CN110548135A - 磷酸化多肽抗原疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磷酸化多肽抗原疫苗，其包含来自人全长Tau蛋白的至少两个多肽片段或其保守性修饰变体，其中所述多肽片段或其保守性修饰变体含有磷酸化位点。本发明还公开了磷酸化多肽抗原疫苗与载体偶联形成的复合物疫苗，所述多肽抗原疫苗和复合物疫苗可用于包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)在内的Tau蛋白病(tauopathy)的预防和/或治疗。

Description

磷酸化多肽抗原疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体地，本发明涉及将截短Tau蛋白拼接以形成磷酸化多肽抗原疫苗，优选将该多肽抗原疫苗与相适应的载体连接来制备复合物疫苗，所述多肽抗原疫苗和复合物疫苗可用于包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)在内的Tau蛋白病(tauopathy)的预防和/或治疗。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性的神经退行性疾病，该疾病会导致患者认知功能缺陷，学习、记忆、语言、活动功能衰退。随着疾病的发展，患者的相伴行为性、情绪性、人际性和社会性退化；晚期患者不能说话、语言理解出现障碍和不能自理。目前获得审批的几种药物可以达到控制和减轻来自AD的症状和副作用，以及提高生存质量，但对直接靶向疾病过程且具有改善治疗作用的治疗仍未满足需要。
AD的组织病理学特征包括脑中神经元外斑块沉积、细胞内和细胞外的神经原纤维缠结和神经元的丢失。众多研究结果显示，Tau蛋白在AD病变中存在重要作用，也是AD病理变化过程中的最下游变化。研究表明，培养的神经元中的Aβ神经毒性似乎取决于Tau蛋白；降低Tau蛋白病模型中的Tau蛋白含量可恢复其记忆功能。另外，降低内源性Tau蛋白抑制了表达人淀粉状蛋白前体的转基因小鼠的行为缺陷且不改变Aβ水平。因此，靶向Tau蛋白的疗法可能成为治疗包括AD在内的Tau蛋白病的有效策略。
Tau蛋白是微管结合蛋白，Tau蛋白介导微管蛋白单体装配成构成神经元微管网状结构的微管(MT)；Tau蛋白在微管上通过磷酸化和去磷酸化的作用携带营养物质、递质等，对神经元回路的正确形成和执行功能具有重要意义。在体外和非神经元细胞中的实验也表明，Tau与MT的结合受动态的磷酸化和去磷酸化控制。当Tau蛋白发生过度磷酸化时，Tau蛋白之间会相互聚集并从MT上脱离下来，MT失去稳定作用导致自身解体，进而形成神经纤维缠结(NFT)和神经元丢失。
尽管AD在人群中广泛发病，其发病机理至此还不完全清晰，目前研究和治疗手段仍未满足需要。Asuni等人在Tau蛋白病的小鼠模型中的实验表明，利用Tau蛋白衍生的磷酸肽接种小鼠后出现神经纤维缠结的减少和功能改善。短肽的小分子虽然通常能与免疫应答产物相互作用，但是常常无法单独引起应答，这些肽免疫原也称为“半抗原”，其不能自身产生免疫原性或引起机体内抗体的产生，只能通过将其与合适的载体偶联来制备成具有免疫原性的组合物。而另一方面，在原核体系中表达的全长重组Tau蛋白似乎不适合作为疫苗。
综上可知，本领域需要开发一种有效预防和/或治疗Tau蛋白病的方法。
发明内容
本发明针对上述缺陷，基于人全长Tau蛋白，设计了磷酸化多肽抗原疫苗及其与相适应的载体偶联形成的复合物疫苗，以用于预防和/或治疗包括AD在内的Tau蛋白病。本发明的疫苗安全性好、免疫原性高且诱导产生的抗体滴度高。
具体地，本发明的第一方面提供了一种磷酸化多肽抗原疫苗，其包含来自人全长Tau蛋白的至少两个多肽片段或其保守性修饰变体，其中所述多肽片段或其保守性修饰变体含有磷酸化位点。在一些实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗在其C’末端处具有额外的半胱氨酸残基。
在本发明的上下文中，术语“磷酸化多肽抗原疫苗”意指磷酸化多肽，并且可以和术语“磷酸化多肽”互换使用。
在一些实施方案中，所述多肽片段来自人全长Tau蛋白的富含磷酸化修饰位点的区域。在一些优选的实施方案中，所述多肽片段来自人全长Tau蛋白的如下区域：人全长Tau蛋白的第14-22位氨基酸、人全长Tau蛋白的第194-266位氨基酸和/或人全长Tau蛋白的第392-408位氨基酸。
在一些实施方案中，所述多肽片段通过肽键直接相连或通过氨基酸接头相连。在优选的实施方案中，所述多肽片段通过肽键直接相连。
在一些具体的实施方案中，所述磷酸化位点包括在对应于人全长Tau蛋白的氨基酸序列的第18、202、205、212、214、231、235、238、262、396和404位发生磷酸化的氨基酸位点，即，18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个，优选全部位点。在一些优选的实施方案中，所述磷酸化位点中的1至4个、优选1至3个、更优选1至2个、最优选1个Ser位点被天冬氨酸置换和/或所述磷酸化位点中的1至4个、优选1至3个、更优选1至2个、最优选1个Thr位点被谷氨酸置换，由此获得的多肽片段或其保守性修饰变体的总体净电荷和其分子上的电荷分布与置换前的基本上保持相同。所述通过天冬氨酸和/或谷氨酸置换磷酸化位点来模拟磷酸化是本领域公知的。
在一些实施方案中，本发明的磷酸化多肽抗原疫苗所包含的多肽片段的保守性修饰变体为该多肽片段的一个或多个氨基酸、优选1至10个氨基酸、更优选1至6个氨基酸、更优选1至4个氨基酸、更优选1至3个氨基酸、最优选1个氨基酸被其功能上相似的氨基酸保守性置换所得的变体。所述保守性置换是本领域公知的，包括以下6组氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
由此获得的多肽片段变体的总体净电荷和其分子上的电荷分布与置换前的保持基本上相同。
在一些优选的实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.1331中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点。在一些实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.1331中任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列，其具有与原磷酸化多肽抗原疫苗基本上相同的免疫原活性，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点。
在一个更优选的实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有SEQ ID NO.201、SEQID NO.225、SEQ ID NO.306、SEQ ID NO.387、SEQ ID NO.468、SEQ ID NO.558、SEQ IDNO.567、SEQ ID NO.769、SEQ ID NO.784、SEQ ID NO.875、SEQ ID NO.1020、SEQ IDNO.1101、SEQ ID NO.1182、SEQ ID NO.1272、SEQ ID NO.1313和SEQ ID NO.1330中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点。在一些实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有与上述序列中任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的氨基酸序列，其具有与原磷酸化多肽抗原疫苗基本上相同的免疫原活性，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点。
在一个特别具体的实施方案中，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有SEQ ID NO.201、SEQ ID NO.225、SEQ ID NO.306、SEQ ID NO.387、SEQ ID NO.468、SEQ ID NO.558、SEQ IDNO.567、SEQ ID NO.769、SEQ ID NO.784、SEQ ID NO.875、SEQ ID NO.1020、SEQ IDNO.1101、SEQ ID NO.1182、SEQ ID NO.1272、SEQ ID NO.1313和SEQ ID NO.1330中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列分别具有如下的磷酸化位点：18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)；18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)；18(P-Tyr18)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)；18(P-Tyr18)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；18(P-Tyr18)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；18(P-Tyr18)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗与载体偶联形成的复合物疫苗。
在一些实施方案中，所述载体选自人血清白蛋白、钥孔蓝蛋白素、细菌样颗粒(BLP)、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白组分V、流感血球凝集素、PAN-DR结合肽(PADRE多肽)、疟疾环子孢子(CS)蛋白、乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)、热休克蛋白(HSP)65、卡介苗(BCG)、霍乱毒素、减毒的霍乱毒素变体、白喉毒素、诺如病毒衣壳P蛋白、重组链球菌C5a肽酶、化脓链球菌ORF1224、化脓链球菌ORF1664、化脓链球菌ORF2452、肺炎链球菌溶血素、减毒的肺炎链球菌溶血素变体、肺炎衣原体ORFT367、肺炎衣原体ORFT858、破伤风类毒素、HIV gp120T1、识别微生物表面粘附基质分子的组分(MSCRAMMS)、生长因子/激素和趋化因子等，与载体偶联或混合形成的复合物疫苗可最大程度地刺激机体产生针对磷酸化多肽的特异性免疫反应。
在一些优选的实施方案中，所述载体为诺如病毒衣壳P蛋白。
术语“诺如病毒P蛋白”，在本文也简称为P蛋白(P protein)，是指诺如病毒的衣壳蛋白中的P蛋白，其能够在体外自主装成P颗粒。用于本文时，在基因水平上使用P protein，意指编码P蛋白的基因片段、核苷酸序列、质粒等；在蛋白质水平上使用P protein，意指P蛋白单体或多聚体。
术语P颗粒(P particle，简称PP)是指诺如病毒中由P蛋白在体外自组装成的蛋白颗粒，以24聚体形式最为常见。用于本文时，仅在蛋白质水平上使用P particle(PP)，意指多聚体(例如24聚体等)的形式，包括各种应用于性质检测的蛋白和用于免疫的蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述诺如病毒衣壳P蛋白的环状结构域中三个loop中各有一个氨基酸被突变为半胱氨酸，以便于与所述磷酸化多肽疫苗进行化学连接，将此突变修饰的诺如病毒衣壳P蛋白命名为PP-3C(序列如SEQ ID NO.1357所示)，其中所述突变不会引起诺如病毒P蛋白的移码突变。
在其他具体的实施方案中，所述诺如病毒P蛋白的环状结构域中三个loop中各插入一个赖氨酸，以便于与拼接的磷酸化多肽进行化学偶联，将此突变修饰的诺如病毒衣壳P蛋白命名为PP-3K(序列如SEQ ID NO.1359所示)，其中所述突变不会引起诺如病毒P蛋白的移码突变。
在其他优选的实施方案中，所述载体为细菌样颗粒(Bacterium-like particles，BLP)。
在一些具体的实施方案中，所述BLP借助于蛋白连接器蛋白(protein adaptor，PA)与磷酸化多肽抗原疫苗偶联；具体地，所述BLP通过共价结合作用与在其N末端加入GGGGSCGGGGS序列的PA(即C-PA)相连由此得到C-PA-BLP，然后C-PA-BLP与C末端具有半胱氨酸的磷酸化多肽抗原疫苗进行偶联。
术语“细菌样颗粒(Bacterium-like particles，BLP)”是一种新型的粘膜佐剂，通过热酸处理乳酸乳球菌得到，为无生命活性的球型颗粒，主要成分为乳酸乳球菌肽聚糖壳。BLP颗粒作为疫苗抗原成分的载体，可以有效的结合抗原并将抗原展示到其表面。BLP本身的肽聚糖壳通过与Toll样受体的作用而激活固有性免疫系统发挥佐剂的功能。BLP可通过本领域已知的方法获得。
术语“蛋白连接器(protein adaptor，PA)”即PA蛋白，其为乳酸乳球菌细胞壁水解酶ACMA细胞壁结合区域全序列或截短序列。本发明中使用的PA蛋白为乳酸乳球菌细胞壁水解酶ACMA(GenBank:U17696.1)的219-437位氨基酸序列在其N端添加GGGGSCGGGGS序列后的产物(即C-PA蛋白)，序列如SEQ ID NO:1364所示。
本发明的第三方面提供了制备本发明的第二方面的复合物疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
1)人工合成本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗；
2)制备待与磷酸化多肽抗原疫苗偶联的载体；
3)将所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体混合以进行偶联反应；
4)分离纯化3)中所得的偶联体，由此获得复合物疫苗。
在一些实施方案中，所述方法的步骤2)中的载体为诺如病毒衣壳P蛋白，优选为PP-3C或PP-3K，具体包括以下步骤：
i)获得含有编码PP-3C或PP-3K蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入受体细胞；
iii)表达所述PP-3C或PP-3K蛋白并在受体细胞中自组装成重组P颗粒，
优选地，还包括分离和纯化步骤。在一些具体的实施方案中，可使用离子交换色谱法和/或疏水层析色谱法进行纯化。
在一些实施方案中，所述方法的步骤3)采用PP-3C作为疫苗载体进行偶联，优选的缓冲体系为碳酸氢铵缓冲体系，优选的pH范围为7.5～8.8；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～10℃。
