CN113150085A - 抗SARS-CoV-2感染的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗SARS‑CoV‑2感染的组合物，属于医药领域。本发明提供了抗SARS‑CoV‑2感染的组合物，由S1‑WT蛋白和S1‑Mut蛋白组成，其中，S1‑WT蛋白含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；S1‑Mut蛋白含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID No.2的基础上含有以下至少一种突变：K417N、N501Y、D614G。本发明提供的由S1‑WT蛋白和S1‑Mut蛋白组成的组合物，能够诱导产生SARS‑CoV‑2变异株和野生型病毒的中和抗体，对开发二价重组疫苗的潜在临床应用具有重要意义。

Description

抗SARS-CoV-2感染的组合物
技术领域
本发明涉及抗SARS-CoV-2感染的组合物，属于医药领域。
背景技术
被报道的SARS-CoV-2的主要突变株，包括B.1.1.7、B.1.351(也称为501Y.V2 或20H)和B.1.1.248(也称为P.1)。英国主要爆发的B.1.1.7变异株对某些单克 隆抗体有抗药性。特别是，B.1.351变异体是南非的一种显性变异体，由南非 B.1.351SARS-CoV-2感染或疫苗接种引起的抗体中和活性降低，传染性增加。 更重要的是，在南非的临床研究中，Novavax NVX-CoV2373亚单位疫苗的疗效 从89.3％下降到49.4％。ChAdOx1黑猩猩腺病毒载体疫苗(AZD1222)对B.1.351 的疗效仅为10.4％。因此，研制一种对SARS-CoV-2野生型和变异株均有效的通 用型冠状病毒疫苗，以阻止B.1.351的流行已迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目 的在于提供抗SARS-CoV-2感染的组合物。
本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的组合物，由S1-WT蛋白和S1-Mut蛋 白组成，其中，S1-WT蛋白含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；S1-Mut蛋 白含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID No.2的基础上含有以 下至少一种突变：K417N、N501Y、D614G。
本发明中表示突变位点的序号是根据野生型进行编号的。比如，K417N突 变表示相对于野生型S1蛋白上第417位氨基酸由K突变为N；N501Y突变表 示相对于野生型S1蛋白上第501位氨基酸由N突变为Y；D614G突变表示相 对于野生型S1蛋白上第614位氨基酸由D突变为G。另外，本发明中有的氨基 酸序列还涉及到E484K突变，表示相对于野生型S1蛋白上第484位氨基酸由E 突变为K。
进一步地，S1-Mut蛋白含有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
进一步地，S1-WT蛋白和/或S1-Mut蛋白上还含有蛋白标签序列。
优选地，所述的蛋白标签为组氨酸标签。
进一步优选地，所述的蛋白标签序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，S1-WT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.5所示。
进一步地，S1-Mut蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示。
进一步地，S1-WT蛋白：S1-Mut蛋白的质量比为(2.5～7.5)：(2.5～7.5)。
优选地，S1-WT蛋白：S1-Mut蛋白的质量比为5：5。
本发明提供了所述的组合物在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物 中的用途。
优选地，所述的感染为SARS-CoV-2野生型和/或变异株引起的感染。
进一步优选地，所述的变异株选自B.1.1.7、B.1.351、P.1中至少一种。
本发明提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，含有所述的组合物， 以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。
优选地，所述的免疫佐剂为AS免疫佐剂。
进一步优选地，所述的免疫佐剂为AS03。
进一步地，所述的疫苗为注射制剂。
优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。
SEQ ID No.1(aa：Val16-Arg685)
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAI HVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVN NATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS QPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPL QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIT PGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
SEQ ID No.2(E484K)
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAI HVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVN NATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS QPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPL QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIT PGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
