DE60008915T2

DE60008915T2 - Konstrukte zur verabreichung von therapeutischen wirkstoffen an die neuronzellen

Info

Publication number: DE60008915T2
Application number: DE60008915T
Authority: DE
Inventors: Clifford Charles Shone; John Mark Sutton; Nigel Silman
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Syntaxin Ltd
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2020-12-05
Also published as: JP4991073B2; AU1719301A; AU768529B2; CA2392202C; WO2001058936A3; ATE261494T1; CA2392202A1; US20090269361A1; WO2001058936A2; JP2003522199A; DK1234043T3; DE60008915D1; PT1234043E; US20120128700A1; EP1234043A2; ES2216996T3; EP1234043B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konstrukte für die Zufuhr therapeutischer Substanzen an neuronale Zellen, auf die Herstellung und Verwendung davon, und insbesondere auf Konstrukte, basierend auf Clostridienneurotoxinen.
Es gibt derzeit wenige wirksame Behandlungen für Hauptstörungen des zentralen Nervensystems. Solche Störungen schließen neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall, Epilepsie, Hirntumoren, Infektionen und HIV-Enzephalopathie ein und Leidende dieser Erkrankungen übertreffen die Erkrankungsziffern von Krebs- und Herzerkrankungen bei weitem. Die Anzahl Leidender an ZNS-Erkrankungen wie Schlaganfall und neurodegenerativen Erkrankungen ist dabei zu wachsen, insbesondere in entwickelten Ländern, wo das Durchschnittsalter der Bevölkerung ansteigt. Indem sich unser Verständnis der Gehirnpharmakologie erhöht und die zu Grunde liegenden Pathologien der Erkrankungen beleuchtet werden, werden mögliche therapeutische Strategien offensichtlich. Alle diese Behandlungen sehen sich jedoch dem gewaltigen Problem der wirksamen Zufuhr von Therapeutika zu den verschiedenen neuronalen Zellpopulationen, die involviert sind, gegenüber. Vektoren, die eine wirksame Zufuhr an neuronale Zellen bewirken können, werden folglich für ein breites Spektrum an therapeutischen Substanzen, einschließlich Arzneimitteln, Enzymen, Wachstumsfaktoren, therapeutischen Peptiden und Genen benötigt.
Ischämie-/Reperfusionsverletzung, induziert durch Schlaganfall oder Verletzung, ist ein bemerkenswertes Beispiel, bei welchem die schnelle und wirksame Zufuhr therapeutischer Mittel einen bemerkenswerten Nutzen leisten würde. Neuronen, die durch Trauma oder Ischämie verletzt wurden, erzeugen erhöhte Spiegel freier Sauerstoffradikale und setzen große Mengen an Glutamat frei. Diese Substanzen sind in hohen Konzentrationen toxisch, sowohl für Neuronen als auch für umgebende Zellen, die den Schadensvorgang potenzieren und verstärken. Von Mitteln wie z. B. Superoxiddismutase oder Glutaminsynthetase, die die Spiegel dieser toxischen Substanzen reduzieren, wurde gezeigt, dass sie den neuronalen Zelltod in eine Reihe an in vitro und in vivo Ischämiemodellen reduzieren (Gorovits et al., PNAS (1997), 94, 7024–7029; Francis et al., Experimental Neurology (1997), 146, 435–443; Lim et al., Ann. Thorac. Surg. (1986), 42, 282–286; Cuevas et al., Acta Anat. (1990), 137, 303–310). Ein Hauptproblem bei der Verwendung solcher Therapien ist die Zufuhr nützlicher Konzentrationen des aktiven Mittels zu der Traumastelle. Spezifische neuronale Vektoren könnten deswegen eine wichtige Rolle beim Richten solcher Verbindungen auf neuronale Zellen spielen.
Störungen des peripheren Nervensystems, wie z. B. Motoneuronerkrankung, sind weitere Beispiele von Erkrankungen, die aus der gerichteten Zufuhr therapeutischer Mittel einen Nutzen ziehen würden. Solche Therapien könnten die Form der Arzneimittelzufuhr oder DNS-Zufuhr im Wege von Gentherapiestrategien annehmen.
Gentherapie enthält ein bemerkenswertes Versprechen für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinsonsche und Alzheimersche Erkrankungen. Den meisten der zur Zeit erhältlichen viralen und aviralen Genzufuhrvektoren fehlt die Gewebsspezifität, was sowohl ihre Wirksamkeit als auch die Sicherheit der Verwendung reduziert. Geeignete neuronale, zellspezifische Zielliganden werden deshalb für einen breiten Bereich von Genvektoren benötigt, um zu ermöglichen, dass wirksame Behandlungen für neuronale Erkrankungen entwickelt werden.
Die Botulinunmeurotoxine sind eine Familie von Proteintoxinen, deren primäre Wirkstelle die motorische Endplatte ist, wo sie die Freisetzung des Transmitters Acetylcholin hemmen. Die Wirkung dieser Toxine auf das periphere Nervensystem von Mensch und Tieren resultiert in dem Syndrom Botulismus, das durch eine ausgedehnte schlaffe Muskelparalyse gekennzeichnet ist (Shone (1986) in "Natural Toxicants in Foods", Herausgeber D. Watson, Ellis Harwood, UK). Jedes der Botulinumneurotoxine besteht aus zwei disulfidgekoppelten Untereinheiten; einer 100 kDa schweren Untereinheit, die eine Rolle spielt bei der anfänglichen Bindung und Aufnahme des Neurotoxins in die Nervenendigung (Dolly et al. (1984), Nature, 307, 457–460) und einer 50 kDa leichten Untereinheit, die intrazellulär wirkt, um den Exozytosevorgang zu hemmen (McInnes und Dolly (1990), Febs Lett., 261, 323–326; de Paiva und Dolly (1990), Febs Lett., 277, 171–174).
Die Clostridienneurotoxine sind potente Inhibitoren der calcium-abhängigen Neurotransmittersekretion in neuronalen Zellen. Man denkt gegenwärtig, dass sie diese Aktivität durch eine spezifische endoproteolytische Spaltung von wenigstens einem von drei mit Vesikeln oder presynaptischer Membran verbundenen Proteinen, VAMP, Syntaxin oder SNAP-25, übermitteln, die zentral sind für das Andocken der Vesikel und die Membranfusionsereignisse der Neurotransmittersekretion. Von dem Anvisieren neuronaler Zellen durch Tetanus- und Botulinumneurotoxine wird angenommen, dass es ein rezeptorvermitteltes Ereignis ist, nach welchem die Toxine aufgenommen werden und nachfolgend zu dem passenden intrazellulären Kompartiment wandern, wo sie ihre Endopeptidaseaktivität bewirken.
Clostridienneurotoxine teilen eine gemeinsame Architektur einer katalytischen L-Kette (LC, ca. 50 kDa), die an eine rezeptorbindende und translozierende H-Kette (HC, ca. 100 kDa) über Disulfidbrücken gekoppelt ist. Von dem HC-Polypeptid wird angenommen, dass es alles oder einen Teil von zwei verschiedenen funktionellen Domänen umfasst. Die carboxyterminale Hälfte von HC, bezeichnet als die H_C-Domäne (ca. 50 kDa), ist in die hochaffine, neurospezifische Bindung des Neurotoxins an Zelloberflächenrezeptoren auf dem Zielneuron verwickelt, wohingegen von der aminoterminalen Hälfte, bezeichnet als die H_N-Domäne (ca. 50 kDa), angenommen wird, dass sie die Translokation von wenigstens einem gewissen Teil des Neurotoxins über zelluläre Membranen vermittelt, dergestalt, dass die funktionale Aktivität der LC innerhalb der Zielzelle exprimiert wird. Die H_N-Domäne hat auch die Fähigkeit, unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert, ionendurchlässige Kanäle in Lipidmembranen zu bilden, und dies kann in irgendeiner Weise einen Zusammenhang mit ihrer Translokationsfunktion haben. Für Botulinumneurotoxin Typ A (BoNT/A) wird von diesen Domänen angenommen, dass sie sich innerhalb den Aminosäureresten 872–1296 für H_C, den Aminosäureresten 449–871 für H_N und den Resten 1–448 für LC befinden.
Es ist deswegen möglich, funktionelle Definitionen der Domänen innerhalb des Neurotoxinmoleküls bereitzustellen, wie folgt:

(A) Leichte Kette von Clostridienneurotoxin:
– eine Metalloprotease, die eine hohe Substratspezifität für Vesikel- und/oder Plasmamembran-assoziierte Proteine ausübt, die in den Exozytosevorgang verwickelt sind. Insbesondere spaltet sie eines oder mehrere von SNAP-25, VAMP (Synaptobrevin/Cellubrevin) und Syntaxin.
