WO2023277432A1 - 재조합 보툴리눔 독소 타입 a 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소 및 이의 조성물, 용도 및 방법 - Google Patents

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light chain
recombinant
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김국한
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곽성성
안동현
이영래
최화정
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present disclosure relates to recombinant botulinum toxins, and more particularly to recombinant botulinum toxin type A light chains, recombinant botulinum toxins, and compositions, uses and methods related thereto.
  • Botulinum Toxin is a neurotoxic protein produced by the bacterium Clostridium botulinum and related species. Botulinum toxin blocks the release of the neurotransmitter acetylcholine from the axon terminals of the neuromuscular junction.
  • Botulinum toxin is synthesized as a 150 kDa double-chain protein consisting of a 100 kDa heavy chain and a 50 kDa light chain linked by disulfide bonds.
  • the heavy chain is further divided into an N-terminal domain (Hn), which helps translocate the light chain to the cell's cytosol, and a C-terminal domain (Hc), which recognizes and binds to cell surface receptors on nerve cells. .
  • Hn N-terminal domain
  • Hc C-terminal domain
  • the light chain specifically hydrolyzes a portion of the soluble NSF-attachment protein receptor (SNARE) to inactivate neurotransmitter release.
  • SNARE soluble NSF-attachment protein receptor
  • Botulinum toxins are divided into seven serotypes (botulinum toxin type A, botulinum toxin type B, botulinum toxin type C, botulinum toxin type D, botulinum toxin type E, botulinum toxin type F and botulinum toxin type G), which are It is further subdivided into subtypes based on variance.
  • botulinum toxin type A1 has been extensively studied at the molecular level, preclinical, and clinical stages, and is currently widely used in the pharmaceutical industry.
  • botulinum toxin type A subtypes it is difficult to isolate the purified toxin, so there are few studies or reports on pharmacological characteristics.
  • botulinum toxin type A subtypes have been characterized biochemically, cellularly and in vivo.
  • various in vitro and in vivo studies on botulinum toxin type A subtypes have revealed properties that are distinct from botulinum toxin type A1 in terms of mechanisms such as potency, intracellular movement, and persistence.
  • properties at the in vitro level have been reported for botulinum toxin types A7 and A8.
  • International Publication WO2018/132423 discloses a botulinum neurotoxin mixture comprising a light chain peptide of subtype A 1 of botulinum neurotoxin type A and a heavy chain peptide of subtype 2 of botulinum neurotoxin for improved potency, cell entry kinetics, and duration of action, and including the same A pharmaceutical composition is disclosed.
  • International Publication WO2017/214447 discloses botulinum toxin B1 in which the heavy chain sequence is recombined to maintain the same level of toxin activity at a lower dose.
  • Another object of the present disclosure is to provide a composition related to the recombinant botulinum toxin.
  • Another object of the present disclosure is to provide a use of a composition related to the recombinant botulinum toxin.
  • Another object of the present disclosure is to provide a method for improving or treating a disease, including administering a composition related to the recombinant botulinum toxin to a subject.
  • Another object of the present disclosure is to provide a wild-type botulinum toxin type A light chain, a recombinant botulinum toxin type A light chain having increased potency or half-life compared to a wild-type botulinum toxin containing the same, and a method for preparing a recombinant botulinum toxin comprising the same. It is to do.
  • One aspect of the present disclosure is that the sequence of the third domain among the first, second, third, and fourth domains of a botulinum toxin type A light chain other than botulinum toxin type A4 is the sequence of the third domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof.
  • a substituted, recombinant botulinum toxin type A light chain is provided.
  • Another aspect of the present disclosure is that the sequence of the fourth domain of the first, second, third, and fourth domains of the recombinant botulinum toxin type A light chain is further substituted with the sequence of the fourth domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof. a recombinant botulinum toxin type A light chain.
  • Another aspect of the present disclosure provides a recombinant botulinum toxin comprising the recombinant botulinum toxin type A light chain and a botulinum toxin heavy chain.
  • compositions comprising the recombinant botulinum toxin and a pharmaceutically acceptable excipient or additive.
  • Another aspect of the present disclosure provides a use for ameliorating or treating a disease by administering to a subject a composition comprising the recombinant botulinum toxin and a pharmaceutically acceptable excipient or additive.
  • sequence of a third domain of the first, second, third, and fourth domains of a botulinum toxin type A light chain other than botulinum toxin type A4 is a sequence of the third domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof.
  • a method for preparing a recombinant botulinum toxin type A light chain having an increased effect or half-life compared to wild-type botulinum toxin type A light chain comprising the step of substituting with .
  • Another aspect of the present disclosure is that the sequence of the fourth domain of the first, second, third, and fourth domains of the recombinant botulinum toxin type A light chain is further substituted with the sequence of the fourth domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof.
  • a method for producing a recombinant botulinum toxin type A light chain having an increased potency or half-life compared to a wild-type botulinum toxin type A light chain comprising the steps of:
  • Another aspect of the present disclosure provides a method for preparing a recombinant botulinum toxin having an increased potency or half-life compared to a wild-type botulinum toxin comprising the recombinant botulinum toxin type A light chain and a botulinum toxin heavy chain.
  • a recombinant botulinum toxin type A light chain a recombinant botulinum toxin, and a composition, use, and method related thereto, which increase patient convenience by increasing potency and half-life, and enable customized treatment for indications.
  • 1A shows a sequence comparison (ESPript3.0, Robert and Gouet, 2014) of botulinum toxin type A1 light chain (GenBank: CAL82360.1), and botulinum toxin type A4 light chain (GenBank: ACQ51417.1).
  • the boundaries and starting points of each domain for domain substitution are indicated by arrows and boxes, and the table below shows the sequence ranges of each domain and the results of amino acid identity analysis between the two sequences.
  • FIG. 1B shows structural information on domains obtained by dividing a botulinum toxin type A1 light chain and a botulinum toxin type A4 light chain, showing differences in amino acid sequences and functional characteristics of each domain.
  • FIG. 1C is a schematic diagram showing a combination of a recombinant botulinum toxin type A light chain in which domains of a botulinum toxin type A1 light chain and a botulinum toxin type A4 light chain are substituted.
  • 2a is an SDS-PAGE analysis result of a domain-substituted and purified recombinant botulinum toxin type A light chain.
  • FIG. 2B is a result of confirming the site hydrolyzed by the recombinant botulinum toxin type A light chain in which the domain of Clover-SNAP25-mRuby2 (137-206) is substituted.
  • the domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain was hydrolyzed in the presence of Samples were analyzed via SDS-PAGE and Coomassie Blue staining.
  • FIG. 3 is a graph showing the thermal stability of a recombinant botulinum toxin type A light chain having domain substitutions.
  • the table below shows the dissolution temperature of each domain substituted recombinant botulinum toxin light chain.
  • FIG. 4 shows the result of endopeptidase assay of the recombinant botulinum toxin type A light chain in which the domain was substituted. Comparing the titers of the domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain and the wild-type botulinum toxin type A light chain, pBT103 showed titers similar to those of the wild type, with pBT112 exhibiting 1.73-fold, pBT113-1.49-fold, pBT114-1.3-fold, and pBT115 titers. increased by 1.55 times.
  • FIG. 5 is an SDS-PAGE analysis result of a purified product of a recombinant botulinum toxin type A light chain in which the light chain of botulinum toxin type A is substituted with a third domain of another botulinum toxin type A subtype (FIG. 5a) and thermal stability analysis. This is one result (Fig. 5b).
  • the melting point of each recombinant botulinum toxin type A light chain is shown in the table below. Thermal stability was most improved when the third domain of the botulinum toxin type A4 light chain was introduced into the botulinum toxin type A light chain.
  • FIG. 6a is a schematic diagram showing the construction of a recombinant botulinum toxin comprising a domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain.
  • 6B is a result of SDS-PAGE analysis of a purified product of a recombinant botulinum toxin into which a domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain was introduced, under reducing conditions.
  • the recombinant botulinum toxin was purified in a 150 kd form without impurities and then analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • FIG. 7a is a graph showing changes in DAS levels over time after administration of Coretox (botulinum toxin type A product) and recombinant botulinum toxin (pBT142) to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, and 12 U/kg, respectively, in rats. to be. DAS values on each measurement day were analyzed using the Mann-Whitney test. (*p ⁇ 0.05)
  • Figure 7b shows the trend line for the highest DAS score and the calculated DAS ED50 at each dose after Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142) were administered to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, and 12 U/kg, respectively, in rats. it's a graph
  • 7C is a graph showing changes in CMAP levels over time after administration of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142) to the right calf muscle at a dose of 12 U/kg in rats.
  • the results of analysis using a two-tailed t-test for the CMAP values of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142) on each measurement day are shown. (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001)
  • 7d is a graph showing changes in DAS levels over time after administration of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT147) to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, and 12 U/kg, respectively, in rats. DAS values on each measurement day were analyzed using the Mann-Whitney test. (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01)
  • Figure 7e shows the trend line for the highest DAS score and the calculated DAS ED50 at each dose after Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT147) were administered to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, and 12 U/kg, respectively, in rats. it's a graph
  • 7f is a graph showing changes in CMAP levels over time after administration of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT147) to the right calf muscle at a dose of 12 U/kg, respectively, in rats.
  • the results of analysis using a two-tailed t-test for the CMAP values of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT147) on each measurement day are shown. (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001)
  • FIG 8a shows the time course of DAS levels after administration of Coretox (botulinum toxin type A product) and recombinant botulinum toxin (pBT142, and pBT147) to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, 12, and 40 U/kg, respectively, in mice. It is a graph showing the change. DAS values on each measurement day were analyzed using the Mann-Whitney test. (*p ⁇ 0.05)
  • 8B shows trend lines and calculations for the highest DAS scores at each dose after administration of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142, and pBT147) to the right calf muscle at doses of 1.2, 4, 12, and 40 U/kg, respectively, in mice. It is a graph showing DAS ED50.
  • 8C is a graph showing changes in CMAP levels over time after administration of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142, and pBT147) to the right calf muscle at a dose of 12 U/kg, respectively, in mice.
  • the CMAP values of Coretox and recombinant botulinum toxin (pBT142, and pBT147) were analyzed using a two-tailed t-test. (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001)
  • Example 1 Domain substitution of botulinum toxin type A light chain
  • botulinum toxin type A1 light chain and the botulinum toxin type A4 light chain four domains of the botulinum toxin type A1 light chain and botulinum toxin type A4 light chain genes were substituted in order to confirm which domains affect protein stability.
