KR20230001254A - 재조합 보툴리눔 독소 타입 a 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소 및 이의 조성물, 용도 및 방법 - Google Patents

재조합 보툴리눔 독소 타입 a 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소 및 이의 조성물, 용도 및 방법 Download PDF

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Abstract

효과 및 반감기가 증가되어 환자의 편의성이 높아지고 적응증 맞춤 치료가 가능한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법을 제공하기 위한 것이다.

Description

재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소 및 이의 조성물, 용도 및 방법 {Recombinant botulinum toxin type A light chain, recombinant botulinum toxin, and its compositions, uses and methods}
본 개시는 재조합 보툴리눔 독소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BoNT)는 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부의 축삭돌기 말단으로부터 분비되는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 방출을 막는다.
보툴리눔 독소는 디설파이드 결합(disulfide bond)에 의해 연결된 100kDa 중쇄(Heavy Chain) 및 50kDa 경쇄(Light Chain)로 구성된 150kDa 이중쇄 단백질로 합성된다. 중쇄는 경쇄를 세포의 시토졸(cytosol)로 전위(translocation)시키는 것을 돕는 N-말단 도메인(Hn), 및 신경 세포 상의 세포 표면 수용체를 인지하고 결합하는 C-말단 도메인(Hc)으로 추가로 나뉜다. 세포 내로 들어가면, 경쇄는 가용성 NSF 부착단백질 수용체(soluble NSF-attachment protein receptor, SNARE) 의 일부를 특이적으로 가수분해(proteolytic cleavage)하여 신경전달물질 방출을 비활성화한다.
보툴리눔 독소는 7개의 혈청형(보툴리눔 독소 타입 A, 보툴리눔 독소 타입 B, 보툴리눔 독소 타입 C, 보툴리눔 독소 타입 D, 보툴리눔 독소 타입 E, 보툴리눔 독소 타입 F 및 보툴리눔 독소 타입 G)으로 나뉘며, 이들은 아미노산 서열의 변이에 기초하여 아형(subtype)으로 추가로 세분화된다. 이들 중 보툴리눔 독소 타입 A1은 분자 수준 연구 및 전임상, 임상 단계 연구가 폭넓게 진행되었으며 현재 제약 산업에서 널리 이용되고 있다. 반면, 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경우 정제된 독소를 분리시키는데 어려움이 있어 약리학적 특징에 관하여 연구되거나 보고된 것이 적다. 현재 보툴리눔 독소 타입 A 아형 중 일부만이 생화학적, 세포적 그리고 생체 내에서의 특성이 규명되었다. 보고된 연구에 따르면 보툴리눔 독소 타입 A 아형에 대한 다양한 시험관내 및 생체 내 연구들로 효력, 세포내 이동, 지속력 등의 메커니즘 측면에서 보툴리눔 독소 타입 A1과 구별되는 특성들이 밝혀졌다. 최근 보툴리눔 독소 타입 A7 및 A8에 대해 시험관내 수준에서의 특성이 보고되고 있다.
국제공개 WO2018/132423는 개선된 역가, 세포 진입 동역학, 및 작용 지속기간을 갖기 위한, 보툴리눔 신경독소 타입 A 제 1 아형의 경쇄 펩티드 및 제 2 아형의 중쇄 펩티드를 포함하는 보툴리눔 신경독소 혼합물 및 이를 포함하는 제약 조성물을 개시하고 있다. 또한, 국제공개 WO2017/214447는 보다 적은 용량으로 동일한 수준의 독소 활성을 유지하기 위해 중쇄 서열을 재조합 한 보툴리눔 독소 B1을 개시하고 있다.
그러나, 지금까지 보툴리눔 신경독소 타입 A 아형 경쇄의 하위 도메인을 재조합 한, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소의 효력을 향상시키려는 시도는 없었다.
본 개시의 목적은 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소를 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 개선 또는 치료방법을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 야생형 보툴리눔 독소 대비, 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 일 양상은 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
본 개시의 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 용도를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효과 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효과 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시에 따르면, 효력 및 반감기가 증가하여 환자의 편의성이 높아지고 적응증 맞춤 치료가 가능한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법이 제공된다.
도 1a는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 (GenBank: CAL82360.1), 및 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 (GenBank: ACQ51417.1)의 서열 비교 (ESPript3.0, Robert and Gouet, 2014)를 나타낸다. 도메인 치환을 위한 각 도메인의 경계와 시작점은 화살표 및 박스로 표시하였으며, 아래 표는 각 도메인의 서열 범위와 두 서열 간의 아미노산 상동성 분석 결과이다.
도 1b는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 및 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄를 분할한 도메인에 대한 구조적 정보를 나타낸 것으로, 각 도메인에 대한 아미노산 서열 차이와 기능적 특성을 나타낸다.
도 1c는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 조합을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 도메인을 치환하고 정제한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 2b는 Clover-SNAP25-mRuby2(137-206)가 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 의해 가수분해된 부위를 확인한 결과이다. 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 존재하는 조건과 존재하지 않는 조건에서 형광단백질 표지가 부착된 SNAP25(137-206)의 가수분해 유무를 확인한 결과, 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 존재하는 조건에서 가수분해 되었다. 샘플은 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 통해 분석하였다.
