JP2008521385A - アジュバントとしてのCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチド - Google Patents
アジュバントとしてのCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008521385A JP2008521385A JP2007541653A JP2007541653A JP2008521385A JP 2008521385 A JP2008521385 A JP 2008521385A JP 2007541653 A JP2007541653 A JP 2007541653A JP 2007541653 A JP2007541653 A JP 2007541653A JP 2008521385 A JP2008521385 A JP 2008521385A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vaccine
- cpg odn
- hbsag
- virus
- adjuvant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
CpGジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドを、少なくとも1個含んでいるアジュバントであって、該CpG含有一本鎖デオキシヌクレオチドは、1個又は多数個のCpGジヌクレオチドを含有している。前記アジュバントは、狂犬病ワクチン、B型肝炎ワクチン又はそのほかのワクチンと組み合わせて使用される場合、ワクチンの免疫効果を顕著に増強させることができる。
Description
本発明は、CpGジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチド(deoxynucleotide)に関しており、特に、B型肝炎ウイルスワクチン、狂犬病ウイルスワクチンのアジュバントとして用いられるCpGジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドに関する。さらに、CpGジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドの配列にも関する。
CpG ODNは、非メチル基化のシトシン−グアニンヌクレオチド(CpG)を中心とするオリゴデオキシヌクレオチド(Oligodeoxynucleotides, ODN)であり、当該CpGの両端と隣接している塩基の配列は、大体5’PurPurCGPyrPyr3’との規律に沿っている。すなわち、5’末端が二つのプリンで、3’末端が二つのピリミジンである(非特許文献1)。研究結果によると、CpG ODNは複数種類の免疫効果細胞を活性化させることができ、非メチル基化のCpGジヌクレオチドは、CpG ODN配列が免疫学活性を具備する重要な条件である。細菌、ウイルス、無脊椎動物のDNAは、非メチル基化のCpGジヌクレオチドを有しているため免疫活性作用を具備しているが、脊椎動物のDNAはその中に含まれているCpGがメチル基化されているため、免疫活性作用を具備していない。免疫系はこれらの特定の非メチル基化のCpG配列を識別することによって、外来性DNAに対する免疫応答を誘発している(非特許文献2)。
狂犬病(rabies,恐水病(hydrophobia)とも言う)は、60個を超える国において発生されたことのある疾病である(非特許文献3)が、その中で東南アジアにおける発病率は世界の他の国に比べて高く、中国内地における発病率は0.4/10万〜1.58/10万に達している。最近、中国を含めて多くの国において狂犬病の発生率が高くなる傾向になっている(非特許文献4)。発病した患者の死亡率はほぼ100%に達する。
ヒト狂犬病は、一般的に狂犬病ウイルスに感染した動物、例えば犬の咬傷によってヒトに伝染される。中国においては、80〜90%のヒト狂犬病が感染した犬の伝播によって発生する。ヒト狂犬病は中枢神経系を侵すことを特徴とする急性伝染病である(非特許文献5)。その臨床症状は、特有の怖水、怖風、強い不安感、咽喉頭筋の痙攣、進行性麻痺などである。
狂犬病ウイルスは、Rhabdoviridae科に属するウイルスであり、大きさが約75×180nmである一本鎖のマイナス鎖RNAである。狂犬病ウイルスの外表面はタンパク質外膜によって囲まれており、その表面にリポタンパク質皮膜を有し、その皮膜の上に、糖タンパク質からなるスパイクが形成されている。狂犬病ウイルスは免疫原性を有しており、中和抗体を生成させることができ、雛、ガチョウ等の動物の赤血球を凝集させる機能を発揮できる。狂犬病ウイルスは、紫外線、第4級アンモニウム化合物、ヨードチンキ、過マンガン酸カリウム、アルコール、ホルムアルデヒドなどによって、失活される。100℃に2分間加熱しても狂犬病ウイルスを失活させることができる。狂犬病ウイルスは低温に耐えられ、−70℃或いは−4℃(凍結乾燥状態)の条件下で何年間も存在できる。
現在、狂犬病に対して特に有効な治療法がなく、狂犬病予防用の主な対策になっているのは、狂犬病ウイルスワクチンを接種することと、抗狂犬病の血清を使用することである。中国において用いられている狂犬病ウイルスワクチンは、ハムスター腎臓細胞ワクチンであるが、その免疫プロセスとして、第0日、第3日、第7日、第14日および第30日にそれぞれ1回ずつ筋肉注射して、全部5回筋肉注射をしている。酷く咬傷された人間に対しては、狂犬病ウイルスワクチンの使用量を増加してもよい。例えば、咬傷された当日から第6日まで毎日1回ずつ注射した後、さらに、第10日、第14日、第30日、第90日にそれぞれ1回ずつ注射して、合わせて10回注射するほうが良い。人間の病犬に咬傷された後の平均発病率は15〜20%である。狂犬病ウイルスワクチンを注射することにより、狂犬病の発生を有効に予防することができる。全コース注射後の発病率は0.15%である。
