JP4818565B2 - ロイシンベースモチーフおよびクロストリジウム神経毒 - Google Patents
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Description
【０００１】
（クロスリファレンス）
本願は2000年7月21日に出願された特許出願第09／620,840号の一部継続出願である。
【０００２】
（背景）
本発明は改変神経毒、特に改変クロストリジウム神経毒に関し、また天然のボツリヌス毒素を使って処置されてきた状態を含む種々の状態を処置するためのその使用に関する。
【０００３】
ボツリヌス毒素、例えばA型ボツリヌス毒素は、痛み、骨格筋異常、平滑筋異常および腺異常を含む数多くの状態の処置に使用されてきた。ボツリヌス毒素は美容目的にも使用されている。
【０００４】
ボツリヌス毒素を使った処置に関する例は数多く存在する。痛みを処置する例についてはAokiらの米国特許第6,113,915号およびAokiらの米国特許第5,721,215号を参照されたい。神経筋障害を処置する例については米国特許第5,053,005号を参照されたい。この米国特許第5,053,005号では、若年性脊柱彎曲、すなわち脊柱側弯症を、アセチルコリン放出阻害剤、好ましくはボツリヌス毒素Aを使って処置することが提案されている。A型ボツリヌス毒素による斜視の処置については、Elston,J.S.ら，British Journal of Ophthalmology，1985，69，718-724および891-896を参照されたい。A型ボツリヌス毒素による眼瞼痙攣の処置については、Adenis,J.P.ら，J.Fr.Ophthalmol.，1990，13（5），259-264を参照されたい。痙性および口下顎ジストニア斜頸の処置については、Jankovicら，Neurology，1987，37，616-623を参照されたい。痙攣性発声障害もA型ボツリヌス毒素によって処置されている。Blitzerら，Ann.Otol.Rhino.Laryngol，1985，94，591-594を参照されたい。Brinら，Adv.Neurol.（1987）50，599-608によれば、A型ボツリヌス毒素を使って、舌ジストニアの処置が行なわれた。Cohenら，Neurology（1987）37（Suppl.1），123-4には、A型ボツリヌス毒素による書痙の処置が開示されている。
【０００５】
変化した生物学的持続性および／または変化した生物学的活性を持つボツリヌス毒素があれば有益だろう。例えばボツリヌス毒素は、腱手術後の筋肉を不動化し肢運動を防いで回復を促進するために使用することができる。患者が手術から回復する頃には再び筋肉を使用し動かすことができるように、生物学的持続時間が短いボツリヌス毒素（A型ボツリヌス毒素など）があれば有益だろう。さらに、変化した生物学的活性、例えば増加した生物学的活性などを持つボツリヌス菌は効率のよい（すなわち単位量あたりの効力が高い）毒素として役立ち、その結果、毒素の使用量を減らすことができる。
【０００６】
加えて、増加した生物学的持続時間を示すことができる改変神経毒（改変クロストリジウム毒素など）ならびに減少した生物学的持続時間および／または生物学的活性を持つ改変神経毒素、ならびにそのような毒素の製造方法も、必要とされている。
【０００７】
（定義）
本発明の説明を続ける前に、以下の定義を記載し、それらを本明細書に適用する。
【０００８】
「重鎖」は、クロストリジウム神経毒の重鎖を意味する。これは約100kDaの分子量を持ち、本明細書では重鎖と呼ぶ場合も、Hと呼ぶ場合もある。
【０００９】
「HN」は、重鎖のアミノ末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒重鎖由来の断片（約50kDaの分子量を持つもの）、または無傷の重鎖中の前記断片に相当する部分を意味する。これは、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、細胞内エンドソーム膜を横切って起こる軽鎖のトランスロケーションに関与する部分を含むと考えられる。
【００１０】
「HＣ」は、重鎖のカルボキシル末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒重鎖由来の断片（約50kDa）、または無傷の重鎖中の前記断片に相当する部分を意味する。これは、免疫原性であると考えられると共に、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、種々のニューロン（運動ニューロンを含む）および他のタイプの標的細胞への高親和性結合に関与する部分を含むと考えられる。
【００１１】
「軽鎖」は、クロストリジウム神経毒の軽鎖を意味する。これは約50kDaの分子量を持ち、軽鎖と呼ぶ場合も、クロストリジウム神経毒のタンパク質分解ドメイン（アミノ酸配列）と呼ぶ場合もある。軽鎖が標的細胞の細胞質中に存在する場合、軽鎖はエキソサイトーシスの阻害剤として、例えば神経伝達物質（すなわちアセチルコリン）放出の阻害剤として有効であると考えられる。
【００１２】
「神経毒」は、ニューロンを含む細胞の機能を妨害する能力を持つ分子を意味する。「神経毒」は天然物質であっても人工物質であってもよい。妨害を受ける機能は、エキソサイトーシスであることができる。
【００１３】
「改変神経毒」は、構造改変を含む神経毒を意味する。言い換えると、「改変神経毒」は、構造改変によって改変されている神経毒である。構造改変は、改変神経毒の生物学的半減期（すなわち神経毒の作用の持続時間）などの生物学的持続性および／または生物学的活性を、その改変神経毒を製造または誘導する元となった神経毒と比較して変化させる。改変神経毒は天然の神経毒とは異なる構造を持つ。
【００１４】
「突然変異」は、天然タンパク質または核酸配列の構造改変を意味する。例えば、核酸突然変異の場合、突然変異は、DNA配列中の1または複数のヌクレオチドの欠失、付加または置換であることができる。タンパク質配列突然変異の場合、突然変異は、タンパク質配列中の1または複数のアミノ酸の欠失、付加または置換であることができる。例えば、あるタンパク質配列を構成する特定の一アミノ酸を、別のアミノ酸、例えば、アミノ酸アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または他の任意の天然もしくは非天然アミノ酸または化学修飾アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸に置換することができる。タンパク質配列に対する突然変異は、転写されその結果生成したmRNAが翻訳された時に突然変異型タンパク質配列を生成するDNA配列に対する突然変異の結果であることができる。また、タンパク質配列に対する突然変異は、所望の突然変異を含むペプチド配列を所望のタンパク質配列に融合することによって作出することもできる。
【００１５】
「構造改変」は、神経毒に加えられる任意の変化であって、その神経毒を、構造改変を持たない同一の神経毒とは物理的または化学的に異なるものにする変化を意味する。
【００１６】
「生物学的持続性」または「持続性」は、細胞（例えばニューロン）機能に対して神経毒または改変神経毒が引き起こす妨害または影響の時間的継続、例えば、ニューロンなどの細胞からのエキソサイトーシス（神経伝達物質、例えばアセチルコリンのエキソサイトーシスなど）の阻害の時間的継続を意味する。
【００１７】
「生物学的半減期」または「半減期」は、神経毒または改変神経毒、好ましくは神経毒または改変神経毒の活性部分、例えばクロストリジウム毒素の軽鎖の濃度が、哺乳類細胞中、例えば哺乳類ニューロン中で、元の濃度の半分に減少する時間を意味する。
【００１８】
「生物学的活性」または「活性」は、細胞からの細胞エキソサイトーシス、例えばニューロンからの神経伝達物質のエキソサイトーシスの単位時間あたりの阻害量を意味する。
【００１９】
「標的細胞」は、神経毒または改変神経毒に対して結合親和性を持つ細胞（ニューロンを含む）を意味する。
【００２０】
（発明の開示）
新しい構造改変神経毒を発見した。本構造改変神経毒は大きな利益、例えば、無改変の神経毒と比較して増加または減少した生物学的持続性および／または生物学的半減期および／または増加または減少した生物学的活性などをもたらすことができる。
【００２１】
本発明によれば、神経毒と構造改変とを含む構造改変神経毒が提供される。前記構造改変は、前記構造改変を持たない同一の神経毒と比較して構造改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効である。また、前記構造改変神経毒は、天然の神経毒とは異なる構造を持つ。
【００２２】
本発明は、構造改変を持つ神経毒を含む改変神経毒であって、前記構造改変が前記構造改変を持たない同一の神経毒と比較して前記改変神経毒の生物学的活性を変化させるのに有効であり、かつ前記改変神経毒が天然の神経毒とは異なる構造を持つものも包含する。この構造改変は、標的細胞からのエキソサイトーシスを、前記構造改変を持たない同一の神経毒による標的細胞からのエキソサイトーシスの減少量よりも多く減少させるのに有効であることができる。もう一つの選択肢として、この構造改変は、標的細胞からのエキソサイトーシスを、前記構造改変を持たない同一の神経毒による細胞からのエキソサイトーシスの減少量よりも少なく減少させるのに有効であることもできる。重要なことに、エキソサイトーシスは神経伝達物質のエキソサイトーシスであることができ、改変神経毒は変化した生物学的持続性を示さずに、変化した生物学的活性を示すことができる。構造改変はロイシンベースモチーフを含むことができる。さらに、改変神経毒は、変化した生物物学的活性および変化した生物学的持続性を示すこともできる。本発明は、（a）改変神経毒が増加した生物学的活性および増加した生物学的持続性を示す場合、（b）改変神経毒が増加した生物学的活性および減少した生物学的持続性を示す場合、（c）改変神経毒が減少した生物学的活性および減少した生物学的持続性を示す場合、ならびに（d）改変神経毒が減少した生物学的活性および増加した生物学的持続性を示す場合も包含する。
【００２３】
重要なことに、単位量（すなわちモルベースでの単位量）の改変神経毒は、単位量の天然神経毒よりも効率よく、細胞からのエキソサイトーシスを減少させることができる。言い換えると、単位量の改変神経毒、例えば改変A型ボツリヌス毒素は、天然神経毒が示す神経伝達物質エキソサイトーシスの阻害と比較して、より大きな神経伝達物質エキソサイトーシスの阻害が起こる（すなわち細胞から放出される神経伝達物質が少なくなる）ような形で、その細胞内基質（SNAP）を切断することができる。
【００２４】
さらに、構造改変が改変神経毒の生物学的持続性を増加させるのに有効である構造改変神経毒も、本発明に包含される。構造改変神経毒の増加した生物学的持続性は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の増加した半減期および／または生物学的活性に起因することができる。
【００２５】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して生物学的持続性が減少している構造改変神経毒も提供される。この生物学的持続性の減少は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の減少した生物学的半減期および／または活性に起因することができる。
【００２６】
さらに本発明によれば、構造改変がいくつかのアミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。例えば、構造改変を構成するアミノ酸の数は、1以上、1〜約22、2〜約10、および約4〜約7であることができる。
【００２７】
一態様として、構造改変神経毒の構造改変は1アミノ酸を含むことができる。このアミノ酸は、いくつかの炭素を含有するR基を含むことができる。例えば、このアミノ酸において、炭素原子数は1以上、1〜約20、1〜約12、1〜約9、2〜約6、および約4であることができる。本願におけるR基とはアミノ酸側鎖を指す。例えば、アラニンのR基はCH3であり、例えばセリンのR基はCH2OHである。
【００２８】
もう一つの態様として、改変が1アミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。このアミノ酸は、実質的にヒドロカルビルであるR基を含むことができる。
【００２９】
さらにもう一つの態様として、構造改変が1アミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。このアミノ酸はさらに、少なくとも1つのヘテロ原子を含有するR基を含むことができる。
【００３０】
さらに本発明によれば、構造改変が例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体などを含む構造改変神経毒も提供される。構造改変神経毒を構成することができるアミノ酸誘導体の例は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、およびリン酸化アミノ酸である。リン酸化アミノ酸は、例えばカゼインキナーゼII、プロテインキナーゼC、およびチロシンキナーゼなどによってリン酸化することができる。
【００３１】
さらに本発明によれば、構造改変を含むことができる構造改変神経毒も提供される。神経毒は、3つのアミノ酸配列領域を含むことができる。第1の領域は細胞結合部分として有効であることができる。この結合部分は、ニューロンなどの標的細胞への結合部分であることができる。結合部分はボツリヌス毒素重鎖のカルボキシル末端であることができる。ボツリヌス毒素重鎖のカルボキシル末端が、例えばある種の神経細胞を含むある種の細胞上に見いだされるレセプターを結合するのに有効でありうることは、よく知られている。一態様として、カルボキシル末端は、神経細胞のシナプス前膜上に見いだされるレセプターに結合する。第2の領域は、エンドソーム膜を横切って構造改変神経毒または構造改変神経毒の一部を移行させるのに有効であることができる。第3の領域は、標的細胞からのエンドサイトーシスを阻害するのに有効であることができる。エキソサイトーシスの阻害は、シナプス前膜からのアセチルコリンなどの神経伝達物質放出の阻害であることができる。例えばボツリヌス毒素軽鎖が、種々のニューロンおよび非ニューロン細胞からのアセチルコリン（および他の神経伝達物質）などの放出を阻害するのに有効であることは、よく知られている。
【００３２】
第1、第2または第3領域の少なくとも1つは、実質的にクロストリジウム神経毒に由来することができる。第3領域は構造改変を含むことができる。さらに改変神経毒は、天然の神経毒とは異なる構造を持つことができる。また、構造改変は、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効であることができる。
【００３３】
一態様として、神経毒がボツリヌス血清型A、B、C1、C2、D、E、F、G、破傷風毒素および／またはその混合物であることができる構造改変神経毒が提供される。
【００３４】
もう一つの態様として、第3領域をボツリヌス毒素血清型Aから誘導することができる構造改変神経毒も提供される。さらに、第3領域をボツリヌス血清型Aから誘導することができない構造改変神経毒も提供される。
【００３５】
さらにもう一つの態様として、構造改変が構造改変神経毒の生物学的持続性を増加させるのに有効な生物学的持続性増加成分を含む構造改変神経毒も提供される。生物学的持続性の増加は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の生物学的半減期および／または活性の増加に起因することができる。
【００３６】
さらに本発明によれば、生物学的持続性増加成分を含む構造改変神経毒であって、生物学的持続性増加成分がロイシンベースモチーフを含むことができる構造改変神経毒も提供される。ロイシンベースモチーフは連続する7アミノ酸を含むことができ、この場合、ロイシンベースモチーフは5つ一組のアミノ酸と2つ一組のアミノ酸とで構成されることができる。5つ一組のアミノ酸は、ロイシンベースモチーフのアミノ末端を規定することができる。2つ一組のアミノ酸はロイシンベースモチーフのカルボキシル末端を規定することができる。5つ一組のアミノ酸が1または複数の酸性アミノ酸を含むことができる構造改変神経毒が提供される。例えば、酸性アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であることができる。5つ一組のアミノ酸は、ヒドロキシル含有アミノ酸を含むことができる。ヒドロキシル含有アミノ酸は、例えばセリン、スレオニンまたはチロシンであることができる。このヒドロキシル含有アミノ酸はリン酸化することができる。2つ一組のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであることができる。また、ロイシンベースモチーフ中の2つ一組のアミノ酸は、ロイシン-ロイシン、ロイシン-イソロイシン、イソロイシン-ロイシンまたはイソロイシン-イソロイシン、ロイシン-メチオニンであることができる。ロイシンベースモチーフは、フェニルアラニン-グルタミン酸-フェニルアラニン-チロシン-リジン-ロイシン-ロイシンというアミノ酸配列であることができる。
【００３７】
一態様として、改変がチロシンベースモチーフであることができる構造改変神経毒が提供される。チロシンベースモチーフは4つのアミノ酸を含むことができる。チロシンベースモチーフのN末端のアミノ酸はチロシンであることができる。チロシンベースモチーフのC末端のアミノ酸は疎水性アミノ酸であることができる。
【００３８】
さらに本発明によれば、第3領域は、ボツリヌス毒素血清型Aまたは他のボツリヌス毒素血清型の一つに由来することができる。
【００３９】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して構造改変神経毒の生物学的持続性を減少させることができる構造改変神経毒も提供される。減少した生物学的持続性は、部分的には、神経毒の減少した生物学的半減期および／または減少した生物学的活性に起因することができる。
【００４０】
一態様として、ロイシンベースモチーフを構成する1または複数のアミノ酸に突然変異を持つロイシンベースモチーフが、構造改変に含まれうる、構造改変神経毒が提供される。突然変異はロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換であることができる。
【００４１】
もう一つの態様として、チロシンベースモチーフを構成する1または複数のアミノ酸に突然変異を持つチロシンベースモチーフが構造改変に含まれる構造改変神経毒も提供される。例えば、突然変異は、チロシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換であることができる。
【００４２】
さらにもう一つの態様として、構造改変がアミノ酸誘導体を含み、そのアミノ酸誘導体の突然変異またはそのアミノ酸の誘導体化をコードするヌクレオチドもしくはアミノ酸配列への突然変異を伴う構造改変神経毒が提供される。例えば、誘導体化アミノ酸または誘導体化アミノ酸の誘導体化を担うヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の欠失または置換。アミノ酸誘導体は、例えばミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、またはホスホリル化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばカゼインキナーゼII、プロテインキナーゼCまたはチロシンキナーゼなどによって製造することができる。
【００４３】
本発明の一態様として、構造改変神経毒の第1、第2および／または第3領域を組換えDNA法によって製造すること、すなわち組換え的に製造することができる構造改変神経毒が提供される。
【００４４】
本発明のもう一つの態様として、神経毒の第1、第2および／または第3領域が天然のクロストリジウム神経毒から単離される構造改変神経毒も提供される。
【００４５】
本発明のもう一つの態様は、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を持つボツリヌス毒素（A型ボツリヌス毒素など）を含む改変神経毒を提供する。構造改変は、神経毒の軽鎖からのアミノ酸416〜437の欠失を含むことができる（図3）。
【００４６】
本発明のさらにもう一つの態様として、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含む改変神経毒（A型ボツリヌス毒素など）が提供される。構造改変は、神経毒の軽鎖からのアミノ酸1〜8の欠失を含むことができる（図3）。
【００４７】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含むA型ボツリヌス毒素などの改変神経毒が提供される。構造改変は、神経毒の軽鎖のアミノ酸1〜8および416〜437の欠失を含むことができる（図3）。
【００４８】
さらに本発明によれば、当該構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含む改変ボツリヌス毒素、例えば改変A型ボツリヌス毒素が提供される。構造改変は、前記神経毒の軽鎖における427位のロイシンのアラニンへの置換、および428位のロイシンのアラニンへの置換を含むことができる（図3）。
【００４９】
さらに、神経毒の生物学的持続性を増加させかつ／または生物学的活性を増加させる方法も、本発明の範囲に含まれる。これらの方法では、神経毒に構造改変を融合または付加することができ、例えば構造改変は、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分であることができる。神経毒に融合または付加することができる構造改変の例は、ロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフ、およびアミノ酸誘導体である。アミノ酸誘導体の例は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸である。アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIまたはチロシンキナーゼなどによってリン酸化することができる。
【００５０】
また、本発明によれば、神経毒の生物学的持続性を減少させかつ／または生物学的活性を減少させる方法も提供される。これらの方法は、神経毒のアミノ酸を突然変異させるステップを含むことができる。例えば、神経毒内のロイシンベースモチーフのアミノ酸を突然変異させることができる。さらに例えば、神経毒のチロシンベースモチーフ内の1または複数のアミノ酸を突然変異させることもできる。さらに例えば、アミノ酸誘導体またはアミノ酸の誘導体化を担うDNAもしくはアミノ酸配列を突然変異させることもできる。誘導体化アミノ酸は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、またはリン酸化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIおよびチロシンキナーゼなどによって製造することができる。これらの突然変異は、例えば、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換であることができる。
