KR20180130452A - 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술 - Google Patents
고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 고용해성의 GFP-HS1 태그와 보툴리늄 독소 단백질을 융합한 것으로, 재조합 단백질의 발현 시 세포질 내 용해도가 향상되어 생산수율이 우수하며, 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 발현되고, 프로테아제 영역을 포함하여 단백질 발현 후 분리 정제뿐만 아니라 활성화 형태의 보툴리늄 독소를 수득하는 데에도 용이하다.
Description
본 발명은 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술에 관한 것이다.
보툴리늄 신경독소 타입 A(Botulinum neurotoxin type A, BoNT/A)는 Clostridium botulinum으로부터 생산되고, serotype A 독소는 현재까지 많은 신경학적 및 비-신경학적 장애의 치료용도로 임상적으로 가장 널리 사용되는 독소이다. 이 독소는 150 kDa의 단백질로, 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 두개의 서브 유닛을 포함하며, 각각은 50 kDa, 및 100 kDa 이다. 상기 LC는 실제 독소이고, HC는 타겟에 결합하여 HC의 아미노 말단 영역에 의해 LC를 세포질 내로 변위시키는 역할을 한다.
상기 HC는 운동 신경의 외부수용체(ectoacceptor)에 결합하여 세포내 함입(endocytosis)에 의해 침입하고, LC는 HC의 아미노 말단 영역에 의해 세포질 내로 변위된다. 마지막으로, 아연-프로테아제 패밀리(zinc-protease family)에 속하는 효소적 도메인 LC는 특별히 SNARE25 단백질을 절단하고, SNARE25 단백질은 시냅스 접합부(junction)에서 아세틸콜린의 방출을 억제한다. 이 독소는 본질적으로 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 단일 사슬로서 생산되고, C. botulinum 프로테아제의 세포 내 프로테아제는 LC 및 HC 영역의 접합부를 절단하여 LC 및 HC 도메인 간의 이황화 결합에 의해 결합된 이중-사슬 분자(di-chain molecule)를 형성한다.
통상적으로, BoNT/A는 Clostridium 종으로부터 생산되며, 생물학적 안전 수준 (BL3) 설비를 필요로 하는 수 개의 정제 및 복잡한 결정화 단계를 필요로 한다. 따라서 위와 같은 생물학적 안전 수준 설비가 필요 없도록 안전하면서도, 수율이 높고, 복잡한 분리 정제 과정이 필요 없는 새로운 보툴리늄 독소 단백질의 생산기술 개발의 필요성이 높아지고 있다.
본 발명자들은 생물학적 안전 수준 설비가 필요 없도록 안전하면서도, 수율이 높고, 복잡한 분리 정제 과정이 필요 없는 새로운 보툴리늄 독소 단백질의 생산기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 컨스트럭트를 제조하고 이를 대장균에서 대량 발현시키고, 분리 정제하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "융합단백질(fusion protein)"은 단백질에 한 개 이상의 다른 단백질의 유전자를 연결시킨 후 발현시킨 인공 재조합 단백질을 의미한다. 융합단백질을 만들어서 얻을 수 있는 가장 큰 이점은 A 단백질에 B 단백질을 연결함으로써 그 기능에 시너지 효과를 기대할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 1) A 단백질을 인식하는 항체가 존재하지 않지만 B 단백질을 인식하는 항체가 존재할 경우, B 단백질을 인식하는 항체를 사용한 western blot 등으로 A 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 또한 2) B 단백질의 성질을 이용하여 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다. 또는 3) A 단백질이 세포에 결합하고 B 단백질이 형광을 띄는 경우, 융합단백질 AB를 이용한 flow cytometry 실험이 가능하다.
본 명세서에서 용어 "태깅 단백질(tagging protein, protein tag)"은 "표지단백질"이라고도 불리우며, 재조합 단백질에 유전적으로 이식된 펩타이드 서열이다. 종종 이 표지들은 화학작용제를 이용하거나 또는 단백질분해나 인테인 스플라이싱(intein splicing)과 같은 효소적 방법 등을 통해 제거할 수 있다. 단백질 태그는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 항원결정기 태그, 형광 표지 등 다양한 목적으로 단백질에 부착된다.