B型ウイルス肝炎は、B型肝炎ウイルス(HBV)による肝臓炎症性損害であり、人類の健康を影響する重篤な疾病である。2004年までに、世界的に4億人がB型肝炎ウイルスに感染されており(非特許文献6)、アジア人が感染者の中で高い比例を占めている。中国においてB型肝炎ウイルスの保菌者は人口総数の10%以上に達している。アルミニウムをアジュバントとするB型ウイルス肝炎の表面抗原遺伝子工学ワクチン(HbsAg)を接種することは、B型肝炎ウイルスの伝播を予防/制御するための主な措置となっている。WTOの報道によると、1982年以後、世界的に10億投与量のB型肝炎ウイルスワクチンが消費され、B型肝炎ウイルスの伝播を予防/制御するに非常に重要な役割を発揮している。このようなワクチンがB型肝炎を予防する主要なメカニズムは、保護性抗体であるIgG1を生成・分泌するように生体を誘導することである。このような抗体は、細胞外のウイルスを中和できるが、感染した細胞内に潜伏しているB型肝炎ウイルスを徹底的に除去することは不可能である。したがって、患者体内におけるB型肝炎ウイルスの隠匿を招く場合が多い。且つ、約10%の人間が該ワクチンに対して反応力が低いか又は反応しない。そこで、現有B型肝炎ウイルスワクチンの免疫活性を如何に向上させるか、または、細胞内に隠匿しているB型肝炎ウイルスを消滅できるメカニズムを有効に活性化できるワクチンを開発することが、重要な課題になっている。現在、国内外の研究者は各方面から新規HBV遺伝子工学ワクチンについて研究を進んでいるが、その研究の重要な内容になっているのは、B型肝炎ウイルスワクチンの有効な免疫アジュバントを探すことである。CpG ODNは近年に発見された新規免疫アジュバントである。
数多くの実験結果から分かるように、CpG ODNはB型肝炎ウイルスワクチンと相乗して、マウス、人間、人間以外の霊長類動物体内の特異性抗体の生成及び細胞毒性Tリンパ細胞(CTL)反応を促進でき(非特許文献7)、B型肝炎ウイルスワクチンの安全且つ有効なアジュバントとして使用できる。
1998年、Davisらは、HbsAgとCpG ODN1826(アジュバントとして)にてBALB/cマウスに対して免疫を行った。B型肝炎ウイルスの表面抗原抗体(HBsAb)を測定した結果、HbsAgにアジュバントとしてCpG ODNを使用した場合にマウス体内に生成されたHbsAbは、HbsAgにアジュバントとしてアルミニウムをアジュバントとして使用した場合より5倍高い。なお、HbsAgにアジュバントとしてCpG ODNとアルミニウムアジュバントを使用した場合にマウス体内に生成されたHbsAbは、HbsAgにアジュバントとしてアルミニウムアジュバントを使用した場合に比べ35倍高く、HbsAgにアジュバントとしてCpG ODNを使用していなかった場合には、HbsAbを生成しないか、低レベルのHbsAbしか生成していなかった。上記の結果から、CpG ODNは、HbsAgのアジュバントとしてマウスを刺激してHbsAbを生成させるに用いられる場合、その作用がアルミニウムアジュバントより優れており、CpG ODNとアルミニウムアジュバントとの間には強い相乗効果を発生できることが分かれる。ELISAと51Crキラー試験結果から、CpG ODNとHbsAg又はCpG ODNとアルミニウムアジュバントとHbsAgとの併用により、Th1型免疫応答を生成するようにマウスを刺激でき、その表現としてはIgG2aHBsAbを生成し、HBV特異性のCTL反応を伴うとのことである。なお、アルミニウムアジュバントとHbsAgとの併用によっては、主にTh2型免疫応答を生成するようにマウスを刺激でき、その表現としてIgG1HbsAbは生成するが、HBV特異性のCTL反応は伴わない。インビトロで細胞表面分子抗体の染色結果から分かるように、CpG ODNがHbsAgの免疫効果を増強させるメカニズムは、CpG が抗原提示細胞(antigen presenting cell)を誘導して共刺激分子を表現させること、Bリンパ細胞から生成された抗体を相乗的に刺激してクラス転換を発生させることと密接な関係を持っている(非特許文献8)。
以上の研究結果から分かるように、CpG ODNはB型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとしていろんな面でその応用が期待されている。
G. Mutwiri, R . Pontarollo, S . BaBIUK . Bological activity of immunostimulatory CpG ODN motif in domestic animals. Veterinary Immunopathology, 2003, 91: 89-103.
YiAK, Klinman DM, Martin TL, et al. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. Immunol, 1996, 157(12):5394-402.
Wolfgang Haupt. Rabies - risk of exposure and current trends in prevention of human cases. Vaccine 1999 (17): 1742-1749.
David W Dreesen. A global review of rabies vaccines for human use. Vaccine, 1997,15,suppl s2-s6. D. Zienius, J. Bagdonas, A. Dranseika. Epidemiological situation of rabies in Lithuania from 1990 to 2000. Veterinary Microbiology, 2003(93):91-100.