【００５１】
本発明は、ある状態を処置する方法も包含する。これらの方法は、ある状態を処置するために有効量の構造改変神経毒を哺乳動物に投与するステップを含むことができる。構造改変神経毒は構造改変を含むことができる。この構造改変は、生物学的持続性および／または生物学的活性を変化させるのに有効である。これらの状態処置方法では、ロイシンベースモチーフを含まない神経毒を利用することができる。また、これらの状態処置方法では、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を含む神経毒を利用することもできる。生物学的持続性または活性増加成分は、例えば、チロシンベースモチーフ、ロイシンベースモチーフ、またはアミノ酸誘導体を含むことができる。アミノ酸誘導体は、例えば、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸またはリン酸化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIまたはチロシンキナーゼなどによって製造することができる。処置される状態は神経筋障害、自律神経障害または痛みであることができる。神経筋障害の処置は、筋または筋群に有効量の改変神経毒を局所投与するステップを含むことができる。自律神経障害を処置する方法は、1または複数の腺に有効量の改変神経毒を局所投与するステップを含むことができる。痛みを処置する方法は、疼痛部位に有効量の改変神経毒を投与するステップを含むことができる。さらに、痛みの処置は、有効量の改変神経毒を脊髄に投与するステップを含むこともできる。
【００５２】
さらに本発明によれば、改変神経毒を使って、痙攣性発声障害、喉頭ジストニア、口下顎ジストニア、舌ジストニア、頸部ジストニア、書痙（focal hand dystonia）、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス（anismus）、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラジア、嚥下障害、流涙、多汗、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、筋痙攣による痛み、頭痛、眉間のシワおよび肌のシワを含む状態を処置する方法が提供される。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、神経毒の構造を改変することによって神経毒の生物学的持続性および／または生物学的活性を変化させることができるという発見に基づいている。言い換えると、変化した生物学的持続性および／または生物学的活性を持つ改変神経毒は、構造改変を持つまたは包含する神経毒から作ることができる。一態様として、構造改変には、神経毒の一次構造に生物学的持続性増加成分を融合してその生物学的持続性を増加させることが含まれる。好ましい一態様として、生物学的持続性増加成分はロイシンベースモチーフである。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期および／または生物学的活性を約100％増加させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を持たない同一の神経毒より約20％〜300％高い生物学的持続性を持つ。すなわち、例えば、生物学的持続性増加成分を含む改変神経毒は、神経終末からの例えばアセチルコリンなどの神経伝達物質の放出を、改変されていない神経毒よりも約20％〜約300％長く、実質的に阻害することができる。
【００５４】
天然神経毒または無改変神経毒の生物学的活性と比較して変化した生物学的活性を持つ改変神経毒も、本発明の範囲に包含される。例えば、改変神経毒は、改変神経毒の生物学的持続性に何らかの変化を伴って、またはそのような変化を伴わずに、減少したまたは増加した標的細胞からのエキソサイトーシス（神経伝達物質のエキソサイトーシスなど）の阻害を示すことができる。
【００５５】
本発明の基本的一態様として、ロイシンベースモチーフは連続する7アミノ酸である。この連続アミノ酸は2つのグループにまとめられる。ロイシンベースモチーフのアミノ末端から出発して最初の5アミノ酸は「5つ一組のアミノ酸」を形成する。5つ一組のアミノ酸のすぐ後ろに続く2つのアミノ酸は「2つ一組のアミノ酸」を形成する。好ましい一態様として、2つ一組のアミノ酸はロイシンベースモチーフのカルボキシル末端領域に位置する。もう一つの好ましい態様では、5つ一組のアミノ酸が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも1つの酸性アミノ酸を含む。
【００５６】
2つ一組のアミノ酸は少なくとも1つの疎水性アミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンを含む。好ましくは、2つ一組のアミノ酸はロイシン-ロイシン、ロイシン-イソロイシン、イソロイシン-ロイシンまたはイソロイシン-イソロイシン、ロイシン-メチオニンである。さらに好ましくは、2つ一組のアミノ酸はロイシン-ロイシンである。
【００５７】
一態様として、ロイシンベースモチーフはxDxxxLLである（xは任意のアミノ酸であることができる）。もう一つの態様として、ロイシンベースモチーフはxExxxLLである（Eはグルタミン酸である）。もう一つの態様として、2つ一組のアミノ酸がイソロイシンまたはメチオニンを含んで、それぞれxDxxLIまたはxDxxxLMを形成することもできる。さらに、アスパラギン酸Dをグルタミン酸Eで置き換えて、xExxxLI、xExxxILおよびxExxxLMを形成させることもできる。好ましい一態様として、ロイシンベースモチーフは、フェニルアラニン-グルタミン酸-フェニルアラニン-チロシン-リジン-ロイシン-ロイシン（配列番号1）である。
【００５８】
もう一つの態様として、5つ一組のアミノ酸は、少なくとも1つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えばセリン、スレオニンまたはチロシンを含む。好ましくは、ヒドロキシル含有アミノ酸はリン酸化することができる。より好ましくは、ヒドロキシル含有アミノ酸は、そのリン酸化によってアダプタータンパク質の結合を可能にすることができるセリンである。
【００５９】
例として無修飾アミノ酸を挙げたが、修飾アミノ酸も本発明の範囲に含まれると考えられる。例えばロイシンベースモチーフはハロゲン化ロイシン、好ましくはフッ化ロイシンを含むことができる。
【００６０】
様々なロイシンベースモチーフが様々な種に見いだされる。本発明に従って使用することができる様々な種に由来するロイシンベースモチーフの候補を表1に列挙する。このリストは限定を意図するものではない。
【表１】
【００６１】
VMATは小胞モノアミントランスポーターであり、VAChtは小胞アセチルコリントランスポーターであり、サッカロミセス・セレビシェVam3pはシナプトブレビンの酵母ホモログである。イタリック体で示したセリン残基は潜在的リン酸化部位である。
【００６２】
改変神経毒は任意の神経毒から作ることができる。また、改変神経毒は神経毒の断片から、例えば軽鎖および／または重鎖の一部が除去されたボツリヌス毒素から作ることもできる。好ましくは、使用される神経毒はクロストリジウム神経毒である。クロストリジウム神経毒は、3つのアミノ酸配列領域を持つポリペプチドを含む。第1のアミノ酸配列領域は、ベラッチ（beratti）毒素、ブチリカム（butyricum）毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に実質上完全に由来する標的細胞（すなわちニューロン）結合部分を含むことができる。好ましくは、第1アミノ酸配列領域は、毒素重鎖のカルボキシ末端領域Hcに由来する。また、第1アミノ酸配列領域はターゲティング部分を含むこともでき、このターゲティング部分は、標的細胞上のレセプター、例えば細胞表面タンパク質または他の生物学的成分に結合することができる分子（アミノ酸配列など）を含むことができる。
【００６３】
第2のアミノ酸配列領域は、エンドソーム膜を横切ってニューロンの細胞質内にポリペプチドまたはその一部を移行させるのに有効である。一態様として、本ポリペプチドの第2アミノ酸配列領域は、ベラッチ毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に由来する重鎖のアミノ末端HNを含む。
【００６４】
第3のアミノ酸配列領域は、ニューロンなどの標的細胞の細胞質中に放出された場合に、治療活性を持つ。一態様として、本ポリペプチドの第3アミノ酸配列領域は、ベラッチ毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に由来する毒素軽鎖Lを含む。
【００６５】
クロストリジウム神経毒はハイブリッド神経毒であることができる。例えば、神経毒の各アミノ酸配列領域は、それぞれ異なるクロストリジウム神経毒血清型に由来することができる。例えば一態様として、本ポリペプチドは、破傷風毒素のHcに由来する第1アミノ酸配列領域、B型ボツリヌス毒素に由来する第2アミノ酸配列領域、およびボツリヌス毒素血清型Eの軽鎖に由来する第3アミノ酸配列領域を含む。他の考え得る組合わせは全て本発明の範囲に包含される。
【００６６】
もう一つの選択肢として、クロストリジウム毒素の3つのアミノ酸配列領域は全て同じ種および同じ血清型に由来することもできる。神経毒の3つのアミノ酸配列領域が全て同じクロストリジウム神経毒種および血清型に由来する場合は、その神経毒を種名および血清型名で呼ぶことにする。例えば、神経毒素ポリペプチドは、E型ボツリヌス毒素に由来する第1、第2および第3アミノ酸配列領域を持つことができる。この場合は、その神経毒をE型ボツリヌス毒素と呼ぶ。
【００６７】
加えて、3つのアミノ酸配列領域のそれぞれは、それらが由来する天然配列から改変することができる。例えば、アミノ酸配列領域は、天然の配列と比較して付加または欠失された少なくとも1つまたは複数のアミノ酸を持つことができる。
【００６８】
生物学的持続性増加成分または生物学的活性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを、上述した神経毒のいずれかに融合して、増加した生物学的持続性および／または増加した生物学的活性を持つ改変神経毒を形成させることができる。本発明で使用する「融合」という用語は、神経毒の一次構造への共有結合による付加、または神経毒の一次構造内への共有結合による挿入を包含する。例えば、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を、その一次構造中にロイシンベースモチーフを持たないクロストリジウム神経毒に付加することができる。一態様として、ロイシンベースモチーフを、第3アミノ酸配列がボツリヌス毒素血清型A、B、C1、C2、D、E、FまたはGに由来するハイブリッド神経毒と融合する。もう一つの態様として、ロイシンベースモチーフをE型ボツリヌス毒素と融合する。
【００６９】
もう一つの態様では、神経毒をコードするクローン化DNA配列を変化させることによって、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を神経毒に付加する。例えば、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を付加しようとする神経毒をコードするクローン化DNA配列に、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分をコードするDNA配列を付加する。これは、通常の技術を持つ分子生物学者にはよく知られている多くの方法で行なうことができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法またはPCRクローニング法を使って、神経毒をコードするDNA配列に所望の変化を生じさせることができる。次に、そのDNA配列を天然の宿主株に再導入することができる。ボツリヌス毒素の場合、天然の宿主株はボツリヌス菌（Clostridium botulinum）株である。好ましくは、この宿主株は天然のボツリヌス毒素遺伝子を持たないだろう。これに代わる方法として、変化させたDNAを異種宿主系、例えば大腸菌（E.coli）または他の原核生物、酵母、昆虫細胞株または哺乳類細胞株に導入することもできる。変化させたDNAをその宿主に導入し終えたら、付加された生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を持つ組換え毒素を、例えば標準的な発酵法などによって製造することができる。
【００７０】
同様に、生物学的持続性増加成分を神経毒から取り除くこともできる。例えば、部位特異的突然変異導入法を使って、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを除去することができる。
【００７１】
これらの遺伝子操作および他の遺伝子操作を達成するために使用することができる標準的な分子生物学的技術は、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するSambrookら（1989）に記載されている。
【００７２】
一態様として、ロイシンベースモチーフを、神経毒の第3アミノ酸配列領域と融合するか、または同領域に付加する。好ましい態様として、ロイシンベースモチーフを第3アミノ酸配列領域のカルボキシル末端近くの領域と融合するか、または同領域に付加する。より好ましくは、ロイシンベースモチーフを神経毒の第3領域のカルボキシル末端と融合するか、または同末端に付加する。さらに好ましくは、ロイシンベースモチーフをE型ボツリヌス毒素の第3領域のカルボキシル末端と融合するか、または同末端に付加する。ロイシンベースモチーフを融合または付加する第3アミノ酸配列はハイブリッドまたはキメラ改変神経毒の成分であることができる。例えば、ロイシンベースモチーフは、ある型のボツリヌス毒素（すなわちA型ボツリヌス毒素）の第3アミノ酸配列領域（またはその一部）と融合するか、または同領域（またはその一部）に付加することができ、そのロイシンベースモチーフ-第3アミノ酸配列領域自体は、1または複数の異なる型のボツリヌス毒素（例えばB型および／またはE型ボツリヌス毒素）に由来する第1および第2アミノ酸配列領域に融合されているか、または同領域に接合されている。
【００７３】
もう一つの態様として、既存の生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを持つ神経毒の構造改変には、ロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換が含まれる。また、改変神経毒は、ロイシンベースモチーフ中の1または複数のアミノ酸が欠失または置換されている神経毒をもたらす構造改変を含む。既存のロイシンベースモチーフ中の1または複数のアミノ酸を除去または置換することは、改変神経毒の生物学的持続性および／または生物学的活性を減少させるのに有効である。例えば、A型ボツリヌス毒素のロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を欠失させるか置換すると、改変神経毒の生物学的半減期および／または生物学的活性が減少する。
【００７４】
生物学的持続性増加成分に含まれるアミノ酸の代わりに使用することができるアミノ酸には、アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン酸、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンおよび他の天然アミノ酸ならびに非標準アミノ酸が含まれる。
【００７５】
本発明では、天然のA型ボツリヌス毒素軽鎖が、分化したPC12細胞膜に特徴的なパターンで局在化することが明らかになった。生物学的持続性増加成分はこの局在化の実質的一因であることを明らかにする。
【００７６】
本発明のデータは、A型ボツリヌス毒素軽鎖を切断して短縮するか、ロイシンベースモチーフを突然変異させると、軽鎖は特有のパターンで膜に局在化する能力を実質的に失うことを証明している。細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性および／または生物学的活性を決定する上で重要な因子である考えられる。なぜなら、細胞膜への局在は局在化したタンパク質を細胞間タンパク質分解から保護することができるからである。
【００７７】
図1および図2は、A型ボツリヌス毒素の軽鎖からロイシンベースモチーフを欠失させると、A型軽鎖の膜局在に変化が起こりうることを示している。図1は分化したPC12細胞におけるGFP-軽鎖A融合タンパク質の局在を表す。例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するGalliら（1998）Mol Biol Cell 9：1437-1448や、やはり参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するMartinez-Arcaら（2000）J Cell Biol 149：889-899に記載されているような当業者に周知の方法を使って、分化したPC12細胞中でGFP融合タンパク質を産生させ、視覚化した。GFP-切断短縮型軽鎖Aの局在を図2に示す。図1と図2を比較すると、N末端およびロイシンベースモチーフを含むC末端の欠失により、局在化のパターンが完全に変化することがわかる。図3はA型ボツリヌス毒素軽鎖のアミノ酸配列を表す。下線付きのアミノ酸配列は、切断短縮型突然変異体で欠失させたアミノ酸を示す。ロイシンベースモチーフをアスタリスク付きの角括弧で示す。
【００７８】
本発明では、ロイシンベースモチーフ内の特定アミノ酸置換の効果を解析するために、さらなる研究を行なった。例えば、ある研究では、ロイシンベースモチーフに含まれる両ロイシン残基をアラニン残基に置換した。図4に、このジ-ロイシン→ジ-アラニン置換GFP-A型ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNAをトランスフェクトした分化PC12細胞の蛍光像を示す。図からわかるように、A型ボツリヌス毒素軽鎖中の427位および428位のロイシンをアラニンで置換すると、軽鎖に特有な局在が大きく変化する。
【００７９】
軽鎖上に存在するロイシンベースモチーフまたは他の任意の持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を、重鎖を保護するためにも利用することができることは、本発明の範囲に含まれる。ランダムコイルのベルトがA型ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインから伸長して軽鎖を取り巻いている。このベルトは、軽鎖が細胞膜に局在化した状態で、2つのサブユニットを細胞内で互いに近接した状態に保っているのかもしれない。天然A型ボツリヌス毒素の構造を図6に示す。
【００８０】
さらに、本発明のデータは、ロイシンベースモチーフが、ボツリヌスA毒素を細胞内でSNAP-25基質のごく近傍に局在化させるのに役立ちうることも示している。これは、ロイシンベースモチーフが毒素の半減期の決定だけでなく、毒素の活性の決定にも重要であることを意味しうる。すなわち、毒素が細胞内でSNAP-25基質のごく近傍に保たれるのであれば、毒素はより強い活性を持つだろう。図5は、分化したPC12細胞の水平共焦点断面におけるSNAP-25の局在を示す（Martinez-Arcaら（2000）J Cell Biol 149：889-899）。図1に示すA型ボツリヌス毒素軽鎖の局在を図5に示すSANP-25の局在と比較すると、局在化パターンの類似性を認めることができる。
【００８１】
本発明のデータは、軽鎖の切断短縮によるロイシンベースモチーフの欠失、またはロイシンベースモチーフ内でのアミノ酸置換が、神経細胞におけるA型ボツリヌス毒素軽鎖の膜局在を大きく変化させることを明示している。切断短縮でも置換でも、ある割合の改変軽鎖は、天然A型軽鎖とは異なるパターンで細胞膜に局在することができる（図1、2および4参照）。このデータは、ロイシンベースモチーフ以外の生物学的持続性増加成分、例えばチロシンモチーフおよびアミノ酸誘導体などの存在を裏付けている。これら他の生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を改変神経毒に使用することも、本発明の範囲に包含される。
【００８２】
さらに、1つの改変神経毒に2以上の生物学的持続性増加成分を組み合わせて使用して、改変された神経毒の生物学的持続性を変化させることも、本発明の範囲に包含される。本発明は、1つの改変神経毒に2以上の生物学的活性増加成分または生物学的活性減少成分を組み合わせて使用して、改変された神経毒の生物学的活性を変化させることも包含する。
【００８３】
チロシンベースモチーフは、生物学的持続性および／または生物学的活性変更成分として、本発明の範囲に包含される。チロシンベースモチーフはY-X-X-Hy（Yはチロシン、Xは任意のアミノ酸、Hyは疎水性アミノ酸である）という配列を含む。チロシンベースモチーフはロイシンベースモチーフと類似する様式で作用することができる。図3に、A型毒素軽鎖に見いだされるチロシンモチーフの一部を角括弧で示す。さらに、チロシンベースモチーフは、図3にアスタリスク付きの角括弧で示すロイシンベースモチーフ内にも見いだされる。
【００８４】
A型ボツリヌス毒素中にもB型ボツリヌス毒素中にも天然に存在する1または複数の生物学的持続性変更成分および／または生物学的活性増加成分を含む改変神経毒も、本発明の範囲に包含される。
【００８５】
図7は、分化したPC12生細胞におけGFP-B型ボツリヌス神経毒軽鎖の局在を表す。B型軽鎖の局在は細胞内小器官への局在であるらしい。同様の局在パターンが図2に示すGFP-切断短縮型ボツリヌスA毒素に認められる。細胞内でのボツリヌス毒素またはボツリヌス毒素軽鎖の局在は、毒素の生物学的持続性および／または生物学的活性を決定する上で重要な因子であると考えられる。したがってこれらのデータは、A型ボツリヌス毒素とB型ボツリヌス毒素に共通する1または複数の生物学的持続性変更成分および／または生物学的活性変更成分が存在することを示しているようである。これらおよびその他の生物学的持続性変更成分および生物学的活性変更成分は、本発明に従って使用することが考えられる。
【００８６】
図8に、それぞれA型HallA株およびB型DanishI株から単離されたA型軽鎖（配列番号19）およびB型軽鎖（配列番号20）の配列整列を示す。A型およびB型ボツリヌス毒素の他の株から単離された軽鎖および重鎖も配列比較に使用することができる。陰付きのアミノ酸は鎖間でのアミノ酸一致またはアミノ酸合致を表す。図8のコンセンサス配列のアミノ酸位置10とアミノ酸位置425の間にある陰付きアミノ酸は、それぞれ単独で、または他の任意の1または複数の陰付きアミノ酸との組み合わせで、本発明の範囲に包含される生物学的持続性変更成分を表す。例えば、19〜22位のアミノ酸KAFK、304〜306位のLNK、228位のLと95位および96位のKLとの組合わせ、346〜351位のFDKLYK、78〜81位のYL-T、73〜75位のYYDと78位および79位のYLと81位のTとの組合わせ、297位のFと300位のIと95位および96位のKLとの組合わせは、本発明の範囲内で使用される生物学的持続性変更成分であることができる。さらに、電荷、疎水性、親水性が保存された領域および／または保存された配列とは無関係に存在しうる保存された二次、三次または四次構造も、本発明の範囲に包含される。