  • Example 2 Expression and purification of domain-substituted botulinum toxin type A light chain
  • Example 14 types of recombinant botulinum toxin type A light chains were prepared.
  • the prepared recombinant expression vector was introduced into BL21(DE3) cells, a type of E.coli, to induce expression of the domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain. Expression was induced with IPTG ((Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside), and the final concentration was used to be 0.5 mM. That is, after adding 0.5 ml of 1M IPTG to 1 L of liquid medium, at 37 ° C.
  • BL21 (DE3) cells cultured at 18 ° C for about 18 hours were centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes to precipitate the cells
  • the medium of the supernatant was removed, and the precipitated cells were mixed with A buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl).
  • a buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl).
  • the cells were disrupted on ice with an ultrasonic disperser at 2 pulses/1 pause and 35% power for 20 minutes.
  • the amino acid sequences of the recombinant botulinum toxin type A light chain were isolated from pBT102 (SEQ ID NO: 18), pBT103 (SEQ ID NO: 19), pBT104 (SEQ ID NO: 20), pBT105 (SEQ ID NO: 21), and pBT106 (SEQ ID NO: 21), respectively. No.
  • Test Example 1 Thermal stability evaluation of domain substituted botulinum toxin type A light chain
  • the thermal stability of the recombinant botulinum toxin type A light chain in which the domain was substituted was compared.
  • evaluation of the middle temperature of heat denaturation (Tm) was performed, and generally, a high temperature of middle heat denaturation is preferable.
  • the thermostability of each domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain was measured using a thermal shift assay (PTS).
  • a thermal shift assay was performed using a Protein Thermal Shift Dye Kit (Catalog No. 4461146, Applied Biosystems) according to the manufacturer's method.
  • each recombinant botulinum toxin type A light chain was mixed with protein thermal shift die and buffer to make 20 ⁇ l, and then in RT-PCR (C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module, Bio-Rad) at 20 ° C. ROX signal was confirmed up to 95 °C while increasing the temperature by 1 °C per 60 seconds from . Based on the melting curve, the melting temperature (Tm) of each recombinant botulinum toxin light chain was determined. The melting point of each recombinant botulinum toxin type A light chain in which the domain was substituted is shown in FIG. 3 .
  • Test Example 2 Potency evaluation of domain substituted botulinum toxin type A light chain
  • an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based endopeptidase assay was performed. First, after diluting the GST-SNAP25 (137-206) substrate to a final concentration of 2 ⁇ g/mL, 100 ⁇ L per well was added to a 96-well plate and reacted at 4° C. for 16 hours. After preparing by dissolving 2% skim milk in PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween), 200 ⁇ l was added to wells coated with the substrate and reacted at 25° C. for 1 hour. After the reaction, wash well No.
  • PBST Phosphate Buffered Saline with Tween
  • Toxin Assay Buffer reaction buffer containing HEPES, DTT, zinc sulfate, and Tween-20
  • STD standard sample
  • domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain samples target concentration: 4 U/mL
  • the measured titer of was obtained.
  • the recovery rate of the recombinant botulinum toxin type A light chain sample in which the domain was substituted was calculated using the calculated titer and target concentration to confirm the recovery rate against the target concentration, and the results are shown in FIG. 4 . As shown in FIG.
  • pBT103 (SEQ ID NO: 19) showed a similar potency to that of the wild-type botulinum toxin type A1 light chain, and pBT114 (SEQ ID NO: 30) and pBT115 (SEQ ID NO: 31) showed a 1.5-fold increase in titer.
  • Comparative Example 1 Expression, purification and thermal stability evaluation of recombinant botulinum toxin type A light chain substituted with light chain third domain of another botulinum toxin type A subtype
  • botulinum toxin type A2 A5, A7, and A8 light chains that are botulinum toxin type A other than botulinum toxin type A4 light chains
  • thermal stability was compared.
  • a recombinant botulinum toxin type A light chain in which the third domain was substituted four recombinant botulinum toxin type A light chains were purified according to the purification method of Example 2, and the light chain 3 domain of each botulinum toxin type A subtype was substituted.
  • the recombinant botulinum toxin type A light chain was transformed into E.coli It was cloned into pET28a, an expression vector.
  • pBT158 (SEQ ID NO: 32) is a vector substituted with the third domain of the botulinum toxin type A2 light chain
  • pBT160 (SEQ ID NO: 33) is a vector substituted with the third domain of the botulinum toxin type A5 light chain
  • the third domain of the botulinum toxin type A7 light chain The vector substituted with the domain was named pBT161 (SEQ ID NO: 34)
  • the vector substituted with the third domain of the botulinum toxin type A8 light chain was named pBT162 (SEQ ID NO: 35).
  • Each recombinant botulinum toxin type A light chain was purified in the same manner as in Example 2 (FIG. 5a).
  • the recombinant botulinum toxin light chain protein substituted with the third domain of the botulinum toxin type A3 light chain was not expressed, and the third domain of the botulinum toxin type A6 light chain had the same sequence as the third domain of A1, so it was excluded from the test.
  • the third domain of a botulinum toxin type A1 light chain, the third domain of a botulinum toxin type A2 light chain, the third domain of a botulinum toxin type A5 light chain, the third domain of a botulinum toxin type A7 light chain, or the third domain of a botulinum toxin type A8 light chain As a result of substitution with the third domain, the recombinant botulinum toxin type A light chain in which the third domain of the botulinum toxin type A1 light chain was substituted with the third domain of botulinum toxin type A4 had the highest melting point, that is, the best thermal stability (Fig. 5b).
  • Example 3 Preparation and purification of domain substituted recombinant botulinum toxin
  • the recombinant full-length botulinum toxin gene containing the recombinant botulinum toxin type A light chain with increased thermal stability and increased activity was used with the pMTL80000 vector system. and cloned by infusion method (infusion-HD, Takara).
  • the cloned products were named pBT142, pBT143, pBT144, pBT145, pBT146, and pBT147, and the configuration of each domain is shown in a schematic diagram in FIG. 6a.
  • a detoxified hall A-hyper strain in which the toxin gene was inactivated using the ClosTron system was prepared and used.
  • Detoxified Clostridium botulinum strains including strains in which the toxin gene is inactivated or knocked out, can be used in a method for producing a purified recombinant botulinum toxin or a purified recombinant botulinum toxin complex.
  • Methods for preparing strains in which the toxin gene is inactivated or knocked out are known in the art and, for example, using the clostron method is described in Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016].
  • the recombinant botulinum toxin prepared by the clostron method was purified in the form of 150 kDa without complex components (FIG. 6a).
  • Recombinant botulinum toxins were identified as pBT142 (SEQ ID NO: 36), pBT143 (SEQ ID NO: 37), pBT144 (SEQ ID NO: 38), pBT145 (SEQ ID NO: 39), pBT146 (SEQ ID NO: 40), and pBT147 (SEQ ID NO: 41), respectively.
  • All of the production of the recombinant botulinum toxin was carried out in facilities licensed for toxin production according to government regulations.
  • Test Example 3 Efficacy of recombinant botulinum toxin with domain substitution in rats
  • mice Female 6-week-old SD (Sprague-Dawley) rats were purchased from Orient Bio Co., Ltd., and after acclimatization and quarantine for 1 week, 7-week-old rats were used in the experiment.
  • sterilized solid feed for laboratory animals R40-10, SAFE, France
  • drinking water was freely fed by sterilizing tap water at high temperature and high pressure.
  • the mice were set at a temperature of 23 ⁇ 3°C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, lighting time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This study was conducted after review and approval by the Medytox Animal Experiment Ethics Committee.
  • botulinum toxin type A Lot No.: NSA19016 or NSA20011, Medytox
  • Recombinant botulinum toxin pBT142 was prepared at 1316 U/mL and pBT147 at 348 U/mL and used in the experiment.
  • the titer of each recombinant botulinum toxin was tested based on the titer value derived by measuring before the efficacy test through the mouse titer test method.
  • the efficacy test of recombinant botulinum toxin pBT142 and pBT147, and Coretox was conducted using the same excipient components except for the botulinum toxin component in the recombinant botulinum toxin.
  • the dose of each test substance was administered at the same dose based on unit (U: a value representing the biological activity of botulinum toxin, 1U is the mouse half-lethal dose by intraperitoneal administration of a mouse).
  • Coretox was diluted using sterile physiological saline (35V3AF3, Daehan Pharmaceutical Co., Ltd.), and recombinant botulinum toxin pBT142 and pBT147 were diluted to concentrations of 12, 40, and 120 U/mL, respectively, using a placebo.
  • the day the test substance was administered was set as day 0, and after anesthetizing the rat using an injection anesthetic (60 mg/kg ketamine hydrochloride + 10 mg/kg xylazine), each test substance was administered according to the composition of each group in Table 1. It was administered to the right calf muscle of rats at 0.1 mL/kg using a Hamilton syringe.
  • the DAS digital abduction score
  • CMAP compound muscle action potential
  • the DAS values shown in Table 2 indicate the degree of muscle paralysis by the shape of the toe of the administered side in rats, and the CMAP value indicates the degree of inhibition of direct muscle contraction caused by nerve blockade.
  • CMAP was measured in the right calf muscle region of each rat using a Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) instrument. After anesthesia with an injectable anesthetic, hair was shaved at the measurement site, and the rat was placed in a prone position. The cathode was placed on the sciatic nerve on the side of the leg to be measured, and the anode was placed about 1 cm away from the site on the basis of the spine. The recording and reference electrodes were placed on the calf muscle and Achilles tendon, respectively, and the ground electrode was placed on the rectus femoris.
  • the level and duration of stimulation were set to 25 ⁇ 30 mA, 0.2 ms, and the filter range of the amplifier was set to 2-10 K at 60 Hz.
  • the height from the base to the peak of the waveform was recorded as CMAP measurement values.
  • the DAS measurements for comparing the effects of pBT142 and Coretox in Experiment 1 were 1.2, 4, It was evaluated from day 1 to day 112 after administration at a dose of 12 U/kg, and CMAP measurements were measured from day 8 to day 127 after administration in subjects administered at a dose of 12 U/kg.
  • DAS measurements were evaluated from 1 day to 112 days after administration at doses of 1.2, 4, and 12 U/kg, and CMAP measurements were performed on individuals administered at 12 U/kg doses. Measurements were taken from day 0 to day 126 after administration in the field.