도 3은 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성을 나타낸 그래프이다. 아래 표는 각각의 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄의 용해 온도를 나타낸다.
도 4는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 엔도펩디데이즈 어세이(endopeptidase assasy) 결과이다. 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄와 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 역가 결과를 비교하면, pBT103은 야생형과 유사한 역가를 보였으며, pBT112는 1.73배, pBT113은 1.49배, pBT114는 1.3배, pBT115는 1.55배 증가하였다.
도 5는 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄가 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 제 3 도메인으로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 정제된 산물을 SDS-PAGE 분석한 결과(도 5a), 및 열적안정성을 분석한 결과(도 5b)이다. 각각의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점은 아래 표에 나타내었다. 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인을 도입할 경우, 열적안정성이 가장 많이 향상되었다.
도 6a는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소 구성을 도시한 모식도이다.
도 6b는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 도입된 재조합 보툴리눔 독소의 정제된 산물에 대해, 환원조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과이다. 재조합 보툴리눔 독소는 불순물이 없는 150kd 형태로 정제한 후, 환원조건에서 SDS-PAGE 분석하였다.
도 7a는 랫드에서 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A 제품)및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05)
도 7b는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석한 결과를 나타내었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 7d는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05, **p<0.01)
도 7e는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)을 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 7f는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)을 각각 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석한 결과를 나타내었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 8a는 마우스에서 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A 제품) 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05)
도 8b는 마우스에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 마우스에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
달리　정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속한 분야에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 이해를 위해, 하기　정의가 적용될 것이고, 단수형으로 사용되는 용어는 복수형을 포함하며, 이의 역도 마찬가지이다.
본원에서 사용되는, 용어 '단백질', '폴리펩티드'는 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 의미하기 위해서 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성된 비천연 발생 아미노산, 예를 들어 관련된 천연 발생 아미노산의 화학적인 유사체를 비롯하여, 천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 이들 용어는 또한 폴리펩티드의 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 인산화 및 아세틸화를 포함한다.
용어 '보툴리눔 독소 (Botulinum toxin, BoNT)'는 보툴리눔 독소의 임의의 폴리펩티드 또는 단편을 포괄한다. 구체예에서, 보툴리눔 독소는 전장 보툴리눔 독소(full-length botulinum toxin) 또는 보툴리눔 독소 단편(botulinum toxin derived fragments)을 지칭한다. 구체예에서, 보툴리눔 독소는 뉴런에 진입하고, 신경전달물질 방출을 억제하는 전체적인 세포 메커니즘을 실행할 수 있다.
용어 '도메인'은 주어진 단백질 서열 및 보존된 부분으로 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 진화하고 기능하며 존재할 수 있는 3차 구조이다. 도메인은 독립적으로 안정하기 때문에, 도메인은 하나의 단백질과 다른 단백질 사이의 유전 공학에 의해 도메인 스왑(domain swap)되어 키메라 단백질(chimera protein)을 생성할 수 있다.
용어 '상동성'은 폴리펩티드들 사이의 아미노산 서열 동일성 정도를 일컫는다. 예를 들어 제 1 아미노산 서열이 제 2 아미노산 서열과 동일한 경우, 제 1 및 제 2 아미노산 서열은 100％ 상동성을 나타낸다.
용어 '재조합'은 DNA(Deoxyribonucleic Acid)나 RNA(Ribonucleic Acid)와 같은 유전자를 이루는 요소가 해체와 재조립 과정에서 원래의 서열과는 다르게 뒤바뀌는 과정을 가리키는 용어이다. 분자생물학의 실험을 통해 DNA의 조각을 인위적으로 재조합 할 수 있다. 이렇게 인위적으로 재조합 된 DNA를 재조합 DNA라 한다.
용어 '변이체'는 즉, 핵산 또는 아미노산 서열에서의 임의의 변형, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산의 절단, 부가, 결실, 치환, 및 이들의 임의의 조합을 포괄한다. 즉, '재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 도메인의 변이체'는 재조합 보툴리눔 신경독소 타입 A 경쇄 도메인을 구성하는 핵산 또는 아미노산의 절단, 부가, 결실, 치환, 및 이들의 임의의 조합을 포괄할 수 있다.
용어 '치환'은 임의의 서열 위치에서 정상적으로 발견되는 야생형 잔기 이외의 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 비-극성(소수성) 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 및 프롤린으로의 대체일 수 있다. 치환은 극성 (친수성) 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민으로의 대체일 수 있다. 치환은 전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어, 음전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 및 글루탐산 및 양전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로의 대체일 수 있다.
용어 '야생형'은 자연에서 발생하는 일반적인 종의 표현형을 말한다. 일반적으로, 야생형은 비표준 돌연변이(mutant) 대립 유전자에 의해 생성된 것과는 반대로 유전자좌(locus)에서 표준 정상(normal) 대립 유전자의 산물일 수 있다.
용어 '개체'는 남성 또는 여성일 수 있다. 개체는 완전히 발달된 개체 (예를 들어, 성인) 또는 발달 과정을 겪고 있는 개체 (예를 들어, 아동, 유아 또는 태아)일 수 있다. 개체는 포유동물일 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 또는 소일 수 있고, 이들 예로 제한하지 않는다.