在一些实施方案中，所述方法的步骤3)采用PP-3K作为疫苗载体进行偶联，优选的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系，优选的pH范围为7.0～8.5；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～25℃。
在其他实施方案中，所述方法的步骤2)中的载体为细菌样颗粒BLP。在一些实施方案中，所述方法的步骤3)具体包括i)获得纯化的蛋白连接器C-PA蛋白(序列如SEQ ID NO:1364所示)；ii)将步骤2)中获得的载体细菌样颗粒BLP与C-PA蛋白连接以获得C-PA-BLP；iii)将C-PA-BLP与所述磷酸化多肽抗原疫苗进行偶联反应；其中缓冲体系为Tris缓冲体系，优选的pH范围为7.2～8.8；优选的C-PA蛋白浓度为0.1mg/mL～1.5mg/mL，优选的反应温度范围为2～30℃。在一些实施方案中，所述方法的步骤3)中采用的缓冲体系为碳酸氢铵缓冲体系，优选的pH范围为7.5～8.8；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述C-PA-BLP以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～10℃。
在一些实施方案中，所述方法的步骤4)包括通过离心、透析和超滤等方法除去未成功连接的载体和多肽抗原。
本发明的第四方面提供了一种疫苗组合物，其包含本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗或本发明第二方面的复合物疫苗。优选地，所述疫苗组合物还包含可药用的佐剂。
在一些实施方案中，所述可药用的佐剂选自CpG、MF59、AS02、AS03、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂中的一种或多种。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗或本发明第二方面的复合物疫苗或本发明第四方面的疫苗组合物用于制备预防和/或治疗神经变性障碍疾病的药物的用途。
在本发明中，所述“神经变性障碍疾病”包括但不限于AD、克-雅综合症、拳击员痴呆、唐氏综合症、格-施-沙病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病和外伤性脑损伤、肌萎性缩侧索硬化/帕金森综合症-痴呆综合症、嗜银颗粒性痴呆、皮层基底节(corticobasal)变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体连锁额颞痴呆伴帕金森综合症、哈-施病(Hallevorden-Spatz disease)、多系统性萎缩、C型尼-皮病、皮克病、进行性皮下神经胶质增生、进行性核上性全脑炎，优选为AD。
在一些实施方案中，所述疫苗或疫苗组合物优选通过皮下或腹腔或肌肉途径、更优选通过肌肉途径进行免疫。
本发明的第六方面提供了本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗或本发明第二方面的复合物疫苗或本发明第四方面的疫苗组合物用于制备保持或改善、优选恢复、更优选完全恢复哺乳动物、尤其是人的认知记忆力的药物的用途。
本发明的第七方面提供了一种治疗或预防神经变性障碍疾病的方法，包括向受试者施用本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗或本发明第二方面的复合物疫苗或本发明第四方面的疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
在一些实施方案中，所述疫苗或疫苗组合物优选通过皮下或腹腔或肌肉途径、更优选通过肌肉途径进行给药。
本发明的第八方面提供了一种保持或改善、优选恢复、更优选完全恢复受试者的认知记忆力的方法，包括向所述受试者给药本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗或本发明第二方面的复合物疫苗或本发明第四方面的疫苗组合物。
本发明的第九方面提供了用于与本发明第一方面的磷酸化多肽抗原疫苗偶联的诺如病毒衣壳P蛋白，其环状结构域中三个loop中各有一个氨基酸被突变为半胱氨酸——由此得到的P蛋白称为PP-3C(序列如SEQ ID NO.1357所示)，或各插入一个赖氨酸——由此得到的P蛋白称为PP-3K(序列如SEQ ID NO.1359所示)。
本发明的第十方面提供了一种制备本发明第九方面的诺如病毒衣壳P蛋白的方法，包括以下步骤：
i)获得含有编码PP-3C或PP-3K蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入受体细胞；
iii)表达所述PP-3C或PP-3K蛋白并在受体细胞中自组装成重组P颗粒，
优选地，还包括分离和纯化步骤。在一些具体的实施方案中，可使用离子交换色谱法和/或疏水层析色谱法进行纯化。
本发明的第十一方面提供了一种连接器蛋白，其在N端插入GGGGSCGGGGS序列——由此得到的连接器蛋白为C-PA(序列如SEQ ID NO.1364所示)。
本发明的第十二方面提供了一种制备本发明第十一方面的连接器蛋白的方法，包括以下步骤：
i)获得含有编码C-PA蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入宿主细胞；
iii)表达所述C-PA蛋白并分离纯化由此获得所述C-PA蛋白。
附图说明
图1示出了各重组质粒构建体的图谱。图1A为已经构建好的pET26b-PP质粒示意图；图1B为已经构建好的pET26b-PP-3C质粒示意图；图1C为已经构建好的pET28a-PP质粒示意图；图1D为已经构建好的pET28a-PP-3K质粒示意图；图1E为已经构建好的pColdIV-PP-3C质粒示意图。
图2示出了重组pET26b质粒构建体及纯化表达结果图。图2A为PP-3C颗粒的示意图；图2B为已经构建好的pET26b–PP-3C质粒双酶切鉴定示意图，如图所示目的条带位于1000bp；图2C为PP-3C蛋白与PP-3K蛋白样品进行非变性电泳胶图，如图所示两种蛋白出现条带均在250kDa以上，经分析为12聚体和24聚体形式。
图3示出了重组pET28a质粒构建体及纯化表达结果图。图3A为PP-3K颗粒的示意图；图3B为已经构建好的pET28a-PP-3K质粒双酶切鉴定示意图，如图所示目的条带位于1000bp；图3C为目的蛋白洗脱峰蛋白样品SDS-PAGE图，如图所示，目的蛋白在35kDa处富集。
图4示出了重组pET28a-PP-3K蛋白颗粒的电镜照片。
图5示出了重组pET26b-PP-3C蛋白颗粒的电镜照片。
图6示出了磷酸化多肽抗原疫苗联合弗氏佐剂免疫小鼠后产生的针对不同抗原的IgG抗体水平。图6A示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠后产生的抗Tau14-22(pY18)IgG抗体水平，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6B示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠后产生的抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6C示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠后产生的抗Tau208-218(pT212/pS214)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6D示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠后产生的抗Tau227-239(pS231/pS235)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6E示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠后产生的抗Tau234-242(pS238)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6F示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠中的抗Tau258-266(pS262)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6G示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠中的抗Tau392-400(pS396)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值；图6H示出了用A1-A16疫苗免疫WT小鼠中的抗Tau401-408(pS404)IgG抗体，每组6只小鼠，各组小鼠接受四次免疫，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫。在第四次免疫后两周采血，获得小鼠血清进行ELISA实验。结果表示为各组小鼠获得的平均O.D.+SD值。
图7示出了与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原经不同免疫途径免疫小鼠的免疫结果。每组六只小鼠，均经过4次免疫，每次免疫间隔两周，在第一次免疫后第四周、第六周和第八周取血获得血清进行ELISA实验。图7A示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A1免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体和抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7B示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A5免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体、抗Tau234-242(pS238)IgG抗体和抗Tau258-266(pS262)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7C示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A9免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体、抗Tau234-242(pS238)IgG抗体和抗Tau258-266(pS262)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7D示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A10免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7E示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A11免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7F示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A12免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau208-218(pT212/pS214)IgG抗体和抗Tau227-239(pS231/pS235)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD至；图7G示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A15免疫WT鼠经肌肉免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau234-242(pS238)IgG抗体、抗Tau258-266(pS262)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7H示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A2免疫WT鼠经腹腔免疫的结果。用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体和抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7J示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A3免疫WT鼠经腹腔免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体和抗Tau208-218(pT212/pS214)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7K示出了用诺如病毒P蛋白偶联A7免疫WT鼠经腹腔免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体和抗Tau227-239(pS231/pS235)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7L示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A11免疫WT鼠经腹腔免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7M示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A14免疫WT鼠经腹腔免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau208-218(pT212/pS214)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7N示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A4免疫WT鼠经皮下免疫的结果。