  • Graphpad Prism 7.05 (GraphPad Software Inc., CA, USA) was used for graph presentation and SPSS software 25.0 (SPSS Inc., IL, USA) and Excel (2013, MS, USA) were used for statistical analysis. Results of experiments are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • DAS ED 50 was calculated using a 3-parameter logistic model after fixing the lowest 0-point and highest 4-point values using Graphpad Prism. Normality test was performed using the Kolmogorov-Smirnov test. Non-parametric data was analyzed statistically through the Mann-Whitney test, and in the case of parametric data, a two-tailed t -test was performed and statistical significance was determined when the p -value was less than 0.05.
  • the group administered with Coretox 1.2 U/kg all individuals recovered on day 28, and in the group administered with the same dose of pBT147, all individuals recovered on day 35, an increase of 7 days.
  • Test Example 4 Efficacy of recombinant botulinum toxin with domain substitution in mice
  • mice 5-week-old female CD1 (ICR) mice were purchased from Orient Bio Co., Ltd., and after acclimatization and quarantine for 1 week, 6-week-old mice were used in the experiment.
  • For the feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and for drinking water, tap water was sterilized at high temperature and high pressure.
  • the mice were set at a temperature of 23 ⁇ 3°C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, lighting time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination of 150 to 300 Lux. Breeding was carried out under specific-pathogen-free conditions. This study was conducted after review and approval by the Medytox Animal Experiment Ethics Committee.
  • Coretox was diluted using sterile physiological saline (35V3AF3, Daehan Pharmaceutical), and recombinant botulinum toxin pBT142 and pBT147 were diluted to concentrations of 6, 20, 60, and 200 U/mL using a placebo, respectively.
  • Day 0 was the day the test substance was administered, and after anesthetizing the mouse using an injection anesthetic (100 mg/kg ketamine hydrochloride + 10 mg/kg xylazine), each test substance was administered to the right calf muscle of the mouse according to the group composition in Table 3. was administered at 0.2 mL/kg using a Hamilton syringe.
  • the evaluation used a DAS (digit abduction score) evaluation method that visually evaluates the degree of mouse muscle paralysis and a compound muscle action potential (CMAP) test method that measures the action potential of muscles in response to external electrical stimulation.
  • DAS digital abduction score
  • CMAP compound muscle action potential
  • CMAP was measured in the right calf muscle region of each mouse using a Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) instrument.
  • the measurement method is the same as in Test Example 3 except for the stimulation level and duration of 7-8 mA and 0.1 ms.
  • DAS measurement was performed at doses of 1.2, 4, 12, and 40 U/kg.
  • the dose was evaluated from day 1 to day 84 after administration, and CMAP measurement was measured from the day of administration to day 98 in subjects administered at a dose of 12 U/kg, and statistically processed in the same manner as in Test Example 3.
  • the terms 'protein' and 'polypeptide' are used interchangeably herein to mean polymers of amino acid residues and variants and synthetic analogues thereof. These terms apply to naturally occurring amino acid polymers, including non-naturally occurring amino acids in which one or more amino acid residues are synthesized, e.g., chemical analogues of related naturally occurring amino acids. These terms also include post-translational modifications of polypeptides, such as glycosylation, phosphorylation and acetylation.
  • Botulinum toxin encompasses any polypeptide or fragment of a botulinum toxin.
  • botulinum toxin refers to full-length botulinum toxin or botulinum toxin derived fragments.
  • a botulinum toxin is capable of entering a neuron and executing a global cellular mechanism that inhibits neurotransmitter release.
  • domain' is a tertiary structure that can exist and evolve independently of the rest of the protein chain as a conserved portion of a given protein sequence. Because the domains are independently stable, domains can be swapped by genetic engineering between one protein and another to create chimeric proteins.
  • the term 'percent identity' refers to the degree of amino acid sequence identity between polypeptides. For example, when a first amino acid sequence is identical to a second amino acid sequence, the first and second amino acid sequences exhibit 100% identity.
  • the percent identity of the two amino acid sequences can be found in Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993 can be determined using a modified allorhythm. Such an algorithm is described in Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 in the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0).
  • 'recombination' refers to a process in which elements constituting genes such as DNA (Deoxyribonucleic Acid) or RNA (Ribonucleic Acid) are reversed differently from the original sequence during disassembly and reassembly.
  • DNA Deoxyribonucleic Acid
  • RNA Ribonucleic Acid
  • the term 'variant' encompasses, ie, any modification in a nucleic acid or amino acid sequence, eg, truncations, additions, deletions, substitutions of nucleic acids or amino acids, and any combination thereof. That is, the 'variant of the recombinant botulinum toxin type A light chain domain' may include truncation, addition, deletion, substitution of nucleic acids or amino acids constituting the recombinant botulinum neurotoxin type A light chain domain, and any combination thereof.
  • substitutions may include any amino acid other than the wild-type residue normally found at any sequence position. Such substitutions may be with non-polar (hydrophobic) amino acids such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline. Substitutions can be with polar (hydrophilic) amino acids such as serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Substitutions can be with electrically charged amino acids such as negatively charged amino acids such as aspartic acid and glutamic acid and positively charged amino acids such as lysine, arginine, and histidine.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline.
  • substitutions can be with polar (hydrophilic) amino acids
  • wild type' refers to a common species phenotype that occurs in nature.
  • the wild type may be the product of the canonical normal allele at the locus as opposed to that produced by the non-canonical mutant allele.
  • the term 'subject' may be male or female.
  • An individual may be a fully developed individual (eg, an adult) or an individual undergoing a developmental process (eg, a child, infant, or fetus).
  • the subject may be a mammal.
  • a mammal can be, but is not limited to, a human, non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, or cow.
  • botulinum toxin preparations Most of the botulinum toxin preparations currently on the market are preparations in which the active ingredient is botulinum toxin type A1, and in the case of Myobloc, botulinum toxin type B1 is used as an active ingredient. It is known that the duration of efficacy of botulinum toxin type A1 preparations is about 3 months on average, and shorter in the case of botulinum toxin type B1 preparations. Due to the nature of botulinum toxin preparations that must be administered by intramuscular injection, it is necessary to develop products that have a longer duration than commercially available preparations in terms of patient convenience.
  • the present inventors divided the sequences of botulinum toxin type A1 and A4 light chains into first, second, third, and fourth domains according to the domain characteristics of FIG. 2, as shown in FIG. 1, into a total of four domains.
  • the first domain (SEQ ID NO: 1) of the botulinum toxin type A1 light chain and the first domain (SEQ ID NO: 5) of the A4 light chain are sites that interact with SNAP25, a substrate, and contain ⁇ -exosite.
  • the first domain of the botulinum toxin type A1 and A4 light chain comprises amino acids from position 1 to amino acids from positions 90 to 150 (e.g., positions 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120). , amino acids at positions 125, 130, 135, 140, 145, and 150).
  • the second domain (SEQ ID NO: 2) of the botulinum toxin type A1 light chain and the second domain (SEQ ID NO: 6) of the A4 light chain are parts mainly involved in the enzymatic activity of the light chain, and contain 170 loops, and contain zinc and part that connects.
  • the second domain of botulinum toxin type A1 and A4 light chain comprises amino acids at positions 91-151 (e.g., positions 91, 96, 101, 106, 111, 116, 121, 126, 131).
  • amino acids at positions 136, 141, 146, and 151 amino acids at positions 136, 141, 146, and 151) to amino acids at positions 210 to 270 (e.g., positions 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, amino acids at positions 245, 250, 255, 260, 265, and 270).
  • the third domain (SEQ ID NO: 3) of the botulinum toxin type A1 light chain and the third domain (SEQ ID NO: 7) of the A4 light chain contain 250 loops and 370 loops for stabilizing substrate binding and substrate binding. It is a site involved in both ⁇ -exosite and ⁇ -exosite.
  • the third domain of the botulinum toxin type A1 and A4 light chain comprises amino acids 211-271 (e.g., 211, 216, 221, 226, 231, 236, 241, 246, 251, 256 261, 266 and 271 amino acids) to amino acids 386-446 (e.g., 386, 391, 396, 401, 406, 411, 416, 421, 426, 431 436, 441, and 446 amino acids).
  • amino acids 211-271 e.g., 211, 216, 221, 226, 231, 236, 241, 246, 251, 256 261, 266 and 271 amino acids
  • amino acids 386-446 e.g., 386, 391, 396, 401, 406, 411, 416, 421, 426, 431 436, 441, and 446 amino acids.
  • the fourth domain (SEQ ID NO: 4) of the botulinum toxin type A1 light chain and the fourth domain (SEQ ID NO: 8) of the A4 light chain are parts involved in the structural flexibility of the botulinum toxin type A light chain.
  • the fourth domain of the botulinum toxin type A1, and A4 light chain is amino acids 362-425 (e.g., 362, 367, 372, 377, 382, 387, 392, 397, 402, 407 amino acids 412, 417, 422 and 425) to amino acids 410 to 448 (e.g., 410, 414, 417, 420, 425, 430, 435, 440, 445). 1, and amino acids 448).
  • the sequence of the third domain among the first, second, third, and fourth domains of a botulinum toxin type A light chain other than botulinum toxin type A4 is the third domain of a botulinum toxin type A4 light chain or a variant thereof.
  • the botulinum toxin type A light chain other than botulinum toxin type A4 is a botulinum toxin type A1 light chain (SEQ ID NO: 9), a botulinum toxin type A2 light chain (SEQ ID NO: 10), a botulinum toxin type A3 light chain (SEQ ID NO: 11) , botulinum toxin type A5 light chain (SEQ ID NO: 13), botulinum toxin type A6 light chain (SEQ ID NO: 14), botulinum toxin type A7 light chain (SEQ ID NO: 15) or botulinum toxin type A8 light chain (SEQ ID NO: 16).
  • a botulinum toxin type A light chain can be a botulinum toxin type A1 light chain.
  • the third domain of the botulinum toxin type A4 light chain may be the sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the variant of the third domain of the botulinum toxin type A4 light chain is involved in both ⁇ -exosite and ⁇ -exosite, which are substrate binding sites, identically to the third domain of the botulinum toxin type A4 light chain, and has the sequence of SEQ ID NO: 3 and amino acid sequences having at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% identity; include
  • the sequence of the fourth domain among the first, second, third, and fourth domains of the recombinant botulinum toxin type A light chain is added to the sequence of the fourth domain of the botulinum toxin type A4 light chain or a variant thereof.
  • a recombinant botulinum toxin type A light chain is provided.
  • the fourth domain of the botulinum toxin type A4 light chain may be the sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the variant of the fourth domain of the botulinum toxin type A4 light chain is involved in the structural flexibility of the botulinum toxin type A light chain identically to the fourth domain of the botulinum toxin type A4 light chain and is at least 90%, at least 91% identical to SEQ ID NO: 4. %, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% identity.
