CN114206946A - 冠状病毒疫苗组合物、方法及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明在一些方面涉及包括重组肽和蛋白质的免疫原性组合物，所述重组肽和蛋白质包含冠状病毒抗原和免疫原，例如冠状病毒S蛋白肽。在一些方面，所述免疫原性组合物包括分泌性融合蛋白，所述分泌性融合蛋白包括可溶性冠状病毒抗原，所述可溶性冠状病毒抗原通过框内融合连接到能够自三聚化的胶原的C‑末端部分以形成二硫键连接的三聚体融合蛋白。在一些方面，本文提供的免疫原性组合物可用于产生免疫应答，例如用于治疗或预防冠状病毒感染。在一些方面，本文提供的免疫原性组合物可用于疫苗组合物中，例如，作为预防性和/或治疗性疫苗的一部分。本文还提供用于产生重组肽和蛋白质的方法、预防、治疗和/或诊断方法以及相关试剂盒。

Description

冠状病毒疫苗组合物、方法及其使用
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月10日提交的PCT/CN2020/095269；2021年4月13日提交的PCT/CN2021/087066；以及2021年5月14日提交的PCT/CN2021/093895的国际专利申请的优先权和权益(benefit)，所述国际专利申请的公开内容出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
为ASCII文本文件的序列表的提交
以下提交的ASCII文本文件的内容以其全文形式被援引加入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：165762000143SEQLIST.TXT，记录日期：2021年6月9日，大小：575KB)。
技术领域
本公开内容在一些方面涉及用于治疗和/或预防冠状病毒感染的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括重组肽和蛋白质，所述重组肽和蛋白质包括冠状病毒抗原和免疫原，例如冠状病毒S蛋白肽。
背景技术
冠状病毒感染广泛范围的鸟类和哺乳动物，包括人类。冠状病毒可能每年在人体内传播，通常会引起轻微的呼吸系统疾病，尽管在婴幼儿、老年人和免疫功能低下的人群中严重程度更高。但是，某些冠状病毒，包括中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，具有高致病性。冠状病毒的高致病性、空气传播性、高病死率和模糊确定的流行病学使得迫切需要有效的疫苗和相关的治疗药剂。特别是，迫切需要能够迅速诱导针对SARS-CoV-2的有效免疫应答的疫苗。本发明提供了满足上述和其它需要的方法、用途和制品(article ofmanufacture)。
发明内容
在一些实施方案中，本文公开了包含多种重组多肽的蛋白质，每种重组多肽包括连接到胶原的C-末端前肽的冠状病毒表面抗原，其中重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。
在一些实施方案中，本文公开了重组亚单位疫苗，其包括来自冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的S蛋白或其片段的胞外域(例如，没有跨膜和细胞质结构域)，其在框内与能够形成二硫键连接的同源三聚体的胶原的C-前肽融合。由此产生的重组亚单位疫苗(例如S-三聚体)可以从转染的细胞中表达和纯化，并且预期为三聚体形式的天然构象。这解决了当病毒抗原以可溶性形式表达为重组肽或蛋白质而没有跨膜和/或细胞质结构域时经常遇到的病毒抗原错误折叠问题。这种错误折叠的病毒抗原不能忠实地保持天然的病毒抗原构象，并且常常不能产生中和抗体。
在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV-1)、SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、SARS样冠状病毒、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)、MERS样冠状病毒、NL63-CoV、229E-CoV、OC43-CoV、HKU1-CoV、WIV1-CoV、MHV、HKU9-CoV、PEDV-CoV或SDCV。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括冠状病毒刺突(S)蛋白或其片段或表位，其中表位可选地是线性表位或构象表位，并且其中蛋白质包括三种重组多肽。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括信号肽、S1亚单位肽、S2亚单位肽或其任意组合。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括信号肽、受体结合结构域(RBD)肽、受体结合基序(RBM)肽、融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)或七肽重复序列2(HR2)或其任意组合。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括S蛋白的受体结合结构域(RBD)。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括S蛋白的S1亚单位和S2亚单位。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以不含跨膜(TM)结构域肽和/或细胞质(CP)结构域肽。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以不含蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L，或者可以包含不可被蛋白酶裂解的突变的蛋白酶裂解位点。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以是可溶解的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。
在前述任一实施方案中，在蛋白质的重组多肽中表面抗原可以相同或不同。
在前述任一实施方案中，表面抗原可以直接融合到C-末端前肽，或可以通过接头(例如包含甘氨酸-X-Y重复序列的接头，其中X和Y独立地是任何氨基酸并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸)连接到C-末端前肽。
在前述任一实施方案中，蛋白质可以是可溶解的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。
在前述任一实施方案中，蛋白质可以结合到受试者的细胞表面受体，可选地其中受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。
在前述任一实施方案中，细胞表面受体可以是血管紧张素转换酶2(ACE2)、二肽基肽酶4(DPP4)、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合素(DC-SIGN)或肝脏/淋巴结-SIGN(L-SIGN)。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以是人胶原。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C-末端前肽或其片段。
在前述任一实施方案中，在重组多肽中C-末端前肽可以相同或不同。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:67-80中任一个，或与SEQ ID NO:67-80中任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:67或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:68或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:69或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:70或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:71或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:72或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:73或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:74或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:75或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:76或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:77或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:78或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:79或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括SEQ ID NO:80或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，C-末端前肽可以包括包含甘氨酸-X-Y重复序列连接到SEQ ID NO:67-80中任一个的N-末端的序列，其中X和Y独立地是任何氨基酸并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸，或与其至少90％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以为融合前构象。
在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以为融合后构象。
在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以包括SEQ ID NO:27-66中任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。
在前述任一实施方案中，重组多肽可以包括SEQ ID NO:1-26中任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。
本文还提供了包含本文提供的蛋白质的免疫原。本文提供了包含直接或间接连接到纳米颗粒的本文提供的蛋白质的蛋白质纳米颗粒。本文提供了包含本文提供的蛋白质的类病毒颗粒(VLP)。
本文还提供了编码本文提供的蛋白质的一种、两种、三种或更多种重组多肽的分离核酸。在一些实施方案中，编码S蛋白肽的多肽在框内与编码胶原的C-末端前肽的多肽融合。在一些实施方案中，本文提供的分离核酸可操作地连接到启动子。
在一些实施方案中，本文提供的分离核酸是DNA分子。在一些实施方案中，本文提供的分离核酸是RNA分子，可选地是mRNA分子，例如核苷修饰的mRNA、非扩增mRNA、自扩增mRNA或反式扩增mRNA。
本文还提供了包含本文提供的分离核酸的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。
在一些方面，本文提供了包含本文提供的载体的病毒、假病毒或细胞，可选地，其中病毒或细胞具有重组基因组。在一些方面，本文提供了免疫原性组合物，其包含本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒或细胞以及药学上可接受的载体。
本文还提供了包含本文提供的免疫原性组合物和可选佐剂的疫苗，其中疫苗可选地是亚单位疫苗。在一些实施方案中，疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。
在一些方面，本文提供了产生蛋白质的方法，包括：在宿主细胞中表达本文提供的分离核酸或载体，以产生本文提供的蛋白质；并纯化蛋白质。本文提供了通过本文提供的方法产生的蛋白质。
本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒的S蛋白肽或其片段或表位的免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的如本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗，以产生免疫应答。在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗或预防冠状病毒感染。在一些实施方案中，产生免疫应答抑制或减少了受试者中冠状病毒的复制。在一些实施方案中，免疫应答包括细胞介导的应答和/或体液应答，可选地包括产生一种或更多种中和抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫应答针对冠状病毒的S蛋白肽或其片段或表位，但不针对C-末端前肽。在一些实施方案中，由于先前暴露于一种或更多种冠状病毒，对受试者的施用不会导致受试者中的抗体依赖性增强(ADE)。在一些实施方案中，当随后暴露于一种或更多种冠状病毒时，施用不会导致受试者中的抗体依赖性增强(ADE)。在一些实施方案中，方法进一步包括初免步骤(priming step)和/或加强步骤(boosting step)。在一些实施方案中，通过局部、经皮、皮下、皮内、口服、鼻内(例如，鼻内喷雾剂)、气管内、舌下、口腔、直肠、阴道、吸入、静脉内(例如，静脉注射)、动脉内、肌肉内(例如，肌肉注射)、心内、骨内、腹腔内、跨粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周围、局部或应用皮肤(epicutaneous)给药来进行给药步骤。在一些实施方案中，以单剂量或具有一个间隔或更多个间隔的一系列剂量施用有效量。在一些实施方案中，在不使用佐剂的情况下施用有效量。在一些实施方案中，有效量与佐剂一起施用。
本文提供了方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文提供的蛋白质，以在受试者中产生针对冠状病毒的中和抗体或中和抗血清。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，可选地是人类或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，方法进一步包括从受试者分离中和抗体或中和抗血清。在一些实施方案中，方法进一步包括通过被动免疫向人类受试者施用有效量的分离中和抗体或中和抗血清，以预防或治疗冠状病毒感染。在一些实施方案中，针对冠状病毒的中和抗体或中和抗血清包括针对冠状病毒S蛋白肽或其片段或表位的多克隆抗体，可选地，其中中和抗体或中和抗血清不含或基本不含针对胶原的C-末端前肽的抗体。在一些实施方案中，中和抗体包括针对冠状病毒S蛋白肽或其片段或表位的单克隆抗体，可选地，其中中和抗体不含或基本不含针对胶原的C-末端前肽的抗体。
在一些方面，本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。
在一些方面，本文提供了本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。在一些方面，本文提供了本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于制造用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答的药物或预防剂，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。
本文还提供了用于分析样品的方法，包括：将样品与本文提供的蛋白质接触，并检测蛋白质与能够特异性结合冠状病毒的S蛋白肽或其片段或表位的分析物之间的结合。在一些实施方案中，分析物是识别S蛋白肽或其片段或表位的抗体、受体或细胞。在一些实施方案中，结合指示样品中存在分析物，和/或样品来源于的受试者中存在冠状病毒感染。
本文提供了试剂盒，其包括本文提供的蛋白质和含有或固定蛋白质的基质、垫或小瓶，可选地其中试剂盒是ELISA或侧向流动检测试剂盒(lateral flow assay kit)。
附图说明
图1示出了用于SARS-CoV-2的示例性可溶性S-三聚体亚单位疫苗的结构特征。(A)S-三聚体结构域的示意图和(B)其三聚体和共价连接的三维构象。
图2示出了示例性S-三聚体的高级表达。显示了全长S-三聚体和在S1/S2弗林蛋白酶(furin)位点裂解的部分裂解形式，即S2-三聚体和裂解的S1片段。
图3示出了示例性共价连接的S-三聚体的纯化和表征。(A)通过蛋白A(PA)亲和层析和阴离子交换柱(Q)然后通过超滤和渗滤(UF/DF)从清除后的细胞培养基中纯化S-三聚体，以获得原料药(DS)。(B)S-三聚体是二硫键连接的三聚体。(C)通过SEC-HPLC分析，S-三聚体纯化至接近均一性，在尺寸排除色谱中分离出一些裂解的S1。(D)评估S-三聚体与ACE2-Fc的受体结合动力学。
图4示出了示例性S-三聚体与N-连接聚糖高度糖基化。显示了去糖基化前和去糖基化后的全长S-三聚体、S2-三聚体和裂解的S1。
图5示出了示例性S-三聚体的电子显微图(EM)和S-三聚体的预测构象(右图)。
图6示出了使用示例性S-三聚体作为抗原从恢复期血清中检测S-特异性抗体和中和抗体。
图7A和图7B分别示出了单独用示例性S-三聚体且不用任何佐剂在大鼠中诱导抗原特异性抗体和中和抗体。图7C示出了不用佐剂或用明矾(氢氧化铝)作为佐剂的示例性S-三聚体疫苗在小鼠中诱导抗原特异性抗体。图7D和图7E分别示出了用角鲨烯基佐剂作为佐剂的示例性S-三聚体在大鼠中诱导抗原特异性抗体和中和抗体。
图8示出了示例性冠状病毒的结构和某些序列。
图9示出了在人类COVID-19恢复期血清中检测SARS-CoV-2中和抗体和ACE2竞争性滴度。基于Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)分析从感染Wuhan-Hu-1毒株的COVID-19患者中采集的8份抗体滴度为中到高的人类康复期血清(HCS)样品的(a)SARS-CoV-2假病毒中和滴度和(b)ACE2竞争性ELISA滴度。提供了将变种毒株滴度与Wuhan-Hu-1毒株滴度进行比较的数据。点代表单个HCS样品的数据，条形代表一半最大有效浓度(EC50)值的几何平均滴度(GMT)。误差条代表95％的置信区间(95％CI)。
图10示出了Wuhan-Hu-1和修饰的B.1.351 S-三聚体抗原以及小鼠免疫原性研究设计。(a)Hu-1 S-三聚体和修饰的B.1.351 S-三聚体的示意图，修饰的B.1.351 S-三聚体包含3个RBD突变和B.1.351变种中的D614G突变。(b)通过ForteBioBioLayer干涉法测定S-三聚体(Wuhan-Hu-1和B.1.351)和人类ACE2-Fc之间的结合亲和力(KD)。(c)在研究的第1阶段，用两剂Hu-1 S-三聚体(3μg)、异源初免-加强剂(第1剂Hu-1 S-三聚体；第2剂B.1.351S-三聚体；每种抗原3μg)、两剂B.1.351 S-三聚体(3μg)或两剂二价疫苗(3μgHu-1 S-三聚体与3μgB.1.351 S-三聚体混合)免疫BALB/c小鼠(n＝16-32/组)。第1阶段的所有动物均接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂初免剂(第1剂)。对于加强剂(第2剂)，每组一半的动物接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂加强剂，另一半接受无佐剂加强剂(仅有抗原)。在研究的第2阶段，第1组的动物随机接受3μgHu-1 S-三聚体或3μg B.1.351S-三聚体(一半含佐剂和一半无佐剂)的再次加强剂(第3剂)。第2-3组的动物随机接受3μg无佐剂Wuhan-Hu-1或B.1.351 S-三聚体的再次加强剂(第3剂)。(d)在第1阶段，在第0天对BALB/c小鼠进行初免(第1剂)并在第21天进行加强剂(第2剂)免疫，并对第35天的血样进行体液免疫原性的初步分析。在第2阶段，在第35天给予再次加强剂(第3剂)，并对第49天的血样进行体液和细胞免疫应答的初步分析。
图11示出了小鼠中使用2剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351刺突-三聚体抗原的体液免疫应答。根据(a)针对Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的SARS-CoV-2假病毒中和试验以及(b)ACE2竞争性ELISA检测基于Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的疫苗诱导的抗体与S-三聚体结合的竞争，在第35天(第2剂后2周)评估研究的第1阶段的体液免疫应答。点代表个体动物；条形代表EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。显示了第2-4组与第1组(Hu-1 S-三聚体)相比在GMT上的倍数差异(Δ)，黑色文本显示统计上的显著差异。P值<0.05被认为是显著的。
图12示出了佐剂对加强剂(第2剂)和再次加强剂(第3剂)的体液免疫应答的影响。研究中的体液免疫应答是基于针对Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的SARS-CoV-2假病毒中和试验进行评估的。基于析因分析的假病毒中和滴度结果在此处显示的是(a)第1阶段，其中所有动物均接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂初免剂(第1剂)，而一半动物接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂加强剂(第2剂)，剩下一半的动物接受无佐剂加强剂(仅有抗原)，和(b)第2阶段，其中第1组的一半动物接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂再次加强剂(第3剂)，剩下一半的动物接受无佐剂再次加强剂(仅有抗原)。点代表单个动物；条形代表EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。P值<0.05被认为是显著的。
图13示出了小鼠中使用3剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351刺突-三聚体抗原的体液免疫应答。在研究的第2阶段，根据针对(a)Wuhan-Hu-1毒株，(b)英国(b.1.1.7)变种，(c)南非(B.1.351)变种和(d)巴西(P.1)变种假病毒的SARS-CoV-2假病毒中和试验，在第49天(第3剂后2周)评估接受无佐剂再次加强剂(第3剂)的动物中的体液免疫应答。还示出了第35天(第2剂后2周)的中和滴度。示出了每个再次加强组的滴度的倍数差异(第49天与第35天)。点代表单个动物；条形代表一半最大有效浓度(EC50)值的几何平均滴度(GMT)，误差条形图代表95％置信区间(95％CI)。
图14示出了小鼠中使用3剂Wuhan-Hu-1或B.1.351刺突-三聚体抗原的细胞介导的免疫应答。根据ELISpot检测用(a)来自Wuhan-Hu-1毒株的S1肽库，(b)来自SARS-CoV的S1肽库，(c)来自b.1.351变种的RBD肽库，或(d)来自P.1变种的RBD肽库刺激的收获的脾细胞中的Th1细胞因子(IFNγ和IL-2)或Th2细胞因子(IL-5)，在第49天(第3剂后2周)评估研究的第2阶段的细胞介导的免疫应答。点代表单个动物；条形代表组平均值，误差条代表95％置信区间(95％CI)。
图15示出了小鼠中使用两剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351 S-三聚体抗原后基于假病毒中和滴度的交叉中和。根据针对Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的SARS-CoV-2假病毒中和试验，在第35天(第2剂后2周)评估研究的第1阶段的体液免疫应答。结果显示：(a)第1组(两剂Hu-1 S-三聚体)，(b)第2组(异源初免-加强)，(c)第3组(两剂B.1.351 S-三聚体)，或(d)两剂二价疫苗。每个图中的点代表单个动物的结果，线连接Wuhan-Hu-1中和滴度和变种中和滴度。示出了EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。P值<0.05被认为是显著的(n.s.指无显著性)。
图16示出了小鼠中使用2剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351 S-三聚体抗原后基于ACE2竞争性滴度的交叉中和。根据针对Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的ACE2竞争性ELISA试验，在第35天(第2剂后2周)评估研究的第1阶段的体液免疫应答。结果显示：(a)第1组(两剂Hu-1 S-三聚体)，(b)第2组(异源初免-加强)，(c)第3组(两剂B.1.351 S-三聚体)，或(d)两剂二价疫苗。每个图中的点代表单个动物的结果，线连接Wuhan-Hu-1中和滴度和变种中和滴度。示出了EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。P值<0.05被认为是显著的(n.s.指无显著性)。
图17示出了小鼠中使用两剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351 S-三聚体抗原后的体液免疫应答。根据针对(a)Wuhan-Hu-1毒株、(b)英国变种(b.1.1.7)、(c)南非变种(b.1.351)和(d)巴西变种(P.1)毒株的SARS-CoV-2假病毒中和试验，在第35天(第2剂后2周)评估研究的第1阶段的体液免疫应答。第1阶段的所有动物均接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂初免剂(第1剂)，而每组的一半动物接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂加强剂(第2剂)，另一半动物接受无佐剂加强剂(仅有抗原)。这里示出了接受含佐剂或无佐剂加强剂(第2剂)的动物亚组的结果。点代表单个动物；条形代表EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。P值<0.05被认为是显著的。
图18示出了小鼠中使用3剂Wuhan-Hu-1和/或B.1.351 S-三聚体抗原后的体液免疫应答。根据针对(a)Wuhan-Hu-1毒株，(b)英国(b.1.1.7)变种，(c)南非(b.1.351)变种和(d)巴西(P.1)变种假病毒的SARS-CoV-2假病毒中和试验，在第49天(第3剂后2周)评估研究的第2阶段的体液免疫应答。这里示出了研究中所有亚组(代表所有疫苗组合)的结果(n＝4/亚组)。点代表单个动物；条形代表EC50值的几何平均滴度(GMT)，误差条代表95％置信区间(95％CI)。
具体实施方式
本文提供了包含冠状病毒抗原或免疫原的融合肽和蛋白质的免疫原性组合物、方法和用途，用于冠状病毒感染的治疗(例如预防性、治疗性)。在一些实施方案中，公开了来自共价连接三聚体形式的RNA病毒的重组可溶性表面抗原的组合物和使用方法。在一些实施方案中，产生的融合蛋白作为二硫键连接的同源三聚体分泌，其结构更稳定，同时保留类天然三聚体病毒抗原的构象，因此可以用作对抗这些危险病原体的更有效疫苗。
在一些实施方案中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为疫苗或作为多价疫苗的一部分来预防病毒感染的方法，不使用或使用佐剂，或使用一种以上佐剂，可选地通过肌肉内注射或鼻内施用。
在一些实施方案中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为抗原用于通过检测识别病毒抗原(例如中和抗体)的抗体(例如IgM或IgG)来诊断病毒感染的方法。
在一些实施方案中，本文公开了使用病毒抗原三聚体作为抗原来产生可用于被动免疫的多克隆或单克隆抗体(例如，用于治疗冠状病毒感染的中和mAb)的方法。
在一些实施方案中，本文公开了作为疫苗或作为多价疫苗的一部分的病毒抗原三聚体，其中疫苗包括多种三聚体亚单位疫苗，所述三聚体亚单位疫苗包括病毒的相同蛋白质的病毒抗原，或包括一种或更多种病毒的两种或更多种不同蛋白质的病毒抗原或相同病毒的一种或更多种毒株的病毒抗原。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的病毒抗原三聚体的单价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的病毒抗原三聚体的二价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的病毒抗原三聚体的三价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的病毒抗原三聚体的四价疫苗。
在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的S-三聚体的单价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的S-三聚体的二价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含至少一个包含第一S蛋白抗原的S-三聚体和至少一个包含第二S蛋白抗原的S-三聚体的二价疫苗。在一些实施方案中，第一和第二S蛋白抗原来自一种或更多种病毒物种或毒株/亚型的相同S蛋白，或来自一种或更多种病毒物种或相同病毒物种的一种或更多种毒株/亚型的两种或更多种不同S蛋白。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的S-三聚体的三价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含至少一个包含第一S蛋白抗原的S-三聚体、至少一个包含第二S蛋白抗原的S-三聚体和至少一个包含第三S蛋白抗原的S-三聚体的三价疫苗。在一些实施方案中，第一、第二和第三S蛋白抗原来自一种或更多种病毒物种或毒株/亚型的相同S蛋白，或来自一种或更多种病毒物种或相同病毒物种的一种或更多种毒株/亚型的两种、三种或更多种不同S蛋白。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的S-三聚体的四价疫苗。在一些实施方案中，本文公开了包含至少一个包含第一S蛋白抗原的S-三聚体、至少一个包含第二S蛋白抗原的S-三聚体、至少一个包含第三S蛋白抗原的S-三聚体和至少一个包含第四S蛋白抗原的S-三聚体的四价疫苗。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四S蛋白抗原来自一种或更多种病毒物种或毒株/亚型的相同S蛋白，或来自一种或更多种病毒物种或相同病毒物种的一种或更多种毒株/亚型的两种、三种、四种或更多种不同S蛋白。
本文提供的包含冠状病毒抗原和免疫原的蛋白质，包括重组多肽和融合蛋白，可用于有效且安全地治疗(例如，治疗性、预防性)冠状病毒感染。例如，本文提供的包含冠状病毒抗原和免疫原的蛋白质治疗冠状病毒感染，而没有介导的(mediated)疫苗诱导的疾病增强(VED)和/或抗体依赖性增强(ADE)。此外，本文提供的包含冠状病毒抗原和免疫原的蛋白质容易产生，并且在例如高温、极端pH、高渗透压和低渗透压等高应激条件下表现出稳定性。因此，本文提供的蛋白质和免疫原性组合物规避并满足了阻碍冠状病毒疫苗开发的生产、稳定性、安全性和有效性问题。
在一些方面，本文提供的冠状病毒抗原和免疫原包括冠状病毒刺突(S)蛋白或肽，尤其是SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白。SARS-CoV和SARS-CoV-2的刺突由S蛋白三聚体组成，S蛋白三聚体属于I类病毒融合糖蛋白的组，该组还包括HIV糖蛋白160(Env)、流感血凝素(HA)、副粘病毒F和埃博拉病毒糖蛋白。SARS-CoV和SARS-CoV-2 S蛋白各自编码表面糖蛋白前体，并且预测氨基端和大部分蛋白质位于细胞表面或病毒颗粒的外侧。S蛋白包括位于N末端的信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。与其它冠状病毒相似，SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白可以被蛋白酶裂解成S1和S2亚基。特别是，SARS-CoV-2包含弗林蛋白酶(furin)样裂解位点，这是其它SARS样CoV所缺乏的。
在一些实施方案中，本文提供了重组S胞外域三聚体。在一些实施方案中，重组S胞外域三聚体包括来自α-冠状病毒(例如，NL63-CoV或229E-CoV)的重组S胞外域原聚体。在一些实施方案中，重组S胞外域三聚体包括来自β-冠状病毒(例如OC43-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HKU1-CoV、WIV1-CoV、小鼠肝炎病毒(MHV)或HKU9-CoV)的S胞外域原聚体。
与其它包膜RNA病毒(例如HIV、RSV和流感)类似，包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒在其病毒包膜上都有三聚体表面抗原，以便在感染期间通过特定的细胞表面受体进入不同的宿主细胞。与SARS-CoV-1一样，SARS-CoV-2利用其三聚体病毒表面抗原S蛋白与其特异性细胞表面受体ACE2结合后进入哺乳动物呼吸系统的宿主细胞。产生有效的重组亚单位疫苗的先决条件是能够产生类似天然的病毒S抗原，特别是保持其三聚体构象，以引起足够数量的抗体可以结合到病毒S蛋白的受体结合结构域(RBD)，从而阻止病毒与ACE2受体结合，从而消除病毒感染。
在一些实施方案中，包含冠状病毒抗原或免疫原(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白肽)的蛋白质能够产生免疫应答，例如，对SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白肽的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答抑制或减少受试者(例如患者)中冠状病毒的复制。在一些实施方案中，免疫应答包括产生一种或更多种中和抗体，例如多克隆和/或单克隆抗体。在一些实施方案中，中和抗体抑制或减少受试者(例如患者)中冠状病毒的复制。在一些实施方案中，例如作为免疫原性组合物向受试者施用蛋白质不会由于先前暴露于冠状病毒而导致受试者中的抗体依赖性增强(ADE)。在一些方面，包含冠状病毒抗原和免疫原的蛋白质用作疫苗。
在一些实施方案中，冠状病毒抗原和免疫原(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白肽)与蛋白质或肽连接以形成融合蛋白或重组多肽。在一些实施方案中，与冠状病毒抗原或免疫原连接的蛋白质或肽能够与蛋白质或肽(例如，融合蛋白或重组多肽的蛋白质或肽)结合，例如共价或非共价连接。因此，在一些情况下，与冠状病毒抗原或免疫原连接的蛋白质或肽是多聚结构域。
在一些实施方案中，冠状病毒抗原和免疫原(例如冠状病毒S蛋白肽)连接到胶原的前肽(例如在胶原的前肽的C-末端)，以形成融合肽或重组多肽。因此，在一些实施方案中，本文提供的蛋白质包括含有冠状病毒抗原和免疫原(例如冠状病毒S蛋白肽或其片段或表位)的重组多肽，连接到胶原的C-末端前肽。在一些实施方案中，胶原的前肽来源于α1胶原的人类C-前肽，表达后能够自三聚体化。
在一些实施方案中，将冠状病毒抗原和免疫原(例如冠状病毒S蛋白肽)连接到胶原的前肽(例如在胶原的前肽的C-末端)有助于蛋白质产生免疫应答的能力。例如，重组蛋白的产生可保留冠状病毒S蛋白肽的三级和四级结构，这可能对冠状病毒S蛋白肽的天然构象的稳定性很重要，而蛋白质表面上抗原位点的可用性反过来能够引发免疫应答，例如中和抗体。此外，将冠状病毒S蛋白肽连接到能够自三聚体化的蛋白质或肽使得重组蛋白聚集，从而模仿病毒包膜上冠状病毒S蛋白肽的天然同源三聚体结构。
