤＩサンプルを表す。破傷風毒素の増加は、プラセボ投与後のＲＤＩと比較して、１０ＩＵ／ｋｇの投与後のＲＤＩ低下と関連していた（P＝０．０４３；ウィルコクソンの符号順位検定）。加えて、プラセボおよび１０ＩＵ／ｋｇの中央値は、それぞれ、〇および＊で表す。
本発明は、免疫回避ＴｅＮＴおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ分子（図１）、その組成物、およびこれらの治療および美容の使用に関する。１つの実施形態では、本発明は、筋緊張低下の治療、必要に応じて、閉塞型睡眠時無呼吸の治療に関する。
破傷風トキソイドに対する防御免疫応答を有する対象における筋緊張低下を治療するための、特に修飾されたＴｅＮＴならびにＴｅＮＴおよびデコイ（不活性化されたＴｅＮＴ）の組成物の使用を、本明細書に記載する。その目標を達成するために、破傷風免疫患者において筋緊張を増大することができる生物活性化合物を送達するため、活性ＴｅＮＴを、ＰＥＧの添加、特定の変異の導入、またはその組合せによって修飾する。
活性は、修飾された毒素、または製剤の規定単位用量の投与によって実証することができ、同じ単位投与量において、ＴｅＮＴはワクチン接種された対象において活性を示さないだろう。ＴｅＮＴの三次元構造解析に基づいた、ＰＥＧ分子の特異的結合のための特異的表面変異の導入は、ワクチン接種された対象における防御抗体応答により標的化されると知られている特定のＴｅＮＴエピトープのマスキングを可能とした。ＰＥＧ化、部位特異的変異およびデコイ分子製剤の組合せは、ＴｅＮＴの同等の単位の投与と比較して、ワクチン接種された哺乳類モデルにおける筋緊張の増大に対する当該分子の効果をかなり高めた。
特許文献１は、不適当な筋収縮の障害の治療のための一連のＰＥＧ化ボツリヌス毒素を開示し、ＴｅＮＴをボツリヌス毒素の代替物として使用することができることを示唆した。しかしながら、ＴｅＮＴを使用して、筋収縮を治療することはできない。さらに、特許文献１の申請された発明は、開示された方法がエピトープの部位特異的マスキングを含まないので、有効であるように思われず、本発明者らの知る限りでは、ＴｅＮＴエピトープの計画的マスキングに必要なエピトープの三次元構造および同定は特許文献１の優先日において利用可能でなかった。
Ｗａｎらは、ＰＥＧ化タンパク質の投与から得られた抗ＰＥＧ免疫応答に対するＰＥＧ化の効果を対象とするが、いずれの治療のための知見も開発していない。Ｗａｎらは、ＰＥＧ化破傷風トキソイドが非ＰＥＧ化破傷風トキソイドに対して免疫原性低下を示したが、Ｗａｎらは、治療上関連のある分子または製剤を提示していない。さらに、破傷風トキソイドは、ＴｅＮＴのホルムアルデヒド架橋により製造され得るワクチン接種のために使用される生物不活性ＴｅＮＴであるので、破傷風トキソイドのＰＥＧ化は、活性ＴｅＮＴの修飾に関連しない。すなわち、破傷風トキソイドは、ＰＥＧ化されていてもされていなくても、活性ＴｅＮＴの酵素、結合および転位活性の組合せを有しない。
特許文献２は、神経伝達物質と結合、ニューロンへ侵入する以上の特定の活性を有しない分子である、ＴｅＮＴ ｃフラグメント単独に関する。
したがって、破傷風トキソイド免疫性を与えられた対象において既存の抗ＴｅＮＴ免疫を回避する、ＴｅＮＴをベースとする治療のためのニーズが存在する。マスクされ、活性であり、治療に適したＰＥＧ化ＴｅＮＴにより部分的に提供される、この問題に対する解決法を本明細書において開示する。
破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）
ＴｅＮＴは、約１５０ｋＤａであり、ｔｅｔＸ遺伝子から発現される。ｔｅｔＸのコード領域に対応するが、開始メチオニンコドンを欠いている、コドン最適化核酸配列は、図３のベクター配列（配列番号２）中に提供されている。ＴｅＮＴは、翻訳後に切断されて－先ず開始メチオニン、次いで２つの部分：未切断タンパク質のＮ末端由来の５０ｋＤａ軽鎖（ＬＣまたはＡ鎖）および未切断タンパク質のＣ末端由来の１００ｋＤａ重鎖（ＨＣまたはＢ鎖）を除去する１つのタンパク質として発現される。２つの鎖は、神経毒性にとって必須である鎖間ジスルフィド結合によって接続されている。成熟ＴｅＮＴの１３１４アミノ酸配列は、図２（配列番号１）に提供されている。
ＬＣは、亜鉛エンドペプチダーゼ活性を有し、膜との小胞融合にとって必要な小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を攻撃し、それにより、神経伝達物質放出を阻止する。
パパインで消化次第、ＨＣを、各々５０ｋＤａである２つのドメイン：ＨＮと呼ばれるＮ末端転位ドメイン；およびフラグメントｃ（ｃ）と呼ばれるＣ末端ガングリオシド（膜）結合ドメインに切断することができる。ｃ欠乏ＴｅＮＴは、本明細書においてはＬＣ－ＨＮと表される。
ｃは、２つのポリシアロガングリオシド結合部位を有し、ニューロン膜上のポリシアロガングリオシド（ＧＤ２ ＧＤ１ｂ、およびＧＴ１ｂ）と結合する。したがって、ｃは、ＴｅＮＴと末梢運動アクソンのシナプス前膜との結合を媒介し、ＴｅＮＴがこの膜を横切ってニューロンへ移動するのを助ける。
アミノ酸配列について：
開始メチオニンを欠いているＴｅＮＴのアミノ酸配列は、図２（配列番号１）に提供されている；
ＨＣのアミノ酸配列は、図５（配列番号３）に提供されている；
ｃのアミノ酸配列は、図６（配列番号４）に提供されている；および
ＬＣ－ＨＮのアミノ酸配列は、図９（配列番号６）に提供されている。
ベクターコード化およびベクターマップのコドン最適化核酸配列について：
ｃの配列は、図７（配列番号５）および図８に提供されている；および
ＬＣ－ＨＮの配列は、図１０（配列番号７）および図１１に提供されている。
本明細書で使用されるとき、「ＴｅＮＴ」は、重鎖および軽鎖から成る完全なＴｅＮＴ分子を表すために使用される。本明細書において、サブドメインおよびフラグメントは、これらの略記により表される：軽鎖「ＬＣ」；重鎖「ＨＣ」；重鎖Ｎ末端ドメイン「ＨＮ」；重鎖フラグメントｃ「ｃ」；軽鎖＋重鎖Ｎ末端ドメイン「ＬＣ－ＨＮ」（すなわち、ｃのないＴｅＮＴ分子）。いずれのサブドメインまたはフラグメントがＰＥＧ化されている場合、接頭語ＰＥＧを使用する：ＰＥＧ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＨＮ；ＰＥＧ－ｃ；ＰＥＧ－ＬＣ－ＨＮ。ＰＥＧ化フラグメントまたはサブドメインを含む完全ＴｅＮＴ分子では、接頭語ＰＥＧを使用してＰＥＧ化サブドメインまたはフラグメントを示す：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ、など。
これらは固有の機能があるため、サブドメインおよびフラグメントは、完全ＴｅＮＴについて互換的でないと理解できるであろう。
本明細書に開示されているＴｅＮＴは活性であっても不活性であってもよい。活性ＴｅＮＴは、天然ＴｅＮＴと同じ生物活性を有する。不活性ＴｅＮＴは、１つ以上の天然ＴｅＮＴ活性を欠く。１つの実施形態では、不活性ＴｅＮＴは、抑制性神経伝達物質の放出を遮断しない。本開示の不活性ＴｅＮＴは、「デコイ」と呼ばれる場合もある。不活性ＴｅＮＴとしては、破傷風トキソイドが挙げられる。１つの実施形態では、不活性ＴｅＮＴは、本明細書に開示されている不活性ＴｅＮＴである。
１つの実施形態では、２つ以上のＴｅＮＴが結合されていてもよい。
別の実施形態では、ＴｅＮＴは結合されていない。本明細書に開示されている組成物、方法および使用の１つの実施形態では、第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴは、第二ＴｅＮＴと結合していない。
本明細書に開示され、図１に図示されている免疫回避ＰＥＧ－ＴｅＮＴとしては：
ＰＥＧ化フラグメントｃを有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）（図１Ａ）；
ＰＥＧ化重鎖を有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）（図１Ｂ）；
ＰＥＧ化軽鎖およびＰＥＧ化フラグメントｃを有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）（図１Ｃ）；ならびに
完全にＰＥＧ化されたＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）（図１Ｄ）
が挙げられる。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃは、ワクチン接種された対象において適応免疫系の既存免疫応答を有利に回避する。１つの実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃは、効果が低下するまで使用される第一段階治療を提供する。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃは、ワクチン接種された対象において適応免疫系の既存免疫応答を有利に回避し、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃへの反復暴露によって誘発される適応免疫系の免疫応答も回避する。
１つの実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃは共に、これらの効果が低下するまで使用される第二段階治療を提供する。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣは、ワクチン接種された対象において適応免疫系の既存免疫応答を有利に回避し、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ＋ＰＥＧ
－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃへの反復暴露によって誘発される適応免疫系の免疫応答も回避する。
１つの実施形態では、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣは、その効果が低下するまで使用される第三段階治療を提供する。
ＰＥＧ化軽鎖を有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ）、ＰＥＧ化ＬＣおよびＨＮを有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ）、ならびにＰＥＧ化ＨＮを有するＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮ）も開示する。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴの特定の組合せおよびこれらのＰＥＧ－ＴｅＮＴの組合せを用いた治療の順序を変更してよいと、当業者は理解できるだろう。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
