CN110637814B - 一种d型肉毒毒素的微囊化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法。该方法包括以下步骤：S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1～5g的海藻糖，搅拌交联；S2，S1所得溶液中加入0.1～0.2g聚乙烯吡咯烷酮和明胶，静置8～18h后500～1000r/min搅拌45～90min；S3，S2所得溶液加入1～2g磷酸二氢钠，400～800r/min，搅拌15～45min；S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90～100℃、出口温度60～80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。本发明的优点：(1)提高了D型肉毒毒素对外界环境的耐受性，降低了毒素的包装、储存和冷链运输的要求。(2)制备工艺简单，无复杂和极端条件，易于推广。(3)自然条件储存，时间长，毒力损失小。(4)本发明制备的D型肉毒毒素微囊更稳定。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法。
背景技术
D型肉毒毒素是D型肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)在厌氧条件下发酵产生的蛋白质类神经毒素，因为鼠类对其敏感，作为一种生物灭鼠剂用于草地鼠害治理，作为是一种安全、高效、经济的生物灭鼠剂，其优点具有易降解、无残留、不污染环境、不伤害鼠类天敌。作为生物灭鼠剂，灭鼠效果在90%以上，在草原鼠害防治和生态环境保护中发挥着不可替代的作用。
由于D型肉毒毒素的大分子蛋白神经毒素，在常温条件下，D肉毒毒素的生物活性与其空间形态结构相关，特别是在外界不利环境下，很容易发生肉毒毒素变性。其易受温度、光照、pH值、紫外线照射及动物胃肠道环境等因素的影响，致使具有灭鼠效果的毒性成分降解，甚至失去毒性。因此对储运条件的要求较高，需低温冷冻保存及运输，无形中增加了毒素的生产成本，限制了毒素的使用季节和使用地域。
现已报到的D型肉毒毒素灭鼠剂主要有水剂、冻干剂和颗粒剂，其中水剂需要常年在-16℃的低温冷库中保存，冻干剂虽然具有常温保存的特点，但是其制作过程相当繁琐，且需要具备大型的冻干设备才能完成，耗时耗力。颗粒剂本身在加工制作工程中就存在大量的D型肉毒毒素由于产热而损失的弊端，毒素使用量是常规量的10倍，室温保存期2个月。
CN107540732A公开了一种D型肉毒毒素的仿生矿化加工方法，加工方法包括用甲基纤维素溶液、羧甲基纤维素钠溶液、含蔗糖的明胶溶液的混合物对D型肉毒毒素蛋白进行保护，得到的D型肉毒毒素核液经海藻酸钙保护壳膜包被，最后经精蛋白/氧化硅杂化壳壁包被，得到仿生矿化加工的D型肉毒毒素颗粒。该方法辅料使用多，工艺复杂，制备的D型肉毒毒素仿生微囊颗粒虽然较水剂提升了D型肉毒毒素对温度的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏要求，经仿生矿化后的D型肉毒毒素矿化颗粒在室温下放置3个月毒力不变，半衰期5-6个月。
发明内容
本发明成功的克服了现有技术的缺陷，提供了一种即克服D型肉毒毒素冷冻储存的缺陷，又提高毒素对外界环境的耐受性和产品的稳定性，延长室温储运有效期的方法，实现了D型肉毒毒素室温保存2年，毒素毒力下降＜10%。
本发明采用的技术方案为：
一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，包括以下步骤：
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1~5g的海藻糖，搅拌交联；
S2，S1所得溶液中加入0.1~0.2g聚乙烯吡咯烷酮和0.1~0.2g明胶，静置8~18h后500~1000r/min搅拌45~90min；
S3，S2所得溶液加入1~2g磷酸二氢钠，400~800r/min，搅拌15~45min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90~100℃、出口温度60~80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。
进一步的，所述的S1步骤中D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
进一步的，所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
进一步的，所述的S4步骤中，喷雾干燥进液量3~5mL/min。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊粒径1~15μm。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降≤10%。
本发明提供D型肉毒毒素的微囊化制备方法,对毒素蛋白毒理保护研究具有借鉴性。
本发明还提供D型肉毒毒素的微囊化制备方法生产的D型肉毒毒素微囊在灭鼠剂加工中的应用。
本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，使用壁材成分简单，微囊化工艺简单，只需按步骤将D型肉毒毒素、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和磷酸二氢钠，通过交联混合均匀后，喷雾干燥即可；工艺中无复杂和极端条件，易于推广。
利用本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法制备的D型肉毒毒素微囊，不仅实现了D型肉毒毒素由液态转变成为固态，同时在室温条件下贮存2年，毒力损失不超过10%，为D型肉毒毒素灭鼠剂的室温存储和运输提供了技术保障。