최근 시판 중인 보툴리눔 독소 제제들은 대부분 유효성분이 보툴리눔 독소 타입 A1인 제제이고, 마이오블록(Myobloc)의 경우에는 보툴리눔 독소 타입 B1을 유효성분으로 사용하고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A1 제제의 효력 지속기간은 평균 약 3개월 가량이고, 보툴리눔 독소 타입 B1 제제의 경우에는 더 짧은 것으로 알려져 있다. 근육내 주사로 투여해야 하는 보툴리눔 독소 제제의 특성상, 환자의 편의성 측면에서 시판 중인 제제보다 긴 지속성을 갖는 제품의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 서열을 제 1, 2, 3, 4 도메인으로 도 2의 도메인 특성에 따라, 도 1과 같이 총 4개의 도메인으로 분할하였다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 1 도메인(서열번호 1), 및 A4 경쇄의 제 1 도메인(서열번호 5)은 주로 기질인 SNAP25와 상호결합하는 부위로 α-exosite가 포함된 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 1 도메인은 1번 위치의 아미노산 내지 90~150번 위치의 아미노산 (예를 들면 90번, 95번, 100번, 105번, 110번, 115번, 120번, 125번, 130번, 135번, 140번, 145번, 및 150번 위치의 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 2 도메인(서열번호 2), 및 A4 경쇄의 제 2 도메인(서열번호 6)은 경쇄의 효소 활성에 주로 관여하는 부분으로 170루프(loop)를 포함하며 보조인자인 아연과 결합하는 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 2 도메인은 91~151번 위치의 아미노산 (예를 들면 91번, 96번, 101번, 106번, 111번, 116번, 121번, 126번, 131번, 136번, 141번, 146번, 및 151번 위치의 아미노산) 내지 210~270번 위치의 아미노산 (예를 들면 210번, 215번, 220번, 225번, 230번, 235번, 240번, 245번, 250번, 255번, 260번, 265번, 및 270번 위치의 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인(서열번호 3), 및 A4 경쇄의 제 3 도메인(서열번호 7)은 기질 결합을 안정화시키는 250루프(loop)과 370루프(loop)을 포함하고 있으며 기질 결합부위인 α-exosite, β-exosite에 모두 관여하는 부위이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 3 도메인은 211~271번 아미노산 (예를 들면 211번, 216번, 221번, 226번, 231번, 236번, 241번, 246번, 251번, 256번, 261번, 266번 및 271번 아미노산) 내지 386~446번 아미노산 (예를 들면 386번, 391번, 396번, 401번, 406번, 411번, 416번, 421번, 426번, 431번, 436번, 441번, 및 446번 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 4 도메인(서열번호 4), 및 A4 경쇄의 제 4 도메인(서열번호 8)은 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 구조적 유연성에 관여하는 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 4 도메인은 362-425번 아미노산 (예를 들면 362번, 367번, 372번, 377번, 382번, 387번, 392번, 397번, 402번, 407번, 412번, 417번, 422번 및 425번 아미노산) 내지 410~448번 아미노산 (예를 들면 410번, 414번, 417번, 420번, 425번, 430번, 435번, 440번, 445번, 및 448번 아미노산)일 수 있다.
본 개시의 일 양상에 따르면, 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인 또는 이의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄(서열번호 9), 보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄(서열번호 10), 보툴리눔 독소 타입 A3 경쇄(서열번호 11), 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄(서열번호 13), 보툴리눔 독소 타입 A6 경쇄(서열번호 14), 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄(서열번호 15) 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄(서열번호 16)인 것일 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인은 서열번호 7의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인의 변이체는 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 3 도메인과 동일하게 기질 결합부위인 α-exosite, β-exosite에 모두 관여하고, 서열번호 3의 서열과 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％, 또는 적어도 99.5％ 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 4 도메인 또는 이의 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 4 도메인은 서열번호 8의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 4 도메인의 변이체는 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 4 도메인과 동일하게 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 구조적 유연성에 관여하고, 서열번호 4와 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％, 또는 적어도 99.5％ 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 중쇄는, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 B 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 C 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 D 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 E 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 F 중쇄, 또는 보툴리눔 독소 타입 G 중쇄일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A2 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A3 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A4 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A5 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A6 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A7 중쇄 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 중쇄일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄(서열번호 17)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄가 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 것인, 재조합 보툴리눔 독소일 수 있다. 예를 들어, 재조합 보툴리눔 독소는, 보툴리눔 독소 타입들 사이에서 높은 정도의 아미노산 서열 상동성을 갖는 약 150 kDa 중량의 비교적 불활성인 단일 폴리펩타이드 쇄로서 클로스트리디움 박테리아에서 생산된다. 단일 폴리펩타이드는 이어서 대략 100 kDa 중쇄(heavy chain) 및 50 kDa 경쇄(light chain)로 분해되고, 중쇄 및 경쇄는 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온 화합물(ionic compound), 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합, 예를 들어 아미노산(예를 들어 메티오닌), 염(예를 들어 NaCl), 완충액, 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20), 당(예를 들어 백당 등과 같은 다이사카라이드), 당 알코올(예를 들어 소르비톨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 조성물은 WO2009-008595A1 또는 WO2012-134240A2에 개시되어 있는 것들을 포함하며, 상기 특허의 내용은 그 전체로 본 명세서에서 참조로 인용된다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 고체 또는 액체 제제, 예를 들어 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지(pre-filled syringe) 제제 등 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 용도를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 용도일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 용도일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 경피, 피하, 또는 근육내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 구체예에서, 상기 조성물을 근육 또는 근육의 군에 국소적으로 투여하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 구체예에서, 이마 주름, 피부 주름의 감소는 상기 조성물을 해당 주름의 경피 또는 피하에 투여하는 것에 의해 이루어질 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 추가로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 방법일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 서로 치환하는 단계; 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 유전자를 각각 클로닝하고 대장균(E. coli)에 도입한 후, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하는 단계; 이 중에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄(pBT103, 서열번호 19)를 제조하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 서로 치환하는 단계; 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 유전자를 각각 클로닝하고 대장균(E. coli)에 도입한 후, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하는 단계; 이 중에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인, 및 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인, 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄(pBT104, 서열번호 20)를 제조하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A2 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A3 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A4 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A5 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A6 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A7 중쇄 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 중쇄일 수 있다. 구체예에서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄(서열번호 17)일 수 있다.