SEQ ID No.3(K417N，E484K，N501Y，D614G)
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAI HVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVN NATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS QPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPL QSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIT PGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
SEQ ID No.4
HHHHHHHHHH
SEQ ID No.5
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAI HVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVN NATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS QPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPL QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIT PGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARAHHHHHHHHHH
SEQ ID No.6
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAI HVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVN NATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVS QPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKY NENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITN LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPL QSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFN GLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVIT PGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLI GAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARAHHHHHHHHHH
本发明提供的由S1-WT蛋白和S1-Mut蛋白组成的组合物，能够诱导产生 SARS-CoV-2变异株和野生型病毒的中和抗体，对开发二价重组疫苗的潜在临床 应用具有重要意义。
附图说明
图1为SARS-CoV-2野生型、变异株的结构以及小鼠免疫接种示意图；
图2为实施例1中小鼠产生RBD和S1特异性抗体结果图；
图3为实施例2中免疫小鼠血清阻断RBD与hACE2受体结合结果图；
图4为实施例3中免疫小鼠血清阻断SARS-CoV-2EGFP假病毒感染 293T/ACE2细胞结果图；
图5为实施例3中免疫小鼠血清阻断表达SARS-CoV-2荧光素酶的假病毒 感染结果图；
图6为实施例4中用二价疫苗免疫小鼠的血清阻断表达SARS-CoV-2荧光 素酶的假病毒感染结果图；
图7为实施例5中二价疫苗在小鼠体内的安全性评价结果图。
具体实施方式
本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的组合物，由S1-WT蛋白和S1-Mut蛋 白组成，其中，S1-WT蛋白含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，S1-Mut蛋 白含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID No.2的基础上含有以 下至少一种突变：K417N、N501Y、D614G。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人对SARS-CoV-2和 B.1.351的重组疫苗进行了观察。小鼠免疫后，S1-WT蛋白引起RBD-WT特异 性IgG反应，S1-Mut蛋白引起RBD-Mut和S1-Mut-IgG抗体反应，均引起S1-WT 特异性IgG反应。重组S1-WT诱导的中和抗体对RBD-WT有较强的阻断作用， S1-Mut蛋白诱导的中和抗体对RBD(E484K)和RBD-Mut有较强的阻断作用。 与S1-WT组相比，S1-Mut免疫小鼠血清对B.1.351假病毒的抑制作用更强。此外，令人兴奋的是，发明人发现用S1-Mut免疫的小鼠血清降低了ACE2与E484K 突变的RBD之间的亲和力，S1-Mut重组蛋白对含有E484K突变的B.1.351和 P.1假病毒产生了强烈的保护性免疫。然而，S1-Mut重组疫苗对先前的 SARS-CoV-2株RBD无突变株的保护作用较差。这些结果表明，单价重组蛋白 疫苗对少数菌株具有较强的保护性免疫作用，但对其他菌株的保护作用有限。 基于这些结果，本发明将S1-WT和S1-Mut蛋白结合形成一种二价疫苗，该二价疫苗对SARS-CoV-2的野生型和变异型都具有交叉保护作用，这可能是开发 SARS-CoV-2野生型和变异株通用疫苗的一个有希望的策略。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解， 下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未 注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产 品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的 常规产品。
