KR20100020972A - 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 온도-안정한 근육 이완제를 제공하는 방법 - Google Patents

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카알 하인쯔 아이스엘레
헤롤드 파우. 테일러
마티아스 막스
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메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
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Abstract

본 발명은 근육 이완제 제공방법을 제공하며, 본 방법에서 상기 근육 이완제는 복합 단백질이 없는 보툴리늄 톡신의 신경독성분을 포함하는 재조합용액이며, 하기 특성 a) 내지 d) 중 하나 이상을 나타내며, 더욱 바람직하게는 모든 특성을 나타낸다: a) 20℃ 이상의 보관온도에서 안정하고, b) 보존제 및/또는 진통제 존재하에서 안정하며, c) "동결 및 해동" 사이클에 저항성을 나타내고, d) 다른 물질로 된 용기에 보관되는 경우에도 안정하다.
근육 이완제 제공, 보툴리늄 톡신, 보존제 및/또는 진통제, "동결 및 해동" 사이클

Description

보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 온도-안정한 근육 이완제를 제공하는 방법{PROCESS FOR PROVIDING A TEMPERATURE - STABLE MUSCLE RELAXANT ON THE BASIS OF THE NEUROTOXIC COMPONENT OF BOTULINUM TOXIN}
본 발명은 근육 이완제를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 상기 근육 이완제는 복합 단백질이 없는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액이며, 하기 특징을 하나 이상 나타내며, 특히 바람직하게는 a) 내지 d)의 모든 특징을 나타낸다:
a) 20℃ 이상의 보관온도에서 안정하다.
b) 보존제 및/또는 진통제 존재하에서 안정하다.
c) "동결 및 해동" 사이클에 저항적이다.
d) 다른 물질로 된 용기에 보관되는 경우에도 안정하다.
보툴리늄 톡신은 클로스트리듐 박테리아에 의해 생산된다. 7개의 항원적으로 구별되는 혈청형의 보툴리늄 톡신이 존재하며, 즉 보툴리늄 톡신 A, B, C, D, E, F 및 G가 존재한다. 보툴리늄 톡신은 일반적으로 용해된 클로스트리늄 배양으로부터 복합체의 형태로, 즉 보툴리늄 톡신의 독성을 나타내는 서브-유닛("신경독 성분"으로 지칭)이 다른 박테리아 단백질과 연합하여 톡신 복합체를 형성하여, 방출된다. 이 복합체의 분자량은 약 300,000 내지 900,000 Da으로 다양하다. 복합 단백질은 예를 들면 다양한 적혈구응집소(hemagglutinins)이다. 이 톡신 복합 단백질은 그 자체로는 독성이 없지만 신경독 성분을 안정화시키고, 보툴리늄 중독시 경구 독성을 나타내는 것으로 여겨진다. 톡신 복합체와는 달리, 어떠한 복합 클로스트리듐 단백질도 없는, 즉 분리되고 순수한 형태의 신경독 성분은 산에 불안정하며 위장관의 공격적인 환경에 저항성을 나타내지 못한다.
보툴리늄 톡신 복합체의 신경독 성분은 초기에는 단일 폴리펩타이드 사슬로 형성되며, 혈청형 A의 경우에는 약 150 kDa의 분자량를 갖는 단일 폴리펩타이드 사슬로 형성된다. 다른 혈청형에서는 박테리아 공급원에 따라 상기 신경독 성분이 약 145 내지 170 kDa로 다양한 분자량을 갖는 것으로 관찰되었다. 혈청형 A의 경우, 예컨대, 폴리펩타이드의 단백분해 가공으로 이황화 결합에 의해 연결되는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 이쇄 폴리펩타이드 형태로 활성화된 폴리펩타이드가 생성된다. 인간에서, 상기 중쇄는 전-시냅스 콜린성 신경 말단에의 결합 및 톡신의 세포내로의 내재화를 매개한다. 경쇄는 아연-엔도펩티다제로 기능하고 막융합에 관련된 특정 단백질(SNARE 복합체)를 분해함으로써 독성을 나타내는 것으로 보인다 (예를 들어, Montecucco C1 Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354)을 보라).
세포내로의 막 융합 과정을 방해함으로써, 보툴리늄 톡신은 아세틸콜린이 시 냅스 간극으로 방출되는 것을 방지한다. 신경-근 이음부에서 보툴리늄 톡신의 전체 효과는 신경-근 전달을 방해하고, 결과적으로 근육을 탈신경화시킨다. 보툴리늄 톡신은 또한 다른 말초 콜린성 시냅스에 활성을 나타내어, 침이나 땀의 감소를 유발한다.
"보툴리늄 톡신" 또는 "보툴리늄 톡신들"은 본 명세서에서 다른 클로스트리듐 단백질이 없는 신경독 성분을 지칭하며, 또한 "보툴리늄 톡신 복합체"를 지칭하기도 한다: "보툴리늄 톡신"은 본 명세서에서 톡신 복합체와 신경독 성분간의 구별이 필요하지 않거나 요망되지 않는 경우 사용된다. 복합체는 일반적으로, 부가적인 소위 "비독성" 단백질을 함유하며, 이는 "복합 단백질" 또는 "박테리아 단백질"로 지칭된다.
보툴리늄 톡신 복합체는 그 독성에도 불구하고 수많은 질병에 대한 치료제로서 사용되어왔다. 보툴리늄 톡신 혈청형 A는 미국에서 인간에 대해 1989년 사시, 눈꺼풀연축 및 기타 질병의 치료제로 승인되었다. 이는 상업적으로 보툴리늄 톡신 A 단백질 복합체, 예를 들면 상표명 보톡스®(알레간사) 또는 상표명 디스포트® (입센사)로 입수할 수 있다. 상기 복합체는 치료제로서 치료될 근육에 직접 주사된다. 생리적 pH에서 신경독 성분이 단백질 복합체로부터 방출되어 원하는 약학적 효과가 나타난다.
분리형 보툴리늄 톡신 혈청형 A의 신경독 성분을 포함하는 약학적 조성물은 독일의 메르쯔 제약사의 상표명 제오민(Xeomin)®으로 시판되고 있다. 보툴리늄 톡 신 A형 및 B형의 신경독 성분의 제조는 예를 들면, 국제특허출원 WO 00/74703 및 WO 2006/133818에 개시되어 있다.
보툴리늄 톡신에 기초한 의약품의 조성 및 용량, 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 의약품의 조성, 용량 및 투여빈도에 관해서는 PCT/EP2007/005754를 참조할 수 있다.
상기 언급한 기능 이외에도 상기 복합 단백질은, 특히 따뜻하거나 더운 기후 또는 여름 일반적으로 20℃ 이상의 온도에서의 보관이나 수송과 같은 단기간의 온도 스트레스가 주어졌을때 분해되거나 불활성화되기 쉬운 보툴리늄 톡신 복합체의 신경독 성분을 거친 환경 조건으로부터 보호하는 것으로 생각된다.
이러한 이유로 과거에는 보툴리늄 톡신 및 특히 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 의약품이 +4℃ 이상, 즉 20℃ 가까운 온도까지 올라가지 않도록 극도의 주의를 기울였다. 대부분의 경우, 보툴리늄 톡신을 포함하는 고형 건조 동결건조물 또는 이들의 재조합 용액을 포함하는 바이알은 약 -20℃에서 동결 하여(동결건조물) 얼음위에서 또는 최소한 냉장고(약 +4℃)에서 보관하였다. 따라서 냉각이 필요하였으며, 이는 의약품 제조에 있어 제조경비의 추가를 초래하였다.