现有技术的微囊，通常是将芯材(功效组分、有效组分)用壁材物理包裹，隔绝芯材与外界环境的接触从而实现对芯材的保护。本发明提供的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，不同于传统微囊化技术，将本质为蛋白质的D型肉毒毒素(芯材)与海藻糖通过官能团取代而交联，海藻糖可替代水分子与蛋白质表面形成氢键维持其结构稳定，以维持毒素蛋白的活性。在干燥过程中海藻糖替代了蛋白质周围原来由水构成的氢键，彼此产生直接的作用。海藻糖不直接与蛋白质空间结构相互作用，而是优先与蛋白质表面的水分子结合，使蛋白质的溶剂化层半径减小，分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御外界极端环境的影响。
因此，本发明采用以化学键链接交联和喷雾法，制备的D型肉毒毒素微囊更稳定，对芯材的保护也更有效。
本发明中添加聚乙烯吡咯烷（PVP）可以提高体系的玻璃化温度，在体系中发挥分散剂及热敏药物的稳定剂作用。明胶是亲水胶体，具备成膜性，而且也易溶于水，作为胶囊壁材使用。
本发明的D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其制作工艺简单、高效，相比冷冻干燥技术，无需要大型的冻干设备，省时、省力、节能。与传统的颗粒加工技术相比较，不仅极大地降低了加工过程中毒素的损失，毒素的投入和产出比为4:1，且毒素在室温下的保存期有了明显的延长。
与现有技术相比，本发明提供的D型肉毒毒素的微囊化制备方法的优点：
(1)明显提高了D型肉毒毒素对外界环境的耐受性，降低了D型肉毒毒素储藏避光、低温的要求，极大的降低了毒素的包装、储存和冷链运输的要求。
(2)制备工艺简单，无复杂和极端条件，易于推广。
(3)自然条件储存，时间长，毒力损失小。
(4)本发明制备的D型肉毒毒素微囊更稳定。
附图说明
图1是本发明提供的D型肉毒毒素微囊外观图。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，包括以下步骤：
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1~5g的海藻糖交联；
S2，S1所得溶液中分别加入0.1~0.2g聚乙烯吡咯烷酮和0.1~0.2g明胶，静置8~18h后500~1000r/min搅拌45~90min；
S3，S2所得溶液加入1~2g磷酸二氢钠，400~800r/min，搅拌15~45min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90~100℃、出口温度60~80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊。
进一步的，所述的S1步骤中D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
进一步的，所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
进一步的，所述的S4步骤中，喷雾干燥进液量3~5mL/min。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊的毒价为2000万MLD/100mg。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊粒径1~15μm。
进一步的，制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降≤10%。
将上述制备的D型肉毒毒素微囊应用于产毒素蛋白毒理研究或者加工。
将上述制备的D型肉毒毒素微囊应用于灭鼠剂加工。
实施例1
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1g的海藻糖交联；D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
S2，S1所得溶液中分别加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮和0.1g明胶，静置8h后500r/min搅拌45min；聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
S3，S2所得溶液加入1g磷酸二氢钠，400r/min，搅拌15min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90℃、出口温度60℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量3mL/min。。
制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。
制备的D型肉毒毒素微囊粒径1μm。
制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降10%。
实施例2
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入5g的海藻糖交联； D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
S2，S1所得溶液中分别加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮和0.2g明胶，静置18h后1000r/min搅拌90min；所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
S3，S2所得溶液加入2g磷酸二氢钠，800r/min，搅拌45min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度100℃、出口温度80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量5mL/min。。
制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。