본 발명에서 상기 태깅 단백질은 친화성 표지(Affinity tags)의 의미로 사용된다. 친화성 표지는 본래의 생물학적 재료로부터 친화도를 이용한 기술(Affinity technique)을 이용하여 정제할 수 있다. 이는 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 글루타치온-S-전이효소(GST) 등을 포함한다. 폴리(히스티딘) 표지(Polyhistidine-tag)가 단백질 표지 재료로 널리 이용되며 금속 기질에 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 태깅 단백질은 4 내지 10개의 폴리(히스티딘), 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 또는 글루타치온 S-전이효소(GST)이다.
본 명세서에서 용어 형광단백질은 형광을 발현하는 단백질로서 다양한 용도의 생물학적 마커로서 사용되는 단백질이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 적색 형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 노란색 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 또는 청록색 형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP)이나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에서 사용되는 다양한 형광단백질이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "프로테아제(protease)"는 단백질 또는 펩타이드(peptide)에서 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 의미하며 단백질 분해효소라고도 한다. 프로테아제의 종류에는 폴리펩티드 사슬의 말단에만 작용, 아미노산 혹은 디펩티드를 차례로 유리(遊離)시키는 엑소펩티다아제(예 : 류신아미노펩티다아제 · 카르복시펩티다아제 · 디펩티딜펩티다아제)와, 내부에 작용해 여러 가지 크기의 펩티드를 유리시키는 엔도펩티다아제(예 : 펩신이나 트립신)의 2가지로 나누어진다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (c) 또는 (e)의 프로테아제는 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(Factor Xa), HRV3C 프로테아제, TEV 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease), 또는 트롬빈(thrombin)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 엔테로키나제인 경우 엔테로키나제가 인식하는 아미노산 서열은 '-DDDDK/비프롤린 아미노산-'이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 Xa 인자인 경우 Xa 인자가 인식하는 아미노산 서열은 '-IE(or D)GR/-'이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 HRV3C인 경우 HRV3C 프로테아제가 인식하는 아미노산 서열은 '-LEVLFQ/GP-'이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 TEV 프로테아제인 경우 TEV 프로테아제가 인식하는 아미노산 서열은 '-ENLYFQ/G-'
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 트롬빈인 경우 트롬빈이 인식하는 아미노산 서열은 -P4P3PR(or K)/P1'P2'- 또는 -P2"R(or K)/P1"- 이다. 여기에서 P4P3는 소수성 아미노산이고, P1'P2'은 비산성 아미노산이며, P2", P1"은 G이다.
여기에서 상기 프로테아제 인식 아미노산 서열 중 "/"는 절단 사이트(cleavage site)를 의미한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 생물학적 기능 균등물의 범위까지 포함된다.
본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등 물은 본 발명의 재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상기 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 구체적으로는 ± 2 이내, 보다 구체적으로는 ± 1 이내, 보다 더 구체적으로는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 구체적으로는 ± 2 이내, 보다 구체적으로는 ± 1 이내, 보다 더 구체적으로는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 인코딩하는 염기서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산분자에서 기본구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다는 사실은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 융합단백질을 인코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 및 재조합바이러스 등으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 재조합 발현벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 구체적으로는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.
본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA) 등을 이용하여 소망하는 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 세균, 효모, 곤충세포, 및 포유동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E. coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내 균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조방법을 제공한다:
(i) 제 9 항의 숙주세포를 융합단백질 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(ii) 생산된 융합단백질을 회수하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 상술한 단계 이후에 (iii) 회수된 융합단백질에 프로테아제를 처리하여 융합단백질의 (c) 및 (e)의 프로테아제 인식 서열을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하여 수행될 수 있다.
