CN109925284A - 肉毒杆菌毒素冻干制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肉毒杆菌毒素冻干制剂，该冻干制剂不包含源自动物的蛋白质稳定剂。本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂可维持肉毒杆菌毒素的活性，还能在贮存，运送及操作肉毒杆菌时可能发生的高温条件下展示出良好的长期的贮存稳定性。

Description

肉毒杆菌毒素冻干制剂
本申请是申请日为2012年3月30日、发明名称为“肉毒杆菌毒素冻干制剂”的申请号为201280016784.6的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及肉毒杆菌毒素冻干制剂，该冻干制剂不包含源自动物的蛋白质稳定剂。
背景技术
肉毒杆菌毒素为厌氧性细菌梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)的多肽产物，是能够特异性地作用于神经细胞的毒性物质。虽然肉毒杆菌毒素本为一种能致死的毒性物质，然而最近用于治疗颈部肌张力障碍、眼睑痉挛、多汗症、斜视、失弛缓症(achalasia)、神经源性膀胱、泌尿系统疾病、偏头痛等。将肉毒杆菌毒素应用于药物组合物的例子有现在由本发明人所销售的Meditoxin Inc.。
诸多具有药理效果的蛋白质具有粘附于固体表面的特性。因此，将其注入容器中时，部分蛋白质会粘附于容器内壁上而带来活性成分的损失。此外，蛋白质易被氧化或被降解成小片段，因此有必要添加稳定剂，使之当作能够防止蛋白质氧化或降解的物质。
最近，作为肉毒杆菌毒素的稳定剂可使用白蛋白和明胶。白蛋白可通过减少注入容器时由蛋白质的粘附或稀释所造成的蛋白质的变性来降低蛋白质活性成分的损失。明胶为将胶原蛋白水解而获得的物质，有时可代替白蛋白而使用。然而，由于白蛋白和明胶是源自动物的蛋白质，有种危险是可能会携带来源于血液的病原体或潜在感染剂。因此，需要一种非源于动物且不会损失肉毒杆菌毒素活性的稳定剂。
为此，本发明人通过韩国公布专利公告第2009-0005963号已公开了在常温下具有长期稳定性的、包含肉毒杆菌毒素、蛋氨酸及聚山梨酯20的肉毒杆菌毒素的药物液态组合物。然而，所述液态组合物很难在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的稳定性。
发明内容
技术问题
本发明在于提供一种在常温以上的高温下能长期地维持贮存稳定性的肉毒杆菌毒素冻干制剂。
技术方案
对于传统的肉毒杆菌毒素制剂来说，在冷藏或常温下可维持肉毒杆菌毒素的稳定性。然而，在高温下很难长期地维持肉毒杆菌毒素的活性。因此，本发明人研发出在宽的温度范围如冷冻温度、冷藏温度、常温和高温下也能长期地维持肉毒杆菌毒素的活性、且具有优秀的贮存稳定性的肉毒杆菌毒素冻干制剂。
由此，本发明提供一种药物冻干制剂，该药物冻干制剂包含1)肉毒杆菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸；及选自4)糖、糖醇和离子化合物中的至少一种成分。
有益效果
本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂可以维持肉毒杆菌毒素的活性，而且在保藏、运送以及操作时可能出现的高温条件下还能展示出良好的长期的贮存稳定性。
具体实施方式
本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂包含传统的液态制剂中所包含的1)肉毒杆菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸；其特征在于，该肉毒杆菌毒素冻干制剂还包含作为附加成分的、选自4)糖、糖醇及离子化合物中的至少一种。