또한 본 발명 이전의 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액은 상이한 온도 또는 수송 조건에 매우 불안정하였다. 또한 재조합 용액의 동결 및 해동은 단백질의 신속한 분해 및 불활성화를 초래하는 것으로 생각되었다. 따라서 의사들은 의약품의 투여 직전에야 비로소 단백질-동결건조물을 재조합하도록 권유되었으며, 전술한 바와 같이 이를 철저히 저온 보관하도록 권유되었다.
이와 같은 상황에서, 본 발명자는 재조합 용액 형태의 보툴리늄 톡신 기초 근육 이완제의 안정성에 대해, 상이한 환경 조건하에서 연구를 수행하였다:
a) 20℃ 이상의 온도에서의 보관,
b) 보존제 및/또는 진통제의 첨가,
c) "동결 및 해동" 사이클,
d) 다른 물질로 제조된 용기에서의 보관.
놀랍게도 복합 단백질이 존재하지 않는 보툴리늄 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액은 이러한 조건하에서 본 기술분야에서 예상된 것 보다 훨씬 안정하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초한 것이다.
본 발명은 근육 이완제를 제공하는 방법에 관한 것으로, 상기 근육 이완제는 복합 단백질이 없는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액이며, 하기 특징을 하나 이상 나타내며, 특히 바람직하게는 a) 내지 d)의 모든 특징을 나타낸다:
a) 20℃ 이상의 보관온도에서 안정하다.
b) 보존제 및/또는 진통제 존재하에서 안정하다.
c) "동결 및 해동" 사이클에 저항성을 나타낸다.
d) 다른 물질로 된 용기에 보관되는 경우에도 안정하다.
일 실시형태에서 본 발명은 30℃ 이상의 온도에서, 근육 이완제를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 근육 이완제는 복합 단백질이 없는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액이다.
다른 실시형태에서, 상기 제공은 보관 및/또는 수송을 포함하거나 또는 상기 근육 이완제 제조 방법내 단계이다. 또 다른 실시형태에서, 근육 이완제는 30℃ 이상, 70℃에 이르는 주변 온도에서 어떠한 냉각 장비없이 수송 또는 보관된다.
다른 실시형태에서 상기 근육 이완제에 "동결-해동" 사이클(freeze and thaw cycle)이 시행된다. 또 다른 실시형태에서 상기 "동결 및 해동" 사이클 횟수는 1 내지 20이다.
다른 실시형태에서 상기 근육 이완제는 보존제 및/또는 진통제 존재하에서 안정하다.
다른 실시형태에서 상기 재조합 용액은 플라스틱, 유리 또는 금속 또는 이들의 조합으로 된 용기에 보관된다.
다른 실시형태에서 상기 용액은 슈크로스 또는 인간 혈청 알부민 또는 이들 둘 다를 추가적으로 포함한다.
다른 실시형태에서 상기 용액은 동결방지제, 안정제, pH 버퍼, 슈크로즈 및 인간 혈청 알부민 이외의 부형제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가적으로 포함한다. 추가적인 실시형태에서 상기 신경독 성분은 보툴리늄 톡신 A형 신경독 성분이다.
본 발명은 +4℃ 이상, 바람직하게는 +6℃ 이상, 더욱 바람직하게는 +20℃ 이상의 온도에서 근육 이완제를 제공하는 방법에 관한 것으로, 상기 근육 이완제는 복합제가 없는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 재조합 용액이다. 본 발명에서 "제공"은 본 명세서에서 정의된 근육 이완제에 대한 모든 종류의 제공, 특히 보관, 수송 및/또는 상기 근육 이완제 제조내 단계를 포함한다. "제공"은 또한 상기 근육이완제가 냉동상태(즉 -20℃)의 온도에서 +4℃ 이상, 바람직하게는 +6℃ 이상, 더욱 바람직하게는 +20℃ 이상의 온도로의 상승에 놓여지는 단계들을 포함한다.
본 발명내에서, 모든 형태의 보툴리늄 톡신의 신경독 성분, 특히 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G를 포함하는 다양한 혈청형이 사용된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 혈청형 B의 보툴리늄 톡신의 신경독 성분은 8℃ 이상의 온도에서 제공된다. 다른 실시형태에서, 상기 혈청형 B의 보툴리늄 톡신의 신경독 성분은 30℃ 이상의 온도에서 제공된다. 이외에도, 돌연변이, 결실 등을 포함는 변경 또는 재조합 제조된 보툴리늄 톡신의 신경독 성분 또한 본 발명의 범위내에 속한다. 적절한 돌연변이에 대해서는 WO 2006/027207 A1 및 WO 2006/114308 A1, 및 EP 07014785.5을 참조할 수 있으며, 이들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 또한 본 발명 내에서, 다양한 혈청형의 혼합물(신경독 성분 형태 또는 재조합 형태 또는 이들 두 형태, 예를 들면 보툴리늄 신경독 A형 및 B형의 혼합물)이 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 화학적으로 변경된, 즉 페질화, 글리코실화, 설퍼화(sulfatation), 인산화, 특히 하나 이상의 표면 또는 용매 노출된 아미노산이 다른 방식으로 변경된 신경톡신을 포함한다.
일 실시형태에서 상기 화학탈신경화제는 클로스트리듐 신경독이다. 다른 실시형태에서, 이 클로스트리듐 신경독은 보툴리늄 톡신이다. 다른 실시형태에서 상기 보툴리늄 톡신은 항원적으로 구별되는 혈청형 A, B, C, D, E, F, 또는 G 보툴리늄 톡신이다. 보툴리늄 톡신 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G가 언급될 때, 상기 혈청형에 대한 기지 변종, 예컨대 혈청형 A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, D2, D3, E1, E2, E3, F1, F2, F3, 또한 G1, G2, G3도 포함된다. 일 실시형태에서 상기 보툴리늄 톡신은 보툴리늄 톡신 A이다.
다른 실시형태에서, 보툴리늄 톡신의 이소형, 호몰로그, 오르토로그 및 파라로그도 포함되며, 이들은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100%에 이르는 서열 동등성을 보인다. 이러한 서열 동등성은 신뢰할 만한 결과를 산출하기에 적합한 어떠한 알고리즘으로도 계산될 수 있으며, 예를 들면 FASTA 알고리즘을 사용한다(W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448).
보툴리늄 톡신은 용해된 클로스트리듐 배양으로부터 방출되었을 때 일반적으로 다른 박테리아 단백질과 연합되어 톡신 복합체를 형성한다. 추가적인 실시형태에서, 상기 보툴리늄 톡신은 다른 복합 단백질이 없으며, 예를 들면 순수한 신경독 혈청형 A이다. 이 이외에도 돌연변이, 결실 등을 포함는 변경 또는 재조합 제조된 보툴리늄 톡신의 신경독 성분 또한 본 발명의 범위내에 속한다. 적절한 돌연변이에 대해서는 WO 2006/027207 A1 및 WO 2006/114308 A1 및 EP 07014785.5(메르쯔에 의한 특허출원, 2007년 7월 27일 출원)을 참조할 수 있으며, 이들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 또한 본 발명 내에서, 다양한 혈청형의 혼합물(신경독 성분 형태 또는 재조합 형태 또는 이들 두 형태, 예를 들면 보툴리늄 신경독 A형 및 B형의 혼합물)이 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 화학적으로 변경된, 즉 페질화, 글리코실화, 설퍼화, 인산화, 특히 하나 이상의 표면 또는 용매 노출된 아미노산이 다른 방식으로 변경된 신경톡신 또한 포함한다.
