ES2647243T3 - Medios y métodos para la determinación de la cantidad de polipéptido Neurotoxina y de sus actividades catalíticas y proteolíticas - Google Patents

Medios y métodos para la determinación de la cantidad de polipéptido Neurotoxina y de sus actividades catalíticas y proteolíticas Download PDF

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Abstract

Un procedimiento in vitro para determinar la cantidad de polipéptidos de neurotoxina clostridial tratados en una solución que comprende polipéptidos de neurotoxina tratados y polipéptidos de neurotoxina parcialmente tratados y/o no tratados, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: a) poner en contacto una primera porción de dicha solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina parcialmente tratado y/o no tratado, con un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a la cadena ligera del polipéptido neurotoxina tratado, parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo de captura a dicha ligera de polipéptido neurotoxina tratado, parcialmente tratado y sin tratar, formando así un primer complejo de anticuerpo, b) poner en contacto dicho primer complejo de anticuerpo con un anticuerpo de detección que se une específicamente a la cadena ligera de dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado, y no tratado en el complejo de anticuerpo formado en la etapa a), por lo que se forma un primer complejo de detección, c) poner en contacto una segunda porción de dicha solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina parcialmente tratado y/o sin tratar con un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al enlazador de dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de captura a dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar, en donde dicho segundo anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ. ID. nº: 1 a nº: 16, formando así un segundo complejo de anticuerpos, d) poner en contacto dicho segundo complejo de anticuerpo con un anticuerpo de detección que es diferente del anticuerpo de detección en la etapa b) y que se une específicamente al complejo de anticuerpo formado en la etapa c), con lo cual se forma un segundo complejo de detección, e) determinar la cantidad del primer complejo de detección formado en la etapa b) y la cantidad del segundo complejo de detección formado en la etapa d), y f) calcular la cantidad de polipéptido neurotoxina clostridial tratado, basándose en las cantidades del primer y segundo complejo de detección determinado en la etapa e).

