KR20200024734A - 신경세포 표적용 단백질 조성물 - Google Patents

신경세포 표적용 단백질 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BoNTs의 RBD 또는 A2 시퀀스와 EEPs를 포함함으로써 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물, 조성물의 제조방법 및 이를 이용한 약학적 조성물, 뉴런 표시용 조성물, 및 화장료 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에서 제조된 재조합 조성물은 생체뉴런 내·외부에서 특이적으로 생리활성 또는 표시 기능을 갖으면서도 단백질의 구조를 단순화하여 분자량을 줄인 것으로 생산과정의 단순화를 도모할 수 있어 경제적이고, 작은 분자량에 의해 항체, 항원 반응으로부터 더 자유로울 수 있으며, 나아가, 화장료로 사용되는 경우 분자의 크기가 작아 흡수율이 증대된다는 이점이 있어 관련된 의료사업분야 및 화장품 산업 분야 등에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신경세포 표적용 단백질 조성물{A composition comprising neuro-targeted proteins}
본 발명은 신경세포 표적용 단백질 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 신경세포(뉴런)을 특이적으로 인식하는 재조합 단백질 조성물에 관한 것으로, 신경-활성 물질에 뉴런을 특이적으로 인식하고 뉴런 내 소포를 탈출하는 서열을 결합시킴으로써, 신경-활성 물질 재조합 단백질이 뉴런을 특이적으로 인식하고, 뉴런 내의 세포질로 이동하여 활성을 나타내는 방법, 이를 포함하는 조성물, 제조 방법, 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin, BoNT)는 신경세포(뉴런, neuron)를 인식하여 결합하는 기능을 가진 부분(receptor binding domain, RBD)을 포함하고 있다. 상기 BoNT 단백질의 RBD는 시냅스 전막의 당지질과 결합하는 아미노산 시퀀스와 시냅스 전막 상에 존재하는 단백질과 특이적으로 결합하는 아미노산 시퀀스 중 전자만을 포함하거나 모두 포함하고 있다. 한편, A타입 BoNT(BoNT/A)의 엔도사이토시스(endocytosis)는 RBD 내의 A2 펩티드(1040-1053, 13개의 특정 아미노산으로 구성)가 시냅스 전막 상에 존재하는 시냅스 소포 당단백질 2C(synaptic vesicle glycoprotein 2C, SV2C)의 루미날 도메인(luminal domain)에 특이적으로 결합함으로써 가능하다 알려져 있으며, 상기 결합은 다른(B-G) 타입의 BoNT와 시냅스 전막 단백질과의 결합에 비해 강력할 것으로 예상되고 있다.
세포 내 기능을 보일 것이라 기대되는 특정 고분자물질, 즉, 활성 물질(active material)은 시냅스 전막에 부착되어 세포 내로 함입되어 흡수될 때는 시냅스 전막으로부터 소포를 형성하여 흡수된다. 해당 고분자가 세포 내 기능을 나타내기 위해서는 소포 내강으로부터 세포질로 탈출하는 과정(소포탈출)이 필요하다. 한편, 소포를 탈출하여 세포질로의 이동을 돕는, 바이러스, 박테리아, 동물, 식물 등으로부터 자연유래되거나 또는 때때로 기능성을 향상시키기 위해 아미노산 시퀀스를 합성/변형한 다양한 펩티드들(endosomal escape peptides, EEPs)이 많은 연구들을 통해 알려져 있다(일반적으로 30개 이하의 아미노산).
한편, 알츠하이머, 보툴리누스 중독증, 통증, 다한증, 피부주름 등 신경계통 이상으로 인해 발생하는 다양한 병증/질환에 대한 다양한 치료법이 존재하지만, 기존의 치료법에서 사용되고 있는 많은 약물/물질들은 신경세포에서만 특이적으로 작용하기 보다는 광역적인 투여를 통해 치료효과를 기대하는 것이 대부분이다. 또한 의료/과학분야에서는 신경세포만을 식별하여 표시하는 기술이 요구되고 있지만, 신경세포만을 특이적으로 식별할 수 있는 기존의 기술은 많지 않고 그 활용이 제한적이다. 한편 단백질 의약품 분자 크기의 증가는 체내의 항원·항체 반응을 일으킬 가능성을 높이기 때문에 치료효과를 감소시킬 가능성이 매우 높을 뿐만 아니라, 피부 층을 통한 치료법에서는 분자 크기가 낮을수록 흡수율이 증대되므로 치료용 약물의 분자 크기를 감소시켜야 할 필요성이 제기된다. 따라서 신경세포를 특이적으로 인식하여 해당 세포의 세포질로 이동할 수 있으면서도 분자량이 작은, 단백질 등의 물질이 의료/과학계에서 필히 요구되나 이에 관한 결과물의 발표는 미흡한 실정이다.
대한민국특허등록공보 10-0852822
본 발명자들은 신경세포를 특이적으로 인식하면서 해당 세포질로 효과적으로 이동시킬 수 있는 작은 분자 크기의 단백질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, BoNT의 RBD 또는 BoNT/A의 A2 펩티드와 다양한 저분자 EEP들을 도입함으로써 종래의 문제점을 개선함과 동시에 신경세포뿐만 아니라 생체 내에서도 기존의 치료법에 준하는 효능을 띈다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, Neuro-active material과 EEP, BoNT/A-A2를 하나 이상 포함함으로써 신경세포를 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물에는 하기 구조식 1로 표시되는 물질, 구조식 2로 표시되는 물질, 및 구조식 3으로 표시되는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함될 수 있으나 순서는 무관하다.
[구조식 1]
N-terminal C-terminal
(Neuro-active material)(EEP1).....(EEPn)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
[구조식 2]
N-terminal C-terminal
(EEP1).....(EEPn)(Neuro-active material)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
[구조식 3]
N-terminal C-terminal
(EEP1)...(EEPn1)(Neuro-active material)(EEP'1)...(EEP'n2)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
Neuro-active material : 신경세포에서 작용하도록 유도된 물질
EEP : 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)
BoNT-RBD : 보툴리눔 신경독소의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain of botulinum neurotoxin type A)
BoNT/A-A2 : 보툴리눔 신경독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)
n, n1, n2는 각각 독립적으로 1 이상의 수이며, EEP는 각각 독립적으로 한번 이상 반복될 수 있다. 즉, [구조식 1]과 [구조식 2]에서 임의의 수 i, j(1≤i≤n; 1≤j≤n)에 대하여 EEPi, EEPj는 같거나 다를 수 있으며, [구조식 3]에서 임의의 수 i, j(1≤i≤n1 or n2; 1≤j≤n1 or n2)에 대하여 EEPi, EEPj, EEP'i, EEP'j는 같거나 다를 수 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물을 유효성분으로 포함하는, 신경병증 예방/치료 또는 표시용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는 신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되어 있는 신경세포 표적용 단백질의 신경-활성 물질은 신경병증 치료용 물질이며, 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 경쇄, 저분자 신경-활성 물질, 저분자 신경-활성 물질을 함유하는 담체, 또는 이의 조합 등일 수 있으나, 신경병증을 치료하는데 사용되고 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 신경병증(neuropathy)은 바람직하게는 사시, 안검경련, 성대장애, 사경, 심근장애, 궤양, 위산역류질환, 식욕감소, 췌장질환, 튼 살, 절박성 요실금, 치열, 소아마비, 근육통, 엉덩이 기형, 다한증, 허리통증, 경부통, 만성두통, 뇌신경장애 등이나, 말초신경계의 기능적 장애 및 병적 변화를 나타내는 질병이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 화장료 조성물에 포함되어 있는 신경세포 표적용 단백질의 신경-활성 물질은 바람직하게는 주름 방지를 위해 사용되는 물질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 경쇄, 저분자 신경-활성 물질, 저분자 신경-활성 물질을 함유하는 담체, 또는 이의 조합 등일 수 있으나, 미용 용도로 사용되고 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는 신경계 뉴런 표시용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 신경계 뉴런 표시용 조성물에 포함되어 있는 신경세포 표적용 단백질의 신경-활성 물질은 바람직하게는 뉴런을 선택적으로 발색시키는 물질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 형광 단백질, 저분자 형광 화합물, 저분자 형광 화합물을 함유하는 담체, 미세 반도체 입자, 또는 이의 조합 등일 수 있으나, 뉴런을 관찰할 수 있도록 하는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 신경세포 표적용 단백질은 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)가 하나 이상 추가로 결합된 형태일 수 있으며, 상기 엔도소말 이스케이프 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 76 내지 98으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 엔도소말 이스케이프 펩타이드가 결합된 형태에는 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어, 상기 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인은 바람직하게는 서열번호 99 내지 115으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 116 내지 120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 신경-활성 물질은 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 경쇄이며, 상기 보툴리눔 신경독소 경쇄는 서열번호 1 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 저분자 신경-활성 물질은 플라보노이드(flavonoid), 스테로이드(sterioid), 알칼로이드(alkaloid), 스틸베노이드(stilbenoid), 찰코노이드(chalconoid), 컬큐민(curcumin), 베라파밀(verapamil), 6-쇼가올(6-shogaol), 브로모데옥 시우리딘(bromodeoxyuridine), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 요오드데옥시우리딘(iododeoxyuridine), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 레티노산(retinoic acid), 파클리탁셀(paclitaxel), 카르보플라틴(carboplatin), 아이소나이아지드(isoniazid), 레보도파(levodopa), 카르무스틴(carmustine) 등일 수 있으며, 상기 플라보노이드에는 Quercetin, Fisetin, Myricetin, Luteolin, Laricitrin, Syringetin, Apigenin, Amontoflavone, Catechin 등이 포함될 수 있으며, 상기 스테로이드에는 Tetrahydrodeoxycorticosterone, Androstane, 3α-Androstanediol, Cholestane, Eltanolone, Brexanolone, Pregnenolone sulfate, Epipregnanolone, Ganaxolone, Isopregnanolone, Dehydroepiandrosterone, Dehydroepiandrosterone sulfate, 24(S)-Hydroxychlesterol, Pregnenolone, Progesterone, Estradiol, Corticosterone, Allopregnanolone, Aloradine, 3β-Metholxypregnenolone 등이 포함될 수 있으며, 상기 알칼로이드에는 Tryptoline, Mellpaladine, β-Carboline 등이 포함될 수 있으며, 상기 스틸베노이드에는 Resveratrol, Piceatannol 등이 포함될 수 있으며, 상기 찰코노이드에는 Butein이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 형광 단백질은 바람직하게는 서열번호 71 내지 75으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 저분자 형광 화합물은 크산틴 유도체(xanthene derivatives), 시아닌 유도체(cyanine derivatives), 스쿠아레인 유도체(Squaraine derivatives), 스쿠아레인 로탁산 유도체(Squaraine Rotaxane derivatives), 나프탈렌 유도체(naphthalene derivatives), 쿠마린 유도체(coumarin derivatives), 옥사디아졸 유도체(oxadiazole derivatives), 안트라센 유도체(anthracene derivatives), 피렌 유도체(pyrene derivatives), 옥사진 유도체(oxazine derivatives), 아크리딘 유도체(acridine derivatives), 아릴메틴 유도체(arylmethine derivatives), 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivatives) 등 일 수 있으며, 상기 유도체는 화합물의 일부를 변형시켜 얻어지는 유사한 화합물을 총칭하는 말로서, 크산틴 유도체에는 Fluorescein, Rhodamine, Oregon green, Eosin, Texas red 등이 포함될 수 있으며, 시아닌 유도체에는 Cyanine Indocarbocyanine, Oxacarbocyanine, Thiacarbocyanine, merocyanine 등이 포함될 수 있으며, 스쿠아레인 유도체에는 Seta dyes, Square dyes 등이 포함될 수 있으며, 스쿠아레인 로탁산 유도체에는 SeTau dyes 등이 포함될 수 있으며, 나프탈렌 유도체에는 Densyl/prodan derivatives 등이 포함될 수 있으며, 옥사디아졸 유도체에는 Pyridyloxazole, Nitrobenzoxadiazole, Benzoxadiazole 등이 포함될 수 있으며, 안트라센 유도체에는 Anthraquinones, DRAQ5, DRAQ7, CyTRAK Orange 등이 포함될 수 있으며, 피렌 유도체에는 Cascade blue 등이 포함될 수 있으며, 옥사진 유도체에는 Nile red, Nile blue, Cresyl violet, Oxazine 170 등이 포함될 수 있으며, 아크리딘 유도체에는 Proflavin, Acridine orange, Acridine yellow 등이 포함될 수 있으며, 아릴메틴 유도체에는 Auramine, Crystal violet, Malachite green 등이 포함될 수 있으나, 저분자 형광 화합물의 유도체라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 미세 반도체 입자는 바람직하게는 퀀텀닷(quantum dot)이나, 세포 내에서 세포를 관찰할 수 있도록 하는 표지 물질이라면 제한이 없다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 담체는 바람직하게는 유기미세입자, 무기미세입자, 자가조립구조체(self-assembled structure) 등의 담체(전달) 시스템일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 금 나노입자(gold nanoparticle), 철 나노입자(magnetic nanoparticle), 실리카 나노입자(silica nanoparticle), 라텍스 나노입자(latex nanoparticle), 지질 나노입자(lipid nanoparticle), 탄소 나노구조체(carbon nanoplate/nanotube), 리포솜(liposome), 나노디스크(nanodisc) 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경병증의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 신경병증 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포 표적용 단백질의 신경병증 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물은 신경계만 특이적으로 식별하여 작용하는 능력을 갖으면서도 신경세포질내 함입이 가능하므로, 신경계 이상으로 유발된 다양한 병증의 치료(경감/개선)용도와 신경세포만을 가시적으로 표시하는 용도로의 사용이 기대된다. 또한 구조를 단순화하여 분자량을 줄인 것으로, 생산과정의 단순화를 도모할 수 있어 경제적이고, 작은 분자량에 의해 체내 항체, 항원 반응으로부터 더 자유로울 수 있으며, 나아가 화장료로 사용되는 경우 분자의 크기가 작아 흡수율이 증대된다는 이점이 있으므로, 관련된 의료사업분야 및 화장품 산업 분야 등에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서의 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물의 일례로서 재조합 보툴리눔 신경독소가 뉴런 내로 흡수되고, 세포질로 이동한 후 SNARE 복합체 형성을 저해하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 2b는 BoNTs LC, EEP, 및 BoNT/A-A2 단백질의 가능한 결합구조를 예시한 것이다.
