CN101720331A - 基于肉毒毒素的神经毒成分供应温度-稳定性肌肉松弛剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种供应肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液，其至少呈现下述特性中的一种，更优选地呈现从a)到d)的全部特性：a)在高于20℃的贮存温度下稳定，b)在防腐剂和/或镇痛剂的存在下稳定，c)耐受“冷冻和解冻”-循环，d)在不同材质的容器中贮存稳定。

Description

基于肉毒毒素的神经毒成分供应温度-稳定性肌肉松弛剂的方法
技术领域
本发明提供一种供应肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液，其至少呈现下述特性中的一种，优选呈现从a)到d)的全部特性：
a)在高于+20℃的贮存温度下稳定；
b)在防腐剂和/或镇痛剂的存在下稳定；
c)耐受“冷冻和解冻”-循环；
d)在不同材质的容器中贮存稳定。
背景技术
肉毒毒素由细菌梭状芽孢杆菌产生。肉毒毒素有七种抗原不同的血清型，即A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。肉毒毒素通常以复合物，即负责肉毒毒素毒性的亚单元(即所称的“神经毒成分”)与其他细菌蛋白复合在一起形成的毒素复合物的形式，从裂解的梭状芽孢杆菌培养物中释放出来。该复合物的分子量从约300,000Da至约900,000Da不等。复合蛋白为，例如，各种血凝素。这种毒素复合物的蛋白本身没有毒性，但被认为能为神经毒成分提供稳定性，并能导致肉毒杆菌口服中毒。与毒素复合物不同，神经毒成分以其分离和提纯形式，即不含任何复合梭菌蛋白的形式存在，其为不稳定酸并且对胃肠道中的侵蚀性环境不耐受。
肉毒毒素复合物的神经毒成分最初形成为单链多肽，在血清型A的情况下分子量约为150kDa。在另一种血清型中，观察到神经毒成分的分子量根据细菌的来源在约145kDa和170kDa间变化。在血清型A的情况下，例如，多肽的酶解加工产生了一种以双链多肽形式存在的活性多肽，该双链多肽由通过二硫键连接的重链和轻链组成。在人体中，重链介导内毒毒素与突触前的胆碱能神经末梢相结合并将毒素内转进入细胞内。轻链被认为具有毒性效应，起锌-肽链内切酶的作用并切割负责膜融合的特异性蛋白(SNARE复合物)(参见例如Montecucco C1 Shiavo G.，Rosetto O：The mechanism of action oftetanus and Botulinum neurotoxins.Arch Toxicol.1996；18(Suppl.)：342-354))。
通过干扰细胞内的膜融合过程，肉毒毒素阻止乙酰胆碱释放进入突触间隙。肉毒毒素在神经-肌肉接头处的总效应是阻断神经-肌肉间的传导，并在实际上，使肌肉去神经。肉毒毒素对其他周边胆碱能神经突触也有活性，造成流涎或出汗减少。
本发明中通篇使用的术语“肉毒毒素”或“肉毒毒素类”，不仅指不含任何其他梭菌蛋白的神经毒成分，也指“肉毒毒素复合物”：当毒素复合物与神经毒成分不必或不要求有区别时，在本发明中使用术语“肉毒毒素”。复合物通常含有其他的，所谓的“无毒蛋白”，我们将称之为“复合蛋白”或“细菌蛋白”。
尽管有毒性作用，肉毒毒素复合物已被用作许多疾病的治疗药物。1989年A型肉毒毒素在美国获准可供人类使用以治疗斜视、眼睑痉挛以及其他疾病。A型肉毒毒素蛋白复合物可市购获得，例如，以商标名BOTOX(Allergan Inc.)或以商标名DYSPORT(Ipsen Ltd)。用于治疗应用的复合物可直接注入需治疗的肌肉。在生理pH值下，神经毒成分从蛋白复合物中释放出来并产生所需的药效。
包含A型肉毒毒素的神经毒成分的药物组合物可从德国MerzPharmaceuticals GmbH以商标市购获得。A型和B型肉毒毒素的神经毒成分的制备描述于，例如，国际专利申请WO 00/74703和WO 2006/133818中。
关于基于肉毒毒素的组合物和药物剂量，以及基于肉毒毒素的神经毒成分的药物组合物、剂量和给药频率，可参阅PCT/EP2007/005754。
除了上述功能，据推测复合蛋白还能保护肉毒毒素的神经毒成分免受严酷的环境条件的影响，因为神经毒成分对降解和/或失活高度敏感，特别是当经受短期温度应力时，例如在温暖到炎热的气候或通常在夏季期间，即温度高于20℃时的贮存和/或运输。
为此，在过去一般会采取极为谨慎的措施以防止基于肉毒毒素，特别是基于肉毒毒素的神经毒成分的药物的温度达到+4℃以上，例如接近20℃。大多数情况下，将装有含有肉毒毒素的固态冻干物或其重组溶液的药瓶在冰上或至少在冰箱(约+4℃)中于约-20℃冷冻贮存(冻干)。这种必需的冷却会导致在供应药物时产生额外的费用。
此外，在本发明之前有人认为，包括肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液对于不同的贮存或运输条件甚至更不稳定。另外还认为，重组溶液的冷冻和解冻将导致蛋白迅速降解和失活。因此，医师建议仅在给药前对蛋白-冻干物进行重组和/或将其严格贮存于上述概括的低温下。
鉴于上述情况，本发明人对以重组溶液形式存在的基于肉毒毒素的肌肉松弛剂在不同环境条件下的稳定性进行了研究：
a)在+20℃以上贮存；
b)添加防腐剂和/或镇静剂；
c)冷冻和解冻-循环；
d)在不同材质的容器中贮存。
令人惊讶的是，发现包含不含复合蛋白的肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液在这些条件下比现有技术预想的情况要稳定的多。下面所述的发明即是基于这一发现。