在一些实施方案中，将冠状病毒S蛋白肽连接到胶原的C-末端前肽导致自三聚体化的重组多肽。在一些实施方案中，本文提供的蛋白质包括多种自三聚体化的冠状病毒S蛋白肽和胶原重组多肽的前肽。在一些实施方案中，重组蛋白的三聚体性质有助于蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，重组蛋白的三聚体性质有助于蛋白质产生免疫应答的能力。在一些实施方案中，重组蛋白的三聚体性质和/或多种自三聚体化的重组蛋白的宏观结构有助于蛋白质产生免疫应答的能力。
本文还提供了包含本文提供的蛋白质的免疫原性组合物、生产本文提供的蛋白质的方法、用本文提供的蛋白质和组合物治疗受试者的方法以及试剂盒。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，均出于所有目的以其全文形式被援引加入，其程度与各单独出版物被单独援引加入的程度相同。如果本文所述定义与被援引加入本文的专利、申请、公开申请和其它出版物中所述定义相反或不一致，则本文所述定义优先于被援引加入本文的定义。本文使用的章节标题仅出于组织的目的，不得解释为限制所描述的主题。
I.病毒抗原和免疫原
本文提供的蛋白质包括冠状病毒抗原和免疫原。本文所预期的冠状病毒抗原和免疫原能够促进或刺激细胞介导的应答和/或体液应答。在一些实施方案中，应答(例如，细胞介导的或体液应答)包括抗体(例如，中和抗体)的产生。在一些实施方案中，冠状病毒抗原或免疫原是冠状病毒刺突蛋白肽。
冠状病毒是正义单链RNA病毒家族，正义单链RNA病毒已知可引起严重呼吸道疾病。它们拥有已知RNA病毒中最大的基因组(26-32kb)，在系统发生上分为四个属(α、β、γ、δ)，其中β-冠状病毒进一步细分为四个谱系(A、B、C、D)。目前已知冠状病毒家族感染人类的病毒来自α-冠状病毒和β-冠状病毒属。此外，人们认为，γ-冠状病毒和δ-冠状病毒属将来可能会感染人类。β-冠状病毒的非限制性示例包括中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、人类冠状病毒HKU1(HKU1-CoV)、人类冠状病毒OC43(OC43-CoV)、鼠肝炎病毒(MHV-CoV)、蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1(WIV1-CoV)和人类冠状病毒HKU9(HKU9-CoV)。α-冠状病毒的非限制性示例包括人类冠状病毒229E(229E-CoV)、人类冠状病毒NL63(NL63-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)。δ-冠状病毒的非限制性示例是猪δ-冠状病毒(SDCV)。
本文公开了严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的列表：
■蝙蝠冠状病毒Cp/Yunnan2011
■蝙蝠冠状病毒RaTG13
■蝙蝠冠状病毒Rp/Shaanxi2011
○蝙蝠SARS冠状病毒HKU3
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-1
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-10
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-11
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-12
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-13
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-2
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-3
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-4
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-5
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-6
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-7
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-8
■蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-9
■蝙蝠SARS冠状病毒Rp1
■蝙蝠SARS冠状病毒Rp2
○蝙蝠SARS CoV Rf1/2004
■蝙蝠CoV 273/2005
○蝙蝠SARS CoV Rm1/2004
■蝙蝠CoV 279/2005
■蝙蝠SARS CoV Rp3/2004
■蝙蝠SARS样冠状病毒
■蝙蝠SARS样冠状病毒Rs3367
■蝙蝠SARS样冠状病毒RsSHC014
■蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1
■蝙蝠SARS样冠状病毒YNLF_31C
■蝙蝠SARS样冠状病毒YNLF_34C
■BtRf-BetaCoV/HeB2013
■BtRf-BetaCoV/JL2012
■BtRf-BetaCoV/SX2013
■BtRs-BetaCoV/GX2013
■BtRs-BetaCoV/HuB2013
■BtRs-BetaCoV/YN2013
■Civet SARS CoV 007/2004
■Civet SARS CoV SZ16/2003
■Civet SARS CoV SZ3/2003
○重组SARSr-CoV
■SARS冠状病毒ExoN1
■SARS冠状病毒MA15
■SARS冠状病毒MA15 ExoN1
■SARS冠状病毒wtic-MB
■中菊头蝠冠状病毒
■SARS蝙蝠冠状病毒
■SARS冠状病毒A001
■SARS冠状病毒A013
■SARS冠状病毒A021
■SARS冠状病毒A022
■SARS冠状病毒A030
■SARS冠状病毒A031
■SARS冠状病毒AS
■SARS冠状病毒B012
■SARS冠状病毒B024
■SARS冠状病毒B029
■SARS冠状病毒B033
■SARS冠状病毒B039
■SARS冠状病毒B040
■SARS冠状病毒BJ01
■SARS冠状病毒BJ02
■SARS冠状病毒BJ03
■SARS冠状病毒BJ04
■SARS冠状病毒BJ162
■SARS冠状病毒BJ182-12
■SARS冠状病毒BJ182-4
■SARS冠状病毒BJ182-8
■SARS冠状病毒BJ182a
■SARS冠状病毒BJ182b
■SARS冠状病毒BJ202
■SARS冠状病毒BJ2232
■SARS冠状病毒BJ302
■SARS冠状病毒C013
■SARS冠状病毒C014
■SARS冠状病毒C017
■SARS冠状病毒C018
■SARS冠状病毒C019
■SARS冠状病毒C025
■SARS冠状病毒C028
■SARS冠状病毒C029
■SARS冠状病毒CDC#200301157
■SARS冠状病毒civet010
■SARS冠状病毒civet014
■SARS冠状病毒civet019
■SARS冠状病毒civet020
■SARS冠状病毒CS21
■SARS冠状病毒CS24
■SARS冠状病毒CUHK-AG01
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■SARS相关蝙蝠冠状病毒RsSHC014
■SARS相关β-冠状病毒Rp3/2004
■严重急性呼吸综合征冠状病毒2
下表示出了示例性SARSCoV-2毒株。
Figure GDA0003496524170000181
冠状病毒基因组被加帽(capped)、多聚腺苷酸化并被核衣壳蛋白覆盖。冠状病毒粒子包括包含称为刺突(S)蛋白的I型融合糖蛋白的病毒包膜。大多数冠状病毒具有共同的基因组结构，其中复制酶基因包含在基因组的5′部分，而结构基因包含在基因组的3′部分。
冠状病毒刺突(S)蛋白是最初作为前体蛋白合成的I类融合糖蛋白。单个前体S多肽形成同源三聚体，并在高尔基体内进行糖基化并加工以去除信号肽，并被细胞蛋白酶裂解以产生单独的S1和S2多肽链，在同源三聚体中仍然作为S1/S2原聚体结合，因此是异二聚体的三聚体。S1亚单位位于病毒膜的远端，包含受体结合结构域(RBD)，该受体结合结构域介导病毒与其宿主受体的附着(attachment)。S2亚单位包含融合蛋白机制(machinery)，例如融合肽、融合糖蛋白特有的两个七肽重复序列(HR1和HR2)和中心螺旋、跨膜结构域和细胞溶质尾部结构域(cytosolic tail domain)。
在一些情况下，冠状病毒抗原或免疫原是处于融合前构象的冠状病毒S蛋白肽，它是冠状病毒S蛋白的胞外域在分泌系统中加工成成熟冠状病毒S蛋白之后并且在触发导致冠状病毒S向融合后构象转变的融合事件之前采用的结构构象。Kirchdoerfer et al.,“Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein,”Nature,531:118-121,2016中提供了处于融合前构象的示例性冠状病毒S蛋白(HKU1-CoV)的三维结构。
在一些情况下，冠状病毒抗原或免疫原包括一个或更多个与天然冠状病毒S序列相比的氨基酸取代、缺失或插入，与由相应的天然冠状病毒S序列形成的冠状病毒S胞外域三聚体相比，其提供了增加的融合前构象保留。通过一个或更多个氨基酸取代、缺失或插入的融合前构象的“稳定”可以是，例如，能量稳定(例如，降低融合前构象相对于融合后开放构象的能量)和/或动力学稳定(例如，降低从融合前构象到融合后构象的转化率)。此外，与相应的天然冠状病毒S序列相比，处于融合前构象的冠状病毒S胞外域三聚体的稳定可以包括增加对变性的抗性。本文提供了确定冠状病毒S胞外域三聚体是否处于融合前构象的方法，包括(但不限于)使用融合前构象特异性抗体的负染色电子显微镜和抗体结合分析。
在一些情况下，冠状病毒抗原或免疫原是S蛋白肽的片段。在一些实施方案中，抗原或免疫原是S蛋白肽的表位。表位包括分子上的抗原决定簇化学基团或肽序列，它们是抗原性的，从而引发特定的免疫应答，例如，表位是B细胞和/或T细胞作出应答的抗原区域。抗体可以结合到特定的抗原表位，例如冠状病毒S胞外域上的表位。表位既可以由连续氨基酸形成，也可以由通过蛋白质三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。在一些实施方案中，冠状病毒表位是线性表位。在一些实施方案中，冠状病毒表位是构象表位。在一些实施方案中，冠状病毒表位是中和表位位点。在一些实施方案中，冠状病毒S蛋白肽或其片段的所有中和表位作为抗原或免疫原存在。
在一些情况下，例如，当病毒抗原或免疫原是S蛋白肽的片段时，仅存在S蛋白肽的单个亚单位，并且S蛋白肽的单个亚单位是三聚化的。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括信号肽、S1亚单位肽、S2亚单位肽或其任意组合。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括信号肽、受体结合结构域(RBD)肽、受体结合基序(RBM)肽、融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)肽或七肽重复序列2(HR2)肽或其任意组合。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括S蛋白的S1亚单位和S2亚单位。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括S蛋白的S1亚单位，但不包括S2亚单位。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括S蛋白的S2亚单位，但不包括S1亚单位。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原不含跨膜(TM)结构域肽和/或细胞质(CP)结构域肽。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa或组织蛋白酶L。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原不含蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa或组织蛋白酶L，或者包含不可被蛋白酶裂解的突变的蛋白酶裂解位点。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原是包含至少一种SARS-CoV-2蛋白质或其片段的SARS-CoV-2抗原。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原被SARS-CoV-2反应性抗体和/或T细胞识别。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原是灭活的全病毒。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原包括病毒的亚单位。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原包括SARS-CoV-2的结构蛋白或其片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2的结构蛋白包括由刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白和包膜(E)蛋白组成的组中的一种或更多种。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原包括或进一步包括SARS-CoV-2的非结构蛋白或其片段。代表性SARS-CoV-2分离菌(isolate)(Wuhan-Hu-1)的核苷酸序列记载为GenBank号MN908947.3(Wu et al.,Nature,579:265-269,2020)。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:55中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与如下所示的SEQ ID NO:55(下划线序列表示Thr333-Gly526(粗体)的受体结合结构域(RBD)内的受体结合基序(RBM))具有至少或约80％、85％、90％、92％、95％或97％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括RBD三聚体，例如，与SEQ ID No:67-80中的任何一个连接的SARS-CoV-2 RBD序列。
Figure GDA0003496524170000201
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括Wuhan-Hu-1冠状病毒的刺突糖蛋白序列(例如NC_045512)。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.526谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括Cluster 5(ΔFVI-刺突)病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.1.7谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.1.207谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.1.317谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.1.318谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括P.1谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.351谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.429/CAL.20C谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.525谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.526谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.617谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.617.2谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.618谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.620谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括P.2谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括P.3谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.1.143谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括A.23.1谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括B.1.617谱系中的病毒的刺突糖蛋白序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括来源于选自由Wuhan-Hu-1、B.1.526谱系中的病毒、B.1.1.7谱系中的病毒、P.1谱系中的病毒、B.1.351谱系中的病毒、P.2谱系中的病毒、B.1.1.143谱系中的病毒、A.23.1谱系中的病毒和B.1.617谱系中的病毒组成的组的任何两种或更多种病毒(以任何合适的组合)的刺突糖蛋白的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括E484K和/或S477N，例如，如在B.1.526变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括Δ400-402(ΔFVI)，例如，如在Cluster5(ΔFVI-刺突)变体中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括Δ69-70(ΔHV)、Δ144(ΔY)、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和/或D1118H，例如，如在B.1.1.7变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括P681H，例如，如在B.1.1.207变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I和/或V1176F，例如，如在P.1变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括E484K，例如，如在P.2变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括E484K和/或N501Y，例如，如在P.3变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括L18F、D80A、D215G，Δ242-244(ΔLAL)、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和/或A701V，例如，如在B.1.351变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括S13I、W152C和/或L452R，例如，如在B.1.429/CAL.20C变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括Δ69-70(ΔHV)、E484K和/或F888L，例如，如在B.1.525变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括G142D、L452R、E484Q和/或P681R，例如，如在B.1.617变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括G142D、L452R和/或P681R，例如，如在B.1.617.2变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括E484K，例如，如在B.1.618变种中。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原可以包括融合多肽(原聚体)，所述融合多肽(原聚体)包括以任何适当组合的任何一种或更多种前述突变。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原可以包括三种融合多肽的三聚体，并且三种原聚体融合多肽中的任何一种可以包括以任何适当组合的任何一种或更多种前述突变。在一些实施方案中，形成三聚体的三种原聚体融合多肽中的两种或全部三种可以在每个原聚体中包括不同的突变和/或不同的突变组合。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原可以包括三聚体的混合物，并且每个三聚体可以包括不同的突变和/或不同的突变组合。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括选自由SEQ ID NO:55的氨基酸位置13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176处的突变(例如，取代、缺失和/或插入)组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括选自由在氨基酸位置440、452、477、484、501、614、655、681和701处的突变(例如，取代、缺失和/或插入)组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或所有突变。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括包含来自不同病毒的序列的嵌合多肽，例如来自冠状病毒第一变种的一个或更多个突变以及来自不同于第一变种的冠状病毒第二变种的一个或更多个突变。在一些实施方案中，此类嵌合病毒抗原或免疫原(或嵌合病毒抗原或免疫原的组合)可用于引发针对冠状病毒的第一和第二变种的广泛免疫应答。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括选自由N440K、L452R、S477G、S477N、E484K、E484Q、N501Y、D614G、H655Y、P681H、P681R和A701V组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原包括缺乏信号肽的截短的S蛋白、全长S蛋白的跨膜和细胞质结构域。在一些实施方案中，SARS-CoV-2抗原是重组蛋白，而在其它实施方案中，SARS-CoV-2抗原从病毒粒子中纯化。在一些优选的实施方案中，SARS-CoV-2抗原是分离抗原。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:27中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:27具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:27的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:28中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:28具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:28的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:29中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:29具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:29的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:30中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:30具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:30的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:31中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:31具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:31的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:32中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:32具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:32的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:33中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:33具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:33的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:34中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:34具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:34的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:35中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:35具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:35的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:36中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:36具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:36的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:37中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:37具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:37的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:38中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:38具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:38的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:39中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:39具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:39的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:40中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:40具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:40的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:41中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:41具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:41的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:42中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:42具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:42的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:43中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:43具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:43的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:44中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:44具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:44的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:45中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:45具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:45的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:46中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:46具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:46的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:47中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:47具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:47的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:48中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:48具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:48的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:49中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:49具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:49的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:50中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:50具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:50的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:51中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:51具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:51的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:52中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:52具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括信号肽。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:53中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:53具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:54中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:54具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:55中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:55具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQID NO:55的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:56中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:56具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在选自由13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)组成的组中的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:56的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:57中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:57具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:57的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:58中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:58具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:58的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:59中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括在SEQ ID NO:59的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:60中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括在SEQ ID NO:60的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:61中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:61具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:61的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:62中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:62具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:62的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:63中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:63具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:63的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:64中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:64具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:64的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括SEQ ID NO:65中所述的序列。在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原包括与SEQ ID NO:65具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:65的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