ＰＥＧは、ＴｅＮＴ中の、例えば、リジン（例えば、アミノ－ＰＥＧ化）、システイン（例えば、チオール－ＰＥＧ化および架橋ＰＥＧ化）、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン（例えば、Ｎ－グリコ－ＰＥＧ化）、グルタミン酸、グルタミン（例えば、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化）、セリン（例えば、Ｏ－グリコ－ＰＥＧ化）、スレオニン（例えば、Ｏ－グリコ－ＰＥＧ化）、またはチロシン残基と結合していてよい。ＰＥＧ化の例としては、Ｎ末端ＰＥＧ化およびＣ末端ＰＥＧ化も挙げられる。
ＰＥＧを水酸基活性である官能基、例えば、無水物、酸塩化物、クロロホルメートおよびカーボネートと反応することによって、ＰＥＧ化を行ってよい。あるいは、アルデヒド、エステル、およびアミドなどの官能基を用いて、ＰＥＧ化を行ってもよい。
ＰＥＧは直鎖でも分岐鎖でもよい。
ＰＥＧは、修飾ＰＥＧ、例えば、ポリ［オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート］（ＰＯＥＧＭＡ）であってよい。
ＰＥＧ化は、部位特異的ＰＥＧ化であってよい。
１つの実施形態では、ＴｅＮＴまたはＴｅＮＴフラグメントの表面セリン残基を、表面システイン残基へ変異導入して免疫原性エピトープにおける特異的ＰＥＧ結合を促進する。これとの関連で、変異は、置換、例えば、セリンからシステインへの置換と同義である。かかる変異、または置換としては、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ；Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；およびＳ１１８７Ｃの１つ以上の任意の組合せが挙げられる。
ヘテロ二官能性ＰＥＧの官能基としては、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、およびＮＨＳエステルが挙げられる。
１つの実施形態では、ＰＥＧは、カルボジイミド－ＥＤＣおよびスルホＮＨＳを使用するカルボキシル－アミン架橋を使用してＴｅＮＴと結合している。
本発明は、ＴｅＮＴの異なるサブドメインまたはフラグメントと結合された異なる分子量のＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴも企図している。
ＰＥＧは、例えば、４℃～２５℃において２～６時間で開示のＴｅＮＴと結合（conjugated）または結合（attached）してよい。１つの実施形態では、ＰＥＧは、室温において６時間でＴｅＮＴと結合した。
効能
本明細書で使用されるとき、「筋緊張低下」は、抑制性神経伝達物質、例えば、ＧＡＢＡまたはグリシン、の阻害により治療され得る不随意筋力低下を伴うあらゆる障害を表す。そうであるから、「筋緊張低下」としては、神経学的駆動力低下または他の原因に続発する筋緊張低下および筋緊張、強度もしくは神経学的駆動力の低下もしくは不十分の病態が挙げられる。したがって、１つの実施形態では、筋緊張低下は、神経性筋緊張低下であり得る。
本開示によるＰＥＧ－ＴｅＮＴ、組成物または方法で治療され得る筋緊張低下疾患としては、閉塞型睡眠時無呼吸、無呼吸、いびき、脊柱側弯症、筋弛緩を原因とする斜視、下垂症、ホルネル症候群、筋萎縮症、神経障害筋肉、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動神経疾患、いずれもの筋疾患、多発性硬化症、パーキンソン病、重症筋無力症、顔面筋緊張、場合によって眼瞼外反、いずれかの骨格筋もしくは平滑筋を原因とする弛緩性麻痺もしくは脱力、人工呼吸後脱力を含むいずれかの原因による呼吸筋力低下、外傷によって誘発された筋力低下または筋弛緩状態を原因とする悪い姿勢、骨盤底筋弛緩状態もしくは筋力低下、または鼻もしくは上気道弛緩症が挙げられる。
本開示によるＰＥＧ－ＴｅＮＴ、組成物または方法で治療され得る他の疾患としては、筋萎縮症、筋ジストロフィー、筋肉量減少、鼻閉、インポテンス、脱毛症、低血圧症、側頭顎関節症候群、斜頸、頸部痛、筋内神経再生、片頭痛、頭痛、アカラシア、肥満症、刺激結腸、肛門裂傷、胃酸の影響を受けた組織または臓器、前立腺肥大、鼻漏、唾液分泌、肺粘膜の刺激、乾癬、免疫寛容、免疫反応が挙げられる。
本開示により治療される疾患が筋緊張低下疾患それ自体でない場合では、本開示のＴｅＮＴを用いた治療による筋緊張増大は、疾患の症状を緩和し得る。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴの美容の応用としては、腹筋強化、胸筋強化、大殿筋強化、骨格筋強化、または筋肉弛緩を原因とする顔面下垂の治療を挙げることができる。
本開示によるＰＥＧ－ＴｅＮＴ、組成物または方法で治療され得る平滑筋、骨格筋、組織または臓器としては、食道上部、食道壁、食道括約筋、下部食道括約筋、肛門括約筋、膀胱、膀胱括約筋、膣括約筋、幽門括約筋、オディ括約筋、回盲部括約筋、骨盤底筋、膣壁筋、前立腺、顎下腺、耳下腺、舌下腺、口腔内粘膜の小唾液腺、声帯ヒダ、顔面筋、咀嚼筋、頭蓋表筋、胸部筋肉、背筋、上肢筋、前腕筋、下肢筋、手筋、足筋、胃壁筋、結腸壁筋、頸筋、咽頭開大筋、咬筋、内側翼突筋、外側翼突筋、オトガイ舌骨筋、頤舌筋、口蓋帆張筋、口蓋帆挙筋、茎突咽頭筋、茎突舌筋、顎舌骨筋、茎突舌骨筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、胸鎖乳突筋、僧帽筋、側頭筋、輪状咽頭筋、子宮筋および子宮頚部、胃神経分布、鼻腔内粘膜、肺粘膜、皮膚、胸腺、骨、冠動脈、肺平滑筋ならびに心筋が挙げられる。
組成物および投与
本開示の組成物は、治療用組成物または美容用組成物であってよい。すなわち、組成物を、治療または美容目的のために使用してよい。
本明細書で使用されるとき、用語「治療用組成物」または「美容用組成物」は、本明細書に記載されている対象における筋緊張低下を抑制または治療するＴｅＮＴを含む組成物を表す。組成物を、対象に投与するために製剤した。１つの実施形態では、組成物は無菌である。１つの実施形態では、組成物は発熱物質を含まない。組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含んでよい。好ましくは、組成物を、優良試験所基準（ＧＬＰ）または医薬品
及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）に従って製造する。
本開示のＴｅＮＴを、１０ｍｇ／ｋｇ以上まで投与してよい。本開示のＴｅＮＴを、約１ｆｇ／ｋｇ、約５ｆｇ／ｋｇ、約１０ｆｇ／ｋｇ、約５０ｆｇ／ｋｇ、約１００ｆｇ／ｋｇ、約５００ｆｇ／ｋｇ、約１ｐｇ／ｋｇ、約５ｐｇ／ｋｇ、約１０ｐｇ／ｋｇ、約５０ｐｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ、約５００ｐｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ、約２ｎｇ／ｋｇ、約３ｎｇ／ｋｇ、約４ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ、約６ｎｇ／ｋｇ、約７ｎｇ／ｋｇ、約８ｎｇ／ｋｇ、約９ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ、約１１ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ、約１３ｎｇ／ｋｇ、約１４ｎｇ／ｋｇ、約１５ｎｇ／ｋｇ、約１６ｎｇ／ｋｇ、約１７ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ、約１９ｎｇ／ｋｇ、約２０ｎｇ／ｋｇ、約３０ｎｇ／ｋｇ、約４０ｎｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇ、約６０ｎｇ／ｋｇ、約７０ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ、約９０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約２００ｎｇ／ｋｇ、約３００ｎｇ／ｋｇ、約４００ｎｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ、約６００ｎｇ／ｋｇ、約７００ｎｇ／ｋｇ、約８００ｎｇ／ｋｇ、約９００ｎｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇで投与してよい。本開示のＴｅＮＴを、上記の投与量のいずれかのいずれかの範囲内で投与してよい。
本開示のＴｅＮＴを、１０００ＩＵ／ｋｇ以上まで投与してよい。本開示のＴｅＮＴを、約０．１ＩＵ／ｋｇ、約０．２ＩＵ／ｋｇ、約０．３ＩＵ／ｋｇ、約０．４ＩＵ／ｋｇ、約０．５ＩＵ／ｋｇ、約０．６ＩＵ／ｋｇ、約０．７ＩＵ／ｋｇ、約０．８ＩＵ／ｋｇ、約０．９ＩＵ／ｋｇ、約１ＩＵ／ｋｇ、約２ＩＵ／ｋｇ、約３ＩＵ／ｋｇ、約４ＩＵ／ｋｇ、約５ＩＵ／ｋｇ、約６ＩＵ／ｋｇ、約７ＩＵ／ｋｇ、約８ＩＵ／ｋｇ、約９ＩＵ／ｋｇ、約１０ＩＵ／ｋｇ、約１１ＩＵ／ｋｇ、約１２ＩＵ／ｋｇ、約１３ＩＵ／ｋｇ、約１４ＩＵ／ｋｇ、約１５ＩＵ／ｋｇ、約１６ＩＵ／ｋｇ、約１７ＩＵ／ｋｇ、約１８ＩＵ／ｋｇ、約１９ＩＵ／ｋｇ、約２０ＩＵ／ｋｇ、約３０ＩＵ／ｋｇ、約４０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約６０ＩＵ／ｋｇ、約７０ＩＵ／ｋｇ、約８０ＩＵ／ｋｇ、約９０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、約５００ＩＵ／ｋｇ、約６００ＩＵ／ｋｇ、約７００ＩＵ／ｋｇ、約８００ＩＵ／ｋｇ、約９００ＩＵ／ｋｇ、約１０００ＩＵ／ｋｇで投与してよい。本開示のＴｅＮＴを、上記の投与量のいずれかのいずれかの範囲内で投与してよい。
２つのＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む組成物、例えば、ＴｅＮＴ－ＨＣがＰＥＧ化（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）されている第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴならびにＴｅＮＴ－ＬＣおよびＴｅＮＴ－ｃがＰＥＧ化（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）されている第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む組成物では、第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対する第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴの比は変動してよい。例えば、第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対する第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴの比は、約１０００：１、約５００：１、約１００：１、約５０：１、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１；約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：５０、約１：１００、約１：５００、または約１：１０００であってよい。
組成物は、ＴｅＮＴのいずれかの組合せを含んでよく、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃの組合せに限定されない。組成物は：ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ならびにＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含んでよい。ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮ
Ｔ－ＬＣ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ；ならびにＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを含む組成物も開示する。組成物では、いずれかのＴｅＮＴに置換してよく、いずれかの組成物は、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮ、および／またはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＮをさらに含んでよい。
１つの実施形態では、組成物は、例えば、ワクチン接種によりＴｅＮＴへの事前の暴露によって産生された抗ＴｅＮＴ抗体に対するデコイとして作用する不活性化されたＴｅＮＴをさらに含む。不活性化されたＴｅＮＴは、配列番号１に対して、Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２２８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；またはＲ１２２５ｄｅｌおよびＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４Ａ；Ｅ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ、またはこれらの組合せを含んでよい。１つの実施形態では、第二ＴｅＮＴは、Ｒ１２２５Ｅ、Ｗ１２８８Ａ、Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４Ａを含む不活性化されたＴｅＮＴを含む。
少なくとも１つのＰＥＧ－ＴｅＮＴおよびデコイＴｅＮＴを含む組成物では、デコイＴｅＮＴは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対して過剰なモル数になってよい。例えば、ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対するデコイＴｅＮＴの比は、約１０６：１；１０５：１、１０４：１、１０００：１、約５００：１、約４００：１、約３００：１、約２００：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１であってよい。
本開示のＰＥＧ－ＴｅＮＴを、毎週１回、２回もしくは３回、毎月１回、２回もしくは３回、四半期毎に１回、２回もしくは３回、６ヶ月毎に１回、２回もしくは３回、または毎年１回、２回もしくは３回投与してよい。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、単回投与、分割投与、または反復投与で投与してよい。筋肉が対として存在する場合、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、対の筋肉１つへ片側的に、または対の筋肉両方へ両側的に投与してよい。
本開示の２つ以上のＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む組合せの代わりとして、かかる２つ以上のＰＥＧ－ＴｅＮＴを、逐次または同時に組み合わせて投与してよい。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、いずれかの適切な方法、例えば、注射、外科的移植、局所的適用、または鼻腔内投与によって局所的に対象に投与してよい。１つの実施形態では、ＴｅＮＴを、患部の筋肉に注射により筋肉内投与する。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、優れた医療行為のための原則に合わせた方法で製剤、投薬、および投与するだろう。これに関連して考慮される因子としては、治療される筋緊張低下の特定の型、治療される特定の対象、対象の臨床状態、投与部位、投与方法、投与計画、および歯科を含む医療の開業医に公知の他の因子が挙げられる。投与しようとするＰＥＧ－ＴｅＮＴの治療有効量は、かかる考察によって管理されるだろう。
薬剤的に許容可能な担体としては、水、緩衝水、例えば、生理食塩水またはハンクもしくはアールの均衡溶液などの均衡食塩溶液などの食塩水、グリシン、および)ヒアルロン酸が挙げられる。
筋肉内投与用に組成物を製剤してよい。筋肉内投与用組成物は、薬剤的に許容可能な滅菌水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液ならびに滅菌注射液もしくは分散液への調製用滅菌散剤を含んでよい。適切な水性または非水性担体、溶媒、希釈剤または媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物、植物油（オリーブ油など）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。
組成物は、浸透促進剤を含んで、ＴｅＮＴの送達を促進してよい。浸透促進剤としては、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリレート、レクリネート（reclineate）、モノオレイン、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１－モノカプレート、モノおよびジグリセリドならびにこれらの生理学的に許容可能な塩を挙げることができる。
組成物は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸塩、ホモバニレート（homovanilate））などのキレート剤をさらに含んでもよい。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたはＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む組成物を収容する容器を備える製造物品および／またはキットも提供する。容器は、必要に応じて単位剤形でＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは組成物を含むビン、バイアルまたは注射器であってよい。例えば、ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは組成物は、ディスポーザブル容器、必要に応じて注射器中に注射可能な液剤の形態であってよい。製造物品および／またはキットは、本明細書に開示されている方法による対象の治療を示す印刷された説明書および／またはラベルなどをさらに備えてよい。
用語「治療有効量」は、対象における筋緊張低下を治療するために効果的なＰＥＧ－ＴｅＮＴ量を表す。
用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、対象における筋緊張低下を予防、低減、もしくは寛解するまたは対象における筋緊張低下の進行を遅らせる（減少する）ことを目的とする治療処置および予防（prophylactic）もしくは予防（preventative）手段の両方を表す。治療を必要とする対象としては、既に筋緊張低下に罹患している者ならびに筋緊張低下を予防または寛解しようとする者が挙げられる。
用語「予防すること」、「予防」、「予防の（preventative）」または「予防の（prophylactic）」は、筋緊張低下の発生を避ける、または筋緊張低下の発生を妨げる、筋緊張低下の発生から身を守る、または筋緊張低下の発生から保護することを表す。予防を必要とする対象は、筋緊張低下に罹患する傾向にあり得る。
用語「寛解する」または「寛解」は、筋緊張低下を減少、低減または排除することを表す。
筋緊張低下を定量化してよい。筋緊張低下を、半定量スケール、例えば、０～５で定量化してよく、０は存在しないことを表し、１～４は重症度の識別可能な増加であり、５は最大の重症度である。あるいは、筋緊張低下を、二値事象、すなわち、存在かまたは非存在、０または１として定量化してもよい。他の半定量スケールは、当業者には容易に分かるだろう。別の実施形態では、筋緊張低下を、例えば、フォースゲージを使用して定量的スケールで定量化してもよい。