  • a recombinant botulinum toxin comprising the recombinant botulinum toxin type A light chain and the botulinum toxin heavy chain is provided.
  • the botulinum toxin heavy chain is a botulinum toxin type A heavy chain, a botulinum toxin type B heavy chain, a botulinum toxin type C heavy chain, a botulinum toxin type D heavy chain, a botulinum toxin type E heavy chain, a botulinum toxin type F heavy chain, or a botulinum toxin. It may be a type G heavy chain.
  • the botulinum toxin heavy chain may be a botulinum toxin type A heavy chain.
  • a botulinum toxin heavy chain is a botulinum toxin type A1 heavy chain, a botulinum toxin type A2 heavy chain, a botulinum toxin type A3 heavy chain, a botulinum toxin type A4 heavy chain, a botulinum toxin type A5 heavy chain, a botulinum toxin type A6 heavy chain, a botulinum toxin type A7 heavy chain, or It may be a botulinum toxin type A8 heavy chain.
  • the botulinum toxin heavy chain can be a botulinum toxin type A1 heavy chain (SEQ ID NO: 17).
  • the recombinant botulinum toxin may be a recombinant botulinum toxin in which a recombinant botulinum toxin type A light chain and a botulinum toxin heavy chain are linked by a disulfide bond.
  • recombinant botulinum toxin is produced in Clostridium bacteria as a single, relatively inactive polypeptide chain weighing about 150 kDa with a high degree of amino acid sequence identity between botulinum toxin types. The single polypeptide then breaks down into an approximately 100 kDa heavy chain and a 50 kDa light chain, and the heavy and light chains can form disulfide bonds.
  • composition comprising the recombinant botulinum toxin and a pharmaceutically acceptable excipient or additive is provided.
  • the pharmaceutically acceptable excipient or additive is a stabilizer, an ionic compound, a surfactant, a buffer, a lyophilization protectant, or a combination thereof such as an amino acid (eg methionine), a salt (e.g. NaCl), buffers, non-ionic surfactants (e.g. polysorbates, e.g. polysorbate 20), sugars (e.g. disaccharides such as sucrose, etc.), sugar alcohols (e.g. sorbitol ), or a combination thereof.
  • an amino acid eg methionine
  • a salt e.g. NaCl
  • non-ionic surfactants e.g. polysorbates, e.g. polysorbate 20
  • sugars e.g. disaccharides such as sucrose, etc.
  • sugar alcohols e.g. sorbitol
  • the composition may be one that does not contain albumin or animal-derived components.
  • compositions that do not contain albumin or animal-derived components include those disclosed in WO2009-008595A1 or WO2012-134240A2, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the composition may be formulated in any form, such as a solid or liquid formulation, for example, a lyophilized powder, liquid, or pre-filled syringe formulation.
  • composition comprising the recombinant botulinum toxin and a pharmaceutically acceptable excipient or additive is administered to a subject to ameliorate or treat a disease.
  • a composition containing the recombinant botulinum toxin, pharmaceutically acceptable excipients or additives is administered to a subject to treat wrinkles, square jaws, pointed chins, scars, skin softening, scars, acne, pores, elasticity or keloids. It may be used for improvement.
  • a composition comprising the recombinant botulinum toxin, pharmaceutically acceptable excipients or additives is administered to a subject to treat facial spasms, blepharospasm, torticollis, blepharospasm, cervical dystonia, central pharyngeal dystonia, spastic dysphonia , migraine, pruritus anus or hyperhidrosis.
  • the composition may be administered by transdermal, subcutaneous, or intramuscular administration. In an embodiment, it may be by topically administering the composition to a muscle or group of muscles. In embodiments, the reduction of forehead wrinkles and skin wrinkles can be achieved by transdermal or subcutaneous administration of the composition to the wrinkles.
  • a method for ameliorating or treating a disease by administering to a subject a composition further comprising the recombinant botulinum toxin and a pharmaceutically acceptable excipient or additive is provided.
  • it may be a method for improving wrinkles, square jaws, pointed jaws, scars, skin softening, scars, acne, pores, elasticity, or keloids, comprising administering the composition to a subject.
  • treating facial spasm, blepharospasm, torticollis, blepharospasm, cervical dystonia, oropharyngeal dystonia, spasmodic dysphonia, migraine, pruritus ani or hyperhidrosis, comprising administering the composition to a subject. may be a way to
  • the sequence of the third domain among the first, second, third, and fourth domains of the botulinum toxin type A light chain, other than botulinum toxin type A4, is the third domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof.
  • a method for producing a recombinant botulinum toxin type A light chain having increased potency or half-life compared to wild-type botulinum toxin type A1 light chain comprising the step of substituting the sequence of
  • an increased potency compared to a wild-type botulinum toxin type A1 light chain comprising replacing the sequence of the third domain of the botulinum toxin type A1 light chain with the sequence of the third domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof; It may be a method for preparing a recombinant botulinum toxin type A light chain having a half-life.
  • preparing a recombinant botulinum toxin A light chain (pBT103, SEQ ID NO: 19) in which the sequence of the third domain of the botulinum toxin type A1 light chain is replaced with the sequence of the third domain of the botulinum toxin type A4 or a variant thereof. may be a method for producing a recombinant botulinum toxin type A light chain having an increased potency or half-life compared to wild-type botulinum toxin.
  • the sequence of the fourth domain among the first, second, third, and fourth domains of the recombinant botulinum toxin type A light chain is added to the sequence of the fourth domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof.
  • the sequence of the fourth domain of the recombinant botulinum toxin type A light chain is increased compared to wild-type botulinum toxin type A1, comprising further replacing the sequence of the fourth domain of botulinum toxin type A4 or a variant thereof. It may be a method for preparing a recombinant botulinum toxin type A light chain having a reduced potency or half-life.
  • botulinum toxin type A1 light chain and botulinum toxin type A4 light chain genes replacing four domains of botulinum toxin type A1 light chain and botulinum toxin type A4 light chain genes with each other; Genes containing the wild-type botulinum toxin type A light chain and the domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain were respectively cloned and introduced into E. coli to induce expression of the domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain.
  • the recombinant botulinum toxin A light chain (pBT104, sequence) in which the sequences of the third domain and the fourth domain of the botulinum toxin type A1 light chain are substituted with sequences of the third domain, the fourth domain or a variant thereof of the botulinum toxin type A4.
  • No. 20 may be a method for preparing a recombinant botulinum toxin type A light chain having an increased potency or half-life compared to wild-type botulinum toxin type A1.
  • Another aspect of the present disclosure provides a cell comprising a polynucleotide encoding the recombinant botulinum toxin type A light chain and a nucleic acid comprising the polynucleotide encoding the botulinum toxin heavy chain or a vector comprising the same.
  • the cell may express a recombinant botulinum toxin including the recombinant botulinum toxin type A light chain and the botulinum toxin heavy chain.
  • culturing a cell comprising a polynucleotide encoding the recombinant botulinum toxin type A light chain and a nucleic acid comprising the polynucleotide encoding the botulinum toxin heavy chain or a vector comprising the same
  • a method for producing a recombinant botulinum toxin having an increased potency or half-life compared to wild-type botulinum toxin may further include isolating the recombinant botulinum toxin from the culture.
  • the botulinum toxin heavy chain is a botulinum toxin type A1 heavy chain, a botulinum toxin type A2 heavy chain, a botulinum toxin type A3 heavy chain, a botulinum toxin type A4 heavy chain, a botulinum toxin type A5 heavy chain, a botulinum toxin type A6 heavy chain, a botulinum toxin type A7 heavy chain or a botulinum toxin type A8 heavy chain.
  • the botulinum toxin heavy chain can be a botulinum toxin type A1 heavy chain (SEQ ID NO: 17).
  • cloning a full-length recombinant botulinum toxin gene comprising a domain-substituted recombinant botulinum toxin type A light chain (pBT103, pBT104) and a botulinum toxin type A1 heavy chain;
  • the cloned toxin gene is introduced into an inactivated, detoxified strain, and the inactivated, detoxified strain into which the toxin gene is introduced is cultured to prepare a botulinum toxin with a domain substitution [Bradshaw et al. 2010, Pellett et al.
  • It may be a method for preparing a recombinant botulinum toxin having an increased potency or half-life compared to wild-type botulinum toxin, comprising purifying and isolating a 150 kDa recombinant toxin without complex components from the culture.

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Abstract

효과 및 반감기가 증가되어 환자의 편의성이 높아지고 적응증 맞춤 치료가 가능한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법을 제공하기 위한 것이다.

Description

재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소 및 이의 조성물, 용도 및 방법
본 개시는 재조합 보툴리눔 독소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BoNT)는 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부의 축삭돌기 말단으로부터 분비되는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 방출을 막는다.
보툴리눔 독소는 디설파이드 결합(disulfide bond)에 의해 연결된 100kDa 중쇄(Heavy Chain) 및 50kDa 경쇄(Light Chain)로 구성된 150kDa 이중쇄 단백질로 합성된다. 중쇄는 경쇄를 세포의 시토졸(cytosol)로 전위(translocation)시키는 것을 돕는 N-말단 도메인(Hn), 및 신경 세포 상의 세포 표면 수용체를 인지하고 결합하는 C-말단 도메인(Hc)으로 추가로 나뉜다. 세포 내로 들어가면, 경쇄는 가용성 NSF 부착단백질 수용체(soluble NSF-attachment protein receptor, SNARE)의 일부를 특이적으로 가수분해(proteolytic cleavage)하여 신경전달물질 방출을 비활성화한다.
보툴리눔 독소는 7개의 혈청형(보툴리눔 독소 타입 A, 보툴리눔 독소 타입 B, 보툴리눔 독소 타입 C, 보툴리눔 독소 타입 D, 보툴리눔 독소 타입 E, 보툴리눔 독소 타입 F 및 보툴리눔 독소 타입 G)으로 나뉘며, 이들은 아미노산 서열의 변이에 기초하여 아형(subtype)으로 추가로 세분화된다. 이들 중 보툴리눔 독소 타입 A1은 분자 수준 연구 및 전임상, 임상 단계 연구가 폭넓게 진행되었으며 현재 제약 산업에서 널리 이용되고 있다. 반면, 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경우 정제된 독소를 분리시키는데 어려움이 있어 약리학적 특징에 관하여 연구되거나 보고된 것이 적다. 현재 보툴리눔 독소 타입 A 아형 중 일부만이 생화학적, 세포적 그리고 생체 내에서의 특성이 규명되었다. 보고된 연구에 따르면 보툴리눔 독소 타입 A 아형에 대한 다양한 시험관내 및 생체 내 연구들로 효력, 세포내 이동, 지속력 등의 메커니즘 측면에서 보툴리눔 독소 타입 A1과 구별되는 특성들이 밝혀졌다. 최근 보툴리눔 독소 타입 A7 및 A8에 대해 시험관내 수준에서의 특성이 보고되고 있다.