보툴리늄 톡신 복합체의 신경독성 서브유닛은 여기에서 "신경독 성분" 또는 "복합 단백질이 없는 신경독 성분"으로 지칭된다. "신경독 성분"은 또한 다른 혈청형 클로스트리듐 보툴리늄에서 발견되는 기능적 호몰로그도 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 신경독 성분은 다른 C. 보툴리늄 단백질이 없으며, 다른 실시형태에서는 신경독 성분과 연합해 있을 가능성이 높은 RNA 또한 없다. 신경독 성분은 약 15OkDa의 단쇄 전구체 단백질이거나 또는 약 5OkDa의 경쇄(Lc) 및 약 10OkDa의 중쇄(Hc)를 포함하며 이들이 하나 이상의 이황화 결합으로 연결되어 있는 단백분해가공된 신경독 성분일 수 있다(리뷰를 위해서 예컨대 Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93를 참조하라).
본 발명에서, 모든 형태의 보툴리늄 톡신, 특히 다양한 혈청형, 다양한 보툴리늄 톡신의 신경독 성분 및 그 수반 복합 단백질의 복합체 및 이들 보툴리늄 톡신의 신경독 성분이 사용된다. 이외에 돌연변이 결실등을 포함하는 변경 및/또는 재조합 제조된 보툴리늄 톡신 또는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분 또한 본 발명에 포함된다. 적합한 돌연변이에 대해서는 WO 2006/027207 A1를 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 전체가 삽입된다. 또한 본 발명내에서, 다양한 혈청형 혼합물(복합체 형태, 신경독 성분 및/또는 재조합 형태), 예를 들면 보툴리늄 톡신 타입 A 및 B의 혼합물 또는 보툴리늄 신경독 타입 A 및 B의 혼합물 또한 사용된다.
본 발명의 교시에 따라 의약품은 신경독 성분 이외의 보툴리늄 톡신에서 발견되는 어떠한 단백질도 포함하지 않을 수 있다. 신경독 성분의 전구체는 분해되거나 분해되지 않을 수 있으며, 그러나, 일 실시형태에서 상기 전구체는 중쇄 및 경쇄로 분해된다. 지적되는 바와 같이 폴리펩타이드는 야생형 서열이거나 또는 하나 이상의 잔기에서 변경될 수 있다. 변경은 화학적 변경, 예컨대, 페질화, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 아미드화 등을 포함하며, 이들은 폴리펩타이드의 흡수 또는 안정성에 유익할 수 있다. 신경독 성분의 폴리펩타이드 사슬은 그러나 교대로 또는 부가적으로, 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가, 치환 또는 결실로 변경될 수 있다.
전술된 신경독 성분은 조성물 또는 약학적 조성물의 일부일 수 있다. 여기에 사용되는 약학적 조성물은 예를 들면 단독 활성 성분으로서 신경독 성분의 형태로 보툴리늄 톡신을 포함하거나 또는 추가적인 약학적 활성 성분, 예를 들면 히알루론산 및/또는 폴리비닐피롤리돈 및/또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있으며, 이들 조성물은 임의로 적합한 pH 버퍼, 특히 소듐 아세테이트 버퍼로 pH 안정화되며, 및/또는 동결건조제 폴리알콜을 포함할 수 있다.
"약학적 조성물"은 의약품 또는 진단제로서 사용되기 위한 활성 성분이 포함되거나 함유되어 있는 포물레이션이다. 이러한 약학적 조성물은 환자에 진단 또는 치료를 위한 투여에 적합하다(즉 근육 또는 피하주사).
본 발명의 일 실시형태에서, 조성물은 신경독 성분 및 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있으며, 이들 조성물은 적합한 pH 버퍼, 특히 소듐 아세테이트 버퍼로 pH 안정화되며, 및/또는 동결방지제 폴리알콜을 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 조성물은 보툴리늄 톡신 타입 A의 신경독 성분을 포함한다. 상기 조성물은 보툴리늄 톡신의 신경독 성분의 재조합 용액이다. 바람직하게 상기 조성물은 추가적으로 슈크로즈 또는 인간 혈청 알부민 또는 이들 모두, 더욱 바람직하게는 슈크로즈에 대한 인간 혈청 알부민을 약 1:5의 비율로 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 제오민®이다. 더욱 바람직하게, 상기 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 또는 상기 조성물은 인간 혈청 알부민과 같은 포유류에서 유래한 단백질이 없다. 이러한 용액은 혈청 알부민을 다른 비단백질성 안정제(인프라)로 대체함으로써 충분한 신경독 안정성을 제공한다.
상기 조성물은 pH 버퍼, 부형제, 동결방지제, 보존제, 진통제, 안정제 또는 이들의 조합물과 같은 부가적인 성분을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서 신경독 성분은 히알루론산 안정제 또는 폴리비닐피롤리돈 안정제 또는 폴리에틸렌글리콜 안정제 또는 이들의 어떠한 조합과도 함께 포뮬레이션될 수 있다. 부가적으로, 상기 조성물은 소듐 아세테이트 버퍼 시스템 또는 알콜 동결방지제 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 포뮬레이션은 알부민이 없고, 안정제로서 히알루론산, 폴리비닐피롤리돈(Kollidon®) 및/또는 하이드록시에틸 전분 및/또는 알지네이트 및/또는 이들 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 상기 바람직한 조성물은 전술된 안정제이외에 물 및 하나 이상의 폴리알콜, 바람직하게는 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 신경독 성분은 신경독 성분 1 ng당 마우스 LD50 어세이에 의해 결정되는 50 내지 250 LD50 단위의 생물학적 활성을 가진다. 다른 실시형태에서, 신경독 성분은 약 150 LD50 단위의 생물학적 활성을 가진다. 여기 단위는 나노그람당 단위로 지칭된다. 일반적으로 본 발명의 약학적 조성물은 약 6 pg 내지 30 ng의 신경독 성분을 포함한다.
분리형 보툴리늄 톡신 타입 A 신경독 성분을 포함하는 약학적 조성물은 독일에서 상표명 제오민®으로 메르쯔 제약에 의해 시판되고 있다. 보툴리늄 톡신 타입 A 및 B 신경독 성분의 제조는 예를 들면 국제특허출원 WO 00/74703 및 WO 2006/133818에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 상기 조성물은 보툴리늄 톡신 타입 A의 신경독 성분을 포함한다. 상기 조성물은 보툴리늄 톡신의 신경독 성분의 재조합 용액이다. 다른 실시형태에서, 조성물은 추가적으로 슈크로스나 인간 혈청 알부민 또는 이들 모두를 포함하며, 또 다른 실시형태에서 슈크로스에 대한 인간 혈청 알부민 비율은 약 1:5이다. 일 실시형태에서 상기 조성물은 제오민®이다. 다른 실시형태에서, 상기 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 또는 상기 조성물은 인간 혈청 알부민과 같은 포유류 유래 단백질이 없는 것이다. 이들 용액들은 다른 비단백질성 안정제(infra)로 혈청 알부민을 대체함으로써 충분한 신경독 안정성을 제공할 수 있다.