用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体和抗Tau227-239(pS231/pS235)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7O示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A6免疫WT鼠经皮下免疫的结果。用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau14-22(pY18)IgG抗体和抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7P示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A8免疫WT鼠经皮下免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体和抗Tau227-239(pS231/pS235)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7Q示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A11免疫WT鼠经皮下免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau198-209(pS202/pT205)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7R示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A13免疫WT鼠经皮下免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau208-218(pT212/pS214)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图7S示出了用与诺如病毒P蛋白偶联的A16免疫WT鼠经皮下免疫的结果，用ELISA方法检测小鼠血清中抗Tau234-242(pS238)IgG抗体、抗Tau258-266(pS262)IgG抗体、抗Tau392-400(pS396)IgG抗体和抗Tau401-408(pS404)IgG抗体含量。结果表示为小鼠血清1/200稀释度下的获得的平均O.D.+SD值。
图8示出了以与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原结合CpG、AS02、AS03、MF59、AS02+CpG佐剂和与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原结合AS02+CpG佐剂，分别对野生小鼠在第0、2、4、6、12周进行肌肉免疫，在每次免疫后2周取血获得血清，以相对于全长Tau蛋白的第202、205、396、404位点氨基酸磷酸化的SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽作为包被抗原来进行ELISA实验。结果表示为以AT8抗体标定的各组小鼠获得的抗磷酸化多肽的抗体浓度。
图9示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂在小鼠中的免疫原性分析。图9A示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂在WT小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQ ID NO:1355的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图9B示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂在P301S小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQID NO:1355的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图9C示出了与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂在P301S小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图9D示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂在P301S小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图9E示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A12结合AS02+CpG佐剂在WT小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQ ID NO:1356的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值；图9F示出了与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A12结合AS02+CpG佐剂在P301S小鼠中的免疫结果，检测小鼠血清中针对序列为SEQ ID NO:1356的磷酸化多肽的抗体含量。结果表示为小鼠血清不同稀释度下的获得的平均O.D.+SD值。
图10示出了疫苗在P301S转基因小鼠中的细胞免疫情况。图10A示出了PP-3K-A5复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在原核表达的全长Tau蛋白刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10B示出了PP-3K-A5复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在非磷酸化的A5多肽刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10C示出了PP-3K-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在原核表达的全长Tau蛋白刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10D示出了PP-3K-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在非磷酸化的A11多肽刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10E示出了PP-3C-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在原核表达的全长Tau蛋白刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10F示出了PP-3C-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在非磷酸化的A11多肽刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10G示出了PP-3K-A12复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在原核表达的全长Tau蛋白刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数；图10H示出了PP-3K-A12复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的ELISPOT结果，结果表示为不同免疫组动物脾细胞在非磷酸化的A12多肽刺激物刺激下每106个细胞刺激引起的IFN-γ的点数。
图11示出了疫苗在P301S转基因小鼠中的转棒行为学情况。图11A示出了PP-3K-A5复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的转棒实验结果，结果表示为不同免疫组动物在300s内小鼠从转棒上跌落的平均时间与检测时间点曲线；图11B示出了PP-3C-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的转棒实验结果，结果表示为不同免疫组动物在300s内小鼠从转棒上跌落的平均时间与检测时间点曲线；图11C示出了PP-3K-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的转棒实验结果，结果表示为不同免疫组动物在300s内小鼠从转棒上跌落的平均时间与检测时间点曲线；图11D示出了PP-3K-A12复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的转棒实验结果，结果表示为不同免疫组动物在300s内小鼠从转棒上跌落的平均时间与检测时间点曲线。
图12示出了疫苗在P301S转基因小鼠中的筑巢行为学情况。图12A示出了PP-3K-A5复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的筑巢实验结果，结果表示为每只小鼠在筑巢实验中三个人评分的平均值。结果表明，免疫组小鼠相对于PBS组具有统计学上显著差异；图12B示出了PP-3C-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的筑巢实验结果，结果表示为每只小鼠在筑巢实验中三个人评分的平均值。结果表明，免疫组小鼠相对于PBS组具有统计学上显著差异；图12C示出了PP-3K-A11复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的筑巢实验结果，结果表示为每只小鼠在筑巢实验中三个人评分的平均值。结果表明，免疫组小鼠相对于PBS组具有差异；图12D示出了PP-3K-A12复合物疫苗在P301S转基因小鼠中的筑巢实验结果，结果表示为每只小鼠在筑巢实验中三个人评分的平均值。结果表明，免疫组小鼠相对于PBS组具有差异。
图13示出了与PP-3C/C-PA-BLP偶联的磷酸化多肽HPLC定量结果示意图。图13A示出了标准品浓度为0.03125mg/mL时的液相图谱，图中标注的峰为标准品出峰位置；图13B示例性地示出了实施例4-2中制备的与PP-3C偶联的磷酸化多肽样品解离出的磷酸化多肽的液相图谱，图中标注的峰为样品出峰位置；图13C示例性地示出了实施例33中制备的与C-PA-BLP偶联的磷酸化多肽样品解离出的磷酸化多肽的液相图谱，图中标注的峰为样品出峰位置；图13D示出了标准品浓度相对于峰面积的标准曲线图。
图14示出了已经构建好的pET28a-C-PA质粒示意图。
图15示出了重组pET28a-C-PA质粒构建体及纯化表达结果图。图15A为已经构建好的pET28a-C-PA质粒的双酶切鉴定示意图，如图所示目的条带位于700bp；图15B为C-PA蛋白样品进行SDS-PAGE电泳胶图，如图所示蛋白出现条带在24kDa左右。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。
实施例1：磷酸化多肽抗原疫苗的制备
在本实施例中，发明人基于人全长Tau蛋白(SEQ ID NO.1332)，设计了如下15种包含选自所述人全长Tau蛋白的两条多肽片段的磷酸化多肽抗原疫苗，具体的序列信息参见下表1：
表1：15种磷酸化多肽抗原疫苗的序列信息
以上所述15种磷酸化多肽抗原疫苗由吉尔生化(上海)有限公司(GL biochem(Shanghai)Ltd.)合成制备而获得，其以冻干形式存在。
实施例2：半胱氨酸修饰的诺如病毒P蛋白(PP-3C)的制备
以pET26b(+)为载体的诺如病毒P蛋白质粒的制备已在中国发明专利申请2015104155561中记载。本实施例以此质粒为模板进行三次点突变，将诺如病毒P颗粒的三个loop环状结构中各一个氨基酸突变为半胱氨酸，并进行表达与纯化蛋白。
2.1PP-3C质粒的构建
通过定点突变的方法，利用中国发明专利申请2015104155561中已构建好的质粒pET26b-P protein，经过三轮定点突变，分别将loop1中的5’ATCGCTGGAACACAA3”突变为5’ATCGCTTGCACACAA3’。具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1334(正向):
CTGTGAACATCGCTACTTTCCGCGGCGACGTCACACACATCGCTTGCACACAAAACTA
CSEQ ID NO:1335(反向):
GTAGTTTTGTGTGCAAGCGATGTGTGTGACGTCGCCGCGGAAAGTAGCGATGTTCACAG对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确。
对获得的第一轮点突变质粒进行第二次定点突变。将loop2中的5’ACCTCAAACGAT3’突变为5’ACCTGCAACGA3’，具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1336(正向):GCAATTCAGCACAGACACCTGCAACGATTTCGAGACTGGCC
SEQ ID NO:1337(反向):GGCCAGTCTCGAAATCGTTGCAGGTGTCTGTGCTGAATTGC
对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确。
对获得的第二轮点突变质粒进行第三次定点突变。将loop3中的5’GACGGCAGCACC3’突变为5’GACTGCAGCACC3’，具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1338(正向)：CCGTGGGTGTCGTTCAAGACTGCAGCACCACTCACCAGAACG
SEQ ID NO:1339(反向)：CGTTCTGGTGAGTGGTGCTGCAGTCTTGAACGACACCCACGG
对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确。所得的pET26b-PP-3C的质粒如图1B所示。
2.2将突变成功的P蛋白即PP-3C基因构建到pCold IV载体上
通过PCR的方法在PP-3C基因(序列如SEQ ID NO.1358所示)的5’端引入EcoR I酶切位点，在3’端引入Hind III酶切位点具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1340(正向)：GGGAATTCCATATGAAGCCCTTCTCGGTCCCTATCCTGACAG