在一些实施方案中，病毒抗原或免疫原不包括例如SEQ ID NO:66或其一部分的跨膜结构域。在一些实施方案中，冠状病毒抗原或免疫原包括可溶性S蛋白肽。在一些实施方案中，可溶性S蛋白肽缺少TM结构域肽和CP结构域肽。在一些实施方案中，可溶性S蛋白肽不结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。
在一些实施方案中，S蛋白肽由经密码子优化的核酸序列产生。在一些实施方案中，S蛋白肽由未经密码子优化的核酸序列产生。
在一些实施方案中，本文提及的病毒抗原或免疫原可包括包含所述病毒抗原或免疫原的重组多肽或融合肽。术语病毒抗原或免疫原可用于指包含冠状病毒抗原或免疫原的蛋白质。在某些情况下，冠状病毒抗原或免疫原是本文提供的冠状病毒蛋白肽。
II.重组肽和蛋白质
可以预期，本文提供的冠状病毒抗原和免疫原，例如S蛋白肽(参见第I节)，可以与其它蛋白质或肽结合，例如连接，以形成重组多肽，包括融合肽。在一些实施方案中，本文提供的单个重组多肽(例如单体)结合形成重组多肽的多聚体，例如三聚体。
在一些实施方案中，单个重组多肽单体的结合通过共价相互作用发生。在一些实施方案中，单个重组多肽单体的结合通过非共价相互作用发生。在一些实施方案中，相互作用(例如共价或非共价)受连接冠状病毒抗原或免疫原(例如S蛋白肽)的蛋白质或肽影响。
在一些实施方案中，例如，当冠状病毒抗原或免疫原是如本文所述的S蛋白肽时，可选择将其连接到的蛋白质或肽，从而保留糖蛋白的天然同源三聚体结构。这可以有利于激发对S蛋白肽的强而有效的免疫原性应答。例如，冠状病毒抗原或免疫原(例如S蛋白肽)的天然构象的保留和/或维持可改善或允许进入能够产生免疫应答的抗原位点。在一些情况下，包含本文所述S蛋白肽的重组多肽(例如，参见第I节)在本文中可选地被称为重组S抗原、重组S免疫原或重组S蛋白。
进一步预期，在一些情况下，重组多肽或其多聚重组多肽聚集或可聚集以形成包含多个冠状病毒抗原和/或免疫原重组多肽的蛋白质或复合物。这种蛋白质的形成可有利于产生对冠状病毒抗原和/或免疫原的强而有效的免疫原性应答。例如，形成包含多个重组多肽的蛋白质，从而形成多个冠状病毒抗原，例如冠状病毒S蛋白肽，可保留病毒抗原的三级和/或四级结构，允许针对天然结构引发(mounted)免疫应答。在一些情况下，聚集可赋予冠状病毒抗原或免疫原的结构稳定性，这反过来又可提供对能够促进免疫应答的潜在抗原位点的进入。
1.融合肽和重组多肽
在一些实施方案中，冠状病毒抗原或免疫原可在其C-末端(C-末端连接)连接至三聚化结构域，以促进单体的三聚化。在一些实施方案中，三聚化以三聚体构型稳定冠状病毒抗原或免疫原(例如冠状病毒S蛋白肽)的膜近端方面。
促进可溶性重组蛋白稳定三聚体的外源性多聚结构域的非限制性示例包括：GCN4亮氨酸拉链(Harbury et al.1993Science 262:1401-1407)、肺表面活性物质蛋白的三聚基序(Hoppe et al.1994FEBS Lett 344:191-195)、胶原(McAlinden et al.2003JBiolChem 278:42200-42207)和噬菌体T4fibritinFoldon(Miroshnikov etal.1998Protein Eng11:329-414)，其中任何一种都可连接到本文所述的冠状病毒抗原或免疫原(例如，通过连接到S肽的C末端)以促进重组病毒抗原或免疫原的三聚化。另请参见美国专利号7,268,116、7,666,837、7,691,815、10,618,949、10,906,944和10,960,070，以及US2020/0009244，这些专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
在一些实施方案中，一个或更多个肽接头(例如，甘氨酸-丝氨酸接头，例如，10个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸肽接头)可用于将重组病毒抗原或免疫原连接到多聚化结构域。只要重组病毒抗原或免疫原三聚体保持所需性质(例如，融合前构象)，三聚体可包括本文提供的任何稳定突变(或其组合)。在一些实施方案中，重组多肽或融合蛋白包括SEQ ID NO:27-66中任一个所述的第一序列，所述第一序列连接到SEQ ID NO:67-80中任一个所述的第二序列，其中第一序列的C末端直接连接到第二序列的N末端。在一些实施方案中，重组多肽或融合蛋白包括SEQ ID NO:27-66中任一个所述的第一序列，所述第一序列连接到SEQ IDNO:67-80中任一个所述的第二序列，其中第一序列的C末端间接连接到第二序列的N末端，例如通过接头。在一些实施方案中，接头包括包含甘氨酸-X-Y重复序列的序列。
为了在治疗上可行，生物药物设计所需的三聚化蛋白部分应满足以下标准。理想情况下，它应该是天然分泌蛋白的一部分，如免疫球蛋白Fc，其还是在循环中丰富(无毒)、来源于人类(缺乏免疫原性)、相对稳定(半衰期长)并且能够有效自三聚化，所述自三聚化通过链间共价二硫键加强，因此三聚化的冠状病毒抗原或免疫原在结构上是稳定的。
胶原是纤维蛋白家族，纤维蛋白家族是细胞外基质的主要成分。它是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，占身体总蛋白质的近25％。胶原在骨骼、肌腱、皮肤、角膜、软骨、血管和牙齿的形成中起着重要的结构作用。胶原I、II、III、IV、V和XI的纤维状类型都合成为较大的三聚体前体，称为前胶原，其中由数百个“G-X-Y”重复序列(或甘氨酸重复序列)组成的中心不间断的三螺旋结构域两侧是非胶原结构域(NC)、N-前肽和C-前肽。C-末端和N-末端延伸都在前胶原分泌后进行蛋白质水解处理，这一事件触发成熟蛋白质组装成胶原原纤维，形成不溶性细胞基质。BMP-1是识别甘氨酸重复序列和胶原C-前结构域之间的连接处附近的前胶原的特定肽序列并负责去除前肽的蛋白酶。在正常成人的人类血清中发现I型胶原的脱落三聚体C-前肽的浓度在50-300ng/mL范围内，儿童具有更高的水平，这表明活跃的骨形成。在I型胶原的C-前肽的家族性高血清浓度人群中，其水平可高达1-6μg/mL而无明显异常，表明C-前肽是无毒的。对胶原的三聚体C-前肽的结构研究表明，它是三叶结构，所有三个亚单位在靠近其N-末端的连接区域聚集在一起，连接到前胶原分子的其余部分。这种突出蛋白质的几何形状在一个方向上的融合与Fc二聚体相似。
I型、Ⅳ型、V型和XI型胶原主要组装成由两个α-1链和一个α-2链(对于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型)或三个不同的链(对于XI型)组成的异源三聚体形式，它们在序列上高度同源。Ⅱ型和Ⅲ型胶原均为α-1链的同源三聚体。对于I型胶原(最丰富的胶原形式)，也形成稳定的α(I)同源三聚体，并且在不同组织中以可变水平存在。当单独在细胞中过表达时，这些胶原C-前肽链中的大多数可以自组装成同源三聚体。虽然N-前肽结构域是首先合成的，但三聚体胶原的分子组装始于C-前肽的配准结合。据信，C-前肽复合物通过链间二硫键的形成而稳定，但二硫键形成对于适当的链配准的必要性尚不清楚。甘氨酸的三螺旋重复，然后以类似拉链的方式从相关的C-末端传播到N-末端。通过使用重组DNA技术交换不同胶原链的C-前肽，这一知识创造了非天然类型的胶原基质。非胶原蛋白质(例如细胞因子和生长因子)也已融合到前胶原或成熟胶原的N-末端，以形成新的胶原基质，其目的是使非胶原蛋白质从细胞基质中缓慢释放。然而，在这两种情况下，在重组胶原纤维组装成不溶性细胞基质之前，C-前肽都需要被裂解。
尽管其它蛋白质三聚化结构域(例如来自细菌噬菌体T4的酵母原纤蛋白(fibritin)的GCN4和大肠杆菌的天冬氨酸转氨基甲酰酶的那些)先前已经描述过允许异源蛋白质的三聚化，但这些三聚体蛋白均不是人类性质的，它们也不是天然分泌的蛋白质。因此，任何三聚体融合蛋白都必须在细胞内合成，这不仅可能导致天然分泌蛋白(例如可溶性受体)的错误折叠，而且也使得从数千种其它细胞内蛋白中纯化此类融合蛋白变得困难。此外，在三聚体生物药物设计中使用此类非人类蛋白质三聚化结构域(例如来自酵母、细菌噬菌体和细菌)的致命缺点是其在人体内的假定免疫原性，使得此类融合蛋白在注射到人体后不久就失效。
因此，在本文所述的重组多肽中使用胶原具有许多优点，包括：(1)胶原是哺乳动物体内分泌的最丰富的蛋白质，占体内总蛋白质的近25％；(2)胶原的主要形式天然地以三聚体螺旋形式出现，其球状C-前肽负责三聚化的启动；(3)从成熟胶原蛋白质水解释放的胶原的三聚体C-前肽在哺乳动物血液中以亚微克/毫升的水平天然存在，并且不知道对身体有毒；(4)胶原的线性三螺旋区域可以作为接头包含在内，预测每个残基的间距为2.9，或排除为融合蛋白的一部分，以便可精确调整待三聚化的蛋白质和胶原的C-前肽之间的距离，以实现最佳生物活性；(5)将C-前肽从原胶原上裂解下来的BMP1的识别位点可以被突变或删除，以防止三聚体融合蛋白的破坏；(6)C-前肽结构域通过二硫键自三聚化，并且它提供通用的亲和标签，可用于纯化产生的任何分泌性融合蛋白。在一些实施方案中，与冠状病毒抗原和免疫原(例如S蛋白肽)结合的胶原的C-前肽能够重组产生可溶性的、共价连接的同源三聚体融合蛋白。
在一些实施方案中，冠状病毒抗原或免疫原连接到胶原的C-末端前肽以形成重组多肽。在一些实施方案中，重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。在一些实施方案中，重组蛋白形成三聚体。在一些实施方案中，冠状病毒抗原或免疫原是如第I节中所述的S蛋白肽。
例如，可通过多肽间二硫键(可形成多肽间二硫键的Cys残基用粗体显示)产生融合多肽并使融合多肽三聚化，所述融合多肽包括SEQ ID NO:1中融合多肽的N-末端上的信号肽MFVFLVLLPLVSS(SEQ ID NO:54)。
Figure GDA0003496524170000371
Figure GDA0003496524170000381
在一些实施方案中，多肽间二硫键可包括Cys15-136、Cys131-166、Cys291-301、Cys379-432、Cys336-361、Cys391-525、Cys480-488、Cys538-590、Cys617-649、Cys662-671、Cys743-749、Cys738-760、Cys840-851、Cys1032-1043和Cys1082-1126中的一个或多个或全部，以任何合适的组合。在一些实施方案中，三聚体中的融合多肽可包括一个或多个糖基化位点(例如，Asn-连接的)，例如，在17、61、122、149、165、234、282、331、343、603、616、657、709、717、801、1074、1098和1134处的一个或多个或全部Asn残基处，以任何合适的组合。
在一些实施方案中，C-末端前肽为人胶原。在一些实施方案中，C-末端前肽包括proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C-末端多肽或其片段。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括proα1(I)的C-末端多肽。
在一些实施方案中，C-端前肽是或包括SEQ ID NO:67所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:67具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:68所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:68具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或是SEQ IDNO:69所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽显示与SEQ ID NO:69具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:70所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ IDNO:70具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:71所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:71具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:72所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:72具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:73所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:73具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或是SEQ IDNO:74所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽显示与SEQ ID NO:74具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:75所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ IDNO:75具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:76所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:76具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:77所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:77具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:78所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ ID NO:78具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或是SEQ IDNO:79所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽显示与SEQ ID NO:79具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括SEQ ID NO:80所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端前肽是与SEQ IDNO:80具有至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括胶原三聚结构域(例如，人α1(I)胶原的C-前肽)的氨基酸序列，在BMP-1位点中具有天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)的取代，例如，如SEQ ID NO:68中所示，其中RAD突变为RAN。在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括胶原三聚化结构域(例如，人α1(I)胶原的C-前肽)的氨基酸序列，在BMP-1位点中具有丙氨酸(A)到天冬酰胺(N)的取代，例如，如SEQ ID NO:69中所示，其中RAD突变为RND。在一些实施方案中，本文中的C-末端前肽可包括突变的BMP-1位点，例如，RSAN而不是DDAN。在一些实施方案中，本文中的C-末端前肽可包括BMP-1位点，例如，包含RAD(例如，RADDAN)序列而非RAN(例如，RANDAN)或RND(例如，RNDDAN)的序列(例如，SEQ ID NO:68或69)可用于本文中公开的融合多肽中。例如，SEQ ID NO:27(带下划线)或其片段、变体或突变体可直接或间接连接到SEQ ID NO:67(斜体)或其片段、变体或突变体，例如，以形成以下融合蛋白：
Figure GDA0003496524170000401
在一些实施方案中，C-末端前肽是或包括氨基酸序列，所述氨基酸序列是SEQ IDNO:67-80中任何一个的片段。
在一些实施方案中，C-末端前肽可包括包含甘氨酸-X-Y重复序列的序列，其中X和Y独立地为任何氨基酸，或与其至少85％、90％、92％、95％或97％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。在一些实施方案中，X和Y独立地为脯氨酸或羟脯氨酸。
在S蛋白肽连接到C-末端前肽以形成重组多肽的一些情况下，重组多肽形成三聚体，从而形成S蛋白肽的同源三聚体。在一些实施方案中，三聚化重组多肽的S蛋白肽处于融合前构象。在一些实施方案中，三聚化重组多肽的S蛋白肽处于融合后构象。在一些实施方案中，确认状态允许进入S蛋白肽上的不同抗原位点。在一些实施方案中，抗原位点是表位，例如线性表位或构象表位。具有所述三聚化重组多肽的优点是可以针对多种潜在和多样的抗原位点进行免疫应答。
在一些实施方案中，三聚化重组多肽包括包含相同的病毒抗原或免疫原的单个重组多肽。在一些实施方案中，三聚化重组多肽包括单个重组多肽，每个重组多肽包含不同于其它重组多肽的病毒抗原或免疫原。在一些实施方案中，三聚化重组多肽包括单个重组多肽，其中单个重组多肽中的一个包括不同于其它重组多肽的病毒抗原或免疫原。在一些实施方案中，三聚化重组多肽包括单个重组多肽，其中单个重组多肽中的两个包括相同的病毒抗原或免疫原，并且该病毒抗原或免疫原不同于包含在剩余重组多肽中的病毒抗原或免疫原。
在一些实施方案中，重组多肽包括第I节中所述的任何冠状病毒抗原或免疫原。在一些实施方案中，重组多肽包括如本文所述连接到如本文所述的胶原的C-末端前肽的第I节中所述的任何冠状病毒抗原或免疫原。
在一些实施方案中，免疫原包括重组SARS-CoV或SARS-CoV-2 S胞外域三聚体，其包括原聚体，所述原聚体在HR1结构域和中心螺旋结构域之间的边界处或附近包含一个或更多个(例如两个，例如两个连续的)脯氨酸取代，所述脯氨酸取代稳定了处于融合前构象的S胞外域三聚体。在一些这样的实施方案中，稳定了处于融合前构象的S胞外域的一个或更多个(例如两个，例如两个连续的)脯氨酸取代位于HR1的C-末端残基的15位氨基酸N-末端和中心螺旋的N-末端残基的5位氨基酸C-末端之间。
在一些实施方案中，一个或更多个(例如两个，例如两个连续的)脯氨酸取代稳定了处于融合前构象的冠状病毒(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2)S胞外域三聚体。在一些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白肽包括986K/987V向986P/987P的突变。
在一些实施方案中，处于融合前构象的被稳定了的重组冠状病毒(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2)S胞外域三聚体包括单链S胞外域原聚体，其包含S1/S2和/或S2′蛋白酶裂解位点的突变，以防止这些位点处的蛋白酶裂解。在一些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白肽包括685R向685A的突变。各种病毒的示例性蛋白酶裂解位点如下所示：
冠状病毒 S1/S2，位点1 S1/S2，位点2 S2’
2019-nCoV SPRRRA↓SVAS IAY↓TMS SKPSKR↓SF
CoV-ZX21 TASILR↓STGQ IAY↓TMS SKPSKR↓SF
Bat-AC45 TASIR↓STGQ IAY↓TMS SKPSKR↓SF
SARS-CoV TVSLLR↓STGQ IAY↓TMS LKPTKR↓SF
BM48-31 SSTLVR↓SGGH LAY↓TMS LKPTKR↓SF
HKU9-1 ADSLPR↓LQLV VNY↓DPL GATTYR↓SA
MERS-CoV TPRSCR↓SVPG GSRSAR↓SA
HKU1 SRRKRR↓SISA CGSSSR↓SF
HCoV-OC43 KNRRSR↓GAITT SKASSR↓SA
HCoV-229E IAVQPR↓NVSYD SRVAGR↓SA
HCoV-NL63 IPVRPR↓NSSDN SRIAGR↓SA
在一些实施方案中，通过一个或更多个脯氨酸取代(例如986P/987P取代)稳定了处于融合前构象的重组冠状病毒(例如，SARS-CoV或SARS-CoV-2)S胞外域三聚体的原聚体包括另外的修饰，用于处于融合前构象的稳定，例如在蛋白酶裂解位点处发生突变以阻止蛋白酶裂解。
参考作为SEQ ID NO:55提供的SARS-CoV-2 S蛋白质序列，胞外域包括信号肽(SP)，其在细胞加工过程中被去除；N-末端结构域(NTD)；受体结合结构域(RBD)；一个或更多个S1/S2裂解位点；融合肽(FP)；内部融合肽(IFP)；七肽重复序列1/2(HR1/2)和跨膜结构域(TM)。序列的示例性来源可在ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947.3、ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947、ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947.2上找到。另外的序列可在ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/上找到，包括肺炎病毒分离株Wuhan-Hu-1的完整基因组。
在一些实施方案中，融合前稳定的SARS-CoV-2 S胞外域三聚体的原聚体可具有NTD、RBD、S1(在S1/S2位点1或S1/S2位点2处)、FP、IFP、HR1、HR2或胞外域的C-末端残基的C-末端残基(其可连接到例如三聚化结构域或跨膜结构域)。S蛋白的位置编号可能在SARS-CoV毒株之间变化，但序列可以对齐以确定相关的结构域和裂解位点。应了解，任何胞外域片段的N-末端和C-末端上的一些残基(例如多达10个)可在所公开的免疫原中被移除或修饰，而不会降低S胞外域三聚体作为免疫原的效用。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白的NTD肽。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白的RBD肽。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白的NTD肽和RBD肽。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白的S1结构域肽。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SARS-CoV或SARS-CoV-2 S蛋白的S2结构域肽。
SEQ ID NO:26(1491aa)中提供了不含信号肽的示例性SARS-CoV-1 S重组多肽：
Figure GDA0003496524170000421
Figure GDA0003496524170000431
上述SARS-CoV-1 S重组多肽可包括SEQ ID NO:53中提供的N-末端信号肽。
SEQ ID NO:1(1509 aa)中提供了不含信号肽的示例性SARS-CoV-2 S重组多肽：
Figure GDA0003496524170000432
Figure GDA0003496524170000441
上述SARS-CoV-2 S重组多肽可包括SEQ ID NO:54中提供的N-末端信号肽。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:1中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:1具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:1的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:2中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:2具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:2的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:3中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:3具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:3的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:4中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:4具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:4的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:5中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:5具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:5的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:6中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:6具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:6的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:7中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:7具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:7的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:8中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:8具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:8的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:9中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:9具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ ID NO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:9的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:10中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:10具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:10的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:11中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:11具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:11的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:12中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:12具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:12的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:13中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:13具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:13的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:14中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:14具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:14的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:15中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:15具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:15的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:16中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:16具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:16的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:17中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:17具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:17的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:18中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:18具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:18的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:19中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:19具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:19的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:20中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:20具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:20的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:21中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:21具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:21的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:22中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:22具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:22的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:23中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:23具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:23的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:24中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:24具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:24的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:25中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:25具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在一个或更多个氨基酸位置(例如13、18、20、26、69、70、80、138、142、144、152、190、215、242、243、244、246、400、401、402、417、440、452、477、484、501、570、614、655、681、682、683、684、685、701、716、888、982、1027、1118和/或1176(关于SEQ IDNO:55的氨基酸位置)或其任何组合)处包含取代、缺失和/或插入的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:25的变体，并且变体包括选自由S13I、L18F、T20N、P26S、Δ69-70(ΔHV)、D80A、D138Y、G142D、Δ144(ΔY)、W152C、R190S、D215G、Δ242-244(ΔLAL)、R246I、Δ400-402(ΔFVI)、K417T、K417N、N440K、L452R、S477N、S477G、E484K、E484Q、N501Y、A570D、D614G、H655Y、P681H、P681R、R682G、R683S、R685G、A701V、T716I、F888L、S982A、T1027I、D1118H和V1176F或其任何组合组成的组中的任何一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