보툴리늄 톡신에 기초한 의약품의 조성 및용량, 및 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 의약품의 조성, 용량 및 투여빈도는 PCT/EP2007/005754를 참조할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 동결건조 또는 진공 건조되거나, 재조합되거나 또는 용액화할 수 있다. 재조합되는 경우, 일 실시형태에서, 재조합 용액은 멸균 생리식염수(0.9% NaCl)를 첨가하여 제조된다.
이러한 조성물은 부가적인 부형제를 포함할 수 있다. "부형제"는 약학적 조성물에 존재하는 활성 약학적 성분을 제외한 나머지 약학적 조성물내 존재하는 물질을 지칭한다. 부형제는 버퍼, 담체, 항부착제, 바인더, 붕해제, 충전제, 희석제, 보존제, 비히클, 사이클로덱스트린 및/또는 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 소듐 클로라이드와 같은 벌크제 등이다. 다른 실시형태에서 상기 부형제는 진통제, 동결방지제 및/또는 안정제일 수 있다.
"pH 버퍼"는 조성물, 용액 등의 pH값을 특정 값 또는 특정 pH 범위로 조절할 수 있는 화학물질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 이 pH 범위는 pH 5 내지 pH 8, 예컨대 pH 7 내지 pH 8, 또는 7.2 내지 7.6, 또는 pH 7.4이다. 전술한 pH 범위는 단지 전형적인 예에 불과하며, 실제 pH는 주어진 값 사이의 어떠한 범위도 포함할 수 있다. 본 발명의 교시에 따른 적합한 버퍼는 예컨대, 소듐-포스페이트 버퍼, 소듐-아세테이트 버퍼, TRIS 버퍼 또는 상기 pH-범위내로 조정하기에 적합한 모든 버퍼이다.
일 실시형태에서, 조성물은 1-100 mM의 소듐 아세테이트 버퍼, 다른 실시형태에서는 10 mM의 소듐 아세테이트 버퍼를 포함한다.
전술한 pH 범위는 단지 전형적인 예에 불과하며, 실제 pH는 주어진 값 사이의 어떠한 범위도 포함할 수 있다. 본 발명의 교시에 따른 적합한 버퍼는 예컨대, 소듐-포스페이트 버퍼, 소듐-아세테이트 버퍼, TRIS 버퍼 또는 상기 pH-범위내로 조정하기에 적합한 모든 버퍼이다.
"안정시키는", "안정하는" 또는 "안정화"는 재조합 또는 수성용액 약학적 조성물 내 신경독 성분이, 상기 약학적 조성물내 포함되기 전에 상기 생물학적으로 활성인 신경독 성분이 가졌던 독성의 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 약 100% 까지 갖는 것을 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 신경독 성분은 활성 성분으로 지칭된다.
이러한 안정화제의 예로는 젤라틴 또는 알부민이며, 일 실시형태에서는 인간 기원이거나 재조합 공급원에서 유래된다. 비인간 또는 비동물 공급원에서 유래된 단백질도 포함될 수 있다. 안정화제는 화학적으로 또는 재조합 유전학에 의해 변경될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 이노시톨, 만니톨과 같은 알콜을, 동결건조되는 동안 단백질을 안정시키기 위한 동결방지용 부형제로 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 안정화제는 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 조합을 포함하는 비단백성 안정화제일 수 있다. 다른 실시형태에서 상기 안정화제는 Kollidon®, 하이드록시에틸 전분 및/또는 알지네이트이다. 이 조성물은 임의로 적합한 pH 버퍼, 특히 소듐 아세테이트 버퍼로 pH 안정화되거나 또는 동결방지제를 포함할 수 있으며, 또는 이들 둘다 시행될 수 있다. 본 조성물은 전술한 안정화제 이외에 물 및 하나 이상의 폴리알콜, 예를 들면 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한 글루코스, 슈크로스 또는 프락토스와 같은 모노-, 디- 또는 고차 폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 본 조성물은 현저한 안정성을 갖는 보다 안전한 조성물로 여겨진다.
히알루론산은 일 실시형태에서 상기 신경독 성분과 조합되며, 200 U/ml 보툴리늄 톡신 용액 1 ml 당 0.1 내지 10 mg, 특히 1 mg의 히알루론산의 용량으로 조합된다.
본 조성물에서 폴리비닐피롤리돈은 존재하는 경우, 200 U/ml 보툴리늄 톡신 용액내 신경독 구성성분 1 ml 당 10 내지 500 mg, 특히 100 mg의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 재조합 용액이 제공되는 양으로 신경독 성분과 조합된다. 다른 실시형태에서 재조합은 8 ml 용액에 까지 수행된다. 이로써 25 U/ml 신경독 성분 용액 1 ml 당 폴리비닐피롤리돈의 농도가 12.5 mg까지 이르도록 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 생성되는 용액은 또한 1-100 mM, 특히 10 mM 소듐 아세테이트 버퍼를 함유한다. 이 성분의 비율은 경우에 따라 낮은 농도로 25U/ml 신경독 성분 용액에 적용된다.
본 약학적 조성물내 폴리에틸렌글리콜은 일 실시형태에서, 200 U/ml 보툴리늄 톡신 용액 1 ml 당 10 내지 500 mg, 특히 100 mg의 폴리에틸렌글리콜의 양으로 신경독 성분과 조합된다. 다른 실시형태에서 상기 용액은 또한 1-100 mM, 특히 10 mM 소듐 아세테이트 버퍼를 함유한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일 실시형태에서, 약 +30℃ 내지 -20℃의 온도에서 보관시, 6개월, 1년, 2년, 3년 및/또는 4년동안 실질적으로 그 역가가 변하지 않고 보유된다. 또한 상기 약학적 조성물은 재조합시 약 20% 내지 100%의 역가 또는 퍼센트 회수를 나타낸다.
"동결방지제"는 약학적 조성물내 생물학적으로 활성인 신경독 성분이 동결건조되기 전에 가졌던 독성의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 및 약 100%에 이르는 독성을 갖는 재조합 또는 수성 용액 약학적 조성물내 신경독 성분을 결과하는 부형제를 지칭한다.
다른 실시형태에서, 조성물은 동결방지제로, 폴리알콜과 같은 폴리하이드록시 화합물을 함유할 수 있다. 사용가능한 폴리알콜의 예로는 이노시톨, 만니톨 및 기타 비환원성 알콜을 포함한다. 이 조성물의 일부 실시형태에서는 단백성 안정제를 포함하지 않거나, 가끔 동결방지제로서 사용되는 트레할로스 또는 말토트리오스 또는 락토스 또는 슈크로스 또는 관련 당 또는 탄수화물을 포함하지 않는다.
"보존제" 및 "보존제들"은 각각 상기 조성물내 미생물, 곤충, 박테리아 또는 기타 오염성 유기체의 성장 또는 생존을 방지하는 물질 또는 물질 그룹을 지칭한다. 보존제는 또한 상기 조성물이 원하지 않는 화학적 변경이 일어나는 것을 방지한다. 본 발명의 범위내 사용될 수 있는 보존제는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있는 모든 보존제들이다. 보존제들은 또한 상기 조성물이 원하지 않게 화학적으로 변경되는 것을 방지한다. 본 발명의 범위내 사용될 수 있는 보존제는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있는 모든 보존제이다. 사용가능한 보존제의 예로는 그 중에서도 특히, 예컨대 벤질 알콜, 벤조산, 벤잘코늄 클로라이드, 칼슘 프로피오네이트, 소듐 니트레이트, 소듐 니트라이트, 설파이트(설퍼 디옥사이드, 소듐 비설파이트, 포타슘 하이드로겐 설파이트 등), 디소듐 EDTA, 포름알데하이드, 글루타알데하이드, 규조토, 에탄올, 메틸 클로로이소티아졸리논, 부틸레이트 하이드록시아니솔 및/또는 부틸레이트 하이드록시톨루엔을 들 수 있다.