【００８７】
アミノ酸誘導体も生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分として本発明の範囲に包含される。生物学的持続性および／または生物学的活性をもたらすように作用するアミノ酸誘導体の例は、リン酸化アミノ酸である。これらのアミノ酸には、例えばチロシンキナーゼ、プロテインキナーゼCまたはカゼインキナーゼIIによってリン酸化されたアミノ酸などが含まれる。生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分として本発明の範囲に包含される他のアミノ酸誘導体は、ミリスチル化アミノ酸およびN-グリコシル化アミノ酸である。
【００８８】
本発明の基本的一側面として、改変神経毒を使ってある状態を処置する方法が提供される。状態としては、例えば骨格筋異常、平滑筋異常、痛みおよび腺異常などを挙げることができる。改変神経毒は、例えば眉間のシワを処置するために、化粧品にも使用することができる。
【００８９】
改変神経毒で処置することができる神経筋障害および神経筋異常としては、例えば痙攣性発声障害、喉頭ジストニア、口下顎ジストニアおよび舌ジストニア、頸部ジストニア、書痙、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、痙性斜頚、脳性麻痺、局所性痙縮および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラジア、嚥下障害などが挙げられ、筋肉群の不随意運動を特徴とする他の筋緊張障害も、本投与法によって処置することができる。本方法および本組成物を使って処置することができる状態の他の例は、流涙、多汗、唾液分泌過多および胃腸分泌過多ならびに他の分泌障害である。さらに、皮膚状態の処置、例えば眉間のシワの減少、肌のシワの減少などにも、本発明を利用することができる。本発明は、スポーツ傷害の処置にも利用することができる。
【００９０】
Borodicの米国特許第5,053,005号には、A型ボツリヌス毒素を使って若年性脊柱彎曲、すなわち脊柱側弯症を処置する方法が開示されている。Borodicの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、Borodicが開示した方法と実質的に同様の方法を使って、脊柱彎曲を処置するために、改変神経毒を哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。好ましい態様として、ロイシンベースモチーフと融合したE型ボツリヌス毒素を含む改変神経毒を投与する。より好ましくは、脊柱彎曲を処置するために、軽鎖のカルボキシル末端に融合されたロイシンベースモチーフを持つA-E型ボツリヌス毒素を含む改変神経毒を、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【００９１】
さらに、A型ボツリヌス毒素を使って広く行なわれている周知の技術を用いて他の神経筋障害を処置するために、改変神経毒を投与することもできる。例えば、本発明は、頭痛、筋痙攣による痛みおよび様々な形態の炎症痛などの痛みの処置に利用することができる。例えばAokiの米国特許第5,721,215号およびAokiの米国特許第6,113,915号には、痛みの処置にA型ボツリヌス毒素を使用する方法が開示されている。これらの2つの特許の開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。
【００９２】
自律神経系障害も改変神経毒を使って処置することができる。例えば腺機能不全は自律神経系障害である。腺機能不全には発汗過多および唾液分泌過多が含まれる。呼吸機能不全は自律神経系障害のもう一つの例である。呼吸機能不全には慢性閉塞性肺疾患および喘息が含まれる。Sandersらは自律神経系を処置する方法、例えば発汗過多、唾液分泌過多、喘息などの自律神経系障害を天然のボツリヌス毒素を使って処置する方法を開示している。Sanderらの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、改変神経毒を使用する点以外はSandersらの方法と実質的に同様の方法を使って、上述したような自律神経系障害を処置することができる。例えば、鼻腔における粘液分泌を制御する自律神経系のコリン作動性ニューロンを変性させるのに十分な量の改変神経毒を哺乳動物の鼻腔に局所適用することができる。
【００９３】
改変神経毒によって処置することができる痛みには、筋緊張または筋痙攣に起因する痛み、または筋痙攣とは関係のない痛みが含まれる。例えばBinderは、血管障害、筋緊張、神経痛およびニューロパシーに起因する頭痛を、天然のボツリヌス毒素、例えばA型ボツリヌス毒素で処置することができることを、米国特許第5,714,468号に開示している。Binderの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、改変神経毒を使用する点以外はBinderの方法と実質的に同様の方法を使って、頭痛、特に血管障害、筋緊張、神経痛およびニューロパシーに起因する頭痛を処置することができる。筋痙攣に起因する痛みも、改変神経毒の投与によって処置することができる。例えば、ロイシンベースモチーフに好ましくはE型ボツリヌス毒素軽鎖のカルボキシル末端で融合されているE型ボツリヌス毒素は、痛みを軽減するために、疼痛／痙攣部位に筋肉内投与することができる。
【００９４】
さらに、痙攣などの筋肉障害に関係しない痛みを処置するために、改変神経毒を哺乳動物に投与することもできる。基本的一態様として、非痙攣関連痛を処置するための本発明の方法は、改変神経毒の中枢投与または末梢投与を含む。
【００９５】
例えばFosterらは、痛みを軽減するために、ターゲティング部分と接合されたボツリヌス毒素を中枢（くも膜下腔内）投与することができることを、米国特許5,989,545号に開示している。Fosterらの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、本発明の改変神経毒を使用する点以外はFosterらの方法と実質的に同様の方法を使って、痛みを処置することができる。処置される痛みは急性痛または好ましくは慢性痛であることができる。
【００９６】
筋痙攣に関係しない急性または慢性痛は、哺乳動物上の実際の疼痛部位または痛みを感じている部位への改変神経毒の局所末梢投与によって軽減することもできる。一態様として、疼痛部位または疼痛部位の近傍、例えば切傷またはその近傍に、改変神経毒を皮下投与する。もう一つの態様として、疼痛部位またはその近傍、例えば哺乳動物上の挫傷部位またはその近傍に、改変神経毒を筋肉内投与する。もう一つの態様として、関節炎状態に起因する痛みを処置または軽減するために、哺乳動物の関節中に、改変神経毒を直接注射する。また、末梢疼痛部位への改変神経毒の頻繁な反復注射または注入も、本発明の範囲に包含される。しかし、長時間持続する本発明の治療効果を考えると、神経毒の頻繁な注射または注入は必要ないはずである。例えば本発明の実施により、1回の注射につき、ヒトで2ヶ月以上、例えば27ヶ月にわたる鎮痛効果を得ることができる。
【００９７】
本発明を何らかの作用機序または作用理論に限定することは望まないが、改変神経毒を末梢部位に局所投与すると、改変神経毒は、SNARE依存的エキソサイトーシスを阻害することにより、末梢一次感覚終末からの神経物質、例えばサブスタンスPなどの放出を阻害すると考えられる。末梢一次感覚終末によるサブスタンスPの放出は疼痛伝達プロセスを誘発するか、または少なくとも増幅することができるので、末梢一次感覚終末におけるその放出を阻害すると、疼痛シグナルの伝達が抑制されて脳に到達しなくなるだろう。
【００９８】
本発明の改変神経毒は、末梢部位で薬理作用を持つだけでなく、米国特許第6,113,915号に記載されているように直接髄腔内投与するか、または末梢投与でも改変毒素がおそらく一次感覚求心神経を通る逆行輸送によって作用する場合には、中枢神経系でも阻害効果を持つことができる。この逆行性軸索輸送仮説は、A型ボツリヌス毒素を末梢に注射した時にこの神経毒が後角に逆行輸送されうることを示す公表されたデータによって裏付けられる。例えば、Weigandら，Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1976：292，161-165およびHabermann，Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1974：281，47-56の研究は、ボツリヌス毒素が逆行輸送によって脊髄領域に上行できることを示した。したがって、末梢部位に注射（例えば筋肉内注射）された改変神経毒、例えばロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を突然変異させたA型ボツリヌス毒素は、末梢一次感覚終末から中枢領域に逆行輸送されると予想することができる。
【００９９】
改変神経毒の投与量は、処置される障害、その重症度、および他の様々な患者変数、例えばサイズ、体重、年齢、および治療法に対する応答性などによって大きく変動しうる。一般に、投与すべき改変神経毒の用量は、処置される哺乳動物、好ましくはヒトの年齢、主症状および体重によって変動するだろう。改変神経毒の効力も考慮されるだろう。
【０１００】
効力（A型ボツリヌス毒素の場合）がヒト患者でLD50＝2,730Uに実質的に等しく、平均的な人が75kgであると仮定すると、改変神経毒の致死量（A型ボツリヌス毒素の場合）は約36U／kgになるだろう。したがって、そのようなLD50を持つ改変神経毒を投与する場合は、36U／kg未満の改変神経毒をヒト対象に投与することが適切だろう。好ましくは約0.01U／kg〜30U／kgの改変神経毒を投与する。より好ましくは約1U／kg〜約15U／kgの改変神経毒を投与する。さらに好ましくは、約5U／kg〜約10U／kgの改変神経毒を投与する。一般に、改変神経毒は、約2.5cc／100Uの割合に相当する投与量で、組成物として投与されるだろう。これより高いまたは低い効力を持つ神経毒について、これらの投与量を調節する方法は、当業者であれば知っているか、容易に確かめることができる。B型ボツリヌス毒素は、同様の治療効果を得るためにA型ボツリヌス毒素で使用されるレベルよりも約50倍高いレベルで投与できることが知られている。したがって、B型ボツリヌス毒素の場合は、上述した単位量を約50倍することができる。
【０１０１】
投与経路および投与量の例を記載したが、適切な投与経路および投与量は一般に主治医が症例毎に決定する。そのような決定は当業者にとっては日常的作業である（例えばAnthony Fauciら編「Harrison's Principles of Internal Medicine」14版，1998，McGraw Hillを参照されたい）。例えば、本発明による改変神経毒の投与経路および投与量は、選択した改変神経毒の溶解度特性ならびに処置される障害のタイプなどの基準に基づいて選択することができる。
【０１０２】
改変神経毒は、当技術分野でよく知られている通常の化学的方法を使って、ロイシンベースモチーフを神経毒に化学的に連結することによって製造することができる。例えば、E型ボツリヌス毒素は、発酵槽でボツリヌス菌の培養を樹立し、増殖させた後、発酵混合物を既知の手法で収集し、精製することによって得ることができる。
【０１０３】
改変神経毒は組換え技術によって製造することもできる。クロストリジウム属の異なる種に由来するアミノ酸配列領域を持つ神経毒、または改変されたアミノ酸配列領域を持つ神経毒を製造するには、組換え技術が好ましい。また、ロイシンベースモチーフが欠失によって改変されているA型ボツリヌス毒素を製造する場合も、組換え技術は好ましい。この技術には、細胞結合部分、神経毒またはその一部を移行させるのに有効なアミノ酸配列、および標的細胞（好ましくはニューロン）の細胞質中に放出された時に治療活性を持つアミノ酸配列のコードを持つ遺伝物質を、天然の供給源または合成的供給源から取得するステップが含まれる。好ましい一態様として、遺伝物質は、生物学的持続性増加成分、好ましくはロイシンベースモチーフ、HC、HNおよびクロストリジウム神経毒の軽鎖ならびにその断片のコードを持つ。遺伝子コンストラクトは、まずファージまたはプラスミドなどのクローニングベクターに遺伝子コンストラクトを融合することによって、増幅用宿主細胞に組み込まれる。次に、クローニングベクターを宿主、例えばクロストリジウム属、大腸菌または他の原核細胞、酵母、昆虫細胞株または哺乳類細胞株などに挿入する。宿主細胞における組換え遺伝子の発現に続いて、得られたタンパク質を通常の技術を使って単離することができる。
【０１０４】
これらの改変神経毒を組換え法で製造することには多くの利点がある。例えば、改変神経毒を作るには、改変用断片または改変用成分を神経毒素に結合するか、挿入しなければならない。嫌気性クロストリジウム培養からの神経毒の製造は、面倒で時間のかかる方法であり、これには数ステップのタンパク質沈降、および長時間かかる結晶化もしくは結晶化の反復、または数段階のカラムクロマトグラフィーを必要とする多段階精製プロトコールが含まれる。重大なことに、生成物の毒性が高いために、作業は厳密な封じ込め（BL-3）の下で行なわれなければならない。発酵プロセス中に、折りたたまれている一本鎖神経毒は、内因性クロストリジウムプロテアーゼにより、ニッキングと呼ばれるプロセスで活性化されて、二鎖（dichain）を生成する。時として、ニッキングプロセスに伴って一本鎖から約10アミノ酸残基が除去され、2本の鎖が鎖内ジスルフィド結合によって共有結合された状態を保っている二鎖型が生成する。
【０１０５】
ニックの入った神経毒は、ニックが入っていないものよりはるかに活性が高い。ニッキングの量および正確な位置は、毒素を産生する細菌の血清型によって様々である。一本鎖神経毒活性化の相違、したがってニックの入った毒素の収量の相違は、血清型およびその株が産生するタンパク質分解活性量の変動によって起こる。例えばボツリヌス菌血清型Aの一本鎖神経毒は99％以上がボツリヌス菌HallA株によって活性されるが、血清型BおよびEの株は活性化の量が少ない毒素を産生する（発酵時間に依存して0〜75％）。したがって、成熟神経毒の高い毒性は、治療薬としての神経毒の商業的製造において重要な役割を果たす。
【０１０６】
したがって、操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度は、これらの物質の製造にとって重要な事項である。ボツリヌス毒素および破傷風毒素などの神経毒を、安全で単離しやすく、完全活性型への変換が容易な、比較的無毒性の一本鎖（または中毒活性が低下した一本鎖）として、迅速に成長する細菌（例えば異種大腸菌細胞）などで高収率に組換え発現させることができれば、非常に有利だろう。
【０１０７】
安全性が最も重要であるため、過去の研究は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素のH鎖と軽鎖を個別に大腸菌で発現させて精製することに集中してきた。これらの単離された鎖は単独では無毒である。参考文献として本明細書の一部を構成するLiら，Biochemistry 33：7014-7020（1994）およびZhouら，Biochemistry 34：15175-15181（1995）を参照されたい。これらのペプチド鎖を個別に製造した後、厳密に制御された条件下で、H鎖と軽鎖を酸化的ジスルフィド結合によって組み合わせて、神経麻痺性の二鎖を形成させることができる。
【０１０８】
（実施例）
以下の非限定的実施例により、当業者に、本発明の範囲に包含される非痙攣関連痛の好ましい処置方法を具体的に示すが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１０９】
実施例１：筋肉障害に伴う痛みの処置
ある36歳の不運な女性は、15年に及ぶ顎関節疾患ならびに咬筋および側頭筋に沿った慢性痛の病歴を持っている。評価を受ける15年前に、彼女は、顎の開閉に関して痛みを伴う顎の不動性が増していること、および顔の両側に沿って圧痛があることに気付いた。最初は左側の方が右側より悪いと判断される。彼女は、関節の亜脱臼を伴う顎関節（TMJ）機能不全と診断され、外科的矯正形成半月切除および顆切除術による処置を受ける。
【０１１０】
手術後も顎を開閉しにくい状態が続くので、数年後に、両側の人工関節置換術を行なう。この手術後に、顎の痙攣および偏位が漸進的に起こるようになる。人工関節のゆるみを修正するために、関節の最初の手術に続いて、さらなる外科的修正も行なわれる。これらの手術後も顎はかなりの痛みと不動を呈し続ける。TMJおよび筋そのものは、相変わらず、触れると痛みを感じた。圧痛点は顎関節の全面にわたって存在し、筋肉全体に緊張の増加が認められる。彼女は術後筋筋膜疼痛症候群と診断され、咬筋および側頭筋への改変神経毒の注射を受ける。改変神経毒はロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。具体的な投与量および投与頻度は治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。
【０１１１】
注射の数日後に、彼女は、痛みがかなり改善したことに気付き、顎が自由になった感じがすると報告する。これは2〜3週間かけて徐々に改善し、この間に彼女は顎が開けやすくなり、痛みも減少していることに気付く。彼女は、痛みはこの4年間で一番ましであると明言する。改善された状態は、改変神経毒の最初の注射後、27ヶ月まで持続する。
【０１１２】
実施例２：脊髄傷害後に起こった痛みの処置
脊髄傷害後に起こった痛みを感じている39歳の患者を、改変神経毒の髄腔内投与、例えば脊椎穿刺または脊髄へのカテーテル挿入（注入の場合）によって処置する。改変神経毒はロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。上述のように、具体的な毒素の投与量と注射部位は、毒素の投与頻度と共に、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変毒素の投与後約1日〜約7日以内に、患者の痛みはかなり減少する。痛みの軽減は27ヶ月まで持続する。
【０１１３】
実施例３：改変神経毒の末梢投与による「肩手症候群」の処置
肩、腕および手の痛みは筋萎縮症、骨粗鬆症および関節の固着に伴って発症しうる。冠不全後が最も一般的であるが、この症候群は頸部関節症または限局性肩疾患でも起こり、また患者に臥床状態を強いる長期間の病気後にも起こりうる。
【０１１４】
ある46歳の女性は肩手症候群型の痛みを呈している。痛みは三角筋領域に特に局在している。この患者を肩への改変神経毒の皮下ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、ロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。改変神経毒は、例えば、ロイシンベースモチーフを含む改変A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素であってもよい。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に、患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１５】
実施例４：改変神経毒の末梢投与による帯状疱疹後神経痛の処置
帯状疱疹後神経痛は難治性が最も高い慢性痛問題の一つである。この耐え難い痛みを伴う経過に苦しむ患者は、多くの場合、高齢であり、消耗性疾患を持ち、大規模なインターベンション術には適さない。診断は疱疹の病巣跡の存在および患者の病歴によって容易に下される。痛みは強く、情動的に苦しい。帯状疱疹後神経痛はどこにでも起こりうるが、胸部に起こることが最も多い。
【０１１６】
ある76歳の男性は帯状疱疹後型の痛みを呈している。痛みは腹部領域に局在している。この患者を、腹部への改変神経毒の皮内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、例えばA、B、C1、C2、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素である。改変神経毒はロイシンベースモチーフおよび／または付加的なチロシンベースモチーフを含む。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１７】
実施例５：改変神経毒の末梢投与による鼻咽頭腫瘍痛の処置
これらの腫瘍は、多くの場合、扁平上皮癌で、通常、ローゼンミュラー窩にあり、頭蓋底を冒しうる。顔面の痛みがよく起こる。この痛みの性質は絶え間なく続く鈍痛である。
【０１１８】
ある35歳の男性は鼻咽頭腫瘍型の痛みを呈している。痛みは左下頬に認められる。この患者を、頬への改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、生物学的持続性を増加させる付加的アミノ酸誘導体、例えばチロシンリン酸化を含むA、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素である。具体的な投与量および投与頻度は治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１９】
実施例６：改変神経毒の末梢投与による炎症痛の処置
ある45歳の患者は胸部に炎症痛を呈している。この患者を、胸部への改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、付加的なチロシンベースモチーフを含むA、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素である。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１２０】
実施例７
片側性発汗過多を示す65歳の男性を改変神経毒の投与によって処置する。投与量及び投与頻度は所望する効果の程度に依存する。改変神経毒は、好ましくは、A、B、C1、C2、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素である。改変毒素はロイシンベースモチーフを含む。投与は腺神経叢、神経節、脊髄または中枢神経系への投与である。具体的な投与部位は、標的とする腺および分泌細胞の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定されることになる。さらに、適当な脊髄レベルまたは脳内領域に毒素を注射することもできる。改変神経毒処置後の発汗過多の停止は27ヶ月に及ぶ。
【０１２１】
実施例８：術後処置