在一些实施方案中，重组多肽是或包括SEQ ID NO:26中所述的序列。在一些实施方案中，重组多肽是或包括与SEQ ID NO:26具有至少或约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO:26的一个或更多个氨基酸位置处包含取代、缺失和/或插入的序列。
如上所述，在一些实施方案中，本文提供的重组多肽不仅结合形成三聚体，而且还可以聚集或被聚集以产生包含多种重组多肽的蛋白质。在一些实施方案中，形成的蛋白质具有宏观结构。在一些情况下，宏观结构可赋予冠状病毒抗原或免疫原重组多肽的结构稳定性，其反过来又可提供进入能够促进免疫应答的潜在抗原位点。
在一些实施方案中，三聚化重组多肽聚集形成包含多种三聚化重组多肽的蛋白质。在一些实施方案中，多种三聚化重组多肽形成具有宏观结构的蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的包含多种重组多肽的蛋白质是免疫原。在一些实施方案中，本文所述的包含多种重组多肽的蛋白质包含在纳米颗粒中。例如，在一些实施方案中，蛋白质直接连接到纳米颗粒，例如蛋白质纳米颗粒。在一些实施方案中，蛋白质间接连接到纳米颗粒。在一些实施方案中，本文所述的包含多种重组多肽的蛋白质包含在病毒样颗粒(VLP)中。
在一些实施方案中，本文提供了复合物，其包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽或其片段、变体或突变体，以任何合适的组合。在一些实施方案中，本文提供了复合物，其包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽或其片段、变体或突变体的三聚体，其中重组多肽通过多肽间二硫键三聚化形成三聚体。
在一些实施方案中，本文提供了包含多个重组多肽的融合蛋白，每个重组多肽从氨基到羧基末端包括：a)第一区域，其包括位于第一冠状病毒的非嵌合冠状病毒刺突蛋白中的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)之前的冠状病毒刺突蛋白胞外域的一部分；b)第二区域，其包括不同于所述第一冠状病毒的第二冠状病毒的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)；和c)胶原的C-末端前肽，其中重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包括第二区域和胶原的C-末端前肽之间的第三区域。在一些实施方案中，第三区域包括第三冠状病毒的S1结构域，其中第三冠状病毒与第一冠状病毒或第二冠状病毒相同或不同。在一些实施方案中，第三区域包括第四冠状病毒的S2结构域，其中第四冠状病毒与第一、第二或第四冠状病毒相同或不同。在一些实施方案中，第一区域包括第一冠状病毒的N-末端结构域(NTD)。在一些实施方案中，第一区域包括与第二冠状病毒中的相应氨基酸残基不同的一个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，第二区域包括与第一冠状病毒中的相应氨基酸残基不同的一个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，第一和第二冠状病毒是相同冠状病毒的不同变种或毒株。在一些实施方案中，第一区域包括第一冠状病毒的NTD，第二区域包括第二冠状病毒的RBD，并且第一和第二冠状病毒是SARS-CoV-2的不同变种。在一些实施方案中，第一冠状病毒和第二冠状病毒独立选自由B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的SARS-CoV-2病毒组成的组。
在一些实施方案中，本文提供了包含三个重组多肽的三聚体融合蛋白，每个重组多肽从氨基到羧基末端包括：a)第一区域，其包括B.1.526谱系的SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白N-末端结构域(NTD)；b)第二区域，其包括B.1.351谱系的SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)；和c)胶原的C-末端前肽，其中重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。
在一些实施方案中，本文提供了用于预防哺乳动物中冠状病毒感染的方法，包括用本文公开的有效量的融合蛋白来免疫哺乳动物。在一些实施方案中，在哺乳动物中产生针对第一和第二冠状病毒的中和抗体。在一些实施方案中，第一和第二冠状病毒是SARS-CoV-2的不同变种，并且在哺乳动物中产生的中和抗体中和B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的两种或更多种SARS-CoV-2病毒。在一些实施方案中，在哺乳动物中产生的中和抗体中和B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的三种或更多种SARS-CoV-2病毒。在一些实施方案中，方法包括用两剂或更多剂的融合蛋白免疫哺乳动物。在一些实施方案中，在一剂或更多剂的免疫原(包括包含来自相同SARS-CoV-2变种的NTD和RBD的刺突蛋白肽)之后，以再次加强剂施用融合蛋白。
在一些实施方案中，本文提供了从包括SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的冠状病毒的刺突(S)糖蛋白衍生或修饰的工程化融合多肽。在一些实施方案中，与冠状病毒的野生型S蛋白序列相比，本文公开的融合多肽可稳定在融合前构象中。在一些实施方案中，与三聚化结构域的融合可防止融合蛋白中的S蛋白肽形成直螺旋(例如，类似于膜融合过程中发生的情况)。例如，S-三聚体亚单位候选疫苗的冷冻EM结构表明，它主要采用紧密闭合的融合前状态，与全长野生型刺突蛋白不同，后者在去污剂存在下形成融合前和融合后状态。Ma etal.,J Virol(2021)doi:10.1128/JVI.00194-21。在一些实施方案中，融合蛋白可以包括改变的可溶性S序列，具有使S1/S2裂解位点失活的修饰；七肽重复序列1(HR1)区域和中心螺旋(CH)区域之间的转角区域中的突变，阻止HR1和CH形成直螺旋；和/或除稳定突变外，七肽重复序列2区域(HR2)的截断。在一些实施方案中，本文中的融合蛋白可以但不必须包括一个或更多个突变，例如K986G/V987G、K986P/V987P、K986G/V987P或K986P/V987G，它们被认为稳定处于融合前状态的刺突蛋白。在一些实施方案中，突变例如K986G/V987G、K986P/V987P、K986G/V987P或K986P/V987G对于稳定本文公开的包含蛋白质三聚体化TM三聚化结构域的融合多肽不是必需的。
在这些实施方案中的一些实施方案中，使得S1/S2裂解位点失活的突变可以包含用GSAG(SEQ ID NO:60)取代RRAR(SEQ ID NO:55中的682-685)，并且转角区域中的突变可以包含双突变K986G/V987G、K986P/V987P、K986G/V987P或K986P/V987G。在一些实施方案中，HR2的截断必须在野生型可溶性S序列的C-末端删除SEQ ID NO:65中所示的一个或更多个残基。在一些实施方案中，免疫原多肽可以进一步包括在与HR2相互作用的HR1区域中的(a)一个或更多个脯氨酸或甘氨酸取代，和/或(b)一个或更多个氨基酸残基的插入。在这些实施方案中的一些实施方案中，免疫原多肽可以具有选自A942P、S943P、A944P、A942G、S943G和A944G的一个或更多个取代。在这些实施方案中的一些实施方案中，插入可以是在A942-A944中的任何残基之间插入G或GS。
2.多核苷酸和载体
还提供了编码本文提供的冠状病毒抗原或免疫原和重组多肽的多核苷酸(核酸分子)，以及用于基因工程化细胞以表达这种冠状病毒抗原或免疫原和重组多肽的载体。
在一些实施方案中，提供了编码本文提供的重组多肽的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸包含单个核酸序列，例如编码重组多肽的核酸序列。在其它实例中，多核苷酸包含编码重组多肽特别是冠状病毒抗原或免疫原的第一核酸序列和编码包含不同冠状病毒抗原或免疫原的重组多肽的第二核酸序列。
在一些实施方案中，编码重组多肽的多核苷酸包含至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组多肽的表达。
在一些实施方案中，例如当多核苷酸包含两个或更多个核酸编码序列，例如编码包含不同冠状病毒抗原或免疫原的重组多肽的序列时，至少一个启动子可操作地连接以控制两个或更多个核酸序列的表达。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组多肽的表达。
在一些实施方案中，重组多肽的表达是可诱导的或有条件的。因此，在一些方面，编码重组多肽的多核苷酸包含条件启动子、增强子或反式激活子。在一些这样的方面中，条件启动子、增强子或反式激活子是诱导型启动子、增强子或反式激活子或者是可抑制启动子、增强子或反式激活子。例如，在一些实施方案中，诱导型或条件启动子可用于将重组多肽的表达限制在特定微环境中。在一些实施方案中，由诱导型或条件启动子驱动的表达通过暴露于外源剂(例如热、辐射或药物)来调节。
在多核苷酸包含一个以上编码重组多肽的核酸序列的情况下，多核苷酸可以进一步包括编码一个或更多个核酸序列之间的肽的核酸序列。在一些情况下，位于核酸序列之间的核酸编码肽，所述肽在翻译期间或之后分离核酸序列的翻译产物。在一些实施方案中，肽包含内部核糖体进入位点(IRES)、自裂解肽或引起核糖体跳跃(skipping)的肽，例如T2A肽。
在一些实施方案中，编码重组多肽的多核苷酸被引入含有培养细胞(例如宿主细胞)的组合物中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化。在一些实施方案中，这可允许重组多肽的表达(例如产生)。在一些实施方案中，对表达的重组多肽进行纯化。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸(核酸分子)编码如本文所述的冠状病毒抗原或免疫原。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸(核酸分子)编码如本文所述的包含冠状病毒抗原或免疫原(例如冠状病毒S蛋白肽)的重组多肽。
还提供了含有如本文所述的核酸分子的载体或构建体。在一些实施方案中，载体或构建体包含一个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接到编码重组多肽的核酸分子以驱动其表达。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到一个或一个以上核酸分子，例如编码含有不同冠状病毒抗原或免疫原的重组多肽的核酸分子。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是γ-逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，载体或构建体包括单个启动子，其驱动多核苷酸的一个或更多个核酸分子的表达。在一些实施方案中，此类启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方案中，转录单元可以被工程化为包含IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的消息来共表达基因产物(例如，编码不同的重组多肽)。在一些实施方案中，本文提供的载体为双顺反子，允许载体包含并表达两个核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的载体为三顺反子，允许载体包含并表达三个核酸序列。
在一些实施方案中，单个启动子指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中包含两个或三个基因(例如编码嵌合信号传导受体和编码重组受体)，这些基因通过编码自裂解肽的序列(例如2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶)彼此分离。因此，ORF编码单个多肽，在翻译过程中(对于2A而言)或翻译后，该多肽被加工成单个蛋白质。在一些情况下，肽(例如T2A)可导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C-末端肽键的合成，导致2A序列末端与下游下一个肽之间的分离(参见，例如，de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipeet al.Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件是本领域已知的。可用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的实例包括但不限于如美国专利公开号20070116690中所述的来自口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、Thoseaasigna病毒(T2A)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A)的2A序列。
在一些实施方案中，载体包含在病毒中。在一些实施方案中，病毒为假病毒。在一些实施方案中，病毒为病毒样颗粒。在一些实施方案中，载体包含在细胞中。在一些实施方案中，包含载体的病毒或细胞包含重组基因组。
III.免疫原性组合物和制剂
在一些实施方案中，本文提供了免疫原性组合物，其包括重组多肽的三聚体，所述重组多肽包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的序列，或任何两种或更多种三聚体的组合。在一些实施方案中，本文提供了包含具有SEQ ID NO:1中所述的序列的重组多肽的三聚体的免疫原性组合物。
在一些实施方案中，单位剂量的免疫原性组合物可包括约10μg至约100μg SARS-CoV-2抗原、优选约25μg至约75μg SARS-CoV-2抗原、优选约40μg至约60μg SARS-CoV-2抗原或约50μg SARS-CoV-2抗原。在一些实施方案中，剂量包含3μg SARS-CoV-2抗原。在其它实施方案中，剂量包含9μg SARS-CoV-2抗原。在进一步的实施方案中，剂量包含30μg SARS-CoV-2抗原。
在一些情况下，可能需要将所公开的免疫原与诱导对其它试剂的保护性应答的其它制药产品(例如疫苗)联合。例如，包括如本文所述的重组冠状病毒S抗原(例如三聚体或蛋白质)的组合物可以与免疫实践咨询委员会(ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html)推荐的针对目标年龄组(例如，大约一到六个月大的婴儿)的其它疫苗(例如流感疫苗或水痘带状疱疹疫苗)同时(通常单独)或顺序施用。因此，包括本文所述的重组冠状病毒S抗原的公开的免疫原可以与针对例如乙型肝炎(HepB)、白喉、破伤风和百日咳(DTaP)、肺炎球菌(PCV)、b型流感嗜血杆菌(Hib)、脊髓灰质炎、流感和轮状病毒的疫苗同时或顺序施用。
多价或联合疫苗提供对多种病原体的抵御。在一些方面，多价疫苗可以抵御同一病原体的多种毒株。在一些方面，多价疫苗抵御多种病原体，例如联合疫苗Tdap，它抵御破伤风、百日咳和白喉的毒株。多价疫苗对于使对多种病原体或致病毒株赋予抵御所需的免疫接种的数量最小化是非常必要的，以降低管理成本，并提高覆盖率。例如，在为婴儿或儿童接种疫苗时，这可能特别有用。
在一些实施方案中，例如包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗是多价疫苗。在一些实施方案中，用于并入多价疫苗组合物的抗原材料来源于冠状病毒毒株或类型，例如如本文所述(参见，例如，第一节)。用于并入多价疫苗组合物的抗原可以来源于冠状病毒的一个毒株或多个毒株(例如，两个和五个毒株之间)，以提供更广泛的保护范围。在一个实施方案中，用于并入多价疫苗组合物的抗原来源于冠状病毒的多个毒株。其它有用的抗原包括活的、减毒的和灭活的病毒，例如灭活的脊髓灰质炎病毒(Jiang et al.,J.Biol.Stand.,(1986)14:103-9)、甲型肝炎病毒的减毒株(Bradley et al.,J.Med.Virol.,(1984)14:373-86)、减毒的麻疹病毒(James et al.,N.Engl.J.Med.,(1995)332:1262-6)以及百日咳病毒的表位(例如，ACEL-IMUNE无细胞DTP、Wyeth-Lederle疫苗和Pediatrics)。
在一些方面，本文提供的疫苗是通用疫苗。在一些实施方案中，通用疫苗是针对同一病毒的多种毒株(例如冠状病毒的多种毒株)进行保护的疫苗。开发有效的通用冠状病毒疫苗将降低成本和劳动力，例如使用季节性疫苗配方，并允许更强有力的大流行预防。
在一些方面，通用疫苗是由来源于不同病毒株的多个表位组成的疫苗。在一些方面，通用疫苗由在不同病毒株中保守的单个表位组成。例如，通用疫苗可以基于S蛋白的相对保守的结构域。
还提供了包含所公开的免疫原(例如，所公开的重组冠状病毒S抗原或编码所公开的重组冠状病毒S抗原的原聚体的核酸分子)和药学上可接受的载体的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的三聚化重组多肽和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括包含本文提供的多个三聚化重组多肽的蛋白质以及可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的蛋白质纳米颗粒和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的VLP和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的分离核酸和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的载体和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的病毒和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的假病毒和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的细胞和可选的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物是疫苗。在一些实施方案中，疫苗是预防性疫苗。在一些实施方案中，疫苗是治疗性疫苗。在一些实施方案中，疫苗是预防性疫苗和治疗性疫苗。此类药物组合物可通过本领域普通技术人员已知的多种给药模式向受试者给药，例如，肌肉内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹腔内、鼻内、舌下、扁桃体、口咽或其它肠胃外和粘膜途径。在几个实施方案中，包括一个或更多个所公开的免疫原的药物组合物是免疫原性组合物。用于制备可给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在例如Remingtons Pharmaceutical Sciences,19th Ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1995这种出版物中进行了更详细的描述。
因此，本文所述的免疫原，例如重组冠状病毒S抗原，例如三聚体、蛋白质，可与药学上可接受的载体调配，以帮助保持生物活性，同时也促进在可接受温度范围内储存期间的稳定性增加。潜在的载体包括但不限于生理平衡培养基、磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)、各种类型的润湿剂、防冷冻添加剂或稳定剂，例如蛋白质、肽或水解产物(例如，白蛋白、明胶)、糖(例如，蔗糖、乳糖、山梨醇)、氨基酸(例如，谷氨酸钠)或其它保护剂。所得的水溶液可按原样包装使用或冻干。冻干制剂在单剂量或多剂量给药前与无菌溶液混合。
配方组合物，尤其是液体制剂，可含有抑菌剂，以防止或最小化储存期间的降解，包括但不限于有效浓度(通常为1％w/v)的苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。一些患者可能禁用抑菌剂；因此，冻干制剂可在含有或不含有此类成分的溶液中重新组合。
本发明的免疫原性组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的载体物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾，氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。免疫原性组合物可以可选地包括佐剂以增强宿主的免疫应答。合适的佐剂例如为toll样受体(TLR)激动剂、明矾、AlPO4、水凝胶(alhydrogel)、脂质-A及其衍生物或变体、油乳剂、皂甙、中性脂质体、含有疫苗和细胞因子的脂质体、非离子嵌段共聚物和趋化因子。本领域众所周知的许多其它合适的佐剂中的含有聚氧乙烯(polyoxyethylene,POE)和聚氧丙烯(polyxylpropylene,POP)的非离子嵌段聚合物可作为佐剂使用，例如POE-POP-POE嵌段共聚物、MPLTM(3-O-脱酰基单磷酸脂A；Corixa,Hamilton,Ind.)和IL-12(Genetics Institute,Cambridge,Mass.)(Newman et al.,1998,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems15:89-142)。这些佐剂的优点在于，它们有助于以非特异性的方式刺激免疫系统，从而增强对药物产品的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包括或与一种以上佐剂一起施用。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包括或与两种佐剂一起施用。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包括或与多种佐剂一起施用。例如，在一些情况下，例如包含本文提供的免疫原性组合物的疫苗可包括或与多种佐剂联合施用。
对于疫苗组合物，合适佐剂的实例包括，例如氢氧化铝、卵磷脂、Freund’s佐剂、MPLTM和IL-12。在一些实施方案中，本文公开的疫苗组合物或纳米颗粒免疫原(例如，SARS-COV-2疫苗组合物)可配制为控释或缓释制剂。这可以通过含有缓释聚合物的组合物或通过微胶囊递送系统或生物粘附凝胶来实现。各种药物组合物可根据本领域众所周知的标准程序制备。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含佐剂制剂，所述佐剂制剂包含水包油乳液形式的可代谢油(例如角鲨烯)和α-生育酚，以及聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐温-80)。在一些实施方案中，佐剂制剂可包括约2％至约10％角鲨烯、约2％至约10％α-生育酚(例如，D-α-生育酚)和约0.3％至约3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，佐剂制剂可包括约5％角鲨烯、约5％生育酚和约0.4％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含3个脱O-酰化单磷酸脂A(3D-MPL)和水包油乳液形式的佐剂，该佐剂包含可代谢油、α-生育酚和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含QS21(Quillajasaponaria Molina提取物：组分21)、3D-MPL和水包油乳液，其中水包油乳液包括可代谢油、α-生育酚和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含QS21、3D-MPL和水包油乳液，其中水包油乳液具有以下组合物：可代谢油，例如角鲨烯、α-生育酚和吐温-80。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含脂质体组合物形式的佐剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含佐剂制剂，所述佐剂制剂包含可代谢的油(例如，角鲨烯)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐温-80)和Span 85。在一些实施方案中，佐剂制剂可包括约5％(w/v)角鲨烯、约0.5％(w/v)聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和约0.5％(w/v)Span 85。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含佐剂制剂，所述佐剂制剂包含皂树(Quillaja)皂苷、胆固醇和磷脂，例如，以纳米颗粒组合物的形式。在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含单独纯化的Quillajasaponaria Molina部分的混合物，其中随后与胆固醇和磷脂调配。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含选自由MF59TM、Matrix-ATM、Matrix-CTM、Matrix-MTM、AS01、AS02、AS03和AS04组成的组的佐剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含toll样受体9(TLR9)激动剂，其中TLR9激动剂为长度为8至35个核苷酸的寡核苷酸，包含未甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷(也称为CpG或胞嘧啶-磷酸-鸟苷)基序，并且SARS-CoV-2抗原和寡核苷酸以有效刺激哺乳动物受试者(例如需要SARS-CoV-2抗原和寡核苷酸的人类受试者)中针对SARS-CoV-2抗原的免疫应答的量存在于免疫原性组合物中。TLR9(CD289)识别微生物DNA中发现的未甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷(CpG)基序，可使用合成的含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)对其进行模仿。已知CpG-ODN可增强抗体产生并刺激T辅助细胞1(Th1)细胞应答(Coffman et al.,Immunity,33:492-503,2010)。最佳寡核苷酸TLR9激动剂通常包含以下通式的回文序列：5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-CG-3’。美国专利号6,589,940，其以其全文形式被援引加入本文。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸是线性的。在其它实施方案中，CpG寡核苷酸是环状的或包括发夹环。CpG寡核苷酸可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸可包含修饰。修饰包括但不限于3’OH或5’OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸基团的修饰。只要经修饰的碱基通过Watson-Crick碱基配对对其天然补体保持相同的特异性(例如，回文部分仍然是自我互补的)，经修饰的碱基可以包括在CpG寡核苷酸的回文序列中。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸包括非经典碱基。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸包括经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷选自由2’-脱氧-7-脱氮鸟苷(2’-deoxy-7-deazaguanosine)、2’-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷(arabinoguanosine)、2’-脱氧-2’取代-阿糖鸟苷和2’-O-取代-阿糖鸟苷。CpG寡核苷酸可能包含磷酸基团的修饰。例如，除了磷酸二酯键之外，磷酸修饰包括但不限于膦酸甲酯、硫代磷酸酯、磷酰胺(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以以任何组合使用。也可使用其它非磷酸键。在一些实施方案中，寡核苷酸仅包括硫代磷酸酯主链。在一些实施方案中，寡核苷酸仅包括磷酸二酯主链。在一些实施方案中，寡核苷酸包括磷酸主链中的磷酸键的组合，例如磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸可以比具有磷酸二酯主链的寡核苷酸具有更高的免疫原性，并且在注射到宿主中后似乎更耐降解(Braun et al.,J Immunol,141:2084-2089,1988；和Latimeret al.,Mol Immunol,32:1057-1064,1995)。本发明的CpG寡核苷酸包括至少一个、两个或三个核苷酸间硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，当多个CpG寡核苷酸分子存在于包含至少一种赋形剂的药物组合物中时，硫代磷酸酯键的两个立体异构体存在于多个CpG寡核苷酸分子中。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯键，或者换句话说，CpG寡核苷酸具有硫代磷酸酯主链。
在本发明中，任何合适的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)或其组合可用作佐剂。例如，K型ODN(也称为B型)编码硫代磷酸酯主链上的多个CpG基序。K型ODN可基于以下序列
Figure GDA0003496524170000621
与天然磷酸二酯核苷酸相比，硫代磷酸酯核苷酸的使用增强了对核酸酶消化的抵抗力，从而导致体内半衰期显著延长。K型ODN引发pDC分化并产生TNF-α，并引发B细胞增殖并分泌IgM。D型ODN(也称为A型)由混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯主链构成，包含单个CpG基序，两侧为回文序列，并在3’和5’端具有多聚G尾巴(促进串联体形成的结构基序)。D型ODN可基于以下序列GGTGCATCGATGCAGGGGGG。D型ODN引发pDC成熟并分泌IFN-α，但对B细胞无影响。C型ODN与K型相似，完全由硫代磷酸酯核苷酸组成，但与D型ODN相似，包含回文CpG基序。C型ODN可基于以下序列
Figure GDA0003496524170000622
这类ODN刺激B细胞分泌IL-6和pDC以产生IFN-α。P型ODN包含两个回文序列，使得它们能够形成更高的有序结构。P型ODN可基于以下序列
Figure GDA0003496524170000623
与C型ODN相比，P型ODN激活B细胞和PDC，并诱导更大量IFN-α产生。在本段中，ODN序列中的粗体字表示自我互补回文，CpG基序加下划线。
示例性CpG ODN，例如CpG 7909(5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’)和CpG 1018(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’)，是已知的并且公开于美国专利号7,255,868、7,491,706、7,479,285、7,745,598、7,785,610、8,003,115、8,133,874、8,114,418、8,222,398、8,333,980、8,597,665、8,669,237、9,028,845和10,052,378；和Bode et al.,“CpG DNA as avaccine adjuvant”,Expert Rev Vaccines(2011),10(4):499-511中，所有这些均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
一种或更多种佐剂可组合使用，包括但不限于明矾(铝盐)、水包油乳液、油包水乳液、脂质体和微粒，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)微粒(Shah et al.,Methods Mol Biol,1494:1-14,2017)。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包括吸附SARS-CoV-2抗原的铝盐佐剂。在一些实施方案中，铝盐佐剂包括由无定形羟基磷酸铝硫酸盐、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾组成的组中的一种或更多种。在一些实施方案中，铝盐佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝中的一种或两者。在一些实施方案中，铝盐佐剂包括氢氧化铝。在一些实施方案中，单位剂量的免疫原性组合物包括约0.25至约0.50mg Al3+，或约0.35mg Al3+。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包括另外的佐剂。其它合适的佐剂包括但不限于水包角鲨烯乳液(例如，MF59或AS03)、TLR3激动剂(例如，聚IC或聚ICLC)、TLR4激动剂(例如，细菌脂多糖衍生物，如单磷酸脂A(MPL)，和/或皂甙，如Quil A或QS-21，如AS01或AS02)、TLR5激动剂(细菌鞭毛蛋白)和TLR7、TLR8和/或TLR9激动剂(咪唑喹啉衍生物，例如咪喹莫特和瑞喹莫特)(Coffman et al.,Immunity,33:492-503,2010)。在一些实施方案中，另外的佐剂包括MPL和明矾(例如AS04)。对于兽医用途和对于非人类动物抗体的生产，可以使用Freund’s佐剂的促有丝分裂成分(完整的和不完整的)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物包括药学上可接受的赋形剂，包括例如溶剂、填充剂、缓冲剂、张力调节剂和防腐剂(Pramanick et al.,Pharma Times,45:65-77,2013)。在一些实施方案中，免疫原性组合物可包括赋形剂，其充当溶剂、填充剂、缓冲剂和张力调节剂中的一种或更多种(例如，盐水中的氯化钠可同时用作水性载体和张力调节剂)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物包括作为溶剂的水性载体。合适的载体包括例如无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水和Ringer’s溶液。在一些实施方案中，组合物是等渗的。