"진통제"는 말초 및 중추신경계에 다양한 방식으로 작용하는 진통제에 관한 것이며, 이중 파라세타몰®(아세트아미노펜), 살리실레이트와 같은 비소염성 항염증약(NSAIDs), 모르핀과 같은 마약, 트라마돌®과 같은 마약성을 갖는 합성약 등을 포함한다. 또한 리도카인, 벤질알콜, 벤조산 등과 같은 국소 진통작용을 갖는 화합물을 포함한다.
일 실시형태에서 상기 진통제는 조성물 중 일부이고, 다른 실시형태에서 상기 진통제는 화학적 탈신경제(chemodenervating agent) 처리 전, 중 또는 후에 투여된다.
"동결건조"는 본 명세서에서 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 함유하는 용액의 처리에 사용되며, 상기 용액을 얼리고, 조성의 단지 고형 성분만이 남겨질때 까지 건조한다. 이 처리의 동결건조된 산물은 따라서 "동결건조물"로 지칭된다.
본 명세서에서, "재조합(reconstitution)"은 상기 동결건조된 신경독 성분 조성물의 용해화 과정을 정의한 것이다. 이는 모든 필요한 성분들이 동결건조물내 이미 함유되어 있는 경우, 적량의 멸균수를 가함으로써 시행된다. 또는 그렇지 않은 경우, 멸균 식염용액 단독, 또는 필요한 경우 예컨대 pH 버퍼, 부형제, 동결방지제, 보존제, 진통 안정제 또는 이들의 조합을 포함하는 성분을 첨가하여 가함으로써 시행된다. 전술한 "식염 용액"의 식염은 염-용액, 더욱 바람직하게는 소듐-클로라이드(NaCl) 용액, 더욱 바람직하게는 소듐-클로라이드 등장 용액(즉, 소듐-클로라이드 농도 0.9%)이다. 용해화는 최종 "재조합"이 직접 또는 간접적으로, 즉 희석후 환자에게 투여가능한 방식으로 수행된다. 바람직하게, 신경독은 등장 매질내에서 재조합된다. 더욱 바람직하게 등장 식염용액내에서, 더욱 바람직하게 상기 식염용액은 멸균 식염용액이다.
"동결-및-해동 사이클(freeze-and-thaw cycle)"은 본 명세서에서, 재조합 용액의 동결 및 해동 과정을 지칭한다. "동결" 과정은 재조합된 용액을 0℃ 이하 예컨대 바람직하게 -20℃(정상 동결온도), 더욱 바람직하게 -80℃(드라이아이스 온도) 또는 그 이하에서 저장하는 것을 정의한다. "해동"은 0℃ 이상, 바람직하게 4℃, 더욱 바람직하게 +20℃, 가장 바람직하게 +25, +30, +40℃에서 보관하는 것을 의미하나 50℃를 초과하지는 않는다. 동결 및 해동 및 그 후 통상적이고 예시적인 보관 기간은 1분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 3주, 1달, 2달, 3달(90일)까지이다. "동결-및-해동 사이클"은 또한 연속 방식으로 후속되는 냉각 및 (재)가열 사이클을 포함한다. 전술한 기간은 오직 전형적인 예에 불과하며 실제 기간은 더 길거나 더 짧거나 또는 상기 값 사이의 어떤 범위도 포함할 수 있다. 한 "동결-및-해동 사이클"은 상기 조건하에서 하나의 동결 및 해동 단계를 의미한다. 복수의 "동결-및-해동 사이클", 즉 "동결-및-해동 사이클들"은 상기 재조합 용액으로 한 "동결-및-해동 사이클"을 동일하거나 상이한 시간 간격 및 온도로 상기 언급한 범위대로 시행하는 것을 반복하는 것이다. 이러한 반복은 2회 이상, 바람직하게는 3회 또는 4회 이상, 더욱 바람직하게는 5회, 6회, 7회 이상, 보다 바람직하게는 8회, 9회 또는 10회이상이며, 단 20회를 초과하지는 않는다.
"용기"는 바이알과 같은 용기, 주사기, 플라스크 또는 상기 조성물이 보관 또는 수송될 수 있는 모든 종류의 용기를 말한다. 용기 벽은 상기 조성물과 직접 접촉하며, 모든 종류의 유리, 플라스틱, 금속, 세라믹 또는 이들의 조합으로 구성된 물질, 또는 재조합 용액을 기밀하게 유지할 수 있는 물질로 구성된다.
"실온"은 본 명세서에서, +20℃ 내지 +25℃, 더욱 바람직하게는 +20℃, +21℃, +22℃, +23℃, +24℃ 또는 +25℃이며, 이들 사이의 어떠한 값이어도 좋다.
"부형제"는 본 명세서에서 본 약학적 조성물에 존재하는 활성 약학적 성분을 제외한 약학적 조성물내 존재하는 물질을 지칭한다. 부형제는 버퍼, 담체, 항부착제, 바인더, 붕해제, 충전제, 희석제, 보존제, 비히클, 사이클로덱스트린 및/또는 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 소듐 클로라이드와 같은 벌크제 등이다.
"냉각 장비"는 주변 온도 이하로 조성물의 온도를 감소시킬 수 있는 장비를 말한다. 바람직하게 상기 "냉각 장비"는 주변 온도 이하의 안정한 온도, 통상 약 6℃, 어떤 경우에는 그 이하로 낮출 수 있다.
통상 상기 언급된 근 이완제의 제공은 보관 또는 수송 또는 이들 모두의 단계를 포함하거나, 또는 상기 근육 이완제 제조 단계 중, 각각, 상승된 온도에서의 일 단계이며, 더욱 바람직하게는 보툴리늄 톡신의 신경독 성분을 포함하는 단백질이 동결건조되고 재조합된 후 수행되는 단계이다. "상승된 온도"는 +6℃ 이상, 바람직하게는 +20℃ 이상, 더욱 바람직하게는 +30℃ 이상을 의미한다. "+6℃ 이상"은 예를 들면 +7℃, +8℃, +9℃, +10℃, +11℃, +12℃, +13℃, +14℃, +15℃, +16℃, +17℃, +18℃, +19℃ 및 그 이상을 의미하나, 7O℃를 초과하지는 않는다. "+20℃ 이상"은 예를 들면, +21℃, +22℃, +23℃, +24℃, +25℃, +26℃, +27℃, +28℃, +29℃ 또는 +30℃를 의미한다. "+30℃ 이상"은 예를 들면 +31℃, +32℃, +33℃, +34℃, +35℃, +36℃, +37℃, +38℃, +39℃ 또는 +40℃를 의미한다. 바람직하게 상기 근육 이완제는 +70℃ 이상의 온도에서 보관되지 않는다. 어떤 경우에는, 예를 들면 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 근육 이완제가 0℃ 이하에서 보관되는 환경인 경우, "상승된 온도"는 0℃ 이상, 바람직하게는 +4℃ 이상, 더욱 바람직하게는 각각 +6℃, +20℃ 및 +3O℃ 이상의 상기 언급된 온도 범위의 온도를 말한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 근육 이완제는 +6℃ 이상 및 +40℃ 이하의 온도에서 14일 이내의 기간동안 놓여진다. 본 기술분야의 당업자라면 자명하게 인식할 수 있을 터이지만, 근육 이완제가 각 온도에 대해 놓여지는 기간은 수분에서 14일 이내 어떤 시간 간격일 수 있다. 통상, 이러한 근육 이완제의 제공 환경, 특히 보관 또는 수송 또는 이들 양자에 소요되는 시간을 고려하면, 상기 기간은 10분 이상일 것이다. 특히 수송전 및 보관전 이들 근육 이완제가 더운 기후에서, 예컨대 공항이나 거리에서 직사광하에 놓여지는 경우, 이러한 짧은 시간도 매우 중요하다. 본 발명의 전형적인 기간은 따라서, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 3주, 1달, 2달, 3달(90일)까지이다. 그럼에도 불구하고, 상기 언급한 기간은 단지 예시에 불과하며 실제 기간은 더 짧거나 길거나 또는 주어진 값 사이의 어떤 간격도 포함할 수 있다.