ALAN C. JACKSON, WILLIAM H. WUNNER. Detection of Rabies Virus Genomic RNA and mRNA in Mouse and Human Brains by Using In Situ Hybridization. JOURNAL OF VIROLOGY, 1991,65(6):2839-2844.
Lin KW, Kirchner JT. Hepatitis B.Am Fam Physician, 2004 Jan 1, 69(1):75-82.
Weeranta RD, McCluskie MJ, Xu Y, et al. CpG ODN is a novel non-toxic adjuvant which induces stronger immune responses than many conventional adjuvants. Vaccine, 2000, 18: 1755-62.
Hartmann G, Weeratna RD, Ballas ZK, et al. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. Immunol, 2000, 164:1617-24.
厳家新、李承平、朱家鴻ら、狂犬病ウイルス中和抗体を測定する快速蛍光巣抑制試験方法の設立、中国生物製品雑誌、1998,11(2):93-96;中華人民共和国衛生部. 中国生物製品規定(一部),北京:中国人口出版社,1996,201.
本発明の目的は、ワクチンのアジュバントとして使用可能のCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチドを提供することにある。
本発明に係るCpG ODNの構造は以下の式1〜5で表すことができる。
1.(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n、但し、X1=A,T,G;X2=A,T;Y1=A,T;Y2=A,T,C;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。X1はアデニン、チミン、グアニンでよい;X2はアデニン又はチミンでよい;Y1はアデニン又はチミンでよい;Y2はアデニン、チミン、シトシンでよい;L,Mはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
2.(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n、但し、X=A,T;Y= A,T;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。Xはアデニン又はチミンでよい;Yはアデニン又はチミンでよい;L,Mはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
3.(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n、但し、L,M=A,T,C,G;nは0−6である。L,Mはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
4.(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n、但し、X1=A,T,G;X2=A,T;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。X1はアデニン、チミン、グアニンでよい;X2はアデニン又はチミンでよい;L,Mはアデニン、チミン、シトシンでよい。
5.TTCGTCGを含む配列。
本発明の詳細な説明に基づいて、当業者であれば、一本鎖デオキシヌクレオチドの塩基に対して修飾を行うことができることが分かるはずである。その修飾の方式としては、非チオ化修飾,チオ化修飾,部分的チオ化修飾,希有塩基修飾(dI,dUなど),メチル化修飾,メルカプト、Aminolinker C6、Thiol−C6 S−S等のほかの物質とのカップリングの後に修飾を行う修飾方式などが挙げられる。同様に、二つ以上のCpGジヌクレオチドを含む一本鎖デオキシヌクレオチドであっても、その中におけるCpGジヌクレオチドの作用は、CpGジヌクレオチドを一つのみ含む一本鎖デオキシヌクレオチドと同じく、本発明の目的を実現できる。
本発明のCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチドは、ワクチンの免疫効果を向上させるために、他の非核酸アジュバントと組み合わせて使用してもよい。前記非核酸アジュバントとしては、アルミニウムアジュバント、Freund’sアジュバント、MPL、乳剤などが挙げられる。
本発明は、さらに、ワクチンの免疫原性を向上させる方法を提供している。前記方法は、ワクチンを本発明のアジュバントと組み合わせて使用することを特徴としている。前記アジュバントは、本発明のCpGジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドを少なくとも一つ含んでおり、該CpG含有一本鎖デオキシヌクレオチドは一つ又は二つ以上のCpGジヌクレオチドを含んでいる。前記ワクチンとして、狂犬病ワクチン、B型肝炎ウイルスワクチンが挙げられるが、これらに限られることではない。前記B型肝炎ウイルスワクチンとして、B型肝炎ウイルス血液源性ワクチン、B型肝炎ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、B型肝炎ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、B型肝炎ウイルスのウイルスベクターワクチン、B型肝炎ウイルスの細菌ベクターワクチン、B型肝炎ウイルスDNAワクチンなどが挙げられるが、これらに限られることではない。B型肝炎ウイルス表面抗原(HbsAg)が上記のワクチン中の主要な抗原成分であってもよい。前記狂犬病ワクチンとしては、狂犬病ウイルス血液源性ワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、狂犬病ウイルスのウイルスベクターワクチン、狂犬病ウイルス細菌ベクターワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、狂犬病ウイルスDNAワクチンが挙げられるが、これらに限られることではない。なお、本発明のアジュバントは非核酸類のアジュバントと組み合わせて使ってもよい。
本発明のアジュバントは、狂犬病ウイルスワクチンと組み合わせて使われる場合、生体の狂犬病ウイルスに対する反応を顕著に向上させることができ、狂犬病ワクチンの注射回数を減少できる。又、HbsAgと組み合わせて使われる場合、CpG ODNはB型肝炎ウイルスワクチンの免疫原性を増強させることができ、速やかに免疫反応を行うように生体を刺激して、Th1免疫応答を誘導し、免疫反応時限を延長して、免疫回数を減少できる。かつ、未成熟又は老衰個体の免疫活性を向上させることができる。このように、CpG ODNはB型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとして使用することができる。
以下、実施例にて、当業者が理解できるように本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の目的を説明するための例に過ぎなく、本発明を制限できるものではない。
(実施例1:CpG一本鎖デオキシヌクレオチドの設計)
配列を以下のように設計することができる。
配列を以下のように設計することができる。
(1)(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n、但し、X1=A,T,G;X2=A,T;Y1=A,T;Y2=A,T,C;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。(表1)