免疫原性组合物可包括缓冲剂。缓冲剂控制pH，以抑制在处理、储存和可选地重构期间活性剂的降解。合适的缓冲剂包括例如包含醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐的盐。其它合适的缓冲剂包括例如氨基酸，例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。缓冲剂可以进一步包括盐酸或氢氧化钠。在一些实施方案中，缓冲剂将组合物的pH保持在6到9的范围内。在一些实施方案中，pH大于(下限)6、7或8。在一些实施方案中，pH小于(上限)9、8或7。也就是说，pH在约6到9的范围内，其中下限小于上限。
免疫原性组合物可包括张力调节剂。合适的张力调节剂包括例如葡萄糖、甘油(glycerol)、氯化钠、甘油(glycerin)和甘露醇。
免疫原性组合物可包括填充剂。当在给药前将药物组合物冻干时，填充剂特别有用。在一些实施方案中，填充剂是保护剂，有助于在冷冻或喷雾干燥期间和/或在储存期间稳定和防止活性剂降解。合适的填充剂为糖(单、双和多糖)，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖和棉子糖。
免疫原性组合物可包括防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗菌剂。然而，在优选实施方案中，免疫原性组合物在无菌条件下制备并在一次性容器中，因此不需要包含防腐剂。
在一些实施方案中，组合物可作为无菌组合物提供。药物组合物通常包含有效量的所公开的免疫原，并且可以通过常规技术制备。通常，选择每剂量免疫原性组合物中免疫原的量作为诱导免疫应答而无显著不良副作用的量。在一些实施方案中，组合物可以单位剂型提供，用于诱导受试者的免疫应答。单位剂型包含用于给受试者施用的合适的单个预选剂量，或两个或更多个预选单位剂量的合适标记的或测量的倍数，和/或用于施用单位剂量或其倍数的计量机构。在其它实施方案中，组合物进一步包括佐剂。
IV.诱导免疫应答的方法
在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，其中表面抗原包括S蛋白或其抗原片段，并且方法包括向受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，其中表面抗原包括选自由SEQ ID NO:27-66组成的组的序列，并且方法包括向受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，其中表面抗原包括冠状病毒的S蛋白或其抗原片段，并且可选地，表面抗原包括SEQ ID NO:55中所述的序列或其抗原片段，并且方法包括向受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括重组多肽，所述重组多肽包括SEQ ID NO:10-25中任一项所述的序列。
在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，其中表面抗原包括S蛋白或其抗原片段，并且方法包括向受试者施用有效量的复合物或复合物中任何两种或更多种的组合，所述复合物包括重组多肽，所述重组多肽包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的序列。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括重组多肽，所述重组多肽包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13中所述的序列。
可以向受试者施用所公开的免疫原(例如，重组冠状病毒S抗原，例如，本文所述的S-三聚体或S蛋白，编码所公开的重组冠状病毒S抗原的原聚体的核酸分子(例如RNA分子)或载体，或包含所公开的重组冠状病毒S抗原的蛋白质纳米颗粒或病毒样颗粒)，以诱导对受试者中相应冠状病毒S抗原的免疫应答。在特定的示例中，受试者是人。免疫应答可以是保护性免疫应答，例如抑制随后相应冠状病毒感染的应答。免疫应答的激发也可用于治疗或抑制与相应冠状病毒相关的感染和疾病。
可以选择受试者进行具有或处于感染冠状病毒的风险中的治疗，例如因为暴露于或可能暴露于冠状病毒。在施用所公开的免疫原后，可以监测受试者的感染或与冠状病毒相关的症状，或两者。
拟用本发明的疗法和方法进行治疗的典型受试者包括人类以及非人类灵长类和其它动物。为了鉴定根据本发明的方法进行预防或治疗的受试者，采用可接受的筛查方法来确定与目标或疑似疾病或病症相关的风险因素，或确定受试者中现有疾病或病症的状态。这些筛查方法包括，例如常规检查，以确定可能与目标或疑似疾病或病症相关的环境、家族、职业和其它此类风险因素，以及诊断方法，例如用于检测和/或表征冠状病毒感染的各种ELISA和其它免疫分析方法。这些和其它常规方法允许临床医生使用本发明的方法和药物组合物选择需要治疗的患者。根据这些方法和原则，可以根据本文的教导或其它常规方法施用组合物，作为独立的预防或治疗方案，或作为其它治疗的后续、辅助或协调治疗方案。
施用所公开的免疫原(例如，冠状病毒S抗原，例如，三聚体、蛋白质)可用于预防性或治疗性目的。当预防性地提供时，所公开的治疗剂在任何症状之前提供，例如在感染之前。所公开的治疗剂的预防性施用用于预防或改善任何后续感染。当治疗性地提供时，所公开的治疗剂在疾病或感染症状开始时或之后提供，例如，在与冠状病毒S抗原对应的冠状病毒感染症状发展之后，或在诊断冠状病毒感染之后。因此，可以在预期暴露于冠状病毒之前提供治疗剂，以便在暴露于或怀疑暴露于病毒之后，或在实际开始感染之后，减弱感染和/或相关疾病症状的预期严重程度、持续时间或程度。
本文所述的免疫原及其免疫原性组合物以有效诱导或增强受试者(优选为人类)针对冠状病毒S抗原的免疫应答的量提供给受试者。所公开的免疫原的实际剂量将根据例如受试者的疾病迹象和特定状态(例如，受试者的年龄、大小、健康状况、症状程度、易感因素等)、给药时间和途径、同时给药的其它药物或治疗等因素以及组合物在受试者中激发所需活性或生物反应的特定药理学而变化。剂量方案可以调整，以提供最佳的预防或治疗反应。
包括一种或更多种所公开的免疫原的免疫原性组合物可用于协调(或初免-加强)疫苗接种方案或组合制剂中。在某些实施方案中，新的组合免疫原性组合物和协调免疫方案使用单独的免疫原或制剂，每种免疫原或制剂均旨在引发抗病毒免疫应答，例如对冠状病毒S抗原的免疫应答。引发抗病毒免疫应答的单独免疫原性组合物可以在单个免疫步骤中组合在向受试者施用的多价免疫原性组合物中，或者它们可以在协调(或初免-加强)免疫方案中单独施用(在单价免疫原性组合物中)。
可以有几个加强剂，每个加强剂可以是不同的所公开的免疫原。在一些示例中，加强剂可以是与另一加强剂或初免剂相同的免疫原。初免剂和加强剂可作为单剂量或多剂量施用，例如，可在几天、几周或几个月内向受试者施用两剂、三剂、四剂、五剂、六剂或更多。也可以进行多次加强剂，例如一到五次(例如，1、2、3、4或5次加强剂)或更多次。不同剂量可用于一系列连续免疫。例如，在初级免疫中使用相对较大的剂量，然后使用相对较小的剂量进行增强。
在一些实施方案中，可在初免剂后约两周、约三到八周或约四周或者初免后约几个月施用加强剂。在一些实施方案中，可在初免剂后约5、约6、约7、约8、约10、约12、约18、约24个月或者初免剂后或多或少时间施用加强剂。也可以在适当的时间点定期使用另外的加强剂，以增强受试者的“免疫记忆”。选择的疫苗参数的适合性，例如制剂、剂量、方案等，可通过从受试者中取出等份血清并在免疫程序期间测定抗体滴度来确定。此外，可监测受试者的临床状况以获得预期效果，例如预防感染或改善疾病状态(例如降低病毒载量)。如果此类监测表明疫苗接种是次优的，则可以使用额外剂量的免疫原性组合物使受试者得到加强，并且可以以预期增强免疫应答的方式改进疫苗接种参数。
在一些实施方案中，初免-加强方法可以包括针对受试者的DNA-引物和蛋白质-加强疫苗接种方案。该方法可以包括两次或更多次施用核酸分子或蛋白质。
对于蛋白质疗法，通常，每个人体剂量将包括1-1000μg的蛋白质，例如从约1μg到约100μg，例如从约1μg到约50μg，例如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg或约50μg。
免疫原性组合物中使用的量基于受试人群(例如，婴儿或老年人)进行选择。通过涉及观察受试者中的抗体滴度和其它反应的标准研究，可以确定特定成分的最佳用量。应理解，所公开的免疫原(例如所公开的重组冠状病毒S抗原，例如免疫原性组合物中的三聚体、蛋白质、病毒载体或核酸分子)的治疗有效量可以包括在通过单剂量给药诱导免疫应答时无效但在多剂量给药时有效的量，例如在初免-加强给药方案中。
在施用本发明所公开的免疫原后，受试者的免疫系统通常通过产生对免疫原中包含的冠状病毒S蛋白肽具有特异性的抗体来对免疫原性组合物作出反应。这种反应意味着向受试者递送了免疫有效剂量。
在一些实施方案中，将在评估有效剂量/免疫方案的情况下确定受试者的抗体反应。在大多数情况下，评估从受试者获得的血清或血浆中的抗体滴度就足够了。关于是否给予再次加强接种和/或改变给予个体的治疗剂的量的决定可以至少部分地基于抗体滴度水平。抗体滴度水平可以基于例如免疫结合分析，该免疫结合分析测量血清中结合抗原(包括例如重组冠状病毒S抗原，例如S-三聚体)的抗体的浓度。
无需完全消除、减少或防止冠状病毒感染，方法即可有效。例如，与在没有免疫原的情况下的冠状病毒感染相比，用一种或更多种所公开的免疫原激发对冠状病毒的免疫应答可以减少或抑制希望量的冠状病毒感染，例如至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、甚至至少100％(消除或防止可检测到的感染的细胞)。在另外的示例中，可以通过所公开的方法减少或抑制冠状病毒复制。不需要完全消除冠状病毒复制，方法即可有效。例如，与在没有免疫应答的情况下的冠状病毒复制相比，用一种或更多种所公开的免疫原激发免疫应答可以减少希望量的相应冠状病毒复制，例如，至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、甚至至少100％(消除或防止可检测到的冠状病毒复制)。
在一些实施方案中，在施用佐剂的同时向受试者施用所公开的免疫原。在其它实施方案中，在施用佐剂之后并在足够的时间内向受试者施用所公开的免疫原以诱导免疫应答。
核酸给药的一种方法是用质粒DNA直接免疫，例如用哺乳动物表达质粒。通过核酸构建体进行免疫是本领域众所周知的，并且披露于例如美国专利号5,643,578(其描述了通过引入编码所需抗原的DNA以引发细胞介导的或体液应答来免疫脊椎动物的方法)以及美国专利号5,593,972和5,817,637(其描述了将编码抗原的核酸序列可操作地连接到能够表达的调控序列)。美国专利号5,880,103描述了几种将编码免疫原性肽或其它抗原的核酸递送至生物体的方法。方法包括核酸(或它们自己的合成肽)和免疫刺激构建体或ISCOMSTM的脂质体递送，ISCOMSTM是胆固醇和Quil ATM(皂甙)混合后自发形成的30-40nm大小的带负电荷的笼状结构。使用ISCOMSTM作为抗原的递送载体已经在各种感染(包括弓形虫病和EB病毒诱导的肿瘤)的实验模型中产生了保护性免疫(Mowat and Donachie,Immunol.Today 12:383,1991)。已发现低至1μg的封装在ISCOMSTM中的抗原剂量产生I类介导的CTL反应(Takahashi et al.,Nature 344:873,1990)。
在一些实施方案中，质粒DNA疫苗用于在受试者中表达所公开的免疫原。例如，可将编码所公开的免疫原的核酸分子施用给受试者以诱导对冠状病毒S抗原的免疫应答。在一些实施方案中，核酸分子可以包括在用于DNA免疫的质粒载体上，例如pVRC8400载体(如Barouch et al.,J.Virol,79,8828-8834,2005中所述，其被援引加入本文)。
在使用核酸进行免疫的另一种方法中，所公开的重组冠状病毒S抗原(例如三聚体、蛋白质)可以通过减毒的病毒宿主或载体或细菌载体来表达。重组牛痘病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒、巨细胞病毒(cytogmeglo virus)或其它病毒载体可用于表达肽或蛋白质，从而引发CTL反应。例如，美国专利号4,722,848中描述了在免疫规划中有用的牛痘载体和方法。卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)提供了另一种用于表达肽的载体(参见Stover,Nature 351:456-460,1991)。
在一个实施方案中，将编码所公开的重组冠状病毒S抗原的核酸直接引入细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸装载到金微球上，并通过诸如Bio-Rad的HELIOSTM基因枪等设备将其引入皮肤中。核酸可以是“裸露的”，由强启动子控制下的质粒组成。通常，DNA被注射到肌肉中，但也可以直接注射到其它部位。注射剂量通常约为0.5μg/kg至约50mg/kg，并且典型地约为0.005mg/kg至约5mg/kg(参见，例如，美国专利号5,589,466)。
例如，可以通过标准方法将核酸装载到金微球上，并通过诸如Bio-Rad的HELIOSTM基因枪等设备将其引入皮肤中。核酸可以是“裸露的”，由强启动子控制下的质粒组成。通常，DNA被注射到肌肉中，但也可以直接注射到其它部位。注射剂量通常约为0.5μg/kg至约50mg/kg，并且典型地约为0.005mg/kg至约5mg/kg(参见，例如，美国专利号5,589,466)。
在另一实施方案中，基于mRNA的免疫方案可用于将编码所公开的重组冠状病毒S抗原的核酸直接递送到细胞中。在一些实施方案中，基于mRNA的核酸疫苗可提供对前述方法的有效替代。mRNA疫苗排除了DNA整合到宿主基因组的安全性问题，并且可以直接在宿主细胞细胞质中翻译。此外，RNA的简单无细胞的体外合成避免了与病毒载体相关的制造并发症。可用于递送编码所公开的重组冠状病毒S抗原的核酸的两种基于RNA的疫苗的示例性形式包括常规非扩增mRNA免疫(参见，例如，Petsch et al.,“Protective efficacy of invitro synthesized,specific mRNA vaccines against influenza A virusinfection,”Nature biotechnology,30(12):1210-6,2012)和自扩增mRNA免疫(参见，例如，Geall et al.,“Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,”PNAS,109(36):14604-14609,2012；Magini et al.,“Self-Amplifying mRNA Vaccines ExpressingMultiple Conserved Influenza Antigens Confer Protection against Homologousand Heterosubtypic Viral Challenge,”PLoS One,11(8):e0161193,2016；和Brito etal.,“Self-amplifying mRNA vaccines,”Adv Genet.,89:179-233,2015)。
在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的一种或更多种所公开的免疫原可诱导受试者中的中和免疫应答。为评估中和活性，在受试者免疫后，可在适当的时间点从受试者收集血清，冷冻并储存以进行中和试验。中和活性的测定方法是本领域普通技术人员已知的，并在此进一步描述，包括但不限于蚀斑减少中和(PRNT)测定、微量中和测定、基于流式细胞术的测定、单周期感染测定。在一些实施方案中，可使用一组冠状病毒假病毒来测定血清中和活性。
在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的一种或更多种所公开的免疫原可诱导受试者中的中和免疫应答。为评估中和活性，在受试者免疫后，可在适当的时间点从受试者收集血清，冷冻并储存以进行中和试验。中和活性的测定方法是本领域普通技术人员已知的，并在此进一步描述，包括但不限于蚀斑减少中和(PRNT)测定、微量中和测定、基于流式细胞术的测定、单周期感染测定。在一些实施方案中，可使用一组冠状病毒假病毒来测定血清中和活性。
在一些实施方案中，由本文公开的免疫原诱导的中和免疫应答产生针对冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的中和抗体。在一些实施方案中，本文的中和抗体结合到冠状病毒(例如SARS-CoV-2)或其组分的细胞受体或共同受体。在一些实施方案中，病毒受体或共同受体是冠状病毒受体或共同受体，优选是肺炎病毒受体或共同受体，更优选是人冠状病毒受体，例如SARS-CoV-2受体或共同受体。在一些实施方案中，本文的中和抗体在体外、在原位和/或在体内调节、减少、拮抗、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种冠状病毒(例如SARS-CoV-2)活性或结合，或冠状病毒(例如SARS-CoV-2)受体活性或结合，例如SARS-CoV-2释放、SARS-CoV-2受体信号传导、膜SARS-CoV-2裂解、SARS-CoV-2活性、SARS-CoV-2产生和/或合成。在一些实施方案中，本文公开的免疫原诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体，其调节、减少、拮抗、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰SARS-CoV-2与SARS-CoV-2受体或共同受体的结合，例如血管紧张素转换酶2(ACE2)、二肽基肽酶4(DPP4)、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合素(DC-SIGN)和/或肝脏/淋巴结-SIGN(L-SIGN)。
V.制品或试剂盒
还提供了含有所提供的重组多肽、蛋白质和免疫原性组合物的制品或试剂盒。制品可以包括容器以及容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV溶液袋等。容器可以由各种材料(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，容器具有无菌进入口。示例性容器包括静脉注射溶液袋、小瓶，包括带有可被注射用针刺穿的塞子的容器。制品或试剂盒可以进一步包括包装说明书，其指示组合物可用于治疗特定病症，例如本文所述的病症(例如冠状病毒感染)。或者，或者另外地，制品或试剂盒可以进一步包括包含药学上可接受的缓冲液的另一或相同容器。它可以进一步包括其它材料，例如其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和/或注射器。
标签或包装说明书可以表明组合物用于治疗个体的冠状病毒感染。容器上或与容器相关的标签或包装说明书可以表明制剂的重组和/或使用说明。标签或包装说明书可以进一步表明制剂用于或目的在于皮下、静脉或其它给药方式，以治疗或预防个体中的冠状病毒感染。
在一些实施方案中，容器容纳组合物，该组合物是单独地或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合。制品或试剂盒可以包括(a)第一容器，具有包含在其中的组合物(即，第一药剂)，其中组合物包括免疫原性组合物或其蛋白质或重组多肽；和(b)第二容器，具有包含在其中的组合物(即，第二药剂)，其中组合物包括另一种药剂，例如佐剂或其它治疗剂，并且该物品或试剂盒进一步包括标签或包装说明书上用第二药剂以有效量治疗受试者的说明。
术语
除非另有定义，否则本文中使用的所有专用术语、符号和其它技术和科学术语(term)或术语(terminology)的含义旨在与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定表示与本领域中通常理解的内容的实质性差异。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其它多肽，例如接头或肽)可包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，只要蛋白质保持所需的活性，多肽可包含关于天然(native)或天然(natural)序列的修饰。这些修饰可以是故意的，如通过定点突变，也可以是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增产生的错误。
如本文所使用的，“受试者”是哺乳动物，例如人类或其它动物，并且通常是人类。在一些实施方案中，向其施用一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，例如人类。在一些实施方案中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄段，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，例如啮齿动物。
如本文所使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指完全或部分改善或减少疾病、病症或紊乱，或与之相关的症状、不良反应或结果、或表型。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。该术语并不意味着完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。
如本文所使用的，“延缓疾病的发展”是指延缓、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延迟疾病(例如癌症)的发展。取决于疾病史和/或接受治疗的个体，延缓的时间长度可能不同。在一些实施方案中，充分或显著的延缓实际上可以包含预防，因为个体不会发生疾病。例如，晚期癌症，如转移的发展，可能会延缓。
如本文所使用的，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未被诊断患有疾病的受试者的疾病发生或复发提供预防。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所使用的，“抑制”功能或活性是指当与除感兴趣的条件或参数之外的其它相同条件相比或者与另一条件相比时，降低功能或活性。例如，与没有细胞时的肿瘤生长速度相比，抑制肿瘤生长的细胞会降低肿瘤的生长速度。
在给药的情况下，药剂(例如药物制剂、细胞或组合物)的“有效量”是指达到预期效果(例如治疗或预防效果)所需的剂量/量和时间段的有效量。
药剂(例如药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指达到预期治疗效果(例如用于治疗疾病、病症或紊乱)和/或治疗的药代动力学或药效学效果所需的剂量和时间段的有效量。治疗有效量可根据例如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指达到预期预防效果所需的剂量和时间段的有效量。通常但不一定的是，因为预防剂量用于疾病之前或早期阶段的受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负担较低的情况下，一些方面的预防有效量将高于治疗有效量。疫苗或其它药剂的有效量，足以产生期望的反应，如减少或消除病症或疾病的病征或症状，如肺炎。例如，这可能是抑制病毒复制或可测定地改变病毒感染的外部症状所必需的量。一般来说，这一数量将足以可测定地抑制病毒(例如，SARS-CoV-2)复制或传染性。当向受试者给药时，通常使用的剂量将达到目标组织浓度，该浓度已被证明能够在体外实现病毒复制的抑制。在一些实施方案中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一个或更多个症状和/或潜在原因的量，例如用于治疗冠状病毒感染。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量。在一些实施方案中，有效量是防止特定疾病或病症的一个或更多个病征或症状发展的量，例如与冠状病毒感染相关的一个或更多个病征或症状。
如本文所使用的，术语“抗原”或“免疫原”可互换地用于指代能够在受试者中诱导免疫应答的物质，通常为蛋白质。该术语还指免疫活性蛋白质，即一旦施用给受试者(直接或通过向受试者施用编码蛋白质的核苷酸序列或载体)，能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。除非另有说明，否则术语“疫苗免疫原”可与“蛋白质抗原”或“免疫原多肽”互换使用。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。对于多肽序列，“保守修饰的变体”是指具有保守氨基酸取代的变体，氨基酸残基被具有有着类似电荷的侧链的其它氨基酸残基替换。本领域已经定义了具有有着类似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
表位是指抗原决定簇。这些是抗原分子上的特定化学基团或肽序列，因此它们引发特异性免疫应答，例如，表位是B细胞和/或T细胞应答的抗原区域。表位既可以由连续氨基酸形成，也可以由通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。
除非另有说明，否则融合蛋白是重组蛋白，含有至少两种不相关蛋白质的氨基酸序列，这些蛋白质通过肽键连接在一起形成单个蛋白质。因此，它不包含天然存在的冠状病毒表面抗原，即本文所述的融合(F)蛋白。不相关的氨基酸序列可以直接相互连接，或者它们可以使用接头序列连接。如本文所使用的，如果蛋白质的氨基酸序列在其自然环境中(例如，在细胞内)通常不通过肽键连接在一起，则蛋白质是不相关的。例如，病毒抗原的氨基酸序列和胶原或前胶原的氨基酸序列通常不会通过肽键连接在一起。
免疫原是蛋白质或其一部分，能够在哺乳动物中诱导免疫应答，例如被病原体感染或有病原体感染风险的哺乳动物。免疫原的施用可导致针对目标病原体的保护性免疫和/或主动免疫。
免疫原性组合物是指包含免疫原性多肽的组合物，该免疫原性多肽诱导针对表达免疫原性多肽的病毒的可测量的CTL反应，或诱导针对免疫原性多肽的可测量的B细胞应答(例如产生抗体)。
两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的序列同一性或相似性按照序列之间的同一性或相似性表示。序列一致性可以按照百分比一致性来衡量；百分比越高，序列越相同。当通过比较窗口或使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的指定区域进行比较和比对以获得最大对应时，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸，则两个序列是“基本相同的”(即，在指定区域上，或者在未指定的情况下在整个序列上，60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)。可选地，同一性存在于长度至少约为50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
疫苗是指在受试者中引发预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗针对病原体的抗原(例如病毒病原体)或与病理状况相关的细胞成分诱发抗原特异性的免疫应答。疫苗可包括多核苷酸(例如编码所公开的抗原的核酸)、肽或多肽(例如所公开的抗原)、病毒、细胞或一种或更多种细胞成分。在一些实施方案中，疫苗或疫苗免疫原或疫苗组合物从融合构建体表达并自组装成在表面上显示免疫原多肽或蛋白质的纳米颗粒。
类病毒颗粒(VLP)是指不可复制的病毒外壳，来源于几种病毒中的任何一种。VLP通常由一种或更多种病毒蛋白质组成，例如但不限于称为衣壳、包被、外壳、表面和/或包膜蛋白的蛋白质，或来源于这些蛋白质的颗粒形成多肽。在适当的表达系统中重组表达蛋白质后，VLP可以自发形成。用于生产特定VLP的方法是本领域已知的。在病毒蛋白质的重组表达之后的VLP的存在可以使用本领域已知的常规技术进行检测，例如通过电子显微镜、生物物理表征等。参见例如Baker et al.(1991)Biophys.J.60:1445-1456；和Hagensee et al.(1994)J.Virol.68:4503-4505。例如，VLP可以通过密度梯度离心进行分离和/或通过特征密度带进行鉴定。或者，低温电子显微镜可以在讨论中的VLP制备的玻璃化含水样品上进行，并在适当的曝光条件下记录图像。
本文使用的术语“大约/约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“大约/约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”表示“至少一个/一种”或“一个或更多个/一种或更多种”。
在本文中，所要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的不灵活的限制。因此，应当认为范围的描述已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间与该范围内的任何其它陈述或介入值的每个介入值都包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在所要求保护的主题内，受制于所述范围内的任何明确排除的限制。如果所述范围包括一个或两个限制，则不包括其中一个或两个那些包括在内的限制的范围也包括在所要求保护的主题内。这适用于任何范围的宽度。
如本文所使用的，组合物指两种或更多种产品、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性的、非水性的或其任何组合。
本文使用的术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入已引入载体的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
示例性实施方案
实施方案1.一种包含多个重组多肽的蛋白质，每个重组多肽包含连接到胶原的C-末端前肽的冠状病毒表面抗原，其中重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。
实施方案2.根据实施方案1的蛋白质，其中冠状病毒为严重急性呼吸综合征(SARS)-冠状病毒(SARS-CoV)、SARS-冠状病毒2(SARS-CoV-2)、SARS样冠状病毒、中东呼吸综合征(MERS)-冠状病毒(MERS-CoV)、MERS样冠状病毒、NL63-CoV、229E-CoV、OC43-CoV、HKU1-CoV、WIV1-CoV、MHV、HKU9-CoV、PEDV-CoV或SDCV。
实施方案3.根据实施方案1或2的蛋白质，其中表面抗原包括冠状病毒刺突(S)蛋白或其片段或表位，其中表位可选地为线性表位或构象表位，并且其中蛋白质包括三个重组多肽。
实施方案4.根据实施方案3的蛋白质，其中表面抗原包括信号肽、S1亚单位肽、S2亚单位肽或其任何组合。
实施方案5.根据实施方案3的蛋白质，其中表面抗原包括信号肽、受体结合结构域(RBD)肽、受体结合基序(RBM)肽、融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)肽或七肽重复序列2(HR2)肽或其任何组合。
实施方案6.根据实施方案3-5中任一项的蛋白质，其中表面抗原包括S蛋白的受体结合结构域(RBD)。
实施方案7.根据实施方案3-6中任一项的蛋白质，其中表面抗原包括S蛋白的S1亚单位和S2亚单位。
实施方案8.根据实施方案3-7中任一项的蛋白质，其中表面抗原不包括跨膜(TM)结构域肽和/或细胞质(CP)结构域肽。
实施方案9.根据实施方案3-8中任一项的蛋白质，其中表面抗原包括蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L。
实施方案10.根据实施方案3-8中任一项的蛋白质，其中表面抗原不包括蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项的蛋白质，其中表面抗原是可溶的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项的蛋白质，其中在蛋白质的重组多肽中表面抗原相同或不同。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项的蛋白质，其中表面抗原直接融合到C-末端前肽，或通过接头(例如包含甘氨酸-X-Y重复序列的接头)连接到C-末端前肽，其中X和Y独立地是任何氨基酸，并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸。
实施方案14.根据实施方案1-13中任一项的蛋白质，其是可溶的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项的蛋白质，其中蛋白质能够结合到受试者的细胞表面受体，可选地其中受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。
实施方案16.根据实施方案15的蛋白质，其中细胞表面受体为血管紧张素转换酶2(ACE2)、二肽基肽酶4(DPP4)、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合素(DC-SIGN)或肝脏/淋巴结-SIGN(L-SIGN)。
实施方案17.根据实施方案1-16中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽是人胶原。
实施方案18.根据实施方案1-17中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(V)、proα1(XI)、proα2(I)、proα2(V)、proα2(XI)或proα3(XI)的C-末端多肽或其片段。
实施方案19.根据实施方案1-18中任一项的蛋白质，其中在重组多肽中C-末端前肽相同或不同。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:67-80中的任一个或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案21.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:67或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案22.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:68或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案23.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:69或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案24.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:70或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案25.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:71或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案26.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:72或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案27.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:73或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案28.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:74或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案29.根据实施方案1-20中任一项的蛋白质，其中C-末端前肽包括SEQ IDNO:75或SEQ ID NO:76或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案30.根据实施方案1-29中任一项的蛋白质，其中C-端前肽包括包含连接到SEQ ID NO:67-80中任一种的N-末端的甘氨酸-X-Y重复序列的序列，其中X和Y独立地是任何氨基酸，并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸，或与其至少90％相同的氨基酸序列，其能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。