SEQ ID NO:1341(反向)：CCCAAGCTTTTACAAGGCTCTGCGACGACCGGCTC
对以上获得的pET26b-PP-3C质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，获得50μL PCR产物。对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对目的片段进行回收，得到5’端带有EcoR I酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点的PP-3C基因片段。
取2μg上述回收片段，加入Hind III酶和EcoR I酶(购自Takara公司)各1μL，并加入5μL酶切缓冲液(购自Takara公司)，最后向体系中加入无菌水使终体积为50μL，37℃，酶切2小时，并用普通DNA产物纯化试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对产物进行纯化，得到具有粘性末端的目的片段。
取2μg pCold IV载体质粒(购自Novagen公司)，加入Hind III酶和EcoR I酶(购自Takara公司)各1μL，并加入5μL酶切缓冲液(购自Takara公司)，最后向体系中加入无菌水使终体积为50μL，37℃，酶切2小时，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对载体片段进行回收，得到具有双酶切粘性末端的质粒载体。
取上述双酶切后的载体片段和目的片段(摩尔比为1:3，总体积15μL)，混合，加入0.75μL的T4连接酶(购自Takara公司)，以及1.5μL连接酶缓冲液(购自Takara公司)，16℃连接过夜，取10μL连接产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有氨苄青霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到重组克隆，测序验证序列正确。得到具有能够表达PP-3C蛋白的pColdIV-PP-3C质粒，如图1E所示。
2.3半胱氨酸修饰的诺如病毒P蛋白的表达
分别取上述实施例中制成的重组质粒1μL加入100μL大肠杆菌BL21感受态细胞(购自TransGen公司)中，冰浴30min，然后在42℃水浴中，热激90s后，冰浴2min。向混合物中加入LB培养基600μL，180rpm/min，37℃培养1h。将混合物均匀涂布在含有卡那霉素(15μg/mL)抗性的LB固体培养基上，37℃培养24小时，即可获得可以稳定表达重组蛋白的菌株。挑取生长的菌落接种在20mL LB培养基中，37℃，220rpm培养，并在培养混合物的OD值达到1.0时，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度0.5mmol/L)进行诱导，16℃，220rpm诱导过夜。诱导完成后，将菌液以4000rpm离心20min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，再次以4000rpm离心20min，弃上清，得到含有目的蛋白的菌体的沉淀。
2.4半胱氨酸修饰的诺如病毒P蛋白的纯化
向2.3获得的菌体沉淀中加入20mL蛋白缓冲液(PH＝8.0，含50mM Tris，300mMKCl)重悬，在冰上将菌体超声30min破碎菌体，将混合物以12000rpm，4℃离心30min，取上清。将上清过0.45μm滤膜后得到蛋白的粗提液。
重组PP-3C颗粒蛋白的结构如图2A所示。
利用阴离子交换柱(购自GE公司)对蛋白质粗提液进行纯化。其具体方案如下：首先用超纯水润洗交换柱，体积约为100mL，然后用pH为5.0的PB溶液平衡交换柱，流速2mL/min，然后将20mL蛋白粗提液以1mL/min的流速加入交换柱，待样品完全挂柱后，用pH为7.0的PB溶液冲洗交换柱，以除去杂蛋白，然后用含有浓度为0.5mol/L氯化钠的PB溶液进行洗脱，收集峰值蛋白，得到目的蛋白。
继续用疏水层析柱(购自GE公司)对蛋白进行进一步纯化，具体操作方法如下：首先用超纯水润洗柱子，然后用pH为7.0的PB溶液润洗疏水柱，流速为2mL/min。柱子平衡好之后，注入蛋白样品，待样品完全进入柱子后，用pH为7.0的PB与1mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱时长为2小时，氯化钠浓度从1mol/L下降到0.1mol/L，收获峰值蛋白。通过还原性SDS-PAGE鉴定所得P颗粒蛋白单体的大小。
然后利用Superdex 200分子筛(购自GE公司)进一步分离纯化P蛋白颗粒的24聚体形式，其操作步骤如下：用超纯水润洗柱子，流速1mL/min，润洗一个柱体积，然后用体积约120mL的pH＝5的PB缓冲液再次润洗柱子，然后将2mL蛋白提取液加入柱子中，用PB缓冲液以1mL/min的流速冲洗，收获峰值蛋白，得到P颗粒24聚体形式蛋白。并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测三种蛋白的多聚体结构，如图2C所示，蛋白条带在250KDa之上，可知重组P蛋白可以在体外自我组装成12聚体和24聚体形式的P蛋白颗粒，并保持平衡；蛋白纯化后，依旧保持了其多聚体的形式。对纯化的PP-3C蛋白颗粒进行电镜分析，结果表明，PP-3C多形成大颗粒聚集体(如图4所示)。
实施例3：赖氨酸修饰的诺如病毒P蛋白(PP-3K)的制备
本实施例以pET28a为载体的诺如病毒P蛋白质粒(其由中国发明专利申请2015104155561提供的pET26b-PP质粒通过同源重组方法将PP基因构建于pET28a中而获得)为模版进行三次点突变，在诺如病毒P颗粒的三个loop环状结构中各插入一个赖氨酸，并进行表达与纯化蛋白。
3.1pET28a-PP质粒的构建
通过PCR的方法将pET 26b-PP质粒中PP基因富集，具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1361(正向)：AACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAAGCCCTTCTCGGTCCCTA
SEQ ID NO:1362(反向)：CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACAAGGCTCTGCGACGACCGGC
对pET26b-P protein质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，获得50μL PCR产物。对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对目的片段进行回收。
取2μg pET28a载体质粒(购自Novagen公司)，加入BamHI酶和XhoI酶(购自Takara公司)各1μL，并加入5μL酶切缓冲液(购自Takara公司)，最后向体系中加入无菌水使终体积为50μL，37℃，酶切2小时，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对载体片段进行回收，得到线性质粒载体。
取上述双酶切后的载体片段和目的片段(摩尔比为1:3，总体积5μL)，混合，加入5μL的同源重组mix(购自中美泰和公司)，25℃连接15min，取10μL连接产物加入DH10B感受态细胞中(购自中美泰和公司)，冰上放置30min后42℃热击30s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到重组克隆，测序验证序列正确。得到具有能够表达PP蛋白的pET28a-PP质粒，如图1C所示。
3.2PP-3K质粒的构建
通过定点突变的方法，利用已经构建好的质粒pET28a-PP，经过三轮定点突变，分别将loop1中的5’CGCTGGAACACAAA3’突变为5’CGCTGGAAAGACACAAA3’。具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1340(正向):GACGTCACACACATCGCTGGAAAGACACAAAACTACACCATGAAC
SEQ ID NO:1341(反向):GTTCATGGTGTAGTTTTGTGTCTTTCCAGCGATGTGTGTGACGTC
对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确。
对获得的第一轮PCR产物进行第二次定点突变。将loop2中的5’ACCTCAAACGAT 3’突变为5’ACCTCAAAGAACGAT3’具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1342(正向):CAATTCAGCACAGACACCTCAAAGAACGATTTCGAGACTGGCCAG
SEQ ID NO:1343(反向):CTGGCCAGTCTCGAAATCGTTCTTTGAGGTGTCTGTGCTGAATTG
对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确。
对获得的第二轮PCR产物进行第三次定点突变。将loop3中的5’GACGGCAGCACC 3’突变为5’GACGGCAGCACC3’具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1344(正向)：
GTGGGTGTCGTTCAAGACGGCAAGAGCACCACTCACCAGAACGAA
SEQ ID NO:1345(反向)：
TTCGTTCTGGTGAGTGGTGCTCTTGCCGTCTTGAACGACACCCAC
对整个质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，得到20μL PCR产物，向产物中加入1μL DpnI酶(购自NEB公司)，37℃酶切1h，取10μL酶切产物加入Tran1-Blue感受态细胞中(购自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃热击45s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到突变质粒的克隆，测序验证序列正确(PP-3K基因的序列如SEQ ID NO.1360所示)。pET28a-P protein-3K质粒如图1D所示。
3.3酪氨酸修饰的诺如病毒P蛋白的表达
分别取上述实施例中制成的重组质粒1μL加入100μL大肠杆菌BL21感受态细胞(购自TransGen公司)中，冰浴30min，然后在42℃水浴中，热激90s后，冰浴2min。向混合物中加入LB培养基600μL，180rpm/min，37℃培养1h。将混合物均匀涂布在含有卡那霉素(15μg/mL)抗性的LB固体培养基上，37℃培养24小时，即可获得可以稳定表达重组蛋白的菌株。挑取生长的菌落接种在20mL LB培养基中，37℃，220rpm培养，并在培养混合物的OD值达到1.0时，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度0.5mmol/L)进行诱导，16℃，220rpm诱导过夜。诱导完成后，将菌液以4000rpm离心20min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，再次以4000rpm离心20min，弃上清，得到含有目的蛋白的菌体的沉淀。
3.4赖氨酸修饰的诺如病毒P蛋白的纯化
向3.3获得的菌体沉淀中加入20mL蛋白缓冲液(PH＝8.0，含50mM Tris，300mMKCl)重悬，在冰上将菌体超声30min破碎菌体，将混合物以12000rpm，4℃离心30min，取上清。将上清过0.45μm滤膜后得到蛋白的粗提液。
重组PP-3K颗粒的结构如图3A所示。
利用阴离子交换柱(购自GE公司)对蛋白质粗提液进行纯化。其具体方案如下：首先用超纯水润洗交换柱，体积约为100mL，然后用pH为5.0的PB溶液平衡交换柱，流速2mL/min，然后将20mL蛋白粗提液以1mL/min的流速加入交换柱，待样品完全挂柱后，用pH为7.0的PB溶液冲洗交换柱，以除去杂蛋白，然后用含有浓度为0.5mol/L氯化钠的PB溶液进行洗脱，收集峰值蛋白，得到目的蛋白。
继续用疏水层析柱(购自GE公司)对蛋白进行进一步纯化，具体操作方法如下：首先用超纯水润洗柱子，然后用pH为7.0的PB溶液润洗疏水柱，流速为2mL/min。柱子平衡好之后，注入蛋白样品，待样品完全进入柱子后，用pH为7.0的PB与1mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱时长为2小时，氯化钠浓度从1mol/L下降到0.1mol/L，收获峰值蛋白。通过还原性SDS-PAGE鉴定所得P颗粒蛋白单体的大小。然后利用Superdex 200分子筛(购自GE公司)进一步分离纯化P蛋白颗粒的24聚体形式，其操作步骤如下：用超纯水润洗柱子，流速1mL/min，润洗一个柱体积，然后用体积约120mL的pH5的PB缓冲液再次润洗柱子，然后将2mL蛋白提取液加入柱子中，用PB缓冲液以1mL/min的流速冲洗，收获峰值蛋白，得到P颗粒24聚体形式蛋白。并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测三种蛋白的多聚体结构，如图2C所示，蛋白条带在250KDa之上，可知重组P蛋白可以在体外自我组装成12聚体和24聚体形式的P蛋白颗粒，并保持平衡；蛋白纯化后，依旧保持了其多聚体的形式。对纯化的PP-3K蛋白颗粒进行电镜分析，结果表明，PP-3K多形成大颗粒聚集体(如图5所示)。
实施例4：PP-3C与磷酸化多肽抗原疫苗的偶联反应
实施例4-1：用GE公司的脱盐柱对纯化后的PP-3C进行换液处理，将蛋白的缓冲体系置换为0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝7.5)。对换液后的PP-3C进行定量，并稀释至浓度为0.3mg/mL。按照蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：30加入实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗，并缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经超滤浓缩，除掉未结合的多肽，并将缓冲体系置换为PBS缓冲体系。