(2)(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n、但し、X=A,T; Y=A,T;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。(表2-1、表2-2)
(3)(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n、但し、L,M=A,T,C,G;nは0−6である。(表3-1、表3-2)
(4)(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n、但し、X1=A,T,G;X2=A,T;L,M=A,T,C,G;nは0−6である。配列を以下のように設計することができる。(表4-1、表4-2、表4-3)
(5)TTCGTCGを含んでいる配列(表5)
本発明CpG ODNは、以下の表6の配列を有することが好ましい。
以下の実施例において、使われたCpG ODNは、[ ]中の数字にて表す。
(実施例2:CpG含有一本鎖デオキシヌクレオチドの合成)
固相亜リン酸トリエステル法にてDNA断片を合成した。該方法は高効率、快速などのメリットを具備しており、DNAの化学合成においてよく使われている。
固相亜リン酸トリエステル法にてDNA断片を合成した。該方法は高効率、快速などのメリットを具備しており、DNAの化学合成においてよく使われている。
DNAの化学合成は、酵素触媒のDNA合成とは異なっている。即ち、酵素触媒のDNA合成では、5’末端から3’末端へ延伸するが、DNAの化学合成は3’末端から始まった。具体的な反応ステップは以下の通りである。
1.脱保護基化:トリクロロ酢酸を用いてCPG(Controlled Pore Glass)に連結されているヌクレオチドの保護基であるDMT(ジメトキシトリチル)を脱離させて、遊離状態の5’−ヒドロキシ基末端を形成して、次の縮合反応に供する。
2.活性化:亜燐酸アミドによって保護されているヌクレオチド単体をテトラゾールと混合してから、合成カラムに投入して、亜燐酸アミドテトラゾール活性中間体(3’末端は活性化されているが、5’末端はDMTによって保護されている)を形成する。該中間体をCPGの上の脱保護基化されたヌクレオチドと縮合反応させる。
3.連結:亜燐酸アミドテトラゾール活性中間体は、CPGの上の脱保護基化されたヌクレオチドと反応するに際して、その中の5’―ヒドロキシ基と親和反応を行い、縮合によりテトラゾールが脱離される。この場合、合成されたオリゴヌクレオチド鎖は、前に向かって一つの塩基の長さで延長される。
4.ブロッキング:縮合反応が終わった後、CPGの上の反応に参加しなかった5’−ヒドロキシ基が次の循環反応において延伸されることを防止するために、通常、アセチル化によって該末端のヒドロキシ基をブロッキングする。一般的に、アセチル化剤は無水酢酸とN−メチルイミダゾール等との混合反応によって生成されたものである。
5.酸化:縮合反応を行う時、ヌクレオチド単体は亜燐酸エステル結合を介してCPGの上のオリゴヌクレオチドに連結されるが、亜燐酸エステル結合が酸、アルカリによって加水分解されやすくて不安定であるため、通常、ヨードのテトラヒドロフラン溶液にて亜燐酸エステルをリン酸トリエステルに転換させて、安定したオリゴヌクレオチドを形成する。
以上の五つのステップを通じて、一つのデオキシヌクレオチドがCPGの上のヌクレオチドに連結される。同様に、さらにトリクロロ酢酸にて新たに連結されたデオキシヌクレオチドの5’―ヒドロキシ基の保護基DMTを脱離させて、上記の活性化、連結、ブロッキング、酸化のステップを繰り返すと、一つのDNA断片粗品が得られる。最後に、切断、脱保護基化(一般的に、A、C塩基に対してはベンゾイル基保護、G塩基に対してはイソブチリル基保護を行い、T塩基は保護する必要がなく、亜リン酸はニトリルエチルにて保護する)、精製(通常使われているのは、HAP、PAGE、HPLC、C18、OPCなどの方法である)、定量化などの合成後処理を行うことにより、実験レベルのオリゴヌクレオチド断片が得られる。
固相におけるオリゴヌクレオチド合成はDNA合成装置中で行われる。上記の方法によってオリゴヌクレオチドを合成する場合、保護基が脱離された後、目的オリゴヌクレオチドの純度は極めて低く、多くの不純物を含んでいる。その中の主な不純物としては、脱離された保護基とアンモニアから生成された安息香酸アンモニア、イソ酪酸アンモニア、ニトリルホスフェート基(nitrile phosphate)から脱離されたニトリルエチル基、及び合成する時に生成された短鎖などが挙げられる。したがって、粗生成品中のオリゴヌクレオチドの含有量は、15%左右のみである。合成するときのステップごとの効率がいずれも97%〜98%になっているにもかかわらず、累積の効率は高くない。故に、粗生成品中のオリゴヌクレオチドの含有量がとても低く、10%未満になる場合もある。これらの不純物、特に粗生成品中に存在している多くの塩と短鎖は定量化の精度を低下させるだけでなく、次の反応にも影響をもたらすので、オリゴヌクレオチドについて精製を行う必要がある。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を採用して精製するほうが好ましい。該方法によって精製された製品は純度が高く、且つ該方法はほとんどの分子生物学実験に使用可能であり、多くの予測できない迷惑も避けることができるからである。コストの面から考慮すると、精度に対する要求が低い実験、例えばPCR反応などに対しては脱塩精製法を採用してもよい。
オリゴヌクレオチドはOD260値により計量される。1mlの1cm光路程の標準石英比色皿の中で、260nmの波長下で吸光度が1であるオリゴヌクレオチドを、1OD260と定義した。オリゴヌクレオチドの種類によって塩基の組成が全く一致しているのではないが、1OD260のオリゴヌクレオチド重量は大体33μgである。
(実施例3:狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNの刺激増強効果の比較)
1.実験動物:マウス200匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けているが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表7)
5.CpG ODNの調製:50μlのPBSで異なる投与量のCpG ODNを溶解させて、対応する濃度のCpG ODN溶液を調製した。
6.マウスの免疫:第0日、第3日、第7日、第14日、第28日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、実験の組み分け項目に記載の狂犬病ワクチン又は狂犬病ワクチン+CpG ODNを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。
7.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けているが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。0.5mlの体積で接種する。
8.狂犬病ワクチン抗体の測定:第35日に、マウスの尾部静脈から採血して、快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法(非特許文献9)を利用して、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体の存在を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