예를 들면, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 (pBT103, pBT104) 및 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄를 포함하는 전장 재조합 보툴리눔 독소 유전자(pBT142, pBT147)를 클로닝하는 단계; 독소 유전자를 불활성화한 무독화 균주를 제조 도메인이 치환된 보툴리눔 독소를 제조[Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016]하는 단계; 복합체 성분을 갖지 않는 150kDa 형태의 재조합 독소로 정제하여 분리하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법일 수 있다.
이하, 본 개시를 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 이는 본 개시의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 개시의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 도메인 치환
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄에 있어서, 어느 도메인이 단백질 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 치환하였다. 인퓨전 클로닝(In-fusion cloning) 방법을 사용하여 도메인이 치환된 유전자 및 야생형을 포함한 총 16개의 도메인 치환 경쇄 유전자를 대장균(E.coli) 발현벡터인 pET28a에 클로닝하였고, 각각 pBT102 내지 pBT108, 및 pBT109 내지 pBT115로 명명하였다(도 1c). 이후, 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄 유전자 서열을 분석하여 도메인 치환을 확인하였다.
실시예 2: 도메인 치환 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 유전자를 이용하여, 14종의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하였다. 제조한 재조합 발현벡터를 대장균(E.coli)의 일종인 BL21(DE3) 세포에 도입하여, 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하였다. 발현은 IPTG((Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 유도하고, 최종 농도는 0.5mM이 되도록 사용하였다. 즉, 1M IPTG 0.5㎖을 액체배지 1L에 넣어준 후, 37℃에서 약 3시간, 18℃에서 약 18시간을 배양한 BL21(DE3) 세포를 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상층액의 배지를 제거하고, 침전된 세포를 A buffer(20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10mM Imidazole, 2mM B-Me, pH 7.9)로 재부유(resuspension) 시킨 후, 얼음에서 초음파 분산기로 2 pulse/1 pause, 파워 35%로 20분간 세포를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 세포를 4℃ 14,000rpm에서 1시간 원심분리한 후, 세포 찌꺼기가 제거된 상층액을 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 히스 태그(His tag)와 Ni-NTA 레진(resin)의 결합을 통해, 상층액으로부터 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 분리하였다. 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 아미노산 서열을 각각 pBT102(서열번호 18), pBT103(서열번호 19), pBT104(서열번호 20), pBT105(서열번호 21), pBT106(서열번호 22), pBT107(서열번호 23), pBT108(서열번호 24), pBT109(서열번호 25), pBT110(서열번호 26), pBT111(서열번호 27), pBT112(서열번호 28), pBT113(서열번호 29), pBT114(서열번호 30), 및 pBT115(서열번호 31)로 나타내었다.
상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1, A4를 비롯한, 총 16종의 단백질 발현을 시도하였으나 5종은 발현량이 적거나 봉입체(inclusion body)로 발현되었고, 최종적으로 11종의 단백질이 가용성으로 발현되었다(도 2a). 이후, 정제된 11종의 단백질을 N-말단과 C-말단에 형광단백질이 표지된 SNAP25(137-206) 기질과 반응시켜, 프로테아제 활성을 확인하였다. 형광단백질이 표지된 SNAP25(137-206) 3μM을 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 0.2μM과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 SDS-PAGE에 로딩하였다. 쿠마시 블루 염색을 통하여 형광단백질-태그 부착된 SNAP25(137-206)가 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 의해 가수분해됨을 확인하였다(도 2b).
시험예 1: 도메인 치환된 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성 평가
도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성을 비교하였다. 안정성 평가방법으로서 열변성 중간온도(Tm)의 평가를 수행하였으며, 일반적으로 열변성 중간온도는 높은 것이 바람직하다. 각 도메인 치환 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열안정성은 열이동분석법(PTS)을 사용하였다. 프로틴 써멀 시프트 다이 키트(Protein Thermal Shift Dye Kit)(Catalog No. 4461146, Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 열이동분석법 어세이를 수행하였다. 구체적으로는, 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 10㎍를 프로틴 써멀 시프트 다이와 버퍼로 20㎕가 되게 혼합한 후, RT-PCR(C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module, Bio-Rad)에서 20℃에서부터 60 초당 1℃씩 온도를 증가시키면서 95℃까지 ROX 시그널을 확인하였다. 용융 곡선을 바탕으로 각 재조합 보툴리눔 독소 경쇄의 용해점(melting temperature, Tm)을 결정하였다. 상기 도메인이 치환된 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점을 도 3에 나타내었다.