细胞培养：293T细胞购自美国型培养物保藏中心(ATCC)。在发明人实验 室产生的稳定高表达ACE的293T细胞(293T/ACE2)。将细胞保存在Dulbecco 改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco，USA)中，培养基中含有10％胎牛血清 (FBS，PAN Biotech，德国)，0.1mg/mL链霉素和100U青霉素，在37℃和 5％的二氧化碳的环境中保存。
RBD蛋白的表达与纯化：如发明人先前报道的，杆状病毒昆虫细胞表达系 统被用于产生野生型RBD(RBD-WT)。简言之，通过基因重组技术将 GP67-Trx-His-EK-RBD转入pFastBac1载体，然后用脂质昆虫转染试剂(Beyotime Biotechnology)将bacmid转染昆虫Sf9细胞。GP67信号肽序列被用来保证蛋白 质的有效分泌，昆虫硫氧还蛋白(TRX)帮助蛋白质正确折叠，提高抗原结构 的稳定性。72小时后，收集含有包装好的重组杆状病毒的上清液，然后将杆状 病毒在Sf9中传代三次以产生蛋白质。对于蛋白质纯化，收集的上清液通过5-ml HisTrap excel柱，在Superdex 200Increase 10/300GL柱上进一步纯化，并交换 到由20mM Tris-HCL和150mM NaCl组成的缓冲液中。用重组RBD蛋白检测 特异性抗体。
以下实施例中使用的S1-WT蛋白和S1-Mut蛋白均购买自义翘神州，S1-WT 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，货号：40591-V08H；S1-Mut蛋白的氨 基酸序列如SEQ IDNo.6所示，货号：40591-V08H10。SEQ ID No.5、SEQ ID No.6 末端的组氨酸标签在蛋白纯化时起识别作用。
S1-WT蛋白(aa:16-685)、S1-Mut蛋白(K417N，E484K，N501Y，D614G， aa:16-685)、RBD-WT蛋白(aa:319-541)、RBD蛋白(K417N，aa:319-541)、 RBD蛋白(E484K，aa:319-541)、RBD蛋白(N501Y，aa:319-541)和RBD-Mut 蛋白(K417N，E484K，N501Y，aa:319-541)及其His片段，所有重组蛋白均 购自义翘神州生物。重组蛋白S1-WT、S1-Mut、RBD-WT、RBD(K417N)、RBD (E484K)、RBD(N501Y)和RBD-Mut的纯度分别大于90％、90％、95％、87％、 90％、95％和90％。用鲎试剂法测定，重组蛋白的内毒素含量低于1.0EU/蛋白。
将S1-WT或S1-Mut蛋白与等体积的AddaS03佐剂(AS03，InvivoGen，法 国)混合制成乳油混合物，制备重组蛋白疫苗。以S1-WT蛋白、S1-Mut蛋白和 等体积的AS03佐剂制备二价疫苗，其中S1-WT蛋白：S1-Mut蛋白的质量比为 5：5。
从HFK生物科学公司(中国北京)购买6-8周龄具有ICR背景的雌性转基 因hACE2小鼠用于免疫。分别于第0、14和28天连续肌注PBS、S1-WT疫苗、 S1-Mut疫苗和二价疫苗免疫hACE2小鼠。第35天经眼窝静脉采血，6000转/ 分离心分离血清10min，-20℃保存后使用。所有动物实验均获得四川大学(中 国四川省成都市)动物保护与使用委员会的批准。
统计分析：使用Prism软件(GraphPad Prism 8.0)进行统计分析。两组间的 比较采用非配对t-检验。多组间的比较采用单因素方差分析，然后采用Tukey 的多重比较事后检验。P<0.05为显著性。
实施例1 S1-WT和S1-Mut两种刺突蛋白诱导的抗体应答
为确定两种刺突蛋白诱导的抗体应答，分别于第0、14、28天用S1-WT或 S1-Mut蛋白肌肉接种具有ICR背景的hACE2小鼠。每次免疫前和最后一次给 药后7天采集血清样本，如图1所示。以RBD-WT、RBD-Mut(K417N、E484K、 N501Y)、S1-WT和S1-Mut蛋白为包被抗原进行抗体检测。特异性抗体的测定 方法如下：平底96孔高结合板(NUNC MaxiSorp，ThermoFisher Scientific)涂 有1μg/ml抗原(S1-WT、S1-Mut、RBD-WT和RBD-Mut)，每孔在4℃存放一 夜。每孔用含0.1％吐温(PBST)的PBS洗涤3次，室温下用1％BSA溶液封闭 1h。将系列稀释的小鼠血清加入孔中，并在37℃培养皿℃放置1h后，用PBST 清洗三次。在室温下向每个孔中加入稀释的抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)抗 体(美国南方生物技术公司)。孵育1小时后，用200μl洗涤5次后，以3,3'， 5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)为底物进行了显色。用1.0MH2SO4按50μl/孔终 止反应，并在微孔板读取器上通过450nm测量吸光度。
结果如图2所示(*P<0.05，**P<0.01)，观察到在S1-WT免疫的小鼠中， 较高的RBD-WT特异性IgG抗体(图2a)，而S1-Mut蛋白诱导则产生针对 RBD-Mut和S1-Mut的更强IgG抗体应答，并且两者均引发强烈的S1-WT特异 性IgG应答(图2c)。S1-WT组血清RBD-WT和RBD-Mut特异性抗体的几何 平均滴度(GMT)分别为8647527和1080871。S1-Mut组RBD-WT和RBD-Mut的GMT分别为1882027和2852620(图2b)。两组血清中S1-WT IgG抗体的 GMT具有可比性，但S1-Mut组(1080941)血清中S1-Mut特异性抗体的GMT 远高于S1-WT组(270235)(图2d)。这些结果表明，S1-WT蛋白可以诱导更强 的野生型S1和RBD特异性抗体应答，S1-Mut蛋白可以作为突变型S1和RBD 特异性抗体应答的较好免疫原。