(B) H_N-Domäne der schweren Kette von Clostridienneurotoxin:
– ein Teil der schweren Kette, der die Translokation jenes Teils des Neurotoxinmoleküls ermöglicht, derart, dass eine funktionelle Expression der Aktivität der leichten Kette innerhalb einer Zielzelle geschieht;
– die Domäne, die verantwortlich ist für die Translokation der Endopeptidaseaktivität in die Zielzelle, gefolgt von der Bindung des Neurotoxins an seinen spezifischen Zelloberflächenrezeptor über die Bindungsdomäne;
– die Domäne, die verantwortlich ist für die Bildung von ionendurchlässigen Poren in Lipidmembranen unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert.
(C) H_C-Domäne der schweren Kette von Clostridienneurotoxin:
– ein Teil der schweren Kette, der verantwortlich ist für die Bindung des nativen Holotoxins an Zelloberflächenrezeptor(en), was verwickelt ist in die vergiftende Wirkung des Clostridienneurotoxins vor der Aufnahme des Toxins in die Zelle.

Die Identität der zellulären Erkennungsmarker für diese Toxine wird gegenwärtig nicht verstanden und bis jetzt wurden keine spezifischen Rezeptorarten identifiziert, obwohl Kozaki et al. berichteten, dass Synaptotagmin der Rezeptor für Botulinumneurotoxin Typ B sein könnte. Es ist möglich, dass jedes der Neurotoxine einen unterschiedlichen Rezeptor hat.
Tetanustoxin ist strukturell sehr ähnlich mit den Botulinumneurotoxinen, sein Hauptwirkort ist jedoch das zentrale Nervensystem, wo es die Freisetzung inhibitorischer Neurotransmitter von zentralen Synapsen (Renshaw-Zellen) hemmt.
Von Tetanus- und den Botulinumneurotoxinen der meisten der sieben Serotypen, gemeinsam mit ihren abgeleiteten schweren Ketten, wurde gezeigt, dass sie an eine breite Reihe neuronaler Zelltypen mit hohen Affinitäten im nM-Bereich binden, z. B. Botulinum-Typ-B-Neurotoxin (Evans et al. (1986), Eur. J. Biochem., 154, 409–416).
Ein Haupthindernis für die Verwendung natürlicher Fragmente schwerer Ketten von Clostridien als Zufuhrvektoren ist jedoch, dass ihr hoch aggregierter Zustand in Lösung ihre angemessene Diffusion in Körpergewebe verhindert und folglich ihre Wirksamkeit als Zielvektoren reduziert. Ein weiteres signifikantes Problem jeglicher vorgeschlagener klinischer Verwendung natürlicher Tetanustoxinfragmente als neuronale Zielliganden für Therapeutika ist das Vorhandensein zirkulierender Antikörper für das Toxin in der Mehrheit der Bevölkerung, die gegen Tetanus immunisiert worden ist. Die Anwesenheit dieser Antikörper wird wahrscheinlich die Wirksamkeit von Konstrukten, die auf Tetanustoxinfragmenten basieren, reduzieren. Folglich bieten Clostridienneurotoxinfragmente keine Lösungen für die identifizierten Probleme an.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung der praktischen Schwierigkeiten bei der Verwendung von therapeutischen Zubereitungen, die auf Clostridienneurotoxin basieren, und dem Ersinnen modifizierter Polypeptide und von Hybridpolypeptiden, basierend auf Clostridienneurotoxinfragmenten, die die zuvor genannten Nachteile vermeiden.
EP-A-439 954 offenbart ein ternäres Hybridprotein, worin eine Bindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine chemische Einheit den Zellen zuzuführen ist. Dieses Dokument bezieht sich nicht auf die Verwendung von Clostridienproteinen als Bindungsdomänen.
WO-A-99/09057 beschreibt ein Verfahren für die in vivo-Zufuhr einer gewünschten Zubereitung in das menschliche oder tierische Nervensystem. Die Zubereitung umfasst ein nicht-toxisches, proteolytisches Fragment von Tetanustoxin, fähig Nervenzellen zu binden, und welches retrograd durch eine Synapse transportiert wird, in Verbindung mit wenigstens einem Molekül mit einer biologischen Funktion.
WO-A-99/17806 offenbart eine Klasse an Mitteln, umfassend ein Galactose-bindendes Lectin, gekoppelt an ein Derivat eines Clostridienneurotoxins (L-Kette). Diese Mittel können bei der Behandlung von chronischem Schmerz verwendet werden.
Demgemäß stellt ein erster Aspekt der Erfindung eine Zubereitung bereit, die ein therapeutisches Mittel umfasst, gekoppelt an ein Polypeptid, worin das Polypeptid ein nicht-toxisches Polypeptid ist, für die Zufuhr eines Heilmittels an eine neuronale Zelle, umfassend:
eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist aus oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und
eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt,
worin die Translokationsdomäne keine H_N-Domäne eines Clostridientoxins und kein Fragment oder Derivat einer H_N-Domäne eines Clostridientoxins ist und worin das Heilmittel für die Reduktion neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reperfusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Beschädigung ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird auch eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid für die Übermittlung eines Heilmittels an eine neuronale Zelle ist, umfassend:
eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist aus oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und
eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt,
worin die Translokationsdomäne eine nicht aggregierende Translokationsdomäne ist, wie bestimmt durch seine Größe in physiologischem Puffer, und worin das Heilmittel für die Reduktion von neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reperfusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Beschädigung ist.
Ob das Konstrukt ein aggregierendes ist, ist gewöhnlich offensichtlich aus einem Fehlen der Lösbarkeit des Konstruktes und dies kann gesehen werden nach einfacher visueller Betrachtung des Konstruktes in wässrigen Medien: nicht aggregierende Domänen resultieren in Konstrukten der Erfindung, die teilweise oder vorzugsweise vollständig löslich sind, wohingegen aggregierende Domänen in nicht löslichen Aggregaten von Polypeptiden mit offensichtlichen Größen, entsprechend etlichen zehn oder sogar hundert Mal der Größe eines einzelnen Polypeptids. Im Allgemeinen sollte das Konstrukt nicht aggregierend sein, wie gemessen durch die Größe auf Gelelektrophorese, und die Größe oder offensichtliche Größe des gemessenen Konstruktes sollte vorzugsweise geringer als 5,0 × 10⁵ Dalton, bevorzugter geringer als 1,5 × 10⁵ Dalton, sein, wobei die Messung geeigneterweise auf natürlichem PAGE durchgeführt wird unter Verwendung von physiologischen Bedingungen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid für die Zufuhr eines Heilmittels an eine neuronale Zelle ist, umfassend:
eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist aus oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und
eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt,
worin die Translokationsdomäne ausgewählt ist aus (1) einer H_N-Domäne eines Diphtherietoxins, (2) einem Fragment oder Derivat von (1), das im Wesentlichen die Translokationsaktivität der H_N-Domäne eines Diphtherietoxins behält, (3) einem fusogenen Peptid, (4)einem Peptid, das die Membran unterbricht, und (5) translozierenden Fragmenten Derivaten von (3) und (4) und worin das Heilmittel für die Reduktion neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reprofusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Schädigung ist.
Es ist festzustellen, dass Botulinumtoxin C₂ kein Neurotoxin ist, da es keine neuronale Spezifität hat, stattdessen ist es ein Enterotoxin und geeignet für die Verwendung in der Erfindung, um eine nicht aggregierende Translokationsdomäne bereitzustellen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid für die Zufuhr eines Heilmittels an eine neuronale Zelle ist, umfassend:
eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist aus oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und
eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt,
worin das Polypeptid eine reduzierte Affinität für neutralisierende Antikörper für Tetanustoxin im Vergleich zu der Affinität für solche Antikörper von natürlichem Tetanustoxin hat, und worin das Heilmittel für die Reduktion neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reprofusion oder für die Förderung von neuronalem Wachstum nach Beschädigung ist.
Die obigen Aspekte können einzeln oder in jeglicher Kombination durch Polypeptide der Erfindung ausgeübt werden und folglich (i) fehlen einem typischen bevorzugten Polypeptid der Erfindung die neurotoxischen Aktivitäten von Botulinum- und Tetanustoxinen, (ii) zeigt ein typisches bevorzugtes Polypeptid der Erfindung eine hohe Affinität für neuronale Zellen, entsprechend der Affinität eines Clostridienneurotoxins für jene Zellen, (iii) enthält ein typisches bevorzugtes Polypeptid der Erfindung eine Domäne, die eine Translokation über Zellmembranen bewirken kann, und (iv) kommt ein typisches bevorzugtes Polypeptid der Erfindung in einem weniger aggregierten Zustand vor als die entsprechende schwere Kette von Botulinum- oder Tetanustoxinen in physiologischen Puffern.