본 근 이완제가 겪게 되는 온도는 통상 그 하한이 20℃ 이상이다. 본 명세서에서 전술한 온도 및 온도 범위에 대해, 본 기술분야의 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 근 이완제/조성물이 겪게 되는 온도의 상한은 바람직하게 70℃를 초과하지 않는다. 즉 본 근육 이완제가 겪게되는 온도는 20℃ 이상, 70℃ 까지의 범위이다. 따라서 본 발명내에서 본 근육 이완제는 각각 20℃ 이상, 또는 25℃ 이상, 또는 30℃ 이상, 또는 35℃ 이상, 또는 40℃ 이상, 또는 45℃ 이상, 또는 50℃ 이상, 또는 60℃ 이상, 또는 65℃ 이상, 또는 70℃ 까지의 온도에 놓여질 수 있다. 또한 상기 20℃ 이상, 70℃ 까지 및 각 온도 간격내 존재하는 특정 온도는 본 근 이완제가 제공, 바람직하게 수송 또는 보관되거나 양자가 이루어지는 환경의 결과물이며, 본 발명내에 속한다.
하기 온도 및 시간 간격은 본 발명의 바람직한 실시형태이다. 제1 실시형태에 따르면, 근 이완제는 +30℃ 이상, +70℃ 까지의 온도에서 90일 이하, 더욱 바람직하게는 +30℃ 이상, +70℃ 까지의 온도에서 10분 내지 14일간, 더욱 바람직하게는 +40℃ 내지 60℃ 까지의 온도에서 10분 내지 90일 까지의 기간이다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, 상기 기간은 10분 내지 30일이며, 온도는 30℃ 이상 70℃까지, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 60℃이다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, 가장 극한 조건을 나타내는 실시형태로, 온도는 65℃ 내지 70℃의 범위이고, 상기 온도에 본 근 이완제가 놓여지는 기간은 10분 내지 90일, 바람직하게는 10분 내지 3일이다.
실험 결과는 용액이 노출된 표면은 본 발명의 재조합 신경독의 안정성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었다. 따라서 본 발명의 재조합 조성물은 다양한 용기 또는 저장용기에 보관될 수 있다. 따라서 이러한 용기 또는 저장용기의 표면은 어떠한 종류의 플라스틱, 금속, 유리 등으로 제조될 수 있다.
본 발명이 기초한 발견 덕분에, 이제는 전술한 근 이완제를 인위적인 냉각 장치를 사용하지 않고도 제공할 수 있게 되었다. 이러한 발견은 이러한 근 이완제의 수송 또는 보관 또는 이들 양자 모두를 수행하는데 특히 중요하다. 또한 본 발명은 습도 상승과 함께 온도가 상승된 환경에서 특히 의미가 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하며, 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 폴리에틸렌 용기내 4℃ 보관이, 보존제 존재 또는 비존재하에 식염용 액에 재조합된 제오민® 및 보톡스®의 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 고무 스토퍼를 갖고 있는 폴리에틸렌 주사기내 4℃ 보관이, 보존제 존재 또는 비존재 식염 용액에 재조합된 제오민® 및 보톡스®의 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 반복된 동결 및 해동이 재조합 제오민®의 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
하기 실시예들은 상업적으로 시판되는 제품 제오민®으로 수행하였다. 제오민®은 활성 성분으로서 보툴리늄 신경독소 타입 A (150 kDa)를 포함하는 동결건조된 분말이다. 이 톡신은 홈이 있는 이중쇄 형태로 존재하며, 즉 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 상기 톡신은 클로스트리듐 보툴리늄 배양액(균주 ATCC 3205)에서 수득하였다. 어떠한 복합 단백질도 포함하지 않는 정도로 정제하였다. 제오민®은 추가적으로 인간 혈청 알부민 및 슈크로즈를 포함한다.
제오민®의 안정성을 평가하기 위해, 생화학적 활성을 마우스 반횡격막어세이(HDA)로 분석하였다. 이 어세이에서, 쥐 횡격 신경 및 상응하는 횡격막 근육 부분으로 구성되는 신경 근육 제제를 힘 측정 장치에 고정하였다. 손상되지 않은 횡 격 신경을 신경 및 횡격막을 자극시키는데 사용되는 두 전극과 연결하였다. 이 조성을 HDA 버퍼 용액을 함유하는 톡신에 적시고 신경을 전기 자극으로 주기적으로 자극하였다(주파수 1 Hz, 자극 지속시간 0.1 ms, 자극 전류 진폭 5-50 mA).
이 간접적으로 자극된 근육의 수축 반응을 이소메트릭 변환기를 사용하여 측정하였다. 시그날을 증폭하고 개인 컴퓨터에 장착한 시판 소프트웨어 VitroDatWin 3.4을 사용하여 문서화하였다. 시간이 경과함에 따른 근육 수축 반응은, 보툴리늄 톡신 존재시, 수축력이 지수적으로 감소하는 것을 관찰 할 수 있다. 이러한 특징적인 감소를 소위 마비 시간으로 지칭한다. 마비시간은 "톡신 샘플의 첨가" 및 "최대 수축력의 반을 나타내는" 시점간의 시간으로 정의하며, 이는 장기 배쓰(organ bath)의 톡신 농도에 비례한다.
상기 방법은 보툴리늄 톡신 활성 테스트를 위한 유럽 약전에 기재된 요건에 따라 수행되었다.
실시예 1 "실온에서의 보관"
제오민® 재조합 식염 용액을 플라스틱 주사기에 넣고 실온(+23℃)에서 9일간 보관하였다. 상기 샘플의 활성을 활성 측정전 즉시 재조합한(2시간 이내) 대조와 비교하였다. 샘플군과 대조간에 유의성있는 단백질활성의 감소가 관찰되지 않았다.
실시예 2 "플라스틱 용기내 보관"
식염용액내 재조합 보툴리늄 신경독소 NT201을 다양한 플라스틱 용기내 넣었다(이하 표 1 참조). 또한 재조합 톡신을 각각 플라스틱 용기 및 주사기에 넣고 14일 까지 상이한 기간 동안 보관한 후 활성을 측정하였다. 어떤 경우에도 유의성있는 단백질활성의 감소는 관찰되지 않았다.