实施例2重组蛋白疫苗诱导抗体降低RBD与ACE2的亲和力
RBD-WT和RBD-Mut(K417N，E484K，N501Y)蛋白用于结合细胞表面 受体ACE2。将0.3μg/ml的RBD-Fc、RBD(K417N)-His、RBD(E484K)-His、 RBD(N501Y)-His或RBD(K417N、E484K、N501Y)-His(RBD Mut)蛋白 添加到293T/ACE2细胞中，血清中可加入或不加入一系列稀释的小鼠血清。室 温孵育30min后，用PBS洗涤细胞三次，于4℃用FITC标记的抗人IgG Fc或APC标记的抗组蛋白二抗(BioLegend，USA)染色持续30分钟。用新生细胞 流式细胞仪(ACEA-Biosciences)检测结合试验，并用FlowJoV软件进行分析。
在无免疫的情况下，血清中有80.5％的293T/ACE2细胞与RBD-Mut结合， 作为阳性对照。PBS免疫小鼠的血清无抑制活性，293T/ACE2细胞RBD-Mut 阳性率达77.36％以上。与S1-Mut免疫小鼠的血清孵育后，阳性率仅为18.5％。 相比之下，54.6％的293T/ACE2细胞在S1-WT组血清的存在下呈RBD-Mut阳 性(图3a)。对于RBD-WT蛋白与ACE2结合的测定，接种S1-WT的小鼠血清 显示出比S1-Mut组更强的阻断作用(图3b)。为了找出哪一个突变可以引起这 种现象，本实验使用了三种突变的RBD蛋白，包括RBD(K417N)、RBD(E484K) 和RBD(N501Y)。两组之间阻断RBD(K417N)和RBD(N501Y)的能力没 有显著差异(图3c、图3e)。有趣的是，S1-Mut组的血清显示出比S1-WT组更 好的抑制RBD(E484K)的能力(图3d)。这些结果表明，免疫S1-WT和S1-Mut 蛋白分别对RBD-WT和RBD-Mut有较强的阻断作用，提示E484K突变在S1-WT 的抗性中起重要作用。图3中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
实施例3突变型或野生型假病毒对S1-WT或S1-Mut免疫小鼠血清中和的敏 感性
假病毒的制备：表达SARS-CoV-2荧光素酶的假病毒的野生型和变异体购 自Genomeditech(中国)。在中和试验中，D614G、N501Y或E484K代表单一 突变的假病毒。B.1.1.7、B.1.351和P.1假病毒的突变位点与图1a中的描述一致。 荧光素酶系统试剂由细胞裂解液和底物组成，来自美国Promega公司。表达EGFP 的SARS-CoV-2野生型和B.1.351假病毒如前所述。在转染前，293T细胞以约 1×106的细胞密度预先接种。SARS-CoV-2假病毒系统由3种质粒组成，包括表 达HIV-1基因组的EGFP(pLenti-EGFP载体)、psPAX2和编码密码子优化的 SARS-CoV-2野生型S蛋白或B.1.351突变蛋白的质粒，3种质粒的最佳比例为8:3:1。所有有45μg转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)的质粒加入700μL opti MEM， 室温下孵育15分钟。将混合物加入293T细胞培养6小时。然后用新鲜培养基 代替上清液。转染后48h和72h取培养上清中的假病毒，用低速离心法分离培 养上清，在-80℃下保存。
假病毒中和试验：293T/ACE2细胞预先接种在96孔板中，密度为1×104个 细胞/每孔，生长一夜。将表达荧光素酶的假病毒(D614G，B.1.1.7，B.1.351， P.1，N501Y，E484K)分别与连续稀释的免疫血清在96孔板中37℃预培养1h°。 然后将混合物加入293T/ACE2细胞中，然后培养48小时以表达报告基因。用萤 火虫荧光素酶法测定病毒进入的效率。简而言之，去除感染细胞的上清。然后 加50μL PBS，50μL荧光素酶试剂盒中的裂解试剂和荧光素酶底物(Promega)。 用多模微孔板读取器(perkineller)检测相对光强。
对有无突变(WT，B.1.351)的表达EGFP的假病毒进行中和试验，方法同 上，用荧光显微镜和流式细胞仪测定EGFP阳性细胞数。
为验证免疫血清的中和能力是否受到变异假病毒的影响，本实验使用了两 种表达EGFP的假病毒，即野生型和B.1.351，它是世界上最流行的SARS-CoV-2 突变株之一。结果观察到，当野生型假病毒以1:2430稀释度与S1-WT免疫小鼠 的免疫血清孵育时，表达EGFP的细胞数量急剧减少，但在相同稀释度的S1-Mut 组中，这种阻断作用消失(图4a)。相比之下，S1-WT组的血清在1:7290稀释 度下几乎丧失对B.1.351假病毒的抑制能力，而S1-Mut组的血清在相同稀释度 下的抑制率超过50％(图4b)。图4中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， ****P<0.0001。
为了进一步研究这两种突变体蛋白对其他突变体假病毒的中和作用，本实 验使用了野生型、D614G、B.1.1.7、B.1.351和P.1假病毒。结果观察到S1-WT 免疫小鼠血清对野生型D614G、B.1.1.7假病毒的保护作用无明显变化(图5a- 图5c)，但对B.1.351和P.1的保护作用显著降低(图5d-图5e)。用S1-Mut蛋白 免疫的小鼠血清对B.1.351和P.1有较好的保护作用(图5d-图5e)，但对野生型 和B.1.1.7的保护作用确实降低(图5d)。为了了解导致观察到的变化的特异性 突变，本实验测试了S1-WT和S1-Mut组的血清，以对抗仅包含在B.1.1.7、B.1.351 和P.1中发现的单一突变位点的假病毒。免疫S1-WT或S1-Mut蛋白的小鼠血清 对N501Y假病毒的保护作用无显著差异(图5f)。S1-WT组血清对E484K突变 的假病毒的中和作用减弱。然而，S1-Mut蛋白对E484K假病毒有较强的中和作 用(图5g)。这些结果表明，S1-Mut蛋白可以诱导较强的保护性免疫，阻断突 变病毒E484K，如B.1.351和P.1。图5中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， ****P<0.0001。