发明内容
本发明提供了一种供应肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液，其至少呈现下述特性中的一种，更优选地呈现从a)到d)的全部特性：
a)在高于+20℃的贮存温度下稳定；
b)在防腐剂和/或镇痛剂的存在下稳定；
c)耐受“冷冻和解冻”-循环；
d)在不同材质的容器中贮存稳定。
在一个实施方案中，本发明提供了一种供应温度高于30℃的肌肉松弛剂，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素神经毒成分的重组溶液。
在另一实施方案中，所述供应涉及贮存和/或运输或为制备所述肌肉松弛剂的方法中的一个步骤。在再一个实施方案中，所述肌肉松弛剂在30℃以上直到70℃的环境温度下贮存和/或运输而不需要任何冷却装置。
在另一个实施方案中，所述肌肉松弛剂经历“冷冻和解冻”-循环。在又一个实施方案中，所述“冷冻和解冻”-循环数为1到20。
在另一个实施方案中，所述肌肉松弛剂在防腐剂和/或镇痛剂的存在下保持稳定。
在另一个实施方案中，所述重组溶液贮存在由塑料、玻璃或金属或其任何组合制成的容器中。
在另一个实施方案中，所述溶液还包含蔗糖或人血清白蛋白或两者兼而有之。
在另一个实施方案中，所述溶液还包含至少一种选自不同于蔗糖和人血清白蛋白的冷冻保护剂、稳定剂、pH缓冲液、赋形剂及其混合物的成分。在另一个实施方案中，所述神经毒成分为A型肉毒毒素的神经毒成分。
附图说明
图1：在有无防腐盐水的存在下于+4℃贮存对重组
Figure G2008800184525D00051
和
Figure G2008800184525D00052
活性的影响。贮存于聚乙烯容器中。
图2：在有无防腐盐水的存在下于+4℃贮存对重组
Figure G2008800184525D00053
和
Figure G2008800184525D00054
活性的影响。贮存于带有橡胶塞的聚乙烯注射器中。
图3：反复冷冻和解冻对重组
Figure G2008800184525D00055
活性的影响。
具体实施方式
本发明涉及供应温度高于+4℃，优选高于+6℃，更优选高于+20℃的肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合药物的肉毒毒素神经毒成分的重组溶液。在本发明中，术语“供应”包括本发明限定的肌肉松弛剂的任何一种供应，尤其是贮存、运输和/或为在制备所述肌肉松弛剂中的一个步骤。术语“供应”还包括这样的步骤，其中所述肌肉松弛剂经历从冷冻态(例如-20℃)到+4℃以上，优选+6℃以上，更优选+20℃以上的温度上升过程。
在本发明中，可采用任何形式的肉毒毒素的神经毒成分，尤其是各种血清型，包括血清型A、B、C、D、E、F和G。在本发明的优选实施方案中，所述B型肉毒毒素的神经毒成分在高于8℃下提供。在另一个实施方案中B型肉毒毒素的神经毒成分在高于30℃下提供。此外，包括突变、缺失等改性以及重组制备的肉毒毒素的神经毒成分也在本发明的范围之内。关于适合的突变，可参阅WO 2006/027207A1和WO 2006/114308A1，以及EP 07014785.5，其以参阅的方式全文并入于此。此外，在本发明中，可采用各种血清型的混合物(以神经毒成分形式或其重组形式或两种形式兼而有之，例如A型和B型肉毒神经毒素的混合物)。然而，本发明还涉及化学改性的神经毒素，例如聚乙二醇化、糖基化、硫酸化、磷酸化或任何其他改性，尤其是一种或多种表面或溶剂暴露的氨基酸。
在一个实施方案中，所述化学性去神经剂为梭菌神经毒素。在另一个实施方案中，所述梭菌神经毒素为肉毒毒素。在又一个实施方案中，肉毒毒素为抗原不同的血清型A、B、C、D、E、F和G的肉毒毒素。在所有提及A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素中，也包括血清型的已知变种，例如血清型A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3、F1、F2、F3、或G1、G2、G3。在一个实施方案中，肉毒毒素为A型肉毒毒素。
在另一个实施方案中，还包括肉毒毒素的亚型、同源物、直系同源物和旁系同源物，其显示至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或达到100％的序列同一性。序列同一性可以通过适于得到可靠结果的任何算法进行计算，例如，使用FASTA算法(W.R.Pearson&D.J.Lipman PNAS(1988)85：2444-2448)。
肉毒毒素，当从溶解的梭菌培养基中释放时通常伴随其他细菌蛋白，它们共同形成一种毒素复合物。在另一个实施方案中，所述肉毒毒素不含任何复合蛋白，例如，为A型肉毒毒素纯品。此外，包括突变、缺失等改性以及重组制备的肉毒毒素的神经毒成分也在本发明的范围之内。关于适合的突变，可参阅WO 2006/027207A1和WO2006/114308A1，以及EP 07014785.5(由Merz于2007年10月27提交的专利申请)，其以参阅的方式全文并入于此。此外，在本发明中，可采用各种血清型的混合物(以神经毒成分形式或其重组形式或两种形式兼而有之，例如A型和B型肉毒神经毒素的混合物)。然而，本发明还涉及化学改性的神经毒素，例如聚乙二醇化、糖基化、硫酸化、磷酸化或任何其他改性，尤其是一种或多种表面或溶剂暴露的氨基酸。