9.結果:CpG ODNの投与量の増加に従って、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体のレベルが高くなった。その結果を図1に示した。
10.結論:CpG ODNは、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、刺激効果を顕著に向上させることができる。これにより、CpG ODNが狂犬病ワクチンの有効なアジュバントであることが明らかになった。
(実施例4:狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較)
1.実験動物:マウス200匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表8)
5.CpG ODNの調製:50μlのPBSで異なる投与量のCpG ODNを溶解させて、対応する濃度のCpG ODN溶液を調製した。
6.マウスの免疫:第0日、第3日、第7日、第14日、第28日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、実験の組み分け項目に記載の狂犬病ワクチン+Alアジュバント又は狂犬病ワクチン+Alアジュバント+CpG ODNを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。Alアジュバントの終濃度は0.5mg/mlである。
7.狂犬病ワクチン抗体の測定:第35日に、マウスの尾部静脈から採血して、快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
8.結果:CpG ODNの投与量の増加に従って、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体のレベルが高くなった。狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較結果を図2に示した。
9.結論:CpG ODNとアルミニウムアジュバントは、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、刺激効果を顕著に向上させることができる。これにより、CpG ODNとアルミニウムアジュバントとの組み合わせが、狂犬病ワクチンの強効なアジュバントであることが明らかになった。
(実施例5:狂犬病ワクチンで生体を刺激して特異性抗体を生成させる場合の、抗体生成速度に対するCpG ODNの影響)
1.実験動物:マウス80匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表9)
5.マウスの免疫方式:第0日、第3日、第7日、第14日、第28日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、狂犬病ワクチンまたは狂犬病ワクチン+Alアジュバント又は狂犬病ワクチン+Alアジュバント+CpG ODNを注射して免疫を行った。ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。アジュバントの終濃度は0.5mg/mlである。
6.狂犬病ワクチン抗体の測定:第0日、第5日、第7日、第14日、第28日、第35日、第49日、第63日、第77日に、各マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
7.結果:CpG ODNとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、抗体の力価はどの時点においても、狂犬病ワクチンを単独使用する場合の力価と、アルミニウムアジュバントを単独使用する場合の力価と、CpG ODNを単独使用する場合の力価との中のいずれかより高い。その結果を図3に示した。
8.結論:CpG ODNとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用すると、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、抗体の出現速度を高めることができる。
(実施例6:狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのCpG ODNが、狂犬病ワクチンの免疫回数を減少できるか否かに係る実験)
1.実験動物:マウス80匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組にして、10組に分けるが、1組中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表10)
5.マウスの免疫方式:組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、狂犬病ワクチンまたは狂犬病ワクチン+Alアジュバント又は狂犬病ワクチン+Alアジュバント+CpG ODNを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。Alアジュバントの終濃度は0.5mg/mlである。免疫の回数をそれぞれ、5回、4回、3回に設定した。5回免疫の場合、免疫の時間はそれぞれ、第0日、第3日、第7日、第14日、第28日であり、4回免疫の場合は、第0日、第7日、第14日、第28日であり、3回免疫の場合には、第0日、第7日、第21日である。
6.狂犬病ワクチン抗体の測定:最後の免疫を行ってから7日間過ごした後、各マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
7.結果:CpG ODNとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、免疫を3回、4回、5回行ったマウスはいずれも高いレベルの狂犬病ウイルス特異性抗体を生成することができた。その結果を図4に示した。
8.結論:CpG ODNとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、狂犬病ワクチンにて免疫を3回行ったマウスであっても、高いレベルの抗体を生成することができる。
(実施例7:狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのCpG ODNが、狂犬病ワクチンの使用量を減少できるか否かに係る実験)
1.実験動物:マウス128匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表11)
5.マウスの免疫方式:第0日、第3日、第7日、第14日、第21日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に注射して免疫を行った。ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。アジュバントの終濃度は0.5mg/mlである。
6.狂犬病ワクチン抗体の測定:第28日に、マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
7.結果:狂犬病ワクチンの使用量を減少した場合であっても、CpG ODNと組み合わせて使用したら、依然としてマウスを刺激して高レベルの狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させることができた。これから分かるように、CpG ODNは狂犬病ワクチンの使用量を減少することができる。その結果を図5に示した。
8.結論:CpG ODNは狂犬病ワクチンの使用量を減少することができる。
(実施例8:狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの種類によるCpG ODNの刺激増強効果の比較)