实施例4本发明二价疫苗对各种假病毒表现出良好的中和特性
为验证S1-WT和S1-Mut两种刺突蛋白的联合免疫对SARS-CoV-2的野生 株和突变株是否都能够发挥很强的保护作用，本实验使用AS03作为佐剂，用 S1-WT蛋白(每只小鼠10μg)、S1-Mut蛋白(每只小鼠10μg)、二价疫苗(每 只小鼠5μg S1-WT和5μg S1-Mut蛋白)免疫ICR-hACE2小鼠。免疫和取样的 时间表与图1b所述相同。结果如图6所示(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， ****P<0.0001)：与S1-Mut疫苗相比，二价疫苗诱导的针对WT和B.1.1.7假病 毒的中和滴度更高，但与S1-WT疫苗相比，中和滴度没有显著差异(图6a，图 6d)。此外，与S1-WT免疫相比，二价疫苗对B.1.351和P.1的保护作用显著增 强。这些结果表明，二价疫苗对野生型和B.1.351假病毒，甚至对其他变种表现 出良好的中和作用。
实施例5本发明二价疫苗的安全性评价
首次免疫后42天处死小鼠进行组织处理。取肺、心、肝、肾、脾等重要脏 器，用10％磷酸盐缓冲福尔马林固定7d，石蜡包埋，后进行切片，切片厚度为 3μm。切片用苏木精和伊红(H&E)染色以评估病理学和器官损伤。用直立显 微镜(Nikon)扫描染色切片。
结果如图7所示，显示了PBS、AS03和二价疫苗组的外周血计数(a)和 生化指标(b)，以及免疫小鼠各器官病理H&E染色(c，放大200倍)。PBS、 AS03和二价疫苗组在体重、皮褶、行为改变和食欲方面无显著性差异。外周血 细胞计数及ASTL、ALTL等生化指标差异无明显变化(图7a、图7b)。此外， PBS、AS03和二价疫苗组的心、肝、脾、肺、肾组织均无病理改变(图7c)。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在 任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本 领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进 行结合和组合。
序列表
<110> 成都威斯克生物医药有限公司
<120> 抗SARS-CoV-2感染的组合物
<130> A210266K
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala His
660 665 670
His His His His His His His His His
675 680
<210> 6
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala His
660 665 670
His His His His His His His His His
675 680

Claims (10)

1.抗SARS-CoV-2感染的组合物，其特征是：由S1-WT蛋白和S1-Mut蛋白组成，其中，S1-WT蛋白含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；S1-Mut蛋白含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID No.2的基础上含有以下至少一种突变：K417N、N501Y、D614G。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征是：S1-Mut蛋白含有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征是：S1-WT蛋白和/或S1-Mut蛋白上还含有蛋白标签序列；优选地，所述的蛋白标签为组氨酸标签；进一步优选地，所述的蛋白标签序列如SEQID No.4所示。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征是：S1-WT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.5所示。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征是：S1-Mut蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.6所示。
6.如权利要求1～5任意一项所述的组合物，其特征是：S1-WT蛋白：S1-Mut蛋白的质量比为(2.5～7.5)：(2.5～7.5)；优选地，S1-WT蛋白：S1-Mut蛋白的质量比为5：5。
7.权利要求1～6任意一项所述的组合物在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途；优选地，所述的感染为SARS-CoV-2野生型和/或变异株引起的感染；进一步优选地，所述的变异株选自B.1.1.7、B.1.351、P.1中至少一种。
8.预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，其特征是：含有权利要求1～6任意一项所述的组合物，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
9.如权利要求8所述的疫苗，其特征是：所述的辅助性成分为免疫佐剂；优选地，所述的免疫佐剂为AS免疫佐剂；进一步优选地，所述的免疫佐剂为AS03。
10.如权利要求8或9所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为注射制剂；优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。
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