국제공개 WO2018/132423는 개선된 역가, 세포 진입 동역학, 및 작용 지속기간을 갖기 위한, 보툴리눔 신경독소 타입 A 제 1 아형의 경쇄 펩티드 및 제 2 아형의 중쇄 펩티드를 포함하는 보툴리눔 신경독소 혼합물 및 이를 포함하는 제약 조성물을 개시하고 있다. 또한, 국제공개 WO2017/214447는 보다 적은 용량으로 동일한 수준의 독소 활성을 유지하기 위해 중쇄 서열을 재조합 한 보툴리눔 독소 B1을 개시하고 있다.
그러나, 지금까지 보툴리눔 신경독소 타입 A 아형 경쇄의 하위 도메인을 재조합 한, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소의 효력을 향상시키려는 시도는 없었다.
본 개시의 목적은 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소를 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 재조합 보툴리눔 독소와 관련된 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 개선 또는 치료방법을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 야생형 보툴리눔 독소 대비, 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 이를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 일 양상은 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
본 개시의 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 용도를 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효과 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효과 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시에 따르면, 효력 및 반감기가 증가하여 환자의 편의성이 높아지고 적응증 맞춤 치료가 가능한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 재조합 보툴리눔 독소, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법이 제공된다.
도 1a는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 (GenBank: CAL82360.1), 및 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 (GenBank: ACQ51417.1)의 서열 비교 (ESPript3.0, Robert and Gouet, 2014)를 나타낸다. 도메인 치환을 위한 각 도메인의 경계와 시작점은 화살표 및 박스로 표시하였으며, 아래 표는 각 도메인의 서열 범위와 두 서열 간의 아미노산 동일성 분석 결과이다.
도 1b는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 및 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄를 분할한 도메인에 대한 구조적 정보를 나타낸 것으로, 각 도메인에 대한 아미노산 서열 차이와 기능적 특성을 나타낸다.
도 1c는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 조합을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 도메인을 치환하고 정제한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 2b는 Clover-SNAP25-mRuby2(137-206)가 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 의해 가수분해된 부위를 확인한 결과이다. 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 존재하는 조건과 존재하지 않는 조건에서 형광단백질 표지가 부착된 SNAP25(137-206)의 가수분해 유무를 확인한 결과, 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 존재하는 조건에서 가수분해 되었다. 샘플은 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 통해 분석하였다.
도 3은 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성을 나타낸 그래프이다. 아래 표는 각각의 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄의 용해 온도를 나타낸다.
도 4는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 엔도펩디데이즈 어세이(endopeptidase assasy) 결과이다. 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄와 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 역가 결과를 비교하면, pBT103은 야생형과 유사한 역가를 보였으며, pBT112는 1.73배, pBT113은 1.49배, pBT114는 1.3배, pBT115는 1.55배 증가하였다.
도 5는 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄가 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 제 3 도메인으로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 정제된 산물을 SDS-PAGE 분석한 결과(도 5a), 및 열적안정성을 분석한 결과(도 5b)이다. 각각의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점은 아래 표에 나타내었다. 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인을 도입할 경우, 열적안정성이 가장 많이 향상되었다.
도 6a는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소 구성을 도시한 모식도이다.
도 6b는 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄가 도입된 재조합 보툴리눔 독소의 정제된 산물에 대해, 환원조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과이다. 재조합 보툴리눔 독소는 불순물이 없는 150kd 형태로 정제한 후, 환원조건에서 SDS-PAGE 분석하였다.
도 7a는 랫드에서 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A 제품)및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05)
도 7b는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)를 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소(pBT142)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석한 결과를 나타내었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 7d는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)를 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05, **p<0.01)
도 7e는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)을 각각 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 7f는 랫드에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)을 각각 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소(pBT147)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석한 결과를 나타내었다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 8a는 마우스에서 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A 제품) 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, DAS 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일의 DAS 값은 Mann-Whitney 검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05)
도 8b는 마우스에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, 각 용량에서 최고 DAS 점수에 대한 추세선과 산출된 DAS ED50를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 마우스에서 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)을 각각 12 U/kg 용량으로 우측 장딴지근육에 투여한 후, CMAP 수치의 경시적인 변화를 나타낸 그래프이다. 각 측정일에 코어톡스 및 재조합 보툴리눔 독소(pBT142, 및 pBT147)의 CMAP 값에 대해 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 분석하였다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
이하, 본 개시를 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 이는 본 개시의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 개시의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 도메인 치환
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄에 있어서, 어느 도메인이 단백질 안정성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 치환하였다. 인퓨전 클로닝(In-fusion cloning) 방법을 사용하여 도메인이 치환된 유전자 및 야생형을 포함한 총 16개의 도메인 치환 경쇄 유전자를 대장균(E.coli) 발현벡터인 pET28a에 클로닝하였고, 각각 pBT102 내지 pBT108, 및 pBT109 내지 pBT115로 명명하였다(도 1c). 이후, 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄 유전자 서열을 분석하여 도메인 치환을 확인하였다.
실시예 2: 도메인 치환 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 유전자를 이용하여, 14종의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하였다. 제조한 재조합 발현벡터를 대장균(E.coli)의 일종인 BL21(DE3) 세포에 도입하여, 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하였다. 발현은 IPTG((Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 유도하고, 최종 농도는 0.5mM이 되도록 사용하였다. 즉, 1M IPTG 0.5㎖을 액체배지 1L에 넣어준 후, 37℃에서 약 3시간, 18℃에서 약 18시간을 배양한 BL21(DE3) 세포를 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상층액의 배지를 제거하고, 침전된 세포를 A buffer(20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10mM Imidazole, 2mM B-Me, pH 7.9)로 재부유(resuspension) 시킨 후, 얼음에서 초음파 분산기로 2 pulse/1 pause, 파워 35%로 20분간 세포를 파쇄하였다. 상기 파쇄된 세포를 4℃ 14,000rpm에서 1시간 원심분리한 후, 세포 찌꺼기가 제거된 상층액을 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 히스 태그(His tag)와 Ni-NTA 레진(resin)의 결합을 통해, 상층액으로부터 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 분리하였다. 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 아미노산 서열을 각각 pBT102(서열번호 18), pBT103(서열번호 19), pBT104(서열번호 20), pBT105(서열번호 21), pBT106(서열번호 22), pBT107(서열번호 23), pBT108(서열번호 24), pBT109(서열번호 25), pBT110(서열번호 26), pBT111(서열번호 27), pBT112(서열번호 28), pBT113(서열번호 29), pBT114(서열번호 30), 및 pBT115(서열번호 31)로 나타내었다.
상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1, A4를 비롯한, 총 16종의 단백질 발현을 시도하였으나 5종은 발현량이 적거나 봉입체(inclusion body)로 발현되었고, 최종적으로 11종의 단백질이 가용성으로 발현되었다(도 2a). 이후, 정제된 11종의 단백질을 N-말단과 C-말단에 형광단백질이 표지된 SNAP25(137-206) 기질과 반응시켜, 프로테아제 활성을 확인하였다. 형광단백질이 표지된 SNAP25(137-206) 3μM을 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 0.2μM과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 SDS-PAGE에 로딩하였다. 쿠마시 블루 염색을 통하여 형광단백질-태그 부착된 SNAP25(137-206)가 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 의해 가수분해됨을 확인하였다(도 2b).
시험예 1: 도메인 치환된 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성 평가
도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열적안정성을 비교하였다. 안정성 평가방법으로서 열변성 중간온도(Tm)의 평가를 수행하였으며, 일반적으로 열변성 중간온도는 높은 것이 바람직하다. 각 도메인 치환 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 열안정성은 열이동분석법(PTS)을 사용하였다. 프로틴 써멀 시프트 다이 키트(Protein Thermal Shift Dye Kit)(Catalog No. 4461146, Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 열이동분석법 어세이를 수행하였다. 구체적으로는, 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 10㎍를 프로틴 써멀 시프트 다이와 버퍼로 20㎕가 되게 혼합한 후, RT-PCR(C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module, Bio-Rad)에서 20℃에서부터 60 초당 1℃씩 온도를 증가시키면서 95℃까지 ROX 시그널을 확인하였다. 용융 곡선을 바탕으로 각 재조합 보툴리눔 독소 경쇄의 용해점(melting temperature, Tm)을 결정하였다. 상기 도메인이 치환된 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점을 도 3에 나타내었다.
결과를 보면 pBT103(서열번호 19) 및 pBT104(서열번호 20)의 열적안정성이 증가한 것을 확인하였다. 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 용해점이 43℃인 것에 반하여 pBT103 및 pBT104의 용해점은 각각 52℃, 및 51℃로 증가하였고, pBT114 및 pBT115는 49℃로 증가하였다. 따라서, 대조군으로 사용한 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 용해점보다 pBT103 및 pBT104은 8℃, 및 9℃의 열적안정성이 증가하였고, pBT114 및 pBT115는 6℃의 열적안정성이 증가하였다. 따라서, 공통적으로 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인을 포함하도록 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점이 증가한 것을 확인하였다.