[표 1]
Figure 112009077951192-PCT00001
100 MLD ("메디안 치사용량" 또는 LD50 단위)의 톡신을 함유하는 동결건조된 NT201 분말은 적용전에 식염용액에서 재조합되었다.
보툴리늄 신경독소의 활성에 플라스틱 물질이 미치는 영향을 시험하기 위해, 그 재조합 식염 용액을 상기 목록의 바늘들, 어댑터 및 스토퍼를 사용한 다양한 주사기에 넣어 적용하고, 장기 배쓰(마우스 반횡격막 어세이에 의한 활성 측정이 수행되는 관)에 근육주사의 의학적 과정을 시뮬레이션하기 위해 통상적인 주사방법을 사용하여 적용하였다.
또한 재조합 톡신을 활성 측정전 각각 플라스틱 용기 주사기내에서 14일 까지 상이한 기간동안 보관하였다.
실험은 최대수의 다양한 변수를 연구하고 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 3개의 독립적인 시리즈로 수행하였으며, 자세한 사항은 후술하였다.
식염 분취량은 피펫으로 직접(시리즈 1) 또는 20G 바늘을 사용한 3 ml 주사기로(BD #300910 및 BD #301300; 시리즈 2) 또는 20G 바늘을 사용한 5 ml 주사기로(B. Braun #4617053V 및 #4665503; 시리즈 3), 통상의 의학적 실무에 따라 채취하였다(시리즈 2 및 3).
소량의 샘플 부피 정확성을 보증하기 위해, 요구량이 0.5 ml 이하인 경우에는 식염 용액은 중간 보관을 위해 원심튜브내에 주입하였다. 이 경우, 이후 피펫을 이용하여 원하는 부피만큼 전달하였다.
시리즈 1 & 3: 10개의 바이알을 얇은 바늘을 사용하여 조심스럽게 공기를 공급하고 개봉하였다. 식염수(1.0 ml)를 제1 바이알내 피펫팅하였다. 조심스럽게 혼합하여 펠렛을 완전히 녹인 후, 용액을 제2 바이알에 이송하였다. 이런 식으로 제1 바이알에서 다음 바이알로, 마지막 바이알 즉 제10 바이알에 까지 이송하였다. 이후, 제1 바이알에 1.0 ml 식염용액을 가하고 전술한 과정으로 순서대로 바이알을 세척하여 잔여 샘플을 수거하여 최종적으로 양 톡신 용액을 합하였다.
이렇게 합한 용액(2.0 ml)은 0.2 ml 용액당 보툴리늄 신경독소 풀(pool) 약 100 MLD에 해당한다. 후속하여 주사기로 조작시에는 상기 풀 0.2 ml 분취량을 마이크로튜브에 피펫팅하여 정확한 부피가 보증되도록 하였다.
시리즈 2: 정확히 2.5 ml 식염용액을 20G 바늘을 갖는 3 ml 주사기(BD #300910 및 BD #301300)에 넣고 보툴리늄 신경독소를 함유하는 5개의 바이알에 각각 0.5 ml씩 주입하였다. 상기 바이알은 전체 펠렛이 용해될 때까지 조심스럽게 혼합하였다. 얇은 바늘로 바이알에 공기를 공급한 후, 재조합 톡신을 21 G 바늘을 갖는 10 ml 주사기에 넣었다(BD #300912 및 BD #301155). 공기는 전체 부피 10 ml이 되도록 주사기내 넣고, 스토퍼(#394075)로 주사기를 밀봉하였다. 이후 상기 주사위를 조심스럽게 회전하여 톡신 용액과 전체 주사기 내부표면이 접촉하도록 하였다.
대조 샘플 풀은 5개의 바이알 각각에 대해 0.2 ml 대신 0.5 ml의 식염용액을 사용하는 것을 제외하고는 전술한 대로 제조하였다.
실험은 세개의 상이한 보툴리늄 톡신 풀로 세 블록으로 수행하였다. 각 경우 100 MLD 의 보툴리늄 톡신에 상응하는 샘플당 0.2 ml (시리즈 1 및 3) 또는 0.5 ml (시리즈 2) 보툴리늄 신경독소 풀을 사용하였다. 상기 부피를 마이크로튜브에 충전한후 주사기에 넣거나 또는 바로 크리오바이알(cryovial)에 보관하였다.
시리즈 1: 제1 실험에서, 보툴리늄 신경독소 풀 분취량을 크리오바이알 또는 26 G 바늘을 갖는 1ml 주사기(BD #309602, US판, 및 B. Braun #4657683)에 넣어 냉장고에서 각각 7일 및 14일간 보관하였다.
상기 톡신 분취량(0.2 ml = 100 MLD)을 준비된 3.6 ml HDA 버퍼 함유 반횡격막 장기 배쓰(이글스 밸랜스 염 용액+ 0.1 % 인간 혈청 알부민)내에 피펫팅 및 주입하여 톡신 활성 측정을 시작하였다. 0.2 ml의 신선한 식염용액을 주사기에 넣어 잔여 톡신 용액을 헹구어 이를 장기 배쓰에 주입하였다. 마이크로튜브 또한 피펫을 사용하여 0.2 ml의 신선한 식염 용액으로 헹구었다.
시리즈 2: 제2 시리즈는 벡톤 디킨손(BD)사의 수개의 상이한 주사 물질을 사용하여 시행하였다.
대조 풀은 활성 측정전에 즉시 사용하거나 또는 얼음상에 마이크로튜브내에 최대 1시간 동안 보관하였다.
전술한 보툴리늄 신경독소 풀은 4℃ 내지 8℃에서 폐쇄된 10 ml 주사기내에 각각 1시간, 3일 및 5일간 보관되었다. 암/암 어댑터(BD #300013 및 B. Brown #5206634)를 통해 1 ml 주사기를 10 ml 보관 주사기에 연결하여 샘플 0.5 ml을 취하였다. 샘플을 취한 후 보관 주사기를 다시 밀봉하고, 냉장고내에 다시 넣었다.
상기 톡신 분취량(0.5 ml = 100 MLD)을 준비된 3.5 ml HDA 버퍼 함유 반횡격막 장기 배쓰(이글스 밸랜스 염 용액+ 0.1 % 인간 혈청 알부민)내에 피펫팅 및 주입하여 톡신 활성 측정을 시작하였다. 상기 1 ml 주사기에는 30 G 바늘(BD #304000)을 사용하였다. 0.5 ml의 반횡격막 장기 배쓰 용액을 주사기에 넣어 잔여 톡신 용액을 헹구어 이를 장기 배쓰에 재주입하였다.
시리즈 3: 이 최종 시리즈는 B. Braun의 주사 물질로 시행하였다.
대조 풀은 활성 측정전에 즉시 사용하거나 또는 얼음상에 마이크로튜브내에 최대 1시간 동안 보관하였다.
전술한 0.2 ml 보툴리늄 신경독소 풀 분취량을 20G 바늘을 갖춘 1 ml 주사기(B. Braun #9161406V 및 #4665503)내에 넣었다. 공기를 전체 부피 1 ml이 되도록 주사기내 넣고, 스토퍼(B. Braun #4495101)로 주사기를 밀봉하였다. 이후 상기 주사위를 조심스럽게 회전하여 톡신 용액과 전체 주사기 내부표면이 접촉하도록 하였다. 이후, 샘플을 4℃ 내지 8℃에서 1시간, 3일 및 9일간 각각 보관하였다.
상기 톡신 분취량(0.2 ml = 100 MLD)을 준비된 3.6 ml HDA 버퍼 함유 반횡격막 장기 배쓰(이글스 밸랜스 염 용액+ 0.1 % 인간 혈청 알부민)내에 피펫팅 및 주입하여 톡신 활성 측정을 시작하였다. 상기 1 ml 주사기에는 30 G 바늘(B. Braun #4656300)을 사용하였다. 0.2 ml의 신선한 식염용액을 주사기에 넣어 잔여 톡신 용액을 헹구어 이를 장기 배쓰에 재주입하였다.