결과를 보면 pBT103(서열번호 19) 및 pBT104(서열번호 20)의 열적안정성이 증가한 것을 확인하였다. 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 용해점이 43℃인 것에 반하여 pBT103 및 pBT104의 용해점은 각각 52℃, 및 51℃로 증가하였고, pBT114 및 pBT115는 49℃로 증가하였다. 따라서, 대조군으로 사용한 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 용해점보다 pBT103 및 pBT104은 8℃, 및 9℃의 열적안정성이 증가하였고, pBT114 및 pBT115는 6℃의 열적안정성이 증가하였다. 따라서, 공통적으로 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인을 포함하도록 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점이 증가한 것을 확인하였다.
시험예 2: 도메인 치환된 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 역가 평가
도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 대한 시험관내 활성을 확인하기 위하여 효소결합 면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 기반 엔도펩티데이즈 어세이(endopeptidase assay)를 수행하였다. 먼저, GST-SNAP25 (137-206) 기질을 최종 2μg/mL이 되도록 희석한 후, 96 well 플레이트에 well 당 100μL를 첨가하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 2% 스킴 밀크(skim milk)를 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween)에 녹여 제조한 후, 기질 코팅이 끝난 웰(well)에 200㎕를 첨가하여 25℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 PBST 300㎕를 사용하여 3번 웰(well)을 씻어 준 후, Toxin Assay Buffer (HEPES, DTT, Zinc sulfate, Tween-20이 첨가된 reaction buffer)를 이용하여 표준시료(STD (1, 2, 3, 4, 5, 6U/mL) sample) 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료(타겟 농도 : 4U/mL)를 제조하여 well에 100μL씩 로딩 후 25℃에서 2시간 반응하였다. 반응 후 PBST 300㎕를 사용하여 3번 well을 씻어 준 후 1차 항체 Rabbit anti-SNAP25 (190-197) pAb를 100㎕/well 첨가한 후, 30분간 반응하고 다시 위와 같이 3번 씻어준 후 2차 항체인 Anti-rabbit IgG HRP conjugate를 첨가하여 30분간 반응하였다. TMB(BioFx사) 용액을 100㎕/well로 넣고 30 분간 25℃에서 발색하였다. 발색이 끝나면 3M 황산 50㎕/well로 첨가하여 발색을 중단하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
표준시료의 흡광값(optical density, OD)을 이용하여 표준시료의 농도와 흡광값 간의 검량선(calibration curve)을 그린 후, 생성된 1차 방정식을 이용하여 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료의 측정된 역가를 구하였다. 산출된 역가와 타겟농도를 이용하여 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료의 회수율을 산출하여 타겟 농도 대비 회수율을 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, pBT103(서열번호 19)은 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 유사한 역가를 보였으며 pBT114(서열번호 30)는 1.3배, pBT115(서열번호 31)는 1.55배 역가가 증가하였다.
비교예 1: 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경쇄 제 3 도메인으로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현, 정제 및 열적안정성 평가
재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에서 A4의 제 3 도메인이 열적안정성 증가에 있어서 중요 요인인지 확인하기 위해, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄가 아닌 다른 보툴리눔 독소 타입 A인 보툴리눔 독소 타입 A2, A5, A7, 및 A8 경쇄의 제 3 도메인을 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인과 치환한 후 열적안정성을 비교하였다.
제 3 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 확보하기 위하여 4종의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 실시예 2의 정제방법에 따라 정제하고, 각 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경쇄 제 3 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 대장균(E.coli) 발현벡터인 pET28a에 클로닝하였다.
보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT158(서열번호 32), 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT160(서열번호 33), 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT161(서열번호 34), 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT162(서열번호 35)로 명명하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하였다(도 5a). 보툴리눔 독소 타입 A3 경쇄의 제 3 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질은 발현이 되지 않았고, 보툴리눔 독소 타입 A6 경쇄 제 3 도메인은 A1의 제 3 도메인과 서열이 같으므로 시험에서 제외하였다.
위와 같이 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인을, 보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄의 제 3 도메인, 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄의 제 3 도메인, 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄의 제 3 도메인, 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄의 제 3 도메인으로 치환한 결과, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인으로 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점이 가장 높았고, 즉 열적안정성이 가장 우수하였다(도 5b).
실시예 3: 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소의 제조 및 정제
도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 대한 재조합 보툴리눔 독소의 기능 분석을 위해, 열적안정성이 증가하고 활성이 증가된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는, 재조합 전장 보툴리눔 독소 유전자를 pMTL80000 벡터 시스템을 이용하여 인퓨전 방법으로(infusion-HD, Takara) 클로닝하였다. 클로닝된 제조물은 pBT142, pBT143, pBT144, pBT145, pBT146, 및 pBT147로 명명하였고, 도 6a에 각 도메인의 구성을 모식도로 나타내었다. 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소는 클로스트론 방법(ClosTron system)을 사용하여 독소 유전자를 불활성화한 무독화 홀 에이-하이퍼(hall A-hyper) 균주를 제조하여 사용하였다.