시험예 2: 도메인 치환된 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 역가 평가
도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 대한 시험관내 활성을 확인하기 위하여 효소결합 면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 기반 엔도펩티데이즈 어세이(endopeptidase assay)를 수행하였다. 먼저, GST-SNAP25 (137-206) 기질을 최종 2μg/mL이 되도록 희석한 후, 96 well 플레이트에 well 당 100μL를 첨가하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 2% 스킴 밀크(skim milk)를 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween)에 녹여 제조한 후, 기질 코팅이 끝난 웰(well)에 200㎕를 첨가하여 25℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 PBST 300㎕를 사용하여 3번 웰(well)을 씻어 준 후, Toxin Assay Buffer (HEPES, DTT, Zinc sulfate, Tween-20이 첨가된 reaction buffer)를 이용하여 표준시료(STD (1, 2, 3, 4, 5, 6U/mL) sample) 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료(타겟 농도 : 4U/mL)를 제조하여 well에 100μL씩 로딩 후 25℃에서 2시간 반응하였다. 반응 후 PBST 300㎕를 사용하여 3번 well을 씻어 준 후 1차 항체 Rabbit anti-SNAP25 (190-197) pAb를 100㎕/well 첨가한 후, 30분간 반응하고 다시 위와 같이 3번 씻어준 후 2차 항체인 Anti-rabbit IgG HRP conjugate를 첨가하여 30분간 반응하였다. TMB(BioFx사) 용액을 100㎕/well로 넣고 30 분간 25℃에서 발색하였다. 발색이 끝나면 3M 황산 50㎕/well로 첨가하여 발색을 중단하고 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
표준시료의 흡광값(optical density, OD)을 이용하여 표준시료의 농도와 흡광값 간의 검량선(calibration curve)을 그린 후, 생성된 1차 방정식을 이용하여 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료의 측정된 역가를 구하였다. 산출된 역가와 타겟농도를 이용하여 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 시료의 회수율을 산출하여 타겟 농도 대비 회수율을 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, pBT103(서열번호 19)은 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 유사한 역가를 보였으며 pBT114(서열번호 30)는 1.3배, pBT115(서열번호 31)는 1.55배 역가가 증가하였다.
비교예 1: 다른 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경쇄 제 3 도메인으로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현, 정제 및 열적안정성 평가
재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에서 A4의 제 3 도메인이 열적안정성 증가에 있어서 중요 요인인지 확인하기 위해, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄가 아닌 다른 보툴리눔 독소 타입 A인 보툴리눔 독소 타입 A2, A5, A7, 및 A8 경쇄의 제 3 도메인을 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인과 치환한 후 열적안정성을 비교하였다.
제 3 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 확보하기 위하여 4종의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 실시예 2의 정제방법에 따라 정제하고, 각 보툴리눔 독소 타입 A 아형의 경쇄 제 3 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 대장균(E.coli) 발현벡터인 pET28a에 클로닝하였다.
보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT158(서열번호 32), 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT160(서열번호 33), 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT161(서열번호 34), 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄의 제 3 도메인으로 치환된 벡터를 pBT162(서열번호 35)로 명명하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하였다(도 5a). 보툴리눔 독소 타입 A3 경쇄의 제 3 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질은 발현이 되지 않았고, 보툴리눔 독소 타입 A6 경쇄 제 3 도메인은 A1의 제 3 도메인과 서열이 같으므로 시험에서 제외하였다.
위와 같이 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인을, 보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄의 제 3 도메인, 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄의 제 3 도메인, 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄의 제 3 도메인, 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄의 제 3 도메인으로 치환한 결과, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인으로 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 용해점이 가장 높았고, 즉 열적안정성이 가장 우수하였다(도 5b).
실시예 3: 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소의 제조 및 정제
도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄에 대한 재조합 보툴리눔 독소의 기능 분석을 위해, 열적안정성이 증가하고 활성이 증가된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는, 재조합 전장 보툴리눔 독소 유전자를 pMTL80000 벡터 시스템을 이용하여 인퓨전 방법으로(infusion-HD, Takara) 클로닝하였다. 클로닝된 제조물은 pBT142, pBT143, pBT144, pBT145, pBT146, 및 pBT147로 명명하였고, 도 6a에 각 도메인의 구성을 모식도로 나타내었다. 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소는 클로스트론 방법(ClosTron system)을 사용하여 독소 유전자를 불활성화한 무독화 홀 에이-하이퍼(hall A-hyper) 균주를 제조하여 사용하였다.
독소 유전자가 불활성화되거나 녹아웃된 균주를 포함하는 무독화 클로스트리디움 보툴리눔 균주는, 정제된 재조합 보툴리눔 독소 또는 정제된 재조합 보툴리눔 독소 복합체의 제조방법에 사용할 수 있다. 독소 유전자가 불활성화되거나 녹아웃된 균주를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 클로스트론 방법을 사용하는 것이 문헌[Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016]에 설명되어 있다.
클로스트론 방법에 의해 제조된 재조합 보툴리눔 독소는 복합체 성분을 포함하지 않는 150kDa의 형태로 정제하였다(도 6a). 재조합 보툴리눔 독소는 각각 pBT142(서열번호 36), pBT143(서열번호 37), pBT144(서열번호 38), pBT145(서열번호 39), pBT146(서열번호 40), pBT147(서열번호 41)인 것으로 확인하였다. 상기 재조합 보툴리눔 독소의 모든 제조는 당국의 규제에 따라 독소 생산이 허가된 시설에서 수행하였다.
시험예 3: 랫드에서 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소의 효력
암컷 6주령 SD (Sprague-Dawley) 랫드를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 랫드를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료 (R40-10, SAFE, France)를 자유 급이 하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압 멸균하여 자유 급이 하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 연구는 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 후 수행하였다.
대조군으로 보툴리눔 독소 제품인 코어톡스 (보툴리눔 독소 타입 A, Lot No.: NSA19016 또는 NSA20011, 메디톡스) 100units을 사용하였다. 재조합 보툴리눔 독소 pBT142는 1316 U/mL, pBT147은 348U/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소의 역가는 마우스 역가시험법을 통해 효력 시험 전 측정하여 도출된 역가값을 바탕으로 시험을 수행하였다. 플라시보(위약 투여군)로는 재조합 보툴리눔 독소에서 보툴리눔 독소 성분을 제외하고 부형제 성분을 동일하게 사용하여, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147, 및 코어톡스의 효력시험을 진행하였다. 각 시험물질의 투여 용량은 모두 unit (U: 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 나타내는 값으로 1U은 마우스 복강투여에 의한 마우스 반수치사량)을 기준으로 동일한 용량으로 투여하였다.
코어톡스는 멸균 생리식염수 (35V3AF3, 대한약품공업)를 사용하여 희석하였으며, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147은 플라시보를 이용하여 12, 40, 120 U/mL 농도로 각각 희석하였다. 시험물질이 투여된 날을 0일로 하였으며, 주사마취제 (60 mg/kg 염산케타민 + 10 mg/kg 자일라진)를 이용해 랫드를 마취한 뒤, 표 1의 각 군의 구성에 따라 각각의 시험물질을 랫드의 오른쪽 장딴지근육에 해밀턴 주사기를 이용하여 0.1mL/kg로 투여하였다.
효력 평가로는 랫드의 근육 마비 정도를 육안으로 평가하는 DAS (digit abduction score) 평가법과 외부적인 전기 자극에 반응하는 근육의 활동전위를 측정하는 복합근육 활동전위 (CMAP: compound muscle action potential) 시험법을 사용하였다.
군 동물수 투여물질 용량 (U/kg) 투여경로 평가지표
실험1 1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 pBT142 1.2 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT142 4 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT142 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
실험2 1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 pBT147 1.2 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT147 4 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT147 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
표 2에 표기된 DAS 수치는 랫드에서 투여된 쪽의 발가락 형태에 의한 근육 마비 정도를 나타내며, CMAP 값은 신경 차단에 의해 나타나는 직접적인 근육의 수축 저해 정도를 나타낸다.
점수 기준
0 정상
1 다섯번째 발가락의 외전 소실
2 세개의 발가락이 서로 붙어있음
3 네개의 발가락이 서로 붙어있음
4 모든 발가락의 외전 소실 및 서로 붙어있음
CMAP은 Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) 장비를 이용하여 각 랫드의 오른쪽 장딴지근 부위에서 측정하였다. 주사마취제로 마취한 뒤 측정부위의 털을 제모하고 엎드린 자세로 랫드를 위치시켰다. 측정하고자 하는 다리 쪽의 좌골신경 부위에 음극을 위치시키고, 그 부위로부터 척추를 기준으로 약 1 cm 떨어진 부위에 양극을 위치시켰다. 기록 전극과 기준 전극을 장딴지근 부위와 아킬레스 건 부위에 각각 위치시키고, 접지 전극을 대퇴직근 부위에 위치시켰다. 자극의 수준과 기간은 25~30 mA, 0.2 ms 로 하였으며, 증폭기의 필터 범위는 60 Hz 에서 2-10 K로 설정하였다. 해당 조건으로 측정하였을 때 파형의 기저부에서 최고점까지의 높이를 CMAP 측정값으로 데이터화 하였다.표 1의 시험군 구성에 따라, 실험 1에서 pBT142와 코어톡스의 효력 비교를 위한 DAS 측정은 1.2, 4, 12 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 112일까지 평가하였으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여 후 8일부터 127일까지 측정하였다. 실험 2에서 pBT147과 코어톡스 간의 효력 비교를 위해 DAS 측정은 1.2, 4, 12 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 112일까지 평가하였으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여 후 0일째부터 126일차까지 측정하였다.
Graphpad Prism 7.05 (GraphPad Software Inc., CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software 25.0 (SPSS Inc., IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 실험의 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. DAS ED50 는 Graphpad Prism을 이용해 최저 0점 및 최고 4점 값을 고정한 뒤 3-지표 로지스틱 모델을 이용해 산출하였다. Kolmogorov-Smirnov test를 이용해 정규성 검정을 실시하였다. 비모수 데이터는 Mann-Whitney 검정을 통해 통계분석을 하였으며, 모수 데이터의 경우 양측 (two-tailed) t-검정을 수행하여 p-value가 0.05 보다 작은 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
랫드 우측 장딴지근육에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소 pBT142를 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 단회 투여한 후, DAS 평가 결과 12 U/kg의 용량으로 투여 후 14일째 pBT142 투여군에서 코어톡스 투여군 대비 유의적으로 DAS 점수가 증가하였다. 코어톡스 4 U/kg 투여군에서는 49일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT142 투여군에서는 이보다 7일이 증가된 56일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 91일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 투여군의 경우 이보다 21일이 증가된 112일째 모든 개체가 회복하였다(도 7a). DAS ED50 비교를 통해 pBT142가 코어톡스보다 약 1.8배 강한 효력을 보이는 것을 확인하였다(도 7b). DAS 결과와 유사하게 CMAP 시험에서도 12 U/kg pBT142 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP값을 보여 강한 효력을 나타내며, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 112일째 CMAP값을 회복하였고, pBT142 12 U/kg 투여군은 이보다 15일이 증가된 127일째 CMAP값을 회복하였다(도 7c). 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT142의 효력과 작용기간이 증가함을 확인하였다.