상기 제조방법은, 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 한 다음, 상기 형질 전환된 숙주세포를 배양한 후, 숙주세포의 배양액으로부터 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 수득 하는 과정을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사(transcription) 및/또는 번역(translation)을 조절하게 된다.
상기 형질 전환된 숙주세포가 배양되는 동안, 재조합 발현벡터 내의 재조합 보툴리늄 독소 단백질이 발현되어 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질이 제조된다. 제조된 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 배양액 내 또는 숙주세포 내에 존재하므로, 이를 분리, 정제함으로써 순수한 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 수득할 수 있다.
형질 전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E. coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
상기 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 형광단백질로 GFP를 포함하고, N-말단에 Ni-NTA 정제에 도움을 주는 8x-His 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 융합단백질은 대장균에서 발현되었으며, BoNT/A와 융합된 재조합 단일 사슬로서 용출되었다.
본 발명의 경우 GFP의 녹색 형광을 사용하여 정제된 단백질의 존재 여부에 대해 쉽게 모니터링이 가능하므로, SDS-PAGE 또는 다른 검출 기술로 확인하지 않아도 되어 종래의 방법에 비하여 정제가 더욱 용이하다. 또한 정제된 단백질은 TEV 프로테아제를 사용한 효소적 절단에 적합한 완충액으로 투석된 후 TEV 프로테아제로 절단되었다. 상기 TEV 프로테아제는 타겟 서열을 매우 높은 특이성으로 인식하고, 인간뿐만 아니라 사용된 이종성 발현 숙주, 즉 대장균에도 전혀 없는 효소이므로 본 발명의 재조합 융합 단백질을 분리하기에 용이하다.
상기 정제된 단백질은 TEV 프로테아제를 이용하여 절단이 이루어진다. 본 발명의 재조합 단백질에는 GFP와 LC 사이, 및 LC와 HC 사이에 TEV 절단 부위가 두 위치에 존재하므로 TEV 프로테아제 처리 시 GFP가 분리되고, LC와 HC 사이에 이황화결합의 형성이 유도되어 활성화 이중-사슬 독소(active di-chain toxin)가 형성된다. 다시 말하면, 상기 대장균에서 발현된 재조합 단백질은 TEV 프로테아제로 절단(cleavage)되기 전에는 그 자체로서는 독성이 없는 완전독소(holotoxin)로서 매우 안전하다. 또한 TEV 프로테아제로 절단이 되어야만 GFP의 제거 및 독소의 활성화가 이루어진다. 따라서 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 TEV 프로테아제로 절단하기 전까지의 발현과정에는 BL3 시설을 필요로 하지 않는다는 점에서 시설 비용을 크게 절감할 수 있는 장점이 있다.
이로 인해 생겨난 혼합물은 Ni-NTA 칼럼이나 겔 여과, 또는 막 차단 여과(membrane cut-off filtration)를 사용하여 간단히 정제될 수 있다.
마지막으로는 상기 혼합물에는 분리된 GFP와 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)가 혼재되어 있으므로, 이로부터 순수한 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)를 분리하여야 한다. 상술한 바와 같이 본 발명의 GFP(GFP-HS1)에는 His 택이 존재하므로 Ni-NTA 칼럼에 쉽게 결합된다. 따라서 상기 혼합물 용액을 Ni-NTA 칼럼에 통과시켜 GFP를 칼럼에 결합시킴으로써 최종적인 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)를 용출 액으로부터 수집할 수 있다. 겔 여과의 경우, TEV 프로테아제와 GFP는 각각 25 및 27 kDa의 서로 다른 분자량을 가지므로 쉽게 분리될 수 있다. 또한 분자량이 27 kDa 언저리인 GFP 또는 TEV와 비교하여 본 발명의 이중-사슬 활성화 BoNT/A는 분자량이 150 kDa이기 때문에 막 차단 여과에 의해 쉽게 정제될 수 있다. 비용을 더 절감하기 위하여, TEV 프로테아제는 E. coli에서 발현될 수 있고, TEV 발현 컨스트럭트를 사용하여 충분한 양이 제조될 수 있다. 고정된 TEV 칼럼은 최종 절단 과정에 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 고용해성의 GFP-HS1 태그와 보툴리늄 독소 단백질을 융합한 것으로, 재조합 단백질의 발현 시 세포질 내 용해도가 향상되어 생산수율이 우수하며, 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 발현되고, 프로테아제 영역을 포함하여 단백질 발현 후 분리 정제뿐만 아니라 활성화 형태의 보툴리늄 독소를 수득하는 데에도 용이하다.