1.実験動物:マウス112匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は18〜22gであり、6〜8週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
2.狂犬病ワクチン:1ml/枝(2.5IUを含む)、長春生物製品所から購入した。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
4.対照配列:5’−TCgTCgTTTTgTCgTTTTgTcgTT−3’[2006]
5.実験の組分け:8匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。(表12)
6.マウスの免疫方式:第0日、第3日、第7日、第14日、第28日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に注射して免疫を行った。ワクチンの用量は0.5ml/マウスである。アジュバントの用量は0.5mg/mlである。
7.狂犬病ワクチン抗体の測定:第35日に、マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験(RFFIT)方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を、陰性対照とした。
8.結果:狂犬病ワクチン+CpG667と、狂犬病ワクチン+CpG309との、抗体生成を刺激する効果は、狂犬病ワクチン+CpG2006に比べて顕著に優れている。その結果を図6に示した。
9.結論:CpGODN667とCpGODN309は、狂犬病ワクチンの免疫効果を顕著に増強させることができる。
(実施例9:ELISA法によるB型肝炎ウイルス抗体の測定)
I.試薬
1.HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製)ワクチンの調製: 1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて、応用液を調製した(1mg/1ml)。
1.HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製)ワクチンの調製: 1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて、応用液を調製した(1mg/1ml)。
2.HRP−house−anti−mouse secondary antibody、北京鼎国生物技術有限公司製。
3.PBS:1000ml;NaCl…8g(北京化工場製)、KCl…0.2g(北京化工場製)、Na2HPO4・12H2O…2.9g(北京化工場製)、KH2PO4…0.2g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、HCl又はNaOHにてPH7.2−7.4になるまでPH値を調整してから、1000mlに定容した。
4.コーティング液:100ml;PBS…80ml、50%グルタルアルデヒド…1.6ml(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容した。
5.洗浄液:500ml;PBS…400ml、Tween20…0.5ml(北京化工場製)、NaCl…14.625g(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで500mlに定容した。
6.ブロッキング液:100ml;PBS…80ml、脱脂ミルク…5g(北京鼎国生物技術有限公司製)、BSA…1g(北京鼎国生物技術有限公司製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容して、0.05gのアジ化ナトリウムを添加した。
7.サンプル希釈液:1000ml;Tris…2.42g(北京化工場製)、NaCl…8.77g(北京化工場製)。800mlの超純水にて溶解させた後、HClでPH7.1になるまでPH値を調整してから、以下の物質を添加した後、超純水にて1000mlに定容した。BSA…1g、Tween20…0.5ml。
8.基質液
甲液:クエン酸…19.2g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
乙液:Na2HPO4・12H2O…71.7g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
基質液:甲液…47.276ml、乙液…50ml。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、0.22μmのろ過膜で濾過・除菌した。
甲液:クエン酸…19.2g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
乙液:Na2HPO4・12H2O…71.7g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
基質液:甲液…47.276ml、乙液…50ml。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、0.22μmのろ過膜で濾過・除菌した。
9.終止液:100ml;濃硫酸…20ml(北京化工場製)。80mlの超純水中に攪拌しながら緩やかに添加した。
II.方法
1.コーティング:10mlのコーティング液を取り、その中にHBsAg(1mg/ml)100μlを添加した。即ち、コーティング液でその終濃度が10μg/mlになるまでHbsAgを希釈した。酵素標識プレートのウェル毎に100μlの希釈されたHbsAgを添加した。酵素標識プレートを4℃の雰囲気中で1晩放置した。
1.コーティング:10mlのコーティング液を取り、その中にHBsAg(1mg/ml)100μlを添加した。即ち、コーティング液でその終濃度が10μg/mlになるまでHbsAgを希釈した。酵素標識プレートのウェル毎に100μlの希釈されたHbsAgを添加した。酵素標識プレートを4℃の雰囲気中で1晩放置した。
2.洗浄:翌日に酵素標識プレートを取り出して、その中の液体を除去した。ウェル毎に300μlの洗浄液を添加した。室温で3分間放置してから、その中の液体を振り捨てた後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。同様にして3回洗浄した。
3.ブロッキング:酵素標識プレートのウェル毎に300μlのブロッキング液を添加した後、室温で2時間放置した。
4.被測定サンプルの添加:上記方法2と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液により異なる希釈度に希釈された被測定サンプルをウェル毎に300μl添加した。各希釈度について二重ウェルで試験を行った。室温で2時間放置した。
5.HRP−house−anti−mouse secondary antibodyの添加:上記方法2と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液でHRP−house−anti−mouse secondary antibodyを希釈した(1:1000)。ウェル毎に100μlの希釈されたHRP−house−anti−mouse secondary antibodyを添加した。室温、遮光条件下で、2時間放置した。
6.基質液の添加:上記方法2と同じにして洗浄した後、ウェル毎に100μlの新たに調製した基質液を添加した。室温、遮光条件下で、20分間放置した。
7.終止液の添加:酵素標識プレートで20分間孵化させてから、直接に酵素標識プレート中に50μlの終止液を添加した。
8.酵素標識機による測定(A492nm):終止液を添加してから5分間以内に酵素標識機による測定を行った(A492nm)。
9.陽性値の判断:サンプルのOD値/陰性対照のOD値≧2である場合、陽性値であると判断した。