Ein signifikanter Vorteil der Polypeptide der Erfindung ist ihr nicht aggregierter Zustand, wodurch sie als lösliche Polypeptide verwendbar gemacht werden, wo es die Konstrukte im Stand der Technik nicht sind, und sie überwinden folglich die meisten, wenn nicht alle der Nachteile vorhergehender Konstrukte, die auf Clostridienneurotoxinen basieren.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung schließen im Allgemeinen Sequenzen der H_C-Domänen der Botulinum- und Tetanusneurotoxine ein und diese werden kombiniert mit funktionellen Domänen von anderen Proteinen, dergestalt, dass die wesentlichen Funktionen der natürlichen schweren Kette, nämlich das Binden an neuronale Zellen, beibehalten wird. Folglich wird z. B. die H_C-Domäne von Botulinum-Typ-F-Neurotoxin mit der Translokationsdomäne, abgeleitet von Diphtherietoxin, verschmolzen, um ein modifiziertes Fragment einer schweren Kette von Clostridien zu ergeben. Überraschenderweise sind solche Polypeptide nützlicher als Konstrukte für die Zufuhr von Substanzen an neuronale Zellen als die natürlichen schweren Ketten von Clostridien.
Folglich wird gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ein Polypeptid bereitgestellt mit einer Aminosäure, umfassend (a) eine Untersequenz, basierend auf dem H_C-Fragment von Botulinum- oder Tetanusneurotoxin, und (b) eine Untersequenz, basierend auf einer Translokationsdomäne, z. B. von Diphtherietoxin, die nicht von einem Clostridienneurotoxin abgeleitet wird, und worin besagtem Polypeptid (i) die Neurotoxinwirkungen von Botulinum- und Tetanustoxinen fehlen, (ii) es eine hohe Affinität für neuronale Zelle zeigt, (iii) es eine Domäne enthält, die eine Translokation über Zellmembranen hinweg bewirken kann, und (iv) es in physiologischen Puffern in einem weniger aggregierten Zustand vorliegt als die entsprechende schwere Kette von Botulinum- oder Tetanustoxinen.
Die modifizierte schwere Kette von Clostridien wird geeigneterweise durch Kombinieren der Bindungsdomäne (H_C-Domäne) eines Clostridienneurotoxins mit einer Translokationsdomäne, die nicht von Clostridien stammt, hergestellt. Folglich kann z. B. ein modifiziertes Fragment einer schweren Kette von Clostridien aus der Translokationsdomäne von Diphtherietoxin (Reste 194–386) konstruiert werden, verschmolzen mit der H_C-Domäne von einem Botulinumtoxin (z. B. dem Typ F H_C-Fragment, Reste 865–1278; dem Typ A H_C-Fragment, Reste 872–1296).
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die modifizierte schwere Kette von Clostridien erzeugt durch Kombinieren der H_C-Domäne eines Clostridienneurotoxins mit einem Peptid, das die Membran durchbricht, das als eine Translokationsdomäne dient, geeigneterweise ein virales Peptid. Folglich kann z. B. ein modifiziertes Fragment der schweren Kette von Clostridien durch Kombinieren der H_C-Domäne eines Botulinumtoxins mit einem Peptid, basierend auf dem Influenzavirus-Hämagglutinin HA2 (Reste 1–23), konstruiert werden.
Die Polypeptide der Erfindung haben Eigenschaften, die sie als neuronale Zielliganden nützlich machen; sie sind untoxisch und behalten doch die spezifische, hochaffine Bindung an neuronale Zellen bei, die von Botulinum- oder Tetanustoxinen gezeigt werden. Anders als die natürlichen schweren Ketten von Clostridien, liegen die modifizierten schweren Ketten von Clostridien jedoch in einem weniger aggregierten Zustand in Lösung vor, was ihren Zugang zu neuronalen Zellen verbessert. Die bevorzugten Konstrukte sind in wässriger Lösung löslich, im Gegensatz zum hoch aggregierten Zustand der Konstrukte im Stand der Technik.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein modifiziertes Fragment der schweren Kette von Tetanus bereitgestellt, welches zusätzlich zu den Eigenschaften der oben definierten modifizierten schweren Ketten den weiteren Vorteil hat, dass es eine reduzierte Affinität für reutralisierende Antikörper hat, die als ein Ergebnis der Antitetanusinokulierung vorhanden sind, im Vergleich zu der schweren Kette natürlichen Tetanustoxins. Die Polypeptide gemäß diesem Aspekt der Erfindung schließen im allgemeinen Untersequenzen ein, die abgeleitet sind von der schweren Kette von Tetanustoxin (Reste 458–1315) und von welchen Epitope, die verantwortlich sind für die Immunogenität von Tetanustoxin, optional reduziert oder entfernt wurden. Folglich ist es z. B. wünschenswert, immunogene Epitope, die mit der H_C-Domäne verknüpft sind, ebenso wie jene der H_N-Domäne, zu eliminieren. Obwohl es möglich ist, Epitope zu eliminieren, indem eine kleinere Zahl an Aminosäuren (z. B. weniger als 20 oder vorzugsweise weniger als 10 Aminosäuren) entfernt wird, wurde herausgefunden, dass Epitope, die mit der Immunogenität der schweren Kette von Tetanustoxin verknüpft sind, genauer reduziert werden können durch Ersetzen einer großen Anzahl von Aminosäureresten (z. B. wenigstens 100, wenigstens 200 und vorzugsweise 400 oder mehr Reste) mit Aminosäuresequenzen von anderen Toxinen.
Folglich wird gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung, der sich auf modifizierte schwere Ketten von Tetanus bezieht, ein Polypeptid bereitgestellt mit einer Aminosäuresequenz, umfassend (a) eine H_N-Domäne, abgeleitet von einer Nicht-Clostridienquelle (z. B. Diphtherietoxin), (b) eine oder mehrere Untersequenzen, abgeleitet von der Sequenz einer Botulinum-H_C; und (c) eine oder mehrere Untersequenzen, abgeleitet von der Sequenz von Tetanustoxin-H_C, und worin diesem Polypeptid (i) die Neurotoxinaktivitäten von Botulinum- und Tetanustoxinen fehlen, (ii) es eine hohe Affinität für neuronale Zellen zeigt, was der neuronalen Bindung von Tetanusneurotoxin entspricht, (iii) es eine Domäne enthält, die eine Translokation über Zellmembranen bewirken kann, und (iv) es eine geringe Affinität für neutralisierende Antikörper von Tetanustoxin hat, die vorhanden sind als ein Ergebnis der Antitetanusinokulierung.
Das letztere modifizierte Fragment der schweren Kette von Tetanus kann hergestellt werden durch Kombinieren der Bindungsdomäne (H_C-Domäne) des Tetanusneurotoxins mit einer Nicht-Clostridien-Translokationsdomäne. Folglich kann z. B. ein modifiziertes Fragment der schweren Kette von Tetanus konstruiert werden aus der Translokationsdomäne von Diphtherietoxin (Reste 194–386), verschmolzen mit der H_C-Domäne eines Tetanustoxins (Reste 865–1315).
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die modifizierte schwere Kette von Tetanus abgeleitet von einer Nicht-Clostridien-Translokationsdomäne, die mit der H_C- Domäne eines Botulinumtoxins verschmolzen ist, in welches die Mindestdomänen von Tetanustoxin eingefügt sind, um eine tetanustoxinähnliche Bindungsaktivität auf das resultierende Hybrid zu übertragen. Folglich kann z. B. eine modifizierte schwere Kette von Tetanus konstruiert werden aus der Translokationsdomäne von Diphtherietoxin (Reste 194–386), verschmolzen mit der H_C-Domäne eines Botulinum-Typ-F-Fragmentes (Reste 865–1278), in welchem die Reste 1097–1273 von letzterem ersetzt wurden durch homologe Sequenzen von Tetanustoxin.
Die modifizierten schwere Ketten von Tetanus haben Eigenschaften, die sie nützlich machen als neuronale Zielliganden; sie sind nicht toxisch und bewahren doch die spezifische, hochaffine Bindung an neuronale Zellen bei, die von Tetanustoxin gezeigt wird. Anders als natürliche Bindungsfragmente von Tetanustoxin haben die modifizierten Clostridienbindungsfragmente jedoch unterschiedliche immunogene Eigenschaften, die sie klinisch nützlicher machen. Besonders reduzieren die unterschiedlichen immunogenen Eigenschaften der modifizierten Clostridienbindungsfragmente der Erfindung signifikant die Probleme, die durch vorhandene Antikörper für natürliche Tetanustoxinsequenzen hervorgerufen werden.