ある22歳の女性は肩腱断裂を呈し、腱を修復するために整形外科手術を受ける。手術後に、患者の肩に、改変神経毒を筋肉内投与する。改変神経毒は、生物学的持続性増加成分の1または複数のアミノ酸を毒素から欠失させたA、B、C、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素であることができる。例えば、ボツリヌス毒素血清型Aのロイシンベースモチーフの1または複数のロイシン残基を欠失させかつ／または突然変異させることができる。もう一つの選択肢として、ロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換することもできる。例えばロイシンベースモチーフ中の2つのロイシンをアラニンで置換することができる。具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。具体的な投与部位は、筋肉の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定されることになる。投与される改変神経毒は、手術からの回復が促進されるように、腕の動きを抑制する。改変神経毒が作用する期間は約5週間以下である。
【０１２２】
実施例９：ボツリヌス神経毒軽鎖遺伝子のクローニング、発現および精製
この実施例では、ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNAヌクレオチド配列をクローニングし、発現させ、その結果得られるタンパク質産物を精製する方法を説明する。ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNA配列は、軽鎖遺伝子の5’および3’末端領域に対応した配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRプロトコールによって増幅することができる。プライマーの設計により、ボツリヌス毒素軽鎖遺伝子PCR産物の5’および3’末端に、例えばStuI制限部位およびEcoRI制限部位などの制限部位が導入されるようにすることができる。そうすれば、これらの制限部位を利用することによって、増幅産物の一方向サブクローニングを容易に行なうことができる。さらに、これらのプライマーを使って、軽鎖コード配列のC末端に停止コドンを導入することもできる。ボツリヌス菌（例えばHallA株）由来の染色体DNAを増幅反応のテンプレートとして利用することができる。
【０１２３】
PCR増幅は、10mMトリスHCl（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、50pmolの各プライマー、200ngのゲノムDNAおよび2.5単位のTaq DNAポリメラーゼを含む0.1mLの液量で行なうことができる。反応混合物は、35サイクルの変性（94℃で1分）、アニーリング（55℃で2分）および重合（72℃で2分）にかけることができる。最後に、72℃でさらに5分間、反応を延長することができる。
【０１２４】
PCR増幅産物を、例えばStuIおよびEcoRIで消化して、軽鎖をコードするクローン化PCR DNA断片を遊離させることができる。次にこの断片を例えばアガロースゲル電気泳動などによって精製して、例えばSmaIおよびEcoRIで消化したpBluescript II SKファージミド中に連結することができる。この組換えファージミドを保持する細菌形質転換体（例えば大腸菌）は、青／白スクリーニング法などの標準的方法によって同定することができる。軽鎖をコードするDNAを含むクローンは、標準的な方法で行なわれるDNA配列解析によって同定することができる。クローン配列は、例えばBinzら，J.Biol.Chem. 265，9153（1990）、Thompsonら，Eur.J.Biochem. 189，73（1990）およびMinton「クロストリジウム神経毒、破傷風およびボツリヌス中毒症の分子病原論（Clostridial Neurotoxins，The Molecular Pathogenesis of Tetanus and Botulism）」C.Motecucco編（1995）161〜191頁などに公表されているボツリヌス毒素軽鎖の配列とクローン配列とを比較することによって、確認することができる。
【０１２５】
軽鎖は例えばpMal-P2などの発現ベクターにサブクローニングすることができる。pMal-P2は、強力な誘導性プロモーターPtacによって制御されるMBP（マルトース結合タンパク質）をコードするmalE遺伝子を保有している。
【０１２６】
ボツリヌス毒素軽鎖の発現を確認するために、軽鎖遺伝子含有pMal-P2を保有する十分に分離された細菌コロニーを使って、0.1mg／mlアンピシリンおよび2％（w／v）グルコースを含むL-ブロスに植菌し、振とうしながら30℃で終夜生育させる。その終夜培養物を、0.1mg／mlのアンピシリンを含む新しいL-ブロスに、1：10に希釈し、2時間培養する。最終濃度0.1mMのIPTGを添加することによって、融合タンパク質の発現を誘導する。30℃でさらに4時間培養した後、6,000×gで10分間の遠心分離によって、細菌を収集することができる。
【０１２７】
少量SDS-PAGE解析によって、IPTG誘導細菌から得られる試料中に90kDaタンパク質バンドの存在を確認することができる。この分子量は、MBP（約40kDa）成分とボツリヌス毒素軽鎖（約50kDa）成分との融合タンパク質の予想サイズと一致しているだろう。
【０１２８】
IPTG誘導細菌抽出物中に所望の融合タンパク質が存在することは、Cenci di Belloら，Eur.J.Biochem. 219，161（1993）に記載のポリクローナル抗L鎖プローブを使ったウェスタンブロット法によって確認することができる。PVDF膜（Pharmacia、英国ミルトンキーンズ）上の反応性バンドは、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギ免疫グロブリン（BioRad、英国ヘメルヘンプステッド）とECL検出システム（Amersham、英国）とを使って可視化することができる。ウェスタンブロット法の結果から、通例、顕著な融合タンパク質の存在が、完全な大きさの融合タンパク質よりも低い分子量を持つタンパク質に相当するいくつかの不鮮明なバンドと共に確認される。この知見は、融合タンパク質の限定的分解が、細菌内または単離操作中に起こったことを示唆している。
【０１２９】
サブクローニングされた軽鎖を製造するために、野生型ボツリヌス神経毒軽鎖タンパク質を発現させる細菌の1リットル培養物から得たペレットを、1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）および10mMベンズアミジンを含むカラムバッファー［10mMトリスHCl（pH8.0）、200mM NaCl、1mM EGTAおよび1mM DTT］に再懸濁し、超音波処理によって溶解することができる。溶解液は、4℃、15,000×gで15分間の遠心分離によって清澄化することができる。上清はアミロースアフィニティーカラム［2×10cm、樹脂量30ml］（New England BioLabs、英国ヒッチン）にかけることができる。結合していないタンパク質は、カラムバッファーを使って、280nmにおける吸光度測定値の安定によって溶出液がタンパク質を含んでいないと判断されるまで、樹脂から洗い流すことができる。次に、結合しているMBP-L鎖融合タンパク質を、10mMマルトースを含むカラムバッファーで溶出させることができる。融合タンパク質を含む画分をプールし、150mM NaCl、2mM CaCl2および1mM DTTを添加した20mMトリスHCl（pH8.0）に対して、4℃で72時間透析する。
【０１３０】
MBP-L鎖融合タンパク質は宿主細菌からの遊離後に精製することができる。細菌からの遊離は、細菌細胞膜を酵素的に分解するか機械的に破壊することによって達成することができる。精製にはアミロースアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。組換え野生型または突然変異型軽鎖は、Xa因子による部位特異的切断によって、融合タンパク質の糖結合ドメインから分離することができる。この切断法では通例、遊離のMBP、遊離の軽鎖および少量の未切断融合タンパク質が得られる。そのような混合物中に存在する得られた軽鎖が所望の活性を持つことを示すことはできるが、さらなる精製ステップを利用することもできる。例えば、切断生成物の混合物を、第2のアミロースアフィニティーカラムにかけて、MBPおよび未切断融合タンパク質を結合させることができる。遊離の軽鎖は通過画分中に単離することができる。
【０１３１】
実施例１０：天然軽鎖、組換え野生型軽鎖の精製重鎖との再構成
天然の重鎖および軽鎖は、2M尿素を使ってBoNTから解離させ、100mM DTTで還元した後、確立されたクロマトグラフィー法によって精製することができる。例えばKozakiら，1981，Japan J.Med.Sci.Biol. 34，61およびMaiseyら，1988，Eur.J.Biochem. 177，683。精製された重鎖を等モル量の天然軽鎖または組換え軽鎖と混合することができる。再構成は、25mMトリス（pH8.0）、50μM酢酸亜鉛および150mM NaClからなるバッファーに対して試料を4℃で4日間透析することによって行なうことができる。透析後に、組換え軽鎖と天然重鎖との会合によるジスルフィド結合した150kDa二鎖の形成は、SDS-PAGEによってモニターし、デンシトメーターで定量することができる。
【０１３２】
実施例１１：増加した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
改変神経毒は組換え技術と通常の化学的技術との併用によって製造することができる。
神経毒鎖、例えば生物学的持続性増加成分と融合して改変神経毒を形成させるボツリヌス軽鎖は、実施例9で述べたように組換え生産し、精製することができる。
【０１３３】
組換え技術によって得た組換え神経毒鎖は、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体などに、共有結合によって融合（またはカップリング）することができる。生物学的持続性増加成分を含むペプチド配列は、当業者に知られる標準的な溶液または固相t-Boc／Fmoc法によって合成することができる。同様の合成技術、例えばMiltonら，1992，Biochemistry 31，8799-8809およびSwainら，1993，Peptide Research 6，147-154で使用されるている方法論なども、本発明の範囲に含まれる。A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖には、例えば毒素のカルボキシル末端に、1または複数の合成生物学的持続性増加成分を融合することができる。生物学的持続性増加成分の融合は、当業者に知られる試薬類および技術、例えばPDPH／EDACおよびトラウト（Traut）試薬法などを用いる化学的カップリングによって達成される。
【０１３４】
もう一つの選択肢として、改変神経毒は、生物学的持続性増加成分を組換えボツリヌス毒素鎖に融合するステップを行なわずに、組換え生産することもできる。例えば、組換え神経毒鎖、例えば実施例9の組換え法によって得られるボツリヌス毒素軽鎖を、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体を持つように製造することができる。例えば、生物学的持続性増加成分をコードする1または複数のDNA配列を、A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖をコードするDNA配列に付加することができる。この付加は、部位特異的突然変異誘発に使用される当業者に周知の数多くの方法によって行なうことができる。
【０１３５】
生物学的持続性増加成分が融合または付加されている組換え改変軽鎖を、実施例10に記載の方法によって神経毒の重鎖と再構成させることによって、完全な改変神経毒を製造することができる。
【０１３６】
この実施例に従って製造される改変神経毒は増加した生物学的持続性を持つ。好ましくは、生物学的持続性は、追加された生物学的持続性増加成分を持たない同一の神経毒と比較して、約20％〜約300％増加する。
【０１３７】
実施例１２：減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒は組換え法を使って製造することができる。例えば、実施例9の組換え法によって得られるボツリヌス毒素軽鎖を、生物学的持続性増加成分を持たないように製造することができる。例えば、1または複数のロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体を突然変異させることができる。例えば、生物学的持続性増加成分をコードする1または複数のDNA配列を、A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖をコードするDNA配列から除去することができる。例えば、ロイシンベースモチーフをコードするDNA配列を、A型ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNA配列から除去することができる。DNA配列の除去は、当業者によく知られている多くの方法によって行なうことができる。
【０１３８】
生物学的持続性増加成分を欠失させた組換え改変軽鎖を、実施例10に記載の方法によって神経毒の重鎖と再構成させることによって、完全な改変神経毒を製造することができる。
【０１３９】
この実施例に従って製造される改変神経毒は減少した生物学的持続性を持つ。好ましくは、生物学的持続性は、ロイシンベースモチーフを持つ同一の神経毒、例えばA型ボツリヌス毒素と比較して、約20％〜約300％減少する。
【０１４０】
いくつかの好ましい方法に関して本発明を詳しく説明したが、他の態様、変形および変更も、本発明の範囲内で可能である。例えば、本発明の方法ではクロストリジウム神経毒の代わりに広範囲にわたる多様な改変毒素を有効に利用することができる。また、改変神経毒に相当する遺伝コード、すなわちDNA配列も、本発明の一部とみなされる。さらに、本発明は、2以上の改変毒素、例えばロイシンベースモチーフが融合されているE型ボツリヌス毒素と、ロイシンベースモチーフを含むB型ボツリヌス毒素とを、同時にまたは逐次的に投与する末梢投与法を包含する。本発明を種々の具体的実施例および具体的態様に関して説明したが、本発明はそれらに限定されるわけではなく、本発明は特許請求の範囲内で様々な形態で実施することができると理解すべきである。
【０１４１】
実施例１３：減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性を決定する上で、重要な因子であると思われる。なぜなら、細胞膜への局在により、局在化したタンパク質は、細胞内タンパク質分解複合体から保護されうるからである。
【０１４２】
B型ボツリヌス神経毒の生物学的持続性がA型ボツリヌス神経毒の生物学的持続性より短いことは周知であり、広く受け入れられている。この研究では、A型ボツリヌス毒素軽鎖を切断短縮してロイシンベースモチーフを除去すると、軽鎖は、その特徴的なパターンで細胞膜に局在化する能力を、実質的に失うことが実証された。実際、切断短縮されたA型軽鎖は、B型ボツリヌス毒素軽鎖に似たパターンで細胞膜に局在化する。
【０１４３】
したがって、切断短縮されたA型ボツリヌス毒素は、B型ボツリヌス毒素と同様の減少した生物学的持続性および／または減少した生物学的活性を持つという仮説を立てることができる。
【０１４４】
実施例１４：変化した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性を決定する上で、重要な因子であると思われる。なぜなら、細胞膜への局在により、局在化したタンパク質は、細胞内タンパク質分解複合体から保護されうるからである。
【０１４５】
この研究では、A型ボツリヌス毒素軽鎖を突然変異させて427位と428位の2つのロイシンをアラニンに変化させると（図3）、軽鎖は、その特徴的なパターンで細胞膜に局在化する能力を、実質的に失うことが実証された。
【０１４６】
このデータから、突然変異させたA型ボツリヌス毒素は、変化した生物学的持続性を持つと結論することができる。
【０１４７】
実施例１５：切断短縮型LC／AによるSNAP25のインビトロ切断
図9に示すように、本発明者らはインビトロELISAアッセイを行なって、切断短縮型LC／Aがインビトロで、非切断短縮型LC／Aより低い効率でSNAP-25基質を切断することを実証した。記載するデータはエキソサイトーシスの阻害の尺度ではなく、SNAP-25切断物のインビトロ形成の尺度である。このアッセイは以下のように行なった。
【０１４８】
材料：
BirA-SNAP25128-206-これは、SNAP25の残基128-206のN末端に融合したBirAシグナル配列からなるLC／Aの組換え基質である。この融合コンストラクトを大腸菌で産生させ、BirAシグナル配列を大腸菌によってビオチン化させた。マイクロタイタープレートをストレプトアビジンで被覆処理した。使用した毒素はBoNT／A複合体またはLC／Aコンストラクトである。一次抗体は抗SNAP25197抗体とした。この抗体は、A型毒素による切断後にSNAP25のC末端を認識する（BirA-SNAP25128-197）。二次抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギIgGとした。セイヨウワサビペルオキシダーゼの比色用基質であるImmunoPure TMB基質はPierceから入手した。切断産物SNAP25197を認識する抗体はその切断産物に特異的であって、完全長未切断基質SNAP25206を認識しない。
【０１４９】
方法：
BirA-SNAP25128-206をマイクロタイタープレート上のストレプトアビジンに結合させた。プレートに、BoNT／A 900kDa複合体、His6-S-天然LC／AまたはHis6-S-切断短縮型LC／A-His6の段階希釈液を加えた。毒素試料は全てDTTと共にプレインキュベートした（これはLC／Aコンストラクトには必要ないが、LC／AコンストラクトもBoNT／A複合体と同じように処理した）。毒素試料を基質と共に37℃で90分間インキュベートした。毒素を除去し、結合している基質を抗SNAP25197抗体と共にインキュベートした。結合していない抗体を洗い流した後、プレートを二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギIgG）と共にインキュベートした。結合していない抗体を再び洗い流し、セイヨウワサビペルオキシダーゼの比色アッセイを行なった。このアッセイは450nmでの吸光度を読み取ることによって定量化した。
【０１５０】
本発明者らが行なった本明細書に記載の他の研究において、PC12細胞中で発現させた軽鎖コンストラクトは、PC12細胞中で直接発現させたものであり、タグは何も含んでいない。これらのインビトロアッセイのために大腸菌から発現させた軽鎖コンストラクトは、精製用のアフィニティータグを含んでいる（これらのタグはPC12細胞中で発現させた本明細書に記載のタンパク質には存在しない）。PC12中で発現させたLC／Aは融合タンパク質GFP-LC／Aであった。GFPとLC／Aの間には、両タンパク質を分離するために、一組のGlyが存在する。
【０１５１】
種々のコンストラクトを以下に説明する。
複合体（グラフでは赤色）：これはボツリヌス菌から単離されたBoNT／A 900kDa複合体である。
切断短縮型LC／A：N末端の8アミノ酸とC末端の22アミノ酸とを欠くコンストラクト。しかしこのコンストラクトは6-ヒスチジンおよびS-タグをN末端に持ち、さらにC末端にも6-ヒスチジンタグを持つ。
透析切断短縮型LC／A：切断短縮型LC／Aと同じであるが、精製に起因するイミダゾールが除去されている。
完全LC／A（グラフでは濃緑色）：天然LC／Aコンストラクト（完全長）。ただし、N末端に6-ヒスチジンおよびS-タグを持っている。C末端6-ヒスチジンは持っていない。
透析完全LC／A（グラフでは淡緑色）：完全LC／Aと同じであるが、精製に起因するイミダゾールが除去されている。
【０１５２】
これらの相違を図的に表すために、これらのコンストラクトのまさにN末端部分およびまさにC末端部分を図10に示す（LC／Aの中間部分は示されていない）。野生型と呼んでいるものは、本発明者らがPC12細胞中で直接発現させた天然LC／Aに相当する（これは、本発明者らが、切断されたSNAP25生成物のウェスタンブロット解析によってその活性を証明したコンストラクトである）。切断短縮型LC／AはHis-タグおよびS-タグを持つ切断短縮型軽鎖である。N-His-LC／Aは図9で完全LC／Aと呼んでいるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF（神経成長因子）分化PC12生細胞におけるGFP-ボツリヌス毒素A軽鎖の局在を表す図である。
【図２】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞におけるGFP-切断短縮型ボツリヌスA軽鎖の局在を表す図である。
【図３】 A型ボツリヌス毒素軽鎖のアミノ酸配列を表す図である。記載したアミノ酸配列から下線付きのアミノ酸を除いた配列は、A型ボツリヌス毒素切断短縮型軽鎖に相当する。
【図４】 427位および428位にLL→AA突然変異を持つGFP-ボツリヌス毒素A軽鎖の、蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞における局在を表す図である。
【図５】 スタウロスポリン分化PC12細胞の水平共焦点断面で視覚化した蛍光標識抗SNAP-25の局在を表す図である。
【図６】 A型ボツリヌス毒素のX線結晶構造を表す図である。
【図７】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞におけるGFP-B型ボツリヌス毒素軽鎖の局在を表す図である。
【図８】 A型ボツリヌス毒素HallA軽鎖およびB型ボツリヌス毒素Danish I軽鎖の整列およびコンセンサス配列を表す図である。
【図９】 本発明者らが行なったインビトロELISAアッセイの結果を表すグラフである。切断短縮型LC／Aが非切断短縮型LC／Aよりも遅い速度または低い効率で基質をインビトロ切断することを実証している。
【図１０】 インビトロ解析用に大腸菌から発現させたLC／Aコンストラクトの比較を表す図である。
（クロスリファレンス）
本願は2000年7月21日に出願された特許出願第09／620,840号の一部継続出願である。
【０００２】
（背景）
本発明は改変神経毒、特に改変クロストリジウム神経毒に関し、また天然のボツリヌス毒素を使って処置されてきた状態を含む種々の状態を処置するためのその使用に関する。
【０００３】
ボツリヌス毒素、例えばA型ボツリヌス毒素は、痛み、骨格筋異常、平滑筋異常および腺異常を含む数多くの状態の処置に使用されてきた。ボツリヌス毒素は美容目的にも使用されている。
【０００４】
ボツリヌス毒素を使った処置に関する例は数多く存在する。痛みを処置する例についてはAokiらの米国特許第6,113,915号およびAokiらの米国特許第5,721,215号を参照されたい。神経筋障害を処置する例については米国特許第5,053,005号を参照されたい。この米国特許第5,053,005号では、若年性脊柱彎曲、すなわち脊柱側弯症を、アセチルコリン放出阻害剤、好ましくはボツリヌス毒素Aを使って処置することが提案されている。A型ボツリヌス毒素による斜視の処置については、Elston,J.S.ら，British Journal of Ophthalmology，1985，69，718-724および891-896を参照されたい。A型ボツリヌス毒素による眼瞼痙攣の処置については、Adenis,J.P.ら，J.Fr.Ophthalmol.，1990，13（5），259-264を参照されたい。痙性および口下顎ジストニア斜頸の処置については、Jankovicら，Neurology，1987，37，616-623を参照されたい。痙攣性発声障害もA型ボツリヌス毒素によって処置されている。Blitzerら，Ann.Otol.Rhino.Laryngol，1985，94，591-594を参照されたい。Brinら，Adv.Neurol.（1987）50，599-608によれば、A型ボツリヌス毒素を使って、舌ジストニアの処置が行なわれた。Cohenら，Neurology（1987）37（Suppl.1），123-4には、A型ボツリヌス毒素による書痙の処置が開示されている。