(実施例10:HBsAgで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの種類によるCpG ODNの刺激増強効果の比較)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいない,北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させて応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。
6.対照CpG ODNの配列:5’−TCgTCgTTTTgTCgTTTTgTcgTT−3’[2006]
II.方法
1.マウスの組み分け:10匹/組(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)(表13)
1.マウスの組み分け:10匹/組(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)(表13)
2.HBsAgで刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの種類によるCpG ODNの刺激増強効果の比較:HbsAg応用液と異なる配列のCpG ODN応用液を用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の3日前(陰性血清)及び免疫の4週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、10μl毎の血液に2μlのヘパリンナトリウム(上海至▲きん▼化工有限公司,0.2gを量り、100mlのddH2O(double distilled water)に溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌する)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、配列の異なるCpG ODNをアジュバントとして添加した場合、マウス体内で生成されたHbsAgのタイターを異なる程度で向上させることができる。HbsAgワクチンを単独に使用する場合に比べ、HbsAg+CpG ODNを使用すると、マウスを有効に刺激して高レベルのHbsAgを生成させることができる。分散解析を行い、有意差ありとした(P<0.05)。各組の抗体タイターの比較結果を図7に示した。
(実施例11:HBsAgで刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNの刺激増強効果の比較)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで異なる投与量のCpG ODNを溶解させて対応する濃度のCpG ODN溶液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN溶液と、1μlのHbsAg応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.マウスの組み分け:10匹/組(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)(表14)
1.マウスの組み分け:10匹/組(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)(表14)
2.HBsAgで刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNの刺激増強効果の比較:HbsAgと、異なる投与量のCpG ODNとを用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の3日前(陰性血清)及び免疫の4週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、10μl毎の血液に2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、投与量の異なるCpG ODNを添加した場合、マウス体内で生成されたHbsAgのタイターを異なる程度で向上させることができる(図8を参照)。CpG ODNアジュバントの投与量≧10μgである時、HbsAgワクチンを単独使用する場合に比べ、いずれもマウス体内に生成されるHbsAgのタイターを顕著に向上させることができる(P<0.05)。各組の抗体のタイター比較結果を図8に示した。
(実施例12:HBsAgで刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいる(25 mg A13+/mg HBsAg)。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで異なる投与量のCpG ODNを溶解させて、対応する濃度のCpG ODN溶液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN溶液と、1μlのHbsAg(25mgA13+/mgHBsAg)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.マウスの組み分け:10匹/組(表15)
1.マウスの組み分け:10匹/組(表15)
2.HBsAgで刺激して抗体を生成させる場合の、CpG ODNの投与量によるCpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較:HbsAgと、異なる投与量のCpG ODNとを用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の3日前(陰性血清)及び免疫の4週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、10μl毎の血液に2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、投与量の異なるCpG ODNを添加した場合、マウス体内で生成されたHbsAgのタイターを異なる程度で向上させることができる。CpG ODNアジュバントの投与量≧10μgである時、HbsAgとアルミニウムアジュバントとの併用(25mgA13+/mgHBsAg)に比べ、CpG ODNとHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない)との併用が、マウス体内に生成されるHbsAgのタイターを顕著に向上させることができる(P<0.05)。各組の抗体のタイター比較結果を図9に示した。
(実施例13:CpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用が、HBsAgの免疫効果の対する増強作用)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいる)、HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない)。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させてCpG ODN応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.マウスの組み分け:10匹/組(表16)
1.マウスの組み分け:10匹/組(表16)