本发明所指的肉毒毒素复合物的神经毒素亚单元为“神经毒成分”或“不含复合蛋白的神经毒成分”。术语“神经毒成分”还包括在肉毒梭菌的其他血清型中发现的功能性同源物。在本发明的一个实施方案中，神经毒成分不含任何其他的肉毒梭菌蛋白，在一个实施方案中，还不含可能与神经毒成分有潜在联系的RNA。神经毒成分可为约150kDa的单链前体蛋白或经过蛋白酶解加工的神经毒成分，其包括由一个或多个二硫键连接的约50kDa轻链(Lc)和约100kDa的重链(Hc)(参见例如Simpson LL，Ann Rev Pharmacol Toxicol.2004；44：167-93)。
在本发明中，可采用任何形式的肉毒杆菌毒素，特别是各种血清型、肉毒毒素的神经毒成分和其复合的伴随蛋白的各种复合物，以及这些肉毒毒素的神经毒成分。此外，包括突变、缺失等改性以及重组制备的肉毒毒素的神经毒成分也在本发明的范围之内。关于适合的突变，可参阅WO 2006/027207A1，其以参阅的方式全文并入于此。此外，在本发明中，可采用各种血清型的混合物(以神经毒成分形式或其重组形式或两种形式兼而有之，例如A型和B型肉毒神经毒素的混合物)。
根据本发明的教导，除了神经毒成分之外，药物可不含有在肉毒毒素复合物中除神经毒成分外发现的蛋白。神经毒成分的前体可切割或不切割，然而在一个实施方案中，前体被切成重链和轻链。如本发明其他部分所指出的，多肽可为野生型序列或可在一个或多个残基上改性。改性包括化学改性，例如通过糖基化、乙酰化、酰化或酰胺化等，这些可能对例如摄取或多肽的稳定性是有益的。然而，神经毒成分的多肽链可通过添加、取代或缺失一个或多个氨基酸残基进行选择性改性或其他改性。
本发明上述所指的神经毒成分可为组合物或药物组合物的一部分。本发明中使用的药物组合物可包含肉毒毒素，例如以神经毒成分作为唯一活性成分或可含有其他的药物活性成分，例如透明质酸和/或聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇，通过合适的pH缓冲液，尤其是醋酸钠缓冲液，和/或冷冻保护剂多元醇可使该组合物在任选的pH下稳定。
“药物组合物”是含有或包括用作药物或诊断药剂的活性成分的制剂。这种药物组合物可能适用于诊断性或治疗性施予(即通过肌肉注射或皮下注射)人类患者。
在本发明的一个实施方案中，组合物可包括神经毒成分和透明质酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，通过合适的pH缓冲液，尤其是醋酸钠缓冲液和/或冷冻保护剂多元醇，可使该组合物在任选的pH下稳定。优选地，所述组合物包含A型肉毒毒素的神经毒成分。所述组合物为肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液。优选地，所述组合物还包括蔗糖或人血清白蛋白或两者兼而有之，更优选人血清白蛋白和蔗糖的比例约为1∶5。在一个实施方案中，组合物为
Figure G2008800184525D00081
更优选地，所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。可选地，所述组合物不含来源于哺乳动物的蛋白，例如人血清白蛋白。通过用其他非蛋白稳定剂取代血清白蛋白，任何这些方案均可提供足够的神经毒素稳定性(infra)。
组合物可包括其他成分，例如pH缓冲液、赋形剂、冷冻保护剂，防腐剂、镇痛剂、稳定剂或其任何组合。
因此，在一个优选的实施方案中，神经毒成分与透明质酸稳定剂或聚乙烯吡咯烷酮稳定剂或聚乙二醇稳定剂或其任意组合一起配制。此外，组合物可含有乙酸钠缓冲体系或醇类冷冻保护剂或两者兼而有之。在另一个优选的实施方案中，制剂不含白蛋白，其含有稳定剂透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮
Figure G2008800184525D00082
和/或羟乙基淀粉和或海藻酸盐和/或其两种和/或多种的混合物。除了上述稳定剂，所述优选的组合物还包括水和至少一种多元醇，优选甘露醇或山梨醇或其混合物。
在一个实施方案中，小鼠LD50试验测定结果显示，神经毒成分的生物活性为每ng神经毒成分50至250个LD50单位。在另一实施方案中，神经毒成分的生物活性为约150个LD50单位。其中这里所述的单位指的是每毫微克单位。通常，本发明的药物组合物包含重量约为6pg至约30ng的神经毒成分。包含分离形式为A型肉毒毒素的神经毒成分的药物组合物可以从德国Merz Pharmaceuticals GmbH市购获得，商标名为
Figure G2008800184525D00091
A型和B型肉毒毒素的神经毒成分的制备描述于例如国际申请WO 00/74703和WO 2006/133818。
在一个实施方案中，所述组合物包括A型肉毒毒素的神经毒成分。所述组合物为肉毒毒素的神经毒成分的重组溶液。在另一个实施方案中，组合物还包括蔗糖或人血清白蛋白或两者兼而有之，在另一个实施方案中，人血清白蛋白和蔗糖的比例为1∶5。在一个实施方案中，组合物为
Figure G2008800184525D00092
在另一个实施方案中，人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。可选地，所述组合物不含来源于哺乳动物的蛋白，例如人血清白蛋白。通过用其他非蛋白稳定剂取代血清白蛋白，任何这些方案均可提供足够的神经毒素稳定性(infra)。
关于基于肉毒毒素的组合物和药物剂量，以及基于肉毒毒素的神经毒成分的药物组合物、剂量和给药频率，可参阅PCT/EP2007/005754。
药物组合物可以冷冻干燥或真空干燥，重组，或为溶液中的主要成分。在一个实施方案中，当重组时，通过加入无菌生理盐水(0.9％NaCl)制备重组溶液。