Description

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imagen5
un aspecto de la invención, el segundo anticuerpo de captura no reacciona de forma cruzada con el polipéptido neurotoxina tratado en un grado significativo. En un aspecto, dicho segundo anticuerpo de captura inmovilizado se une específicamente a un epítopo que consiste esencialmente en, comprender o estar comprendido por una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID nº: 1 a nº: 16, véase la Tabla 2 o 3 a continuación.
5 Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de los puntos de escisión de diferentes polipéptidos de neurotoxina y secuencias flanqueantes
SEQ. ID. nº:
Secuencia del epítopo incluidos puntos de escisión (resaltado) Neurotoxina (cepa bacteriana)
1
KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN .... DLCIKV BoNT/A (Hall/62A)
2
IQMCKSVKAPG ...................................... ICIDV BoNT/B (Okra)
3
TKFCHKAIDGRSL .... YNKTL …...... DCRELLV BoNT/C1 (C-6814)
4
TKVCLRLTK …....... NSRD …........... DSTCIKV BoNT/D
5
IRFCKNIVSVKG …......... IRK …............ SICIEI BoNT/E (Beluga)
6
VKFCKSVIPRKG ......... TKAP …...... PRLCIRV BoNT/F (NCTC10281)
7
IAMCKPVMYKNT …......... GKS ........... EQCIIV BoNT / G
8
IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKI TeNT
Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de las regiones del enlazador
SEQ. ID. nº:
Secuencia de los epítopos Puntos de escisión Neurotoxin /cepa bacteriana
9
TKSLDKGYNK K438 / T439 K448 / A449 BoNT/A (Hall/62A)
10
CKSVKAPGIC K441 / A442 BoNT/B (Okra)
11
SLYNK R444 / S445 K449 / T450 BoNT/C1 (C-6814)
12
NSR K442 / N443 R445 / D446 BoNT/D (CB16)
13
GIR K419 / G420 R422 /K423 BoNT/ E (Beluga)
14
KGTK R435 / K436 K439 / A440 BoNT/F (NCTC10281)
15
NGTK BoNT/G
16
ENLYNR R449 (alternativamente R455) TeNT
7
imagen6
Convenientemente, el procedimiento de la presente invención permite una determinación fiable de la cantidad de neurotoxina tratada en un preparado dado. En consecuencia, la calidad de los preparados de neurotoxina puede aumentar ya que los preparados se pueden analizar en cuanto a cantidades constantes del polipéptido neurotoxina tratado deseado.
5 En principio, el procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo acoplando un primer anticuerpo de captura a un soporte sólido tal como un vial de reacción. Asimismo, el segundo anticuerpo de captura se acoplará a otro soporte sólido físicamente separado (p. ej., otro vial de reacción). Ambos anticuerpos de captura acoplados a los soportes sólidos se pondrán posteriormente en contacto con dichas porciones de la solución que comprende la neurotoxina tratada, no tratada y/o parcialmente tratada a determinar. Dicha solución podría ser, p. ej., un cultivo
10 celular bacteriano purificado de Clostridum sp. Se entenderá que una primera porción se pondrá en contacto con el primer anticuerpo de captura en el primer soporte sólido y la segunda parte se pondrá en contacto con el segundo anticuerpo de captura en el segundo soporte sólido. Las porciones suelen ser de igual volumen y están normalizadas con respecto a sus contenidos, p. ej., su contenido de proteína total. La puesta en contacto se llevará a cabo durante un tiempo suficiente para permitir la unión específica del primer y segundo anticuerpos de captura a
15 sus respectivos antígenos. Por ejemplo, el contacto puede realizarse a temperatura ambiente durante aprox. una hora. Posteriormente, se descartarán la primera y la segunda porción de la solución y los soportes sólidos (p. ej., viales de reacción) se lavarán una o dos veces con un tampón en condiciones que no afecten al primer y segundo complejos de anticuerpos que se han formado mientras tanto con los anticuerpos de captura en los soportes sólidos. Una vez se han llevado a cabo las etapas de lavado, el anticuerpo de detección se agregará a los soportes sólidos
20 en condiciones que permitan la unión específica del anticuerpo de detección. El exceso de anticuerpos de detección deberá eliminarse mediante más etapas de lavado utilizando un tampón apropiado. Posteriormente, la cantidad del primer y el segundo complejo de detección se puede determinar mediante la determinación de la cantidad de anticuerpo de detección específicamente unido. Esto se conseguirá dependiendo de la naturaleza del marcador del anticuerpo de detección, p. ej., midiendo la densidad óptica o la intensidad de la fluorescencia. La cantidad medida
25 para el marcador detectable se puede comparar con patrones de calibración para determinar la cantidad de una especie de neurotoxina, es decir, la neurotoxina total (tratada, no tratada y parcialmente tratada) o la neurotoxina no tratada y parcialmente tratada en el primer o segundo complejo de detección. Debe entenderse que el primer complejo de detección representa la cantidad de neurotoxina total mientras que el segundo complejo de detección representa solamente la cantidad de polipéptidos de neurotoxina parcialmente tratados y no tratados. Por
30 consiguiente, la cantidad de polipéptido neurotoxina tratada se puede calcular en la configuración anteriormente mencionada restando la cantidad del polipéptido neurotoxina parcialmente tratada o sin tratar de la cantidad total del polipéptido neurotoxina.
Debe entenderse que las definiciones y explicaciones de los términos anteriores se aplican haciendo los cambios necesarios a todos los aspectos descritos en esta memoria descriptiva a continuación, excepto que se indique lo
35 contrario.
La presente invención también se refiere a un procedimiento in vitro para la determinación de la cantidad de polipéptido neurotoxina clostridial tratado en una solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina parcialmente tratado y/o no tratado, procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto una primera porción de dicha solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial
40 tratado y polipéptido neurotoxina parcialmente tratado y/o no tratado, con un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a la cadena pesada del polipéptido neurotoxina tratado, parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo de captura a dicha cadena pesada de polipéptido neurotoxina tratado, parcialmente tratado y sin tratar, formando así un primer complejo de anticuerpo,