랫드 우측 장딴지근육에 코어톡스와 재조합 보툴리눔 독소 pBT147을 1.2, 4, 12 U/kg 용량으로 단회 투여한 후 DAS 평가 결과, 4 U/kg 용량에서 투여 후 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42일째, 12 U/kg 용량에서 투여 후 14, 21, 28일째 pBT147 투여군에서 코어톡스 투여군 대비 유의적으로 DAS 점수가 증가하였다. 코어톡스 1.2 U/kg 투여군에서는 28일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT147 투여군에서는 이보다 7일이 증가된 35일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 4 U/kg 투여군에서는 42일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT147 투여군에서는 이보다 28일이 증가된 70일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 84일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT147 투여군의 경우 이보다 28일이 증가된 112일째 모든 개체가 회복되었다(도 7d). DAS ED50 비교를 통해 pBT147가 코어톡스보다 약 1.5배 강한 효력을 보이는 것을 확인하였다(도 7e). CMAP 시험에서는 모든 측정일에서 pBT147 12 U/kg 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP 값을 보이는 것을 확인하였고, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 112일째 CMAP 회복이 관찰되었고, pBT147 12 U/kg 투여군은 이보다 14일이 증가된 126일째 CMAP 회복이 관찰되었다(도 7f). 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT147의 효력과 작용기간이 증가하였음을 확인하였다.
시험예 4: 마우스에서 도메인을 치환한 재조합 보툴리눔 독소의 효력
암컷 5주령 CD1 (ICR) 마우스를 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 6주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료 (R40-10, SAFE, France)를 자유급이 하였으며, 음수는 상수도수를 고온 고압멸균하여 자유급이 하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육하였다. 본 연구는 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 후 수행하였다.
대조군으로 코어톡스(보툴리눔 독소 타입 A, Lot No.: NSA20015, 메디톡스) 100 units을 사용하였다. 재조합 보툴리눔 독소로 pBT142는 2803 U/mL, pBT147은 2537 U/mL로 제조하여 실험에 사용하였다. 각 재조합 보툴리눔 독소의 역가는 마우스 역가시험법을 통해 효력 시험 전 측정하여 도출된 역가값을 바탕으로 시험을 수행하였다. 플라시보(위약투여군)는 재조합 보툴리눔 독소에서 보툴리눔 독소를 제외하고 나머지 부형제 성분은 동일하게 사용하였다. 효력시험에서 각 시험물질의 투여 용량은 모두 unit (U : 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 나타내는 값으로 1 U은 마우스 복강투여에 의한 마우스 반수치사량)을 기준으로 동일하게 투여하였다.
코어톡스는 멸균 생리식염수 (35V3AF3, 대한약품공업)를 사용하여 희석하였으며, 재조합 보툴리눔 독소 pBT142, pBT147은 플라시보를 이용하여 6, 20, 60, 200 U/mL 농도로 각각 희석하였다. 시험물질이 투여된 날을 0일로 하였으며, 주사마취제 (100mg/kg 염산케타민 + 10mg/kg 자일라진)를 이용해 마우스를 마취한 뒤 표 3의 군 구성에 따라 각각의 시험물질을 마우스의 오른쪽 장딴지근육에 해밀턴 주사기를 이용하여 0.2mL/kg로 투여하였다.
군 동물수 투여물질 용량 (U/kg) 투여경로 평가지표
1 6 플라시보 0 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
2 6 코어톡스 1.2 우측 장딴지근육 DAS
3 6 코어톡스 4 우측 장딴지근육 DAS
4 6 코어톡스 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
5 6 코어톡스 40 우측 장딴지근육 DAS
6 6 pBT142 1.2 우측 장딴지근육 DAS
7 6 pBT142 4 우측 장딴지근육 DAS
8 6 pBT142 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
9 6 pBT142 40 우측 장딴지근육 DAS
10 6 pBT147 1.2 우측 장딴지근육 DAS
11 6 pBT147 4 우측 장딴지근육 DAS
12 6 pBT147 12 우측 장딴지근육 DAS, CMAP
13 6 pBT147 40 우측 장딴지근육 DAS
평가는 마우스 근육 마비 정도를 육안으로 평가하는 DAS (digit abduction score) 평가법과 외부적인 전기 자극에 반응하는 근육의 활동전위를 측정하는 복합근육 활동전위 (CMAP: compound muscle action potential) 시험법을 사용하였다. 표 4에 표기된 DAS 수치는 마우스에서 투여된 쪽의 발가락 형태에 의한 근육 마비 정도를 나타내며 CMAP 값은 신경 차단에 의해 나타나는 직접적인 근육의 수축 저해 정도를 나타낸다.
점수 기준
0 정상, 주입하지 않은 쪽의 발 모양과 다르지 않음
1 발가락 사이의 넓이가 좁하져 있음, 또는 두 개의 발가락이 서로 붙어 있고 나머지는 완전히 펴짐
2 모든 발가락 사이가 상당히 좁아져 있음, 또는 세 개의 발가락이 서로 붙어 있음
3 발이 굽어 있고 네 개의 발가락이 서로 붙어 있음
4 발이 굽어 있고 모든 발가락이 서로 붙어 있음
CMAP은 Nicolet Viking Quest (Viasys Healthcare, Inc.) 장비를 이용하여 각 마우스의 오른쪽 장딴지근 부위에서 측정되었다. 측정 방법은 자극의 수준과 기간 7~8 mA, 0.1 ms을 제외하고 나머지는 시험예 3과 동일하다.표 3의 시험군 구성에 따라 DAS 측정은 1.2, 4, 12, 40 U/kg 투여된 용량에서 투여 후 1일부터 84일까지 평가되었으며, CMAP 측정은 12 U/kg 용량으로 투여된 개체들에서 투여일부터 98일까지 측정하였고, 시험예 3과 동일하게 통계처리 하였다.
마우스 우측 장딴지근육에 코어톡스와 2종의 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147을 1.2, 4, 12, 40 U/kg 용량으로 단회 투여한 후, DAS 평가한 결과 pBT147 4U/kg 투여군에서 투여 후 14, 21, 28일차에 코어톡스 대비 유의적인 DAS 점수의 증가를 관찰하였다. 코어톡스 1.2 U/kg 투여군에서는 14일째 모든 개체가 회복하였고, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군에서는 이보다 14일이 증가된 28일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고 코어톡스 4 U/kg 투여군은 투여 후 28일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 이보다 14일이 증가된 42일째 모든 개체가 회복하였다. 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 49일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 이보다 14일이 증가된 63일째 모든 개체가 회복하였다. 그리고, 코어톡스 40 U/kg 투여군은 투여 후 70일째 모든 개체가 회복하였으나, 같은 용량의 pBT142 및 pBT147 투여군의 경우 각각 이보다 14일 및 7일이 증가된 84일 및 77일째 모든 개체가 회복하였고(도 8a), DAS ED50 비교를 통해 pBT142가 코어톡스보다 약 1.2배, pBT147이 코어톡스보다 약 1.4배 강한 효력을 보였다(도 8b).
CMAP 시험에서는 pBT142 및 pBT147 12 U/kg 투여군이 코어톡스 12 U/kg 투여군 대비 유의적으로 낮은 CMAP 값을 보이는 것을 확인하였고, 코어톡스 12 U/kg 투여군은 투여 후 84일째 CMAP 회복이 관찰되었으나 pBT147 12 U/kg 투여군은 이보다 14일이 증가된 98일째 CMAP 회복이 관찰되었다(도 8c). 이상과 같이, 마우스에서 수행된 이상의 결과들로부터 코어톡스 대비 재조합 보툴리눔 독소 pBT142 및 pBT147의 효력과 작용기간이 증가하였다.
달리　정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속한 분야에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 이해를 위해, 하기　정의가 적용될 것이고, 단수형으로 사용되는 용어는 복수형을 포함하며, 이의 역도 마찬가지이다.
본원에서 사용되는, 용어 '단백질', '폴리펩티드'는 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 의미하기 위해서 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성된 비천연 발생 아미노산, 예를 들어 관련된 천연 발생 아미노산의 화학적인 유사체를 비롯하여, 천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 이들 용어는 또한 폴리펩티드의 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 인산화 및 아세틸화를 포함한다.
용어 '보툴리눔 독소 (Botulinum toxin, BoNT)'는 보툴리눔 독소의 임의의 폴리펩티드 또는 단편을 포괄한다. 구체예에서, 보툴리눔 독소는 전장 보툴리눔 독소(full-length botulinum toxin) 또는 보툴리눔 독소 단편(botulinum toxin derived fragments)을 지칭한다. 구체예에서, 보툴리눔 독소는 뉴런에 진입하고, 신경전달물질 방출을 억제하는 전체적인 세포 메커니즘을 실행할 수 있다.
용어 '도메인'은 주어진 단백질 서열 및 보존된 부분으로 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 진화하고 기능하며 존재할 수 있는 3차 구조이다. 도메인은 독립적으로 안정하기 때문에, 도메인은 하나의 단백질과 다른 단백질 사이의 유전 공학에 의해 도메인 스왑(domain swap)되어 키메라 단백질(chimera protein)을 생성할 수 있다.
용어 '퍼센트 동일성(perecent identity)'은 폴리펩티드들 사이의 아미노산 서열 동일성 정도를 일컫는다. 예를 들어 제 1 아미노산 서열이 제 2 아미노산 서열과 동일한 경우, 제 1 및 제 2 아미노산 서열은 100％ 동일성을 나타낸다. 두 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990의 알로리듬으로서, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993에서 변형된 알로리듬을 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 알고리듬은 Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2.0)에 포함되어(incorporated) 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, score=50, wordlength=3으로 수행되어 관심 단백질 분자에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 있는 경우, Gapped BLAST Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기술된대로 사용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수가 사용될 수 있다.
용어 '재조합'은 DNA(Deoxyribonucleic Acid)나 RNA(Ribonucleic Acid)와 같은 유전자를 이루는 요소가 해체와 재조립 과정에서 원래의 서열과는 다르게 뒤바뀌는 과정을 가리키는 용어이다. 분자생물학의 실험을 통해 DNA의 조각을 인위적으로 재조합 할 수 있다. 이렇게 인위적으로 재조합 된 DNA를 재조합 DNA라 한다.
용어 '변이체'는 즉, 핵산 또는 아미노산 서열에서의 임의의 변형, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산의 절단, 부가, 결실, 치환, 및 이들의 임의의 조합을 포괄한다. 즉, '재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 도메인의 변이체'는 재조합 보툴리눔 신경독소 타입 A 경쇄 도메인을 구성하는 핵산 또는 아미노산의 절단, 부가, 결실, 치환, 및 이들의 임의의 조합을 포괄할 수 있다.