这种组合可包括其他赋形剂。术语“赋形剂”指的是组合物中存在的除了活性成分之外的物质。赋形剂可以是缓冲液、载体、抗粘剂、粘合剂、崩解剂、填料、稀释剂、防腐剂、辅料、环糊精和/或填充剂，例如白蛋白、明胶、胶原蛋白、氯化钠。在另一个实施方案中，赋形剂也可以是止痛剂、冷冻保护剂和/或稳定剂。
术语“pH缓冲液”是指能够将组合物、溶液等的pH调至一定值或一定pH范围的化学物质。在一个实施方案中，pH值范围可为5至8，例如为7至8，或7.2至7.6，或为7.4。上述给出的pH值范围只是典型的示例，实际值可能包含上述数值间的任何区间。根据本发明教导的适合的缓冲液为，例如磷酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液或任何适于缓冲至上述pH值范围的缓冲液。
在一个实施方案中，组合物还包括1-100mM醋酸钠缓冲液，在另一个实施方案中，包含10mM醋酸钠缓冲液。
上述给出的pH值范围仅为典型示例。实际值可能包含上述数值间的任何区间。根据本发明教导的适合的缓冲液为，例如磷酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液或任何适于缓冲至上述pH值范围的缓冲液。
“稳定的”、“使稳定”、“稳定化”是指与加入到药物组合物之前的生物活性神经毒成分的毒性相比，药物组合物的重组溶液或水溶液中的神经毒成分的毒性大于前者的20％、30％、40％，50％、60％、70％、80％、90％，直到约为100％。在一个实施方案中，所述神经毒成分被称为活性成分。
稳定剂的示例为明胶或白蛋白，在一个实施方案中，为人源或重组来源的白蛋白。非人类或非动物来源的蛋白也被包括在内。可通过化学方法或基因重组对稳定剂进行改性。在本发明的一个实施方案中，设想用醇，例如，肌醇、甘露醇、作为冷冻保护赋形剂来稳定冷冻干燥过程中的蛋白质。
在本发明的另一实施方案中，稳定剂可以是包含透明质酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其任意组合的非蛋白稳定剂。在另一个实施方案中，稳定剂为羟乙基淀粉和/或海藻酸盐。通过合适的pH缓冲液，尤其是醋酸钠缓冲液或冷冻保护剂或两者联用可使该组合物在任选的pH下稳定。除了上述提到的稳定剂，所述组合物可包括水和至少一种多元醇，例如甘露醇或山梨糖醇或其混合物。它也可包括单糖、双糖或更高的多糖，例如葡萄糖、蔗糖或果糖。这样的组合物被认为是具有高稳定性的更加安全的组合物。
在一个实施方案中，本发明药物组合物中的透明质酸以在200U/ml肉毒毒素溶液中，每毫升含有0.1至10mg，优选1mg透明质酸的量与神经毒成分联用。
当本发明的组合物中存在聚乙烯吡咯烷酮时，其以能够制备出重组溶液的量，例如以在200U/ml神经毒成分的肉毒毒素溶液中，每毫升含有10到500mg，优选100mg聚乙烯吡咯烷酮的量与神经毒成分联用。在另一个实施方案中，在多达8ml的溶液中进行重组。这导致在25U/ml神经毒成分溶液中，其浓度降至每毫升含12.5mg聚乙烯吡咯烷酮。在另一个实施方案中，所得溶液还含有1-100mM，优选10mM醋酸钠缓冲液。如果神经毒成分溶液的浓度由25U/ml降至更低，组分的这个比例同样适用。
在一个实施方案中，本发明药物组合物中的聚乙二醇以在200U/ml的肉毒毒素溶液中，每毫升含有10至500mg，优选100mg聚乙二醇的量与神经毒成分联用。在另一个实施方案中，所得溶液还含有1-100mM醋酸钠缓冲液，在又一个实施方案中，还含有10mM醋酸钠缓冲液。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物在约+30℃至-20℃的贮存温度下，其药效在六个月、一年、两年、三年和/或四年内基本保持不变。此外，所述药物组合物经重组后具有药效，或可恢复到20％至100％。
“冷冻保护剂”是指能导致组合物的重组溶液或水溶液中的神经毒成分具有比在药物组合物中冻干之前的生物活性的神经毒成分的毒性大20％、30％、40％，50％、60％、70％、80％、90％，直到具有约为100％的毒性的赋形剂。
在另一个实施方案中，组合物可包含多羟基化合物，例如作为冷冻保护剂的多元醇。可用的多元醇的示例包括，例如，肌醇、甘露醇和其他非还原醇。组合物的一些实施方案不包含蛋白稳定剂，或不含有有时用作冷冻保护剂的海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖或相关糖类。
术语“防腐剂”和“防腐剂类”分别指一种或一类物质，其能阻止微生物、昆虫、细菌或其他污染性微生物在所述组合物中的生长或存活。防腐剂还能防止所述组合物发生不希望有的化学变化。可在本专利范围内应用的防腐剂，可以是本领域技术人员所知的所有防腐剂。可用的防腐剂的示例包括，尤其是，例如苄基醇、苯甲酸、苯扎氯铵、丙酸钙、硝酸钠，亚硝酸钠、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)、乙二胺四乙酸(EDTA)二钠、甲醛、戊二醛、硅藻土、乙醇、甲基氯代异噻唑啉酮、丁基羟基苯甲醚和/或丁基羟基甲苯。
术语“镇痛剂”涉及以多种方式作用于外周和中枢神经系统的镇痛药，包括特别是扑热息痛(对乙酰氨基酚)、非甾体抗炎药(NSAIDs)，例如水杨酸盐、麻醉药品例如吗啡、具有麻醉性的合成药物例如曲马多，及其他药物。还包括任何带有局部镇痛作用的化合物，例如利多卡因、苄醇、苯甲酸及其他化合物。
在一个实施方案中，镇痛剂是组合物的一部分，在另一个实施方案中，镇痛剂在化学去神经剂治疗前、治疗中或治疗后施予。