将肉毒杆菌毒素制成冻干剂型时，所述附加成分起到不仅能够维持肉毒杆菌毒素的活性，还在常温以上的高温下稳定活性的作用。对于包含1)肉毒杆菌毒素；2)聚山梨酯；3)蛋氨酸的组合物，进行冻干时该组合物的稳定性会下降，而且被制成液态制剂时在常温以上的高温下其稳定性也会下降。反之，本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂不仅在常温以上的高温下能够维持肉毒杆菌毒素的活性，而且还具有良好的长期的贮存稳定性。
本发明的冻干制剂所包含的肉毒杆菌毒素可来源于梭状芽孢杆菌。本发明的冻干制剂所包含的肉毒杆菌毒素可通过公知方法从上述菌株中分离并纯化而得，或将市场上可见的产品用作所述肉毒杆菌毒素。
本发明的冻干制剂所包含的肉毒杆菌毒素可从肉毒杆菌血清型(Serotype)A、B、C、D、E、F及G中任意选取。根据免疫识别法，可以将肉毒杆菌毒素分为血清型A、B、C、D、E、F及G。所有的血清型肉毒杆菌毒素会阻断神经肌接头中的信号传递分子乙酰胆碱的分泌来产生麻痹神经的效果，然而不同的血清型可作用于不同的动物种类，而且具有不同的麻痹程度、持续时间等。
此外，梭状芽孢杆菌细菌在产生毒素蛋白时，通过形成各种能够辅助并保护肉毒杆菌毒素蛋白的功能的血凝素(Hemagglutinin)和非血凝素蛋白、以及各种复合物来产生肉毒杆菌毒素蛋白。本发明的冻干制剂所包含的肉毒杆菌毒素可包含含有复合蛋白的复合物形式和未含有复合蛋白的形式。肉毒杆菌毒素的活性不会因是否含有所述复合蛋白而受影响。
在本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂中，聚山梨酯为肉毒杆菌毒素的稳定剂的一种，是非离子型表面活性剂，在制药或食品领域主要用作乳化剂。根据氧乙烯基团总数量，聚山梨酯的种类包括聚山梨酯20、40、60、80和100。对于本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂，可使用上述所有的聚山梨酯。相对于肉毒杆菌毒素100单位，聚山梨酯的含量为0.01～2mg的。在此范围内，不仅可在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。
此外，蛋氨酸，一种稳定剂，作为肉毒杆菌毒素的稳定剂，可代替动物蛋白质如白蛋白或明胶来使用。相对于肉毒杆菌毒素100单位，蛋氨酸的含量为0.01～10mg。在此范围内，不仅可在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。
与传统的液态制剂不同，除了蛋氨酸和聚山梨酯外，本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂还包含4)糖、糖醇及离子化合物中的至少一种。
已知，糖能防止高分子的变性。可用于本发明的冻干制剂包括，如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、棉子糖、乳糖、葡萄糖等，但不限于此。相对于肉毒杆菌毒素100单位，所述糖的含量为0.1～50mg。在此范围内，不仅可在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。
已知，糖醇可在液态下或在冻干时能稳定高分子并防止其变性。可用于本发明的冻干制剂包括，如环糊精、甘露醇、山梨糖醇、甘油、木糖醇、肌醇等，但不限于此。相对于肉毒杆菌毒素100单位，所述糖醇的含量为0.1～50mg。在此范围内，不仅可在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。
此外，离子化合物指盐或缓冲液。离子化合物可通过特异性或非特异性的结合与高分子反应。盐可以增强热稳定性，增加溶解度，而且可以减少聚集程度。然而，需要注意的是，在高浓度的盐中蛋白质可易于变性。因此，可用于本发明的冻干制剂包括，如氯化钠、磷酸钠、磷酸铵、硫酸镁、乙酸钠、乳酸钠、琥珀酸钠、丙酸钠、磷酸钾等，但不限于此。相对于肉毒杆菌毒素100单位，所述离子化合物的含量为0.1～10mg。在此范围内，不仅可在常温以上的高温下维持肉毒杆菌毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。