Während die Verwendung modifizierter schwerer Ketten, basierend auf Botulinumneurotoxinen, als neuronale Zielliganden nicht unter dem Problem bereits existierender, zirkulierender Antikörper leiden, ist Tetanustoxin einzigartig unter den Clostridientoxinen darin, dass es eine Selektivität für inhibitorische Neuronen (z. B. Renshaw-Zellen) hat, und als solche sind modifizierte schwere Ketten von Tetanustoxin wertvolle Zielliganden für diese Neuronenklasse. Tetanustoxin hat auch die Eigenschaft, dass es retrograd von dem peripheren zum zentralen Nervensystem transportieren kann.
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien mit einem Linkerpeptid über den N-Terminus der Translokationsdomäne verschmolzen, an welche eine Polypeptidladung angehängt werden kann. Ein Beispiel solch eines Linkerpeptids ist die Sequenz CGLVPAGSGP (SEQ ID Nr. 1), welche die Thrombinproteasespaltungsstelle und einen Cysteinrest für die Disulfidbrückenbildung enthält. Solch ein Peptidlinker ermöglicht die Erzeugung eines rekombinanten Fusionsprotems, umfassend ein therapeutisches Polypeptidmolekül, verschmolzen durch das Linkerpeptid mit dem N-Terminus des modifizierten Fragmentes der schweren Kette von Clostridien. Das letztere Einzelkettenfusionsprotein kann dann mit Thrombin behandelt werden, um ein zweikettiges Protein zu ergeben, in welchem das Polypeptidtherapeutikum mit der Translokationsdomäne des modifizierten Fragmentes der schweren Kette von Clostridien durch eine Disulfidbindung gekoppelt ist. In einem anderen Beispiel eines Linkerpeptides, in welchem die Translokationsdomäne keinen freien Cysteinrest in der Nähe ihres C-Terminus enthält, wie es z. B. der Fall ist, wenn die Translokationsdomäne ein fusogenes Peptid ist, enthält das Linkerpeptid beide Cysteinreste, die für die Disulfidbrücke benötigt werden. Ein Beispiel jenes letzteren Linkerpeptides ist die Aminosäuresequenz: CGLVPAGSGPSAGSSAC (SEQ ID Nr. 2).
In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die modifizierte schwere Kette von Clostridien an ein Polypeptid gekoppelt, das ein Enzym, Wachstumsfaktor, Protein oder Peptid sein kann, welches einen therapeutischen Nutzen hat, wenn es an neuronale Zellen verabreicht wird. Das Polypeptid kann mit der modifizierten schweren Kette von Clostridien durch chemische Mittel verknüpft sein. Alternativ kann das Polypeptid als ein Fusionsprotein erzeugt werden, verknüpft mit dem modifizierten Clostridienbindungsfragment durch eine Rekombinationstechnik unter Verwendung der oben beschriebenen Linkerpeptide. In solch einem Beispiel würde das Konstrukt die folgenden Bestandteile enthalten:
eine therapeutische Polypeptidsubstanz;
ein Linkerpeptid; und
eine modifizierte schwere Kette von Clostridien.
Ein Beispiel einer therapeutischen Polypeptidladung ist Superoxiddismutase.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die modifzierte schwere Kette von Clostridien direkt oder indirekt an DNS gekoppelt, dergestalt, dass das Konstrukt in der Lage ist, die DNS neuronalen Zellen zuzuführen, z. B. über den Rezeptor für Tetanustoxin. Solche Konstrukte haben Anwendungen in der Gentherapie und können verwendet werden, um ausgewählte Gene in der Zelle anzuschalten oder abzuschalten. Die DNS kann innerhalb einem Liposom enthalten sein oder kann über ein Peptid oder Protein verdichtet sein. Die modifizierte schwere Kette von Clostridien kann chemisch an das Protein gekoppelt sein, das die DNS-Verdichtung durch chemische Kopplungsmittel bewirkt. Alternativ kann die modifizierte schwere Kette von Clostridien erzeugt werden als ein Fusionsprotein durch eine Rekombinationstechnik mit einem Peptid, das die Verdichtung von DNS bewirken kann.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung kann das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien mit einem rekombinanten Virus gekoppelt sein, so dass das modifizierte Virus einen geänderten Tropismus hat und in der Lage ist, Zellen über den Tetanustoxinrezeptor zu transduzieren. Solch ein Konstrukt ist nützlich, um genetische Defekte innerhalb von neuronalen Zellen durch Anschalten oder Abschalten ausgewählter Gene zu korrigieren. Das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien kann direkt an die Oberfläche des Virus unter Verwendung von chemischen Vernetzungsmitteln gekoppelt sein. Alternativ kann das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien mit dem rekombinanten Virus über einen Antikörper gekoppelt sein, der spezifisch an das Virus binden kann. In diesem Beispiel ist das modifizierte Clostridienbindungsfragment chemisch an einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gekoppelt, der spezifisch einen Marker auf der Oberfläche des Virus erkennt. Ein ähnliches modifiziertes Fusionsprotein aus einem Clostridienbindungsfragment und einem Antikörper könnte durch Rekombinationstechnik erzeugt werden, in welchem der Antikörperbestandteil ein rekombinanter Einzelkettenantikörper ist.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien an ein Arzneimittelfreisetzungssystem wie z. B. ein Mikropartikel gekoppelt, gebildet aus einem geeigneten Polymer, z. B. Poly(lactid-co-glycolid), Polyhydroxylalkonat, Collagen, Poly(divinylether-co-maleinanhydrid), Polystyrol-co-maleinanhydrid) oder aus einem anderen Polymer, der nützlich ist in solchen Mikropartikeln. Das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien kann an das Arzneimittelfreisetzungssystem durch eine kovalente chemische Kopplung oder elektrostatisch oder über hydrophobe Kräfte gekoppelt sein. Das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien kann auch in dem Freisetzungsvehikel gemeinsam mit der therapeutischen Ladung verkapselt sein, vorausgesetzt, dass ein Teil des modifizierten Clostridienbindungsfragmentes an der Oberfläche exponiert ist. Alternativ kann das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien entweder am N- oder C-terminalen Ende an ein Peptid oder Protein gekoppelt sein, um das Koppeln des Fragmentes an das Arzneimittelfreisetzungssystem zu erleichtern.
Andere Strategien sind bekannt, durch welche modifizierte Bindungsfragmente schwerer Ketten an eine Reihe therapeutischer Substanzen unter Verwendung einer Anzahl etablierter chemischer Quervernetzungstechniken gekoppelt werden können, und eine Anzahl an Fusionsproteinen kann erzeugt werden, die ein modifiziertes Clostridienbindungsfragment und ein anderes Polypeptid enthalten. Unter Verwendung dieser Techniken kann eine Anzahl an Substanzen auf neuronale Zellen gerichtet werden unter Verwendung der modifizierten Clostridienbindungsfragmente. Beispiele möglicher Verwendungen der modifizierten Clostridienbindungsfragmente als neuronale Zufuhrvektoren sind detaillierter unten in Tabelle 1 wiedergegeben.
Konstrukte der Erfindung können entweder in neuronales oder nicht neuronales Gewebe eingefügt werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Durch die anschließende spezifische Bindung an neuronales Zellgewebe übt das gerichtete Konstrukt seine therapeutischen Wirkungen aus. Idealerweise wird das Konstrukt in der Nähe einer Stelle injiziert, die der therapeutischen Intervention bedarf.
Das Konstrukt der Erfindung kann als eine Suspension, Emulsion, Lösung oder als ein gefriergetrocknetes Pulver in Abhängigkeit von der Anwendung und den Eigenschaften der therapeutischen Substanz hergestellt werden. Das Konstrukt der Erfindung kann in Abhängigkeit von der Anwendung in einer Reihe pharmazeutisch annehmbarer Flüssigkeiten resuspendiert oder verdünnt werden.
"Clostridienneurotoxin" bedeutet entweder Tetanusneurotoxin oder eines der sieben Botulinumneurotoxine, wobei letztere als Serotypen A, B, C₁, D, E, F oder G bezeichnet werden. "Modifiziertes Fragment der schweren Kette von Clostridien" bedeutet ein Polypeptidfragment, das an neuronale Zellrezeptoren in einer ähnlichen Weise bindet wie eine entsprechende schwere Kette, die abgeleitet ist von Botulinum- oder Tetanustoxin, das sich jedoch in seiner Aminosäuresequenz und seinen Eigenschaften unterscheidet, im Vergleich zu dem von Tetanus abgeleiteten entsprechenden Fragment.