本申请中使用的术语“冷冻干燥”用于处理含有肉毒毒素的神经毒成分的溶液，其中溶液被冷冻并干燥直到仅有组合物的固体成分保留下来。因此本申请中经该处理得到的冻干产物被定义为“冻干物”。
在本申请中，术语“重组”被定义为溶解所述神经毒成分的冻干组合物的方法。这可以通过添加适量无菌水完成，例如，如果所有必要的组分均已包含在该冻干物中时。或者，如果不是这样，可以通过例如单独添加无菌盐水或者，如果适用，加入包括例如pH缓冲液、赋形剂、冷冻保护剂、防腐剂、镇痛稳定剂或其任何组合。前述提到的“盐溶液”是一种盐-溶液，更优选是氯化钠(NaCl)溶液，然而更优选为等渗氯化钠溶液(即氯化钠浓度为0.9％)。以这种方式进行溶解可使得最后的“重组”液可直接或间接地，即例如稀释后，施予患者。优选在等渗媒介中重组神经毒素。更优选在等渗盐水中。更优选地，所述盐水为无菌盐水。
本申请中使用的术语“冷冻和解冻循环”，是指冷冻和解冻重组溶液的过程。其中，定义的“冷冻”过程是指重组溶液在0℃以下，例如优选在-20℃(正常冰箱温度)以下，更优选在-80℃(干冰温度)或以下贮存。其中，定义的“解冻”过程是在0℃以上，优选+4℃以上，更优选+20℃以上，在温度范围中最优选分别在+25℃以上，+30℃以上，+40℃以上贮存，但不能高于50℃。冷冻和解冻期间及其之后的典型的和示例性的贮存时间可长达1分钟、长达10分钟、长达30分钟、长达1小时、长达2小时、长达3小时、长达4小时、长达5小时、长达6小时、长达7小时、长达8小时、长达1天、长达2天、长达3天、长达4天、长达5天、长达6天、长达7天、长达8天、长达9天、长达10天、长达2周、长达3周、长达1个月、长达2个月、长达3个月(90天)。术语“冷冻和解冻循环”也包括随后连续进行的冷却和(再次)加热的循环。上面提到的时限只是典型的示例，实际的时限可长可短，包括上面提到的任何数值之间的区间。定义的一个“冷冻和解冻循环”是指按照上述条件进行的一个冷冻步骤和一个解冻步骤。本申请中提及的“冷冻和解冻循环”的复数，即“多个冷冻和解冻循环”，是指在上述限定的范围内，不同和相同的时间间隔和温度下使重组溶液重复经历“冷冻和解冻循环”。上述提到的重复至少为2次，优选至少3次或至少4次，更优选至少5次，至少6次，至少7次，甚至更优选至少8次，至少9次或至少10次，但不能超过20次。
术语“容器”是指器皿，如小瓶、注射器、烧瓶或任何其他类型的容器，所述组合物可在容器中贮存和/或运输。容器壁直接与所述组合物接触，并由适于密封重组溶液的材料例如各种玻璃、塑料、金属、陶瓷或其任何组合，或任何材料构成。
本申请使用的术语“室温”是指在+22℃至+25℃之间的任何温度，优选+20℃、+21℃、+22℃、+23℃、+24℃或+25℃及其任意数值范围间的任一温度。
本申请中的术语“赋形剂”是指组合物中存在的除了活性成分之外的物质。赋形剂可以是缓冲液、载体、抗粘剂、粘合剂、崩解剂、填料、稀释剂、防腐剂、辅料、环糊精和/或填充剂，例如白蛋白、明胶、胶原蛋白和/或氯化钠。
“冷却装置”被定义为任何能够将组合物温度降至环境温度以下的装置。优选地，所述“冷却装置”能达到低于环境温度的稳定温度，通常在6℃或约6℃，在某些情况下甚至更低。
典型地，上述肌肉松弛剂的供应包含在高温下贮存或运输或两者皆有，或为制备所述肌肉松弛剂中的一个步骤，更优选包括肉毒毒素的神经毒成分的蛋白已被冻干和重组之后进行的一个步骤。“高温”是指+6℃以上，优选+20℃以上，更优选+30℃以上。术语“+6℃以上”是指例如+7℃、+8℃、+9℃、+10℃、+11℃、+12℃、+13℃、+14℃、+15℃、+16℃、+17℃、+18℃、+19℃或更高，但不能高于70℃。术语“+20℃以上”是指例如+21℃、+22℃、+23℃、+24℃、+25℃、+26℃、+27℃、+28℃、+29℃或+30℃。术语“+30℃以上”是指例如+31℃、+32℃、+33℃、+34℃、+35℃、+36℃、+37℃、+38℃、+39℃或+40℃。优选肌肉松弛剂不在+70℃以上贮存。在某些情况下，即基于肉毒毒素的神经毒成分贮存于0℃以下的环境下，术语“高温”是指“高温”是指温度在0℃以上，优选4℃以上，对上述温度范围而言更优选分别在+6℃以上，+20℃以上，和+30℃以上。
在一个优选的实施方案中，肌肉松弛剂在不超过14天的一段时间期限内经受上述+6℃以上至高达+40℃范围间的某个温度。如本领域技术人员所知，肌肉松弛剂经受各个温度的时间期限可为几分钟至14天间的任何时间间隔。通常，考虑到供应该种肌肉松弛剂的情况，尤其是贮存和/或运输或两者兼而有之所涉及地点的情况，时间期限不应少于10分钟。这些短期限在某些情况下尤为重要，其中在炎热气候下运输后或贮存后，肌肉松弛剂经受阳光直接照射，例如在机场或街道上。因此本发明典型的时间期限长达10分钟、长达30分钟、长达1小时、长达3小时、长达4小时、长达5小时、长达6小时、长达7小时、长达8小时、长达1天、长达2天、长达3天、长达4天、长达5天、长达6天、长达7天、长达8天、长达9天、长达10天、长达2周、长达3周、长达1个月、长达2个月、长达3个月(90天)。毋庸赘述，上述提到的时间期限仅为典型示例，实际的时间期限可或长或短并且包括上述给出的数值间的任何间隔。