도 1은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 클로닝 전략을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 아미노산 서열 및 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 발현 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 발현 및 정제된 분획을 SDS-PAGE한 결과를 나타낸 도이다. SDS-PAGE에서는 정제 후 179 kDa의 표적 단백질(빨간색 화살표로 표시), 부분적으로 생성된 표적 단백질(파란색 화살표로 표시)을 나타내었다 [S; 용해성 단백질 추출물(soluble protein extract), I; 불용성 단백질 추출물(insoluble protein extract), TCP; 전체 세포 단백질(total cell protein), F1; Ni-NTA로부터 정제 된 분획, 및 M; 분자량 마커(molecular weight marker)].
도 5는 SDS-PAGE겔의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. A는 웨스턴블롯 결과 이미지를 나타낸다(M; 마커, I; 불용성 단백질 분획, 및 S; 가용성 단백질 분획) B는 정제된 분획은 GFP로 인하여 녹색을 나타내며, 이는 육안 검사를 통한 정제에 도움이 된다.
도 2는 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 아미노산 서열 및 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 발현 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 발현 및 정제된 분획을 SDS-PAGE한 결과를 나타낸 도이다. SDS-PAGE에서는 정제 후 179 kDa의 표적 단백질(빨간색 화살표로 표시), 부분적으로 생성된 표적 단백질(파란색 화살표로 표시)을 나타내었다 [S; 용해성 단백질 추출물(soluble protein extract), I; 불용성 단백질 추출물(insoluble protein extract), TCP; 전체 세포 단백질(total cell protein), F1; Ni-NTA로부터 정제 된 분획, 및 M; 분자량 마커(molecular weight marker)].
도 5는 SDS-PAGE겔의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. A는 웨스턴블롯 결과 이미지를 나타낸다(M; 마커, I; 불용성 단백질 분획, 및 S; 가용성 단백질 분획) B는 정제된 분획은 GFP로 인하여 녹색을 나타내며, 이는 육안 검사를 통한 정제에 도움이 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
1: 재조합
보툴리늄
독소 단백질
컨스트럭트의
제작
본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 컨스트럭트는 도 1 및 2에 나타낸 것과 같다.
도 1에 따르면, 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 컨스트럭트는 GFP-HS1, LC(light chain), 및 HC(heavy chain)를 포함한다.
상기 GFP-HS1은 8x His 태깅된 녹색 형광단백질로, 이 GFP는 폴딩 및 안정성을 향상시킴으로써 높은 용해도를 증가시키기 위해 개발되었다. 상기 GFP-HS1은 고농도의 8 M 우레아에도 견딜 만큼 충분히 안정적이며 이의 폴딩 속도(folding rate)는 야생형의 것보다 2.3 배 빠르다. 따라서 이 GFP-HS1은 E. coli의 세포질에서 BoNT/A 발현의 용해도를 증가시키는 데 적합한 태그가 될 수 있다.
보툴리늄 신경독소 타입 A(Botulinum neurotoxin type A, BoNT/A)는 Clostridium botulinum으로부터 생산되는 독소로 총 150 kDa의 단백질이며, 약 50 kDa의 경쇄(light chain, LC) 및 약 100 kDa의 중쇄(heavy chain, HC)로 두개의 서브 유닛을 포함한다. 상기 LC는 실제 독소이고, 상기 HC는 타겟에 결합하여 HC의 아미노 말단 영역에 의해 LC를 세포질 내로 변위시키는 역할을 한다.