实施例4-2：用GE公司的脱盐柱对纯化后的PP-3C进行换液处理，将蛋白的缓冲体系置换为1M碳酸氢铵溶液(pH＝8.0)。对换液后的PP-3C进行定量，并稀释至浓度为0.5mg/mL。按照蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：50加入实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗，并缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经超滤浓缩，除掉未结合的多肽，并将缓冲体系置换为PBS缓冲体系。
实施例4-3：用GE公司的脱盐柱对纯化后的PP-3C进行换液处理，将蛋白的缓冲体系置换为0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝7.8)。对换液后的PP-3C进行定量，并稀释至浓度为0.3mg/mL。按照蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：100加入实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗，并缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经超滤浓缩，除掉未结合的多肽，并将缓冲体系置换为PBS缓冲体系。
实施例4-4：用GE公司的脱盐柱对纯化后的PP-3C进行换液处理，将蛋白的缓冲体系置换为0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝8.8)。对换液后的PP-3C进行定量，并稀释至浓度为0.3mg/mL。按照蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：30加入实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗，并缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育72小时。将得到的产物经超滤浓缩，除掉未结合的多肽，并将缓冲体系置换为PBS缓冲体系。
实施例5：PP-3K与磷酸化多肽抗原疫苗的偶联反应
实施例5-1：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量，并调节pH＝7.2。取1mg/mL硫代马来酰亚胺(suflo-SMCC)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝5：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于25℃水浴下反应30min。用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的sulfo-SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：5的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，然后将反应体系转入25℃水浴下反应30min。收集反应产物用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-2：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取1mg/mL硫代马来酰亚胺(sulfo-SMCC)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝20：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于25℃水浴下反应30min。用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PB溶液(pH＝8.5)，并除去未结合的sulfo-SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：30的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，然后将反应体系转入25℃水浴下反应30min。收集反应产物用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PB溶液(pH＝8.5)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-3：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取1mg/mL硫代马来酰亚胺(sulfo-SMCC)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝20：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于25℃水浴下反应30min。用20kd截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PB溶液(pH＝7.0)，并除去未结合的sulfo-SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：50的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，然后将反应体系转入25℃水浴下反应30min。用20kDa截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PB溶液(pH＝7.0)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-4：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取1mg/mL硫代马来酰亚胺(sulfo-SMCC)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝20：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于2-8℃缓慢震荡反应过夜。用20kd截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的sulfo-SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：50的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，然后将反应体系于2-8℃缓慢震荡反应过夜。用20kd截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-5：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取20mg/mL马来酰亚胺(SMCC)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝10：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于25℃水浴下反应30min。用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：30的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，然后将反应体系转入25℃水浴下反应30min。收集反应产物用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-6：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取20mg/mL马来酰亚胺(SMCC)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝30：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于2-8℃缓慢震荡反应过夜。用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：50的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，混合物于2-8℃缓慢震荡反应过夜。收集反应产物用GE公司的脱盐柱对混合物进行脱盐处理，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例5-7：对纯化得到的PP-3K溶液进行BCA定量。取20mg/mL马来酰亚胺(SMCC)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，按照SMCC摩尔量：PP-3K摩尔量＝5：1的比例将两种蛋白溶液混合，混合物于25℃水浴反应30min。用20kDa截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2-7.4)，并除去未结合的SMCC。取反应产物按照PP-3K摩尔量：磷酸化多肽摩尔量＝1：100的比例向体系中加入实施例1中所制备的各磷酸化多肽抗原疫苗冻干品，并缓慢混合，混合物于2-8℃缓慢震荡反应过夜。收集反应产物用20kDa截留分子量的透析袋对混合物进行脱盐处理，透析体积比为1000：1，2-8℃透析过夜，将体系置换为PBS溶液(pH＝7.2)，并除去未结合的磷酸化多肽。
实施例6：与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原产物连接效率的测定
向与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原产物中以体积比为1：1加入10mM二硫苏糖醇溶液，均匀混合后室温静置，反应16小时。将反应产物16000g，4℃离心15min。取上清进行HPLC的测定。以0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL的10mM二硫苏糖醇溶液溶解的磷酸化多肽作为标准品，以标准品浓度对磷酸化多肽出峰面积作标准曲线，对待测样品浓度进行定量分析(结果如图13A、图13B和图13D所示)。
实施例7：与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原产物连接效率的测定
将与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原产物进行质谱分析，以PBS溶解的磷酸化多肽作为标准品，对待测样品进行浓度定量分析(结果未示出)。
实施例8：磷酸化多肽抗原疫苗在野生鼠中的免疫原性分析
对SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:306、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:468、SEQ ID NO:558、SEQ ID NO:567、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:784、SEQ ID NO:875、SEQID NO:1020、SEQ ID NO:1101、SEQ ID NO:1182、SEQ ID NO:1272、SEQ ID NO:1313、SEQID NO:1330中所示序列的磷酸化多肽抗原溶解至1mg/mL，并与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂进行体积比为1：1混合为油包水乳剂，制备疫苗A1～A16。每只野生鼠肌肉注射50μL。间隔两周注射一次，第一次免疫采用完全弗氏佐剂，第二、第三、第四次免疫采用不完全弗氏佐剂，共进行四次免疫。并于第四次免疫后两周进行采血，取小鼠血清进行ELISA分析。
以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第18位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQIDNO:1346所示)作为检测针对于磷酸化Y18位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第202和205位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1347所示)作为检测针对于磷酸化S202和T205位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第212/214位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1348所示)作为检测针对于磷酸化T212个S214位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第231/235位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1349所示)作为检测针对于磷酸化T231和S235位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第238位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1350所示)作为检测针对于磷酸化S238位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第262位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1351所示)作为检测针对于磷酸化S262位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第396位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1352所示)作为检测针对于磷酸化S396位点的抗血清效价的包被抗原；以偶联于BSA上的相对于全长Tau蛋白第404位氨基酸磷酸化的多肽(序列如SEQ ID NO:1353所示)作为检测针对于磷酸化S404位点的抗血清效价的包被抗原。
将上述各抗原分别用pH＝9.5的碳酸盐缓冲液溶解，稀释至1μg/mL，加入ELISA板，100μL/孔，4℃过夜。弃去板中液体，加300μL/孔PBST洗涤96孔板3次，弃去板中液体。加入3％BSA(PBS)溶液200μL/孔，37℃孵育1小时。弃去板中液体，加300μL/孔PBST洗涤96孔板3次，弃去板中液体。加入1％BSA(PBS)溶液梯度稀释的小鼠血清，100μL/孔，37℃孵育2小时。弃去板中液体，加300μL/孔PBST洗涤96孔板3次，弃去板中液体。加入1％BSA(PBS)溶液稀释的山羊抗鼠HRP标记的抗体溶液100μL/孔，37℃孵育1小时。弃去板中液体，加300μL/孔PBST洗涤96孔板3次，弃去板中液体。加入TMB100μL/孔，室温避光孵育25min。加入1M硫酸水溶液终止反应。酶标仪检测450nm处吸光值。