对于肌肉松弛剂所经受的温度，本领域技术人员能够想到典型的温度下限为20℃以上。对于本发明详细记载的温度和温度范围，本领域技术人员应能理解肌肉松弛剂/组合物所经受的温度上限优选不高于70℃。即肌肉松弛剂所经受的温度优选在20℃以上至70℃的范围。因此，在本发明中，肌肉松弛剂分别经受20℃以上、或25℃以上、或30℃以上、或35℃以上、或40℃以上、或45℃以上、或50℃以上、或55℃以上、或60℃以上、或65℃以上，直到70℃的温度。另外，上述给出的20℃以上至70℃之间的任一特定温度及各个温度间隔可能是由供应肌肉松弛剂时的环境决定的，所述供应优选运输或贮存或两者兼而有之，所述特定温度及各个温度间隔在本发明的范围之内。
下述温度和时间间隔表示本发明的优选实施方案。根据第一实施方案，使肌肉松弛剂在+30℃以上到高达+70℃间的某一温度经历一段时期但不超过90天，优选在在+30℃以上到高达+70℃间的某一温度经历10分钟到14天，更优选在+40℃以上到+60℃间的某一温度经历10分钟到90天。
在一个优选的实施方案中，当时期范围是从10分钟到30天时，温度从30℃以上到高达70℃，优选从40℃到60℃，更优选从50℃到60℃。
在另一个优选的实施方案中，代表极端情况下，温度在65℃至70℃的范围，且肌肉松弛剂在所述温度下经历的时期从10分钟到90天，优选从10分钟到3天。
实验结果表明溶液接触的表面对本发明重组神经毒素的稳定性没有影响。因此，本发明的重组组合物可保存在各种器皿或容器中。这些器皿或容器的表面也因此可由各种塑料、金属、玻璃等制备。
由于这个发现，本发明现在能够提供上述不需使用人工冷却装置的肌肉松弛剂。这个发现对肌肉松弛剂的运输和/或贮存尤其重要。此外，本发明与高温、可能还伴有高湿度的环境有很大关系。
下面将通过非限制性的实施例对本发明进行详细说明。
实施例
实施例是使用市购获得的产品
Figure G2008800184525D00161
进行的。是一种含有以A型肉毒毒素(150kDa)为活性成分的冻干粉。这种毒素以有缺口的(nicked)双链形式存在，即它包含重链和轻链。该毒素是从肉毒梭菌培养物(ATCC 3205菌株)中获得的。已被提纯至不含任何复合蛋白。
Figure G2008800184525D00163
还含有人血清白蛋白和蔗糖。
为了评估
Figure G2008800184525D00164
的稳定性，使用小鼠横隔膜法(mousehemidiaphragm assay，HDA)对生物活性进行了测定。在该方法中，将由小鼠膈神经以及膈肌的相应部分组成的神经肌肉制剂固定于力测量仪器中。将整条膈神经穿过两个电极以刺激神经并因此刺激隔膜。将组合物浸在含有HAD缓冲液的毒素中，用电脉冲(频率1Hz，刺激时间0.1ms，刺激电流幅度5-50mA)定期刺激该神经。
借助等长传感器监测该间接刺激肌肉的收缩反应。信号由使用市购软件VitroDatWin 3.4的个人电脑放大并记录。在测量肌肉收缩反应的时间过程时，观察到在肉毒毒素的存在下，收缩力呈指数级减小。这种减小的特点就是所谓的麻痹时间。麻痹时间被定义为两个时间点“毒素样品增加”和“半最大收缩力”之间的时间段，并与器官浴槽中的毒素浓度成正比。
上述方法是按照欧洲药典对于检测肉毒毒素活性的规定实施的。
实施例1“室温贮存”
的重组盐溶液于室温下(+23℃)在塑料-注射器中贮存达9天。将样品活性与活性检测前刚刚(不超过2小时)重组的对照液的活性进行比较。在样品组与对照组中未检测到蛋白活性有显著降低。
实施例2“塑料容器贮存”
将重组肉毒神经毒素NT201的盐溶液引入各种塑料容器并应用(见下文表1)。此外，在检测活性前将重组毒素分别在塑料容器和注射器中贮存不同时期，最多达14天。在任何情况下均未检测到蛋白活性显著降低。
表1：
Figure G2008800184525D00172
Figure G2008800184525D00181
使用前将含100MLD(“中间致死剂量”或LD50单位)的冻干粉NT201在盐溶液中重组。
为了测试塑料材料对肉毒毒素活性的影响，重组盐溶液被引入到并适用于使用上表所列出的针头、适配器和瓶塞的各种注射器中，以及适用于使用常规方法模拟肌肉内注射医疗过程的器官浴槽(在容器中通过小鼠横隔膜法测定活性)。
此外，在检测活性前将重组毒素分别在塑料容器和注射器中贮存不同时期，最多达14天。
分3个独立的系列进行试验，以研究不同的变量的最大数目并获得可靠的结果。详情请参阅下文。
根据典型的医疗实践(系列2和3)直接用吸管(系列1)或用3ml注射器和20G针头(BD#300910和BD#301300；系列2)或用5ml注射器和20G针头(B.Braun#4617053V和#4665503；系列3)取等份盐水。
为了确保小样本量的准确性，当所需量小于0.5ml时将盐溶液注入离心管作中间贮存。在这些情况下，用吸管转入所需的体积。
系列1和3：将10只小瓶用细针仔细充气，随后打开。将盐水(1.0ml)吸入第一个小瓶。通过仔细混合充分溶解干粉团(pellet)后，将溶液转入第二个小瓶。照此方式将液体从一个小瓶转到下一个直到最后一个，即第10个小瓶。然后通过将1.0ml盐水加入到第一个小瓶中并按照前述步骤逐一清洗小瓶以收集任何残留样品，最后组合这两份毒素溶液。
这些组合液(2.0ml)代表每0.2ml溶液中约有100MLD肉毒神经毒素池。当随后用注射器处理时，将该池的0.2ml等份吸入微管以保证准确的量。
系列2：将刚好2.5ml盐水吸入带有20G针头(BD#300910和BD#301300)的3ml注射器中并按每份0.5ml注入到含有肉毒毒素的五个小瓶中。将这些小瓶仔细混合，直至干粉团(pellet)全部溶解。对小瓶充气后插入一个细针，将重组毒素吸入带有21G针头(BD#300912和BD#301155)的10ml注射器中。接着在注射器中吸入空气至总体积为10ml，并用瓶塞(#394075)密封注射器。然后小心旋转注射器使毒素溶液和整个注射器内表面接触。