도 1에 나타낸 표적 유전자 카세트는 pQE80-L 벡터에 클로닝 되었다. 상기 pQE80-L 벡터는 낮은 복사수를 가지고 적절한 폴딩을 돕는다. 표적 유전자 카세트는 EcoRI 및 SalI 사이트로 클로닝 되었다.
도 1의 다이어그램에 표시된 유전자 카세트는 N-말단부터 GFP-HS1, 링커 서열(GGSGGT), TEV (Tabacco Etch Virus) 프로테아제 부위(ENLYFQG)가 융합되어 있으며, LC 및 링커 서열(GSGG)이 뒤에 온다. 여기에 다시 TEV 프로테아제 부위 및 HC가 뒤따른다. 상기 표적 유전자 카세트는 완전독소(holotoxin)로서 단백질을 발현하는데 사용되며 이는 매우 안전하고 BL3 시설을 필요로 하지 않는다.
상기 본 발명의 표적 유전자 카세트의 서열은 도 2에 나타내었다.
도 2의 서열은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소(BoNT/A)의 융합 단백질 서열을 나타낸다. 녹색 바탕은 8X his로 태깅된 N-말단의 GFP-HS1 서열을 나타내고, EcoRI 절단 부위가 pQE80-L 벡터로 클로닝 되는데 사용되었다. GFP에 이어, 링커 서열(GGSGGT)이 볼드체로 강조되었으며, KpnI 절단 부위와 뒤따르는 TEV 프로테아제 절단 부위(ENLYFQG)는 빨간 바탕으로 표시되었다. BoNT/A의 LC는 노란색 바탕으로 표시되었으며, 링커(GSGG)와 TEV 프로테아제 절단 부위(ENLYFQG)가 뒤따른다. 마지막으로 BoNT/A의 HC는 청록색(cobalt cyan) 바탕으로 표시되었고, 그에 앞서는 링커(GGSGGS)는 볼드체로 표시되었으며, 이황화 결합 형성을 위한 시스테인들은 빨간색 볼드체로 표시되었다. SalI 절단 부위는 마지막에 위치한다. 단백질 서열 내에 표시된 모든 제한 효소 부위는 도 1에 표시되었다.
실시예
2: 재조합
보툴리늄
독소 단백질의 발현 및 정제
GFPhs-Link-TEV-BoNT/A/pQE80L 콘스트럭트를 BL21로 형질 전환시키고 Luria Britani (LB) 배지에서 발현시켰다. 간단히 설명하면, 오버 나이트로 배양시킨 형질전환된 BL21 배양액의 1 %를 LB에 접종하고 0.1 mM IPTG에 의해 단백질 생산을 스위치 온하고 25 ℃에서 5 시간 동안 발현하였다. 세포를 수확하고 단백질을 추출하였다. 생산된 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 된 분획은 녹색을 명확하게 나타내었고 식별하기 쉬웠으며, 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE가 수행되었다. 쿠마시 염색 젤은 표적 단백질의 95 % 순도를 보였다. 단백질을 추출 및 정제하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
50 ㎖의 배양 펠렛을 5 ㎖의 용해 완충액(lysis buffer) (8 M 우레아, 50 mM 이미다졸, 500 mM NaCl pH 7.4를 함유하는 20 mM 인산 나트륨)에 현탁시키고 세포를 용해시켰다. 용해성 단백질(soluble protein)을 추출하여 FPLC를 사용하여 Ni-NTA 칼럼에 로딩하였다. Ni-NTA 칼럼에 결합된 표적 단백질은 이미다졸을 사용하여 용출되었고, 용출된 분획은 녹색으로 나타났다.