疫苗A1～A16的第四次免疫血清中针对不同抗原的抗体水平如图6所示。结果表明：疫苗A1～A6各组小鼠免疫后均能成功产生针对pY18位点的抗体，其中疫苗A2与疫苗A5能产生高浓度抗体；疫苗A7～A16几乎不能产生针对pY18位点的抗体(图6A)。疫苗A1～A2和疫苗A7～A11各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS202/pT205位点的抗体，其中疫苗A8～A11能产生高浓度抗体；疫苗A3～A6和疫苗A12～A16几乎不能产生针对pS202/pT205位点的抗体(图6B)。疫苗A3和疫苗A12～A14各组小鼠免疫后均能成功产生针对pT212/pS214位点的高浓度抗体，疫苗A6、疫苗A8、疫苗A11能产生低浓度抗体；疫苗A1、疫苗A2、疫苗A4、疫苗A5、疫苗A7、疫苗A9～A11、疫苗A15、疫苗A16几乎不能产生针对pT212/pS214位点的抗体(图6C)。疫苗A4疫苗A7～A8和疫苗A12各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS231/pS235位点的高浓度抗体，疫苗A1、疫苗A5、疫苗A14能产生低浓度抗体；疫苗A2、疫苗A3、疫苗A6、疫苗A9～A11、疫苗A13、疫苗A15、疫苗A16几乎不能产生针对pS231/pS235位点的抗体(图6D)。疫苗A5、疫苗A9和疫苗A13、疫苗A15～A16各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS238位点的高浓度抗体，疫苗A8、疫苗A14也能产生较高浓度抗体；疫苗A1～A4、疫苗A6、疫苗A7、疫苗A10～A12几乎不能产生针对pS238位点的抗体(图6E)。疫苗A5、疫苗A9和疫苗A13、疫苗A16各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS262位点的高浓度抗体，疫苗A7、疫苗A14也能产生较高浓度抗体；疫苗A1～A4、疫苗A6、疫苗A8、疫苗A10～A12几乎不能产生针对pS238位点的抗体(图6F)。疫苗A6、疫苗A10、疫苗A11、疫苗A14～A16各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS396位点的高浓度抗体，疫苗A8能产生低浓度抗体；疫苗A1～A5、疫苗A7、疫苗A9、疫苗A12～A13几乎不能产生针对pS396位点的抗体(图6G)。疫苗A6、疫苗A10、疫苗A11、疫苗A14～A16各组小鼠免疫后均能成功产生针对pS404位点的高浓度抗体，疫苗A8能产生低浓度抗体；疫苗A1～A5、疫苗A7、疫苗A9、疫苗A12～A13几乎不能产生针对pS396位点的抗体(图6H)。综上所述，实施例1中所设计的各磷酸化多肽疫苗免疫动物后均能产生针对相应磷酸化位点的抗体，具有免疫原性，且疫苗A8和疫苗A14还能产生对其它磷酸化位点的交叉保护反应；同时发现采用较长的磷酸化多肽免疫可以引起较高浓度的抗体。
实施例9：对与诺如病毒P蛋白PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原通过肌肉注射免疫野生鼠的免疫原性评价
将PP-3C蛋白分别偶联至A1、A5、A9、A10、A11、A12、A15来制备复合物疫苗，对野生小鼠通过肌肉注射进行免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价，方法同实施例8，结果如图7A-7G所示。从图中可知，以复合物疫苗A1进行免疫的小鼠可产生针对pY18和pS202/pT205的特异性抗体(图7A)；以复合物疫苗A5进行免疫的小鼠可产生针对pY18和pS238和pS262的特异性抗体(图7B)；以复合物疫苗A9进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205、pS238和pS262的特异性抗体(图7C)；以复合物疫苗A9进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205、pS396和pS404的特异性抗体(图7D)；以复合物疫苗A11进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205、pS396和pS404的特异性抗体(图7E)；以复合物疫苗A12进行免疫的小鼠可产生针对pT212/pS214和pS231/pS235的特异性抗体(图7F)；以复合物疫苗A15进行免疫的小鼠可产生针对pS238、pS262、pS396和pS404的特异性抗体(图7G)。由此可见，各组复合物疫苗通过肌肉免疫的各次免疫后血清特异性抗体浓度均呈上升趋势，并在第四次免疫后产生高浓度抗体，其中pY18和pS202/pT205表位易引起高浓度特异性抗体。相对于其它免疫途径，肌肉免疫普遍能引起更高浓度抗体。
实施例10：与诺如病毒P蛋白PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原通过腹腔注射免疫野生鼠的免疫原性评价
将PP-3C蛋白分别偶联至A2、A3、A7、A11、A14来制备复合物疫苗，对野生小鼠通过腹腔注射进行免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价，方法同实施例10，结果如图7H-7M所示。从图中可知，以复合物疫苗A2进行免疫的小鼠可产生针对pY18和pS202/pT205的特异性抗体(图7H)；以复合物疫苗A3进行免疫的小鼠可产生针对pY18和pT212/pS214的特异性抗体(图7J)；以复合物疫苗A7进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205和pS231/pS235的特异性抗体(图7K)；以复合物疫苗A11进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205、pS396和pS404的特异性抗体(图7L)；以复合物疫苗A14进行免疫的小鼠可产生针对pT212/pS214、pS396和pS404的特异性抗体(图7M)。由此可见，各组复合物疫苗通过腹腔免疫的各次免疫后血清特异性抗体浓度均呈上升趋势，并在第四次免疫后产生高浓度抗体。
实施例11：与诺如病毒P蛋白PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原通过皮下注射免疫野生鼠的免疫原性评价
将PP-3C蛋白分别偶联至A4、A6、A8、A11、A13、A16来制备复合物疫苗，对野生小鼠通过皮下注射进行免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价，方法同实施例10，结果如图7N-7S所示。从图中可知，以复合物疫苗A4进行免疫的小鼠可产生针对pY18和pS231/pS235的特异性抗体(图7N)；以复合物疫苗A6进行免疫的小鼠可产生针对pY18、pS396和pS404的特异性抗体(图7O)；以复合物疫苗A8进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205和pS231/pS235的特异性抗体(图7P)；以复合物疫苗A11进行免疫的小鼠可产生针对pS202/pT205、pS396和pS404的特异性抗体(图7Q)；以复合物疫苗A13进行免疫的小鼠可产生针对pT212/pS214、pS396和pS404的特异性抗体(图7R)；以复合物疫苗A16进行免疫的小鼠可产生针对pS238、pS262、pS396和pS404的特异性抗体(图7S)。由此可见，各组疫苗通过皮下免疫的各次免疫后血清特异性抗体浓度均呈上升趋势，并在第四次免疫后产生高浓度抗体。
实施例12：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原在野生鼠中的免疫原性评价
以A11疫苗为例，PP-3C或PP-3K偶联A11，分别结合CpG、AS02、AS03、MF59、AS02+CpG佐剂对野生小鼠进行肌肉免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第202、205、396、404位点氨基酸磷酸化。以梯度稀释的AT8抗体(Thermoscientific MN1020)的浓度对O.D.值做标准曲线，标定小鼠血清中的抗体浓度。各组抗体浓度变化如图8所示。从图8中可以看出，结合不同佐剂的与诺如病毒P蛋白偶联的A11疫苗在野生鼠中均能引起较高免疫反应，其中结合AS02、AS03、MF59的疫苗在连续的四次免疫中会逐渐产生较高抗体，在间隔6周后的一次免疫中，未刺激引起相对较高的免疫反应；结合CpG佐剂和AS02+CpG佐剂的疫苗在连续的四次免疫中会逐渐产生浓度较低抗体，在间隔6周后的一次免疫中可刺激产生较高浓度抗体，且抗体含量可在较长时间维持高水平。以与PP-3C和PP-3K偶联的A11疫苗免疫的小鼠的抗体产生情况基本一致。其它磷酸化多肽疫苗免疫野生小鼠均产生类似效果(结果未示出)。
实施例13：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A5在野生鼠中的免疫原性评价
将与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对野生小鼠进行肌肉免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1355的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第18、238、262位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化如图9A所示。结果表明，PP-3K-A5复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例14：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A5在P301S转基因小鼠中的免疫原性评价
将与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对P301S转基因小鼠进行肌肉免疫，每组8只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1355的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第18、238、262位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化见图9B。结果表明，PP-3K-A5复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例15：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中的免疫原性评价
将与以PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对P301S转基因小鼠进行肌肉免疫，每组12只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第202、205、396和404位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化见图9C。结果表明，PP-3K-A11复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例16：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中的免疫原性评价
将与以PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对P301S转基因小鼠进行肌肉免疫，每组12只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1354的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第202、205、396和404位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化见图9D。结果表明，PP-3K-A5复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例17：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A12在野生鼠中的免疫原性评价
将与以PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A12结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对野生小鼠进行肌肉免疫，每组6只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1356的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第212、214、231和235位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化见图9E。结果表明，PP-3K-A12复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例18：诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽A12在P301S转基因小鼠中免疫原性评价将与以PP-3K偶联的磷酸化多肽A12结合AS02+CpG佐剂作为疫苗对P301S转基因小鼠进行肌肉免疫，每组12只小鼠，免疫剂量蛋白量为25μg/只，在第0、2、4、6、12周分别进行一次免疫，每次免疫后两周采血获得血清进行ELISA评价。在ELISA实验中用偶联至BSA的序列为SEQ ID NO:1356的磷酸化多肽作为包被抗原，所述磷酸化多肽在相对于全长Tau蛋白的第212、214、231和235位点氨基酸磷酸化。小鼠血清中的抗体浓度变化见图9F。结果表明，PP-3K-A12复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂通过肌肉免疫，逐次免疫后抗体呈上升趋势，疫苗免疫原性佳，在最后一次免疫后可在至少6周内维持高抗体浓度，抗体效价≥12800。