도 3은 BoNTs LC를 생산하는데 사용된 클로닝 벡터 맵의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 경쟁적 엘라이자(ELAISA) 기법을 사용하여 노르에피네프린 농도를 측정하는 실험방법을 나타낸 것이다.
도 5는 재조합 보툴리눔 신경독소가 분화된 PC12 세포에서 노르아드레날린 방출량에 미치는 영향을 실험한 결과이다.
도 6은 재조합 보툴리눔 신경독소의 국소 근육약화효능을 확인하기 위해 마
우스를 대상으로 한 디지트 어브덕션 스코어(digit abduction score; DAS) 어세이(assay) 결과이다.
도 7은 본 발명에서의 뉴런을 특이적 인식하는 조성물의 일례로서의 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 포함한 뉴런 표시용 조성물들을 생산하기 위한 유전자의 모식도(도 7B)와 peptide A2' 또는 peptide A2에 결합하는 수용체(synaptic vesicle glycoprotein 2C, SV2C)를 생산하기 위한 유전자의 모식도(도 7C)를 나타낸 것이다(도 7A, peptide A2'와 peptide A2의 아미노산 서열).
도 8은 도 7의 EGFP를 포함하는 뉴런 표시용 조성물을 생산하는데 사용된 클로닝 벡터 맵(도 8A)과 SV2C를 생산하는데 사용된 클로닝 벡터 맵(도 8B)의 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 도 7의 EGFP를 포함하는 뉴런 표시용 조성물과 SV2C을 발현 및 정제 후의 SDS-PAGE젤 전기영동 결과이다.
도 10은 도 7의 EGFP를 포함하는 뉴런 표시용 조성물과, SV2C가 결합되어 있는 bead와의 반응 후의 반응물의 SDS-PAGE젤 전기영동 결과이다.
도 11은 도 7의 EGFP를 포함하는 뉴런 표시용 조성물을 처리한 분화된 PC12 세포의 공초점 레이저 형광 현미경 사진이다.
본 발명자들은 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 기존 BoNT(botulinum neurotoxin) 단백질의 RBD(receptor binding domain) 또는 BoNT/A의 A2 펩티드와 뉴런 내 소포 탈출이 가능토록 다양한 저분자 EEP(endosomal escape peptide)들을 신경-활성 물질에 도입함으로써 신경계만 특이적으로 식별하여 작용하는 능력을 가지면서도 생체 신경계를 대상으로 우수한 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment Protein Receptor; SNAP Receptor) 복합체 형성 저해용 재조합 보툴리눔 신경독소를 생산하기 위한 플라스미드의 제조방법 및 상기 플라스미드를 이용한 재조합 보툴리눔 신경독소 생산방법을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 분화된 PC12 세포를 이용하여 노르에피네프린 방출량을 분석한 결과 재조합 보툴리눔 신경독소가 노르에피네프린 방출을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스를 이용하여 디지트 어브덕션 스코어(digit abduction score; DAS) 어세이(assay)를 수행한 결과 재조합 보툴리눔 신경독소가 근육약화효능을 가지고 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 뉴런 특이적 표시 기능을 지닌 녹색형광단백질을 생산하기 위한 플라스미드의 제조방법 및 상기 플라스미드를 이용한 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질의 생산방법을 확인하였다(실시예 5 및 6 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 제조된 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질과 뉴런 세포막에 존재하는 SV2C(synaptic vesicle glycoprotein 2C) 사이에 결합력이 있는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 분화된 PC12 세포와 공초점 레이저 형광 현미경(confocal laser fluorescence microscope, CLFM)을 이용하여 얻은 이미지의 결과 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질이 상기 세포에 잘 부착되고 세포 내로 잘 흡수되는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
이에, 본 발명은 하기 구조식 1로 표시되는 물질, 구조식 2로 표시되는 물질, 및 구조식 3으로 표시되는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 뉴런을 특이적 인식하고 소포 탈출이 가능한 조성물을 제공한다.
[구조식 1]
N-terminal C-terminal
(Neuro-active material)(EEP1).....(EEPn)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
[구조식 2]
N-terminal C-terminal
(EEP1).....(EEPn)(Neuro-active material)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
[구조식 3]
N-terminal C-terminal
(EEP1)...(EEPn1)(Neuro-active material)(EEP'1)...(EEP'n2)(BoNT-RBD 또는 BoNT/A-A2)
Neuro-active material : 신경-활성 물질, 신경세포에서 작용하도록 유도된 물질, 신경세포에서 활성을 나타내는 단백질
EEP : 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)
BoNT-RBD : 보툴리눔 신경독소의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain of botulinum neurotoxin type A)
BoNT/A-A2 : 보툴리눔 신경독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)
n, n1, n2는 각각 독립적으로 1 이상의 수이며, EEP는 각각 독립적으로 한번 이상 반복될 수 있다. 즉, [구조식 1]과 [구조식 2]에서 임의의 수 i, j(1≤i≤n; 1≤j≤n)에 대하여 EEPi, EEPj는 같거나 다를 수 있으며, [구조식 3]에서 임의의 수 i, j(1≤i≤n1 or n2; 1≤j≤n1 or n2)에 대하여 EEPi, EEPj, EEP'i, EEP'j는 같거나 다를 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment Protein Receptor; SNAP Receptor)" 란 효모 및 포유류 세포에 존재하는 60개 이상의 멤버로 구성된 거대 단백질 수퍼패밀리로, SNARE 단백질의 주된 역할은 소포 융합(vesicle fusion)을 매개하는 것이다. 즉, 리소좀과 같은 기관(compartmets)에 부착된 이들은 표적 막과 소포의 융합을 매개한다. 구체적인 예로서, SNARE는 신경세포에서 시냅스전막(presynaptic membrane)과 시냅스소포(synaptic vesicle)의 결합(docking)에 관여한다.
한편 근육의 이완과 수축을 조절하기 위하여 근육의 상층에는 신경근육 접합부(neuromuscular junction)가 있으며, 이 신경 말단(nerve terminal)에는 시냅스 소포가 장전되어 있다. 근육들은 일종의 신경소포 내부에서 전달되는 신경전달물질의 메시지를 받아 수축하게 되며, 이와 같이 신경전달물질들이 방출되려면, SNARE 단백질들이 복합체를 형성함으로써 신경물질들이 근육과 도킹해야 된다. 구체적으로, 신경전달물질의 배출 시에 신경전달물질을 담고 있는 시냅스 소포는 시냅스전막과 융합되어야 두 경계 간의 통로가 형성될 수 있으며, 이 때 막 융합의 근원적인 힘은 3종의 단백질 복합체로 존재하는 SNARE에 의해 제공된다. 특히, 시냅스 소포와 시냅스전막 간의 융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리게 된다. 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는, 신탁신(Syntaxin) 1a 단백질과 SNAP-25 단백질의 복합체인 t-SNARE 복합체와, 소포에 부착되어 있는 v-SNARE가 관여하게 되는데, 이들 SNARE 단백질은 꽈배기처럼 꼬여 있게 된다.
상기 막 융합 시에는 당해 분야에 널리 알려져 있는 바와 같이 지질이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 물리적으로 서로 강하게 밀어내고 있으므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들 간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이때 막들 간의 반발력을 이겨낼 정도의 강한 힘을 만들어 내는 것이 SNARE 단백질이다. 즉 SNARE 복합체의 형성은 막 간 반발력을 극복하는 힘의 원천이며, 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포 외 배출작용(exocytosis)의 핵심 현상인 것이다.
일례로, 모공은 얼굴 피부에 전체적으로 고르게 분포하나, 특히 코와 볼 부위는 육안으로 식별할 수 있을 정도로 많고, 모공의 양상은 성별, 유전적, 노화, 여드름, 만성 자외선 노출 등의 내인성과 외인성 요인에 의해 개인차가 있다. 모공이 넓어지는 이유는 피지가 과도하게 분비되거나 피부노화가 시작되면서 모공 벽을 지지하고 있던 콜라겐 섬유와 탄력 섬유가 변성, 감소함에 따라 피부 탄력이 없어지고 쳐지기 때문이다. 털에 붙어있는 근육(입모근)의 수축 또는 이완은 교감신경과 부교감신경의 지배를 받기 때문에, 모공은 신경조절에 의해 축소 또는 확대될 수 있으며 교감신경은 근육에서 약간 떨어져 있으면서 모공 축소 작용을, 부교감 신경은 근육 가까이에 있으면서 모공 확대 작용을 한다. 선택적으로 부교감 신경을 억제하면 보상 작용으로 교감신경이 작용하여 털에 붙어 있는 근육을 수축시켜 모공이 축소된다.
반면에, SNARE 접합과 꼬임 과정이 완전히 완료되지 않으면 막 융합이 실패하고 그에 따라 신경전달물질 방출이 이뤄지지 않아 결국 근육의 움직임이 없게 된다. 이 과정은 자주 사용하는 근육에 의하여 생성되는 주름의 생성을 예방하고 미리 만들어진 주름도 개선할 수 있음을 의미한다. 즉, SNARE 형성 억제 효능에 의하여 근육의 운동에 의한 주름의 생성을 억제하고 생성된 주름을 개선할 수 있다.
한편, 땀샘 주위를 감싸고 있는 근세포의 수축은 땀샘을 자극하여 땀이 방출되도록 하는 역할을 하고 있다. 이러한 땀샘 주위 근세포의 수축 또한 신경세포로부터의 신경전달물질 방출로부터 비롯된다. 근세포-신경접합부 상에서 과도한 신경전달물질의 방출은 과다한 땀 분비를 유발하게 되는데, 이러한 병증을 다한증(hyperhidrosis)이라 한다. 따라서 상기 근세포-신경접합부 상에 존재하는 뉴런 내의 SNARE 복합체 형성 저해는 다한증의 병증을 치료 또는 완화할 수 있다.