实施方案31.根据实施方案1-30中任一项的蛋白质，其中每个重组多肽中的表面抗原为融合前构象或融合后构象。
实施方案32.根据实施方案1-31中任一项的蛋白质，其中每个重组多肽中的表面抗原包括SEQ ID NO:27-66中的任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。
实施方案33.根据实施方案1-32中任一项的蛋白质，其中重组多肽包括SEQ IDNO:1-26中的任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。
实施方案34.一种包含实施方案1-33中任一项的蛋白质的免疫原。
实施方案35.一种包含实施方案1-33中任一项的蛋白质的蛋白质纳米颗粒，所述蛋白质直接或间接连接到纳米颗粒。
实施方案36.一种包含实施方案1-33中任一项的蛋白质的病毒样颗粒(VLP)。
实施方案37.一种分离核酸，其编码根据实施方案1-33中任一项的蛋白质的重组多肽中的一个、两个、三个或更多个。
实施方案38.根据实施方案37的分离核酸，其中编码表面抗原的多肽在框架内融合到编码胶原的C-末端前肽的多肽。
实施方案39.根据实施方案37或38的分离核酸，其可操作地连接到启动子。
实施方案40.根据实施方案37-39中任一项的分离核酸，其是DNA分子。
实施方案41.根据实施方案37-39中任一项的分离核酸，其为RNA分子，可选地为mRNA分子，例如核苷修饰的mRNA、非扩增mRNA、自扩增mRNA或反式扩增mRNA。
实施方案42.一种包含根据实施方案37-41中任一项的分离核酸的载体。
实施方案43.根据实施方案42的载体，其为病毒载体。
实施方案44.一种包含根据实施方案42或43的载体的病毒、假病毒或细胞，可选地其中病毒或细胞具有重组基因组。
实施方案45.一种免疫原性组合物，其包含根据实施方案1-44中任一项的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒或细胞以及药学上可接受的载体。
实施方案46.一种疫苗，其包含根据实施方案45的免疫原性组合物和可选的佐剂，其中疫苗可选地为亚单位疫苗，和/或可选地其中疫苗为预防性和/或治疗性疫苗。
实施方案47.根据实施方案46的疫苗，其中疫苗包括多种不同佐剂。
实施方案48.一种产生蛋白质的方法，包括：在宿主细胞中表达根据实施方案37-43中任一项的分离核酸或载体，以产生根据实施方案1-33中任一项的蛋白质；和纯化蛋白质。
实施方案49.通过实施方案48的方法产生的蛋白质。
实施方案50.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案1-47和49中任一项的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗，以产生免疫应答。
实施方案51.根据实施方案50的方法，用于治疗或预防冠状病毒感染。
实施方案52.根据实施方案50或51的方法，其中产生免疫应答抑制或减少受试者中的冠状病毒复制。
实施方案53.根据实施方案50-52中任一项的方法，其中免疫应答包括细胞介导的应答和/或体液应答，可选地包括产生一种或更多种中和抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。
实施方案54.根据实施方案50-53中任一项的方法，其中免疫应答针对冠状病毒的表面抗原，但不针对C-末端前肽。
实施方案55.根据实施方案50-54中任一项的方法，其中施用不会由于先前暴露于一种或更多种冠状病毒而导致受试者中的抗体依赖性增强(ADE)。
实施方案56.根据实施方案50-55中任一项的方法，其中当随后暴露于一种或更多种冠状病毒时，施用不会导致受试者中的抗体依赖性增强(ADE)。
实施方案57.根据实施方案50-56中任一项的方法，进一步包括初免步骤和/或加强步骤。
实施方案58.根据实施方案50-57中任一项的方法，其中通过局部、经皮、皮下、皮内、口服、鼻内(例如，鼻内喷雾剂)、气管内、舌下、口腔、直肠、阴道、吸入、静脉内(例如，静脉注射)、动脉内、肌肉内(例如，肌内注射)、心内、骨内、腹腔内、跨粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周围、局部或应用皮肤(epicutaneous)给药来进行给药步骤。
实施方案59.根据实施方案50-58中任一项的方法，其中以单剂量或具有一个间隔或更多个间隔的一系列剂量施用有效量。
实施方案60.根据实施方案50-59中任一项的方法，其中在没有佐剂的情况下施用有效量。
实施方案61.根据实施方案50-59中任一项的方法，其中有效量与佐剂或多种佐剂一起施用。
实施方案62.一种方法，包括向受试者施用有效量的根据实施方案1-33中任一项的蛋白质，以在受试者中产生针对冠状病毒的中和抗体或中和抗血清。
实施方案63.根据实施方案62的方法，其中受试者为哺乳动物，可选地为人类或非人类灵长类。
实施方案64.根据实施方案62或63的方法，进一步包括从受试者分离中和抗体或中和抗血清。
实施方案65.根据实施方案64的方法，进一步包括通过被动免疫向人类受试者施用有效量的分离的中和抗体或中和抗血清，以预防或治疗冠状病毒感染。
实施方案66.根据实施方案62-65中任一项的方法，其中中和抗体或中和抗血清包括针对冠状病毒表面抗原的多克隆抗体，可选地其中中和抗体或中和抗血清不含或基本不含针对胶原的C-末端前肽的抗体。
实施方案67.根据实施方案62-65中任一项的方法，其中中和抗体包括针对冠状病毒表面抗原的单克隆抗体，可选地其中中和抗体不含或基本不含针对胶原的C-末端前肽的抗体。
实施方案68.根据实施方案1-47和49中任一项的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗，用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或治疗或预防冠状病毒感染。
实施方案69.根据实施方案1-47和49中任一项的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。
实施方案70.根据实施方案1-47和49中任一项的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、VLP、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于制造用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答的药物或预防剂，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。
实施方案71.一种用于分析样品的方法，包括：将样品与实施方案1-33中任一项的蛋白质接触，并检测蛋白质与能够特异性结合到冠状病毒表面抗原的分析物之间的结合。
实施方案72.根据实施方案71的方法，其中分析物为识别表面抗原的抗体、受体或细胞。
实施方案73.根据实施方案71或72的方法，其中结合表明样品中存在分析物，和/或样品来源于的受试者中存在冠状病毒感染。
实施方案74.一种试剂盒，包括实施方案1-33中任一项的蛋白质和含有或固定蛋白质的底物、板或小瓶，可选地其中试剂盒是ELISA或侧向流动检测试剂盒(lateral flowassay kit)。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：重组二硫键连接的SARS-CoV-2 S-三聚体融合蛋白作为亚单位疫苗的产 生
产生分泌型重组二硫键连接的多肽，其包含融合到三聚化结构域的SARS-CoV-2蛋白肽，作为候选蛋白亚单位疫苗。在一个实施例中，来自SARS-CoV2的包括其信号肽(SP)、S1和S2结构域的天然刺突蛋白的完整胞外域在框内在C-末端融合到编码α1胶原的人类C-前肽的哺乳动物表达载体，以使分泌的三聚体S-三聚体融合抗原得以表达，例如如图1所示。
图2中显示了S-三聚体融合蛋白的高水平表达。在10L生物反应器中对补料分批无血清CHO细胞培养物中的S-三聚体表达进行了8％SDS-PAGE分析。在还原条件下分析第6天至第11天的10μL无细胞条件培养基，然后进行考马斯亮蓝染色。将高度纯化的S-三聚体作为参考标准(Std)加到凝胶上。S1/S2弗林蛋白酶位点的全长S-三聚体和部分裂解形式如图所示。
然后纯化并表征共价连接的S-三聚体。通过蛋白A(PA)亲和层析和阴离子交换柱(Q)，然后通过超滤和渗滤(UF/DF)从清除的细胞培养基中纯化S-三聚体，以获得原料药(DS)，如图3A所示。通过8％还原性SDS-PAGE针对起始细胞培养基对4μg纯化的蛋白质进行分析，并用考马斯亮蓝染色。S-三聚体在S1/S2弗林蛋白酶裂解位点处被部分裂解，但裂解的S1亚单位似乎与S-三聚体结合，因为它与S-三聚体共纯化。如图3B所示，S-三聚体是二硫键连接的三聚体。如图所示，在非还原和还原条件下，通过6％SDS-PAGE分析4μg高度纯化的天然类S-三聚体，并用考马斯亮蓝染色。根据SEC-HPLC分析判断，S-三聚体纯化至接近均一性，一些裂解的S1在尺寸排除色谱中被分离出来，如图3C所示。S-三聚体的分子量估计为660Kda。在图3D中，使用蛋白质A传感器通过FortebioBioLayer干涉测量法评估S-三聚体与ACE2-Fc的受体结合动力学。
用N-连接的聚糖对S-三聚体进行高度糖基化。高纯度的S-三聚体在消化前和消化后单独使用内切葡聚糖酶F(PNGase F)或PNGase F加内-O-糖苷酶去除N-和O-连接的聚糖，并通过8％还原性SDS-PAGE进行分析，并用考马斯亮蓝染色。去糖基前后的全长S-三聚体、S2-三聚体和裂解的S1如图4所示。使用FEI-Tecnai spirit电子显微镜通过负电镜观察高度纯化的S-三聚体，预测的S-三聚体构象如图5所示。
实施例2：包含S-三聚体蛋白肽的重组多肽的功能表征
用S-三聚体作为抗原分析了最近从COVID-19康复的多名患者的血清，来确定S-特异性的抗体滴度(图6，左图)，并通过抑制S-三聚体与ACE2受体结合来确定中和抗体水平(图6，右图)。结果表明，使用S-三聚体作为抗原，成功地从恢复期血清中检测到S-特异性抗体和中和抗体。
为了进一步评估如实施例1中所述的产生的示例性重组多肽的免疫原性和保护效力，图7A和图7B分别显示了在仅使用S-三聚体(30微克)和不使用任何佐剂的大鼠中诱导抗原特异性抗体和中和抗体。与图6中显示的人类数据类似，这些结果表明，S-三聚体疫苗可诱导抗原特异性抗体和中和抗体。类似地，小鼠中显示了S-三聚体的免疫原性。在第1天和第14天，用3微克的S-三聚体单独或S-三聚体+明矾(氢氧化铝)作为佐剂免疫6组Balb-c小鼠两次。用S-三聚体分析第28天收集的抗血清以确定抗体滴度(图7C)。用基于角鲨烯的佐剂作为佐剂的S-三聚体显示出诱导抗原特异性抗体以及中和抗体的强大能力，分别如图7D和图7E所示。GMT代表几何平均滴度。
实施例3：S-三聚体疫苗组合物诱导的病毒的广泛中和
从2020年末开始，携带有突变的可能导致免疫逃逸的多重变异SARS-CoV-2毒株的出现和传播使得对第二代疫苗进行快速评估成为必要，目的是诱导具有广泛保护性的优化的免疫应答。本实施例在小鼠免疫原性研究中证明，两剂修饰的B.1.351刺突(S)-三聚体候选疫苗(B.1.351 S-三聚体)可诱导强烈的体液免疫应答，其可广泛中和SARS-CoV-2的Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株。此外，虽然使用两剂(初免-加强)Hu-1 S-三聚体疫苗(基于Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2株)进行免疫对B.1.351变种的交叉反应中和水平较低，施用Hu-1 S-三聚体或B.1.351 S-三聚体的第三剂(再次加强剂)能够将针对B.1.351的中和抗体滴度增加到与两剂Hu-1 S-三聚体引发的针对Wuhan-Hu-1毒株的中和抗体滴度相当的水平。
尽管COVID-19疫苗开发的巨大进展和空前速度，但在SARS-CoV-2病毒爆发首次出现16个月后的2021年4月，COVID-19每日病例创下了新的纪录。COVID-19导致的总死亡人数在2021年5月超过300万人，仅在前3个月就累计死亡100万人。
最令人担忧的是，在全球COVID-19病例激增的同时，从2020年底开始出现多种新的SARS-CoV-2变异株(VOC)。这些VOC似乎与刺突(S)蛋白的突变有关，突变可能会增加病毒传播率和/或基于SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1毒株的第一波COVID-19疫苗接种引起的免疫逃逸。B.1.1.7变种在英国(UK)、B.1.351变种在南非和P.1变种在巴西的出现和传播导致其被归类为VOC。这些VOC都包括S蛋白的受体结合结构域(RBD)中的N501Y突变，据报道，该突变可使传播增加40％至70％。B.1.351和P.1变种还有两个另外的RBD突变——E484K和K417——这可能允许从Wuhan-Hu-1疫苗和自然感染诱导的抗体中免疫逃逸。
Wuhan-Hu-1COVID-19疫苗的随机对照临床试验表明，与Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株相比，疫苗对VOC的有效性降低。基于佐剂蛋白的COVID-19疫苗NVX-CoV2373在英国(B.1.1.7占主导地位)的有效性为89％，但在南非(B.1.351占主导地位)的有效性仅为49％。腺病毒载体COVID-19疫苗ChAdOx1对B.1.351变种的有效性仅为10％。辉瑞疫苗接种者对B.1.351变种的有效性为75％，而对Wuhan-Hu-1毒株的有效性为95％。Coronavac是基于Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株的灭活SARS-CoV-2疫苗，接种该疫苗的受试者未检测到针对P.1的中和抗体滴度。
虽然有一些令人鼓舞的证据表明，Wuhan-Hu-1COVID-19疫苗可能会预防由VOC引起的严重疾病和死亡，但对任何传播率上升的COVID-19疾病的疫苗有效性较低，可能会使实现群体免疫特别困难，全球COVID-19疫苗短缺可能会进一步加剧这一问题。如果不能得到有效控制，SARS-CoV-2VOC在全球的迅速传播可能会导致新的目标变种或可能包含新的逃逸突变的VOC的继续出现，例如印度变种(B.1.617)，它与2021年春季COVID-19病例的大规模激增同时出现，现已被世卫组织宣布为新的VOC。
在这些情况下，必须迅速评估再次加强剂策略，以增强对VOC的中和抗体应答，并开发可能提供优化的广泛保护和交叉中和特性的第二代COVID-19疫苗。在本研究中，产生了修饰的B.1.351刺突-三聚体抗原(称为“B.1.351 S-三聚体”)，并在小鼠免疫原性研究中与Hu-1 S-三聚体(Liang et al.,Nat.Comms.,12:1346,2021；Richmond et al.,Lancet,397:682-694,2021)进行了比较。还评估了异源初免-加强和二价疫苗方案以及第三剂(再次加强剂)的效果。
结果
人COVID-19康复期血清中交叉反应中和抗体的检测
分析了从感染Wuhan-Hu-1毒株的COVID-19患者收集的8份中至高抗体滴度的人恢复期血清(HCS)样品的针对Wuhan-Hu-1毒株、英国变种(B.1.1.7)、南非变种(B.1.351)和巴西变种(P.1)毒株的SARS-CoV-2假病毒中和滴度(图9A)和ACE2竞争性ELISA滴度(图9B)。HCS中针对B.1.1.7的中和抗体滴度似乎与Wuhan-Hu-1毒株相似，并且ACE2竞争性滴度的差异也没有统计学意义。但是，与针对Wuhan-Hu-1毒株的滴度相比，观察到HCS中针对B.1.351(低7到9倍)和P.1(低2到3倍)的抗体滴度显著降低。
基于Wuhan-Hu-1毒株和B.1.351毒株的刺突抗原的生产和表征
基于Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株(Hu-1 S-三聚体)和南非变种(B.1.351 S-三聚体)利用蛋白质三聚体化TM技术(Liang et al.,Nat.Comms.,12:1346,2021)产生共价三聚体的S-蛋白抗原。Hu-1 S-三聚体基于Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株(Wuhan-Hu-1)的天然刺突胞外域序列，而修饰的B.1.351 S-三聚体(SEQ ID NO:10)包含3个RBD突变(K417N、E484K、N501Y)和在B.1.351变种毒株中发现的D614G突变，而N-末端结构域(NTD)和S2序列基于Wuhan-Hu-1毒株(图10A)。
使用ForteBioBioLayer干涉仪的纯化的S-三聚体抗原与人类ACE2受体的结合亲和力(KD)显示Hu-1 S-三聚体约为5.2nM，B.1.351 S-三聚体约为1.5nM(图10B)。与Hu-1 S-三聚体相比，B.1.351 S-三聚体的ACE2结合亲和力高3到4倍，与先前报道的结果相似。
小鼠中Wuhan-Hu-1和B.1.351 S-三聚体初免-加强剂(2剂)方案的免疫原性
在研究的第1阶段对BALB/c小鼠进行免疫(图10C-10D)，使用两剂(第0天和第21天)Hu-1 S-三聚体、异源初免-加强剂(第1剂Hu-1 S-三聚体+第2剂B.1.351 S-三聚体)、两剂B.1.351 S-三聚体或两剂二价疫苗(Hu-1 S-三聚体与B.1.351 S-三聚体混合)。第1阶段的所有动物均接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂初免剂(第1剂)。对于第二剂(加强剂)，每组有一半的动物接受包含明矾(氢氧化铝)的含佐剂加强剂，另一半接受无佐剂加强剂(仅有抗原)。根据针对Wuhan-Hu-1毒株和三种VOC(B.1.1.7、B.1.351和P.1)的假病毒中和滴度，对第35天的血样(给药2周后)进行体液免疫原性分析。
在接受两剂B.1.351 S-三聚体和二价疫苗的组中，针对B.1.351和P.1的中和抗体滴度最高(图11A)，前者诱导数值最高的滴度。与接受两剂Hu-1 S-三聚体的动物相比，接受两剂B.1.351 S-三聚体的动物观察到针对B.1.351假病毒的中和抗体滴度高13.8倍，针对P.1假病毒的滴度高2.4倍。有趣的是，与接受两剂Hu-1 S-三聚体的动物相比，接受异源初免-加强剂(第1剂Hu-1 S-三聚体+第2剂B.1.351 S-三聚体)的组没有诱导更高的针对B.1.351和P.1的抗体滴度。
针对Wuhan-Hu-1和B.1.1.7变异假病毒的中和抗体滴度在所有疫苗组中相似(图11A)，证明两剂B.1.351疫苗能够诱导抗体，所述抗体能够完全反中和Wuhan-Hu-1毒株，也可以使完全免受B.1.1.7变种。
ACE2竞争性ELISA结果与假病毒中和结果一致，并进一步证实了假病毒中和结果(图11B)，并且ACE2竞争性ELISA滴度被发现与所有四种受试毒株的假病毒中和滴度相关。
含佐剂与无佐剂第二剂(加强剂)的效果通过基于假病毒中和滴度的析因分析进行(图12A)。与接受无佐剂加强剂(仅有抗原)的动物相比，接受含佐剂加强剂的动物似乎诱导的中和抗体滴度高出约2至4倍，表明佐剂用于加强剂时对免疫应答的积极影响。
小鼠中Wuhan-Hu-1或B.1.351 S-三聚体再次加强剂(第3剂)的免疫原性
在研究的第2阶段(图10C)，Hu-1 S-三聚体初免-加强组的动物在第35天随机接受Hu-1 S-三聚体或B.1.351 S-三聚体(一半含佐剂和一半无佐剂)的再次加强剂(第3剂)。异源初免-加强组和B.1.351 S-三聚体初免-加强组的动物随机接受无佐剂Wuhan-Hu-1或无佐剂B.1.351 S-三聚体的再次加强剂(第3剂)。对第49天的样品(第3剂后2周)进行体液和细胞免疫应答分析。
在接受再次加强剂后的所有疫苗组中，针对Wuhan-Hu-1毒株(图13A)和B.1.1.7变种(图13B)假病毒的中和抗体滴度相似，并且与第2剂后的滴度增加倍数相比，再次加强剂(第3剂)后的滴度增加倍数在各组中也相似。在再次加强组中，中和抗体滴度相对于Wuhan-Hu-1毒株平均增加约1.6至3.1倍，相对于B.1.1.7变种平均增加约1.8至2.8倍。
在接受三剂疫苗(包括Hu-1 S-三聚体初免剂(第1剂))的组中，在再次加强剂后，针对B.1.351变种假病毒的中和抗体滴度(图13C)平均增加1.7至4.6倍，达到与两剂Hu-1S-三聚体引发的对Wuhan-Hu-1毒株的中和相当的水平。我们注意到，这些组中B.1.351中和滴度的可变性似乎高于针对其它受试毒株的中和。在接受三剂B.1.351 S-三聚体的组中，针对B.1.351的中和抗体滴度在再次加强剂后没有显著增加，可能是因为在加强剂(第2剂)后滴度已经处于较高的生物水平。
有趣的是，在使用Hu-1 S-三聚体进行初免-加强的组中，在再次加强剂(Hu-1 S-三聚体或B.1.351 S-三聚体)之后，P.1中和滴度(图13D)在再次加强剂后似乎没有增加。与B.1.351中和滴度类似，在接受三剂B.1.351 S-三聚体的组中，P.1中和滴度数值最高。
在接受两剂Hu-1 S-三聚体疫苗(初免-加强)的动物组中，与使用Hu-1 S-三聚体作为再次加强剂的动物相比，使用B.1.351 S-三聚体的随后的再次加强剂(第3剂)似乎没有诱导更高的针对B.1.351或P.1的中和抗体(图13C-13D)。
使用基于假病毒中和滴度的析因分析，研究了含佐剂与无佐剂再次加强剂(第3剂)对第1组体液免疫原性的影响(图12B)。与接受无佐剂再次加强剂(仅有抗原)的动物相比，接受含佐剂再次加强剂的动物似乎没有诱导显著更高的中和抗体滴度。
小鼠中3剂Wuhan-Hu-1或B.1.351 S-三聚体诱导的细胞介导的免疫应答
在第49天(第3剂后2周)，在接受三剂Hu-1 S-三聚体或三剂B.1.351 S-三聚体的动物中评估细胞介导的免疫应答。通过ELISpot检测Wuhan-Hu-1毒株S1肽库(pool)、SARS-CoV S1肽库、B.1.351变种RBD肽库或P.1变种RBD肽库刺激的收获的小鼠脾细胞中的Th1细胞因子(IFNγ和IL-2)或Th2细胞因子(IL-5)来评估细胞介导的免疫(CMI)。
在所有受试刺激剂的两个疫苗组中均观察到强烈的Th1偏向性CMI(图14A-14D)。由含佐剂S-三聚体抗原诱导的Th1偏向性CMI与Liang等人,Nat.Comms.,12:1346,2021的结果一致。
重要的是，在所有刺激剂的两个疫苗组中，CMI的程度似乎相似，这表明Wuhan-Hu-1和B.1.351 S-三聚体疫苗均可诱导针对VOC(包括B.1.1.7、B.1.351和P.1)的广泛交叉反应性CMI。针对SARS-CoV S1肽库的交叉反应性CMI(图14B)的水平确实比SARS-CoV-2的Wuhan-Hu-1毒株的CMI低约40-50％(图14A)，这与SARS-CoV和SARS-CoV-2的S1结构域的79％序列同源性一致。
讨论
修饰的B.1.351 S-三聚体疫苗针对Wuhan-Hu-1毒株和关注的变种产生广泛中和
与基于SARS-CoV-2的Wuhan-Hu-1毒株评价Wuhan-Hu-1COVID-19疫苗的其它研究结果一致，在本研究中，与针对同源Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株的滴度相比，Hu-1 S-三聚体初免-加强疫苗针对B.1.351和P.1变种诱导的中和抗体滴度更低(图11A-11B)。据认为，B.1.351和P.1变种的RBD中的E484K和K417突变使得能够从Wuhan-Hu-1疫苗诱导的抗体中免疫逃逸。
两剂修饰的B.1.351 S-三聚体抗原诱导高水平的针对B.1.351和P.1变种的中和抗体。重要的是，两剂B.1.351 S-三聚体也能够完全反中和Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株并且中和B.1.1.7变种。相比之下，与Wuhan-Hu-1mRNA疫苗相比，小鼠中基于B.1.351变种刺突蛋白(包含B.1.351中发现的所有突变)的mRNA COVID-19候选疫苗似乎诱导的针对Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株的中和抗体滴度降低了约6倍(Wu et al.,bioRxiv2021.04.13.439482)，并且结果与该B.1.351mRNA候选疫苗的1期临床试验结果一致(Wu etal.,N Engl J Med 2021；384:1468-1470)。
修饰的B.1.351 S-三聚体候选疫苗诱导的广泛中和可能由抗原序列的嵌合性质来解释，该抗原序列包含3个RBD突变(K417N、E484K、N501Y)和在B.1.351变异株中发现的D614G突变，而NTD和S2序列基于Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2毒株(Wuhan-Hu-1)(图10A)。先前的研究已经确定了针对NTD的中和抗体，并且新证据表明疫苗诱导的抗NTD中和抗体与抗RBD中和抗体共同占优势，突出了NTD的重要性。因此，数据表明了诱导广泛中和的潜在模型，其中修饰的B.1.351 S-三聚体抗原可诱导(a)针对E484K和K417突变的抗RBD抗体，其可中和B.1.351和P.1变异株，以及(b)可中和Wuhan-Hu-1毒株的抗NTD抗体。
两剂Wuhan-Hu-1疫苗后的再次加强剂可以增强广泛中和
本研究的结果表明，在两剂Hu-1 S-三聚体之后的再次加强剂(使用Hu-1 S-三聚体或B.1.351 S-三聚体)可增加针对Wuhan-Hu-1毒株和VOC(包括B.1.351)的广泛中和抗体水平。如果给予的再次加强剂是Hu-1 S-三聚体或B.1.351 S-三聚体，则中和抗体滴度似乎没有显著差异。因此，在给定的时间提供Wuhan-Hu-1和变异疫苗的基础上，可以采用更灵活的有效加强策略。
还应注意，与接受Hu-1 S-三聚体同源初免-加强的动物相比，异源初免-加强剂(第1剂Hu-1 S-三聚体+第2剂B.1.351 S-三聚体)不会诱导更高的针对B.1.351和P.1的中和抗体滴度。此外，尽管Hu-1 S-三聚体初免-加强后的再次加强剂使针对B.1.351变种的中和滴度增加了约2.8至4.6倍(与第2剂后水平相比)，但滴度在数值上仍然较低，但也比接受两剂或三剂B.1.351 S-三聚体的动物更易变化。此外，在接受Hu-1 S-三聚体初免-加强后进行再次加强的这些组中，P.1中和滴度没有增加，并且仍然比接受三剂B.1.351 S-三聚体的组低2.7至4.1倍。这些结果表明，使用Wuhan-Hu-1COVID-19疫苗进行初免可能会诱发一定程度的“抗原原罪(original antigenic sin)”，这是之前描述的其它病毒(例如流感和登革热)的一种现象，其中免疫系统优先响应初免免疫原中的表位，而对变种中的新表位响应能力较弱(Vatti et al.,J.Autoimmun.83:12-21,2017)。然而，Hu-1 S-三聚体初免-加强诱导的小鼠中针对VOC的交叉反应中和抗体滴度虽然低于B.1.351 S-三聚体诱导的水平，但仍然相对较高，并且中和滴度可以随着再次加强剂的增加而增加。
本实施例中再次加强剂的结果支持跨不同平台的异源初免-加强策略，例如，在腺病毒载体、mRNA和/或灭活COVID-19疫苗的初次系列之后，利用基于蛋白质的S-三聚体作为再次加强剂。已经围绕多剂量mRNA疫苗与潜在PEG致敏相关的安全性出现了安全担忧，并且已知腺病毒载体疫苗的抗载体免疫原性会降低后续同源剂量的有效性。初步的人类临床数据表明，腺病毒载体和mRNA COVID-19疫苗的异源初免-加强(或反之)表明，它们比它们的同源初免-加强对应物诱导更高的全身反应原性率(Shaw et al.,Lancet.(2021)doi:10.1016/S0140-6736(21)01115-6)。
针对SARS-CoV-2的广泛交叉反应的细胞介导的免疫应答
虽然细胞介导的免疫(CMI)在COVID-19预防或康复中的确切作用仍有待阐明，有充分证据表明，在COVID-19患者中诱导针对刺突(S)蛋白的强烈细胞免疫应答，并且CMI可有助于缓解症状和加速SARS-CoV-2的清除。此外，据报道，高达35％的SARS-CoV-2新染个体(
Figure GDA0003496524170000841
individual)对SARS-CoV-2抗原有一定程度的交叉反应CD4+T-细胞应答，这是由于先前感染了其它普通感冒冠状病毒。在本研究中，虽然与B.1.351 S-三聚体相比，Hu-1 S-三聚体诱导的针对B.1.351的中和抗体水平较低，但两种候选疫苗的CMI水平似乎相似，并且对SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1毒株S1、B.1.351变种RBD、P.1变种RBD)和SARS-CoV(S1)的抗原具有交叉反应，表明CMI对冠状病毒刺突蛋白的交叉反应可能比体液免疫应答更广泛。本研究中S-三聚体诱导的CMI在本质上似乎是Th1偏好的，这与之前评估佐剂Hu-1 S-三聚体的研究一致(Liang et al.,Nat.Comms.,12:1346,2021；Richmond et al.,Lancet,397:682-694,2021)。
加强策略中佐剂的使用
鉴于利用蛋白质三聚体化TM技术的S-三聚体抗原的高生产率和迅速扩大生产至数十亿剂量的潜力，本研究评估了“佐剂保留”的可能性，如果佐剂的供应是COVID-19疫苗可用性的限制因素的话。
由于佐剂的使用被认为是建立免疫初免，因此对含佐剂与无佐剂第二剂(加强)和第三剂(再次加强)的给药进行了评估和比较。与接受无佐剂加强剂(仅有抗原)的动物相比，接受含佐剂加强剂的动物诱导的中和抗体滴度高2-4倍(图12A)，这表明初次接种系列中的第二剂可能仍然需要佐剂，以实现最佳免疫应答。然而，与接受无佐剂再次加强剂(仅有抗原)的动物相比，接受含佐剂再次加强剂(第三剂)的动物似乎没有诱导显著更高的中和抗体滴度(图12B)。
方法
蛋白表达和纯化
Hu-1 S-三聚体和修饰的B.1.351 S-三聚体抗原被如前所述制备和纯化(Lianget al.,Nat.Comms.,12:1346,2021)，并用于免疫原性研究。基于B.1.1.7变种和P.1变种的S-三聚体抗原也被制备并用于ACE2竞争性ELISA分析。编码各SARS-CoV-2变异株刺突(S)蛋白的胞外域的cDNA被亚克隆到pTRIMER哺乳动物表达载体中，以允许在框内融合到蛋白质三聚体化TM标签，蛋白质三聚体化TM标签能够通过二硫键自我三聚化。在293F细胞中瞬时转染后，变种S-三聚体抗原以足够水平表达和分泌，以能够进一步进行表征和小鼠免疫原性研究。为了获得高纯度形式的变种S-三聚体抗原以用于表征和疫苗研究，利用如前所述的亲和纯化方案(Liang et al.,Nat.Comms.,12:1346,2021)在单个步骤中将抗原纯化至接近均一性。
S-三聚体与人类ACE2的受体结合研究
通过Bio-Layer干涉法测量在ForteBio Octet QKe(Pall)上评估S-三聚体与ACE2的结合亲和力。ACE2-Fc(10μg/mL)固定在蛋白质A(ProA)生物传感器(Pall)上。通过将传感器应用于S-三聚体(PBS中为22.5-36μg/mL)的两倍连续稀释液中来获得实时受体结合曲线。使用Octet软件12.0版本分析动力学参数(Kon和Koff)和亲和力(KD)。假设S-三聚体(Wuhan-Hu-1或B.1.351)与ACE2-Fc的结合模型为1:1，使用稳态分析确定解离常数(KD)。
小鼠中Hu-1 S-三聚体和修饰的B.1.351 S-三聚体的免疫原性分析
在研究的第1阶段，用两剂(第0天和第21天)Hu-1 S-三聚体(3μg)、异源初免-加强剂(第1剂Hu-1 S-三聚体)；第2剂B.1.351 S-三聚体；每种抗原3μg)、两剂B.1.351 S-三聚体(3μg)或两剂二价疫苗(3μgHu-1 S-三聚体与3μg B.1.351 S-三聚体混合)对BALB/c小鼠(n＝16-32/组)进行免疫。在第1阶段，所有动物均接受含佐剂初免剂(第1剂)，而每组中有一半动物接受含佐剂加强剂(第2剂)，另一半接受无佐剂加强剂(仅有抗原)。在研究的第2阶段，第1组的动物随机接受3μgWuhan-Hu-1或3μg B.1.351 S-三聚体(一半含佐剂和一半无佐剂)的再次加强剂(在第35天第3剂)。第2-3组的动物随机接受3μg无佐剂Wuhan-Hu-1或B.1.351 S-三聚体的再次加强剂(第3剂)。在第1阶段，对第35天的血样进行体液免疫原性初步分析。在第2阶段，对第49天的血样进行体液和细胞免疫应答的初步分析。动物尾静脉放血进行体液免疫应答分析。处死后取脾脏进行ELISpot试验。
ACE2竞争性ELISA试验
96孔板(康宁)在4℃下涂有1μg/mL ACE2-Fc(100μL/孔)过夜，用2％脱脂乳在37℃下封闭2小时。在用PBST洗涤3次后，用与连续稀释的抗血清混合的100ng/mL S-三聚体(Wuhan-Hu-1、B.1.351、B.1.1.7或P.1)在37℃下温育1小时。用PBST洗涤3次后，将板与1:5000稀释度的兔抗蛋白质三聚体化TM标签抗体(三叶草生物制药)在37℃下温育1小时，然后用PBST洗涤3次，然后用1:20000稀释度的山羊抗兔IgG-HRP(Southern Biotech)温育。用PBST洗涤3次后，加入TMB(Thermo Scientific)进行信号显影。抑制百分比计算如下：％抑制＝[(A-空白)-(P-空白)]/(A-空白)×100，其中A是不存在血清时S-三聚体与ACE2-Fc结合的最大OD信号，P是在给定稀释度下存在血清时S-三聚体与ACE2-Fc结合的OD信号。给定血清样品的IC50被定义为稀释度的倒数，其中样品显示50％竞争。
假病毒中和试验
对Wuhan-Hu-1毒株和变种B.1.1.7、B.1.351和P.1毒株进行SARS-CoV-2假病毒中和试验。为了评估抗血清的SARS-CoV-2假病毒中和活性，首先将样品热灭活30分钟，并连续稀释(3倍)，与等量的650TCID50假病毒在37℃下温育1小时，同时使用单独病毒(阳性对照)和单独细胞(阴性对照)。然后，将新鲜的胰蛋白酶化的ACE2过表达-293细胞以20000个细胞/孔添加到每个孔中。在5％CO2培养箱中在37℃下温育24小时后，根据生产商的方案，裂解细胞，并通过荧光素酶分析系统(Beyotime)测定荧光素酶活性。给定血清样品的EC50中和抗体滴度被定义为稀释度的倒数，其中样品显示与单独病毒对照孔相比，相对光单位(RLU)减少50％。
脾细胞刺激和ELISpot试验
为了检测抗原特异性的T-细胞应答，按照生产商的说明使用ELISpot试剂盒(Mabtech)测量Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2细胞因子(IL-5)。在第三次免疫后2周，收集免疫小鼠的脾细胞或免疫小鼠的PBMC。用2μg/mLWuhan-Hu-1SARS-CoV-2S1肽库(pool)、SARS-CoV S1肽库、B.1.351RBD肽库或P.1RBD肽库在体外刺激5×105脾细胞(96孔板)。将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和离子霉素作为非特异性刺激物添加到阳性对照孔中，而阴性对照孔未接受刺激物。温育24-48小时后，加入ELISpot试剂盒和SA-ALP/SA-HRP中的生物素化的检测抗体。通过添加BCIP/NBT或AEC底物溶液来形成斑点，在黑暗中温育5-30分钟后产生色斑。使用自动ELISpot读出器(CTL)对IFN-γ、IL-2和IL-5斑点形成细胞(SFC)进行计数。
实施例4：含佐剂SARS-CoV-2疫苗的免疫原性