制备的D型肉毒毒素微囊粒径15μm。
制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降8%。
实施例3
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入3g的海藻糖交联；D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
S2，S1所得溶液中分别加入0.15g聚乙烯吡咯烷酮和0.15g明胶，静置12h后800r/min搅拌60min；聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
S3，S2所得溶液加入1.5g磷酸二氢钠，600r/min，搅拌30min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度95℃、出口温度70℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为D型肉毒毒素微囊；喷雾干燥进液量4mL/min。。
制备的D型肉毒毒素微囊的毒价2000万MLD/100mg。
制备的D型肉毒毒素微囊粒径8μm。
制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降10%。
实施例4
微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂毒力测定。
微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂的稀释方法：取样品0.1g加入到10mL1%蛋白胨稀释液中，待完全溶解后，按10倍梯度稀释，至1000万倍的样品测试液。
微囊化D型肉毒毒素灭鼠粉剂毒力测定方法
小鼠腹腔测定法被公认为检测肉毒毒素最经典和灵敏的“金标准”。试验动物选用体重18~20g的昆明系小白鼠，将不同稀释度的毒素，每只小白鼠腹腔注射0.5mL，每个剂量组2只小白鼠。注射后，正常饲喂，观察4d。初步确定毒素的毒力范围。然后，在已确定的毒力范围内，统计小白鼠的死亡情况。分别腹腔注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察和记录96h（4天）小鼠的发病和死亡情况。计算样品的最低致死量,评估样品中肉毒毒素毒力，等于小鼠全部死亡的最高样品试验液倍数乘以2，以该稀释度为基础稀释液，分级稀释，每个稀释梯度腹腔注射2只小白鼠，每只0.5mL。以小鼠全部死亡组的总稀释倍数×2，确定毒素的准确含量。（例如，在规定的观察时间内，腹腔注射100万倍稀释测试液组的小鼠全部死亡，而1000万倍稀释液测试组存活，则该样品的毒力为200万MLD/100mg以上），说明样品的毒力在200万至2000万之间。然后再以100万倍稀释度的测试液为基础测试液，按（基础测试液:1%蛋白胨稀释液）分别以1:1（2倍）、1:2（3倍）、1:3（4倍）、1：4（5倍）、1:5（6倍）、1:6（7倍）、1:7（8倍）、1:8（9倍）、1:9（10倍）的比例分级稀释。各稀释度腹腔注射小鼠2只，每只0.5mL，观察和记录96h（4d）小鼠死亡情况。再以该稀释度乘以新的稀释倍数，然后再乘以2，即为样品在稀释前样品中的毒素含量，（例如，在规定的观察时间内，腹腔注射的小鼠在1:7稀释度全部死亡，而1:8稀释度的小鼠全部存活，则样品的毒力为：100万倍×8×2=1600万MLD/100mg）。
室温留样试验
该试验是考察药物制剂稳定性的最可靠方法，也是必须考察的项目。首先用通过加速试验确定的配方，生产3个批次，将样品配制成相同浓度的样品，密封放置在自然室温存放条件下，分别观测0，1，2，3，6，12，18，24个月，定期测定毒力的变化，结果见表1。
室温留样测定毒力变化统计表
单位：万MLD/100mg
由试验结果可见：水剂在室温保存保存6个月毒力下降50%，微囊粉剂在室温条件下，毒力下降缓慢，保存2年毒力下降小于10%。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (7)
1.一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
S1，每100mL D型肉毒毒素溶液中加入1~5g的海藻糖，搅拌交联；
S2，S1所得溶液中加入0.1~0.2g聚乙烯吡咯烷酮和0.1~0.2g明胶，静置8~18h后500~1000r/min搅拌45~90min；
S3，S2所得溶液加入1~2g磷酸二氢钠，400~800r/min，搅拌15~45min；
S4，S3制得的混合溶液在真空度0.025mPa、进风口温度90~100℃、出口温度60~80℃条件下喷雾干燥，干燥粉末即为微囊化D型肉毒毒素。
2.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于，所述的S1步骤中D型肉毒毒素溶液的毒价为2000万MLD/mL。
3.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于，所述的S2步骤中聚乙烯吡咯烷酮和明胶的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于：所述的S4步骤中，喷雾干燥进液量3~5mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于：制备的D型肉毒毒素的毒价≥2000万MLD/100mg。
6.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于：制备的D型肉毒毒素微囊粒径1~15μm。
7.根据权利要求1所述的一种D型肉毒毒素的微囊化制备方法，其特征在于：制备的D型肉毒毒素微囊在自然室温条件下存放24个月毒力下降≤10%。
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