상기 SNARE를 표적으로 하는 대표적인 물질로는 보툴리눔 식중독(botulism) 및 파상풍(tetanus)을 유발하는 박테리아 신경독소(bacterial neurotoxin) 등이 있다. 예컨대, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 유래의 신경독소는 "보툴리눔 신경독소"로 알려진 약물의 주성분으로, 구체적으로, 보툴리눔 신경독소는 그 주성분인 신경독소가 신경세포에 존재하는 SNARE에 특이적으로 작용 후 복합체 형성을 저해하여 막 융합을 억제함으로써 신경전달물질의 방출을 차단한다. 이에 따라 근육의 움직임이나 교감 또는 부교감 신경계를 억제함으로써 상기와 같은 질환의 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin, BoNT) 단백질은 크게 약 100kDa의 중쇄(heavy chain; HC)와 신경세포 내에서 SNARE 복합체 형성 단백질을 절단하는 효소활성을 지니는 약 50 kDa의 경쇄(light chain; LC) 두 부분으로 나누어지며, 여기서 HC은 또다시 신경세포를 인식하여 결합하는 기능을 가진 부분(receptor binding domain, RBD)과 LC을 신경세포질로 이동시키는 기능을 가진 도메인(translocation domain)으로 나누어진다. 상기 신경독소 단백질은 단일 사슬로 박테리아에서 방출된 이후, 자체 프로테아제에 의해 두 사슬로 나눠지고 두 사슬은 이황화 결합을 통해 다시 연결되어 약 150 kDa 크기로 존재한다.
상기 BoNT 단백질의 RBD는 시냅스 전막의 당지질과 결합하는 아미노산시퀀스와 시냅스 전막 상에 존재하는 단백질과 특이적으로 결합하는 아미노산시퀀스 중 전자만을 포함하거나 모두 포함하고 있다. 전자와 시냅스 전막 당지질과의 결합(해리상수: 약 10-6-10-7 M)은 후자와 특정 시냅스 전막 단백질과의 결합(해리상수: 10-13-10-14 M)에 비해 비 특이적이며 훨씬 약한 결합력을 가진다고 알려져 있다. 한편 A타입의 BoNT의(BoNT/A) 엔도사이토시스(endocytosis)는 RBD 내의 A2 펩티드(1040-1053, 14개의 특정 아미노산으로 구성)가 시냅스 전막 상에 존재하는 시냅스 소포 당단백질 2C(synaptic vesicle glycoprotein 2C, SV2C)의 루미날 도메인(luminal domain)에 특이적으로 결합함으로써 가능하다 알려져 있으며, 상기 결합은 다른(B-G) 타입의 BoNT와 시냅스 전막 단백질과의 결합에 비해 강력할 것으로 예상되고 있다. 이러한 이유 등으로 인해 BoNT/A는 다른 타입의 BoNT들에 비해 신경세포에 더 빨리 들어간다는 것이 보편적 견해이다.
BoNT가 시냅스 전막에 부착되어 세포내로 함입되어 흡수될 때는 시냅스 전막으로부터 소포를 형성하여 흡수된다. BoNT가 SNARE 복합체 형성을 저해하기 위해서는 소포 내강으로부터 세포질로 탈출하는 과정이 필요하며 이때 소포로부터 세포질로 BoNT LC을 이동시키는 부분이 HC의 트렌스로케이션 도메인(translocation domain)이다. 소포 내 pH가 감소하면 상기 트렌스로케이션 도메인 내 알파-헬리시즈(α-helices)가 소포 막에 채널을 형성하게 되며, LC이 상기 채널을 통과하여 세포질 방향으로 이동한 후 HC과의 이황화결합이 끊어지면서 세포질 내에서 활성화된 형태로 존재하게 된다. 본 발명에서 제안하는 재조합 보툴리눔 신경독소 형태는 기존 보툴리눔 신경독소와 유사한 활성에 전제하므로, 상기 BoNT의 트렌스로케이션 도메인(translocation domain)과 유사한 기능(소포탈출)을 갖는 부분이 필요하다. 소포를 탈출하여 세포질로의 이동을 돕는 다양한 펩티드들(endosomal escape peptides, EEPs)은 주로 바이러스, 박테리아, 동물, 식물 등 자연유래로 알려져 있으며 때때로 기능성을 향상시키기 위해 아미노산 시퀀스를 합성/변형하여 사용된다. 상기 EEPs는 일반적으로 30개 이하의 아미노산으로 이루어져 있는 반면에, BoNT/A 트렌스로케이션 도메인의 아미노산 수는 435개 이므로, 기존 보툴리눔 신경독소의 트렌스로케이션 도메인을 대체하기 위한 목적으로 도입할 경우 기존 보다 훨씬 작은 분자크기의 보툴리눔 신경독소 미니어처를 기대할 수 있다.
본 발명에서 상기 BoNTs LC는 서열번호 1 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 EEP는 서열번호 76 내지 98로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 BoNT/A-A2는 서열번호 116 내지 120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment Protein Receptor; SNAP Receptor) 복합체 형성 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 신경병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경병증을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신경병증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 일일 투여량은 상기 조성물의 양을 기준으로 0.01 내지 10 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신경병증은 사시, 안검경련, 성대장애, 사경, 심근장애, 궤양, 위산역류질환, 식욕감소, 췌장질환, 튼 살, 절박성 요실금, 치열, 소아마비, 근육통, 엉덩이 기형, 다한증, 허리통증, 경부통, 만성두통 및 뇌신경장애로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 SNARE(Soluble Nethylameimide-sensitive factor Attachment Protein Receptor; SNAP Receptor) 복합체 형성 저해용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 주름방지 효과가 있을 수 있다.
피부의 모공은 얼굴 피부에 전체적으로 고르게 분포하며, 모공 내에 존재하는 털과 붙어있는 근육(입모근)에 의해 여닫음이 조절되고 해당 입모근의 수축 또는 이완은 각각 교감신경과 부교감신경의 지배를 받으며, 구체적으로, 부교감신경은 입모근 주위에 존재하여 모공의 확대 작용을 유도하고, 교감신경은 입모근과의 물리적 거리가 비교적 멀고 모공의 축소 작용을 유도한다. 따라서 선택적으로 모공근처에 존재하는 부교감 신경만을 억제하면 보상 작용으로 교감신경만이 작용하게 되어 털에 붙어 있는 근육을 수축시켜 모공이 축소될 수 있다. 이와 더불어 과도한 얼굴근육 운동에 의한 주름의 생성을 억제하고, 피부를 당겨지는 효과로 인해 생성된 주름을 개선할 수 있다. 기존 상용되는 보톡스 또한 해당 기작을 통해 피부미용을 목적으로 사용되고 있으며, 주름 및 모공 개선효과가 있음이 이미 확인되었다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 상기 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물 이외에, 상기 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존), 벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물의 함량은 전체 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 10 중량% 포함하며, 바람직하게는 0.005 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 3 중량% 포함할 수 있다. 상기 SNARE 복합체 형성 저해용 조성물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우, 피부주름 개선 효과를 기대하기 어려울 수 있으며, 10 중량%를 초과하는 경우, 조성물을 적절한 제형으로 제조하거나 장기 안정성의 확보에도 어려움이 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 뉴런 표시용 재조합 형광단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 뉴런 표시용 재조합 형광단백질은 녹색, 노란색, 청록색, 빨간색, 파란색형광단백질일 수 있으나, 상기 색으로 정의되지 않는 특정한 파장대의 형광을 발광하는 형광단백질일 수 있으며, 또한 단백질이 아닌 저분자 발광화합물일 수 있다.
본 발명에서 상기 뉴런 표시용 재조합 형광단백질은 실험적 또는 의학적 용도로 사용될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 재조합 보툴리눔 신경독소를 생산하기 위한 플라스미드의 제조
BoNTs LC 단백질을 생산하기 위한 플라스미드(1)의 제조는 pET28b 벡터를 이용하여 T4 DNA 폴리머레이즈(polymerase)를 이용한 방법으로 클로닝 하였다. 상기 클로닝 과정 중 사용된 벡터맵은 도 3과 같으며, 인설트(insert) DNA 시퀀스는 하기 표 1의 아미노산 시퀀스를 바탕으로 https://sg.idtdna.com/CodonOpt 내 Codon optimization tool의 코돈최적화(E. coli 기준) 과정을 통해 하기 표 2에 기재된 DNA 서열을 이용하였다.
샘플 서 열 비고
(1) MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPF (서열번호 121) 437 amino acids
(50 kDa)
(2) MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPFRGSVVTTNIYLNST(서열번호 122) 451 amino acids
(52 kDa)
(3) MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPFGLFDIIKKIAESFRGSVVTTNIYLNST(서열번호 123) 464 amino acids(53 kDa)
(4) MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPFHHHHHHHHHHRGSVVTTNIYLNST(서열번호 124) 461 amino acids(53 kDa)
(5) MGLFDIIKKIAESFPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPFHHHHHHHHHHRGSVVTTNIYLNST(서열번호 125) 474 amino acids
(54 kDa)
(6) MGLFDIIKKIAESFHHHHHHHHHHPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHDVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAEHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDVASTLNKAKSIIGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVNFFKVINRKTYLNFDKAVFRINIVPDENYTIKDGFNLKGANLSTNFNGQNTEINSRNFTRLKNFTGLFEFYKLLCVRGIIPFRGSVVTTNIYLNST(서열번호 126) 474 amino acids
(54 kDa)
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
보다 자세하게는, 최초 PCR(polymerase chain reaction)은 pET28b와 BoNTs LC 인설트의 양 말단 15 bp에 상호보완적으로 디자인된 프라이머들을 이용해 수행되었다. 그리고 PCR 완료 후에는 셀프-라이게이션(self-ligation) 방지를 위해 37 ℃에서 1 시간 동안 Dpn1 용액을 처리하여, DNA 외의 PCR 산물을 제거하였다. PCR을 통하여 증폭된 pET28b와 BoNTs LC 인설트는 라이게이션(ligation)하기 위해 T4 DNA 폴리머레이즈를 첨가하고 상온에서 2 분 30 초, 얼음에서 10 분 동안 반응시켜 pET28b와 BoNTs LC 인설트 간의 안정적인 수소결합을 유도하였다. 상기 클로닝 과정을 통해 얻어진 DNA 용액 4 μL를 competent E. coli TOP10이 포함되어 있는 용액 100 μL에 첨가하고 얼음에서 30 분 배양 후 42 ℃에서 45 초간 열처리하여 형질전환하였다. 그리고 상기 형질전환된 E. coli 용액 내에 LB(Luria-Bertani) 액체 배지 900 μL를 넣어 배양(37 ℃, 1 시간)한 후 원심분리(13,000 rpm, 10 분)를 통해 세포를 수집하였다. 수집된 E. coli 용액 중 0.1 mL을 카나마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말/배양(37 ℃)한 후 형성된 콜로니 중 하나를 0.1% 카나마이신이 첨가된 10 mL LB 액체 배지에 접종하고 18 시간(37 ℃) 동안 배양하였다. 그리고 배양액을 초음파 처리 및 정제하여 결과물로서의 플라스미드를 얻었다. 상기의 플라스미드의 시퀀스는 업체(바이오닉스, 한국)를 통해 확인하였다. 상기 과정에서 사용된 프라이머의 서열, 자세한 조성과 반응 조건은 이하와 같다.