筋緊張低下のいずれもの定量も、コントロール、例えば、ＰＥＧ－ｔｅＮＴの投与を受けていない健康なコントロール対象、筋緊張低下のための治療を受けているがＰＥＧ－ＴｅＮＴで治療されていない罹患コントロール患者と比較してよい。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴの投与による筋緊張低下の治療は、筋緊張低下において約１％減少、約２％減少、約３％減少、約４％減少、約５％減少、約６％減少、約７％減少、約８％減少、約９％減少、約１０％減少、約２０％減少、約３０％減少、約４０％減少、約５０％減少、約６０％減少、約７０％減少、約８０％減少、約９０％減少、または約１００％減少であり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、哺乳類を表し得る。哺乳類は、霊長類、特に、ヒトであってもよく、飼育動物、動物園の動物、またはコンパニオンアニマルであってよい。本明細書に開示されているＰＥＧ－ＴｅＮＴの組成物および方法がヒトの医学的治療に適していると特に考えられるが、ウマ、ウシおよびヒツジなどの飼育動物、イヌおよびネコなどのコンパニオンアニマル、またはネコ科、イヌ科、ウシ科および有蹄動物などの動物園の動物の治療を含む獣医学的治療にも適用可能である。
本明細書中で別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者および出版された文献により共通に理解されるのと同じ意味を有する。
なお、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を表し、例えば、「ａ ＴｅＮＴ」は、１つ以上のＴｅＮＴを表すと理解される。このように、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用してよい。
続くクレームおよび本発明の明細書では、言語表現または含意のせいで文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」は非排他的意味で使用される、すなわち、本発明の様々な実施形態において表明された特徴の存在を規定するが、更なる特徴の存在も付加も排除しない。
本明細書で使用されるとき、用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、その数の大きさ±２５％の所与の数に対する値の範囲を意図する。他の実施形態では、用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、その数の大きさ±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の所与の数に対する値の範囲を意図する。例えば、１つの実施形態では、約３グラムは、２．７グラム～３．３グラム（すなわち、３グラム±１０％）、などを示す。
同様に、事象のタイミングまたは期間は、少なくとも２５％変動し得る。例えば、１日続く１つの実施形態では、特定の事象が開示され得るが、事象は１日より長くまたは短く続き得る。例えば、「１日」は、約１８時間～約３０時間の期間を含み得る。他の実施形態では、時間は、その時間の±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％変動し得る。
実施例１－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ（図１Ａ）の製造
本実施例では、ＴｅＮＴ－ｃの表面セリン残基を、表面システイン残基へ変異導入して免疫原性エピトープにおいて特異的ＰＥＧ結合を促進し、図１Ａの分子を産生する。変異は、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃである。
表面セリンからシステインへの置換Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、および
Ｓ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴのための遺伝子は、商用プロバイダー、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグを変異体タンパク質のＮ末端に付加するように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクターにサブクローン化する。
Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを発現し、ＰＥＧ化し、実施例５に従って精製して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃを得る。
実施例２－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ（図１Ｂ）の製造
本実施例では、ＴｅＮＴ－ＨＣの表面セリン残基を、表面システイン残基へ変異導入して、免疫原性エピトープにおいて特異的ＰＥＧ結合を促進し、図１Ｂの分子を産生する。変異は、Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃである（図２４ 配列番号１６）。
表面セリンからシステインへの置換Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴのための遺伝子は、商用プロバイダー、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成される。遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグを変異体タンパク質のＮ末端に付加するように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクター（図２５ 配列番号１７、図２６）にサブクローン化する。
Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを発現し、ＰＥＧ化し、実施例５に従って精製して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣを得る。
実施例３－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（図１Ｃ）の製造
本実施例では、ＬＣおよびｃの表面セリン残基を、表面システイン残基へ変異導入して、免疫原性エピトープにおいて特異的ＰＥＧ結合を促進し、図１Ｃの分子を産生する。変異は、Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃであった（図２１ 配列番号１４）。
ＬＣおよびｃ中、表面セリンからシステインへの置換Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを有するＴｅＮＴのための遺伝子は、商用プロバイダー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグを変異体タンパク質のＮ末端に付加するように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクター（図２２ 配列番号１５、図２３）にサブクローン化した。
Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃを含むＴｅＮＴを、発現し、ＰＥＧ化し、実施例５に従って精製して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを得た。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体から除去した。
システイン残基とのＰＥＧの結合
１．過剰モル数のＰＥＧ－約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａまたは約２０ｋＤａ
のＰＥＧを有するマレイミドを、ＰＢＳ中、ｐＨ６．５～７．５においてセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。
２．室温で６時間、結合を行った。
３．過剰のＰＥＧを、サイズ排除クロマトグラフィにより取り除いた。
タンパク質のトリプシン消化活性
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の活性化のためのトリプシン消化を行った。
実施例４－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ（図１Ｄ）の製造（方法１）
ＴｅＮＴの製造
１．Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ株を、ｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴベクターで電気形質転換し（図３および４）、３７℃において選択抗生物質（アンピシリンおよびクロラムフェニコール）と共にＬＢ寒天上で一夜生育した。
２，２００ｍＬの前誘発ブロスに、選択プレートからの１コロニーを播種した。１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；２％グルコース；０．４％グリセロール；１７ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；および選択抗生物質（アンピシリンおよびクロラムフェニコール）を含む前誘発ブロスｐＨ７．２～７．４。
３．培養液を、高速で振盪しながら３０℃で一夜インキュベートした。
４．一夜培養した培養液を、４０００ｇ、１０分間の遠心分離により収穫した。
５．１．２％トリプトン；２．４％酵母エキス；０．４％グリセロール；１ｍＭ ＩＰＴＧ；１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４；１００μｇ／ｍＬアンピシリン；および１０μＭ ＺｎＣｌ２を含む２００ｍＬの発現ブロスｐＨ７．２～７．４中に、ペレットを再懸濁した。
６．タンパク質を、高速で振盪しながら３０℃で６時間発現した。
７．細胞を、４５００ｇで１５分間遠心分離により収穫し、ペレットを、２０ｍＭイミダゾールを含む３０ｍＬのＴＢＳ中にｐＨ８において再懸濁した。
８．細胞を、超音波処理により溶解した。
９．細胞ライセートを、４５００ｇで２０分間遠心分離により透明にして、０．４５μｍフィルターにより濾過した。
１０．タンパク質を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ＦＰＬＣシステム（ＧＥ）を使用して、Ｈｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
１１．精製されたタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＰＢＳに緩衝液交換し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラムを備えたＡＫＴＡピュア２５ＦＰＬＣシステムを使用して、ゲル濾過による第二段階精製を行った。