b) poner en contacto el primer dicho complejo de anticuerpo con un anticuerpo de detección que se une
45 específicamente a la cadena ligera de dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado, y no tratado en el complejo de anticuerpo formado en la etapa a), por lo que se forma un primer complejo de detección,
c) poner en contacto una segunda porción de dicha solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina parcialmente tratado y/o sin tratar con un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al enlazador de dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar en
50 condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar, en donde dicho segundo anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ. ID. nº: 1 a nº: 16, formando así un segundo complejo de anticuerpos,
d) poner en contacto dicho segundo complejo de anticuerpo con un anticuerpo de detección que es diferente del
55 anticuerpo de detección en la etapa b) y que se une específicamente al complejo de anticuerpo formado en la etapa c), con lo cual se forma un segundo complejo de detección,
e) determinar la cantidad del primer complejo de detección formado en la etapa b) y la cantidad del segundo complejo de detección formado en la etapa d), y
9
imagen7
El término "dispositivo", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un sistema que comprende al menos la configuración mencionada anteriormente y medios operativamente unidos entre sí para permitir la determinación. En un aspecto, la configuración puede ser un soporte sólido con anticuerpos de captura inmovilizados como se ha mencionado anteriormente que pueden estar presenten en viales físicamente separados
5 para permitir un contacto separado con la primera y segunda porción de la solución. Además, el dispositivo puede comprender, en un aspecto, una unidad para la determinación de la cantidad de los complejos de detección. Dependiendo del tipo de anticuerpo de detección a usar, dicha unidad comprenderá un detector para las señales generadas por el anticuerpo de detección. Además, la unidad también puede comprender, en un aspecto, medios para la calibración, p. ej., un algoritmo informático, para comparar las señales medidas con los patrones de calibración con objeto de determinar las cantidades de los polipéptidos de neurotoxina presentes en una solución o parte de la misma. El dispositivo también comprenderá medios para calcular la cantidad de polipéptido neurotoxina maduro basándose en las cantidades del primer y segundo complejo de detección, p. ej., un algoritmo informático para llevar a cabo el cálculo.
Además, la invención se refiere a un equipo para llevar a cabo para la determinación de la cantidad de un
15 polipéptido neurotoxina clostridial tratado en una solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar, comprendiendo el equipo:
a) un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a la cadena ligera del polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de captura a dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado y sin tratar, formando de este modo un primer complejo de anticuerpo;
b) un anticuerpo de detección que se une específicamente a la cadena pesada de dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, sin tratar y parcialmente tratado en el primer complejo de anticuerpo, con lo que se forma un primer complejo de detección;
c) un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al enlazador de dicho polipéptido neurotoxina
25 clostridial parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de captura a dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar, en donde dicho segundo anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ. ID. nº: 1 a nº: 16, formando de este modo un segundo complejo de anticuerpos;
d) un anticuerpo de detección que es diferente del anticuerpo de detección en la etapa b) y que se une específicamente al complejo de anticuerpo formado en la etapa c), con lo cual se forma un segundo complejo de detección;
e) medios para calcular la cantidad de polipéptido neurotoxina clostridial tratado, en base a las cantidades del primer y segundo complejo de detección; y
35 f) instrucciones para llevar a cabo la formación de un primer complejo de anticuerpo, la formación de un segundo complejo de anticuerpo, la determinación de las cantidades del primer complejo de anticuerpo y del segundo complejo de anticuerpo y el cálculo de la cantidad de polipéptido neurotoxina clostridial tratado.
Además, la invención se refiere a un equipo para la determinación de la cantidad de un polipéptido neurotoxina clostridial tratado en una solución que comprende polipéptido neurotoxina clostridial tratado y polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar, comprendiendo el equipo:
a) un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a las cadenas pesadas del polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de captura a dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, parcialmente tratado y sin tratar, formando de este modo un primer complejo de anticuerpo;
45 b) un anticuerpo de detección que se une específicamente a las cadenas ligeras de dicho polipéptido neurotoxina clostridial tratado, sin tratar y parcialmente tratado en el primer complejo de anticuerpo, con lo que se forma un primer complejo de detección;
c) un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al enlazador de dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado y sin tratar en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de captura a dicho polipéptido neurotoxina clostridial parcialmente tratado o sin tratar, en donde dicho segundo anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo peptídico que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ. ID. nº: 1 a nº: 16, formando de este modo un segundo complejo de anticuerpos;
d) un anticuerpo de detección que es diferente del anticuerpo de detección en la etapa b) y que se une
55 específicamente al complejo de anticuerpo formado en la etapa c), con lo cual se forma un segundo complejo de detección;
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