本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂可从特定的培养基内所培养的梭状芽孢杆菌的培养物中制备而得，但本发明不限于此。通过一系列酸沉淀从培养物溶液中对肉毒杆菌毒素复合物进行纯化来获得由活性高分子量毒素蛋白及相关血凝素蛋白组成的肉毒杆菌毒素复合物晶体。将所述晶体复合物溶解于含有盐水和稳定剂的溶液中，然后将其冻干而制成肉毒杆菌毒素冻干制剂。
实施例
通过参考后续的实施例可明确本发明的优点和特征、以及获得所述优点和特征的方法。然而，本发明不会受以下所公开的任一试验实施例的限制，而且可通过多种形式来实现。这些试验实施例是为了使本发明公开完整，并让本领域的技术人员理解本发明的范畴而所提供。本发明的范围应根据所附的权利要求书的范围而定。
【实施例1】肉毒杆菌毒素冻干制剂的制备
本发明的肉毒杆菌毒素冻干制剂是将已灭菌处理的、包含肉毒杆菌毒素、蛋氨酸和聚山梨酯、以及糖或糖醇和/或离子化合物的溶液进行冻干处理而制得。
(肉毒杆菌毒素的稳定性测试)
肉毒杆菌毒素的稳定性可通过贮存一段期间后的活性的持续性来判断，而肉毒杆菌毒素的活性的持续性可通过小鼠LD50的致死率来测定。在40℃、相对湿度70％下将所述冻干制剂剂型贮存30天，然后溶解于生理盐水中。而后，给3只小鼠腹腔注射相当于2.5LD50IU的肉毒杆菌毒素。当2只或以上小鼠死亡时，就能确认稳定性在持续，在下面表中以死亡率表示。小鼠的死亡率达50％或以上时，可评估出维持了肉毒杆菌毒素的活性。
(滴定法)
如下进行滴定法。在2个装有试样的瓶中分别加入2.8ml生理盐水。从所述瓶中提取4.4ml试样，然后将1.45ml生理盐水加入于试样中而获得测试溶液1。将1.45ml生理盐水加入于4.4ml测试溶液1中而获得测试溶液2。通过相同方法，重复稀释溶液8次来制得各测试溶液。给17～22g重量的小鼠(CD1，雌性)腹腔注射测试溶液3～6，每种测试溶液各注射10只，每只各注射0.1ml，经过3天后测定死亡率。用概率法对结果进行统计处理而获得小鼠LD50和滴度。
【实施例2】肉毒杆菌毒素的稳定剂的选取
(1)蛋氨酸和聚山梨酯组合的选取
从已知的作为肉毒杆菌毒素的稳定剂的成分的人血清白蛋白和聚山梨酯组合中选取代替人血清白蛋白的稳定剂。
表1
从上述结果可评估，蛋氨酸和聚山梨酯20组合能够代替HAS和聚山梨酯20组合作为稳定剂。
其次，对于被选作肉毒杆菌毒素的稳定剂的蛋氨酸和聚山梨酯20组合，可通过对蛋氨酸和聚山梨酯20组合的浓度进行各种变化来进行肉毒杆菌毒素的稳定性试验。
表2展示了贮存30天时蛋氨酸和聚山梨酯20组合在多种浓度下的肉毒杆菌毒素的稳定性试验的结果(死亡率(％))，而表3展示了贮存60天时蛋氨酸和聚山梨酯20组合在多种浓度下的肉毒杆菌毒素的稳定性试验的结果(死亡率(％))。在上述试验的肉毒杆菌毒素液态组合物中，肉毒杆菌毒素的浓度为100单位/ml。
表2
表3
通过利用表2和表3所列的结果进行统计分析的结果，可认为25～75mM蛋氨酸和0.1～2.5mg/ml聚山梨酯20的组合在最大程度上能够稳定肉毒杆菌毒素。
(2)附加成分的选取
将从表2和表3中选取的蛋氨酸和聚山梨酯20的组合用作冻干制剂时，算出蛋氨酸的含量范围在0.01～10mg内，聚山梨酯20的含量范围在0.01～1mg内。然而，将具有此组合的稳定剂用作冻干制剂时，贮存30天后无法持续稳定性。因此，如表4所示来选取能够维持稳定性的附加稳定剂。此时，可使用100单位肉毒杆菌毒素、3mg蛋氨酸和2mg聚山梨酯20。
表4
如表4所示，可以确认的是，当使用仅包含作为稳定剂的蛋氨酸和聚山梨酯20的冻干制剂时，不能持续肉毒杆菌毒素的稳定性效果，而除了蛋氨酸和聚山梨酯20外还添加糖、糖醇和离子化合物中的至少一种时，能够维持稳定性效果。