- 벡터(pET28b, 5340 bp)
① 전방 프라이머(Forward primer)
5‘-CACCACCACCACCACCACTGAGATC-3’(서열번호 133)
② 후방 프라이머(Backward primer)
5‘-CTCGCTACCGCCTCCACCACTG-3’ (서열번호 134)
- 재조합 보툴리눔 신경독소 인설트(BoNTs LC)
① 전방 프라이머
5‘-GTGGTGGTGGTGGTGGAAGGGAATGATGCCACGGACACAAAGTAACTT-3’ (서열번호 135)
② 후방 프라이머
5‘-GGAGGCGGTAGCGAGATGCCCTTCGTCAACAAACAGTTCAATTATAAGGATCC-3’ (서열번호 136)
- PCR 조성물: 전방 프라이머 1 μL, 후방 프라이머 1 μL, 벡터 1 μL, dNTP 4 μL, 10X 리액션 버퍼 5 μL, Pfu DNA 폴리머레이즈 0.5 μL, 증류수 37.5 μL
- 벡터의 PCR 조건
① 최초 변성(denaturation, 95℃, 3분)
② 30회 반복: 변성(95℃, 3초) → 결합(annealing, 61℃, 3초) → 연장(extension, 72℃, 6분)
③ 마지막 연장(extension, 72℃, 3분)
- 인설트의 PCR 조건
① 최초 변성(95℃, 3분)
② 30회 반복: 변성(95℃, 3초) → 결합(61℃, 3초) → 연장(72℃, 1분)
③ 마지막 연장(72℃, 3분)
- Dpn1 처리조건(37℃, 1시간): 5 μL(10X reaction buffer4) + 44 μL(벡터 또는 인설트의 PCR 산물) + 1 μL(Dpn1 용액)
- T4 DNA 폴리머레이즈 처리: 1 μL(벡터 용액) + 7 μL(인설트 용액) + 1 μL(10X reaction buffer2.1) + 1 μL(T4 DNA polymerase 용액)
BoNTs LC 이외의 도 2의 (2) 내지 (6)에서 나타난 재조합 보툴리눔 신경독소의 생산에서, Aurein 1.2(서열번호 92), His10(서열번호 76), A2(서열번호 156)에 해당하는 각각의 서열은 비교적 짧기 때문에 T4 DNA 폴리머레이즈를 이용한 방법이 아닌 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis) 방법으로 특정 DNA에 상기의 짧은 특정서열이 삽입되도록 하였으며 특히 전방 프라이머(forward primer)는 앞 말단에 희망서열이 삽입되도록 디자인하였다. BoNTs LC 생산용 플라스미드(1)에 기초하여, 상기 부위 특이적 변이 방법으로 BoNTs LC의 C 말단에 A2가 삽입되도록 재조합 보툴리눔 신경독소(BoNTs LC-A2) 생산용 플라스미드(2)를 디자인하였다. 상기 플라스미드(2)를 이용하여 BoNTs LC와 A2 사이에 Aurein 1.2가 삽입되도록 플라스미드(3)(BoNTs LC-Aurein 1.2-A2)와, BoNTs LC와 A2 사이에 His10이 삽입되도록 플라스미드(4)(BoNTs LC-His10-A2)를 디자인하였다. 그리고 상기 플라스미드(4)를 이용하여 BoNTs LC의 N 말단에 Aurein 1.2가 삽입되도록 플라스미드(5)(Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2)를 디자인하였다. 마지막으로, 플라스미드(2)를 이용하여 BoNTs LC의 N 말단에 His10과 Aurein1.2가 차례로 삽입될 수 있도록 플라스미드(6)(Aurein 1.2-His10-LC-A2)을 디자인하였다. 상기 과정에서 사용된 각각의 프라이머 염기서열은 다음과 같다.
- 재조합 보툴리눔 신경독소(BoNTs LC-A2)
① 전방 프라이머
5‘-TGTGCTGTTCAAATAGATGTTTGTGGTCACAACGCTCCCGCGAGAGGGTCTGTGGTCACCACAAATATATACCTGA-3’ (서열번호 137)
② 후방 프라이머
5‘-CACCACCACCACCACCACTGAGATC-3’ (서열번호 138)
- 재조합 보툴리눔 신경독소(BoNTs LC-Aurein 1.2-A2)
① 전방 프라이머
5‘-AAATGATTCTGCGATCTTTATTATGATGTCAAACAGTCCAGAGGGTCTGTGGTCACCACAAATATATACCTG-3’ (서열번호 139)
② 후방 프라이머
5‘-CGCGGGAGCGTTGTGACCACAAACAT-3’ (서열번호 140)
- 재조합 보툴리눔 신경독소(BoNTs LC-His10-A2)
① 전방 프라이머
5‘-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGAGAGGGTCTGTGGTCACCACAAATATATACCTG-3’ (서열번호 141)
② 후방 프라이머
5‘-CGCGGGAGCGTTGTGACCACAAACAT-3’ (서열번호 142)
- 재조합 보툴리눔 신경독소(Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2)
① 전방 프라이머
5‘-AAATGATTCTGCGATCTTTATTATGATGTCAAACAGCTCGCTACCGCCTCCACCACTG-3’ (서열번호 143)
② 후방 프라이머
5‘-ATGCCCTTCGTCAACAAACAGTTCAATTATAAGGATCC-3’ (서열번호 144)
- 재조합 보툴리눔 신경독소(Aurein 1.2-His10-BoNTs LC-A2) 1st 단계
① 전방 프라이머
5‘-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGCTCGCTACCGCCTCCACCACTG-3’ (서열번호 145)
② 후방 프라이머
5‘-ATGCCCTTCGTCAACAAACAGTTCAATTATAAGGATCC-3’ (서열번호 146)
- 재조합 보툴리눔 신경독소(Aurein 1.2-His10-BoNTs LC-A2) 2nd 단계
① 전방 프라이머
5‘-AAATGATTCTGCGATCTTTATTATGATGTCAAACAGTCCCTCGCTACCGCCTCCACCACTG-3’ (서열번호 147)
② 후방 프라이머
5‘-CACCACCATCACCATCACCATCACCATC-3’ (서열번호 148)
※ 모든 프라이머들의 Tm값은 65 ℃
이후의 상기 플라스미드 결과물(2) 내지 (6)을 제조하기 위한 클로닝 방법은 상기 에 기재된 BoNTs LC 생산용 플라스미드(1)의 제조방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 자세한 조성과 반응 조건은 다음과 같다.
- PCR 조건
① 최초 변성(95℃, 3분)
② 30회 반복: 변성(95℃, 3초) → 결합(61℃, 3초) → 연장(72℃, 6분)
③ 마지막 연장(72℃, 3분)
- 라이게이션(25℃, 2시간): 5 μL(X10 ligase 버퍼) + 5 μL(10X kinase 버퍼) + 10 μL(PCR 산물) + 0.5 μL(ligase 용액) + 1 μL(kinase 용액)
※ PCR 조성 및 Dpn1 처리조건은 상기 플라스미드(1) 제작방법과 상동
※ Dpn1, 10X reaction buffer, 10X reaction buffer4, 10X reaction buffer2.1, Pfu DNA polymerase T4 DNA polymerase, dNTP(2.5mM)의 구입처: ELPIS BIOTECH, 한국
※ PCR 산물의 정제법 및 플라스미드의 제조법: Dokdo-prep Gel extraction kit spintype 200 (ELPIS)에 내장된 프로토콜에 따름
실시예 2. E. coli를 이용한 보툴리눔 신경독소 미니어처 생산
실시예 1에서 제조된 플라스미드(1) 내지 (6)을 이용하여 재조합 보툴리눔 신경독소를 생산하는 방법은 이하와 같다. 수용성 세포(competent cell)로 변환된 E. coli BL21(DE3) 균주에 전기에 의한 천공을 통하거나 열 충격을 가함으로써 상기 완성된 플라스미드를 균주 내부로 이동시킴으로써 형질 도입시켰다. 그리고 형질 도입된 E. coli를 암피실린이 첨가된 LB 고체 선택배지에 도말한 후 37 ℃에서 하루 동안 배양하였으며, 선택배지에서 자란 1 개의 콜로니를 암피실린이 첨가된 액체 LB 배지 10 mL에 접종한 후 12 시간 동안 37 ℃에서 전 배양하였다.
그 뒤, 전 배양한 재조합 균주를 다시 암피실린이 첨가된 600 mL의 LB 배지에 1 %의 농도로 접종하고, OD600nm 값이 0.5가 될 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 그리고, 상기 배양액을 8,000 rpm, 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 배지를 제거하고 균주들을 수확하였으며, 수확한 균주들은 10 mL의 PBS(phosphate buffered saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2.55 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4)에 재부유시킨 후 1 초 간격으로 1 분 45 초 간 초음파 처리(sonication)하여 세포를 파쇄하였다. 그리고 다시 4 ℃, 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 획득하였다. 그리고 획득된 상층액 내에 부유하는, 발현된 재조합 보툴리눔 신경독소를 분리하기 위해, Ni-NTA 비드(bead)가 담긴 4 ℃ 컬럼 내에서 2 시간동안 장동(nutation)운동 시킴으로써 재조합 보툴리눔 신경독소의 His-tag을 통해 비드에 부착되도록 하였다. 상기 장동운동 후, PBS 10-15 mL로 세척하여 재조합 보툴리눔 신경독소를 제외한 불순물을 제거하였다. 그 다음, 상기 세척된 컬럼에 150 mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 처리하여 단백질을 비드에서 떨어뜨림으로써 순수한 재조합 보툴리눔 신경독소를 획득하였다.
실시예 3. 분화된 PC12 세포에서의 노르에피네프린 방출 분석
분화된 PC12 세포에서의 노르에피네프린의 방출량 분석은 세포수준에서의 신경전달저해효능을 결정하는데 사용되었다. 한국세포주은행으로부터 분양받은 랫트의 부신(rat adrenal gland) 유래의 PC12 세포(21721)를 배양접시의 70-80 %에 이를 때까지 DMEM(100 μg/mL streptomycin, 100 U/mL penicillin, 2 mM L-glutamine, and 10% heat-inactivated FBS)에서 배양하였다. 이후 신경생장인자(NGF; 7S, 50 ng/mL, Invitrogen)를 처리하고 5일 동안 추가 배양하여 분화시킨 후 분화된 PC12 세포에 high-K+ 용액(115 mM NaCl, 50 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 11 mM glucose, and 15 mM HEPES-Tris, pH 7.4)을 처리하고 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 15 분간 다시 배양하였다. 이후 low-K+ 용액(140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 11 mM glucose, and 15 mM HEPES-Tris, pH 7.4)으로 세척 후, 도 2의 (1) 내지 (6)에 나타낸 재조합 보툴리눔 신경독소 50 pM이 함유된 low-K+ 용액을 처리하였다. 이후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 재배양한 후, low-K+ 용액으로 1분 동안 세척하였으며 그 뒤, high-K+ 용액을 처리하여 신경전달물질이 분비되도록 유도하였다. 분비된 신경전달물질을 함유한 완충액에서의 노르에피네프린의 농도는 도 4에 나타난 경쟁적 ELISA 기법을 사용하는 노르에피네프린(norepinephrine) ELISA 키트(KA1891, Abnova Co.)를 이용하여 정량하였다. 정량의 과정은 분화된 PC12 세포로부터 분비된 신경전달물질을 함유한 high-K+ 용액 300 μL를 extraction 96-well 플레이트로 옮긴 후부터 제조업체에서 제공된 프로토콜과 동일하게 따라 진행되었으며 최종적으로, 반응 기질을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 배출된 노르에피네프린의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 군에 비하여 보툴리눔 신경독소 미니어처(1)은 1±3%, (2)는 16±2%, (3)은 32±10%, (4)는 31±6%, (5)는 50±6%, (6)은 61±5%의 노르에피네프린 방출을 억제하는 것으로 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 신경-활성 물질(neuro-active material), 즉, 보톨리눔 신경독소의 경쇄(light chain) 등과 같은 신경 내에서 작동하는 활성 물질에 EEP 및 BoNT/A-A2를 결합시킴으로써 뉴런을 특이적으로 인식하고 뉴런 내의 세포질로 탈출하여 활성(노르에피네프린 방출 저해)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 디지트 어브덕션 스코어(Digit abduction score; DAS) 어세이
DAS 분석은 국소 근육약화효능을 결정하는데 사용되었다. 17-21 g의 Swiss Webster 마우스를 상기 분석법에 사용했다. 실험 전 마우스는 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 그룹 당 5 마리씩 분류하였다. 그리고 각 마우스의 오른 비복근 위쪽 부분의 근육주사를 통해 재조합 보툴리눔 신경독소(실시예 1에서 제조된 재조합 보툴리눔 신경독소, 도 2의 (1) 내지 (6) 참조)가 투여되었다. 주사는 멸균된 250 μL 주사기에 부착된 30 게이지 바늘을 사용하여 5 μL를 각각 투여하였으며, 투여된 샘플의 용량은 10 U kg-1 체중이었으며, 각 실험은 실험군당 5 마리의 마우스를 사용하였다. 샘플을 주사하고 이틀이 지난 후 샘플이 주사된 마우스 오른 뒷다리의 발가락이 펴지지 않는 것과 다리전체가 마비된 정도를 그렇지 않은 왼 뒷다리와 비교하여 5 점 척도로 점수가 매겨졌다(0 = 정상; 1 = 펴진 발, 두 발가락이 맞닿아 있고 나머지 발가락은 펴짐; 2 = 펴진 발, 모든 발가락 끝 사이에 약간의 공간만이 존재하거나 세 발가락이 맞닿음; 3 = 발이 펴질 때 모든 발가락이 맞닿아 있거나 발이 굽을 때 네 발가락이 모임; 4 = 굽은 발, 모든 발가락이 맞닿음).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 DAS 어세이 상에서 보툴리눔 재조합 신경독소(1)은 0.2±0.4, (2)는 0.6±0.5, (3)은 1.8±0.8, (4)는 1.6±0.5, (5)는 2.8±0.4, (6)은 3.2±0.4로 점수 값이 매겨졌다. 상기 결과는 본 발명의 조성물이 단순히 근육을 마비시킬 수 있다는 것만을 의미하는 것이 아니라, 입모근의 움직임을 마비시킴으로써 피부주름과 모공 개선효과를 야기하는 보톡스와 동일한 기작으로 피부주름과 모공을 개선시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 보톨리눔 신경독소 경쇄(light chain) 이외의 다양한 신경-활성 물질에 EEP 및 BoNT/A-A2를 결합시킨다면 뉴런 특이적으로 활성을 나타내는 약물로도 사용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질을 생산하기 위한 플라스미드의 제조
Botulinum toxin A(BoNT/A)의 receptor binding domain(RBD)의 일부 서열인 A2 펩타이드는 신경세포에 존재하는 수용체(synaptic vesicle glycoprotein 2C, SV2C)를 인식해 결합하는데 중요하게 작용하는 부분이라고 보고 되어있다(도 7A). pET28b 플라스미드 내부의 녹색형광단백질(EGFP)의 C-말단에 있는 히스티딘 테그 뒤에 링커(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)와 함께 펩타이드와 도메인을 클로닝하여 녹색형광단백질과 융합된 유전자를 제작하였다(도 7B). 상기 펩타이드와 결합한다고 알려진 수용체(SV2C) 또한 결합하는데 주요하게 작용하는 일부분 만을 pGex4T 플라스미드에 클로닝하여 제작하였다(도 7C). 이때 수용체와 녹색형광단백질과 융합된 유전자는 정제를 위한 서로 다른 태그를 가지도록 제작하였다. RBD을 발현하는 플라스미드의 제조는 pET28b-EGFP를 기초로 하여, SV2C를 발현하는 플라스미드의 제조는 pGex4T-1을 기초로 하여 T4 DNA polymerase를 이용한 방법으로 클로닝 하였다. 상기 클로닝 과정 중 사용된 백터맵은 도 8과 같으며, insert의 DNA 시퀀스는 하기 표 3의 아미노산 시퀀스를 바탕으로 코돈 최적화 과정을 통해 하기 표 4와 같이 얻어졌다.