독소 유전자가 불활성화되거나 녹아웃된 균주를 포함하는 무독화 클로스트리디움 보툴리눔 균주는, 정제된 재조합 보툴리눔 독소 또는 정제된 재조합 보툴리눔 독소 복합체의 제조방법에 사용할 수 있다. 독소 유전자가 불활성화되거나 녹아웃된 균주를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 클로스트론 방법을 사용하는 것이 문헌[Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016]에 설명되어 있다.
클로스트론 방법에 의해 제조된 재조합 보툴리눔 독소는 복합체 성분을 포함하지 않는 150kDa의 형태로 정제하였다(도 6a). 재조합 보툴리눔 독소는 각각 pBT142(서열번호 36), pBT143(서열번호 37), pBT144(서열번호 38), pBT145(서열번호 39), pBT146(서열번호 40), pBT147(서열번호 41)인 것으로 확인하였다. 상기 재조합 보툴리눔 독소의 모든 제조는 당국의 규제에 따라 독소 생산이 허가된 시설에서 수행하였다.
시험예 3: 랫드에서 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소의 효력
암컷 6주령 SD (Sprague-Dawley) 랫드를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 랫드를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료 (R40-10, SAFE, France)를 자유 급이 하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압 멸균하여 자유 급이 하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 연구는 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 후 수행하였다.
대조군으로 보툴리눔 독소 제품인 코어톡스 (보툴리눔 독소 타입 A, Lot No.: NSA19016 또는 NSA20011, 메디톡스) 100units을 사용하였다. 재조합 보툴리눔 독소 pBT142는 1316 U/mL, pBT147은 348U/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소의 역가는 마우스 역가시험법을 통해 효력 시험 전 측정하여 도출된 역가값을 바탕으로 시험을 수행하였다. 플라시보(위약 투여군)로는 재조합 보툴리눔 독소에서 보툴리눔 독소 성분을 제외하고 부형제 성분을 동일하게 사용하여, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147, 및 코어톡스의 효력시험을 진행하였다. 각 시험물질의 투여 용량은 모두 unit (U: 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 나타내는 값으로 1U은 마우스 복강투여에 의한 마우스 반수치사량)을 기준으로 동일한 용량으로 투여하였다.
코어톡스는 멸균 생리식염수 (35V3AF3, 대한약품공업)를 사용하여 희석하였으며, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147은 플라시보를 이용하여 12, 40, 120 U/mL 농도로 각각 희석하였다. 시험물질이 투여된 날을 0일로 하였으며, 주사마취제 (60 mg/kg 염산케타민 + 10 mg/kg 자일라진)를 이용해 랫드를 마취한 뒤, 표 1의 각 군의 구성에 따라 각각의 시험물질을 랫드의 오른쪽 장딴지근육에 해밀턴 주사기를 이용하여 0.1mL/kg로 투여하였다.
효력 평가로는 랫드의 근육 마비 정도를 육안으로 평가하는 DAS (digit abduction score) 평가법과 외부적인 전기 자극에 반응하는 근육의 활동전위를 측정하는 복합근육 활동전위 (CMAP: compound muscle action potential) 시험법을 사용하였다.
군 동물수 투여물질 용량 (U/kg) 투여경로 평가지표
실험1 1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 pBT142 1.2 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT142 4 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT142 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
실험2 1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 pBT147 1.2 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT147 4 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT147 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
표 2에 표기된 DAS 수치는 랫드에서 투여된 쪽의 발가락 형태에 의한 근육 마비 정도를 나타내며, CMAP 값은 신경 차단에 의해 나타나는 직접적인 근육의 수축 저해 정도를 나타낸다.
점수 기준
0 정상
1 다섯번째 발가락의 외전 소실
2 세개의 발가락이 서로 붙어있음
3 네개의 발가락이 서로 붙어있음
4 모든 발가락의 외전 소실 및 서로 붙어있음
CMAP은 Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) 장비를 이용하여 각 랫드의 오른쪽 장딴지근 부위에서 측정하였다. 주사마취제로 마취한 뒤 측정부위의 털을 제모하고 엎드린 자세로 랫드를 위치시켰다. 측정하고자 하는 다리 쪽의 좌골신경 부위에 음극을 위치시키고, 그 부위로부터 척추를 기준으로 약 1 cm 떨어진 부위에 양극을 위치시켰다. 기록 전극과 기준 전극을 장딴지근 부위와 아킬레스 건 부위에 각각 위치시키고, 접지 전극을 대퇴직근 부위에 위치시켰다. 자극의 수준과 기간은 25~30 mA, 0.2 ms 로 하였으며, 증폭기의 필터 범위는 60 Hz 에서 2-10 K로 설정하였다. 해당 조건으로 측정하였을 때 파형의 기저부에서 최고점까지의 높이를 CMAP 측정값으로 데이터화 하였다.
표 1의 시험군 구성에 따라, 실험 1에서 pBT142와 코어톡스의 효력 비교를 위한 DAS 측정은 1.2, 4, 12 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 112일까지 평가하였으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여 후 8일부터 127일까지 측정하였다. 실험 2에서 pBT147과 코어톡스 간의 효력 비교를 위해 DAS 측정은 1.2, 4, 12 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 112일까지 평가하였으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여 후 0일째부터 126일차까지 측정하였다.