其次，对蛋氨酸和聚山梨酯20中所要进一步添加的糖、糖醇或离子化合物的的适当的含量及种类进行测试。此时，可使用100单位肉毒杆菌毒素、2mg蛋氨酸和0.2mg聚山梨酯20。
表5
如表5所示，可确认在蛋氨酸和聚山梨酯20中添加0.1～50mg蔗糖、0.1～10mg氯化钠时，能够维持稳定性效果。所述附加稳定剂的含量低于此范围时会无稳定性效果，而所述附加稳定剂的含量高于此范围时不能获得作为冻干制剂的稳定形态。
其次，在高温下根据滴定法对冻干制剂的长期稳定性进行测试。此时，将肉毒杆菌毒素+蛋氨酸+聚山梨酯20+磷酸钠+蔗糖组合用作所述冻干制剂时，可使用100单位肉毒杆菌毒素、0.8mg蛋氨酸、0.02mg聚山梨酯20、磷酸钠(0.05mg无水磷酸氢二钠+0.101mg磷酸二氢钠二水)和4mg蔗糖。将肉毒杆菌毒素+蛋氨酸+聚山梨酯20+氯化钠+蔗糖组合用作所述冻干制剂时，可使用100单位肉毒杆菌毒素、0.2mg蛋氨酸、0.02mg聚山梨酯20、2mg氯化钠和4mg蔗糖。将含有人血清白蛋白的冻干制剂作为对照组时，可使用0.5mg人血清白蛋白、0.9mg氯化钠。
表6
如表6所示，可确认将肉毒杆菌毒素、蛋氨酸、聚山梨酯、磷酸钠或氯化钠及蔗糖组合用作冻干制剂时，稳定剂效果能维持6个月左右。
工业应用性
本发明可用于治疗颈部肌张力障碍、眼睑痉挛、多汗症、斜视、失弛缓症、神经原性膀胱、泌尿系统疾病、偏头痛等。

Claims (12)

1.一种药物冻干制剂，其包括：
肉毒杆菌毒素、聚山梨酯和蛋氨酸；以及
选自糖、糖醇和离子化合物中的一种或多种成分。
2.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述肉毒杆菌毒素选自肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F及G。
3.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述肉毒杆菌毒素为不含复合蛋白的形式或含有复合蛋白的复合物形式。
4.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述聚山梨酯为聚山梨酯20、40、60、80和100中的任一种。
5.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，相对于100单位肉毒杆菌毒素，所述聚山梨酯的含量为0.01～2mg。
6.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，相对于100单位肉毒杆菌毒素，蛋氨酸的含量为0.01～10mg。
7.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述糖为选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，相对于100单位所述肉毒杆菌毒素，所述糖的含量为0.1～50mg。
9.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述糖醇为选自环糊精、甘露醇、山梨糖醇、甘油、木糖醇和肌醇中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，相对于100单位所述肉毒杆菌毒素，所述糖醇的含量为0.1～50mg。
11.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，所述离子化合物为选自氯化钠、磷酸钠、磷酸铵、硫酸镁、乙酸钠、乳酸钠、琥珀酸钠、丙酸钠和磷酸钾中的一种或多种。
12.根据权利要求1所述的药物冻干制剂，其特征在于，相对于100单位所述肉毒杆菌毒素，所述离子化合物的含量为0.1～10mg。
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