활성 측정 결과를 하기 표에 나타내었다.
Figure 112009077951192-PCT00002
Figure 112009077951192-PCT00003
(1SD- 표준 편차)
본 연구에서 사용된 플라스틱 물질은 재조합된 신경독소 포뮬레이션의 활성에 어떠한 유의성있는 영향도 나타내지 않았다.
개별적인 마비시간은 대조 샘플의 경우 68분 내지 82분 (평균: 72.6 분 ± 5.0 분)이고, 플라스틱 물질로 처리한 샘플의 경우 60분 내지 77분(평균: 68.6분 ± 4.8분)이었다.
실시예 3 "보존제 존재하 안정성"
제오민®을 보존제(벤질 알콜) 존재하 또는 비존재에 멸균 식염용액으로 재조합하고, 다양한 시간 간격으로 보관하였다. 상기 풀들을 폴리에틸렌 용기내에 4℃에서 14일 까지 보관하였다. 단백질활성에 있어 벤질알콜 존재로 인한 어떠한 유 의성있는 감소도 검출되지 않았다.
각 의약품 바이알을 최종 농도 100 MLD/ml이 되도록 1.0 ml 식염용액(0.9 % v/v농도로 또는 보존제 없이)으로 재조합하고, 폴리에틸렌 용기에서 적합한 보관 시간 동안 보관하였다. 이후 모든 샘플을 테스트군에 따라 풀링하였다.
반횡격막 테스트 시스템에 대한 벤질알콜의 마취작용으로 인해, 바이어오세이전에 이들 제제를 투석으로 제거하여야 한다. 따라서 이들 보존제의 존재 또는 비존재에 관계없이 모든 테스트 샘플을 250배 과량 얼버퍼염용액(Earl's buffered salt solution; EBSS)에 대해 4℃에서 2회 투석하였으며, 각각 2시간 이상 수행하였다.
투석 단계에 후속하여 샘플을 EBSS로 최종농도 25 MLD/ml이 되도록 희석하고, 이들 샘플의 잔여 활성을 측정당 100 MLD 명목 용량으로 반횡격막 어세이로 측정하였다.
본 실시예 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 폴리에틸렌 용기내 4℃ 보관이, 보존제 존재 또는 비존재하에 식염용액에 재조합된 보툴리늄 톡신 의약품 제오민®의 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 고무 스토퍼를 갖고 있는 폴리에틸렌 주사기내 4℃ 보관이, 보존제 존재 또는 비존재하에 식염용액에 재조합된 보툴리늄 톡신 의약품 제오민®의 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 1에 나타난 결과는 보존제 벤질알코올 존재 또는 비존재하의 제오민®의 재조합이 보툴리늄 신경독소 의약품의 활성에 어떠한 유의성있는 영향도 미치지 않음을 확인해 준다.
상기 의약품은 식염용액내 조합되어 4℃ 보관되는 경우 14일까지 안정하다. 보존제 벤질알콜의 존재 또는 비존재는 이 안정성에 아무런 영향을 미치지 않는다.
실시예 4 "동결 및 해동 사이클"
본 실시예에서, 제오민®은 보존제없이 멸균 식염용액내 재조합되며, 5회까지 동결 및 해동을 반복하였다. 보툴리늄 신경독소 의약품의 마비활성에 어떠한 유의적인 효과도 검출되지 않았다.
멸균 식염용액은 주사용으로 물 내 0.9% 소듐 클로라이드(w/v)로 이루어져 있다. 의약품 제오민®을 사용하여 샘플 풀을 생성하였다.
전체 14 바이알의 제오민®을 7 바이알씩 2군으로 나누어 바늘을 사용하여 공기를 조심스럽게 공급하여 개봉하였다. 동결건조물질이 바이알 바닥에 손상없이 존재하도록 조심하여 다루었다.
7개 바이알 제오민®군 중 첫번째 바이알을 1.4 ml 식염용액으로 재조합하고, 동결건조산물을 완전히 용해시켰다. 이 용액을 정량적으로 다른 바이알로 옮기고 다시 동결건조물을 완전히 용해시켰다. 이러한 절차를 군내 7개 모든 바이알의 의 약품이 1.4 ml의 멸균 식염수에 완전히 녹을때까지 반복하였다. 이러한 두 군의 1.4 ml 용액을 풀링하여 2.8 ml 제오민®-풀을 형성하였다.
이 제오민®-풀의 분취액(0.2 ml)을 12개의 라벨링한 폴리프로필렌 튜브내에 피펫팅하였다: 두개의 대조 및 1 내지 5(동결-해동-사이클 수를 가르킴)로 매긴 10개의 동결-해조 샘플 두쌍. 이 두개의 대조 튜브는 반횡격막 어세이에서 측정될 때까지 4℃에서 보관하고, 나머지 튜브는 -20℃에서 최소 120분간 동결하였다. 2-5로 라벨링된 튜브를 실온에서 완전히 해동하고(약 30분) 후속하여 -20℃에서 최소 120분간 동결하였다. 이러한 과정은 3으로 라벨링된 튜브는 3번 동결하고, 4로 라벨링된 튜브는 4번 동결하고, 5로 라벨링된 튜브는 5번 동결될 때까지 계속되었다.
반횡격막 어세이전에, 모든 샘플을 실온에서 30분간 해동하고, 37℃에서 10분간 해동하였다. 혼합하고 10초간 원심분리하였다. 각 샘플을 3.6 ml 얼완충염 용액/ 0.1% HSA내로 이송하고, 완전한 이송을 위해 추가적으로 0.2 ml 얼완충염 용액/ 0.1% HSA을 사용하였다. 생성되는 제오민® 4.0 ml의 마비활성을 후속하여 반횡격막 어세이에서 측정하였다.
이들 실시예의 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에 나타난 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 재조합 제오민®의 동결 및 해동의 반복은 보툴리늄 신경독소 의약품 제오민®의 마비활성에 어떠한 유의적 인 영향도 나타내지 않았다. 제오민®은 식염용액내 재조합시 최소한 5회까지의 동결 및 해동 사이클 동안 안정하였다.

Claims (10)

  1. 6℃ 이상, 바람직하게 25℃ 이상의 온도에서 근육 이완제를 제공하는 방법으로서, 상기 근육 이완제는 복합 단백질이 없는 보툴리늄 톡신의 신경독성분을 포함하는 재조합용액인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제공은 보관 및/또는 수송을 포함하거나 또는 상기 근육 이완제 제조 방법내 일 단계인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 근육 이완제는 6℃ 이상, 바람직하게 25℃ 이상 70℃ 까지의 주변 온도에서 냉각 장비 없이 수송 또는 보관되거나 수송 및 보관되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 근육 이완제에 "동결-해동" 사이클이 시행되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 "동결-해동" 사이클 수가 1 내지 20인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 근육 이완제는 보존제 및/또는 진통제 존재하에서 안정한 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 용액은 플라스틱, 유리 또는 금속 또는 이들의 조합으로 된 용기에 보관되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액이 슈크로스 또는 인간 혈청 알부민 또는 이들 모두를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액이 동결방지제, 안정제, pH 버퍼, 슈크로즈 및 인간 혈청 알부민 이외의 부형제, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신경독 성분이 보툴리늄 톡신 타입 A 신경독 성분인 방법.
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