"Binden" in Bezug auf die Fragmente der schweren Kette von Botulinum und Tetanus bedeutet die spezifische Wechselwirkung zwischen dem Clostridienfragment und einem oder mehreren Zelloberflächenrezeptoren oder -markern, was in der Lokalisierung des Bindungsfragmentes auf der Zelloberfläche resultiert. In dem Falle von Clostridienneurotoxinen kann die Eigenschaft eines Fragmentes, dass es in der Lage ist, wie ein Fragment eines vorbestimmten Serotyps zu "binden", durch ein Konkurrieren des Liganden und des natürlichen Toxins für dessen neuronalen Zellrezeptor gezeigt werden.
"Hochaffine Bindung, spezifisch für neuronale Zellen, entsprechend jener eines Clostridienneurotoxins" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Liganden, stark an Zelloberflächenrezeptoren neuronaler Zellen, die in das spezifische Binden eines bestimmten Neurotoxins verwickelt sind, zu binden. Die Fähigkeit eines vorbestimmten Liganden, stark an diese Zelloberflächenrezeptoren zu binden, kann unter Verwendung gewöhnlicher kompetitiver Bindungstests abgeschätzt werden. In solchen Untersuchungen wird radioaktiv markiertes Clostridienneurotoxin mit neuronalen Zellen in der Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an Liganden, die nicht radioaktiv markiert sind, in Kontakt gebracht. Die Ligandmischung wird mit den Zellen bei einer niedrigen Temperatur (0–3°C) inkubiert, um die Aufnahme des Liganden zu verhindern, in welcher Zeit die Konkurrenz zwischen dem radioaktiv markierten Clostridienneurotoxin und dem nicht markierten Liganden geschehen kann. In solchen Untersuchungen wird, wenn der verwendete, nicht markierte Ligand derselbe ist wie der des markierten Neurotoxins, das radioaktiv markierte Clostridienneurotoxin von den neuronalen Zellrezeptoren verdrängt werden, wie die Konzentration des nicht markierten Neurotoxins erhöht wird. Die Konkurrenzkurve, die in diesem Fall erhalten wird, wird deswegen repräsentativ sein für das Verhalten eines Liganden, das eine "hochaffine Bindung, spezifisch für neuronale Zellen, entsprechend jener eines Clostridienneurotoxins" zeigt, wie hierin verwendet.
"Translokationsdomäne" bedeutet eine Domäne oder ein Fragment eines Proteins, das den Transport von sich selber und/oder anderen Proteinen und Substanzen über eine Membran oder Lipiddoppelschicht bewirkt. Die letztere Membran kann jene eines Endosoms sein, wo die Translokation während des Vorgangs der rezeptorvermittelten Endozytose geschehen wird. Translokationsdomänen können häufig identifiziert werden durch die Eigenschaft, dass sie in der Lage sind, messbare Poren in Lipidmembranen bei einem niedrigen pH-Wert zu bilden (Shone et al., Eur. J. Biochem., 167, 175–180). Beispiele von Translokationsdomänen sind detaillierter unten in 1 dargestellt. In der Anmeldung wird auf Translokationsdomänen häufig Bezug genommen als "H_N-Domänen".
"Translokation" in Bezug auf Translokationsdomäne meint die Aufnahmeereignisse, die nach der Bindung an die Zelloberfläche geschehen. Diese Ereignisse führen zu dem Transport von Substanzen in das Cytosol neuronaler Zellen.
"Therapeutische Substanzen" oder "Mittel" bedeutet jede Substanz, Mittel oder Mischung davon, die, falls sie durch das modifizierte Clostridienbindungsfragment zugeführt wird, nützlich sein würde bei der Behandlung neuronaler Erkrankungen. Beispiele dieser schließen Arzneimittel, Wachstumsfaktoren, Enzyme und DNS ein, verpackt in unterschiedlichen Formen (z. B. modifizierte Viren, kationische Liposome und verdichtete DNS).
In der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung durch Exprimieren einer Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert, in einer Wirtszelle bereitgestellt, und die Verwendung eines Polypeptids oder einer Zubereitung gemäß der Erfindung bei der Behandlung eines Erkrankungszustandes, der verbunden ist mit neuronalen Zellen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden spezifischen Ausführungsbeispielen erläutert und wird begleitet durch Zeichnungen, in denen:
1 modifizierte Fragmente schwerer Ketten von Clostridien zeigt, hergestellt durch Rekombinationstechnik als Fusionsproteine;
2 zeigt modifizierte Fragmente der schweren Kette von Clostridien, hergestellt durch Rekombinationstechnik; Fusionsproteine können eine oder mehrere Reinigungspeptidanhänge enthalten, um bei der Aufreinigung des Proteins unterstützend zu wirken; eine oder mehrere Protease-Spaltstellen können ebenfalls eingeschlossen sein, um das Entfernen der Reinigungspeptidanhänge zu ermöglichen; ähnliche Aufreinigungsstrategien können auch verwendet werden für modifizierte Clostridienbindungsfragmente, die eine Translokationsdomäne enthalten;
3 zeigt die Kopplung eines modifizierten Clostridienbindungsfragmentes an eine therapeutische Substanz; die modifizierte schwere Kette von Clostridien enthält eine Translokationsdomäne, die eine freie Thiolgruppe hat (ein Beispiel einer Translokationsdomäne mit dieser Eigenschaft ist die Aminosäuresequenz 194–386 vom Diphtherietoxin), wobei eine freie Aminogruppe auf der therapeutischen Substanz mit einem Vernetzungsreagens (z. B. SPDP; Pierce & Warriner, UK Ltd.) modifiziert ist, welche anschließend die Konjugatbildung unter Verwendung des freien Thiols, vorhanden auf dem modifizierten Clostridienbindungsfragment, ermöglichen wird;
4 zeigt die Bildung eines Konjugats zwischen einem modifizierten Fragment einer schweren Kette von Clostridien und einem Oligonucleotid, wie beschrieben in Beispiel 4;
5 zeigt eine Strategie zur Herstellung einer rekombinanten, modifizierten schwere Kette von Clostridien als ein Fusionsprotein mit einer therapeutischen Polypeptidsubstanz. Letztere ist mit der modifizierten schweren Kette von Clostridien durch ein Linkerpeptid verschmolzen. Das Linkerpeptid enthält eine einzige Protease-Spaltstelle (z. B. jene, die durch Thrombin erkannt wird) und einen Cysteinrest. Beispiele von Linkerpeptiden sind (a) CGLVPAGSGP; und (b) CGIEGRAPGP (SEQ ID Nr. 18). Der Cysteinrest bildet eine Disulfidbrücke mit einem anderen zugänglichen Cysteinrest auf der Translokationsdomäne des modifizierten Fragmentes der schweren Kette. Falls gewünscht, kann ein zweikettiges Produkt dann durch Behandlung mit Thrombin erzeugt werden, in welchem die therapeutische Polypeptidsubstanz mit der schweren Kette über eine Disulfidbrücke gekoppelt ist;
6 zeigt einen Vergleich der Bindung einer modifizierten schweren Kette mit jener des natürlichen Neurotoxins an neuronale synaptische Membranen, wobei die modifizierte schwere Kette die Bindungseigenschaften des Tetanusneurotoxins zeigt, wie abgeschätzt durch das im Beispiel 7 beschriebene Verfahren;
7 zeigt die Bindung einer modifizierten schwere Kette von Clostridien, basierend auf der Bindungsdomäne des Botulinum-Typ-F-Neurotoxins, an neuronale Membranen; in diesem Beispiel enthielt die modifizierte schwere Kette die Translokations-(H_N)-Domäne von Diphtherietoxin und die Bindungs-(H_C)-Domäne vom Typ F Neurotoxin; und
8 zeigt einen Vergleich der Molekulargrößen unter nicht denaturierenden Bedingungen einer modifizierten schweren Kette von Clostridien im Vergleich zu einer natürlichen schweren Kette; die modifizierte schwere Kette von Clostridien (Diphtherie H_N – BoNT/F H_C) läuft als ein Monomer von ungefähr 70 kDa, wohingegen eine natürliche schwere Kette (von BoNT/A) als ein Aggregat von >500 kDa läuft.
1 zeigt detaillierter Ausführungsbeispiele der Erfindung, die modifizierte Fragmente von schweren Ketten von Clostridien einbauen.
Die Bindungsdomäne wird abgeleitet von Sequenzen der Clostridienneurotoxine:

(a) HC-Domänen, z. B.