エンドトキシン除去
１．０．５ｍＬエンドトキシン除去スピンカラムを室温まで平衡化した。
２．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。溶液を廃棄した。
３．カラムボタンプラグを交換し、カラムキャップを取り除き、９５％エタノール中の０．２Ｎ ＮａＯＨを樹脂に添加し、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転して樹脂を再懸濁してから、室温で１～２時間インキュベートした。
４．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。溶液を廃棄した。
５．カラムボタンプラグを交換し、カラムキャップを取り除き、エンドトキシンを含ま
ない２Ｍ ＮａＣｌを樹脂に添加し、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転して樹脂を再懸濁した。
６．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。溶液を廃棄した。
７．カラムボタンプラグを交換し、カラムキャップを取り除き、エンドトキシンを含まない超純水を樹脂に添加し、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転して樹脂を再懸濁した。
８．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。溶液を廃棄した。
９．カラムボタンプラグを交換し、カラムキャップを取り除き、エンドトキシンを含まないリン酸緩衝液を樹脂に添加し、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転して樹脂を再懸濁した。
１０．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。溶液を廃棄した。
１１．カラムを、リン酸緩衝液で２回以上リンスし、溶離液を廃棄した。
１２．カラムボタンプラグを交換し、カラムキャップを取り除き、サンプルを樹脂に適用し、カラムキャップを交換し、カラムを数回反転して樹脂を再懸濁した。
１３．カラムを、４℃で少なくとも１時間、回転混合しながらインキュベートした。
１４．カラムボタンプラグを取り除き、カラムキャップを緩め、カラムを、エンドトキシンを含まない１５ｍＬチューブ中に入れて、５００ｇで１分間遠心分離してカラムから溶液を除去した。サンプルは保持。
１５．サンプル中のエンドトキシンが同等かそれ以下のレベルになって全ての投与量が対象のキログラム当たり５ＥＵユニット未満のエンドトキシンしか含まなくなるまで、再生スピンカラムを用いてエンドトキシン除去手順を繰り返した。
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの製造
１．５００μＬのＰＢＳ ｐＨ７．４の全体積において、３μｍｏｌの精製ＴｅＮＴおよび０．５ｍｍｏｌのｍｐｅｇ－ＮＨＳ（ＳＣ）（Ｎａｎｏｃｓ）を、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａ ＰＥＧと結合した。
２．サンプルを、室温で３時間混合した。
３．過剰のＰＥＧを、サイズ排除クロマトグラフィにより取り除いた。
タンパク質の活性体へのトリプシン消化
１．０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．０または０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５を含む０．５ｍＬ消化緩衝液中に、１ｍｇのタンパク質を溶解した。
２．０．１０ｍＬ～０．２５ｍＬの固定化ＴＰＣＫトリプシンを、３×５００μＬの消化緩衝液で洗浄した。各洗浄後、遠心分離によってゲルを緩衝液から分離した。
３．約０．２ｍＬの消化緩衝液中に、ゲルを再懸濁した。
４．固定化ＴＰＣＫトリプシンを、タンパク質サンプルに添加した。
５．反応混合物を、高速振盪インキュベーターにおいて３７℃で２時間～１８時間インキュベートした。
６．固定化ＴＰＣＫトリプシンを、遠心分離によって分離した。
実施例５－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ（図１Ｄ）の製造（方法２）
本実施例では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの表面セリン残基を、表面システイン残基に変異（ＳからＣへの変異体）して、免疫原性エピトープにおいて特異的ＰＥＧ結合を促進した。ＴｅＮＴ変異は、配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ；Ｓ１２０Ｃ；Ｓ１４４Ｃ；Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ；Ｓ４２８Ｃ；Ｓ６００Ｃ；Ｓ９６３Ｃ；Ｓ１０４１Ｃ；Ｓ１１５５Ｃ；およびＳ１１８７Ｃであった。
セリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣの製造
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、ＳからＣへの変異を含む図１８（配列番号１２）のアミノ酸配列をコードするベクターｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ（図１９および２０）で電気形質転換した。ＳからＣへの変異を含むＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを発現し、ステップ１０および１１間に１５分間０．５ｍＭ ＤＴＴの処理を付加した実施例４に従って精製した。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体から除去した。
システイン残基とのＰＥＧの結合
１．約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａまたは約２０ｋＤａのＰＥＧを有する過剰モル数のＰＥＧ－マレイミドを有するマレイミドを、ＰＢＳ中、ｐＨ６．５～７．５においてセリン変異体ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ（０．５～２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。
２．室温で６時間、結合を行った。
３．過剰のＰＥＧを、サイズ排除クロマトグラフィにより取り除いた。
タンパク質のトリプシン消化活性
実施例４に従って、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣセリン変異体の活性化のためのトリプシン消化を行った。
実施例６－不活性化デコイＴｅＮＴ
本実施例では、ガングリオシド結合領域において配列番号１に対してＲ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａアミノ酸置換を含む非ＰＥＧ化組換えｃを製造した。不活性化されたｃを、非ＰＥＧ化ＬＣ－ＨＮの等モル量と結合して、不活性化デコイＴｅＮＴを製造した。得られた不活性化ＴｅＮＴを、破傷風トキソイドのワクチンを接種された対象において抗体に基づいた中和応答のためのデコイとして使用する。
Ｒ１２２５Ｅ Ｗ１２８８Ａを含むｃの製造
Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａを含むｃの遺伝子は、商用プロバイダー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグを変異体タンパク質のＮ末端に付加するように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクターにサブクローン化した。
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、Ｒ１２２５Ｅ Ｗ１２８８Ａ（図１２、配列番号８）を含むｃをコードするｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ｃベクター（図１３（配列番号９）および図１４）で電気形質転換し、３７℃で選択抗生物質（アンピシリンおよびクロラムフェニコール）を含むＬＢ寒天上で一夜生育した。Ｒ１２２５Ｅ Ｗ１２８８Ａを含むｃを発現し、実施例４に従って精製した。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、精製されたタンパク質から除去した。
ＬＣ－ＨＮの製造
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、ｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮベクター（図１０および１１）で電気形質転換し、３７℃において選択抗生物質（アン
ピシリン、クロラムフェニコール）と共にＬＢ寒天上で一夜生育した。ＬＣ－ＨＮを発現し、実施例４に従って精製した。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、精製されたタンパク質から除去した。
Ｅ２７０Ａ Ｙ３７４Ａを含むＬＣ－ＨＮの製造
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、Ｅ２７０Ａ Ｙ３７４Ａを含むＬＣ－ＨＮをコードするｐＲＳＥＴ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＮベクターで電気形質転換し、３７℃において選択抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール）と共にＬＢ寒天上で一夜生育した。Ｅ２７０Ａ Ｙ３７４Ａを含むＬＣ－ＨＮを発現し、実施例４に従って精製した。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、精製されたタンパク質から除去した。
実施例７－不活性デコイＴｅＮＴ
Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａを含むＴｅＮＴの遺伝子は、商用プロバイダー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。遺伝子は、ベクターからの６ｘヒスチジンタグを変異体タンパク質（図１５ 配列番号１０、図１６