【０００５】
変化した生物学的持続性および／または変化した生物学的活性を持つボツリヌス毒素があれば有益だろう。例えばボツリヌス毒素は、腱手術後の筋肉を不動化し肢運動を防いで回復を促進するために使用することができる。患者が手術から回復する頃には再び筋肉を使用し動かすことができるように、生物学的持続時間が短いボツリヌス毒素（A型ボツリヌス毒素など）があれば有益だろう。さらに、変化した生物学的活性、例えば増加した生物学的活性などを持つボツリヌス菌は効率のよい（すなわち単位量あたりの効力が高い）毒素として役立ち、その結果、毒素の使用量を減らすことができる。
【０００６】
加えて、増加した生物学的持続時間を示すことができる改変神経毒（改変クロストリジウム毒素など）ならびに減少した生物学的持続時間および／または生物学的活性を持つ改変神経毒素、ならびにそのような毒素の製造方法も、必要とされている。
【０００７】
（定義）
本発明の説明を続ける前に、以下の定義を記載し、それらを本明細書に適用する。
【０００８】
「重鎖」は、クロストリジウム神経毒の重鎖を意味する。これは約100kDaの分子量を持ち、本明細書では重鎖と呼ぶ場合も、Hと呼ぶ場合もある。
【０００９】
「HN」は、重鎖のアミノ末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒重鎖由来の断片（約50kDaの分子量を持つもの）、または無傷の重鎖中の前記断片に相当する部分を意味する。これは、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、細胞内エンドソーム膜を横切って起こる軽鎖のトランスロケーションに関与する部分を含むと考えられる。
【００１０】
「HＣ」は、重鎖のカルボキシル末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒重鎖由来の断片（約50kDa）、または無傷の重鎖中の前記断片に相当する部分を意味する。これは、免疫原性であると考えられると共に、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、種々のニューロン（運動ニューロンを含む）および他のタイプの標的細胞への高親和性結合に関与する部分を含むと考えられる。
【００１１】
「軽鎖」は、クロストリジウム神経毒の軽鎖を意味する。これは約50kDaの分子量を持ち、軽鎖と呼ぶ場合も、クロストリジウム神経毒のタンパク質分解ドメイン（アミノ酸配列）と呼ぶ場合もある。軽鎖が標的細胞の細胞質中に存在する場合、軽鎖はエキソサイトーシスの阻害剤として、例えば神経伝達物質（すなわちアセチルコリン）放出の阻害剤として有効であると考えられる。
【００１２】
「神経毒」は、ニューロンを含む細胞の機能を妨害する能力を持つ分子を意味する。「神経毒」は天然物質であっても人工物質であってもよい。妨害を受ける機能は、エキソサイトーシスであることができる。
【００１３】
「改変神経毒」は、構造改変を含む神経毒を意味する。言い換えると、「改変神経毒」は、構造改変によって改変されている神経毒である。構造改変は、改変神経毒の生物学的半減期（すなわち神経毒の作用の持続時間）などの生物学的持続性および／または生物学的活性を、その改変神経毒を製造または誘導する元となった神経毒と比較して変化させる。改変神経毒は天然の神経毒とは異なる構造を持つ。
【００１４】
「突然変異」は、天然タンパク質または核酸配列の構造改変を意味する。例えば、核酸突然変異の場合、突然変異は、DNA配列中の1または複数のヌクレオチドの欠失、付加または置換であることができる。タンパク質配列突然変異の場合、突然変異は、タンパク質配列中の1または複数のアミノ酸の欠失、付加または置換であることができる。例えば、あるタンパク質配列を構成する特定の一アミノ酸を、別のアミノ酸、例えば、アミノ酸アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または他の任意の天然もしくは非天然アミノ酸または化学修飾アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸に置換することができる。タンパク質配列に対する突然変異は、転写されその結果生成したmRNAが翻訳された時に突然変異型タンパク質配列を生成するDNA配列に対する突然変異の結果であることができる。また、タンパク質配列に対する突然変異は、所望の突然変異を含むペプチド配列を所望のタンパク質配列に融合することによって作出することもできる。
【００１５】
「構造改変」は、神経毒に加えられる任意の変化であって、その神経毒を、構造改変を持たない同一の神経毒とは物理的または化学的に異なるものにする変化を意味する。
【００１６】
「生物学的持続性」または「持続性」は、細胞（例えばニューロン）機能に対して神経毒または改変神経毒が引き起こす妨害または影響の時間的継続、例えば、ニューロンなどの細胞からのエキソサイトーシス（神経伝達物質、例えばアセチルコリンのエキソサイトーシスなど）の阻害の時間的継続を意味する。
【００１７】
「生物学的半減期」または「半減期」は、神経毒または改変神経毒、好ましくは神経毒または改変神経毒の活性部分、例えばクロストリジウム毒素の軽鎖の濃度が、哺乳類細胞中、例えば哺乳類ニューロン中で、元の濃度の半分に減少する時間を意味する。
【００１８】
「生物学的活性」または「活性」は、細胞からの細胞エキソサイトーシス、例えばニューロンからの神経伝達物質のエキソサイトーシスの単位時間あたりの阻害量を意味する。
【００１９】
「標的細胞」は、神経毒または改変神経毒に対して結合親和性を持つ細胞（ニューロンを含む）を意味する。
【００２０】
（発明の開示）
新しい構造改変神経毒を発見した。本構造改変神経毒は大きな利益、例えば、無改変の神経毒と比較して増加または減少した生物学的持続性および／または生物学的半減期および／または増加または減少した生物学的活性などをもたらすことができる。
【００２１】
本発明によれば、神経毒と構造改変とを含む構造改変神経毒が提供される。前記構造改変は、前記構造改変を持たない同一の神経毒と比較して構造改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効である。また、前記構造改変神経毒は、天然の神経毒とは異なる構造を持つ。
【００２２】
本発明は、構造改変を持つ神経毒を含む改変神経毒であって、前記構造改変が前記構造改変を持たない同一の神経毒と比較して前記改変神経毒の生物学的活性を変化させるのに有効であり、かつ前記改変神経毒が天然の神経毒とは異なる構造を持つものも包含する。この構造改変は、標的細胞からのエキソサイトーシスを、前記構造改変を持たない同一の神経毒による標的細胞からのエキソサイトーシスの減少量よりも多く減少させるのに有効であることができる。もう一つの選択肢として、この構造改変は、標的細胞からのエキソサイトーシスを、前記構造改変を持たない同一の神経毒による細胞からのエキソサイトーシスの減少量よりも少なく減少させるのに有効であることもできる。重要なことに、エキソサイトーシスは神経伝達物質のエキソサイトーシスであることができ、改変神経毒は変化した生物学的持続性を示さずに、変化した生物学的活性を示すことができる。構造改変はロイシンベースモチーフを含むことができる。さらに、改変神経毒は、変化した生物物学的活性および変化した生物学的持続性を示すこともできる。本発明は、（a）改変神経毒が増加した生物学的活性および増加した生物学的持続性を示す場合、（b）改変神経毒が増加した生物学的活性および減少した生物学的持続性を示す場合、（c）改変神経毒が減少した生物学的活性および減少した生物学的持続性を示す場合、ならびに（d）改変神経毒が減少した生物学的活性および増加した生物学的持続性を示す場合も包含する。
【００２３】
重要なことに、単位量（すなわちモルベースでの単位量）の改変神経毒は、単位量の天然神経毒よりも効率よく、細胞からのエキソサイトーシスを減少させることができる。言い換えると、単位量の改変神経毒、例えば改変A型ボツリヌス毒素は、天然神経毒が示す神経伝達物質エキソサイトーシスの阻害と比較して、より大きな神経伝達物質エキソサイトーシスの阻害が起こる（すなわち細胞から放出される神経伝達物質が少なくなる）ような形で、その細胞内基質（SNAP）を切断することができる。
【００２４】
さらに、構造改変が改変神経毒の生物学的持続性を増加させるのに有効である構造改変神経毒も、本発明に包含される。構造改変神経毒の増加した生物学的持続性は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の増加した半減期および／または生物学的活性に起因することができる。
【００２５】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して生物学的持続性が減少している構造改変神経毒も提供される。この生物学的持続性の減少は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の減少した生物学的半減期および／または活性に起因することができる。
【００２６】
さらに本発明によれば、構造改変がいくつかのアミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。例えば、構造改変を構成するアミノ酸の数は、1以上、1〜約22、2〜約10、および約4〜約7であることができる。
【００２７】
一態様として、構造改変神経毒の構造改変は1アミノ酸を含むことができる。このアミノ酸は、いくつかの炭素を含有するR基を含むことができる。例えば、このアミノ酸において、炭素原子数は1以上、1〜約20、1〜約12、1〜約9、2〜約6、および約4であることができる。本願におけるR基とはアミノ酸側鎖を指す。例えば、アラニンのR基はCH3であり、例えばセリンのR基はCH2OHである。
【００２８】
もう一つの態様として、改変が1アミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。このアミノ酸は、実質的にヒドロカルビルであるR基を含むことができる。
【００２９】
さらにもう一つの態様として、構造改変が1アミノ酸を含む構造改変神経毒も提供される。このアミノ酸はさらに、少なくとも1つのヘテロ原子を含有するR基を含むことができる。
【００３０】
さらに本発明によれば、構造改変が例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体などを含む構造改変神経毒も提供される。構造改変神経毒を構成することができるアミノ酸誘導体の例は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、およびリン酸化アミノ酸である。リン酸化アミノ酸は、例えばカゼインキナーゼII、プロテインキナーゼC、およびチロシンキナーゼなどによってリン酸化することができる。
【００３１】
さらに本発明によれば、構造改変を含むことができる構造改変神経毒も提供される。神経毒は、3つのアミノ酸配列領域を含むことができる。第1の領域は細胞結合部分として有効であることができる。この結合部分は、ニューロンなどの標的細胞への結合部分であることができる。結合部分はボツリヌス毒素重鎖のカルボキシル末端であることができる。ボツリヌス毒素重鎖のカルボキシル末端が、例えばある種の神経細胞を含むある種の細胞上に見いだされるレセプターを結合するのに有効でありうることは、よく知られている。一態様として、カルボキシル末端は、神経細胞のシナプス前膜上に見いだされるレセプターに結合する。第2の領域は、エンドソーム膜を横切って構造改変神経毒または構造改変神経毒の一部を移行させるのに有効であることができる。第3の領域は、標的細胞からのエンドサイトーシスを阻害するのに有効であることができる。エキソサイトーシスの阻害は、シナプス前膜からのアセチルコリンなどの神経伝達物質放出の阻害であることができる。例えばボツリヌス毒素軽鎖が、種々のニューロンおよび非ニューロン細胞からのアセチルコリン（および他の神経伝達物質）などの放出を阻害するのに有効であることは、よく知られている。
【００３２】
第1、第2または第3領域の少なくとも1つは、実質的にクロストリジウム神経毒に由来することができる。第3領域は構造改変を含むことができる。さらに改変神経毒は、天然の神経毒とは異なる構造を持つことができる。また、構造改変は、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効であることができる。
【００３３】
一態様として、神経毒がボツリヌス血清型A、B、C1、C2、D、E、F、G、破傷風毒素および／またはその混合物であることができる構造改変神経毒が提供される。
【００３４】
もう一つの態様として、第3領域をボツリヌス毒素血清型Aから誘導することができる構造改変神経毒も提供される。さらに、第3領域をボツリヌス血清型Aから誘導することができない構造改変神経毒も提供される。
【００３５】
さらにもう一つの態様として、構造改変が構造改変神経毒の生物学的持続性を増加させるのに有効な生物学的持続性増加成分を含む構造改変神経毒も提供される。生物学的持続性の増加は、少なくとも部分的には、構造改変神経毒の生物学的半減期および／または活性の増加に起因することができる。
【００３６】
さらに本発明によれば、生物学的持続性増加成分を含む構造改変神経毒であって、生物学的持続性増加成分がロイシンベースモチーフを含むことができる構造改変神経毒も提供される。ロイシンベースモチーフは連続する7アミノ酸を含むことができ、この場合、ロイシンベースモチーフは5つ一組のアミノ酸と2つ一組のアミノ酸とで構成されることができる。5つ一組のアミノ酸は、ロイシンベースモチーフのアミノ末端を規定することができる。2つ一組のアミノ酸はロイシンベースモチーフのカルボキシル末端を規定することができる。5つ一組のアミノ酸が1または複数の酸性アミノ酸を含むことができる構造改変神経毒が提供される。例えば、酸性アミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸であることができる。5つ一組のアミノ酸は、ヒドロキシル含有アミノ酸を含むことができる。ヒドロキシル含有アミノ酸は、例えばセリン、スレオニンまたはチロシンであることができる。このヒドロキシル含有アミノ酸はリン酸化することができる。2つ一組のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであることができる。また、ロイシンベースモチーフ中の2つ一組のアミノ酸は、ロイシン-ロイシン、ロイシン-イソロイシン、イソロイシン-ロイシンまたはイソロイシン-イソロイシン、ロイシン-メチオニンであることができる。ロイシンベースモチーフは、フェニルアラニン-グルタミン酸-フェニルアラニン-チロシン-リジン-ロイシン-ロイシンというアミノ酸配列であることができる。
【００３７】
一態様として、改変がチロシンベースモチーフであることができる構造改変神経毒が提供される。チロシンベースモチーフは4つのアミノ酸を含むことができる。チロシンベースモチーフのN末端のアミノ酸はチロシンであることができる。チロシンベースモチーフのC末端のアミノ酸は疎水性アミノ酸であることができる。
【００３８】
さらに本発明によれば、第3領域は、ボツリヌス毒素血清型Aまたは他のボツリヌス毒素血清型の一つに由来することができる。
【００３９】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して構造改変神経毒の生物学的持続性を減少させることができる構造改変神経毒も提供される。減少した生物学的持続性は、部分的には、神経毒の減少した生物学的半減期および／または減少した生物学的活性に起因することができる。
【００４０】
一態様として、ロイシンベースモチーフを構成する1または複数のアミノ酸に突然変異を持つロイシンベースモチーフが、構造改変に含まれうる、構造改変神経毒が提供される。突然変異はロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換であることができる。
【００４１】
もう一つの態様として、チロシンベースモチーフを構成する1または複数のアミノ酸に突然変異を持つチロシンベースモチーフが構造改変に含まれる構造改変神経毒も提供される。例えば、突然変異は、チロシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換であることができる。
【００４２】
さらにもう一つの態様として、構造改変がアミノ酸誘導体を含み、そのアミノ酸誘導体の突然変異またはそのアミノ酸の誘導体化をコードするヌクレオチドもしくはアミノ酸配列への突然変異を伴う構造改変神経毒が提供される。例えば、誘導体化アミノ酸または誘導体化アミノ酸の誘導体化を担うヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の欠失または置換。アミノ酸誘導体は、例えばミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、またはホスホリル化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばカゼインキナーゼII、プロテインキナーゼCまたはチロシンキナーゼなどによって製造することができる。
【００４３】
本発明の一態様として、構造改変神経毒の第1、第2および／または第3領域を組換えDNA法によって製造すること、すなわち組換え的に製造することができる構造改変神経毒が提供される。
【００４４】
本発明のもう一つの態様として、神経毒の第1、第2および／または第3領域が天然のクロストリジウム神経毒から単離される構造改変神経毒も提供される。
【００４５】
本発明のもう一つの態様は、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を持つボツリヌス毒素（A型ボツリヌス毒素など）を含む改変神経毒を提供する。構造改変は、神経毒の軽鎖からのアミノ酸416〜437の欠失を含むことができる（図3）。
【００４６】
本発明のさらにもう一つの態様として、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含む改変神経毒（A型ボツリヌス毒素など）が提供される。構造改変は、神経毒の軽鎖からのアミノ酸1〜8の欠失を含むことができる（図3）。
【００４７】
さらに本発明によれば、構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含むA型ボツリヌス毒素などの改変神経毒が提供される。構造改変は、神経毒の軽鎖のアミノ酸1〜8および416〜437の欠失を含むことができる（図3）。
【００４８】
さらに本発明によれば、当該構造改変を持たない同一の神経毒と比較して改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに有効な構造改変を含む改変ボツリヌス毒素、例えば改変A型ボツリヌス毒素が提供される。構造改変は、前記神経毒の軽鎖における427位のロイシンのアラニンへの置換、および428位のロイシンのアラニンへの置換を含むことができる（図3）。
【００４９】
さらに、神経毒の生物学的持続性を増加させかつ／または生物学的活性を増加させる方法も、本発明の範囲に含まれる。これらの方法では、神経毒に構造改変を融合または付加することができ、例えば構造改変は、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分であることができる。神経毒に融合または付加することができる構造改変の例は、ロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフ、およびアミノ酸誘導体である。アミノ酸誘導体の例は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸である。アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIまたはチロシンキナーゼなどによってリン酸化することができる。
【００５０】
また、本発明によれば、神経毒の生物学的持続性を減少させかつ／または生物学的活性を減少させる方法も提供される。これらの方法は、神経毒のアミノ酸を突然変異させるステップを含むことができる。例えば、神経毒内のロイシンベースモチーフのアミノ酸を突然変異させることができる。さらに例えば、神経毒のチロシンベースモチーフ内の1または複数のアミノ酸を突然変異させることもできる。さらに例えば、アミノ酸誘導体またはアミノ酸の誘導体化を担うDNAもしくはアミノ酸配列を突然変異させることもできる。誘導体化アミノ酸は、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸、またはリン酸化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIおよびチロシンキナーゼなどによって製造することができる。これらの突然変異は、例えば、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換であることができる。
【００５１】
本発明は、ある状態を処置する方法も包含する。これらの方法は、ある状態を処置するために有効量の構造改変神経毒を哺乳動物に投与するステップを含むことができる。構造改変神経毒は構造改変を含むことができる。この構造改変は、生物学的持続性および／または生物学的活性を変化させるのに有効である。これらの状態処置方法では、ロイシンベースモチーフを含まない神経毒を利用することができる。また、これらの状態処置方法では、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を含む神経毒を利用することもできる。生物学的持続性または活性増加成分は、例えば、チロシンベースモチーフ、ロイシンベースモチーフ、またはアミノ酸誘導体を含むことができる。アミノ酸誘導体は、例えば、ミリスチル化アミノ酸、N-グリコシル化アミノ酸またはリン酸化アミノ酸であることができる。リン酸化アミノ酸は、例えばプロテインキナーゼC、カゼインキナーゼIIまたはチロシンキナーゼなどによって製造することができる。処置される状態は神経筋障害、自律神経障害または痛みであることができる。神経筋障害の処置は、筋または筋群に有効量の改変神経毒を局所投与するステップを含むことができる。自律神経障害を処置する方法は、1または複数の腺に有効量の改変神経毒を局所投与するステップを含むことができる。痛みを処置する方法は、疼痛部位に有効量の改変神経毒を投与するステップを含むことができる。さらに、痛みの処置は、有効量の改変神経毒を脊髄に投与するステップを含むこともできる。
【００５２】