实施例19：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A5在P301S转基因小鼠中的细胞免疫评价－ELISPOT检测
利用细胞因子干扰素γ的单克隆抗体(来自elispot试剂盒，购自BD公司)包被96孔板，浓度5μg/mL，每孔50μL,加盖4℃包被过夜。弃去包被抗体，用10％胎牛血清的完全培养基洗涤一次后，在每孔加入该完全培养基200μL，37℃封闭1小时后弃去培养基。拉颈将实验鼠处死，取其脾细胞，制成细胞浓度为107个/mL细胞悬液，将细胞悬液加入包被好的96孔板中，每孔100μL。每孔加入1μg/mL的原核表达的全长Tau蛋白和非磷酸化的A5多肽抗原100μL，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，刺激、活化细胞。24小时后，用无菌水洗板两次，无菌PBST(pH7.4，0.01mol/L PBS，含有0.05％Tween-20)缓冲液洗涤6次，洗去细胞。每孔加入干扰素γ的抗体(来自elispot试剂盒，购自BD公司)，50μL，抗体浓度为2μg/mL，室温孵育两小时。洗涤96孔板，加入辣根过氧化物标记的生物素二抗(来自elispot试剂盒，购自BD公司)每孔50μL，室温培养2h，PBST洗涤四次，PBS洗涤2次后，每孔加入50μLElispot显色液(AEC底物)，避光室温反应5～60分钟，弃去染色液，用蒸馏水洗涤，过夜干燥后，利用显微镜计算出样品中被激活细胞的数目。
实验结果如图10A和10B所示，PP-3K-A5复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂组经过五次免疫后，可刺激脾细胞产生较少的斑点数，证明其在体内无明显的T细胞反应发生，并且如实施例14中所述，该免疫策略能够刺激小鼠产生最高滴度的针对于磷酸化A5多肽的特异性抗体。而出于疫苗的安全性考虑，该免疫策略可作为一种优选的免疫策略。
实施例20：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中的细胞免疫评价－ELISPOT检测
实验方法同实施例19。刺激物采用1μg/mL的原核表达的全长Tau蛋白和非磷酸化的A11多肽抗原100μL。
实验结果如图10C和10D所示，PP-3K-A11复合物疫苗结合AS02+CpG佐剂组经过五次免疫后，可刺激脾细胞产生较少的斑点数，证明其在体内无明显的T细胞反应发生，并且如实施例15中所述，该免疫策略能够刺激小鼠产生最高滴度的针对于磷酸化A11多肽的特异性抗体。而出于疫苗的安全性考虑，该免疫策略可作为一种优选的免疫策略。
实施例21：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中的细胞免疫评价－ELISPOT检测
实验方法同实施例19。刺激物采用1μg/mL的原核表达的全长Tau蛋白和非磷酸化的A11多肽抗原100μL。
实验结果如图10E和10F所示，PP-3C-A11结合AS02+CpG佐剂组经过五次免疫后，可刺激脾细胞产生较少的斑点数，证明其在体内无明显的T细胞反应发生，并且如实施例15中所述，该免疫策略能够刺激小鼠产生最高滴度的针对于磷酸化A11多肽的特异性抗体。而出于疫苗的安全性考虑，该免疫策略可作为一种优选的免疫策略。
实施例22：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A12在P301S转基因小鼠中的细胞免疫评价－ELISPOT检测
实验方法同实施例19。刺激物采用1μg/mL的原核表达的全长Tau蛋白和非磷酸化的A12多肽抗原100μL。
实验结果如图10G和10H所示，PP-3K-A12结合AS02+CpG佐剂组经过五次免疫后，可刺激脾细胞产生较少的斑点数，证明其在体内无明显的T细胞反应发生，并且如实施例15中所述，该免疫策略能够刺激小鼠产生最高滴度的针对于磷酸化A12多肽的特异性抗体。而出于疫苗的安全性考虑，该免疫策略可作为一种优选的免疫策略。
实施例23：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A5在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价。
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，从实验开始后8周开始，每隔两周取免疫组小鼠对其进行转棒耐受能力测试。将小鼠置于小鼠转棒仪上，转棒仪器开启后1.5min内转速从5rpm上升至40rpm并维持恒定。记录小鼠300s内从转棒上跌落的时间。实验表明经过免疫后的小鼠在转棒实验中耐受力较PBS组增强(结果如图11A所示)。
实施例24：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽A11在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价。
用与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，从实验开始后8周开始，每隔两周取免疫组小鼠对其进行转棒耐受能力测试。将小鼠置于小鼠转棒仪上，转棒仪器开启后1.5min内转速从5rpm上升至40rpm并维持恒定。记录小鼠300s内从转棒上跌落的时间。实验表明经过免疫后的小鼠在转棒实验中耐受力较PBS组增强(结果如图11B所示)。
实施例25：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，从实验开始后8周开始，每隔两周取免疫组小鼠对其进行转棒耐受能力测试。将小鼠置于小鼠转棒仪上，转棒仪器开启后1.5min内转速从5rpm上升至40rpm并维持恒定。记录小鼠300s内从转棒上跌落的时间。实验表明经过免疫后的小鼠在转棒实验中耐受力较PBS组增强(结果如图11C所示)。
实施例26：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A12在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A12结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，从实验开始后8周开始，每隔两周取免疫组小鼠对其进行转棒耐受能力测试。将小鼠置于小鼠转棒仪上，转棒仪器开启后1.5min内转速从5rpm上升至40rpm并维持恒定。记录小鼠300s内从转棒上跌落的时间。实验表明经过免疫后的小鼠在转棒实验中耐受力较PBS组增强(结果如图11D所示)。
实施例27：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A5在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A5结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，于实验开始后10周进行筑巢实验。将每只小鼠转于新换的灭菌鼠盒中，均匀铺开新灭菌垫料至厚度0.8cm/盒，并在每个鼠盒右侧中心放置两块5cm×5cm的棉花两片，棉花总重1.2g-1.3g。将小鼠于16：00转入鼠盒并关闭室内照明，于次日7：00开启照明并于8：00对小鼠筑巢效果进行评分。隐藏小鼠编号标签并由3名经过培训的操作员独立评分，三人评分的平均值表示一只小鼠在筑巢实验中的得分。
评分标准：1分，棉花未完全被撕扯开；2分，棉花被完全撕扯用于筑巢，巢口浅平；3分，棉花被完全撕扯开用于筑巢，但除露出饮水口等，还有其它部分有缺刻，或巢口上沿低于小鼠头部；4分，棉花被完全撕扯开用于筑巢，巢口高于小鼠头部，或巢穴立体无缺刻。
筑巢实验可反应小鼠意识的完整程度。实验表明经过免疫后的小鼠在筑巢实验中较PBS组表现明显变好(结果如图12A所示)。
实施例28：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3C偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，于实验开始后10周进行筑巢实验。实验方法同实施例27。实验表明经过免疫后的小鼠在筑巢实验中较PBS组表现明显变好(结果如图12B所示)。
实施例29：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A11在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A11结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，于实验开始后10周进行筑巢实验。实验方法同实施例27。实验表明经过免疫后的小鼠在筑巢实验中较PBS组表现变好(结果如图12C所示)。
实施例30：与诺如病毒P蛋白偶联的磷酸化多肽抗原A12在P301S转基因小鼠中免疫后的行为学评价
用与PP-3K偶联的磷酸化多肽抗原A12结合AS02+CpG佐剂免疫P301S转基因小鼠后，于实验开始后10周进行筑巢实验。实验方法同实施例27。实验表明经过免疫后的小鼠在筑巢实验中较PBS组表现变好(结果如图12D所示)。
实施例31：pET28a-C-PA质粒的构建
通过序列优化和基因合成(吉尔生物)获得含有C-PA的质粒。
通过PCR的方法将C-PA基因富集，其基因序列如SEQ ID NO:1363所示，具体实施方案如下：
SEQ ID NO:1365(正向)：TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTGGTGGTGGTTCTTGCGGCGGCG
SEQ ID NO:1366(反向)：GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTAATACGCAGATACTGGCCAATCA，
对含有C-PA的质粒进行PCR反应，其PCR反应体系为KOD-Plus DNA聚合酶体系(购自TOYOBO公司)，反应体系总体积为50μL(缓冲液5μL，dNTP 0.2mM，硫酸镁1mM，上下游引物各0.3μM，模板DNA 50ng，KOD酶1μL，加水补充至终体积50μL)。按照反应体系说明书进行PCR，获得50μL PCR产物。对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对目的片段进行回收。
取2μg pET28a载体质粒(购自Novagen公司)，加入BamH I酶和Xho I酶(购自Takara公司)各1μL，并加入5μL酶切缓冲液(购自Takara公司)，最后向体系中加入无菌水使终体积为50μL，37℃，酶切2小时，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自天根生化技术有限公司)对载体片段进行回收，得到线性质粒载体。
取上述双酶切后的载体片段和目的片段(摩尔比为1:3，总体积5μL)，混合，加入5μL的同源重组mix(购自中美泰和公司)，25℃连接15min，取10μL连接产物加入DH10B感受态细胞中(购自中美泰和公司)，冰上放置30min后42℃热击30s，冰上放置2min，而后将其加入600μL无抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm复苏1h。将菌液平铺于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养板上，37℃倒置培养过夜。得到重组克隆，测序验证序列正确，其序列如SEQ ID NO.1363所示。得到具有能够表达C-PA蛋白的pET28a-C-PA质粒，如图15A所示。
实施例32：C-PA蛋白的表达与纯化
32.1 C-PA蛋白的表达
分别取上述实施例中制成的重组质粒1μL加入100μL大肠杆菌BL21感受态细胞(购自TransGen公司)中，冰浴30min，然后在42℃水浴中，热激90s后，冰浴2min。向混合物中加入LB培养基600μL，180rpm/min，37℃培养1h。将混合物均匀涂布在含有卡那霉素(15μg/mL)抗性的LB固体培养基上，37℃培养24小时，即可获得可以稳定表达重组蛋白的菌株。挑取生长的菌落接种在20mL LB培养基中，37℃，220rpm培养，并在培养混合物的OD值达到2.0时，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度1.0mmol/L)进行诱导，37℃，220rpm诱导6h。诱导完成后，将菌液以4000rpm离心20min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，再次以4000rpm离心20min，弃上清，得到含有目的蛋白的菌体的沉淀。
32.2 C-PA蛋白的纯化
向32.1获得的菌体沉淀中加入20mL蛋白缓冲液(PH＝7.0，含50mM Tris，300mMKCl)重悬，在冰上将菌体超声30min破碎菌体，将混合物以12000rpm，4℃离心30min，弃上清。收集沉淀用8M尿素缓冲液((PH＝7.0，含50mM Tris，300mM KCl，8M尿素)重悬，4℃搅拌过夜。收集溶液16000rpm，4℃离心30min，收集上清，转入截留尺寸为10kd的透析袋中，以甘氨酸透析液体积：蛋白溶液体积＝10：1比例透析，每4小时换液，透析6次使蛋白缓慢复性。收集蛋白液超滤浓缩至蛋白浓度至1.0mg/mL～2.0mg/mL。SDS-PAGE蛋白电泳结果如图15B所示，蛋白分子量在24kd左右。
实施例33：磷酸化多肽抗原疫苗与BLP的偶联反应
实施例33.1 C-PA与BLP的连接反应
BLP制备方法如中国专利申请CN 105968213所述。取15mg/mLBLP溶液1mL，5000g 4℃离心30min，弃上清；以5mL C-PA溶液重悬BLP，25℃缓慢震荡30min，制备C-PA-BLP。5000g4℃离心30min，弃上清，以10mL无菌PBS(pH＝7.2)重悬。重复4次。以1mL PBS重悬洗涤后的沉淀，检测OD600，以BLP标准品标定C-PA-BLP浓度。
实施例33.2 C-PA与BLP的连接反应
BLP制备方法如中国专利申请CN 105968213所述。取15mg/mLBLP溶液1mL，5000g 4℃离心30min，弃上清；以3mL C-PA溶液重悬BLP，4℃缓慢震荡6h，制备C-PA-BLP。5000g 4℃离心30min，弃上清，以10mL无菌PBS(pH＝7.2)重悬。重复4次。以1mL PBS重悬洗涤后的沉淀，检测OD600，以BLP标准品标定C-PA-BLP浓度。
实施例33.3磷酸化多肽抗原疫苗与C-PA-BLP的偶联反应