配列番号１１、および図１７）のＮ末端に付加するように、制限消化によってｐＲＳＥＴ－Ａ発現ベクターにサブクローン化した。
Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａを含む不活性化ＴｅＮＴを発現し、実施例４に従って精製した。
エンドトキシン除去
エンドトキシンを、実施例４に従って、精製されたタンパク質から除去した。
実施例８－ＰＥＧ－ＴｅＮＴ分析
ＴｅＮＴを製造し、実施例４に従ってＰＥＧ化し、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析（図２８）し、（Ａ）クーマシーブルーによって、および（Ｂ）ポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体を使用してウエスタンブロットによって検出した。（Ｂ）は、免疫原性がＰＥＧ分子量に比例することを示している。
実施例９－ＴｅＮＴに対するＰＥＧ－ＴｅＮＴの低下された免疫原性
各々異なる分子量のＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を含む４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴを製造し、実施例４に従ってＰＥＧ化した。次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、ＴｅＮＴに対して競合ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
第一アッセイ（図２９Ａ）では、ＴｅＮＴを、ＥＬＩＳＡプレートに吸着した。次いで、吸着されたＴｅＮＴを、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴ抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。このアッセイでは、より高い応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）は、ＴｅＮＴに対するより大きな親和性を示し、したがって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対する免疫原性が低いことを示す。
第二アッセイ（図２９Ｂ）では、各ＰＥＧ－ＴｅＮＴを、別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着した。次いで、各吸着されたＰＥＧ－ＴｅＮＴ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａお
よび２０ｋＤａ）を、ＴｅＮＴ抗原の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。このアッセイでは、より低い応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）は、ＴｅＮＴに対するより大きな親和性を示し、したがって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴに対する免疫原性が低いことを示す。
この実施例は、抗ＴｅＮＴ抗体は選択的にＴｅＮＴと結合し、ＰＥＧ化ＴｅＮＴはＴｅＮＴ（すなわち、非ＰＥＧ化）と比較して免疫原性を低下させたことを示した。
実施例１０－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対するＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の低下された免疫原性
ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を、実施例５に従って製造した。ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体の４つのサンプルを、実施例５に従ってＰＥＧ化し、各サンプルは、異なる分子量のＰＥＧ（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を含む。次いで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体に対して競合ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
第一アッセイ（図２９Ｃ）では、ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を、ＥＬＩＳＡプレートに吸着した。次いで、吸着されたＴｅＮＴセリン変異体を、４つのＰＥＧ－ＴｅＮＴセリン変異体抗原（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。このアッセイでは、より高い応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）は、ＴｅＮＴセリン変異体に対するより大きな親和性を示し、したがって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴセリン変異体に対する免疫原性が低いことを示す。
第二アッセイ（図２９Ｄ）では、各ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体を、別々のＥＬＩＳＡプレートに吸着した。次いで、各吸着されたＰＥＧ－ＴｅＮＴセリン変異体（２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を、ＴｅＮＴセリン変異体抗原の４つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌ）の各々でプレインキュベートされたポリクローナル抗ＴｅＮＴ抗体でプローブした。このアッセイでは、より低い応答（ＯＤ ４５０ｎｍ）は、ＴｅＮＴセリン変異体に対するより大きな親和性を示し、したがって、ＰＥＧ－ＴｅＮＴセリン変異体に対する免疫原性が低いことを示す。
この実施例は、抗ＴｅＮＴ抗体は選択的にＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体と結合し、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体はＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃセリン変異体（すなわち、非ＰＥＧ化）と比較して免疫原性を低下させたことを示した。
実施例１１－ＴｅＮＴに対するＰＥＧ－ＴｅＮＴの低下された免疫原性
前の１２ヶ月内に追加免疫破傷風トキソイドワクチン接種を受けた１つ以上の対象から採取されたヒト血清によりポリクローナル抗体を置換することを除いて実施例９に従って、競合ＥＬＩＳＡアッセイを行う。血清中の抗体は、ＰＥＧ－ＴｅＮＴと対比してＴｅＮＴ（すなわち、非ＰＥＧ化ＴｅＮＴ）に対してより大きな親和性を示すだろう。
実施例１２－インビボモデル
ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、実施例４に従って、組換えＴｅＮＴの表面に露出したリジン残基とＰＥＧ（約５ｋＤａ、約１０ｋＤａまたは約２０ｋＤａ）を結合することによって製造した。
１５μＬのＰＢＳ中の１ユニット以上のＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢に注射した。各動物は、注射４８時間以内に局所的肢筋強縮を示した（図３０Ａおよび３０Ｂ）。
実施例１３－インビボモデル
実施例４に従って、ＴｅＮＴの表面リジン残基と結合された５ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、ｃデコイ、すなわち、Ｒ１２２５Ｅ Ｗ１２８８Ａにより不活性化されたｃと、１：１０のモル比で結合した。５ｎｇのＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む、１５ミリリットルのＰＢＳ中の組成物を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後肢の筋肉内に注射した。各動物は、４８時間以内に局所的肢筋強縮を示し、デコイの存在なしでＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣで治療された動物から病徴発現は識別できなかった。
実施例１４．
５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、破傷風トキソイドで前以て免疫化されたマウスの後肢筋肉に５０～５０００００ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与した。増大された筋収縮は、３日までに注射された筋肉内で観察され、同ユニットのＴｅＮＴを投与されたマウスにおいて観察された効果より大きかった。図３１Ａは、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ ２０ｋＤａについての結果を報告している。
実施例１５．
実施例６に従って製造されたＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣおよび１０：１または１００：１モル過剰のデコイＴｅＮＴを含む組成物を、破傷風トキソイドで前以て免疫化されたマウスの後肢筋肉に５０～５０００００ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与した。増大された筋収縮は、３日間までに注射された筋肉内で観察され、ＴｅＮＴを投与されたマウスにおいて観察された効果より大きかった（図３２Ａ）。
実施例１６．
実施例６に従って製造された５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣおよび１０：１または１００：１モル過剰のデコイＴｅＮＴを含む組成物を、破傷風トキソイドで前以て免疫化されたマウスの後肢筋肉に５０～５０００００ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与した。増大された筋収縮は、３日間まで注射された筋肉内で観察され、ＴｅＮＴを投与されたマウスにおいて観察された効果より大きく、かつ、ＰＥＧ－ＴｅＮＴのみを投与されたマウスにおいて観察された効果より大きかった（図３２Ｂ）。
実施例１７．