按照上述方法创建对照样品池，区别是在5个小瓶中每个用0.5ml，而不是0.2ml盐溶液。
在三个单元使用三个不同的肉毒毒素池进行试验。然而每种情况下相对于100MLD肉毒毒素，每个样品使用0.2ml(系列1和3)或0.5ml(系列2)肉毒毒素池。这个体积量或者被填入微管并吸入到注射器或直接贮存于冷冻管。
系列1：在第一个实验中，肉毒神经毒素池的各等份分别在冰箱在冷冻管或带有26G针头(BD#309602，US edition，和B.Braun#4657683)的1ml注射器中贮存7到14天。
通过将毒素等份(0.2ml＝100MLD)注入或移入制备得到的含有3.6ml HAD缓冲液(Eagles平衡盐溶液+0.1％人血清白蛋白)的隔膜器官浴槽中开始进行毒素的活性测定。将0.2ml新鲜盐水溶液引入到注射器中冲洗残余的毒素液并将其注入到器官浴槽。采用移液管，用0.2ml新鲜盐水溶液冲洗微管。
系列2：第二系列是利用来自Becton Dickinson的几种不同注射材料进行的。
对照池或者立即使用，或者在活性测定前将其贮存在置于冰上的微管中，最多放置1小时。
上述肉毒毒素池在4℃到8℃下贮存于封闭的10ml注射器中，分别放置1小时、3天和5天。通过使用凹/凹适配器(BD#300013和B.Brown#5206634)将1ml注射器连接到10ml贮存注射器上取出0.5ml样品。取出样品之后，将贮存注射器重新密封并视情况可送回到冰箱。
通过将毒素等份(0.5ml＝100MLD)注入或移入制备得到的含有3.5ml HAD缓冲液(Eagles平衡盐溶液+0.1％人血清白蛋白)的隔膜器官浴槽中开始进行毒素的活性测定。与上述1ml注射器一起使用的是30G针头(BD#304000)。通过将0.5ml隔膜器官浴槽溶液引入到注射器中，并将其注回至器官浴槽中来冲洗残余的毒素液。
系列3：使用来自B.Braun的注射材料进行最后的系列。
对照池或者立即使用，或者在活性测定前将其贮存在放置于冰上的微管中，最多放置1小时。
将上述0.2ml肉毒毒素池等份引入到配备20G针头(B.Braun#9161406V和#4665503)的1ml注射器中。接着注射器吸入空气至总体积为10ml，并用瓶塞(B.Braun#4495101)密封。然后小心旋转注射器使毒素溶液和整个注射器内表面接触。之后，样品在4℃到8℃下分别贮存1小时、3天和9天。通过将毒素等份(0.2ml＝100MLD)注入或移入制备得到的含有3.6ml HAD缓冲液(Eagles平衡盐溶液+0.1％人血清白蛋白)的隔膜器官浴槽中。与上述1ml注射器一起使用的是30G针头(B.Braun#4656300)。将另0.2ml新鲜盐水溶液引入到注射器中冲洗残余的毒素液，并将其注回到器官浴槽。
活性测定的结果列于下表。
Figure G2008800184525D00201
Figure G2008800184525D00211
(1SD-标准差)
该项研究中显示所使用的塑料材料对重组神经毒素制剂的活性没有显著作用。
对照样品的各个麻痹时间值的范围从68min至82min(平均：72.6min±5.0min)，塑料材质处理的样品的各个麻痹时间值的范围从60min至77min(平均：68.6min±4.8min)。
实施例3“防腐剂存在下的稳定性”
将
Figure G2008800184525D00221
在含有或不含有防腐剂(苄醇)的无菌盐水中进行重组并贮存不同的时间范围。未检测到蛋白活性在苄醇存在下有显著降低。
用1.0ml盐水(含(0.9％ v/v)或不含防腐剂)将每小瓶药品重组至终浓度为100MLD/ml并于聚乙烯容器中贮存适当的贮存时间。接着汇集所有实验组的样品。
由于苄醇对实验体系的隔膜制剂的麻醉作用，在生物测定之前需要透析的步骤以除去该药物。因此不论有无防腐剂，用250倍过剩Earl′s缓冲盐溶液(EBSS)将所有实验样品透析两次，每次超过2小时。
继透析步骤之后，用EBSS将样品稀释至终浓度为25MLD/ml，在横膈膜实验中采用每次测定100MLD的标称剂量测定样品的残留活性。
该实施例的结果示于图1。
图1显示了4℃下在聚乙烯容器中贮存对在含或不含防腐剂的盐水中重组的肉毒毒素药品
Figure G2008800184525D00222
活性的影响。
图2显示了4℃下在带有橡胶塞的聚乙烯注射器中贮存对在含或不含防腐剂的盐水中重组的肉毒毒素药品
Figure G2008800184525D00223
活性的影响。
图1结果显示在含或不含防腐剂苄醇的盐水中进行的
Figure G2008800184525D00224
重组对肉毒神经毒素药品的活性没有显著影响。
当在盐溶液中重组并在4℃贮存时，药品在长达14天里保持稳定。防腐剂苄醇的存在与否对稳定性没有影响。
实施例4“冷冻和解冻循环”
在该实施例中，在不含防腐剂的无菌盐溶液中重组
Figure G2008800184525D00231
冷冻和解冻重复5次。未检出肉毒神经毒素药品对麻痹活性的显著影响。
注射用的无菌盐水由0.9％氯化钠(w/vol)水溶液组成。使用药品
Figure G2008800184525D00232
创建样品池。
将总数14支
Figure G2008800184525D00233
小瓶分成两组，每组7支，用针头仔细充气，随后打开。小心地使冻干产品在瓶底部保持完整。
用1.4ml盐溶液对7瓶
Figure G2008800184525D00234
组的第一瓶进行重组且冻干产品完全溶解。将溶液定量转移至下一个小瓶，其中再使冻干物完全溶解。重复此步骤直到该组全部7支小瓶的药品溶解于1.4ml无菌盐水中。然后将两组各1.4ml溶液汇集起来得到2.8ml