도 4에서, SDS-PAGE 는 정제 후 179 kDa의 표적 단백질(빨간색 화살표로 표시), 부분적으로 생성된 표적 단백질(파란색 화살표로 표시) [S; 용해성 단백질 추출물(soluble protein extract), I; 불용성 단백질 추출물(insoluble protein extract), TCP; 전체 세포 단백질(total cell protein), F1; Ni-NTA로부터 정제 된 분획, 및 M; 분자량 마커(molecular weight marker)]. 표적 mRNA와 단백질의 크기가 매우 크기 때문에 부분 생성물 (파란색 화살표)이 세포에서 생성되었다. 이것은 본 발명의 표적 유전자의 크기가 매우 커서 불완전하게 전사가 되었기 때문에 발생된 것이다.
상기 부분적으로 생성된 재조합 단백질은 GFP에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 추가로 확인되었다. 블롯은 도 5의 A에서 화살표로 표시된 179 kDa 및 기타 부분적으로 생성 된 단백질에서 표적 단백질을 명확하게 나타내었다. (블롯에서, M; 마커, I; 불용성 단백질 분획, 및 S; 가용성 단백질 분획)
도 5의 B에서, 정제된 분획물은 GFP로 인해 녹색을 나타내었고, 이는 육안 검사에 의한 정제를 돕는다. 정제된 분획을 모아 물에 투석 하였다. 동결 건조를 수행하여 단백질을 농축시켰다. 이 단계까지는 BL3 시설에 대한 요구 사항이 없으며 독소가 활성을 갖지 않기 때문에. 생산 설비에서 상당한 비용을 절감할 수 있다.
실시예
3: 재조합
보툴리늄
독소 단백질의 절단 및 활성화
농축된 재조합 BoNT/A 단백질을 20 mM Tris pH 7.5로 현탁시키고 제조 프로토콜에 따라 20 ℃에서 밤새 TEV 프로테아제 (Thermo Scientific, USA)로 절단(digest)시켰다. 절단은 BL3 시설에서 수행되었으며 이후 모든 실험은 BL3 시설에서 수행되었다. 절단 여부는 SDS-PAGE로 확인 하였다. SDS-PAGE 분석 결과, TEV 프로테아제에 의해 전장 BoNT/A가 분해되어 재조합 BoNT/A의 LC 및 HC 단편으로부터 GFP를 제거함을 명백히 보여 주었다. LC 및 HC 단편은 다이설파이드 결합에 의해 결합 되었기 때문에, 전체 길이의 활성 BoNT/A가 생성된다. TEV 프로테아제 및 GFPhs1은 100 kDa 컷오프 막에 의해 제거되었다. TEV와 GFPhs1은 둘 다 27 kDa 였으므로 차단막에서 여과된다. GFP가 제거된 150 kDa의 표적 재조합 BoNT/A를 정제하고 Bradford 분석법을 사용하여 정량 하였다.
실시예
4: 재조합
보툴리늄
독소 단백질의 활성 확인
정제된 재조합 BoNT/A를 PBS에 현탁시키고 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 약 95 %로 확인 하였다. 정제 된 단백질을 추후 사용시까지 -70 ℃에서 동결시켰다. 재조합 BoNT/A의 LD50은 마우스를 통한 바이오어세이(bioassay)에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, 1XPBS에 현탁 된 재조합 BoNT/A의 단계 희석물을 약 14 내지 16 g의 CS57BL/6 마우스에 주사 하였다(표 1). 재조합 BoNT/A를 희석시키고 희석 배수당 3 마리의 마우스에 복강 내 주사 하였다 (1 회 주입 당 0.5 ml). 1 마리의 마우스는 음성 대조군으로서 작용하였고, 1X PBS 단독으로 주사 하였다. 모든 생쥐를 4 일간 관찰하고 보툴리누스 중독 또는 사망률을 기록했다. 결과는 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 20 pg를 투여한 그룹에서는 독소 투여 후 24 또는 48 시간 후에 마우스가 폐사하였다. 그러나 15 pg 를 투여한 그룹에서는 투여 24 시간 후에 임상증상을 나타내었으나, 투여 48 시간 후에는 회복되었다. 본 실시예에서는 정확한 LD50 를 계산하지 않았으나, 재조합 BoNT/A의 LD50은 약 20 pg/마우스가 될 것이다. 또한 20 pg보다 높은 용량으로 투여시 더 높은 폐사율을 나타낼 것임은 자명하다. 이 결과는 재조합 BoNT/A의 활성이 완전하게 기능한다는 것을 나타낸다. 1L LB 배양물에서 생산된 재조합 활성 BoNT/A의 총 수율은 부분적으로 번역 된 단백질을 고려하지 않으면 약 43±2 mg 이다. 그러나 BoNT/A의 완전 번역 빈도를 늘림으로써 위에서 기술한 방법을 더욱 최적화하면 더 높은 수율을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명자들은 상기 실시예 및 결과로부터 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 제조 기술이 상술한 고순도 활성 BoNT 분자를 상업적 수준으로 생산할 수 있을 정도로 간단하면서도 강력하다는 것을 분명히 입증하였다.