샘플 서 열 비고
RBD MKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYIDVNNVGIRGYMYLKGPRGNVMTTNIYLNSSLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL 서열번호 149
RBD ' MKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL 서열번호 150
A2 RGNVMTTNIYLNSS 서열번호 151
A2' RGSVMTTNIYLNSS 서열번호 152
SV2C DVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFD 서열번호 153
샘플 서 열 비고
RBD ATGAAAAACATTATTAATACTTCCATACTTAACCTGCGCTACGAGTCTAACCATTTGATTGACTTATCGCGGTACGCTTCTAAAATAAACATCGGGAGCAAGGTAAACTTTGATCCGATAGATAAAAACCAGATTCAATTGTTCAACTTAGAGTCTAGTAAAATAGAGGTTATTTTAAAAAATGCCATTGTTTATAACTCGATGTACGAAAATTTCTCGACCTCGTTTTGGATACGGATACCGAAGTACTTTAACTCTATTTCCTTGAATAATGAGTACACCATCATAAATTGCATGGAAAACAATTCCGGTTGGAAAGTGTCATTAAACTATGGCGAGATAATTTGGACTTTGCAGGACACTCAGGAGATAAAGCAGCGTGTAGTCTTTAAGTATTCCCAGATGATAAACATCTCGGACTACATAAATCGTTGGATTTTTGTAACCATAACAAATAATCGCCTTAACAATAGCAAAATTTATATCAACGGCCGGTTGATCGATCAAAAACCAATTTCCAACTTGGGGAACATACACGCTTCGAATAACATCATGTTTAAGCTTGACGGTTGTAGAGATACGCATCGCTACATTTGGATAAAGTATTTTAACCTGTTTGACAAGGAGTTGAATGAGAAAGAAATTAAGGACTTATATGATAATCAATCAAACAGTGGGATATTGAAAGATTTCTGGGGCGACTATCTTCAGTACGATAAGCCCTATTATATGTTGAACTTATACGACCCAAACAAATACATTGACGTAAACAATGTGGGTATCAGAGGATATATGTACTTAAAGGGCCCAAGAGGGAATGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAGCAGTCTTTACATGGGCACGAAATTCATAATAAAAAAATATGCGTCCGGGAATAAGGACAATATTGTAAGAAATAACGACCGTGTATATATCAATGTCGTGGTCAAAAACAAAGAGTACCGGCTGGCTACCAATGCTTCCCAGGCAGGTGTCGAGAAAATACTTTCGGCGCTTGAAATTCCAGACGTGGGCAATCTGTCACAAGTGGTCGTTATGAAAAGTAAAAATGATCAAGGGATCACCAATAAGTGCAAGATGAATTTGCAAGACAATAATGGTAACGATATAGGATTTATAGGGTTTCACCAGTTCAATAACATCGCTAAGCTGGTCGCTAGTAACTGGTATAATAGACAAATTGAACGGTCCAGTCGCACGCTTGGCTGTTCTTGGGAGTTCATTCCGGTTGATGATGGATGGGGCGAACGCCCACTG 서열번호 154
RBD ' ATGAAAAACATTATTAATACTTCCATACTTAACCTGCGCTACGAGTCTAACCATTTGATTGACTTATCGCGGTACGCTTCTAAAATAAACATCGGGAGCAAGGTAAACTTTGATCCGATAGATAAAAACCAGATTCAATTGTTCAACTTAGAGTCTAGTAAAATAGAGGTTATTTTAAAAAATGCCATTGTTTATAACTCGATGTACGAAAATTTCTCGACCTCGTTTTGGATACGGATACCGAAGTACTTTAACTCTATTTCCTTGAATAATGAGTACACCATCATAAATTGCATGGAAAACAATTCCGGTTGGAAAGTGTCATTAAACTATGGCGAGATAATTTGGACTTTGCAGGACACTCAGGAGATAAAGCAGCGTGTAGTCTTTAAGTATTCCCAGATGATAAACATCTCGGACTACATAAATCGTTGGATTTTTGTAACCATAACAAATAATCGCCTTAACAATAGCAAAATTTATATCAACGGCCGGTTGATCGATCAAAAACCAATTTCCAACTTGGGGAACATACACGCTTCGAATAACATCATGTTTAAGCTTGACGGTTGTAGAGATACGCATCGCTACATTTGGATAAAGTATTTTAACCTGTTTGACAAGGAGTTGAATGAGAAAGAAATTAAGGACTTATATGATAATCAATCAAACAGTGGGATATTGAAAGATTTCTGGGGCGACTATCTTCAGTACGATAAGCCCTATTATATGTTGAACTTATACGACCCAAACAAATACGTGGACGTAAACAATGTGGGTATCAGAGGATATATGTACTTAAAGGGCCCAAGAGGGTCTGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAGCAGTCTTTACCGTGGCACGAAATTCATAATAAAAAAATATGCGTCCGGGAATAAGGACAATATTGTAAGAAATAACGACCGTGTATATATCAATGTCGTGGTCAAAAACAAAGAGTACCGGCTGGCTACCAATGCTTCCCAGGCAGGTGTCGAGAAAATACTTTCGGCGCTTGAAATTCCAGACGTGGGCAATCTGTCACAAGTGGTCGTTATGAAAAGTAAAAATGATCAAGGGATCACCAATAAGTGCAAGATGAATTTGCAAGACAATAATGGTAACGATATAGGATTTATAGGGTTTCACCAGTTCAATAACATCGCTAAGCTGGTCGCTAGTAACTGGTATAATAGACAAATTGAACGGTCCAGTCGCACGCTTGGCTGTTCTTGGGAGTTCATTCCGGTTGATGATGGATGGGGCGAACGCCCACTG 서열번호 155
A2 AGAGGGAATGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAGCAGT 서열번호 156
A2' GGGTCTGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAGCAGTCTT 서열번호 157
SV2C GACGTGATAAAGCCCCTTCAGTCAGATGAATATGCATTGCTGACTCGCAACGTGGAACGTGACAAGTATGCCAATTTTACCATAAATTTCACAATGGAAAACCAGATCCATACGGGCATGGAGTACGACAACGGTCGGTTTATCGGGGTAAAATTCAAGTCAGTAACCTTTAAGGATTCGGTGTTCAAAAGTTGCACATTTGAGGACGTTACCTCCGTAAACACCTACTTCAAAAATTGCACTTTTATTGATACAGTATTCGACAACACCGATTTCGAGCCATATAAATTCATCGACAGTGAGTTCAAGAACTGCAGTTTCTTTCATAATAAGACCGGCTGCCAGATTACTTTCGAT 서열번호 158
보다 자세하게는, 최초의 PCR은 pET28b-EGFP와 RBD insert의 양 말단 15bp에 상호보완(complementary)적으로 디자인된 프라이머들을 이용해 수행되었다. 그리고 PCR 완료 후 self-ligation 방지를 위해 37 ℃에서 1 시간 동안 효소 Dpn1을 처리하였고, DNA 외의 PCR 산물을 제거하기 위해 PCR purification을 진행하였다. 이렇게 생성된 pET28b-EGFP와 RBD insert를 ligation하기 위해 T4 DNA polymerase를 첨가하고 상온에서 2 분 30 초 동안 반응시킨 후 얼음에서 10 분 동안 방치하여 벡터와 insert 사이의 안정적인 수소결합을 유도하였다. 그리고 클로닝 과정을 통해 얻어진 DNA 용액 4 μl를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환 과정은 다음과 같다. competent E.coli TOP10 용액 100 μl에 DNA 용액 4 μl를 첨가하고 얼음에서 30 분 동안 반응시킨 후에 42 ℃에서 45 초간 열처리하였다. 그리고 상기 반응액에 LB(Luria-Bertani) 액체배지 900 μl를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 후 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포 용액(0.1 ml)은 카나마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말하고 37 ℃에서 배양한 후 형성된 콜로니 중 하나를 0.1 % 카나마이신이 첨가된 10 ml의 LB 액체배지에 접종하고 37 ℃에서 18 시간 배양하였다. 그리고 플라스미드 prep을 통해 플라스미드를 얻었다. 획득된 플라스미드의 시퀸스는 업체(바이오닉스, 한국)를 통해 확인하였다. 상기 과정에 사용된 유전자와 primer의 서열, 자세한 조성과 반응 조건은 다음과 같다.
- 벡터(pET28b-EGFP, 6045bp)
① 전방 프라이머(Forward primer)
5’-GCTACCGCCTCCACCGTGGTG-3’ (서열번호 159)
② 후방 프라이머(Backward primer)
5’-TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAA-3’ (서열번호 160)
- RBD 인설트
① 전방 프라이머
5’-AGCAGCCGGATCTCACAGTGGGCGTTCGCCCCATCCAT-3’ (서열번호 161)
② 후방 프라이머
5’-GGTGGAGGCGGTAGCAAAAACATTATTAATACTTCCATACTTAACCTGCGCTACGAGTCTAA-3’ (서열번호 162)
- PCR 조성, 벡터의 PCR 조건, 인설트의 PCR 조건, Dpn1 처리조건, 및 T4 DNA 폴리머레이즈 처리는 실시예 1과 상동.
RBD'는 site-directed mutagenesis를 이용한 방법으로 클로닝하였다. 기존 서열을 희망서열로 변경 후 서열 양 옆으로 15bp씩을 포함하여 primer를 디자인하고 backward primer는 forward primer를 상보적으로 reverse시킨다. RBD와 RBD'는 3 개의 아미노산 서열이 차이가 나기 때문에 상기 방법을 3 번 반복하여 RBD'을 제작하였다. PCR 완료 후에는 37 ℃에서 1 시간 동안 효소 Dpn1을 처리하였고 이후 형질전환하고 시퀀싱하여 염기서열을 확인하였다. 상기 과정에 사용된 유전자와 primer의 서열, 자세한 조성과 반응 조건은 다음과 같다.