Figure G2008800184525D00235
池。
将
Figure G2008800184525D00236
池等份(0.2ml)移入到12支贴有标签的聚乙烯管中：两个对照和10个编号1至5(表示冷冻-解冻循环次数)的冻融重复样本。在横膈膜检测前将两支对照管在4℃贮存，而另一支管在-20℃冷冻至少120min。将标为2-5的管在室温下完全解冻(约30min)，然后在-20℃冷冻至少120min。持续进行这个程序直到标为3的管被冷冻3次，标为4的管被冷冻4次以及标为5的管被冷冻5次。
在横隔膜检测前，所有样本在室温解冻30min并在37℃培养10min。将他们混合并离心10秒钟。每个样本被转移到3.6ml Earl′s缓冲盐溶液/0.1％HSA中，该转移是使用额外0.2ml Earl′s缓冲盐溶液/0.1％HSA完成的。随后在横膈膜检测中对得到的4.0ml
Figure G2008800184525D00237
进行测定。
这些实施例结果显示于图3。
图3结果显示重组
Figure G2008800184525D00238
的反复冻融对肉毒神经毒素药品的麻痹活性没有显著影响。当在盐溶液中进行重组时，
Figure G2008800184525D00239
在至少多达5个冷冻-解冻循环中保持稳定。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.在高于20℃的温度下供应肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素神经毒成分的重组溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供应涉及贮存和/或运输或为制备所述肌肉松弛剂的方法中的一个步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述肌肉松弛剂在高于20℃直至70℃的环境温度下运输或贮存或者运输和贮存而不需要任何冷却装置。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述肌肉松弛剂经历“冷冻和解冻”-循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述“冷冻和解冻”-循环次数为1到20。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述肌肉松弛剂在防腐剂和/或镇痛剂的存在下保持稳定。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述重组溶液贮存在由塑料、玻璃或金属或其任何组合制成的容器中。
8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述溶液还包含蔗糖或人血清白蛋白或两者兼而有之。
9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述溶液还包含至少一种选自不同于蔗糖和人血清白蛋白的冷冻保护剂、稳定剂、pH缓冲液、赋形剂及其混合物的成分，。
10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述神经毒成分为A型肉毒毒素的神经毒成分。

Claims (10)

1.在高于6℃，优选高于25℃的温度下供应肌肉松弛剂的方法，其中所述肌肉松弛剂为包含不含复合蛋白的肉毒毒素神经毒成分的重组溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供应涉及贮存和/或运输或为制备所述肌肉松弛剂的方法中的一个步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述肌肉松弛剂在高于6℃，优选高于25℃直至70℃的环境温度下运输或贮存或者运输和贮存而不需要任何冷却装置。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述肌肉松弛剂经历“冷冻和解冻”-循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述“冷冻和解冻”-循环次数为1到20。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述肌肉松弛剂在防腐剂和/或镇痛剂的存在下保持稳定。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述重组溶液贮存在由塑料、玻璃或金属或其任何组合制成的容器中。
8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述溶液还包含蔗糖或人血清白蛋白或两者兼而有之。
9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述溶液还包含至少一种选自不同于蔗糖和人血清白蛋白的冷冻保护剂、稳定剂、pH缓冲液、赋形剂及其混合物的成分。
10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述神经毒成分为A型肉毒毒素的神经毒成分。
CN200880018452A 2007-06-01 2008-05-28 基于肉毒毒素的神经毒成分供应温度-稳定性肌肉松弛剂的方法 Pending CN101720331A (zh)

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