용어 '치환'은 임의의 서열 위치에서 정상적으로 발견되는 야생형 잔기 이외의 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 비-극성(소수성) 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 및 프롤린으로의 대체일 수 있다. 치환은 극성 (친수성) 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민으로의 대체일 수 있다. 치환은 전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어, 음전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 및 글루탐산 및 양전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들어 리신, 아르기닌, 및 히스티딘으로의 대체일 수 있다.
용어 '야생형'은 자연에서 발생하는 일반적인 종의 표현형을 말한다. 일반적으로, 야생형은 비표준 돌연변이(mutant) 대립 유전자에 의해 생성된 것과는 반대로 유전자좌(locus)에서 표준 정상(normal) 대립 유전자의 산물일 수 있다.
용어 '개체'는 남성 또는 여성일 수 있다. 개체는 완전히 발달된 개체 (예를 들어, 성인) 또는 발달 과정을 겪고 있는 개체 (예를 들어, 아동, 유아 또는 태아)일 수 있다. 개체는 포유동물일 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 또는 소일 수 있고, 이들 예로 제한하지 않는다.
최근 시판 중인 보툴리눔 독소 제제들은 대부분 유효성분이 보툴리눔 독소 타입 A1인 제제이고, 마이오블록(Myobloc)의 경우에는 보툴리눔 독소 타입 B1을 유효성분으로 사용하고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A1 제제의 효력 지속기간은 평균 약 3개월 가량이고, 보툴리눔 독소 타입 B1 제제의 경우에는 더 짧은 것으로 알려져 있다. 근육내 주사로 투여해야 하는 보툴리눔 독소 제제의 특성상, 환자의 편의성 측면에서 시판 중인 제제보다 긴 지속성을 갖는 제품의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 서열을 제 1, 2, 3, 4 도메인으로 도 2의 도메인 특성에 따라, 도 1과 같이 총 4개의 도메인으로 분할하였다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 1 도메인(서열번호 1), 및 A4 경쇄의 제 1 도메인(서열번호 5)은 주로 기질인 SNAP25와 상호결합하는 부위로 α-exosite가 포함된 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 1 도메인은 1번 위치의 아미노산 내지 90~150번 위치의 아미노산 (예를 들면 90번, 95번, 100번, 105번, 110번, 115번, 120번, 125번, 130번, 135번, 140번, 145번, 및 150번 위치의 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 2 도메인(서열번호 2), 및 A4 경쇄의 제 2 도메인(서열번호 6)은 경쇄의 효소 활성에 주로 관여하는 부분으로 170루프(loop)를 포함하며 보조인자인 아연과 결합하는 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 2 도메인은 91~151번 위치의 아미노산 (예를 들면 91번, 96번, 101번, 106번, 111번, 116번, 121번, 126번, 131번, 136번, 141번, 146번, 및 151번 위치의 아미노산) 내지 210~270번 위치의 아미노산 (예를 들면 210번, 215번, 220번, 225번, 230번, 235번, 240번, 245번, 250번, 255번, 260번, 265번, 및 270번 위치의 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인(서열번호 3), 및 A4 경쇄의 제 3 도메인(서열번호 7)은 기질 결합을 안정화시키는 250루프(loop)과 370루프(loop)을 포함하고 있으며 기질 결합부위인 α-exosite, β-exosite에 모두 관여하는 부위이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 3 도메인은 211~271번 아미노산 (예를 들면 211번, 216번, 221번, 226번, 231번, 236번, 241번, 246번, 251번, 256번, 261번, 266번 및 271번 아미노산) 내지 386~446번 아미노산 (예를 들면 386번, 391번, 396번, 401번, 406번, 411번, 416번, 421번, 426번, 431번, 436번, 441번, 및 446번 아미노산)일 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 4 도메인(서열번호 4), 및 A4 경쇄의 제 4 도메인(서열번호 8)은 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 구조적 유연성에 관여하는 부분이다. 보툴리눔 독소 타입 A1, 및 A4 경쇄의 제 4 도메인은 362-425번 아미노산 (예를 들면 362번, 367번, 372번, 377번, 382번, 387번, 392번, 397번, 402번, 407번, 412번, 417번, 422번 및 425번 아미노산) 내지 410~448번 아미노산 (예를 들면 410번, 414번, 417번, 420번, 425번, 430번, 435번, 440번, 445번, 및 448번 아미노산)일 수 있다.
본 개시의 일 양상에 따르면, 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인 또는 이의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄(서열번호 9), 보툴리눔 독소 타입 A2 경쇄(서열번호 10), 보툴리눔 독소 타입 A3 경쇄(서열번호 11), 보툴리눔 독소 타입 A5 경쇄(서열번호 13), 보툴리눔 독소 타입 A6 경쇄(서열번호 14), 보툴리눔 독소 타입 A7 경쇄(서열번호 15) 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 경쇄(서열번호 16)인 것일 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인은 서열번호 7의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 3 도메인의 변이체는 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 3 도메인과 동일하게 기질 결합부위인 α-exosite, β-exosite에 모두 관여하고, 서열번호 3의 서열과 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％, 또는 적어도 99.5％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 4 도메인 또는 이의 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 4 도메인은 서열번호 8의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄의 제 4 도메인의 변이체는 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 제 4 도메인과 동일하게 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 구조적 유연성에 관여하고, 서열번호 4와 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％, 또는 적어도 99.5％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 중쇄는, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 B 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 C 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 D 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 E 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 F 중쇄, 또는 보툴리눔 독소 타입 G 중쇄일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A2 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A3 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A4 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A5 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A6 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A7 중쇄 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 중쇄일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄(서열번호 17)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄가 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 것인, 재조합 보툴리눔 독소일 수 있다. 예를 들어, 재조합 보툴리눔 독소는, 보툴리눔 독소 타입들 사이에서 높은 정도의 아미노산 서열 동일성을 갖는 약 150 kDa 중량의 비교적 불활성인 단일 폴리펩타이드 쇄로서 클로스트리디움 박테리아에서 생산된다. 단일 폴리펩타이드는 이어서 대략 100 kDa 중쇄(heavy chain) 및 50 kDa 경쇄(light chain)로 분해되고, 중쇄 및 경쇄는 디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온 화합물(ionic compound), 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합, 예를 들어 아미노산(예를 들어 메티오닌), 염(예를 들어 NaCl), 완충액, 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20), 당(예를 들어 백당 등과 같은 다이사카라이드), 당 알코올(예를 들어 소르비톨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 조성물은 WO2009-008595A1 또는 WO2012-134240A2에 개시되어 있는 것들을 포함하며, 상기 특허의 내용은 그 전체로 본 명세서에서 참조로 인용된다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 고체 또는 액체 제제, 예를 들어 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지(pre-filled syringe) 제제 등 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 용도를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 용도일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 용도일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 경피, 피하, 또는 근육내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 구체예에서, 상기 조성물을 근육 또는 근육의 군에 국소적으로 투여하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 구체예에서, 이마 주름, 피부 주름의 감소는 상기 조성물을 해당 주름의 경피 또는 피하에 투여하는 것에 의해 이루어질 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 추가로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 질환을 개선하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 방법일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 서로 치환하는 단계; 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 유전자를 각각 클로닝하고 대장균(E. coli)에 도입한 후, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하는 단계; 이 중에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄(pBT103, 서열번호 19)를 제조하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
예를 들면, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄와 보툴리눔 독소 타입 A4 경쇄 유전자들의 4개 도메인을 서로 치환하는 단계; 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 도메인이 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 포함하는 유전자를 각각 클로닝하고 대장균(E. coli)에 도입한 후, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 발현을 유도하는 단계; 이 중에서, 보툴리눔 독소 타입 A1 경쇄의 제 3 도메인, 및 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인, 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환된 재조합 보툴리눔 독소 A 경쇄(pBT104, 서열번호 20)를 제조하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A1 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 재조합 보툴리눔 독소를 발현하는 것일 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상에 따르면, 상기 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 배양물로부터 재조합 보툴리눔 독소를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A2 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A3 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A4 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A5 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A6 중쇄, 보툴리눔 독소 타입 A7 중쇄 또는 보툴리눔 독소 타입 A8 중쇄일 수 있다. 구체예에서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄(서열번호 17)일 수 있다.
예를 들면, 도메인 치환된 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 (pBT103, pBT104) 및 보툴리눔 독소 타입 A1 중쇄를 포함하는 전장 재조합 보툴리눔 독소 유전자(pBT142, pBT147)를 클로닝하는 단계; 클로닝된 독소 유전자를 불활성화한 무독화 균주에 도입하고 독소 유전자가 도입된 불활성화한 무독화 균주를 배양하여 도메인이 치환된 보툴리눔 독소를 제조[Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016]하는 단계; 배양물로부터 복합체 성분을 갖지 않는 150kDa 형태의 재조합 독소를 정제하여 분리하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법일 수 있다.

Claims (28)

  1. 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제3 도메인 또는 그의 변이체의 서열로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환된 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  4. 제3항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 포함하는 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  6. 제5항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 또는 G인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  7. 제6항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  8. 제7항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 재조합 보툴리눔 독소.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온화합물, 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 아미노산, 염, 완충액, 비이온성 계면활성제, 당, 당 알코올, 또는 이들의 조합인 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 또는 동물 유래 성분을 포함하지 않는 조성물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지 제제 형태의 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드 증상을 개선하기 위한 조성물.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 조성물.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 경피, 피하, 또는 근육내 투여용인 조성물.
  17. 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드 증상을 개선하기 위한, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  18. 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  19. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름살, 사각턱, 뾰쪽턱, 상처, 피부연화, 흉터, 여드름, 모공, 탄력 또는 켈로이드를 개선하기 위한 방법.
  20. 제9항 내지 제13항 증 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경, 안검경련, 경부 근긴장 이상증, 인두 중앙부 근긴장 이상증, 경련성 발성 장애, 편두통, 항문 소양증 또는 다한증을 치료하기 위한 방법.
  21. 보툴리눔 독소 타입 A4가 아닌 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 3 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 3 도메인 또는 그 변이체의 서열로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄의 제 1, 2, 3, 및 4 도메인 중 제 4 도메인의 서열이, 보툴리눔 독소 타입 A4의 제 4 도메인 또는 그 변이체의 서열로 추가로 치환되는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 제조하는 방법.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 보툴리눔 독소 타입 A 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 보툴리눔 독소 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F, 또는 G인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 또는 A8인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 보툴리눔 독소 중쇄는 보툴리눔 독소 타입 A1인 것인, 야생형 보툴리눔 독소 대비 증가된 효력 또는 반감기를 갖는 재조합 보툴리눔 독소를 제조하는 방법.
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