- EGFP-RBD’ SDM1
① 전방 프라이머
5’-TATGAATTTCGTGCCACGGTAAAGACTGCTGTT -3’ (서열번호 163)
② 후방 프라이머
5’-AACAGCAGTCTTTACCGTGGCACGAAATTCATA -3’ (서열번호 164)
- EGFP-RBD’ SDM2
① 전방 프라이머
5’-TTCGTCGTCATTACAGACCCTCTTGGGCCCTT -3’ (서열번호 165)
② 후방 프라이머
5’-AAGGGCCCAAGAGGGTCTGTAATGACGACGAA -3’ (서열번호 166)
- EGFP-RBD’ SDM3
① 전방 프라이머
5’-CACATTGTTTACGTCCACGTATTTGTTTGGGTC -3’ (서열번호 167)
② 후방 프라이머
5’- GACCCAAACAAA ACGTGGACGTAAACAATGTG -3’ (서열번호 168)
- PCR 조성 : 전방 프라이머 1 μL, 후방 프라이머 1 μL, 벡터 1 μL, dNTP 4 μL, 10X reaction buffer 5 μL, Pfu DNA polymerase 0.5 μL, 증류수 37.5 μL
- PCR 조건
① 최초 변성(95℃, 3분)
② 30회 반복: 변성(95℃, 3초) → 결합(58℃, 3초) → 연장(72℃, 6분)
③ 마지막 연장(72℃, 3분)
- Dpn1 처리조건(37℃, 1시간): 5 μL(10X reaction buffer4) + 44 μL(벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 1 μL(Dpn1용액)
RBD 외의 보톡스 미니어처 생산에서 Aurein1.2와 A2, A2'에 해당하는 각각의 서열은 비교적 짧기 때문에 T4 DNA polymerase를 이용한 방법이 아닌 site-directed mutagenesis 방법으로 forward primer의 앞 말단에 희망서열이 삽입되도록 디자인하여 클로닝하였다. 상기 site-directed mutagenesis 방법으로 EGFP의 C말단에 A2가 삽입되도록 하였고, EGFP와 A2사이에 Aurein1.2가 삽입되도록 플라스미드를 디자인하였다. T4 DNA polymerase를 이용해 클로닝한 EGFP-RBD도 EGFP와 RBD 사이에 Aurein1.2를 삽입하였다. PCR 완료 후 37 ℃에서 1 시간 동안 효소 Dpn1을 처리하였고 DNA 외의 PCR 산물을 제거하기 위해 PCR purification을 진행하였다. 이후 DNA들의 ligation을 위해 ligase와 kinase를 넣고 25 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후 형질전환 하고 시퀀싱하여 유전자 서열을 확인하였다. 상기 과정에서 사용된 각각의 primer 염기서열과 반응조건은 다음과 같다.
- EGFP-A2
① 전방 프라이머
5’-GGTGGAGGCGGTAGCAGAGGGAATGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAGCAGT
TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAA-3’ (서열번호 169)
② 후방 프라이머
5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG-3’ (서열번호 170)
- EGFP-Aurein1.2-A2
① 전방 프라이머
5’-GCTACCGCCTCCACCGGCCTGTTTGACATCATCAAAAAAATCGCCGAAAGCTTTGCTAC
CGCCTCCACCGTGGTG -3’ (서열번호 171)
② 후방 프라이머
5’- AGAGGGAATGTAATGACGACGAACATATACCTTAACAG -3’ (서열번호 172)
- EGFP-Aurein1.2-RBD
① 전방 프라이머
5’-GCTACCGCCTCCACCGGCCTGTTTGACATCATCAAAAAAATCGCCGAAAGCTTTGCTAC
CGCCTCCACCGTGGTG -3’ (서열번호 173)
② 후방 프라이머
5’- GACTCGTAGCGCAGGTTAAGTATGGAAGTATTAATAATGTTTTT -3’ (서열번호 174)
- PCR 조성 : 전방 프라이머 1 μL, 후방 프라이머 1 μL, 벡터 1 μL, dNTP 4 μL, 10X reaction buffer 5 μL, Pfu DNA polymerase 0.5 μL, 증류수 37.5 μL
- PCR 조건
① 최초 변성(95℃, 3분)
② 30회 반복: 변성(95℃, 3초) → 결합(61℃, 3초) → 연장(72℃, 6분)
③ 마지막 연장(72℃, 3분)
- Dpn1 처리조건(37℃, 1시간): 5 μL(10X reaction buffer4) + 44 μL(벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 1 μL(Dpn1용액)
- Ligase와 kinase 처리조건(25℃, 2시간): 5 μL(10X ligase reaction buffer + ATP) + 5 μL(10X kinase reaction buffer) + 10 μL(벡터 또는 insert의 PCR 산물) + 0.5 μL(ligase용액) + 1 μL(kinase용액) + 28.5 μL(증류수)
※ PCR 조성 및 Dpn1 처리조건은 상기 플라스미드(1) 제작방법과 상동
※ Dpn1, 10X reaction buffer, 10X reaction buffer4, 10X reaction buffer2.1, Pfu DNA polymerase T4 DNA polymerase, dNTP(2.5mM)의 구입처: ELPIS BIOTECH, 한국
※ PCR 산물의 정제법 및 플라스미드의 제조법: Dokdo-prep Gel extraction kit spintype 200 (ELPIS)에 내장된 프로토콜에 따름
실시예 6. E. coli를 이용한 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질 생산 및 정제
실시예 5에서 제조된 플라스미드를 E. coli에 형질 도입하여 재조합 단백질을 생산하기 위해 발현 정도를 확인하였다. 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시키고 콜로니 하나를 선택하여 0.1 % 카나마이신이 첨가된 10 mL LB 액체배지에 넣어 37℃에서 18시간 배양하였다. 그리고 배양액 6 mL를 1 % 카나마이신이 첨가된 600 mL의 LB 액체배지에 재접종하고 200 rpm, 37 ℃에서 배양하고, 600 nm에서 광학밀도 값이 0.5에서 1 사이가 되었을 때, 0.1 mM의 IPTG를 첨가하고 150 rpm, 16 ℃에서 20 시간 동안 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 발현이 끝나면 8,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, 수집된 세포는 10 mL의 PBS로 재현탁시키고 초음파 처리를 통해 세포를 파쇄하였다. 그리고 파쇄된 세포액을 12000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 수용성 단백질과 불용성 단백질로 분리하고, 분리된 수용성 단백질 중 원하는 단백질만 선별하기 위해 니켈 수지를 이용하여 정제하였다. 보다 자세하게는, 1 mL의 니켈수지를 25 mL 컬럼에 넣고 125 mL의 PBS로 세척한 후 분리된 수용성 단백질 용액을 넣고 4 ℃에서 1 시간 동안 회전시키면서 부착되게 처리해준다. 부착이 끝나면 PBS와 워싱버퍼를 각각 125 mL씩 컬럼에 흘려주고 일루션 버퍼를 1 mL씩 흘려 용출된 단백질을 수집하였다. 실험 시 단계별로 샘플링하여 6X 로딩버퍼와 섞어 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 과정에서 사용된 버퍼 조성은 다음과 같다.
- PBS : NaCl 8 g/L + KCl 200 mg/L + Na2HPO4 1.44 g/L + KH2HPO4 240 mg [pH 7.4]
- 워싱 버퍼: NaCl 8 g/L + KCl 200 mg/L + Na2HPO4 1.44 g/L + KH2HPO4 240 mg + 50 mM imidazole
- 일루션 버퍼: NaCl 8 g/L + KCl 200 mg/L + Na2HPO4 1.44 g/L + KH2HPO4 240 mg + 500 mM imidazole
- 로딩버퍼: 0.375 M Tris [pH 6.8] + 12% SDS + 60% glycerol + 0.6 M DTT + 0.06% bromophenol blue
SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현을 분석한 결과 16 ℃, IPTG 0.1 mM의 조건에서 수용성으로 발현된 것을 확인하였다(도 9A). 발현된 재조합 녹색형광단백질과 SV2C의 결합력을 평가하기 위해 BL21(DE3) 대장균을 이용하여 수용성으로 발현된 단백질을 정제하고자 하였다. 형광단백질과 융합된 재조합 녹색형광단백질과 SV2C은 히스티딘 태그(His6-tag)를 이용해 니켈 bead로 정제하였고, 수용체는 GST(glutathione S-transferase) 태그를 이용해 glutathione bead로 정제하였으며 SDS-PAGE를 통해 분석하였다(도 9B).
실시예 7. GST pull assay를 이용한 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질과 뉴런 수용체( SV2C )의 결합력 확인
실시예 6에서 발현/정제된 재조합 녹색형광단백질과 SV2C 간의 결합력을 확인하기 위해 GST pull down을 진행하였다. 정제된 SV2C를 glutathione bead에 결합시킨 후 재조합 녹색형광단백질과 상기 SV2C와 결합된 glutathione bead를 반응시켰다. 결합하지 못한 단백질을 제거하기 위해 bead를 세척한 후 SDS-PAGE 내에서 전기영동하여 확인하였다(도 10). 이 때 세척에 사용한 버퍼는 두 가지 pH(pH 7.4와 5.8)로 나누어 사용하였다. SDS-PAGE 결과에 따르면, pH 7.4와 pH 5.8 워싱버퍼 사용 간의 차이가 없는 것으로 보아 pH에 의존적이지 않게 결합한다는 것을 알 수 있었으며, 각각 RBD 보다는 RBD'이, A2 보다는 A2'이, A2와 A2' 보다는 RBD와 RBD'이, SV2C와의 결합력이 좋다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실시예를 통해 실시예 6에서 제조된 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질과 SV2C 간의 결합력이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 공초점 레이저 형광 현미경 이미지 획득
콜라겐 용액과 poly-D-lysine 용액에 각각 12 시간씩 코팅된 커버글라스를 세포 배양용 12 well plate에 넣고 PC12 cell(1.0 X 105 cell/well)을 분주하여 37 ℃ 5 % CO2 배양기에서 하루 동안 세포를 배양하였다. 그 후 100 ng/mL nerve growth factor(NGF)를 처리하여 5일 동안 분화를 유도하였다. 분화가 확인되면 실시예 6에서 발현/정제된 재조합 녹색형광단백질을 첨가하고 15 분 동안 37 ℃ 5 % CO2 배양기에서 배양해준 후, 엔도솜과 핵(Hoechst 33258), 그리고 세포막(WGA-AF647)을 차례로 염색하였다. 염색이 끝나면 커버글라스만 핀셋으로 꺼내 슬라이드글라스 위에 덮고 움직이지 않게 고정시키고, 상기 방법으로 만들어진 샘플을 공초점 레이저 형광 현미경(Leica TCS SP8 HyVolution confocal microscope)으로 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있듯이 EGFP-A2, EGFP-A2', EGFP-RBD, EGFP-RBD' 모두 세포 내에서도 EGFP에 해당하는 녹색형광 신호가 관찰되었기 때문에, 실시예 6에서 제조된 뉴런 표시용 재조합 녹색형광단백질은 신경세포를 표시하는 역할을 잘 수행할 수 있다는 것을 확인하였다.