BoNT/A-Reste 872–1296
BoNT/B-Reste 859–1291
BoNT/C-Reste 867–1291
BoNT/D-Reste 863–1276
BoNT/E-Reste 846–1252
BoNT/F-Reste 865–1278
BoNT/G-Reste 864–1297
Tetanusreste 880–1315
(b) Hybrid-H_C-Domänen, z. B.
Hybride der H_C-Domäne von BoNT/F und Tetanus
(c) trunkierte H_C-Domänen

Die Translokationsdomäne kann aus einer Anzahl an Quellen abgeleitet werden:

(a) bakterielle Toxine, z. B. Diphtherietoxinfragment B (Reste 194–386)
(b) virale fusogene Peptide, z. B. von Influenzavirus-Hämagglutinin HA-2
(c) synthetische membranunterbrechende Peptide (z. B. Plank et al., J. Biol. Chem., 269, 12918–12924).

2 zeigt Beispiele von rekombinanten Fusionsproteinen aus modifiziertem Fragment der schweren Kette von Clostridien, welche Positionen von Reinigungspeptid-Anhängen und spezifischen Protease-Spaltstellen zeigen (durch die Behandlung mit der geeigneten Protease können die Reinigungspeptid-Anhänge von dem modifizierten Clostridienbindungsfragment entfernt werden).
Beispiele der Reinigungspeptid-Anhänge sind:
His6
S-Peptid
T7-Peptid
Calmodulinbindungspeptid
Maltosebindungsprotein
Beispiele spezifischer Protease-Spaltstellen sind:
Thrombin
Enterokinase
Faktor X
Beispiel 1
Zubereitung und Aufreinigung rekombinanter modifizierter Fragmente schwerer Ketten von Clostridien.
Für alle genetischen Manipulationen wurden molekularbiologische Standardprotokolle verwendet (z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Es wurde ein vollständig synthetisches Gen, das die H_C-Bereiche des Botulinumtoxins von C. botulinum Typ F (Reste 865–1278) und des Tetanustoxins (Reste 880–1315) kodiert, erzeugt unter Verwendung von Recursive-PCR-Reaktionen (Prodromou & Pearl, 1992, Protein Engineering, 5: 827–829) unter Verwendung von selbst-primenden Oligonucleotiden, enthaltend die gewünschte Sequenz. Die Codonbevorzugung und das GC/AT-Basenverhältnis wurden angepasst für die Erleichterung der Expression in E. coli. Fragmente wurden sequenziell in pLitmus 38 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) kloniert, um das gesamte Gen zusammenzusetzen. Konstrukte für die Expression wurden in pMALc2 (NEB) unterkloniert, wodurch das BamH1-EcoR1-Fragment ersetzt wurde. Die Ligationsreaktionen wurden in E. coli JM109 (Promega) transformiert. Plasmid-DNS wurde amplifiziert, aufgereinigt und nach der Anwesenheit der passenden Sequenz durchsucht (Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Genkonstruktionen, von denen bestätigt wurde, dass sie die richtigen Sequenzen enthalten, wurden dann in den Expressionswirt E. coli BL21 (DE3) transformiert (Studier & Moffatt, 1986, Journal of Molecular Biology, 189: 113–130).
Zusätzliche Sequenzen für das Hinzufügen von Anhängen für die Affinitätsaufreinigung und eine oder mehrere spezifische Proteasestellen für die anschließende Entfernung dieser Affinitätsanhänge wurden ebenfalls in den Leserahmen der Genprodukte eingeschlossen.
Die in pMAL exprimierten rekombinanten Proteine wurden mit aminoterminalen Maltosebindungsprotein-Anhängen hergestellt, wodurch ermöglicht wurde, dass die Proteine durch Affinitätschromatographie auf Amyloseharz aufgereinigt werden. Kurz, Kulturen von E. coli BL21 (DE3) pMALc2-H_C wurden in Terrific Broth-Ampicillin (100 μgml^–1)-Kanamycin (30 μgml^–1) wachsen gelassen bis zu einem OD₆₀₀ nm-Wert von 2,5 bis 3,8 und die Proteinexpression wurde durch die Zugabe von 1 nM IPTG für ungefähr 2 Stunden induziert. Die Zellen wurden durch Frieren/Auftauen lysiert, gefolgt von Beschallung, wobei die Lysate durch Zentrifugation geklärt wurden und die Überstände auf eine Amyloseharzsäule geladen und mit Maltose eluiert wurden. Alle verwendeten Puffer waren, wie vom Hersteller spezifiziert. Thrombin- oder Faktor-Xa-Proteasestellen wurden in das Protein eingeschlossen für das anschließende Entfernen dieser Aufreinigungsmarkierungen.
Andere kodierende Sequenzen, die die Expression des gewünschten Proteins ermöglichen, würden auch annehmbar sein. Andere Anhänge oder Kopplungsstellen können auch in die Sequenz eingeschlossen werden. Beispiele einiger dieser Möglichkeiten sind in 2 zusammengefasst.
Beispiel 2
Erzeugung von modifizierten Fragmenten schwerer Ketten von Clostridien
Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Techniken wurden modifizierte Fragmente schwerer Ketten von Clostridien durch das Verschmelzen von Domänen der H_C-Fragmente von entweder Botulinum-Typ-F- oder Tetanusneurotoxinen mit der Translokationsdomäne von Diphtherietoxin konstruiert. Die Aminosäuresequenzen der Beispiele sind in SEQ ID Nrn. 8–17 gezeigt, welche auch Beispiele modifizierter schwerer Ketten von Tetanus wiedergeben, in welchen das H_C-Fragment ein Hybrid von Tetanus- und Botulinum-Typ-F-Neurotoxin ist.
Beispiel 3
Kuppeln eines modifizierten Fragmentes schwerer Ketten von Clostridien an ein Protein oder ein Enzym
Das an das modifizierte Fragment der schweren Kette von Clostridien zu koppelnde Polypeptid, Protein oder Enzym wird als erstes mit einem geeigneten Vernetzungsmittel derivatisiert. Mn-Superoxiddismutase (SOD) wurde durch die Behandlung mit einem 15 molaren Überschuss von SPDP (Pierce) in 0,05 M HEPES-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,15 M NaCl, für 60 Minuten bei 25°C modifiziert. Der SPDP-Überschuss wurde durch Dialyse gegen denselben Puffer bei 4°C für 16 Stunden entfernt. Die substituierte SOD wurde dann in einem 1:5 molaren Verhältnis mit dem modifizierten Fragment der schweren Kette von Clostridien vermischt, verschmolzen mit einer Translokationsdomäne, abgeleitet von Diphtherietoxin (siehe 3), und bei 25°C für 16 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das mit SOD modifizierte Clostridienbindungsfragment-Konjugat durch Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G200 aufgereinigt.
Beispiel 4
Koppeln des modifizierten Fragmentes der schweren Kette von Clostridien an verdichtete DNS
Poly-L-Lysin (M_r 1000–4000) (10 mg) für die Verwendung bei der Kondensation von DNS wurde in 2 ml 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,15 M NaCl, (HBS), gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,6 mg Sulpho-LC-SPDP (Pierce and Warriner, UK Ltd.) hinzugefügt und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Das aktivierte Poly-L-Lysin wurde dann gegen HBS bei 4°C unter Verwendung eines Dialyseschlauchs mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 1000 dialysiert und dann auf 1 mg/ml unter Verwendung von HBS verdünnt.
Die Verdichtung von DNS wurde in Glasröhrchen durchgeführt. Aufgereinigte Plasmid-DNS, enthaltend ein Gen, das ein therapeutisches Protein (oder ein Reportergen) unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors (z. B. CMV Immediate Early oder einen für neuronale Anwendungen spezifischen Promotor, z. B. neuronenspezifischer Enolasepromotor) kodiert, wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in HBS hergestellt und zu den Glasröhrchen hinzugefügt, gefolgt von dem aktivierten poly-L-Lysin, wie oben zubereitet. Aktiviertes Poly-L-Lysin wird in unterschiedlichen Verhältnissen zu der DNS hinzugefügt (siehe Tabelle 2) und für 90 Minuten bei 25°C inkubiert.
Tabelle 2: Kondensation von DNS mit aktiviertem Poly-L-Lysin
Nach der Inkubation wurde die Größe der kondensierten DNS-Partikel unter Verwendung eines Brookhaven-B190-Partikelgrößenbestimmungsgerätes bestimmt. Die Inkubationsbedingungen, die den höchsten Anteil kondensierter DNS-Partikel von weniger als 100 nm im Durchmesser ergaben, wurden verwendet, um DNS-modifizierte Clostridienbindungsfragment-Konjugate zu erzeugen. Modifizierte schwere Ketten von Clostridien wurden gegen HBS dialysiert.