２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、破傷風トキソイドで前以てワクチン接種されたヒト対象の左おとがい舌骨筋に０．０１～５００００ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与する。増大された筋収縮は、２週間までに注射された筋肉内で観察され、同対象に媒体のみ投与された右おとがい舌骨筋において観察された効果より大きいだろう。
実施例１８．
実施例６に従って製造された、２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣおよび１０：１または１０００：１モル過剰のデコイＴｅＮＴを含む組成物を、破傷風トキソイドで前以てワクチン接種されたヒト対象の左おとがい舌骨筋に５０ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与する。２０ｋＤａのＰＥＧを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、同ヒト対象の右おとがい舌骨筋に５０ｎｇ／ｋｇ筋肉内投与する。
増大された筋収縮は、２週間までに左および右の両おとがい舌骨筋において観察されるが、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ単独と比較して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣおよ
びデコイＴｅＮＴを含む組成物で治療された左おとがい舌骨筋において大きい。
実施例１９．
約３０ｋｇのブルドッグに、左および右おとがい舌骨筋に両側的に分割された投与量で、２０ｋＤａのＰＥＧを含む２５～５００００ｎｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃを筋肉内投与する。投与すると、閉塞型睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）は、媒体のみで治療された動物と比較して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ治療された動物において低減する。ＯＳＡに関して、毎週、ブルドッグを観察し、媒体のみで治療された動物と比較可能なＯＳＡの再開によって決定される、効果の低下まで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ投与を必要に応じて繰り返す。
その後、ブルドッグに、それぞれが２０ｋＤａのＰＥＧを含む２５～５００００ｎｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣまたは２５～５００００ｎｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを、左および右おとがい舌骨筋に両側的に分割して投与する。投与すると、ＯＳＡは、媒体のみで治療された動物と比較して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ治療された動物において低減する。ＯＳＡに関して、毎週、ブルドッグを観察し、媒体のみで治療された動物と比較可能なＯＳＡの再開によって決定される、効果の低下まで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ投与を必要に応じて繰り返す。
その後、ブルドッグに、それぞれが２０ｋＤａのＰＥＧを含む２５～５００００ｎｇ／ｋｇのＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣを、左および右おとがい舌骨筋に両側的に分割して投与する。投与すると、ＯＳＡは、媒体のみで治療された動物と比較して、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ治療された動物において低減する。ＯＳＡに関して、毎週、ブルドッグを観察し、媒体のみで治療された動物と比較可能なＯＳＡの再開によって決定される、効果の低下まで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ投与を必要に応じて繰り返す。
実施例２０．
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏを使用して、タンパク質データバンクに寄託された結晶学的データから誘導されたＴｅＮＴの三次元モデル上に、ｄａ Ｓｉｌｖａ Ａｎｔｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ（２０１７）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，１２（１）， ｅ０１６９０８６およびＰａｌｅｒｍｏ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，１２（１０），１７００１９７により特定された主要ヒト抗体クローン形質により認識されたＴｅＮＴをマッピングした。同定されたエピトープ中または周囲の表面セリン残基を、実施例１～３および５に記載された続くＰＥＧ化のためのシステインへの変異のために特定した。
実施例２１．
１ナノグラム～６４マイクログラムの、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（表面リジンまたはシステイン残基と結合された５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａの分岐鎖または直鎖ＰＥＧ）および１０～１０００モル過剰のデコイＴｅＮＴの混合物を、破傷風トキソイドのワクチン接種されたマウスの後肢に筋肉内注射する。局所的筋強縮は、数時間から数ヶ月の期間観察され、天然ＴｅＮＴを注射されたマウスで観察された効果より大きい。
実施例２２．
１ナノグラム～６４マイクログラムの、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（表面リジンまたはシステイン残基と結合された５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａの分岐鎖または直鎖ＰＥＧ）および１０～１０００モル過剰のデコイＴｅＮＴの混合物を、破傷風トキソイドのワクチン接種されたヒトのおとがい舌骨筋に筋肉内注射する。局所的筋強縮は、数週間から数ヶ月の期間観察され、天然ＴｅＮＴを注射されたヒトで観察された効果より大きい。
実施例２３．
睡眠時呼吸障害のブリティッシュブルドッグに、０．００１～１０ＩＵ／ＫｇのＴｅＮＴを左および右おとがい舌骨筋に両側的に分割して筋肉内投与した。投与すると、閉塞型睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）は最も高い投与量において有意に減少することが確認された。ベースライン呼吸障害指数（ＲＤＩ）スコアは１９．９（四分位範囲５．４５）であり、１０ＩＵ／ＫｇのＴｅＮＴでの治療後１３．２（四分位範囲４．４５）まで減少し、ウィルコクソン符号順位検定によって、プラセボの投与と比較して有意であると判定した；Ｐ＝０．０４３。ブルドッグを、治療後４ヶ月観察し、ＲＤＩ低下は維持された；ＲＤＩ中央値＝１３．４、Ｐ＝０．０４３；ウィルコクソン符号順位検定。

Claims (36)

  1. 配列番号１に対して、１つ以上の表面セリンからシステインへのアミノ酸置換を含む、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）またはそのフラグメント。
  2. 前記置換されたセリンは、配列番号１に対して、Ｓ８１Ｃ、Ｓ１２０Ｃ、Ｓ１４４Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ３３５Ｃ、Ｓ４２８Ｃ、Ｓ６００Ｃ、Ｓ９６３Ｃ、Ｓ１０４１Ｃ、Ｓ１１５５Ｃ、およびＳ１１８７Ｃの１つ以上を含む、請求項１に記載のＴｅＮＴ。
  3. 前記置換システインは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１または２に記載のＴｅＮＴ。
  4. 前記ＰＥＧは、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａである、請求項３に記載のＴｅＮＴ。
  5. 前記ＰＥＧは、直鎖または分岐鎖である、請求項３または４に記載のＴｅＮＴ。
  6. ＴｅＮＴまたはそのフラグメントであって、配列番号１に対して、Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２８８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；もしくはＲ１２２５ｄｅｌおよびＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含み、前記ＴｅＮＴまたはそのフラグメントが不活性である、ＴｅＮＴまたはそのフラグメント。
  7. （ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）前記第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴに結合していない前記第二ＴｅＮＴを含む、組成物。
  8. 前記第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴは、請求項３～５のいずれか一項に記載のＴｅＮＴを含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記第二ＴｅＮＴは、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴｅＮＴである、請求項７または請求項８に記載の組成物。
  10. 筋緊張低下の治療方法であって、前記方法は、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴを、対象に投与することを含む、方法。
  11. 第二ＴｅＮＴを投与される対象における筋緊張低下治療のための医薬製剤におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）の使用。
  12. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）を投与される対象における筋緊張低下治療のための医薬製剤における第二ＴｅＮＴの使用。