- 배양배지: RPMI-1640 + 5% fetal bovine serum + 10% horse serum + 1% antibiotics
- 콜라겐 용액 : 50 μg/mL collagen in 20 mM acetic acid
- Poly-D-lysine 용액 : 0.1 mg/mL Poly-D-Lysine
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 EEP와 BoNT/A-A2 또는 RBD를 신경-활성 물질에 다양한 형태로 결합시킴으로써, 신경-활성 물질 재조합 단백질이 뉴런을 특이적으로 인식하고 뉴런의 세포질로 탈출하여 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여, 다양한 신경-활성 물질에 EEP와 A2 또는 RBD를 결합시킴으로써 뉴론 특이적으로 다양한 약물 전달, 형광 신호를 통한 뉴런 관찰 등 다양한 분야에 적용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Research and Business Foundation SungKyunKwan University <120> A composition comprising neuro-targeted proteins <130> MP19-178 <150> KR 10-2018-0101615 <151> 2018-08-28 <160> 174 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/A-A1 <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/A-A1 subtype <400> 2 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu 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Recombinant botulinum neurotoxin amino acid sequence 4 <400> 124 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Asp Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu 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gaacgcttac tatgaaatgt ctggtctgga ggtaagcttt 780 gaagaactgc gtactttcgg ggggcacgac gccaagttca tcgactccct gcaagagaat 840 gagtttcggc tgtactatta caataaattc aaggacgtag cgagcacctt aaataaagcc 900 aaaagcatca ttggcactac tgcctcttta cagtacatga agaacgtatt taaagagaag 960 tatcttttaa gcgaagatac gtcgggcaag tttagcgtcg ataagttaaa gtttgacaag 1020 ttatataaga tgttgacgga gatttataca gaggataact tcgttaactt cttcaaagta 1080 ataaaccgta aaacgtacct gaacttcgat aaggctgtgt tccgtataaa catcgtgccg 1140 gacgagaact acacaattaa ggacggcttt aacttaaaag gggcaaacct gagtaccaac 1200 ttcaacggcc aaaatactga gataaattca cgtaatttta cccgtttgaa gaattttacg 1260 ggcctgttcg agttttacaa gttactttgt gtccgtggca tcattccctt c 1311 <210> 128 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNTs LC-A2/DNA sequence 2 <400> 128 atgcctttcg ttaataagca gttcaactat aaggatcctg tcaacggtgt cgacatcgcg 60 tacataaaaa tcccgaatgc tggtcaaatg cagccggtaa aagccttcaa aattcacaat 120 aagatctggg taatacctga gcgtgatacg ttcacgaatc cagaggaagg tgatttgaac 180 ccgcctccag aggcaaaaca ggttcctgta tcgtattacg atagtaccta cctgagtacg 240 gacaacgaga aagacaatta tttaaagggt gtcacgaaac tgtttgagcg gatttactca 300 acggatttgg gaagaatgct gttgacgtca atcgtaagag gtattccttt ctggggtggt 360 tcaaccatag atacagaact gaaggtcatt gatactaatt gtataaatgt catacagcct 420 gatggttctt atcgctccga agaactgaac ttggttatta tagggccatc cgctgatata 480 attcagtttg agtgtaaaag tttcggccac gacgtcttaa acttgacaag aaacgggtac 540 gggtctactc aatatattcg cttcagccct gatttcactt ttggcttcga ggaatcgtta 600 gaagtggaca caaatccgct tctgggggcg ggaaaatttg ctacggaccc cgcggtcacg 660 cttgctcacg agttaattca tgcagagcat cggttatacg gcatcgccat caatccaaac 720 cgggttttca aggtaaatac gaacgcctac tacgaaatga gcggattaga ggtatcgttc 780 gaagaacttc ggacgtttgg cggacatgac gccaaattca tagattcact gcaagaaaat 840 gaatttagat tgtattatta caacaagttt aaagacgtgg cgtccaccct taataaggcc 900 aagtctatca taggtacaac agcatcgtta cagtatatga agaacgtttt caaggaaaaa 960 taccttttgt ctgaagacac cagcgggaag ttctcggttg ataaactgaa gtttgacaaa 1020 ctgtacaaga tgttgacaga aatctacact gaggacaatt ttgtcaattt ttttaaggtc 1080 attaatcgta agacatatct gaatttcgac aaagcggtat tccgtataaa catcgtgcca 1140 gatgagaatt atacaattaa ggacggcttc aacttaaaag gtgctaacct tagcaccaac 1200 tttaacggcc agaataccga gattaattcc cgcaacttca cccgcttaaa aaactttaca 1260 ggactttttg aattttacaa attgctgtgt gtgcggggca taatcccttt tagagggtct 1320 gtggtcacca caaatatata cctgaacagt act 1353 <210> 129 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNTs LC-Aurein 1.2-A2/DNA sequence 3 <400> 129 atgcctttcg taaacaaaca attcaactat aaagaccctg tcaatggggt agacatcgcg 60 tacataaaga ttcccaatgc gggccagatg caaccagtca aagcctttaa gatccacaac 120 aagatctggg tgattccaga acgcgacacg ttcaccaatc ctgaagaagg cgacttgaat 180 ccaccgccag aggccaaaca agtaccggta agctattacg actccaccta tttatcgaca 240 gataatgaga aagacaacta cttaaaaggt gtaaccaagt tatttgagcg tatatactcg 300 actgatctgg gaagaatgct gttaacttct attgttagag gaattccttt ttggggtgga 360 tccactatcg acaccgagtt aaaagttatt gacacaaatt gtataaacgt tatccagccc 420 gacggttcct accgttccga agaactgaac cttgtcatca ttggtccctc ggcagatata 480 attcaatttg aatgtaagag tttcgggcac gatgtcttga atctgactag aaacgggtat 540 ggatcaacac agtatattag attttcgccc gacttcacgt tcggattcga ggaaagttta 600 gaagtcgata ctaacccctt gttaggtgcg gggaaatttg caaccgaccc tgctgttacc 660 ttggcccacg agttgatcca cgcagagcat cggctttatg gaattgctat taacccaaac 720 cgcgtcttta aagtaaacac taacgcctac tatgagatga gtggcttgga ggtgagtttt 780 gaagagctta gaacctttgg tggccatgat gctaagttta tcgactcttt acaggaaaat 840 gagttcagat tgtactacta taacaaattt aaagacgttg catcaacttt gaataaagcc 900 aaatctataa ttgggactac tgcgtccctg caatacatga aaaacgtgtt caaggagaag 960 taccttctgt cggaagatac atctggtaaa tttagcgttg acaagttaaa gttcgataaa 1020 ctgtacaaga tgttaacaga aatatatacc gaggataatt tcgtcaactt tttcaaagtc 1080 attaatcgga agacttactt aaacttcgat aaagccgtct tccgcattaa cattgtgcca 1140 gacgagaact atacaattaa ggatggtttc aatttgaaag gagctaactt aagcactaac 1200 tttaacggcc agaacacaga gatcaattca cgtaacttca caagacttaa gaattttaca 1260 gggctgttcg agttttataa gctgctttgc gtaagaggaa tcatcccctt tggattattt 1320 gacattatta agaagatcgc cgaaagtttt cgtgggtccg ttgttacgac aaacatttat 1380 ttaaattcga ca 1392 <210> 130 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2/DNA sequence 4 <400> 130 atgccgtttg tgaacaaaca attcaactat aaagatccgg taaacggagt tgacatcgcg 60 tacatcaaaa taccgaatgc tggtcagatg cagccagtaa aagctttcaa aatccacaac 120 aaaatctggg tcatccctga aagagatacc tttacaaatc ccgaggaggg ggacctgaat 180 ccaccaccag aggcgaaaca ggtcccggtt tcatactatg acagtaccta cctttctact 240 gataacgaga aagataacta tttgaagggt gtaactaaat tatttgaaag aatttacagc 300 acggatttgg gtcggatgct gttaacatca attgtgcgcg gcataccatt ctggggagga 360 tcgactatag acaccgagtt aaaggtgatt gatactaact gtataaatgt aatacaaccc 420 gacggttcat acagaagtga agagttaaat cttgtcatca ttggtccttc agctgatatt 480 atacagtttg aatgcaaaag ttttggacac gacgtactta acttgacgcg taatggttac 540 ggcagtacac agtacatacg cttcagccct gacttcacgt tcggtttcga ggaaagtctt 600 gaagttgata ctaaccccct gcttggcgca ggcaaattcg ccactgatcc cgctgtcaca 660 ctggctcacg aactgataca tgcagagcat agactttacg gcatcgcaat taacccaaac 720 cgggtcttta aggtaaatac gaatgcttac tacgaaatgt ctggcctgga agtatcattc 780 gaggagttga gaaccttcgg cggccacgac gctaaattta tcgacagtct tcaggaaaac 840 gagttccgtc tgtactacta caataaattt aaggatgtgg cttctacttt gaataaggcc 900 aaaagtatca tcgggactac tgcatccttg caatatatga agaacgtatt caaggaaaaa 960 tacttgttat cagaggacac gagtggcaag ttctctgttg acaagttaaa attcgataaa 1020 ttatacaaga tgttgactga gatatacaca gaggataact ttgtcaattt ttttaaggtt 1080 ataaatcgga agacctattt gaacttcgat aaggctgtct ttcgtattaa tatagtgccc 1140 gatgaaaact ataccatcaa agacggtttc aatctgaaag gtgccaattt gtcgaccaac 1200 ttcaacgggc aaaacacgga gatcaatagt agaaatttca cgcgtcttaa aaacttcact 1260 ggtctgttcg aattttataa gcttttgtgc gttcgcggaa taattccttt tcatcatcat 1320 catcaccatc atcaccacca tcgtgggtcc gtagtgacca ctaacatcta cttaaattct 1380 acc 1383 <210> 131 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2/DNA 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agcccgttaa ggccttcaag 180 atacacaata aaatctgggt cataccggag cgggatacat tcacaaaccc ggaagaaggt 240 gaccttaacc ctcccccgga ggcaaaacaa gttcccgttt catattatga ctctacgtac 300 ctttccaccg acaacgaaaa ggacaattat ctgaaaggcg tgacaaaact tttcgaacgc 360 atttattcta cagatcttgg tagaatgctg ttgacttcta ttgtcagagg aattcctttc 420 tggggcggga gcactataga cactgagtta aaggtaattg acacgaattg cataaatgtt 480 atacaaccgg acggcagtta ccgttcggag gagcttaatt tagttataat cggtccatca 540 gctgacataa ttcaatttga gtgcaaatca tttggacacg atgttttaaa tttgactcgt 600 aatggatacg gctccacgca atacatccgt ttcagtcctg attttacatt cggttttgaa 660 gagtctcttg aggtggacac gaaccctttg ttaggcgccg gcaaatttgc tactgatcca 720 gccgtcacat tagctcacga acttattcac gccgaacacc gtctgtacgg tattgcaata 780 aatccaaacc gggtctttaa agtaaacacg aacgcctact acgaaatgtc gggtcttgag 840 gtctcattcg aggaattaag aacctttgga ggtcacgatg cgaagttcat tgactccttg 900 caagagaacg aatttagact ttactattac aacaagttca aggatgtcgc gtcgacctta 960 aataaggcca aatccataat tgggacgaca gcaagccttc aatacatgaa aaacgtcttc 1020 aaggagaagt atcttttaag cgaggacacc agcggtaagt ttagtgtcga taagttaaaa 1080 ttcgacaaat tgtacaagat gcttactgag atttacacag aagacaattt tgttaatttt 1140 ttcaaagtta taaatcgtaa aacctatctg aatttcgata aagcggtttt ccgtatcaac 1200 attgtgccgg acgagaatta caccataaaa gacgggttca atttaaaggg cgcaaacctt 1260 tctaccaatt ttaacggaca aaatacggaa atcaactcac gcaattttac gcgcctgaaa 1320 aattttacag gcctttttga attttataag ttgctttgtg tacggggtat tatacccttt 1380 cggggatcag tggtgactac taatatatac ttgaactcga ct 1422 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28b/Forward primer <400> 133 caccaccacc accaccactg agatc 25 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28b/Backward primer <400> 134 ctcgctaccg cctccaccac tg 22 <210> 135 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNTs LC/Forward primer <400> 135 gtggtggtgg tggtggaagg gaatgatgcc acggacacaa agtaactt 48 <210> 136 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNTs LC/Backward primer 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<223> BoNTs LC-His10-A2/Backward primer <400> 142 cgcgggagcg ttgtgaccac aaacat 26 <210> 143 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2/Forward primer <400> 143 aaatgattct gcgatcttta ttatgatgtc aaacagctcg ctaccgcctc caccactg 58 <210> 144 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-BoNTs LC-His10-A2/Backward primer <400> 144 atgcccttcg tcaacaaaca gttcaattat aaggatcc 38 <210> 145 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-His10-BoNTs LC-A2/Backward primer <400> 145 gtgatggtga tggtgatggt gatggtggtg ctcgctaccg cctccaccac tg 52 <210> 146 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-His10-BoNTs LC-A2/Backward primer <400> 146 atgcccttcg tcaacaaaca gttcaattat aaggatcc 38 <210> 147 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aurein 1.2-His10-BoNTs LC-A2/Forward primer <400> 147 aaatgattct gcgatcttta ttatgatgtc aaacagtccc tcgctaccgc ctccaccact 60 g 61 <210> 148 <211> 28 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Ile Gly Phe Ile Gly Phe His 370 375 380 Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg 385 390 395 400 Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile 405 410 415 Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 420 425 <210> 150 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD' <400> 150 Met Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser 1 5 10 15 Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly 20 25 30 Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe 35 40 45 Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val 50 55 60 Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile 65 70 75 80 Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile 85 90 95 Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly 100 105 110 Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val 115 120 125 Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg 130 135 140 Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly 165 170 175 Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg 180 185 190 Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys 195 200 205 Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn 210 215 220 Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys 225 230 235 240 Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val 245 250 255 Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly 260 265 270 Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly 275 280 285 Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 290 295 300 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile 325 330 335 Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val 340 