Graphpad Prism 7.05 (GraphPad Software Inc., CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software 25.0 (SPSS Inc., IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 실험의 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. DAS ED50 는 Graphpad Prism을 이용해 최저 0점 및 최고 4점 값을 고정한 뒤 3-지표 로지스틱 모델을 이용해 산출하였다. Kolmogorov-Smirnov test를 이용해 정규성 검정을 실시하였다. 비모수 데이터는 Mann-Whitney 검정을 통해 통계분석을 하였으며, 모수 데이터의 경우 양측 (two-tailed) t-검정을 수행하여 p-value가 0.05 보다 작은 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
랫드 우측 장딴지근육에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소 pBT142를 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 단회 투여한 후, DAS 평가 결과 12 U/kg의 용량으로 투여 후 14일째 pBT142 투여군에서 코어톡스 투여군 대비 유의적으로 DAS 점수가 증가하였다. 코어톡스 4 U/kg 투여군에서는 49일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT142 투여군에서는 이보다 7일이 증가된 56일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 91일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 투여군의 경우 이보다 21일이 증가된 112일째 모든 개체가 회복하였다(도 7a). DAS ED50 비교를 통해 pBT142가 코어톡스보다 약 1.8배 강한 효력을 보이는 것을 확인하였다(도 7b). DAS 결과와 유사하게 CMAP 시험에서도 12 U/kg pBT142 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP값을 보여 강한 효력을 나타내며, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 112일째 CMAP값을 회복하였고, pBT142 12 U/kg 투여군은 이보다 15일이 증가된 127일째 CMAP값을 회복하였다(도 7c). 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT142의 효력과 작용기간이 증가함을 확인하였다.
랫드 우측 장딴지근육에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소 pBT147을 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 단회 투여한 후 DAS 평가 결과, 4 U/kg 용량에서 투여 후 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42일째, 12 U/kg 용량에서 투여 후 14, 21, 28일째 pBT147 투여군에서 코어톡스 투여군 대비 유의적으로 DAS 점수가 증가하였다. 코어톡스 1.2 U/kg 투여군에서는 28일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT147 투여군에서는 이보다 7일이 증가된 35일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 4 U/kg 투여군에서는 42일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT147 투여군에서는 이보다 28일이 증가된 70일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 84일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT147 투여군의 경우 이보다 28일이 증가된 112일째 모든 개체가 회복되었다(도 7d). DAS ED50 비교를 통해 pBT147가 코어톡스보다 약 1.5배 강한 효력을 보이는 것을 확인하였다(도 7e). CMAP 시험에서는 모든 측정일에서 pBT147 12 U/kg 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP 값을 보이는 것을 확인하였고, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 112일째 CMAP 회복이 관찰되었고, pBT147 12 U/kg 투여군은 이보다 14일이 증가된 126일째 CMAP 회복이 관찰되었다(도 7f). 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT147의 효력과 작용기간이 증가하였음을 확인하였다.
시험예 4: 마우스에서 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소의 효력
암컷 5주령 CD1 (ICR) 마우스를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 6주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료 (R40-10, SAFE, France)를 자유급이 하였으며, 음수는 상수도수를 고온 고압멸균하여 자유급이 하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육하였다. 본 연구는 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 후 수행하였다.
대조군으로 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A, Lot No.: NSA20015, 메디톡스) 100 units을 사용하였다. 재조합 보툴리눔 독소로 pBT142는 2803 U/mL, pBT147은 2537 U/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소의 역가는 마우스 역가시험법을 통해 효력 시험 전 측정하여 도출된 역가값을 바탕으로 시험을 수행하였다. 플라시보(위약투여군)는 재조합 보툴리눔 독소에서 보툴리눔 독소를 제외하고 나머지 부형제 성분은 동일하게 사용하였다. 효력시험에서 각 시험물질의 투여 용량은 모두 unit (U : 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 나타내는 값으로 1 U은 마우스 복강투여에 의한 마우스 반수치사량)을 기준으로 동일하게 투여하였다.
코어톡스는 멸균 생리식염수 (35V3AF3, 대한약품공업)를 사용하여 희석하였으며, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142, pBT147은 플라시보를 이용하여 6, 20, 60, 200 U/mL 농도로 각각 희석하였다. 시험물질이 투여된 날을 0일로 하였으며, 주사마취제 (100mg/kg 염산케타민 + 10mg/kg 자일라진)를 이용해 마우스를 마취한 뒤 표 3의 군 구성에 따라 각각의 시험물질을 마우스의 오른쪽 장딴지근육에 해밀턴 주사기를 이용하여 0.2mL/kg로 투여하였다.
군 동물수 투여물질 용량 (U/kg) 투여경로 평가지표
1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 코어톡스 40 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT142 1.2 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT142 4 우측 장딴지근육 DAS
8 6 pBT142 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
9 6 pBT142 40 우측 장딴지근육 DAS
10 6 pBT147 1.2 우측 장딴지근육 DAS
11 6 pBT147 4 우측 장딴지근육 DAS
12 6 pBT147 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
13 6 pBT147 40 우측 장딴지근육 DAS
평가는 마우스 근육 마비 정도를 육안으로 평가하는 DAS (digit abduction score) 평가법과 외부적인 전기 자극에 반응하는 근육의 활동전위를 측정하는 복합근육 활동전위 (CMAP: compound muscle action potential) 시험법을 사용하였다.