  13. 筋緊張低下治療のための医薬製剤における、（ｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
    が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む第一ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）；および（ｉｉ）第二ＴｅＮＴの使用。
  14. 前記第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは前記第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）、ＰＥＧ化ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）、またはＰＥＧ化ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物、請求項１０に記載の方法、または請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用。
  15. 前記第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴまたは前記第二ＴｅＮＴは、ＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ、またはＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃである、請求項７～１４のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
  16. 前記第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣであり、前記第二ＴｅＮＴはＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃである、請求項７～１５のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
  17. 前記第二ＴｅＮＴは、不活性化されたＴｅＮＴを含む、請求項７～１６のいずれか一項に記載の組成物、方法または使用。
  18. 配列番号１に対して、前記不活性化されたＴｅＮＴは：Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２２８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；もしくはＲ１２２５ｄｅｌおよびＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含む、請求項１７に記載の組成物、方法または使用。
  19. 前記対象に、
    効能が低下するまで、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで
    効能が低下するまで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを含む組成物を対象に投与し；次いで
    ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）
    を投与する、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法または使用。
  20. 前記筋緊張低下は、閉塞型睡眠時無呼吸である、請求項９～１９のいずれか一項に記載の方法または使用。
  21. 前記組成物は、治療用組成物である、請求項７または１４～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  22. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合した破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を含む、ＰＥＧ化破傷風神経毒素（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ）。
  23. 前記ＴｅＮＴ軽鎖（ＬＣ）がＰＥＧ化されているか、前記ＴｅＮＴ重鎖（ＨＣ）がＰＥＧ化されているか、または前記ＴｅＮＴフラグメントｃ（ｃ）がＰＥＧ化されている、請求項２２に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴ。
  24. ＬＣがＰＥＧ化されており、かつ、ＨＣがＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）か、またはＬＣがＰＥＧ化されており、かつ、ｃがＰＥＧ化されている（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）、請求項２２または請求項２３に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴ。
  25. ＰＥＧはリジン残基と結合している、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴ。
  26. ＰＥＧはシステイン残基と結合されており、必要に応じて、前記システイン残基は、配列番号１に対して、表面セリンからシステインへの置換である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴ。
  27. 前記ＰＥＧは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａまたは約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴ。
  28. 筋緊張低下の治療方法であって、前記方法は、請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴを対象に投与することを含み、前記ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴと結合していない、方法。
  29. 筋緊張低下治療のための医薬製剤における請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴの使用であって、前記ＰＥＧ－ＴｅＮＴは第二ＴｅＮＴと結合していない、使用。
  30. 前記対象に、ＰＥＧ化ＨＣを含む第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）ならびにＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ｃを含む第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）を投与する、請求項２８に記載の方法または請求項２９に記載の使用。
  31. 前記対象に、
    ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）；ならびに／または
    ＰＥＧ化ＨＣを含む第一ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣ）およびＰＥＧ化ＬＣ－ｃを含む第二ＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃ）；ならびに／または
    ＰＥＧ化ＨＣおよびＰＥＧ化ＬＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）
    を投与する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法または使用。
  32. 治療は、
    効能が低下するまで、ＰＥＧ化ｃを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ｃ）を対象に投与し；次いで
    効能が低下するまで、ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＨＣおよびＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ｃを対象に投与し；次いで
    ＰＥＧ化ＬＣおよびＰＥＧ化ＨＣを含むＰＥＧ－ＴｅＮＴ（ＰＥＧ－ＴｅＮＴ－ＬＣ－ＨＣ）
    を対象に投与することを含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法または使用。
  33. 治療は、不活性化されたＴｅＮＴを投与することをさらに含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法または使用。
  34. 配列番号１に対して、前記不活性化されたＴｅＮＴは：Ｒ１２２５Ｋ；Ｒ１２２５Ｅ；Ｗ１２８８Ａ；Ｗ１２８８Ｙ；Ｗ１２８８Ｆ；Ｗ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２
    ８８Ａ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ａ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｙ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｆ；Ｒ１２２５ＫおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ＥおよびＷ１２８８Ｌ；Ｒ１２２５ｄｅｌ；Ｗ１２８８ｄｅｌ；もしくはＲ１２２５ｄｅｌおよびＷ１２８８ｄｅｌ；Ｅ２７０Ａ；Ｙ３７４Ａ；Ｅ２７０ＡおよびＹ３７４；Ｇ２７０ｄｅｌ；Ｙ３７４ｄｅｌ；またはこれらの組合せを含む、請求項３３に記載の方法または使用。
  35. 前記筋緊張低下は、閉塞型睡眠時無呼吸である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法または使用。
  36. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＴｅＮＴ、請求項７、１４～１８もしくは２１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＰＥＧ－ＴｅＮＴを含む、キット。
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