345 350 Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met 355 360 365 Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His 370 375 380 Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg 385 390 395 400 Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile 405 410 415 Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu 420 425 <210> 151 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A2 <400> 151 Arg Gly Asn Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser 1 5 10 <210> 152 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A2' <400> 152 Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser 1 5 10 <210> 153 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SV2C <400> 153 Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Arg 1 5 10 15 Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn Phe Thr Ile Asn Phe Thr Met 20 25 30 Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu Tyr Asp Asn Gly Arg Phe Ile 35 40 45 Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe Lys Asp Ser Val Phe Lys Ser 50 55 60 Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val Asn Thr Tyr Phe Lys Asn Cys 65 70 75 80 Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Lys 85 90 95 Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys Ser Phe Phe His Asn Lys Thr 100 105 110 Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp 115 <210> 154 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD <400> 154 atgaaaaaca ttattaatac ttccatactt aacctgcgct acgagtctaa ccatttgatt 60 gacttatcgc ggtacgcttc taaaataaac atcgggagca aggtaaactt tgatccgata 120 gataaaaacc agattcaatt gttcaactta gagtctagta aaatagaggt tattttaaaa 180 aatgccattg tttataactc gatgtacgaa aatttctcga cctcgttttg gatacggata 240 ccgaagtact ttaactctat ttccttgaat aatgagtaca ccatcataaa ttgcatggaa 300 aacaattccg gttggaaagt gtcattaaac tatggcgaga taatttggac tttgcaggac 360 actcaggaga taaagcagcg tgtagtcttt aagtattccc agatgataaa catctcggac 420 tacataaatc gttggatttt tgtaaccata acaaataatc gccttaacaa tagcaaaatt 480 tatatcaacg gccggttgat cgatcaaaaa ccaatttcca acttggggaa catacacgct 540 tcgaataaca tcatgtttaa gcttgacggt tgtagagata cgcatcgcta catttggata 600 aagtatttta acctgtttga caaggagttg aatgagaaag aaattaagga cttatatgat 660 aatcaatcaa acagtgggat attgaaagat ttctggggcg actatcttca gtacgataag 720 ccctattata tgttgaactt atacgaccca aacaaataca ttgacgtaaa caatgtgggt 780 atcagaggat atatgtactt aaagggccca agagggaatg taatgacgac gaacatatac 840 cttaacagca gtctttacat gggcacgaaa ttcataataa aaaaatatgc gtccgggaat 900 aaggacaata ttgtaagaaa taacgaccgt gtatatatca atgtcgtggt caaaaacaaa 960 gagtaccggc tggctaccaa tgcttcccag gcaggtgtcg agaaaatact ttcggcgctt 1020 gaaattccag acgtgggcaa tctgtcacaa gtggtcgtta tgaaaagtaa aaatgatcaa 1080 gggatcacca ataagtgcaa gatgaatttg caagacaata atggtaacga tataggattt 1140 atagggtttc accagttcaa taacatcgct aagctggtcg ctagtaactg gtataataga 1200 caaattgaac ggtccagtcg cacgcttggc tgttcttggg agttcattcc ggttgatgat 1260 ggatggggcg aacgcccact g 1281 <210> 155 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD' <400> 155 atgaaaaaca ttattaatac ttccatactt aacctgcgct acgagtctaa ccatttgatt 60 gacttatcgc ggtacgcttc taaaataaac atcgggagca aggtaaactt tgatccgata 120 gataaaaacc agattcaatt gttcaactta gagtctagta aaatagaggt tattttaaaa 180 aatgccattg tttataactc gatgtacgaa aatttctcga cctcgttttg gatacggata 240 ccgaagtact ttaactctat ttccttgaat aatgagtaca ccatcataaa ttgcatggaa 300 aacaattccg gttggaaagt gtcattaaac tatggcgaga taatttggac tttgcaggac 360 actcaggaga taaagcagcg tgtagtcttt aagtattccc agatgataaa catctcggac 420 tacataaatc gttggatttt tgtaaccata acaaataatc gccttaacaa tagcaaaatt 480 tatatcaacg gccggttgat cgatcaaaaa ccaatttcca acttggggaa catacacgct 540 tcgaataaca tcatgtttaa gcttgacggt tgtagagata cgcatcgcta catttggata 600 aagtatttta acctgtttga caaggagttg aatgagaaag aaattaagga cttatatgat 660 aatcaatcaa acagtgggat attgaaagat ttctggggcg actatcttca gtacgataag 720 ccctattata tgttgaactt atacgaccca aacaaatacg tggacgtaaa caatgtgggt 780 atcagaggat atatgtactt aaagggccca agagggtctg taatgacgac gaacatatac 840 cttaacagca gtctttaccg tggcacgaaa ttcataataa aaaaatatgc gtccgggaat 900 aaggacaata ttgtaagaaa taacgaccgt gtatatatca atgtcgtggt caaaaacaaa 960 gagtaccggc tggctaccaa tgcttcccag gcaggtgtcg agaaaatact ttcggcgctt 1020 gaaattccag acgtgggcaa tctgtcacaa gtggtcgtta tgaaaagtaa aaatgatcaa 1080 gggatcacca ataagtgcaa gatgaatttg caagacaata atggtaacga tataggattt 1140 atagggtttc accagttcaa taacatcgct aagctggtcg ctagtaactg gtataataga 1200 caaattgaac ggtccagtcg cacgcttggc tgttcttggg agttcattcc ggttgatgat 1260 ggatggggcg aacgcccact g 1281 <210> 156 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2 <400> 156 agagggaatg taatgacgac gaacatatac cttaacagca gt 42 <210> 157 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2' <400> 157 gggtctgtaa tgacgacgaa catatacctt aacagcagtc tt 42 <210> 158 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV2C <400> 158 gacgtgataa agccccttca gtcagatgaa tatgcattgc tgactcgcaa cgtggaacgt 60 gacaagtatg ccaattttac cataaatttc acaatggaaa accagatcca tacgggcatg 120 gagtacgaca acggtcggtt tatcggggta aaattcaagt cagtaacctt taaggattcg 180 gtgttcaaaa gttgcacatt tgaggacgtt acctccgtaa acacctactt caaaaattgc 240 acttttattg atacagtatt cgacaacacc gatttcgagc catataaatt catcgacagt 300 gagttcaaga actgcagttt ctttcataat aagaccggct gccagattac tttcgat 357 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28b-EGFP/Forward primer <400> 159 gctaccgcct ccaccgtggt g 21 <210> 160 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28b-EGFP/Backward primer <400> 160 tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaa 29 <210> 161 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD insert/Forward primer <400> 161 agcagccgga tctcacagtg ggcgttcgcc ccatccat 38 <210> 162 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD insert/Backward primer <400> 162 ggtggaggcg gtagcaaaaa cattattaat acttccatac ttaacctgcg ctacgagtct 60 aa 62 <210> 163 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM1/Forward primer <400> 163 tatgaatttc gtgccacggt aaagactgct gtt 33 <210> 164 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM1/Backward primer <400> 164 aacagcagtc tttaccgtgg cacgaaattc ata 33 <210> 165 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM2/Forward primer <400> 165 ttcgtcgtca ttacagaccc tcttgggccc tt 32 <210> 166 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM2/Backward primer <400> 166 aagggcccaa gagggtctgt aatgacgacg aa 32 <210> 167 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM3/Forward primer <400> 167 cacattgttt acgtccacgt atttgtttgg gtc 33 <210> 168 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-RBD' SDM3/Backward primer <400> 168 gacccaaaca aaacgtggac gtaaacaatg tg 32 <210> 169 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-A2/Forward primer <400> 169 ggtggaggcg gtagcagagg gaatgtaatg acgacgaaca tataccttaa cagcagttga 60 gatccggctg ctaacaaagc ccgaaa 86 <210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-A2/Backward primer <400> 170 gtggtggtgg tggtggtgct cg 22 <210> 171 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-Aurein1.2-A2/Forward primer <400> 171 gctaccgcct ccaccggcct gtttgacatc atcaaaaaaa tcgccgaaag ctttgctacc 60 gcctccaccg tggtg 75 <210> 172 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-Aurein1.2-A2/Backward primer <400> 172 agagggaatg taatgacgac gaacatatac cttaacag 38 <210> 173 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-Aurein1.2-RBD/Forward primer <400> 173 gctaccgcct ccaccggcct gtttgacatc atcaaaaaaa tcgccgaaag ctttgctacc 60 gcctccaccg tggtg 75 <210> 174 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-Aurein1.2-RBD/Backward primer <400> 174 gactcgtagc gcaggttaag tatggaagta ttaataatgt tttt 44

Claims (28)

  1. 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된, 신경세포 표적용 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경세포 표적용 단백질은 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)가 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 보툴리눔 신경독소 경쇄인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 보툴리눔 신경독소 경쇄는 서열번호 1 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 저분자 신경-활성 물질인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 저분자 신경-활성 물질은 플라보노이드(flavonoid), 스테로이드(sterioid), 알칼로이드(alkaloid), 스틸베노이드(stilbenoid), 찰코노이드(chalconoid), 컬큐민(curcumin), 베라파밀(verapamil), 6-쇼가올(6-shogaol), 브로모데옥 시우리딘(bromodeoxyuridine), 5-플루오로우라신(5-fluorouracil), 요오드데옥시우리딘(iododeoxyuridine), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 레티노산(retinoic acid), 파클리탁셀(paclitaxel), 카르보플라틴(carboplatin), 아이소나이아지드(isoniazid), 레보도파(levodopa), 및 카르무스틴(carmustine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 신경-활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 저분자 신경-활성 물질을 함유하는 담체인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 담체는 유기미세입자, 무기미세입자 및 자가조립구조체(self-assembled structure)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 형광 단백질인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 서열번호 71 내지 75으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 크산틴 유도체(xanthene derivatives), 시아닌 유도체(cyanine derivatives), 스쿠아레인 유도체(Squaraine derivatives), 스쿠아레인 로탁산 유도체(Squaraine Rotaxane derivatives), 나프탈렌 유도체(naphthalene derivatives), 쿠마린 유도체(coumarin derivatives), 옥사디아졸 유도체(oxadiazole derivatives), 안트라센 유도체(anthracene derivatives), 피렌 유도체(pyrene derivatives), 옥사진 유도체(oxazine derivatives), 아크리딘 유도체(acridine derivatives), 아릴메틴 유도체(arylmethine derivatives) 및 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivatives)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 형광 화합물인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 저분자 형광 화합물을 함유하는 담체인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 담체는 유기미세입자, 무기미세입자 및 자가조립구조체(self-assembled structure)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 미세 반도체 입자인 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  15. 제 2 항에 있어서,
    상기 엔도소말 이스케이프 펩타이드는 서열번호 76 내지 98으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  16. 제 2 항에 있어서,
    상기 엔도소말 이스케이프 펩타이드는 하나 이상이 결합된 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인은 서열번호 99 내지 115으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드는 서열번호 116 내지 120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경세포 표적용 단백질.
  19. 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는, 신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 신경-활성 물질은 신경병증 치료용 물질인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 신경세포 표적용 단백질은 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)가 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 신경병증 치료용 물질은 보툴리눔 신경독소 경쇄, 저분자 신경-활성 물질, 저분자 신경-활성 물질을 함유하는 담체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  22. 제 19 항에 있어서,
    상기 신경병증은 사시, 안검경련, 성대장애, 사경, 심근장애, 궤양, 위산역류질환, 식욕감소, 췌장질환, 튼 살, 절박성 요실금, 치열, 소아마비, 근육통, 엉덩이 기형, 다한증, 허리통증, 경부통, 만성두통 및 뇌신경장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  23. 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 신경세포 표적용 단백질은 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)가 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 보툴리눔 신경독소 경쇄, 저분자 신경-활성 물질, 저분자 신경-활성 물질을 함유하는 담체, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  26. 신경-활성 물질(neuro-active material)에 보툴리눔 독소 단백질의 리셉터 바인딩 도메인(receptor binding domain) 또는 보툴리눔 독소 타입A의 A2 펩타이드(A2 peptide of botulinum neurotoxin type A)가 결합된 신경세포 표적용 단백질을 유효성분으로 포함하는, 신경계 뉴런 표시용 조성물로서,
    상기 신경-활성 물질은 뉴런을 선택적으로 발색시키는 것을 특징으로 하는, 신경계 뉴런 표시용 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 신경세포 표적용 단백질은 엔도소말 이스케이프 펩타이드(endosomal escape peptide)가 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 신경계 뉴런 표시용 조성물.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 신경-활성 물질은 형광 단백질, 저분자 형광 화합물, 저분자 형광 화합물을 함유하는 담체, 미세 반도체 입자, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경계 뉴런 표시용 조성물.
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