즉, 본 발명자들은 공학적으로 조작된 고도로 폴딩가능한 GFP-hs1(highly foldable GFP-hs1)의 도움으로 BoNT/A를 용해성 폴딩 단백질(soluble folded protein)로 성공적으로 발현하였다. 또한 TEV 프로테아제를 GFPhs1을 제거하기 위해 정제된 표적 분자를 절단(digest)시키고, 다이설파이드 결합에 의해 보전된 BoNT/A의 LC와 HC 도메인 사이의 닉을 만들었다. 마지막으로, 본 발명자들은 또한 마우스 바이오어세이를 통하여 본 발명의 재조합 BoNT/A가 활성화되었음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-GFPhs1-Link-TEV-BoNT/A
<400> 1
Met His His His His His His His His Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu
1 5 10 15
Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
20 25 30
Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn
35 40 45
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
50 55 60
Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe
65 70 75 80
Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
85 90 95
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp
100 105 110
Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
115 120 125
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
130 135 140
Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Lys Val Tyr
145 150 155 160
Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile
165 170 175
Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
180 185 190
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
195 200 205
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Leu Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
210 215 220
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His
225 230 235 240
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Thr Glu Asn Leu
245 250 255
Tyr Phe Gln Gly Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp
260 265 270
Pro Val Asn Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly
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<223> BoNT/A-HC
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485 490 495
Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr
500 505 510
Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met
515 520 525
Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile
530 535 540
Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys
545 550 555 560
Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe
565 570 575
Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn
580 585 590
Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His
595 600 605
Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His
610 615 620
Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn
625 630 635 640
Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile
645 650 655
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr
660 665 670
Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
675 680 685
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met
690 695 700
Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe
705 710 715 720
Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn
725 730 735
Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg
740 745 750
Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala
755 760 765
Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys
770 775 780
Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln
785 790 795 800
Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn
805 810 815
Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu
820 825 830
Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp
835 840 845
Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu
850 855
Claims (11)
- 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서,
(a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질. - 제 1 항에 있어서, 상기 태깅 단백질은 4 내지 10개의 폴리(히스티딘), 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 또는 글루타치온 S-전이효소(GST)인, 융합단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 적색 형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 노란색 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 또는 청록색 형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP)인, 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 또는 (e)의 프로테아제는 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(Factor Xa), HRV3C 프로테아제, TEV 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease), 또는 트롬빈(thrombin)인, 융합단백질.
- 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서,
(a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 인코딩하는 염기서열을 포함하는 분리된 핵산 분자. - 제 5 항의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 및 재조합바이러스로 구성된 군에서 선택된 것인, 재조합 발현벡터.
- 제 6 항 또는 제 7 항의 재조합 발현벡터를 포함하는, 숙주세포.
- 제 8 항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균, 효모, 곤충세포, 및 포유동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 숙주세포.
- (i) 제 9 항의 숙주세포를 융합단백질 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(ii) 생산된 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조방법. - 제 10 항에 있어서,
(iii) 회수된 융합단백질에 프로테아제를 처리하여 융합단백질의 (c) 및 (e)의 프로테아제 인식 서열을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.
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