以0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝7.5)。对实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗磷酸化多肽溶解至1mg/mL进行定量。按照C-PA蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：30比例将多肽溶液缓慢加入到C-PA-BLP离心后的沉淀中，缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经离心，以PBS重悬除掉未结合的多肽。
实施例33.4磷酸化多肽抗原疫苗与C-PA-BLP的偶联反应
以0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝8.0)。对实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗磷酸化多肽溶解至2mg/mL进行定量。按照C-PA蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：100比例将多肽溶液缓慢加入到C-PA-BLP离心后的沉淀中，缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经离心，以PBS重悬除掉未结合的多肽。
实施例33.5磷酸化多肽抗原疫苗与C-PA-BLP的偶联反应
以0.1M碳酸氢铵溶液(pH＝8.0)。对实施例1中所制备的各冻干形式的磷酸化多肽抗原疫苗磷酸化多肽溶解至2mg/mL进行定量。按照C-PA蛋白摩尔量：多肽摩尔量＝1：100比例将多肽溶液缓慢加入到C-PA-BLP离心后的沉淀中，缓慢混合。混合体系于2-8℃中缓慢震荡孵育48小时。将得到的产物经离心，以PBS重悬除掉未结合的多肽。
实施例34：与BLP偶联的磷酸化多肽抗原产物连接效率的测定
向与C-PA-BLP偶联的磷酸化多肽抗原产物中以体积比为1：1加入10mM二硫苏糖醇溶液，均匀混合后室温静置，反应16小时。将反应产物16000g，4℃离心15min。取上清进行HPLC的测定。以0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL、0.03125mg/mL、0.015625mg/mL的10mM二硫苏糖醇溶液溶解的磷酸化多肽作为标准品，以标准品浓度对磷酸化多肽出峰面积作标准曲线，对待测样品浓度进行定量分析(结果如图13A、图13C和图13D所示)。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表：

Claims (21)

1.一种磷酸化多肽抗原疫苗，其包含来自人全长Tau蛋白的至少两个多肽片段或其保守性修饰变体，其中所述多肽片段或其保守性修饰变体含有磷酸化位点；优选地，其在C’末端处具有额外的半胱氨酸残基。
2.权利要求1的磷酸化多肽抗原疫苗，其中所述多肽片段通过肽键直接相连或通过氨基酸接头相连；优选地，所述多肽片段通过肽键直接相连。
3.权利要求1的磷酸化多肽抗原疫苗，其中所述多肽片段来自人全长Tau蛋白的富含磷酸化修饰位点的区域；优选地，所述多肽片段来自人全长Tau蛋白的如下区域：人全长Tau蛋白的第14-22位氨基酸、人全长Tau蛋白的第194-266位氨基酸和/或人全长Tau蛋白的第392-408位氨基酸。
4.权利要求3的磷酸化多肽抗原疫苗，其中所述磷酸化位点包括在对应于人全长Tau蛋白的氨基酸序列的第18、202、205、212、214、231、235、238、262、396和404位发生磷酸化的氨基酸位点，即，18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个，优选全部位点；更优选地，所述磷酸化位点中的1至4个、优选1至3个、更优选1至2个、最优选1个Ser位点被天冬氨酸置换和/或所述磷酸化位点中的的1至4个、优选1至3个、更优选1至2个、最优选1个Thr位点被谷氨酸置换。
5.权利要求1的磷酸化多肽抗原疫苗，其中所述多肽片段的保守性修饰变体为该多肽片段的一个或多个氨基酸、优选1至10个氨基酸、更优选1至6个氨基酸、更优选1至4个氨基酸、更优选1至3个氨基酸、最优选1个氨基酸被其功能上相似的氨基酸保守性置换所得的变体。
6.权利要求1-5中任一项的磷酸化多肽抗原疫苗，其具有SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.1331中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点；优选地，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.1331中任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；更优选地，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有SEQ ID NO.201、SEQ ID NO.225、SEQ IDNO.306、SEQ ID NO.387、SEQ ID NO.468、SEQ ID NO.558、SEQ ID NO.567、SEQ ID NO.769、SEQ ID NO.784、SEQ ID NO.875、SEQ ID NO.1020、SEQ ID NO.1101、SEQ ID NO.1182、SEQID NO.1272、SEQ ID NO.1313和SEQ ID NO.1330中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列包含选自18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)和404(P-Ser404)中的两个或更多个的磷酸化位点；最优选地，所述磷酸化多肽抗原疫苗具有SEQID NO.201、SEQ ID NO.225、SEQ ID NO.306、SEQ ID NO.387、SEQ ID NO.468、SEQ IDNO.558、SEQ ID NO.567、SEQ ID NO.769、SEQ ID NO.784、SEQ ID NO.875、SEQ IDNO.1020、SEQ ID NO.1101、SEQ ID NO.1182、SEQ ID NO.1272、SEQ ID NO.1313和SEQ IDNO.1330中任一个所示的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列分别具有如下的磷酸化位点：18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)；18(P-Tyr18)、202(P-Ser202)、205(P-Thr205)；18(P-Tyr18)、212(P-Thr212)、214(P-Ser214)；18(P-Tyr18)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；18(P-Tyr18)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；18(P-Tyr18)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；202(P-Ser202)、205(P-Thr205)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、231(P-Thr231)、235(P-Ser235)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、238(P-Ser238)、262(P-Ser262)；212(P-Thr212)、214(P-Ser214)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)；238(P-Ser238)、262(P-Ser262)、396(P-Ser396)、404(P-Ser404)。
7.一种复合物疫苗，其由权利要求1-6中任一项的磷酸化多肽抗原疫苗与载体偶联形成。
8.权利要求7的复合物疫苗，其中所述载体选自人血清白蛋白、钥孔蓝蛋白素、细菌样颗粒(BLP)、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白组分V、流感血球凝集素、PAN-DR结合肽(PADRE多肽)、疟疾环子孢子(CS)蛋白、乙型肝炎表面抗原(HBSAg19-28)、热休克蛋白(HSP)65、卡介苗(BCG)、霍乱毒素、减毒的霍乱毒素变体、白喉毒素、诺如病毒衣壳P蛋白、重组链球菌C5a肽酶、化脓链球菌ORF1224、化脓链球菌ORF1664、化脓链球菌ORF2452、肺炎链球菌溶血素、减毒的肺炎链球菌溶血素变体、肺炎衣原体ORFT367、肺炎衣原体ORFT858、破伤风类毒素、HIV gp120T1、识别微生物表面粘附基质分子的组分(MSCRAMMS)、生长因子/激素和/或趋化因子；；优选地，所述载体为细菌样颗粒(BLP)；优选地，所述载体为诺如病毒衣壳P蛋白；更优选地，所述诺如病毒衣壳P蛋白为PP-3C，其序列如SEQ ID NO.1357所示，或PP-3K，其序列如SEQ ID NO.1359所示。
9.制备权利要求7的复合物疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
1)人工合成权利要求1-6中任一项的的磷酸化多肽抗原疫苗；
2)制备待与所述磷酸化多肽抗原疫苗偶联的载体；
3)将所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体混合以进行偶联反应；
4)分离纯化3)中所得的偶联体，由此获得复合物疫苗。
10.权利要求9的方法，其中步骤2)中的载体为诺如病毒衣壳P蛋白，优选为PP-3C或PP-3K，具体包括以下步骤：
i)获得含有编码PP-3C或PP-3K蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入受体细胞；
iii)表达所述PP-3C或PP-3K蛋白并在受体细胞中自组装成重组P颗粒，
优选地，还包括分离和纯化步骤；更优选地，使用离子交换色谱法和/或疏水层析色谱法进行纯化。
11.权利要求9的方法，其中步骤3)采用PP-3C作为疫苗载体进行偶联，优选的缓冲体系为碳酸氢铵缓冲体系，优选的pH范围为7.5-8.8；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～10℃；或步骤3)采用PP-3K作为疫苗载体进行偶联，优选的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系，优选的pH范围为7.0～8.5；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述载体以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～25℃。
12.权利要求9的方法，其中步骤2)中的载体为细菌样颗粒(BLP)，并且步骤3)具体包括i)获得纯化的蛋白连接器C-PA蛋白，其序列如SEQ ID NO:1364所示；ii)将步骤2)中获得的载体细菌样颗粒BLP与C-PA蛋白连接以获得C-PA-BLP；iii)将C-PA-BLP与所述磷酸化多肽抗原疫苗进行偶联反应；其中缓冲体系为Tris缓冲体系，优选的pH范围为7.2～8.8；优选的C-PA蛋白浓度为0.1mg/mL～1.5mg/mL，优选的反应温度范围为2～30℃；或者其中缓冲体系为碳酸氢铵缓冲体系，优选的pH范围为7.5～8.8；优选所述磷酸化多肽抗原疫苗与所述C-PA-BLP以10:1-100:1比例进行混合，优选的反应温度范围为2～10℃。
13.权利要求9至12中任一项的方法，其中步骤4)包括通过脱盐层析、透析和超滤等方法除去未成功连接的偶联剂和多肽抗原。
14.一种疫苗组合物，其包含权利要求1至6中任一项的磷酸化多肽抗原疫苗或权利要求7或8的复合物疫苗；优选地，所述疫苗组合物还包含可药用的佐剂；更优选地，所述可药用的佐剂选自CpG、MF59、AS02、AS03、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂中的一种或多种。
15.权利要求1至6中任一项的磷酸化多肽抗原疫苗或权利要求7或8的复合物疫苗或权利要求14的疫苗组合物用于制备预防和/或治疗神经变性障碍疾病的药物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述神经变性障碍疾病选自AD、克-雅综合症、拳击员痴呆、唐氏综合症、格-施-沙病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病和外伤性脑损伤、肌萎性缩侧索硬化/帕金森综合症-痴呆综合症、嗜银颗粒性痴呆、皮层基底节(corticobasal)变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体连锁额颞痴呆伴帕金森综合症、哈-施病(Hallevorden-Spatz disease)、多系统性萎缩、C型尼-皮病、皮克病、进行性皮下神经胶质增生和进行性核上性全脑炎中的一种或多种，优选为AD；优选地，所述疫苗或疫苗组合物优选通过皮下或腹腔或肌肉途径、更优选通过肌肉途径进行免疫。
17.权利要求1至6中任一项的磷酸化多肽抗原疫苗或权利要求7或8的复合物疫苗或权利要求14的疫苗组合物用于制备保持或改善、优选恢复、更优选完全恢复哺乳动物、尤其是人的认知记忆力的药物的用途。
18.一种诺如病毒衣壳P蛋白，其序列如SEQ ID NO.1357或SEQ ID NO.1359所示。
19.一种制备权利要求18的诺如病毒衣壳P蛋白的方法，包括以下步骤：
i)获得含有编码PP-3C或PP-3K蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入受体细胞；
iii)表达所述PP-3C或PP-3K蛋白并在受体细胞中自组装成重组P颗粒，
优选地，还包括分离和纯化步骤；更优选地，可使用离子交换色谱法和/或疏水层析色谱法进行纯化。
20.一种连接器蛋白，其序列如SEQ ID NO.1364所示。
21.一种制备权利要求20的连接器蛋白的方法，包括以下步骤：
i)获得含有序列如SEQ ID NO.1363所示的编码C-PA蛋白的核酸的表达载体；
ii)将所述表达载体转入宿主细胞；
iii)表达所述C-PA蛋白并分离纯化由此获得所述C-PA蛋白。
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