さらに本発明によれば、改変神経毒を使って、痙攣性発声障害、喉頭ジストニア、口下顎ジストニア、舌ジストニア、頸部ジストニア、書痙（focal hand dystonia）、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス（anismus）、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラジア、嚥下障害、流涙、多汗、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、筋痙攣による痛み、頭痛、眉間のシワおよび肌のシワを含む状態を処置する方法が提供される。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、神経毒の構造を改変することによって神経毒の生物学的持続性および／または生物学的活性を変化させることができるという発見に基づいている。言い換えると、変化した生物学的持続性および／または生物学的活性を持つ改変神経毒は、構造改変を持つまたは包含する神経毒から作ることができる。一態様として、構造改変には、神経毒の一次構造に生物学的持続性増加成分を融合してその生物学的持続性を増加させることが含まれる。好ましい一態様として、生物学的持続性増加成分はロイシンベースモチーフである。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期および／または生物学的活性を約100％増加させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を持たない同一の神経毒より約20％〜300％高い生物学的持続性を持つ。すなわち、例えば、生物学的持続性増加成分を含む改変神経毒は、神経終末からの例えばアセチルコリンなどの神経伝達物質の放出を、改変されていない神経毒よりも約20％〜約300％長く、実質的に阻害することができる。
【００５４】
天然神経毒または無改変神経毒の生物学的活性と比較して変化した生物学的活性を持つ改変神経毒も、本発明の範囲に包含される。例えば、改変神経毒は、改変神経毒の生物学的持続性に何らかの変化を伴って、またはそのような変化を伴わずに、減少したまたは増加した標的細胞からのエキソサイトーシス（神経伝達物質のエキソサイトーシスなど）の阻害を示すことができる。
【００５５】
本発明の基本的一態様として、ロイシンベースモチーフは連続する7アミノ酸である。この連続アミノ酸は2つのグループにまとめられる。ロイシンベースモチーフのアミノ末端から出発して最初の5アミノ酸は「5つ一組のアミノ酸」を形成する。5つ一組のアミノ酸のすぐ後ろに続く2つのアミノ酸は「2つ一組のアミノ酸」を形成する。好ましい一態様として、2つ一組のアミノ酸はロイシンベースモチーフのカルボキシル末端領域に位置する。もう一つの好ましい態様では、5つ一組のアミノ酸が、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも1つの酸性アミノ酸を含む。
【００５６】
2つ一組のアミノ酸は少なくとも1つの疎水性アミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンを含む。好ましくは、2つ一組のアミノ酸はロイシン-ロイシン、ロイシン-イソロイシン、イソロイシン-ロイシンまたはイソロイシン-イソロイシン、ロイシン-メチオニンである。さらに好ましくは、2つ一組のアミノ酸はロイシン-ロイシンである。
【００５７】
一態様として、ロイシンベースモチーフはxDxxxLLである（xは任意のアミノ酸であることができる）。もう一つの態様として、ロイシンベースモチーフはxExxxLLである（Eはグルタミン酸である）。もう一つの態様として、2つ一組のアミノ酸がイソロイシンまたはメチオニンを含んで、それぞれxDxxLIまたはxDxxxLMを形成することもできる。さらに、アスパラギン酸Dをグルタミン酸Eで置き換えて、xExxxLI、xExxxILおよびxExxxLMを形成させることもできる。好ましい一態様として、ロイシンベースモチーフは、フェニルアラニン-グルタミン酸-フェニルアラニン-チロシン-リジン-ロイシン-ロイシン（配列番号1）である。
【００５８】
もう一つの態様として、5つ一組のアミノ酸は、少なくとも1つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えばセリン、スレオニンまたはチロシンを含む。好ましくは、ヒドロキシル含有アミノ酸はリン酸化することができる。より好ましくは、ヒドロキシル含有アミノ酸は、そのリン酸化によってアダプタータンパク質の結合を可能にすることができるセリンである。
【００５９】
例として無修飾アミノ酸を挙げたが、修飾アミノ酸も本発明の範囲に含まれると考えられる。例えばロイシンベースモチーフはハロゲン化ロイシン、好ましくはフッ化ロイシンを含むことができる。
【００６０】
様々なロイシンベースモチーフが様々な種に見いだされる。本発明に従って使用することができる様々な種に由来するロイシンベースモチーフの候補を表1に列挙する。このリストは限定を意図するものではない。
【表１】
VMATは小胞モノアミントランスポーターであり、VAChtは小胞アセチルコリントランスポーターであり、サッカロミセス・セレビシェVam3pはシナプトブレビンの酵母ホモログである。イタリック体で示したセリン残基は潜在的リン酸化部位である。
【００６２】
改変神経毒は任意の神経毒から作ることができる。また、改変神経毒は神経毒の断片から、例えば軽鎖および／または重鎖の一部が除去されたボツリヌス毒素から作ることもできる。好ましくは、使用される神経毒はクロストリジウム神経毒である。クロストリジウム神経毒は、3つのアミノ酸配列領域を持つポリペプチドを含む。第1のアミノ酸配列領域は、ベラッチ（beratti）毒素、ブチリカム（butyricum）毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に実質上完全に由来する標的細胞（すなわちニューロン）結合部分を含むことができる。好ましくは、第1アミノ酸配列領域は、毒素重鎖のカルボキシ末端領域Hcに由来する。また、第1アミノ酸配列領域はターゲティング部分を含むこともでき、このターゲティング部分は、標的細胞上のレセプター、例えば細胞表面タンパク質または他の生物学的成分に結合することができる分子（アミノ酸配列など）を含むことができる。
【００６３】
第2のアミノ酸配列領域は、エンドソーム膜を横切ってニューロンの細胞質内にポリペプチドまたはその一部を移行させるのに有効である。一態様として、本ポリペプチドの第2アミノ酸配列領域は、ベラッチ毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に由来する重鎖のアミノ末端HNを含む。
【００６４】
第3のアミノ酸配列領域は、ニューロンなどの標的細胞の細胞質中に放出された場合に、治療活性を持つ。一態様として、本ポリペプチドの第3アミノ酸配列領域は、ベラッチ毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される神経毒に由来する毒素軽鎖Lを含む。
【００６５】
クロストリジウム神経毒はハイブリッド神経毒であることができる。例えば、神経毒の各アミノ酸配列領域は、それぞれ異なるクロストリジウム神経毒血清型に由来することができる。例えば一態様として、本ポリペプチドは、破傷風毒素のHcに由来する第1アミノ酸配列領域、B型ボツリヌス毒素に由来する第2アミノ酸配列領域、およびボツリヌス毒素血清型Eの軽鎖に由来する第3アミノ酸配列領域を含む。他の考え得る組合わせは全て本発明の範囲に包含される。
【００６６】
もう一つの選択肢として、クロストリジウム毒素の3つのアミノ酸配列領域は全て同じ種および同じ血清型に由来することもできる。神経毒の3つのアミノ酸配列領域が全て同じクロストリジウム神経毒種および血清型に由来する場合は、その神経毒を種名および血清型名で呼ぶことにする。例えば、神経毒素ポリペプチドは、E型ボツリヌス毒素に由来する第1、第2および第3アミノ酸配列領域を持つことができる。この場合は、その神経毒をE型ボツリヌス毒素と呼ぶ。
【００６７】
加えて、3つのアミノ酸配列領域のそれぞれは、それらが由来する天然配列から改変することができる。例えば、アミノ酸配列領域は、天然の配列と比較して付加または欠失された少なくとも1つまたは複数のアミノ酸を持つことができる。
【００６８】
生物学的持続性増加成分または生物学的活性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを、上述した神経毒のいずれかに融合して、増加した生物学的持続性および／または増加した生物学的活性を持つ改変神経毒を形成させることができる。本発明で使用する「融合」という用語は、神経毒の一次構造への共有結合による付加、または神経毒の一次構造内への共有結合による挿入を包含する。例えば、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を、その一次構造中にロイシンベースモチーフを持たないクロストリジウム神経毒に付加することができる。一態様として、ロイシンベースモチーフを、第3アミノ酸配列がボツリヌス毒素血清型A、B、C1、C2、D、E、FまたはGに由来するハイブリッド神経毒と融合する。もう一つの態様として、ロイシンベースモチーフをE型ボツリヌス毒素と融合する。
【００６９】
もう一つの態様では、神経毒をコードするクローン化DNA配列を変化させることによって、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を神経毒に付加する。例えば、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を付加しようとする神経毒をコードするクローン化DNA配列に、生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分をコードするDNA配列を付加する。これは、通常の技術を持つ分子生物学者にはよく知られている多くの方法で行なうことができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法またはPCRクローニング法を使って、神経毒をコードするDNA配列に所望の変化を生じさせることができる。次に、そのDNA配列を天然の宿主株に再導入することができる。ボツリヌス毒素の場合、天然の宿主株はボツリヌス菌（Clostridium botulinum）株である。好ましくは、この宿主株は天然のボツリヌス毒素遺伝子を持たないだろう。これに代わる方法として、変化させたDNAを異種宿主系、例えば大腸菌（E.coli）または他の原核生物、酵母、昆虫細胞株または哺乳類細胞株に導入することもできる。変化させたDNAをその宿主に導入し終えたら、付加された生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を持つ組換え毒素を、例えば標準的な発酵法などによって製造することができる。
【００７０】
同様に、生物学的持続性増加成分を神経毒から取り除くこともできる。例えば、部位特異的突然変異導入法を使って、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを除去することができる。
【００７１】
これらの遺伝子操作および他の遺伝子操作を達成するために使用することができる標準的な分子生物学的技術は、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するSambrookら（1989）に記載されている。
【００７２】
一態様として、ロイシンベースモチーフを、神経毒の第3アミノ酸配列領域と融合するか、または同領域に付加する。好ましい態様として、ロイシンベースモチーフを第3アミノ酸配列領域のカルボキシル末端近くの領域と融合するか、または同領域に付加する。より好ましくは、ロイシンベースモチーフを神経毒の第3領域のカルボキシル末端と融合するか、または同末端に付加する。さらに好ましくは、ロイシンベースモチーフをE型ボツリヌス毒素の第3領域のカルボキシル末端と融合するか、または同末端に付加する。ロイシンベースモチーフを融合または付加する第3アミノ酸配列はハイブリッドまたはキメラ改変神経毒の成分であることができる。例えば、ロイシンベースモチーフは、ある型のボツリヌス毒素（すなわちA型ボツリヌス毒素）の第3アミノ酸配列領域（またはその一部）と融合するか、または同領域（またはその一部）に付加することができ、そのロイシンベースモチーフ-第3アミノ酸配列領域自体は、1または複数の異なる型のボツリヌス毒素（例えばB型および／またはE型ボツリヌス毒素）に由来する第1および第2アミノ酸配列領域に融合されているか、または同領域に接合されている。
【００７３】
もう一つの態様として、既存の生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分、例えばロイシンベースモチーフを持つ神経毒の構造改変には、ロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸の欠失または置換が含まれる。また、改変神経毒は、ロイシンベースモチーフ中の1または複数のアミノ酸が欠失または置換されている神経毒をもたらす構造改変を含む。既存のロイシンベースモチーフ中の1または複数のアミノ酸を除去または置換することは、改変神経毒の生物学的持続性および／または生物学的活性を減少させるのに有効である。例えば、A型ボツリヌス毒素のロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を欠失させるか置換すると、改変神経毒の生物学的半減期および／または生物学的活性が減少する。
【００７４】
生物学的持続性増加成分に含まれるアミノ酸の代わりに使用することができるアミノ酸には、アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン酸、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンおよび他の天然アミノ酸ならびに非標準アミノ酸が含まれる。
【００７５】
本発明では、天然のA型ボツリヌス毒素軽鎖が、分化したPC12細胞膜に特徴的なパターンで局在化することが明らかになった。生物学的持続性増加成分はこの局在化の実質的一因であることを明らかにする。
【００７６】
本発明のデータは、A型ボツリヌス毒素軽鎖を切断して短縮するか、ロイシンベースモチーフを突然変異させると、軽鎖は特有のパターンで膜に局在化する能力を実質的に失うことを証明している。細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性および／または生物学的活性を決定する上で重要な因子である考えられる。なぜなら、細胞膜への局在は局在化したタンパク質を細胞間タンパク質分解から保護することができるからである。
【００７７】
図1および図2は、A型ボツリヌス毒素の軽鎖からロイシンベースモチーフを欠失させると、A型軽鎖の膜局在に変化が起こりうることを示している。図1は分化したPC12細胞におけるGFP-軽鎖A融合タンパク質の局在を表す。例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するGalliら（1998）Mol Biol Cell 9：1437-1448や、やはり参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するMartinez-Arcaら（2000）J Cell Biol 149：889-899に記載されているような当業者に周知の方法を使って、分化したPC12細胞中でGFP融合タンパク質を産生させ、視覚化した。GFP-切断短縮型軽鎖Aの局在を図2に示す。図1と図2を比較すると、N末端およびロイシンベースモチーフを含むC末端の欠失により、局在化のパターンが完全に変化することがわかる。図3はA型ボツリヌス毒素軽鎖のアミノ酸配列を表す。下線付きのアミノ酸配列は、切断短縮型突然変異体で欠失させたアミノ酸を示す。ロイシンベースモチーフをアスタリスク付きの角括弧で示す。
【００７８】
本発明では、ロイシンベースモチーフ内の特定アミノ酸置換の効果を解析するために、さらなる研究を行なった。例えば、ある研究では、ロイシンベースモチーフに含まれる両ロイシン残基をアラニン残基に置換した。図4に、このジ-ロイシン→ジ-アラニン置換GFP-A型ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNAをトランスフェクトした分化PC12細胞の蛍光像を示す。図からわかるように、A型ボツリヌス毒素軽鎖中の427位および428位のロイシンをアラニンで置換すると、軽鎖に特有な局在が大きく変化する。
【００７９】
軽鎖上に存在するロイシンベースモチーフまたは他の任意の持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を、重鎖を保護するためにも利用することができることは、本発明の範囲に含まれる。ランダムコイルのベルトがA型ボツリヌス毒素トランスロケーションドメインから伸長して軽鎖を取り巻いている。このベルトは、軽鎖が細胞膜に局在化した状態で、2つのサブユニットを細胞内で互いに近接した状態に保っているのかもしれない。天然A型ボツリヌス毒素の構造を図6に示す。
【００８０】
さらに、本発明のデータは、ロイシンベースモチーフが、ボツリヌスA毒素を細胞内でSNAP-25基質のごく近傍に局在化させるのに役立ちうることも示している。これは、ロイシンベースモチーフが毒素の半減期の決定だけでなく、毒素の活性の決定にも重要であることを意味しうる。すなわち、毒素が細胞内でSNAP-25基質のごく近傍に保たれるのであれば、毒素はより強い活性を持つだろう。図5は、分化したPC12細胞の水平共焦点断面におけるSNAP-25の局在を示す（Martinez-Arcaら（2000）J Cell Biol 149：889-899）。図1に示すA型ボツリヌス毒素軽鎖の局在を図5に示すSANP-25の局在と比較すると、局在化パターンの類似性を認めることができる。
【００８１】
本発明のデータは、軽鎖の切断短縮によるロイシンベースモチーフの欠失、またはロイシンベースモチーフ内でのアミノ酸置換が、神経細胞におけるA型ボツリヌス毒素軽鎖の膜局在を大きく変化させることを明示している。切断短縮でも置換でも、ある割合の改変軽鎖は、天然A型軽鎖とは異なるパターンで細胞膜に局在することができる（図1、2および4参照）。このデータは、ロイシンベースモチーフ以外の生物学的持続性増加成分、例えばチロシンモチーフおよびアミノ酸誘導体などの存在を裏付けている。これら他の生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分を改変神経毒に使用することも、本発明の範囲に包含される。
【００８２】
さらに、1つの改変神経毒に2以上の生物学的持続性増加成分を組み合わせて使用して、改変された神経毒の生物学的持続性を変化させることも、本発明の範囲に包含される。本発明は、1つの改変神経毒に2以上の生物学的活性増加成分または生物学的活性減少成分を組み合わせて使用して、改変された神経毒の生物学的活性を変化させることも包含する。
【００８３】
チロシンベースモチーフは、生物学的持続性および／または生物学的活性変更成分として、本発明の範囲に包含される。チロシンベースモチーフはY-X-X-Hy（Yはチロシン、Xは任意のアミノ酸、Hyは疎水性アミノ酸である）という配列を含む。チロシンベースモチーフはロイシンベースモチーフと類似する様式で作用することができる。図3に、A型毒素軽鎖に見いだされるチロシンモチーフの一部を角括弧で示す。さらに、チロシンベースモチーフは、図3にアスタリスク付きの角括弧で示すロイシンベースモチーフ内にも見いだされる。
【００８４】
A型ボツリヌス毒素中にもB型ボツリヌス毒素中にも天然に存在する1または複数の生物学的持続性変更成分および／または生物学的活性増加成分を含む改変神経毒も、本発明の範囲に包含される。
【００８５】
図7は、分化したPC12生細胞におけGFP-B型ボツリヌス神経毒軽鎖の局在を表す。B型軽鎖の局在は細胞内小器官への局在であるらしい。同様の局在パターンが図2に示すGFP-切断短縮型ボツリヌスA毒素に認められる。細胞内でのボツリヌス毒素またはボツリヌス毒素軽鎖の局在は、毒素の生物学的持続性および／または生物学的活性を決定する上で重要な因子であると考えられる。したがってこれらのデータは、A型ボツリヌス毒素とB型ボツリヌス毒素に共通する1または複数の生物学的持続性変更成分および／または生物学的活性変更成分が存在することを示しているようである。これらおよびその他の生物学的持続性変更成分および生物学的活性変更成分は、本発明に従って使用することが考えられる。
【００８６】
図8に、それぞれA型HallA株およびB型DanishI株から単離されたA型軽鎖（配列番号19）およびB型軽鎖（配列番号20）の配列整列を示す。A型およびB型ボツリヌス毒素の他の株から単離された軽鎖および重鎖も配列比較に使用することができる。陰付きのアミノ酸は鎖間でのアミノ酸一致またはアミノ酸合致を表す。図8のコンセンサス配列のアミノ酸位置10とアミノ酸位置425の間にある陰付きアミノ酸は、それぞれ単独で、または他の任意の1または複数の陰付きアミノ酸との組み合わせで、本発明の範囲に包含される生物学的持続性変更成分を表す。例えば、19〜22位のアミノ酸KAFK、304〜306位のLNK、228位のLと95位および96位のKLとの組合わせ、346〜351位のFDKLYK、78〜81位のYL-T、73〜75位のYYDと78位および79位のYLと81位のTとの組合わせ、297位のFと300位のIと95位および96位のKLとの組合わせは、本発明の範囲内で使用される生物学的持続性変更成分であることができる。さらに、電荷、疎水性、親水性が保存された領域および／または保存された配列とは無関係に存在しうる保存された二次、三次または四次構造も、本発明の範囲に包含される。
【００８７】
アミノ酸誘導体も生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分として本発明の範囲に包含される。生物学的持続性および／または生物学的活性をもたらすように作用するアミノ酸誘導体の例は、リン酸化アミノ酸である。これらのアミノ酸には、例えばチロシンキナーゼ、プロテインキナーゼCまたはカゼインキナーゼIIによってリン酸化されたアミノ酸などが含まれる。生物学的持続性増加成分および／または生物学的活性増加成分として本発明の範囲に包含される他のアミノ酸誘導体は、ミリスチル化アミノ酸およびN-グリコシル化アミノ酸である。
【００８８】
本発明の基本的一側面として、改変神経毒を使ってある状態を処置する方法が提供される。状態としては、例えば骨格筋異常、平滑筋異常、痛みおよび腺異常などを挙げることができる。改変神経毒は、例えば眉間のシワを処置するために、化粧品にも使用することができる。
【００８９】
改変神経毒で処置することができる神経筋障害および神経筋異常としては、例えば痙攣性発声障害、喉頭ジストニア、口下顎ジストニアおよび舌ジストニア、頸部ジストニア、書痙、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、痙性斜頚、脳性麻痺、局所性痙縮および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラジア、嚥下障害などが挙げられ、筋肉群の不随意運動を特徴とする他の筋緊張障害も、本投与法によって処置することができる。本方法および本組成物を使って処置することができる状態の他の例は、流涙、多汗、唾液分泌過多および胃腸分泌過多ならびに他の分泌障害である。さらに、皮膚状態の処置、例えば眉間のシワの減少、肌のシワの減少などにも、本発明を利用することができる。本発明は、スポーツ傷害の処置にも利用することができる。