为了快速表达S-三聚体抗原，采用了蛋白质三聚体化TM技术(Liu et al.,Scientific Reports,7(1):8953,2017)。编码野生型SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的胞外域的cDNA被亚克隆到pTRIMER哺乳动物表达载体中，以允许在框内融合到蛋白质三聚体化TM标签，蛋白质三聚体化TM标签能够通过二硫键自我三聚化。在稳定转染到CHO细胞中、随后筛选高滴度生产克隆和广泛的工艺优化后，开发了生物反应器中的补料分批无血清细胞培养工艺，导致S-三聚体作为分泌蛋白的高水平表达，滴度约为500mg/L。
为了获得用于疫苗研究的高纯度形式的S-三聚体，利用蛋白质三聚体化TM标签和Endo180之间的高结合亲和力的优势开发了亲和纯化方案，Endo180是能够结合到1型前胶原的C-末端区域并使胶原成熟的胶原受体。将Endo180-Fc融合蛋白装载到蛋白A柱上，并通过蛋白A与Endo180-Fc的人IgG1Fc结构域之间的高亲和力结合被树脂捕获。然后，将含有CHO细胞分泌的S-三聚体的无血清细胞培养基装载到具有预捕获的Endo180-Fc的蛋白A柱上。在冲洗掉任何未结合的污染宿主细胞蛋白质(HCP)和其它杂质后，在不使Endo180-Fc从蛋白A柱分离的条件下，使用温和的盐洗脱一步将结合的S-三聚体纯化至接近均一性。进一步纯化S-三聚体，通过低pH值用于预防性病毒灭活(VI)，阴离子交换层析以去除宿主细胞DNA和任何残留的内毒素，纳滤作为预防性病毒去除(VR)步骤，以及最终UF/DF以将S-三聚体浓缩到制剂缓冲液中所需的浓度，从而获得S-三聚体亚单位候选疫苗的活性药物(DS)。纯化的S-三聚体的稳定性分析表明，S-三聚体在2-8℃的液体溶液制剂中是稳定的。
非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析证实，纯化的S-三聚体是二硫键连接的三聚体，并在S1/S2边界被CHO细胞产生的弗林蛋白酶部分裂解。在非还原条件下，S-三聚体以多种高分子量形式出现，可能是抗原的部分裂解的结果，在样品处理期间释放非共价连接的和裂解的S1。未裂解的S-三聚体的还原形式的分子量约为245kDa。通过Edman降解进行的肽测序证实了685R-686S之间的S1/S2裂解，还揭露了S-三聚体的N-末端氨基酸在13S-14Q之间的信号肽裂解后被阻断，可能通过残余的14Q处的焦谷氨酸形成。在焦谷氨酸氨基肽酶去除14Q后，随后的肽测序证实了这一点。通过N-和O-连接的去糖基化酶分析S-三聚体的蛋白质糖基化，其在S1和S2区域显示广泛的N-连接的糖基化，根据S2-三聚体和S1在去糖基化之前(129kDa和116kDa)和之后(93kDa和72kDa)的分子量变化，约32％的质量(79kDa)为聚糖。通过尺寸排除SEC-HPLC分析纯化的S-三聚体的纯度，显示约700kDa的96.3％的主峰，约180kDa的3.7％的副峰被认定为裂解的S1。使用ForteBioBioLayer干涉仪，纯化的S-三聚体与人类ACE2受体的结合亲和力(KD)显示为1.33nM。负染色EM可视化证实S-三聚体颗粒主要以亚稳态的三聚体融合前形式存在，类似于全长野生型刺突蛋白，随附论文中的冷冻EM结构研究进一步证实了这一点(Ma et al.,bioRxiv 2020.09.21.306357.doi:10.1101/2020.09.21.306357)。
用S-三聚体检测康复期血清中SARS-CoV-2特异性结合和中和抗体。S-三聚体被用作抗原，以检测从康复的COVID-19患者采集的人类恢复期血清样品中SARS-CoV-2刺突蛋白结合抗体和ACE2竞争性抗体的存在。在恢复期血清中检测到高水平的S-三聚体结合抗体和ACE2竞争性滴度，以及使用假病毒中和试验检测到高中和抗体滴度。在新染
Figure GDA0003496524170000881
人类志愿者的血清中未检测到S-三聚体结合抗体，而在COVID-19康复期血清和新染
Figure GDA0003496524170000882
血清中均检测到与流感血凝素(HA)-三聚体结合的抗体，暗示所有测试的受试者均有流感感染史，但在COVID-19康复期受试者中仅发现SARS-CoV-2感染史。这些结果支持了试验的特异性，并证明了S-三聚体用于检测康复期血清中SARS-CoV-2刺突蛋白特异性的抗体的能力，进一步证实了S-三聚体中刺突抗原的天然类似构象。
观察到抗体滴度与疾病严重程度相关，在患有轻度COVID-19疾病的患者中观察到抗体滴度较低，在严重病例中滴度较高。抗体滴度似乎也与患者年龄中度相关，但未观察到性别差异。
观察到人类康复期血清中的抗体滴度在所用的三种分析之间存在相关性，这些相关性在用S-三聚体免疫的动物的血清中得到进一步证实。有趣的是，几个具有可检测的假病毒中和抗体滴度的康复期血清样品没有任何可检测的ACE2竞争性滴度，这表明结合ACE2的RBD不是中和抗体的唯一靶点，其它结构域如NTD和S2也可能是病毒中和的重要抗原表位。
评估BALB/c小鼠中S-三聚体的免疫原性。在两剂初免-加强方案(第0天和第21天)中，小鼠被两次肌肉注射S-三聚体(无佐剂或具有各种佐剂)。佐剂对体液免疫原性的影响是明显的，因为在相应的抗原剂量水平下，含佐剂组的S-三聚体结合抗体滴度、ACE2竞争性滴度和中和抗体滴度显著高于无佐剂疫苗。具有不同佐剂的S-三聚体引发与在人类康复期血清样品中观察到的水平相似或更高的ACE2竞争性抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。在S-三聚体免疫的大鼠中观察到类似的结果。
通过收集被处死的免疫的小鼠的脾细胞，然后用S-三聚体抗原刺激并通过ELISpot检测Th1(IL-2和IFNγ)和Th2(IL-4和IL-5)细胞因子，来研究S-三聚体抗原特异性的细胞介导的免疫(CMI)。含佐剂组似乎比无佐剂S-三聚体诱导更强的整体CMI应答。在无佐剂组和某些含佐剂S-三聚体组中观察到Th1偏好的细胞介导的免疫应答，而在其它含佐剂组中观察到混合的Th1-Th2分布。CMI似乎不依赖于抗原的剂量。
在非人类灵长类动物(恒河猴)中进一步研究了含佐剂S-三聚体的免疫原性。用含佐剂S-三聚体或PBS载体对照对动物肌肉内接种两次。然后在第35天用SARS-CoV-2病毒攻击动物，然后通过各种参数评估免疫保护。在接受含佐剂S-三聚体的两组中，通过不同方法(包括野生型SARS-CoV-2病毒中和试验)检测到高水平的结合和中和抗体滴度。第二剂(第21天)的加强作用是明显的，在第28天观察到中和抗体水平显著增加，并在攻击前的35天内持续上升。在第35天，含佐剂S-三聚体组的中和抗体滴度显著高于人类康复期血清的水平。此外，含佐剂S-三聚体组的动物似乎在病毒攻击后7天出现了保持较高水平的快速和更持久的淋巴细胞应答。病毒攻击后的抗体滴度似乎在第40天(5dpi)攻击后适度降低，表明高剂量的SARS-CoV-2攻击可能导致流通的抗刺突抗体与病毒快速结合并随后清除；在再次暴露于病毒的恢复期人类中报告了类似的趋势(Addetia et al.,J Clin Microbiol,21,JCM.021107-20(2020))。
在SARS-CoV-2攻击后，含佐剂S-三聚体组的动物免受体重减轻的影响，而载体对照组的动物在7dpi内观察到体重迅速减轻约8％，这与其它报告的研究一致(Munster etal.,Nature,585:268-272,2020)。类似地，接受含佐剂S-三聚体的动物似乎在SARS-CoV-2攻击后免受体温升高的影响。各种血液化学参数也表明，由于与含佐剂S-三聚体组相比，载体对照组的动物在7dpi内观察到血白蛋白(ALB)、A/G比、AST、肌酸激酶(CK)、葡萄糖(GLU)、乳酸(LAC)和甘油三酯(TRIG)增加，因此活性疫苗组的动物可能已免受器官和组织损伤以及SARS-CoV-2感染的其它不良影响。
在5至7dpi尸检时采集肺组织，并基于基因组RNA(gRNA)检测SARS-CoV-2病毒载量。在含佐剂S-三聚体组中观察到肺组织中的病毒载量完全降低，而在载体组中可检测到病毒载量。在攻击7dpi后，在接受活性疫苗的动物中从咽拭子、肛拭子和气管刷(trachealbrush)观察到病毒载量降低的类似趋势。考虑到病毒攻击的位置，在鼻拭子中检测到的病毒gRNA是预期的，并且不一定表明病毒正在复制。在肺组织中进行的组织病理学分析和用对刺突蛋白具有特异性的抗体进行的IHC染色进一步证实在接种S-三聚体的动物中SARS-CoV-2感染减少。
SARS-CoV-2刺突蛋白中的D614G突变不会改变受体结合，也不会逃避S-三聚体引发的中和抗体。由于刺突蛋白中具有D614G突变的SARS-CoV-2已成为世界许多地区的主要流通毒株，因此也产生了具有D614G突变的S-三聚体。结果表明，与野生型S-三聚体相比，在ACE2结合亲和力和ACE2与野生型S-三聚体免疫的动物产生的抗刺突中和抗体的竞争性结合方面未观察到显著差异。
在动物模型中，用具有佐剂的S-三聚体免疫可诱导高水平的中和抗体和Th1偏好的细胞免疫应答。此外，基于临床观察和肺部病毒载量的减少，与载体对照组相比，用含佐剂S-三聚体免疫的恒河猴免受SARS-CoV-2攻击。
与用于结构研究和疫苗开发的其它刺突蛋白胞外域不同，S-三聚体不包括通过弗林蛋白酶引入以消除S1/S2裂解或以将蛋白质稳定在融合前形式的突变。因此，S-三聚体在S1/S2连接处被部分裂解，类似于从活的SARS-CoV-2病毒分离的S蛋白(Gao et al.,Science,369:77-81,2020)和在HEK293细胞中表达的重组全长S蛋白(Cai et al.,Science,eabd4251,2020.doi:10.1126/science.abd425132)。如本文所述，具有来自SARS-CoV-2的完全野生型S蛋白胞外域序列的S-三聚体候选疫苗不仅在CHO细胞中高水平表达，而且高度糖基化并采用类似天然的三聚体融合前构象。N-末端蛋白质序列分析显示，在其生物合成过程中，信号肽被去除后，S-三聚体的N-末端14Q通过焦谷氨酸形成修饰，以保护自身免受外蛋白酶降解。与蛋白质三聚体化TM标签的融合允许可溶性野生型S蛋白胞外域形成二硫键连接的同源三聚体，其中部分裂解的S1与S-三聚体保持非共价结合。重要的是，S-三聚体保持与ACE2受体的高亲和力结合，表明病毒中和所需的关键抗原表位得以保留。
本发明并不旨在将范围限于特定的公开实施方案，这些实施方案被提供例如用于阐明本发明的各个方面。通过本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种改动将变得显而易见。可以在不偏离本发明的真实范围和精神的情况下实施这些变化，并且这些变化旨在落入本发明的范围。
序列
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Figure GDA0003496524170001061
Figure GDA0003496524170001071
Figure GDA0003496524170001081
Figure GDA0003496524170001091
序列表
<110> 四川三叶草生物制药有限公司
<120> 冠状病毒疫苗组合物、方法及其使用
<130> 16576-20001.43
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> PCT/CN2021/093895
<151> 2021-05-14
<150> PCT/CN2021/087066
<151> 2021-04-13
<150> PCT/CN2020/095269
<151> 2020-06-10
<160> 80
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 1509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
85 90 95
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
100 105 110
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
115 120 125
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
130 135 140
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
145 150 155 160
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
180 185 190
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
195 200 205
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
210 215 220
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
275 280 285
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
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Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
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545 550 555 560
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
565 570 575
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
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Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
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Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
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Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala
1475 1480 1485
Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly
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Pro Val Cys Phe Leu
1505
<210> 4
<211> 1509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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1 5 10 15
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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325 330 335
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Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
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485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
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Pro Val Cys Phe Leu
1505
<210> 5
<211> 836
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
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835
<210> 6
<211> 979
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
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Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
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Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
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325 330 335
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355 360 365
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Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
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Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
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565 570 575
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595 600 605
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Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser
740 745 750
Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys
755 760 765
Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp
770 775 780
Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp
785 790 795 800
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820 825 830
Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr Asp Gly
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850 855 860
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885 890 895
Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu Ile Glu
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Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp
915 920 925
Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr
930 935 940
Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu
945 950 955 960
Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val
965 970 975
Cys Phe Leu
<210> 7
<211> 837
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
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290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
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Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
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355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
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Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
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<211> 1509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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<210> 28
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<220>
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<400> 28
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<211> 1195
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<220>
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<400> 29
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<210> 30
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
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<210> 31
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<212> PRT
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<220>
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<400> 31
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
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660 665
<210> 33
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
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<210> 34
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 34
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Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
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<220>
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<220>
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<400> 38
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Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
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Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
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Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
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Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
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Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Ala
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1170 1175 1180
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1185 1190 1195
<210> 52
<211> 1177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
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<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
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1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
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625 630 635 640
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690 695 700
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725 730 735
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740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
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835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
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1265 1270
<210> 56
<211> 1208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
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65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
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195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
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485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
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Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
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Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
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Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1205
<210> 57
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser
290
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<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
35 40 45
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65 70 75 80
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Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
100 105 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
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Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
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Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
180 185 190
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Arg Arg Ala Arg
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gly Ser Ala Gly
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile
1 5 10 15
Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu
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Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu
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Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val
35 40 45
Leu Gly
50
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<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
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Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg
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35 40 45
Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp
50 55 60
Pro Leu
65
<210> 65
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
1 5 10 15
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
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Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
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Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile
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Val Met Val Thr Ile Met Leu
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys
1 5 10 15
Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg
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50 55 60
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165 170 175
Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val
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210 215 220
Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro
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Val Cys Phe Leu
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<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr
1 5 10 15
Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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165 170 175
Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp
180 185 190
Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser
195 200 205
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210 215 220
Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu
225 230 235 240
Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr
245 250 255
Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile
260 265 270
Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala
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Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly
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Pro Val Cys Phe Leu
305
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<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr
1 5 10 15
Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln
35 40 45
Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Asn Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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305
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
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Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
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Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu
195 200 205
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<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Gly Ser Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly
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245 250 255
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275 280 285
Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp
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Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
305 310
<210> 72
<211> 244
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys
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Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg
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Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val
115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro
210 215 220
Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro
225 230 235 240
Val Cys Phe Leu
<210> 73
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser
195 200 205
Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln
210 215 220
Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu
225 230 235 240
Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr
245 250 255
Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile
260 265 270
Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala
275 280 285
Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly
290 295 300
Pro Val Cys Phe Leu
305
<210> 74
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr
1 5 10 15
Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln
35 40 45
Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Asn Asp
50 55 60
Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu
65 70 75 80
Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser
85 90 95
Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser
100 105 110
Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn
115 120 125
Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys
130 135 140
Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile Ser
145 150 155 160
Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr
165 170 175
Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp
180 185 190
Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser
195 200 205
Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln
210 215 220
Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu
225 230 235 240
Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr
245 250 255
Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile
260 265 270
Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala
275 280 285
Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly
290 295 300
Pro Val Cys Phe Leu
305
<210> 75
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Arg Ser Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg
50 55 60
Ala Asn Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys
100 105 110
His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly
115 120 125
Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu
130 135 140
Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser
165 170 175
Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro
180 185 190
Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu
195 200 205
Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met
210 215 220
Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser
225 230 235 240
Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser
245 250 255
Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr
260 265 270
Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp
275 280 285
Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp
290 295 300
Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
305 310
<210> 76
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gly Ser Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg
50 55 60
Ala Asn Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys
100 105 110
His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly
115 120 125
Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu
130 135 140
Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser
165 170 175
Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro
180 185 190
Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu
195 200 205
Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met
210 215 220
Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser
225 230 235 240
Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser
245 250 255
Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr
260 265 270
Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp
275 280 285
Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp
290 295 300
Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
305 310
<210> 77
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg
20 25 30
Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val
35 40 45
Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn
50 55 60
Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro
65 70 75 80
Arg Lys His Trp Trp Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp
85 90 95
Phe Gly Glu Ser Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val Gln Leu Ala Phe Leu Arg Leu
115 120 125
Leu Ser Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser
130 135 140
Ile Ala Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys
145 150 155 160
Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys
165 170 175
Phe Thr Tyr Thr Val Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu
180 185 190
Trp Ser Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu
195 200 205
Pro Ile Val Asp Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu
210 215 220
Phe Gly Val Asp Val Gly Pro Val Cys Phe
225 230
<210> 78
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu
1 5 10 15
Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile Ser Pro Asp Gly Ser
20 25 30
Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp Leu Lys Phe Cys His Pro
35 40 45
Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys
50 55 60
Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys
65 70 75 80
Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg Lys His Trp Trp Thr Asp
85 90 95
Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Asp Gly
100 105 110
Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp Val Leu
115 120 125
Asp Val Gln Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ser Gln
130 135 140
Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Gln Ala
145 150 155 160
Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly
165 170 175
Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu Glu
180 185 190
Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val Phe Glu
195 200 205
Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile Ala Pro
210 215 220
Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val Gly Pro
225 230 235 240
Val Cys Phe Leu
<210> 79
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Ser Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile Ser Pro Asp Gly
20 25 30
Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp Leu Lys Phe Cys His
35 40 45
Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys
50 55 60
Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr
65 70 75 80
Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg Lys His Trp Trp Thr
85 90 95
Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Asp
100 105 110
Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp Val
115 120 125
Leu Asp Val Gln Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ser
130 135 140
Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Gln
145 150 155 160
Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu
165 170 175
Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu
180 185 190
Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val Phe
195 200 205
Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile Ala
210 215 220
Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val Gly
225 230 235 240
Pro Val Cys Phe Leu
245
<210> 80
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Arg Ser Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile Ser Pro Asp
20 25 30
Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp Leu Lys Phe Cys
35 40 45
His Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly
50 55 60
Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu
65 70 75 80
Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg Lys His Trp Trp
85 90 95
Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met
100 105 110
Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp
115 120 125
Val Leu Asp Val Gln Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala
130 135 140
Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp
145 150 155 160
Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn
165 170 175
Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val
180 185 190
Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val
195 200 205
Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile
210 215 220
Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val
225 230 235 240
Gly Pro Val Cys Phe Leu
245

Claims (62)

1.一种用于预防哺乳动物中冠状病毒感染的方法，该方法包括用有效量的重组亚单位疫苗免疫哺乳动物，该重组亚单位疫苗包括可溶性冠状病毒表面抗原，该可溶性冠状病毒表面抗原通过框内融合连接到胶原的C-末端部分以形成二硫键连接的三聚体融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中冠状病毒是严重急性呼吸综合征(SARS)-冠状病毒(SARS-CoV)、SARS-冠状病毒2(SARS-CoV-2)、SARS样冠状病毒、中东呼吸综合征(MERS)-冠状病毒(MERS-CoV)、MERS样冠状病毒、NL63-CoV、229E-CoV、OC43-CoV、HKU1-CoV、WIV1-CoV、MHV、HKU9-CoV、PEDV-CoV或SDCV。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括冠状病毒刺突(S)蛋白或其片段或表位。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)胞外域肽或其片段或表位。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)N-末端结构域(NTD)肽或其片段或表位。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)受体结合结构域(RBD)肽或其片段或表位。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)S1肽或其片段或表位。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)S2肽或其片段或表位。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该冠状病毒表面抗原包括具有突变的SARS-CoV-2刺突(S)胞外域肽或其片段或表位。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该突变包括685R→685A。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中该突变包括986K→986P。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中该突变包括987V→987P。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:27-66的任一个中所述的序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:1-9的任一个中所述的序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:10-13的任一个中所述的序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:14-17的任一个中所述的序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:18-21的任一个中所述的序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:22-25的任一个中所述的序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:26中所述的序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗包括SEQ ID NO:27-66的任一个中所述的第一序列连接到SEQ ID NO:67-80的任一个中所述的第二序列，其中该第一序列的C末端直接或间接连接到该第二序列的N末端。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗通过肌肉内注射施用。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗通过鼻内喷雾剂施用。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗以单剂量施用或以周或月间隔开的一系列剂量施用。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗在没有佐剂的情况下施用。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗与佐剂一起施用。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该重组亚单位疫苗与一种以上佐剂一起施用。
27.一种用于检测来自哺乳动物血清的冠状病毒抗体的方法，该方法包括将血清与可溶性冠状病毒表面抗原接触的步骤，该可溶性冠状病毒表面抗原通过框内融合连接到胶原的C-末端部分以形成二硫键连接的三聚体融合蛋白。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该可溶性冠状病毒表面抗原是S蛋白或肽。
29.一种使用包含来自冠状病毒的可溶性表面抗原的重组亚单位疫苗的方法，该可溶性表面抗原通过框内融合连接到胶原的C-末端部分以形成二硫键连接的三聚体融合蛋白，该方法包括：免疫哺乳动物，纯化产生的中和抗体，以及使用所述中和抗体通过被动免疫治疗感染所述冠状病毒的患者。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体包括多克隆抗体。
31.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体是单克隆抗体。
32.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体是S蛋白或肽的单克隆抗体。
33.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体是SARS-CoV-2的S蛋白的单克隆抗体。
34.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体是SARS-CoV-1的S蛋白的单克隆抗体。
35.根据权利要求29所述的方法，其中该中和抗体是MERS的S蛋白的单克隆抗体。
36.一种包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽的复合物。
37.一种包含选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽的三聚体的复合物，其中该重组多肽通过多肽间二硫键三聚化以形成三聚体。
38.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括重组多肽的三聚体或任何两个或更多个三聚体的组合，该重组多肽包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的序列。
39.根据权利要求38所述的免疫原性组合物，包括具有SEQ ID NO:1中所述的序列的重组多肽的三聚体。
40.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的复合物，该复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。
41.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，
其中该表面抗原包括S蛋白或其抗原片段，以及
该方法包括向受试者施用有效量的复合物，该复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。
42.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，
其中该表面抗原包括选自由SEQ ID NO:27-66组成的组的序列，以及
该方法包括向受试者施用有效量的复合物，该复合物包括选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的重组多肽。
43.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，
其中该表面抗原包括冠状病毒的S蛋白或其抗原片段，并且可选地，该表面抗原包括SEQ ID NO:55中所述的序列或其抗原片段，以及
该方法包括向受试者施用有效量的复合物，该复合物包括包含SEQ ID NO:10-25的任一个中所述的序列的重组多肽。
44.一种用于在受试者中产生对冠状病毒表面抗原的免疫应答的方法，
其中该表面抗原包括S蛋白或其抗原片段，以及
该方法包括向受试者施用有效量的复合物或任何两种或更多种复合物的组合，该复合物包括包含选自由SEQ ID NO:1-26组成的组的序列的重组多肽。
45.根据权利要求44所述的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的包括重组多肽的复合物，该重组多肽包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和/或SEQ IDNO:13中所述的序列。
46.一种包含多个重组多肽的融合蛋白，每个重组多肽从氨基到羧基末端包括：
a)第一区域，该第一区域包括位于第一冠状病毒的非嵌合冠状病毒刺突蛋白中的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)之前的冠状病毒刺突蛋白胞外域的一部分；
b)第二区域，该第二区域包括不同于所述第一冠状病毒的第二冠状病毒的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)；和
c)胶原的C-末端前肽，其中该重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。
47.根据权利要求46所述的融合蛋白，还包括该第二区域与该胶原的C-末端前肽之间的第三区域。
48.根据权利要求47所述的融合蛋白，其中该第三区域包括第三冠状病毒的S1结构域，其中该第三冠状病毒与第一冠状病毒或第二冠状病毒相同或不同。
49.根据权利要求47或48所述的融合蛋白，其中该第三区域包括第四冠状病毒的S2结构域，其中该第四冠状病毒与第一、第二或第四冠状病毒相同或不同。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的融合蛋白，其中该第一区域包括第一冠状病毒的N-末端结构域(NTD)。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的融合蛋白，其中该第一区域包括与第二冠状病毒中的相应氨基酸残基不同的一个或更多个氨基酸残基。
52.根据权利要求46-51中任一项所述的融合蛋白，其中该第二区域包括与第一冠状病毒中的相应氨基酸残基不同的一个或更多个氨基酸残基。
53.根据权利要求46-52中任一项所述的融合蛋白，其中该第一和第二冠状病毒是相同冠状病毒的不同变种或毒株。
54.根据权利要求53所述的融合蛋白，其中该第一区域包括第一冠状病毒的NTD，该第二区域包括第二冠状病毒的RBD，并且第一和第二冠状病毒是SARS-CoV-2的不同变种。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的融合蛋白，其中该第一冠状病毒和第二冠状病毒独立地选自由B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的SARS-CoV-2病毒组成的组。
56.一种包含三个重组多肽的三聚体融合蛋白，每个重组多肽从氨基到羧基末端包括：
a)第一区域，该第一区域包括B.1.526谱系的SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白N-末端结构域(NTD)；
b)第二区域，该第二区域包括B.1.351谱系的SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域(RBD)；和
c)胶原的C-末端前肽，其中该重组多肽的C-末端前肽形成多肽间二硫键。
57.一种用于预防哺乳动物中冠状病毒感染的方法，该方法包括用有效量的根据权利要求46-56中任一项所述的融合蛋白免疫哺乳动物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中在哺乳动物中产生针对该第一和第二冠状病毒的中和抗体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中该第一和第二冠状病毒是SARS-CoV-2的不同变种，并且在哺乳动物中产生的中和抗体中和B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的两种或更多种SARS-CoV-2病毒。
60.根据权利要求59所述的方法，其中在哺乳动物中产生的中和抗体中和B.1.526、B.1.1.143、P.2、B.1.351、P.1、B.1.1.7、B.1.617和A.23.1谱系的三种或更多种SARS-CoV-2病毒。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，包括用两剂或更多剂的融合蛋白免疫哺乳动物。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中在一剂或更多剂的免疫原之后以再次加强剂施用融合蛋白，该免疫原包括包含来自相同SARS-CoV-2变种的NTD和RBD的刺突蛋白肽。
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