표 4에 표기된 DAS 수치는 마우스에서 투여된 쪽의 발가락 형태에 의한 근육 마비 정도를 나타내며 CMAP 값은 신경 차단에 의해 나타나는 직접적인 근육의 수축 저해 정도를 나타낸다.
점수 기준
0 정상, 주입하지 않은 쪽의 발 모양과 다르지 않음
1 발가락 사이의 넓이가 좁하져 있음, 또는 두 개의 발가락이 서로 붙어 있고 나머지는 완전히 펴짐
2 모든 발가락 사이가 상당히 좁아져 있음, 또는 세 개의 발가락이 서로 붙어 있음
3 발이 굽어 있고 네 개의 발가락이 서로 붙어 있음
4 발이 굽어 있고 모든 발가락이 서로 붙어 있음
CMAP은 Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) 장비를 이용하여 각 마우스의 오른쪽 장딴지근 부위에서 측정되었다. 측정 방법은 자극의 수준과 기간 7~8 mA, 0.1 ms을 제외하고 나머지는 시험예 3과 동일하다.
표 3의 시험군 구성에 따라 DAS 측정은 1.2, 4, 12, 40 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 84일까지 평가되었으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여일부터 98일까지 측정하였고, 시험예 3과 동일하게 통계처리 하였다.
마우스 우측 장딴지근육에 코어톡스와 2종의 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147을 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 단회 투여한 후, DAS 평가한 결과 pBT147 4U/kg 투여군에서 투여 후 14, 21, 28일차에 코어톡스 대비 유의적인 DAS 점수의 증가를 관찰하였다. 코어톡스 1.2 U/kg 투여군에서는 14일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군에서는 이보다 14일이 증가된 28일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고 코어톡스 4 U/kg 투여군은 투여 후 28일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 이보다 14일이 증가된 42일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 49일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 이보다 14일이 증가된 63일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고, 코어톡스 40 U/kg 투여군은 투여 후 70일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 각각 이보다 14일 및 7일이 증가된 84일 및 77일째 모든 개체가 회복하였고(도 8a), DAS ED50 비교를 통해 pBT142가 코어톡스보다 약 1.2배, pBT147이 코어톡스보다 약 1.4배 강한 효력을 보였다(도 8b).
CMAP 시험에서는 pBT142 및 pBT147 12 U/kg 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP 값을 보이는 것을 확인하였고, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 84일째 CMAP 회복이 관찰되었으나 pBT147 12 U/kg 투여군은 이보다 14일이 증가된 98일째 CMAP 회복이 관찰되었다(도 8c). 이상과 같이, 마우스에서 수행된 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147의 효력과 작용기간이 증가하였다.
<110> Medytox Inc. <120> Recombinant botulinum toxin type A light chain, recombinant botulinum toxin, and its compositions, uses and methods <130> 53-KR-GN-1 <160> 41 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 2 Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn 1 5 10 15 Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu 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Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu 1010 1015 1020 Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro 1025 1030 1035 1040 Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys 1045 1050 1055 Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe 1060 1065 1070 Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr 1075 1080 1085 Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr 1090 1095 1100 Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn 1105 1110 1115 1120 Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu 1125 1130 1135 Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser 1140 1145 1150 Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly 1155 1160 1165 Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val 1170 1175 1180 Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala 1185 1190 1195 1200 Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn 1205 1210 1215 Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr 1220 1225 1230 Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser 1250 1255 1260 Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys 1265 1270 1275 1280 Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1285 1290 1295 <210> 41 <211> 1296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pBT147 <400> 41 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ala Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Leu Glu Glu Leu Ile Thr Phe Gly Gly Asn Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Lys Lys Glu Phe Ser Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Ala Thr Gly Lys Phe Leu Val Asp Arg Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Asp Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile His Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Ile Glu Ile Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu 1010 1015 1020 Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro 1025 1030 1035 1040 Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys 1045 1050 1055 Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe 1060 1065 1070 Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr 1075 1080 1085 Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr 1090 1095 1100 Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn 1105 1110 1115 1120 Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu 1125 1130 1135 Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser 1140 1145 1150 Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly 1155 1160 1165 Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val 1170 1175 1180 Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala 1185 1190 1195 1200 Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn 1205 1210 1215 Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr 1220 1225 1230 Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser 1250 1255 1260 Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys 1265 1270 1275 1280 Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 1285 1290 1295

Claims (28)

  1. 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제3 도메인 또는 그의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  4. 제3항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  6. 제5항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 또는 G인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  7. 제6항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  8. 제7항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온화합물, 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 아미노산, 염, 완충액, 비이온성 계면활성제, 당, 당 알코올, 또는 이들의 조합인 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 조성물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지 제제 형태의 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드 증상을 개선하기 위한 조성물.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 조성물.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 경피, 피하, 또는 근육내 투여용인 조성물.
  17. 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드 증상을 개선하기 위한, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  18. 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  19. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 방법.
  20. 제9항 내지 제13항 증 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 방법.
  21. 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  23. 제221항 또는 제232항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 또는 G인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
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