【００９０】
Borodicの米国特許第5,053,005号には、A型ボツリヌス毒素を使って若年性脊柱彎曲、すなわち脊柱側弯症を処置する方法が開示されている。Borodicの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、Borodicが開示した方法と実質的に同様の方法を使って、脊柱彎曲を処置するために、改変神経毒を哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。好ましい態様として、ロイシンベースモチーフと融合したE型ボツリヌス毒素を含む改変神経毒を投与する。より好ましくは、脊柱彎曲を処置するために、軽鎖のカルボキシル末端に融合されたロイシンベースモチーフを持つA-E型ボツリヌス毒素を含む改変神経毒を、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。
【００９１】
さらに、A型ボツリヌス毒素を使って広く行なわれている周知の技術を用いて他の神経筋障害を処置するために、改変神経毒を投与することもできる。例えば、本発明は、頭痛、筋痙攣による痛みおよび様々な形態の炎症痛などの痛みの処置に利用することができる。例えばAokiの米国特許第5,721,215号およびAokiの米国特許第6,113,915号には、痛みの処置にA型ボツリヌス毒素を使用する方法が開示されている。これらの2つの特許の開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。
【００９２】
自律神経系障害も改変神経毒を使って処置することができる。例えば腺機能不全は自律神経系障害である。腺機能不全には発汗過多および唾液分泌過多が含まれる。呼吸機能不全は自律神経系障害のもう一つの例である。呼吸機能不全には慢性閉塞性肺疾患および喘息が含まれる。Sandersらは自律神経系を処置する方法、例えば発汗過多、唾液分泌過多、喘息などの自律神経系障害を天然のボツリヌス毒素を使って処置する方法を開示している。Sanderらの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、改変神経毒を使用する点以外はSandersらの方法と実質的に同様の方法を使って、上述したような自律神経系障害を処置することができる。例えば、鼻腔における粘液分泌を制御する自律神経系のコリン作動性ニューロンを変性させるのに十分な量の改変神経毒を哺乳動物の鼻腔に局所適用することができる。
【００９３】
改変神経毒によって処置することができる痛みには、筋緊張または筋痙攣に起因する痛み、または筋痙攣とは関係のない痛みが含まれる。例えばBinderは、血管障害、筋緊張、神経痛およびニューロパシーに起因する頭痛を、天然のボツリヌス毒素、例えばA型ボツリヌス毒素で処置することができることを、米国特許第5,714,468号に開示している。Binderの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、改変神経毒を使用する点以外はBinderの方法と実質的に同様の方法を使って、頭痛、特に血管障害、筋緊張、神経痛およびニューロパシーに起因する頭痛を処置することができる。筋痙攣に起因する痛みも、改変神経毒の投与によって処置することができる。例えば、ロイシンベースモチーフに好ましくはE型ボツリヌス毒素軽鎖のカルボキシル末端で融合されているE型ボツリヌス毒素は、痛みを軽減するために、疼痛／痙攣部位に筋肉内投与することができる。
【００９４】
さらに、痙攣などの筋肉障害に関係しない痛みを処置するために、改変神経毒を哺乳動物に投与することもできる。基本的一態様として、非痙攣関連痛を処置するための本発明の方法は、改変神経毒の中枢投与または末梢投与を含む。
【００９５】
例えばFosterらは、痛みを軽減するために、ターゲティング部分と接合されたボツリヌス毒素を中枢（くも膜下腔内）投与することができることを、米国特許5,989,545号に開示している。Fosterらの開示は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。一態様として、本発明の改変神経毒を使用する点以外はFosterらの方法と実質的に同様の方法を使って、痛みを処置することができる。処置される痛みは急性痛または好ましくは慢性痛であることができる。
【００９６】
筋痙攣に関係しない急性または慢性痛は、哺乳動物上の実際の疼痛部位または痛みを感じている部位への改変神経毒の局所末梢投与によって軽減することもできる。一態様として、疼痛部位または疼痛部位の近傍、例えば切傷またはその近傍に、改変神経毒を皮下投与する。もう一つの態様として、疼痛部位またはその近傍、例えば哺乳動物上の挫傷部位またはその近傍に、改変神経毒を筋肉内投与する。もう一つの態様として、関節炎状態に起因する痛みを処置または軽減するために、哺乳動物の関節中に、改変神経毒を直接注射する。また、末梢疼痛部位への改変神経毒の頻繁な反復注射または注入も、本発明の範囲に包含される。しかし、長時間持続する本発明の治療効果を考えると、神経毒の頻繁な注射または注入は必要ないはずである。例えば本発明の実施により、1回の注射につき、ヒトで2ヶ月以上、例えば27ヶ月にわたる鎮痛効果を得ることができる。
【００９７】
本発明を何らかの作用機序または作用理論に限定することは望まないが、改変神経毒を末梢部位に局所投与すると、改変神経毒は、SNARE依存的エキソサイトーシスを阻害することにより、末梢一次感覚終末からの神経物質、例えばサブスタンスPなどの放出を阻害すると考えられる。末梢一次感覚終末によるサブスタンスPの放出は疼痛伝達プロセスを誘発するか、または少なくとも増幅することができるので、末梢一次感覚終末におけるその放出を阻害すると、疼痛シグナルの伝達が抑制されて脳に到達しなくなるだろう。
【００９８】
本発明の改変神経毒は、末梢部位で薬理作用を持つだけでなく、米国特許第6,113,915号に記載されているように直接髄腔内投与するか、または末梢投与でも改変毒素がおそらく一次感覚求心神経を通る逆行輸送によって作用する場合には、中枢神経系でも阻害効果を持つことができる。この逆行性軸索輸送仮説は、A型ボツリヌス毒素を末梢に注射した時にこの神経毒が後角に逆行輸送されうることを示す公表されたデータによって裏付けられる。例えば、Weigandら，Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1976：292，161-165およびHabermann，Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1974：281，47-56の研究は、ボツリヌス毒素が逆行輸送によって脊髄領域に上行できることを示した。したがって、末梢部位に注射（例えば筋肉内注射）された改変神経毒、例えばロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を突然変異させたA型ボツリヌス毒素は、末梢一次感覚終末から中枢領域に逆行輸送されると予想することができる。
【００９９】
改変神経毒の投与量は、処置される障害、その重症度、および他の様々な患者変数、例えばサイズ、体重、年齢、および治療法に対する応答性などによって大きく変動しうる。一般に、投与すべき改変神経毒の用量は、処置される哺乳動物、好ましくはヒトの年齢、主症状および体重によって変動するだろう。改変神経毒の効力も考慮されるだろう。
【０１００】
効力（A型ボツリヌス毒素の場合）がヒト患者でLD50＝2,730Uに実質的に等しく、平均的な人が75kgであると仮定すると、改変神経毒の致死量（A型ボツリヌス毒素の場合）は約36U／kgになるだろう。したがって、そのようなLD50を持つ改変神経毒を投与する場合は、36U／kg未満の改変神経毒をヒト対象に投与することが適切だろう。好ましくは約0.01U／kg〜30U／kgの改変神経毒を投与する。より好ましくは約1U／kg〜約15U／kgの改変神経毒を投与する。さらに好ましくは、約5U／kg〜約10U／kgの改変神経毒を投与する。一般に、改変神経毒は、約2.5cc／100Uの割合に相当する投与量で、組成物として投与されるだろう。これより高いまたは低い効力を持つ神経毒について、これらの投与量を調節する方法は、当業者であれば知っているか、容易に確かめることができる。B型ボツリヌス毒素は、同様の治療効果を得るためにA型ボツリヌス毒素で使用されるレベルよりも約50倍高いレベルで投与できることが知られている。したがって、B型ボツリヌス毒素の場合は、上述した単位量を約50倍することができる。
【０１０１】
投与経路および投与量の例を記載したが、適切な投与経路および投与量は一般に主治医が症例毎に決定する。そのような決定は当業者にとっては日常的作業である（例えばAnthony Fauciら編「Harrison's Principles of Internal Medicine」14版，1998，McGraw Hillを参照されたい）。例えば、本発明による改変神経毒の投与経路および投与量は、選択した改変神経毒の溶解度特性ならびに処置される障害のタイプなどの基準に基づいて選択することができる。
【０１０２】
改変神経毒は、当技術分野でよく知られている通常の化学的方法を使って、ロイシンベースモチーフを神経毒に化学的に連結することによって製造することができる。例えば、E型ボツリヌス毒素は、発酵槽でボツリヌス菌の培養を樹立し、増殖させた後、発酵混合物を既知の手法で収集し、精製することによって得ることができる。
【０１０３】
改変神経毒は組換え技術によって製造することもできる。クロストリジウム属の異なる種に由来するアミノ酸配列領域を持つ神経毒、または改変されたアミノ酸配列領域を持つ神経毒を製造するには、組換え技術が好ましい。また、ロイシンベースモチーフが欠失によって改変されているA型ボツリヌス毒素を製造する場合も、組換え技術は好ましい。この技術には、細胞結合部分、神経毒またはその一部を移行させるのに有効なアミノ酸配列、および標的細胞（好ましくはニューロン）の細胞質中に放出された時に治療活性を持つアミノ酸配列のコードを持つ遺伝物質を、天然の供給源または合成的供給源から取得するステップが含まれる。好ましい一態様として、遺伝物質は、生物学的持続性増加成分、好ましくはロイシンベースモチーフ、HC、HNおよびクロストリジウム神経毒の軽鎖ならびにその断片のコードを持つ。遺伝子コンストラクトは、まずファージまたはプラスミドなどのクローニングベクターに遺伝子コンストラクトを融合することによって、増幅用宿主細胞に組み込まれる。次に、クローニングベクターを宿主、例えばクロストリジウム属、大腸菌または他の原核細胞、酵母、昆虫細胞株または哺乳類細胞株などに挿入する。宿主細胞における組換え遺伝子の発現に続いて、得られたタンパク質を通常の技術を使って単離することができる。
【０１０４】
これらの改変神経毒を組換え法で製造することには多くの利点がある。例えば、改変神経毒を作るには、改変用断片または改変用成分を神経毒素に結合するか、挿入しなければならない。嫌気性クロストリジウム培養からの神経毒の製造は、面倒で時間のかかる方法であり、これには数ステップのタンパク質沈降、および長時間かかる結晶化もしくは結晶化の反復、または数段階のカラムクロマトグラフィーを必要とする多段階精製プロトコールが含まれる。重大なことに、生成物の毒性が高いために、作業は厳密な封じ込め（BL-3）の下で行なわれなければならない。発酵プロセス中に、折りたたまれている一本鎖神経毒は、内因性クロストリジウムプロテアーゼにより、ニッキングと呼ばれるプロセスで活性化されて、二鎖（dichain）を生成する。時として、ニッキングプロセスに伴って一本鎖から約10アミノ酸残基が除去され、2本の鎖が鎖内ジスルフィド結合によって共有結合された状態を保っている二鎖型が生成する。
【０１０５】
ニックの入った神経毒は、ニックが入っていないものよりはるかに活性が高い。ニッキングの量および正確な位置は、毒素を産生する細菌の血清型によって様々である。一本鎖神経毒活性化の相違、したがってニックの入った毒素の収量の相違は、血清型およびその株が産生するタンパク質分解活性量の変動によって起こる。例えばボツリヌス菌血清型Aの一本鎖神経毒は99％以上がボツリヌス菌HallA株によって活性されるが、血清型BおよびEの株は活性化の量が少ない毒素を産生する（発酵時間に依存して0〜75％）。したがって、成熟神経毒の高い毒性は、治療薬としての神経毒の商業的製造において重要な役割を果たす。
【０１０６】
したがって、操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度は、これらの物質の製造にとって重要な事項である。ボツリヌス毒素および破傷風毒素などの神経毒を、安全で単離しやすく、完全活性型への変換が容易な、比較的無毒性の一本鎖（または中毒活性が低下した一本鎖）として、迅速に成長する細菌（例えば異種大腸菌細胞）などで高収率に組換え発現させることができれば、非常に有利だろう。
【０１０７】
安全性が最も重要であるため、過去の研究は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素のH鎖と軽鎖を個別に大腸菌で発現させて精製することに集中してきた。これらの単離された鎖は単独では無毒である。参考文献として本明細書の一部を構成するLiら，Biochemistry 33：7014-7020（1994）およびZhouら，Biochemistry 34：15175-15181（1995）を参照されたい。これらのペプチド鎖を個別に製造した後、厳密に制御された条件下で、H鎖と軽鎖を酸化的ジスルフィド結合によって組み合わせて、神経麻痺性の二鎖を形成させることができる。
【０１０８】
（実施例）
以下の非限定的実施例により、当業者に、本発明の範囲に包含される非痙攣関連痛の好ましい処置方法を具体的に示すが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１０９】
実施例１：筋肉障害に伴う痛みの処置
ある36歳の不運な女性は、15年に及ぶ顎関節疾患ならびに咬筋および側頭筋に沿った慢性痛の病歴を持っている。評価を受ける15年前に、彼女は、顎の開閉に関して痛みを伴う顎の不動性が増していること、および顔の両側に沿って圧痛があることに気付いた。最初は左側の方が右側より悪いと判断される。彼女は、関節の亜脱臼を伴う顎関節（TMJ）機能不全と診断され、外科的矯正形成半月切除および顆切除術による処置を受ける。
【０１１０】
手術後も顎を開閉しにくい状態が続くので、数年後に、両側の人工関節置換術を行なう。この手術後に、顎の痙攣および偏位が漸進的に起こるようになる。人工関節のゆるみを修正するために、関節の最初の手術に続いて、さらなる外科的修正も行なわれる。これらの手術後も顎はかなりの痛みと不動を呈し続ける。TMJおよび筋そのものは、相変わらず、触れると痛みを感じた。圧痛点は顎関節の全面にわたって存在し、筋肉全体に緊張の増加が認められる。彼女は術後筋筋膜疼痛症候群と診断され、咬筋および側頭筋への改変神経毒の注射を受ける。改変神経毒はロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。具体的な投与量および投与頻度は治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。
【０１１１】
注射の数日後に、彼女は、痛みがかなり改善したことに気付き、顎が自由になった感じがすると報告する。これは2〜3週間かけて徐々に改善し、この間に彼女は顎が開けやすくなり、痛みも減少していることに気付く。彼女は、痛みはこの4年間で一番ましであると明言する。改善された状態は、改変神経毒の最初の注射後、27ヶ月まで持続する。
【０１１２】
実施例２：脊髄傷害後に起こった痛みの処置
脊髄傷害後に起こった痛みを感じている39歳の患者を、改変神経毒の髄腔内投与、例えば脊椎穿刺または脊髄へのカテーテル挿入（注入の場合）によって処置する。改変神経毒はロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。上述のように、具体的な毒素の投与量と注射部位は、毒素の投与頻度と共に、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変毒素の投与後約1日〜約7日以内に、患者の痛みはかなり減少する。痛みの軽減は27ヶ月まで持続する。
【０１１３】
実施例３：改変神経毒の末梢投与による「肩手症候群」の処置
肩、腕および手の痛みは筋萎縮症、骨粗鬆症および関節の固着に伴って発症しうる。冠不全後が最も一般的であるが、この症候群は頸部関節症または限局性肩疾患でも起こり、また患者に臥床状態を強いる長期間の病気後にも起こりうる。
【０１１４】
ある46歳の女性は肩手症候群型の痛みを呈している。痛みは三角筋領域に特に局在している。この患者を肩への改変神経毒の皮下ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、ロイシンベースモチーフを含むE型ボツリヌス毒素である。改変神経毒は、例えば、ロイシンベースモチーフを含む改変A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素であってもよい。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に、患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１５】
実施例４：改変神経毒の末梢投与による帯状疱疹後神経痛の処置
帯状疱疹後神経痛は難治性が最も高い慢性痛問題の一つである。この耐え難い痛みを伴う経過に苦しむ患者は、多くの場合、高齢であり、消耗性疾患を持ち、大規模なインターベンション術には適さない。診断は疱疹の病巣跡の存在および患者の病歴によって容易に下される。痛みは強く、情動的に苦しい。帯状疱疹後神経痛はどこにでも起こりうるが、胸部に起こることが最も多い。
【０１１６】
ある76歳の男性は帯状疱疹後型の痛みを呈している。痛みは腹部領域に局在している。この患者を、腹部への改変神経毒の皮内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、例えばA、B、C1、C2、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素である。改変神経毒はロイシンベースモチーフおよび／または付加的なチロシンベースモチーフを含む。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１７】
実施例５：改変神経毒の末梢投与による鼻咽頭腫瘍痛の処置
これらの腫瘍は、多くの場合、扁平上皮癌で、通常、ローゼンミュラー窩にあり、頭蓋底を冒しうる。顔面の痛みがよく起こる。この痛みの性質は絶え間なく続く鈍痛である。
【０１１８】
ある35歳の男性は鼻咽頭腫瘍型の痛みを呈している。痛みは左下頬に認められる。この患者を、頬への改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、生物学的持続性を増加させる付加的アミノ酸誘導体、例えばチロシンリン酸化を含むA、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素である。具体的な投与量および投与頻度は治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１１９】
実施例６：改変神経毒の末梢投与による炎症痛の処置
ある45歳の患者は胸部に炎症痛を呈している。この患者を、胸部への改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって処置する。改変神経毒は、好ましくは、付加的なチロシンベースモチーフを含むA、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素である。上述のように、具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。改変神経毒投与後1〜7日以内に患者の痛みはかなり軽減する。痛みの軽減の持続期間は約7ヶ月〜約27ヶ月である。
【０１２０】
実施例７
片側性発汗過多を示す65歳の男性を改変神経毒の投与によって処置する。投与量及び投与頻度は所望する効果の程度に依存する。改変神経毒は、好ましくは、A、B、C1、C2、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素である。改変毒素はロイシンベースモチーフを含む。投与は腺神経叢、神経節、脊髄または中枢神経系への投与である。具体的な投与部位は、標的とする腺および分泌細胞の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定されることになる。さらに、適当な脊髄レベルまたは脳内領域に毒素を注射することもできる。改変神経毒処置後の発汗過多の停止は27ヶ月に及ぶ。
【０１２１】
実施例８：術後処置
ある22歳の女性は肩腱断裂を呈し、腱を修復するために整形外科手術を受ける。手術後に、患者の肩に、改変神経毒を筋肉内投与する。改変神経毒は、生物学的持続性増加成分の1または複数のアミノ酸を毒素から欠失させたA、B、C、D、E、Fおよび／またはG型ボツリヌス毒素であることができる。例えば、ボツリヌス毒素血清型Aのロイシンベースモチーフの1または複数のロイシン残基を欠失させかつ／または突然変異させることができる。もう一つの選択肢として、ロイシンベースモチーフの1または複数のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換することもできる。例えばロイシンベースモチーフ中の2つのロイシンをアラニンで置換することができる。具体的な投与量および投与頻度は、治療医の技量の範囲で種々の因子に依存する。具体的な投与部位は、筋肉の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定されることになる。投与される改変神経毒は、手術からの回復が促進されるように、腕の動きを抑制する。改変神経毒が作用する期間は約5週間以下である。
【０１２２】
実施例９：ボツリヌス神経毒軽鎖遺伝子のクローニング、発現および精製
この実施例では、ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNAヌクレオチド配列をクローニングし、発現させ、その結果得られるタンパク質産物を精製する方法を説明する。ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNA配列は、軽鎖遺伝子の5’および3’末端領域に対応した配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRプロトコールによって増幅することができる。プライマーの設計により、ボツリヌス毒素軽鎖遺伝子PCR産物の5’および3’末端に、例えばStuI制限部位およびEcoRI制限部位などの制限部位が導入されるようにすることができる。そうすれば、これらの制限部位を利用することによって、増幅産物の一方向サブクローニングを容易に行なうことができる。さらに、これらのプライマーを使って、軽鎖コード配列のC末端に停止コドンを導入することもできる。ボツリヌス菌（例えばHallA株）由来の染色体DNAを増幅反応のテンプレートとして利用することができる。
【０１２３】