Die dialysierten Fragmente (100 μg) wurden dann zu 1 ml kondensierter DNS hinzugefügt und für 18 Stunden bei 25°C inkubiert, um das modifizierte Konstrukt aus Clostridienbindungsprotein und verdichteter DNS zu bilden (siehe 4).
Beispiel 5
Zufuhr von DNS an neuronale Zellen über den Rezeptor für ein modifiziertes Fragment der schweren Kette von Clostridien
Das in Beispiel 4 beschriebene Konstrukt aus der schweren Kette von Clostridien und verdichteter DNS wurde mit 2 ml serumfreiem MEM-Medium verdünnt. Wachstumsmedien von NG108, die in Schalen mit 12 Vertiefungen gewachsen waren, wurde entfernt und 1 ml des verdünnten Konstruktes wurde hinzugefügt und für 2 Stunden bei 37°C in der Anwesenheit von 5% CO₂ inkubiert. Wachstumsmedien (1 ml) wurden dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Inkubation wurde unter denselben Bedingungen für 24–48 Stunden fortgesetzt. Nach diesem Zeitraum wurden die Zellen untersucht.
In Experimenten, wo die verdichtete DNS ein Reportergen enthielt, das Grünes Fluoreszierendes Protein kodiert, zeigten etliche der Zellen eine sichtbare Expression des Reporterproteins, wodurch die erfolgreiche Zufuhr der DNS in die neuronale Zelle dargestellt wurde. Zahlreiche Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die beobachtete Transfektion in NG108-Zellen rezeptorvermittelt war:
Die Transfektion der NG108-Zellen wurde für abhängig befunden von der Anwesenheit des modifizierten Fragmentes der schweren Kette von Clostridien innerhalb von Konjugaten (keine Transfektion wurde beobachtet mit kondensierten DNS-Partikeln alleine).
Keine Transfektion wurde in nicht neuronalen Zellen (Vero-Zellen) unter Verwendung der Konjugate aus schwerer Kette und DNS- beobachtet.
Beispiel 6
Zubereitung von Konjugaten von modifiziertem Fragment der schweren Kette von Clostridien und Mikropartikeln, bestehend aus Poly(lactid-co-glycolid)
398 mg Poly(lactid-co-glycolid) mit einer niedrigen internen Viskosität (3000 MW) (Boehringer Mannheim) wurden in 4 ml Dichlormethan gelöst. Dies wurde homogenisiert bei 2000 rpm für 150 Sekunden mit 1 ml Pufferlösung, enthaltend die therapeutische Substanz wie ein Enzym und/oder Arzneimittel. In dem Falle der Mn-Superoxiddismutase wurden 10 mg des Enzyms in 10 mM HEPES-Puffer, pH 8,0, enthaltend 100 mM NaCl, gelöst. Die Mischung wurde dann zu 50 ml 8% Polyvinylalkohol hinzugefügt und bei 2000 rpm für weitere 150 Sekunden emulgiert. Die Emulsion wurde in 300 ml ultrareines destilliertes Wasser bei 37°C gegossen und für 30 Minuten bei 37°C gerührt. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 25 Minuten bei 20°C gesammelt und dann in 300 ml Wasser resuspendiert und wie oben zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde dann weitere viermal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde das wässrige Überstandsfluid entfernt und die Mikropartikel wurden gefriergetrocknet.
2 mg Poly(lactid-co-glycolid)-Mikropartikel wurden in 1 ml Aktivierungspuffer (0,1 M MES-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,5 M NaCl) resuspendiert. Festes 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysulphosuccinimid (sulphoNHS) wurden auf eine Konzentration von 2 mM bzw. 5 mM hinzugefügt und die Mischung wurde für 15 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation für 1 Minute bei 10.000 × g gewaschen und in 1 ml Aktivierungspuffer resuspendiert. Der Waschschritt wurde viermal wiederholt und dann wurden die Mikropartikel in 1 ml Aktivierungspuffer, enthaltend 33 μm eines modifizierten Fragmentes der schweren Kette von Clostridien, resuspendiert und für 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde dann mit 10 mM Hydroxylamin abgelöscht.
Nach 20 Minuten bei 25°C wurden die Mikropartikel in einem geeigneten Puffer durch Zentrifugation, wie oben beschrieben, gewaschen.
Beispiel 7
Nachweis der hochaffinen Bindung an neuronales Zellgewebe, gezeigt durch modifizierte Fragmente der schweren Kette
Clostridienneurotoxine können mit 125-Jod markiert werden unter Verwendung von Chloramin-T und ihre Bindung an verschiedene Zellen kann abgeschätzt werden durch Standardverfahren, wie beschrieben in Evans et al., 1986, Eur. J. Biochem., 154, 409, oder Wadsworth et al., 1990, Biochem. J., 268, 123). In diesen Experimenten wurde die Fähigkeit modifizierter Konstrukte der schweren Kette von Clostridien mit natürlichen Clostridienneurotoxinen abgeschätzt, um um Rezeptoren, anwesend auf neuronalen Zellen oder Gehirnsynaptosomen, zu konkurrieren. Sämtliche Bindungsexperimente wurden in Bindungspuffern durchgeführt. Für die Botulinumneurotoxine bestand dieser Puffer aus: 50 mM HEPES, pH 7,0, 30 mM NaCl, 0,25% Sucrose, 0,25% Rinderserumalbumin. Für Tetanustoxin war der Bindungspuffer: 0,05M MES-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,6% Rinderserumalbumin. In einem typischen Bindungsexperiment wurde das radiomarkierte Clostridienneurotoxin auf einer festen Konzentration zwischen 1 bis 10 nM gehalten. Reaktionsmischungen wurden durch Mischen des radioaktiv markierten Toxins mit verschiedenen Konzentrationen unmarkierten Neurotoxins oder mit dem modifizierten Konstrukt der schweren Kette von Clostridien zubereitet. Die Reaktionsmischungen wurden dann zu neuronalen Zellen oder Synaptosomen aus Rattengehirn hinzugefügt und dann bei 0 bis 3°C für 2 Stunden inkubiert. Nach diesem Zeitraum wurden die neuronalen Zellen oder Synaptosomen zweimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen und die Menge des markierten Clostridienneurotoxins, gebunden an Zellen oder Synaptosomen, wurde durch γ-Zählen abgeschätzt.
In einem Experiment, wobei ein modifiziertes Konstrukt der schweren Kette von Clostridien verwendet wurde, das aus einer Bindungsdomäne, abgeleitet von Tetanustoxin, und einer Translokationsdomäne von Diphtherietoxin bestand, wurde gefunden, dass das Konstrukt mit ¹²⁵I-markiertem Tetanusneurotoxin um neuronale Zellrezeptoren in einer ähnlichen Weise wie unmarkiertes natürliches Tetanusneurotoxin konkurriert (siehe 6). Diese Daten zeigten, dass das Konstrukt Bindungseigenschaften des natürlichen Neurotoxins bewahrte.
In einem weiteren Experiment, wobei Diphtherie-H_N-BoNT/F-H_C als die modifizierte schwere Kette von Clostridien verwendet wurde, wurde das Konstrukt als konkurrierend mit ¹²⁵I-markiertem BoNT/F um Rezeptoren auf neuronalen synaptischen Membranen befunden (7). Diese Daten zeigen, dass die modifiziere schwere Kette von Clostridien die neuronalen Rezeptorbindungseigenschaften von BoNT/F bewahrt.
Beispiel 8
Nicht denaturierende Gelelektrophorese, um die Größen einer natürlichen schweren Kette von Botulinumtoxin (Typ A) mit jenen einer modifizierten schweren Kette von Clostridien rekombinante Diphtherie-H_N-BoNT/F-H_C) zu vergleichen
Die schwere Kette von Botulinum Typ A wurde aufgereinigt, wie kürzlich beschrieben (Shone et al., 1985, Eur J. Biochemistry, 151, 75–82), und rekombinantes Diphtherie-H_N-BoNT/F-H_C wurde, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, aufgereinigt. Die modifizierte schwere Kette von Clostridien wurde aufgereinigt als eine Fusion mit Maltosebindungsprotein, wobei dann das Fusionsprotein durch die Behandlung mit Faktor Xa entfernt wurde. Proben der schweren Kette von Typ A (20 μg) und von Diphtherie-H_N-BoNT/F-H_C (10 μg) wurden auf ein 4–20% Tris-Glycin-Polyacrylamidgel in Tris-Glycin-Puffer geladen. Proben wurden der Elektrophorese bis zum Äquilibrium (Novex Gelsystem; 43 Volt, 16 Stunden) ausgesetzt und das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Hauptbande für Diphtherie-H_N-BoNT/F/H_C scheint sehr nahe zu seinem vorhergesagten Molekulargewicht ungefähr 70 kDa zu wandern. Im Gegensatz dazu erscheint die natürliche schwere Kette von Typ A als eine diffuse Bande bei ungefähr 500 kDa, verglichen mit einem geschätzten Molekulargewicht von 100 kDa, was die Bildung von großen Proteinaggregaten nahe legt.
Beispiel 9
Rekombinante Konjugate aus modifizierter schwerer Kette und Superoxiddismutase
Rekombinante modifizierte Konjugate aus schwerer Kette und Superoxiddismutase wurden zubereitet, umfassend eine Kombination der folgenden Elemente:

– eine bakterielle Superoxiddismutase von Bacillus stearothermophilus;
– einen Linkerbereich, der die Bildung einer Disulfidbindung zwischen der Superoxiddismutase und der Translokationsdomäne ermöglicht, und der auch eine einzige Protease-Spaltstelle für die Spaltung durch Faktor Xa oder Thrombin enthält, um die Bildung eines zweikettigen Moleküls zu erlauben;
– eine Translokationsdomäne von Diphtherietoxin oder ein endosomolytisches (fusogenes) Peptid von Influenzavirus-Hämagglutinin; und
– eine für neuronale Zellen spezifische Bindungsdomäne von Tetanus- oder Botulinumneurotoxin Typ F.

Die Sequenzen dieser modifizierten Konjugate aus schwerer Kette und Superoxiddismutase sind in den SEQ ID Nrn. 3–7 gezeigt.
Um die Art ihrer Struktur zu bestätigen, wurden die rekombinanten Konjugate aus der modifizierten schweren Kette von Clostridien und Superoxiddismutase zu der Doppelkettenform durch Behandlung mit einer einzigen Protease umgewandelt, entsprechend der Spaltstellensequenzen innerhalb des Linkerbereichs. Konjugate, die die Thrombinspaltstelle enthalten, wurden mit Thrombin (20 μg pro mg Konjugat) für 20 Stunden bei 37°C behandelt; Konjugate; enthaltend die Faktor-Xa-Spaltstelle, wurden mit Faktor Xa (20 μg pro mg Konjugat) für 20 Minuten bei 22°C behandelt.
Auf SDS-PAGE-Gelen erschienen unter nicht reduzierenden Bedingungen die Konjugate als eine Bande mit einer Molekularmasse von ungefähr 120 kDa. In der Anwesenheit von reduzierendem Mittel (Dithiothreitol) wurden zwei Banden bei ungefähren molekularen Massen von 70 und 30 kDa beobachtet, entsprechend der modifizierten schweren Kette von Clostridien bzw. der Superoxiddismutase. Diese Daten erläutern, dass nach der Behandlung mit der einzigen Protease die Konjugate aus den letzteren beiden Bestandteilen bestehen, die über eine Disulfidbrücke gekoppelt sind. TABELLE 1. Beispiele möglicher therapeutischer Verwendungen modifizierter Clostridienbindungsfragmente

SEQUENZEN DER KONJUGATE AUS MODIFIZIERTER SCHWERER KETTE VON CLOSTRIDIEN UND SUPEROXIDDISMUTASE

Claims

Zusammensetzung, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid ein nicht-toxisches Polypeptid ist, für die Übermittlung eines Heilmittels an eine neuronale Zelle, umfassend: eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist aus oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt, worin die Translokationsdomäne keine H_N-Domäne eines Clostridientoxins ist und kein Fragment oder Derivat einer H_N-Domäne eines Clostridientoxins ist und worin das Heilmittel für die Reduktion neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reperfusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Beschädigung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Translokationsdomäne weiterhin eine nicht aggregierende Translokationsdomäne ist, bestimmt durch die Größe in physiologischen Puffern.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Translokationsdomäne weiterhin ausgewählt ist aus (1) einer H_N-Domäne eines Diphtherietoxins, (2) einem Fragment oder Derivat von (1), das im Wesentlichen die Translokationsaktivität der H_N-Domäne eines Diphtherietoxins behält, (3) einem fusogenen Peptid, (4) einem Peptid, das die Membran unterbricht, und (5) translozierenden Fragmenten und Derivaten von (3) und (4).
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Polypeptid die Bindungsspezifität von Tetanustoxin hat und eine reduzierte Affinität für neutralisierende Antikörper für Tetanustoxin im Vergleich mit der Affinität für solche Antikörper für die schwere Kette von natürlichem Tetanustoxin hat.
Zusammensetzung, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid für die Übermittlung eines Heilmittels an eine neuronale Zelle ist, umfassend: eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt, worin die Translokationsdomäne ausgewählt ist aus (1) einer H_N-Domäne eines Diphtherietoxins, (2) einem Fragment oder Derivat von (1), das im Wesentlichen die Translokationsaktivität der H_N-Domäne eines Diphtherietoxins behält, (3) einem fusogenen Peptid, (4) einem Peptid, das die Membran unterbricht, und (5) translozierenden Fragmenten und Derivaten von (3) und (4), und worin das Heilmittel für die Reduktion von neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reperfusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Schädigung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das Polypeptid eine reduzierte Affinität für neutralisierende Antikörper für Tetanustoxin hat im Vergleich mit der Affinität für solche Antikörper von natürlichem Tetanustoxin.
Zusammensetzung, die ein Heilmittel umfasst, das an ein Polypeptid gekoppelt ist, worin das Polypeptid für die Übermittlung eines Heilmittels an eine neuronale Zelle ist, umfassend: eine Bindungsdomäne, die an die neuronale Zelle bindet und zusammengesetzt ist oder abgeleitet ist von Fragmenten der schweren Kette von Clostridien, und eine Translokationsdomäne, die das Heilmittel in die neuronale Zelle überführt, worin das Polypeptid eine reduzierte Affinität für neutralisierende Antikörper für Tetanustoxin im Vergleich mit der Affinität für solche Antikörper von natürlichem Tetanustoxin hat, und worin das Heilmittel für die Reduktion von neuronaler Schädigung nach Ischämie/Reperfusion oder für die Förderung neuronalen Wachstums nach Schädigung ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Bindungsdomäne eine Botulinum-H_C-Domäne umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, worin die Bindungsdomäne eine Tetanus-H_C-Domäne umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, worin die Bindungsdomäne ein Hybrid einer Botulinum-H_C-Domäne und einer Tetanus-H_C-Domäne umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, basierend auf einem Botulinum Typ B-Fragment (Reste 859–1291) oder Typ A-Fragment (Reste 872–1296) oder Typ F-Fragment (Reste 862–1278).
Zusammensetzung nach Anspruch 10, basierend auf einem Botulinum Typ B-Fragment (Reste 859–1291) durch Ersetzen der Reste 1093–1285 mit der homologen Sequenz von Tetanustoxin.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, basierend auf einem Botulinum Typ A-Fragment (Reste 872–1296) durch Ersetzen der Reste 1103–1296 mit der homologen Sequenz von Tetanustoxin.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, basierend auf einem Botulinum Typ F-Fragment (Reste 863–1278) durch Ersetzen der Reste 1097–1273 mit der homologen Sequenz von Tetanustoxin.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, umfassend eine Tetanus-H_C-Domäne und eine Diphtherie-H_N-Domäne.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, umfassend eine Botulinum-H_C-Domäne und eine Diphtherie-H_N-Domäne.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–16, worin die therapeutische Substanz chemisch an dieses Polypeptid gebunden ist.
Zusammensetzung nach eiNem der Ansprüche 1–17, worin die therapeutische Substanz an eine Translokationsdomäne dieses Polypeptids gekoppelt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–18, worin die therapeutische Substanz ein Enzym, Wachstumsfaktor, Protein oder Peptid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18–19, worin das Heilmittel hergestellt ist als ein Fusionsprotein durch Verfahren der Rekombinationstechnik.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–20, worin das Heilmittel eine Nukleinsäure ist, die nützlich ist als ein Genheilmittel oder ein antisense-Arzneimittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei der die Nukleinsäure in einem Liposom enthalten ist oder kondensiert ist über ein Peptid oder Protein oder kondensiert ist durch Kondensation unter Verwendung eines chemischen Kupplungsmittels.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei der die Nukleinsäure in der Form eines rekombinanten Virus vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei der das Virus einen veränderten Tropismus hat und fähig ist, Zellen zu transduzieren über einen Clostridientoxinrezeptor.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–16, umfassend die Expression einer Nukleinsäure, die die Zusammensetzung kodiert, in einer Wirtszelle.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–24 für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines Krankheitszustandes im Zusammenhang mit neuronalen Zellen.