PCR増幅は、10mMトリスHCl（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、50pmolの各プライマー、200ngのゲノムDNAおよび2.5単位のTaq DNAポリメラーゼを含む0.1mLの液量で行なうことができる。反応混合物は、35サイクルの変性（94℃で1分）、アニーリング（55℃で2分）および重合（72℃で2分）にかけることができる。最後に、72℃でさらに5分間、反応を延長することができる。
【０１２４】
PCR増幅産物を、例えばStuIおよびEcoRIで消化して、軽鎖をコードするクローン化PCR DNA断片を遊離させることができる。次にこの断片を例えばアガロースゲル電気泳動などによって精製して、例えばSmaIおよびEcoRIで消化したpBluescript II SKファージミド中に連結することができる。この組換えファージミドを保持する細菌形質転換体（例えば大腸菌）は、青／白スクリーニング法などの標準的方法によって同定することができる。軽鎖をコードするDNAを含むクローンは、標準的な方法で行なわれるDNA配列解析によって同定することができる。クローン配列は、例えばBinzら，J.Biol.Chem. 265，9153（1990）、Thompsonら，Eur.J.Biochem. 189，73（1990）およびMinton「クロストリジウム神経毒、破傷風およびボツリヌス中毒症の分子病原論（Clostridial Neurotoxins，The Molecular Pathogenesis of Tetanus and Botulism）」C.Motecucco編（1995）161〜191頁などに公表されているボツリヌス毒素軽鎖の配列とクローン配列とを比較することによって、確認することができる。
【０１２５】
軽鎖は例えばpMal-P2などの発現ベクターにサブクローニングすることができる。pMal-P2は、強力な誘導性プロモーターPtacによって制御されるMBP（マルトース結合タンパク質）をコードするmalE遺伝子を保有している。
【０１２６】
ボツリヌス毒素軽鎖の発現を確認するために、軽鎖遺伝子含有pMal-P2を保有する十分に分離された細菌コロニーを使って、0.1mg／mlアンピシリンおよび2％（w／v）グルコースを含むL-ブロスに植菌し、振とうしながら30℃で終夜生育させる。その終夜培養物を、0.1mg／mlのアンピシリンを含む新しいL-ブロスに、1：10に希釈し、2時間培養する。最終濃度0.1mMのIPTGを添加することによって、融合タンパク質の発現を誘導する。30℃でさらに4時間培養した後、6,000×gで10分間の遠心分離によって、細菌を収集することができる。
【０１２７】
少量SDS-PAGE解析によって、IPTG誘導細菌から得られる試料中に90kDaタンパク質バンドの存在を確認することができる。この分子量は、MBP（約40kDa）成分とボツリヌス毒素軽鎖（約50kDa）成分との融合タンパク質の予想サイズと一致しているだろう。
【０１２８】
IPTG誘導細菌抽出物中に所望の融合タンパク質が存在することは、Cenci di Belloら，Eur.J.Biochem. 219，161（1993）に記載のポリクローナル抗L鎖プローブを使ったウェスタンブロット法によって確認することができる。PVDF膜（Pharmacia、英国ミルトンキーンズ）上の反応性バンドは、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギ免疫グロブリン（BioRad、英国ヘメルヘンプステッド）とECL検出システム（Amersham、英国）とを使って可視化することができる。ウェスタンブロット法の結果から、通例、顕著な融合タンパク質の存在が、完全な大きさの融合タンパク質よりも低い分子量を持つタンパク質に相当するいくつかの不鮮明なバンドと共に確認される。この知見は、融合タンパク質の限定的分解が、細菌内または単離操作中に起こったことを示唆している。
【０１２９】
サブクローニングされた軽鎖を製造するために、野生型ボツリヌス神経毒軽鎖タンパク質を発現させる細菌の1リットル培養物から得たペレットを、1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）および10mMベンズアミジンを含むカラムバッファー［10mMトリスHCl（pH8.0）、200mM NaCl、1mM EGTAおよび1mM DTT］に再懸濁し、超音波処理によって溶解することができる。溶解液は、4℃、15,000×gで15分間の遠心分離によって清澄化することができる。上清はアミロースアフィニティーカラム［2×10cm、樹脂量30ml］（New England BioLabs、英国ヒッチン）にかけることができる。結合していないタンパク質は、カラムバッファーを使って、280nmにおける吸光度測定値の安定によって溶出液がタンパク質を含んでいないと判断されるまで、樹脂から洗い流すことができる。次に、結合しているMBP-L鎖融合タンパク質を、10mMマルトースを含むカラムバッファーで溶出させることができる。融合タンパク質を含む画分をプールし、150mM NaCl、2mM CaCl2および1mM DTTを添加した20mMトリスHCl（pH8.0）に対して、4℃で72時間透析する。
【０１３０】
MBP-L鎖融合タンパク質は宿主細菌からの遊離後に精製することができる。細菌からの遊離は、細菌細胞膜を酵素的に分解するか機械的に破壊することによって達成することができる。精製にはアミロースアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。組換え野生型または突然変異型軽鎖は、Xa因子による部位特異的切断によって、融合タンパク質の糖結合ドメインから分離することができる。この切断法では通例、遊離のMBP、遊離の軽鎖および少量の未切断融合タンパク質が得られる。そのような混合物中に存在する得られた軽鎖が所望の活性を持つことを示すことはできるが、さらなる精製ステップを利用することもできる。例えば、切断生成物の混合物を、第2のアミロースアフィニティーカラムにかけて、MBPおよび未切断融合タンパク質を結合させることができる。遊離の軽鎖は通過画分中に単離することができる。
【０１３１】
実施例１０：天然軽鎖、組換え野生型軽鎖の精製重鎖との再構成
天然の重鎖および軽鎖は、2M尿素を使ってBoNTから解離させ、100mM DTTで還元した後、確立されたクロマトグラフィー法によって精製することができる。例えばKozakiら，1981，Japan J.Med.Sci.Biol. 34，61およびMaiseyら，1988，Eur.J.Biochem. 177，683。精製された重鎖を等モル量の天然軽鎖または組換え軽鎖と混合することができる。再構成は、25mMトリス（pH8.0）、50μM酢酸亜鉛および150mM NaClからなるバッファーに対して試料を4℃で4日間透析することによって行なうことができる。透析後に、組換え軽鎖と天然重鎖との会合によるジスルフィド結合した150kDa二鎖の形成は、SDS-PAGEによってモニターし、デンシトメーターで定量することができる。
【０１３２】
実施例１１：増加した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
改変神経毒は組換え技術と通常の化学的技術との併用によって製造することができる。
神経毒鎖、例えば生物学的持続性増加成分と融合して改変神経毒を形成させるボツリヌス軽鎖は、実施例9で述べたように組換え生産し、精製することができる。
【０１３３】
組換え技術によって得た組換え神経毒鎖は、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体などに、共有結合によって融合（またはカップリング）することができる。生物学的持続性増加成分を含むペプチド配列は、当業者に知られる標準的な溶液または固相t-Boc／Fmoc法によって合成することができる。同様の合成技術、例えばMiltonら，1992，Biochemistry 31，8799-8809およびSwainら，1993，Peptide Research 6，147-154で使用されるている方法論なども、本発明の範囲に含まれる。A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖には、例えば毒素のカルボキシル末端に、1または複数の合成生物学的持続性増加成分を融合することができる。生物学的持続性増加成分の融合は、当業者に知られる試薬類および技術、例えばPDPH／EDACおよびトラウト（Traut）試薬法などを用いる化学的カップリングによって達成される。
【０１３４】
もう一つの選択肢として、改変神経毒は、生物学的持続性増加成分を組換えボツリヌス毒素鎖に融合するステップを行なわずに、組換え生産することもできる。例えば、組換え神経毒鎖、例えば実施例9の組換え法によって得られるボツリヌス毒素軽鎖を、生物学的持続性増加成分、例えばロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体を持つように製造することができる。例えば、生物学的持続性増加成分をコードする1または複数のDNA配列を、A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖をコードするDNA配列に付加することができる。この付加は、部位特異的突然変異誘発に使用される当業者に周知の数多くの方法によって行なうことができる。
【０１３５】
生物学的持続性増加成分が融合または付加されている組換え改変軽鎖を、実施例10に記載の方法によって神経毒の重鎖と再構成させることによって、完全な改変神経毒を製造することができる。
【０１３６】
この実施例に従って製造される改変神経毒は増加した生物学的持続性を持つ。好ましくは、生物学的持続性は、追加された生物学的持続性増加成分を持たない同一の神経毒と比較して、約20％〜約300％増加する。
【０１３７】
実施例１２：減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒は組換え法を使って製造することができる。例えば、実施例9の組換え法によって得られるボツリヌス毒素軽鎖を、生物学的持続性増加成分を持たないように製造することができる。例えば、1または複数のロイシンベースモチーフ、チロシンベースモチーフおよび／またはアミノ酸誘導体を突然変異させることができる。例えば、生物学的持続性増加成分をコードする1または複数のDNA配列を、A、B、C1、C2、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素の軽鎖をコードするDNA配列から除去することができる。例えば、ロイシンベースモチーフをコードするDNA配列を、A型ボツリヌス毒素軽鎖をコードするDNA配列から除去することができる。DNA配列の除去は、当業者によく知られている多くの方法によって行なうことができる。
【０１３８】
生物学的持続性増加成分を欠失させた組換え改変軽鎖を、実施例10に記載の方法によって神経毒の重鎖と再構成させることによって、完全な改変神経毒を製造することができる。
【０１３９】
この実施例に従って製造される改変神経毒は減少した生物学的持続性を持つ。好ましくは、生物学的持続性は、ロイシンベースモチーフを持つ同一の神経毒、例えばA型ボツリヌス毒素と比較して、約20％〜約300％減少する。
【０１４０】
いくつかの好ましい方法に関して本発明を詳しく説明したが、他の態様、変形および変更も、本発明の範囲内で可能である。例えば、本発明の方法ではクロストリジウム神経毒の代わりに広範囲にわたる多様な改変毒素を有効に利用することができる。また、改変神経毒に相当する遺伝コード、すなわちDNA配列も、本発明の一部とみなされる。さらに、本発明は、2以上の改変毒素、例えばロイシンベースモチーフが融合されているE型ボツリヌス毒素と、ロイシンベースモチーフを含むB型ボツリヌス毒素とを、同時にまたは逐次的に投与する末梢投与法を包含する。本発明を種々の具体的実施例および具体的態様に関して説明したが、本発明はそれらに限定されるわけではなく、本発明は特許請求の範囲内で様々な形態で実施することができると理解すべきである。
【０１４１】
実施例１３：減少した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性を決定する上で、重要な因子であると思われる。なぜなら、細胞膜への局在により、局在化したタンパク質は、細胞内タンパク質分解複合体から保護されうるからである。
【０１４２】
B型ボツリヌス神経毒の生物学的持続性がA型ボツリヌス神経毒の生物学的持続性より短いことは周知であり、広く受け入れられている。この研究では、A型ボツリヌス毒素軽鎖を切断短縮してロイシンベースモチーフを除去すると、軽鎖は、その特徴的なパターンで細胞膜に局在化する能力を、実質的に失うことが実証された。実際、切断短縮されたA型軽鎖は、B型ボツリヌス毒素軽鎖に似たパターンで細胞膜に局在化する。
【０１４３】
したがって、切断短縮されたA型ボツリヌス毒素は、B型ボツリヌス毒素と同様の減少した生物学的持続性および／または減少した生物学的活性を持つという仮説を立てることができる。
【０１４４】
実施例１４：変化した生物学的持続性を持つ改変神経毒の製造
細胞膜への局在は、ボツリヌス毒素の生物学的持続性を決定する上で、重要な因子であると思われる。なぜなら、細胞膜への局在により、局在化したタンパク質は、細胞内タンパク質分解複合体から保護されうるからである。
【０１４５】
この研究では、A型ボツリヌス毒素軽鎖を突然変異させて427位と428位の2つのロイシンをアラニンに変化させると（図3）、軽鎖は、その特徴的なパターンで細胞膜に局在化する能力を、実質的に失うことが実証された。
【０１４６】
このデータから、突然変異させたA型ボツリヌス毒素は、変化した生物学的持続性を持つと結論することができる。
【０１４７】
実施例１５：切断短縮型LC／AによるSNAP25のインビトロ切断
図9に示すように、本発明者らはインビトロELISAアッセイを行なって、切断短縮型LC／Aがインビトロで、非切断短縮型LC／Aより低い効率でSNAP-25基質を切断することを実証した。記載するデータはエキソサイトーシスの阻害の尺度ではなく、SNAP-25切断物のインビトロ形成の尺度である。このアッセイは以下のように行なった。
【０１４８】
材料：
BirA-SNAP25128-206-これは、SNAP25の残基128-206のN末端に融合したBirAシグナル配列からなるLC／Aの組換え基質である。この融合コンストラクトを大腸菌で産生させ、BirAシグナル配列を大腸菌によってビオチン化させた。マイクロタイタープレートをストレプトアビジンで被覆処理した。使用した毒素はBoNT／A複合体またはLC／Aコンストラクトである。一次抗体は抗SNAP25197抗体とした。この抗体は、A型毒素による切断後にSNAP25のC末端を認識する（BirA-SNAP25128-197）。二次抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギIgGとした。セイヨウワサビペルオキシダーゼの比色用基質であるImmunoPure TMB基質はPierceから入手した。切断産物SNAP25197を認識する抗体はその切断産物に特異的であって、完全長未切断基質SNAP25206を認識しない。
【０１４９】
方法：
BirA-SNAP25128-206をマイクロタイタープレート上のストレプトアビジンに結合させた。プレートに、BoNT／A 900kDa複合体、His6-S-天然LC／AまたはHis6-S-切断短縮型LC／A-His6の段階希釈液を加えた。毒素試料は全てDTTと共にプレインキュベートした（これはLC／Aコンストラクトには必要ないが、LC／AコンストラクトもBoNT／A複合体と同じように処理した）。毒素試料を基質と共に37℃で90分間インキュベートした。毒素を除去し、結合している基質を抗SNAP25197抗体と共にインキュベートした。結合していない抗体を洗い流した後、プレートを二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗ウサギIgG）と共にインキュベートした。結合していない抗体を再び洗い流し、セイヨウワサビペルオキシダーゼの比色アッセイを行なった。このアッセイは450nmでの吸光度を読み取ることによって定量化した。
【０１５０】
本発明者らが行なった本明細書に記載の他の研究において、PC12細胞中で発現させた軽鎖コンストラクトは、PC12細胞中で直接発現させたものであり、タグは何も含んでいない。これらのインビトロアッセイのために大腸菌から発現させた軽鎖コンストラクトは、精製用のアフィニティータグを含んでいる（これらのタグはPC12細胞中で発現させた本明細書に記載のタンパク質には存在しない）。PC12中で発現させたLC／Aは融合タンパク質GFP-LC／Aであった。GFPとLC／Aの間には、両タンパク質を分離するために、一組のGlyが存在する。
【０１５１】
種々のコンストラクトを以下に説明する。
複合体（グラフでは赤色）：これはボツリヌス菌から単離されたBoNT／A 900kDa複合体である。
切断短縮型LC／A：N末端の8アミノ酸とC末端の22アミノ酸とを欠くコンストラクト。しかしこのコンストラクトは6-ヒスチジンおよびS-タグをN末端に持ち、さらにC末端にも6-ヒスチジンタグを持つ。
透析切断短縮型LC／A：切断短縮型LC／Aと同じであるが、精製に起因するイミダゾールが除去されている。
完全LC／A（グラフでは濃緑色）：天然LC／Aコンストラクト（完全長）。ただし、N末端に6-ヒスチジンおよびS-タグを持っている。C末端6-ヒスチジンは持っていない。
透析完全LC／A（グラフでは淡緑色）：完全LC／Aと同じであるが、精製に起因するイミダゾールが除去されている。
【０１５２】
これらの相違を図的に表すために、これらのコンストラクトのまさにN末端部分およびまさにC末端部分を図10に示す（LC／Aの中間部分は示されていない）。野生型と呼んでいるものは、本発明者らがPC12細胞中で直接発現させた天然LC／Aに相当する（これは、本発明者らが、切断されたSNAP25生成物のウェスタンブロット解析によってその活性を証明したコンストラクトである）。切断短縮型LC／AはHis-タグおよびS-タグを持つ切断短縮型軽鎖である。N-His-LC／Aは図9で完全LC／Aと呼んでいるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF（神経成長因子）分化PC12生細胞におけるGFP-ボツリヌス毒素A軽鎖の局在を表す図である。
【図２】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞におけるGFP-切断短縮型ボツリヌスA軽鎖の局在を表す図である。
【図３】 A型ボツリヌス毒素軽鎖のアミノ酸配列を表す図である。記載したアミノ酸配列から下線付きのアミノ酸を除いた配列は、A型ボツリヌス毒素切断短縮型軽鎖に相当する。
【図４】 427位および428位にLL→AA突然変異を持つGFP-ボツリヌス毒素A軽鎖の、蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞における局在を表す図である。
【図５】 スタウロスポリン分化PC12細胞の水平共焦点断面で視覚化した蛍光標識抗SNAP-25の局在を表す図である。
【図６】 A型ボツリヌス毒素のX線結晶構造を表す図である。
【図７】 蛍光倒立顕微鏡で視覚化したNGF分化PC12生細胞におけるGFP-B型ボツリヌス毒素軽鎖の局在を表す図である。
【図８】 A型ボツリヌス毒素HallA軽鎖およびB型ボツリヌス毒素Danish I軽鎖の整列およびコンセンサス配列を表す図である。
【図９】 本発明者らが行なったインビトロELISAアッセイの結果を表すグラフである。切断短縮型LC／Aが非切断短縮型LC／Aよりも遅い速度または低い効率で基質をインビトロ切断することを実証している。
【図１０】 インビトロ解析用に大腸菌から発現させたLC／Aコンストラクトの比較を表す図である。
Claims (14)
- 改変クロストリジウム神経毒であって、前記改変が、配列番号７の天然のロイシンベースモチーフに加えて、少なくとも１つの追加のロイシンベースモチーフを含み、前記追加のロイシンベースモチーフが、前記改変クロストリジウム神経毒の軽鎖に位置しており、そして前記追加のロイシンベースモチーフが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号２１からなる群より選択される配列を含む、改変クロストリジウム神経毒。
- 改変されるクロストリジウム神経毒がボツリヌス神経毒である請求項１に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- ボツリヌス神経毒が、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、ボツリヌス毒素Ｃ１型、ボツリヌス毒素Ｄ型、ボツリヌス毒素Ｅ型、ボツリヌス毒素Ｆ型、ボツリヌス毒素Ｇ型およびこれらのキメラボツリヌス毒素からなる群より選択される請求項２に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- 改変されるボツリヌス神経毒が、ボツリヌス毒素Ａ型である請求項３に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- 改変されるクロストリジウム神経毒が破傷風神経毒である請求項１に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- 追加のロイシンベースモチーフが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- ロイシンベースモチーフが配列番号７を含む請求項１に記載の改変クロストリジウム神経毒。
- 神経筋障害、自律神経障害または痛みの状態を処置するための薬剤の製造における請求項１〜７のいずれかに記載の改変神経毒の使用。
- 状態が、痙攣性発声障害、喉頭ジストニア、口下顎ジストニア、舌ジストニア、頸部ジストニア、書痙、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、局所性痙縮、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラジア、嚥下障害、流涙、多汗、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、筋痙攣による痛み、頭痛、眉間のシワおよび肌のシワである請求項８に記載の使用。
- 改変ボツリヌス毒素Ａ型であって、前記改変が、配列番号７を含む天然のボツリヌス毒素Ａ型のアミノ酸配列からの配列番号７のロイシンベースモチーフ中における突然変異である、改変ボツリヌス毒素Ａ型。
- ロイシンベースモチーフの突然変異が、配列番号７のアミノ酸の１つまたはそれ以上の欠失である請求項１０に記載の改変ボツリヌス毒素Ａ型。
- ロイシンベースモチーフの突然変異が、配列番号７のアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換である請求項１０に記載の改変ボツリヌス毒素Ａ型。
- 生物学的持続性の減少が、改変ボツリヌス毒素Ａ型の生物学的半減期の減少である請求項１０に記載の改変ボツリヌス毒素Ａ型。
- 生物学的持続性の減少が、改変ボツリヌス毒素Ａ型の生物学的活性の減少である請求項１０に記載の改変ボツリヌス毒素Ａ型。
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