2.CpG ODNとアルミニウムアジュバントとの併用が、HBsAgの免疫効果の対する増強作用:実験マウスを、HBsAg 組と、HBsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいる)(25mgA13+/mgHBsAg)組と、HBsAg+CpG ODN組と、HBsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいる)(25mgA13+/mgHBsAg)+CpG ODN組との4組に分けて、それぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の3日前(陰性血清)に、マウスの尾部静脈から採血して、10μl毎の血液サンプルに2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。0w免疫後、4w目に免疫を増強させた。免疫してからそれぞれ、1w(週)後、2w後、4w後、6w後、8w後、10w後、12w後にマウスの尾部静脈から採血して、血漿を分離させ、ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、CpG ODNをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれもHbsAgのタイターを向上させることができる。HBsAg組、HBsAg(25mgA13+/mgHBsAg)組に比べ、分散解析を行い全て有意差ありとした(P<0.05)。CpG ODNとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合のHbsAgのタイターが一番高かった。各組の抗体のタイター比較結果を図10に示した。
(実施例14:HBsAgで生体を刺激して抗体サブタイプを生成させる場合の、アジュバントの種類によるアジュバントの刺激増強効果の比較)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、6〜8週齢(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいる)、HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない)。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させてCpG ODN応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。
HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製)の調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。
HbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製)の調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。
6.HRP標識のsheep−anti−mouseのIgG2aとIgG1:Serotec会社製。
7.試薬の調製:
PBS:1000ml;NaCl…8g(北京化工場製)、KCl…0.2g(北京化工場製)、Na2HPO4・12H2O…2.9g(北京化工場製)、KH2PO4…0.2g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、HCl又はNaOHにてPH7.2−7.4になるまでPH値を調整してから、1000mlに定容した。
コーティング液:100ml;PBS…80ml、50%グルタルアルデヒド…1.6ml(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容した。
洗浄液:500ml;PBS…400ml、Tween20…0.5ml(北京化工場製)、NaCl…14.625g(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで500mlに定容した。
ブロッキング液:100ml;PBS…80ml、脱脂ミルク…5g(北京鼎国生物技術有限公司製)、BSA…1g(北京鼎国生物技術有限公司製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容して、0.05gのアジ化ナトリウムを添加した。
サンプル希釈液:1000ml;Tris…2.42g(北京化工場製)、NaCl…8.77g(北京化工場製)。800mlの超純水にて溶解させた後、HClでPH7.1になるまでPH値を調整してから、以下の物質を添加した後、超純水にて1000mlに定容した。BSA…1g、Tween20…0.5ml。
基質液:甲液:クエン酸…19.2g(北京化工場製)、800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。乙液:Na2HPO4・12H2O…71.7g(北京化工場製)、800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
基質液:甲液…47.276ml、乙液…50ml。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、0.22μmのろ過膜で濾過・除菌した。
終止液:100ml;濃硫酸…20ml(北京化工場製)。80mlの超純水中に攪拌しながら緩やかに添加した。
PBS:1000ml;NaCl…8g(北京化工場製)、KCl…0.2g(北京化工場製)、Na2HPO4・12H2O…2.9g(北京化工場製)、KH2PO4…0.2g(北京化工場製)。800mlの超純水にて充分に溶解させた後、HCl又はNaOHにてPH7.2−7.4になるまでPH値を調整してから、1000mlに定容した。
コーティング液:100ml;PBS…80ml、50%グルタルアルデヒド…1.6ml(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容した。
洗浄液:500ml;PBS…400ml、Tween20…0.5ml(北京化工場製)、NaCl…14.625g(北京化工場製)。充分に溶解させた後、PBSで500mlに定容した。
ブロッキング液:100ml;PBS…80ml、脱脂ミルク…5g(北京鼎国生物技術有限公司製)、BSA…1g(北京鼎国生物技術有限公司製)。充分に溶解させた後、PBSで100mlに定容して、0.05gのアジ化ナトリウムを添加した。
サンプル希釈液:1000ml;Tris…2.42g(北京化工場製)、NaCl…8.77g(北京化工場製)。800mlの超純水にて溶解させた後、HClでPH7.1になるまでPH値を調整してから、以下の物質を添加した後、超純水にて1000mlに定容した。BSA…1g、Tween20…0.5ml。
基質液:甲液:クエン酸…19.2g(北京化工場製)、800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。乙液:Na2HPO4・12H2O…71.7g(北京化工場製)、800mlの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で1000mlに定容した。
基質液:甲液…47.276ml、乙液…50ml。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、0.22μmのろ過膜で濾過・除菌した。
終止液:100ml;濃硫酸…20ml(北京化工場製)。80mlの超純水中に攪拌しながら緩やかに添加した。
二)マウスの免疫
1.マウスの組み分け(表17):
1.マウスの組み分け(表17):
2.マウスの免疫:組み分けに基づいて、それぞれ第0週と、第4週にマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の3日前(陰性血清)に、マウスの尾部静脈から採血して、10μl毎の血液サンプルに2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.コーティング:10mlのコーティング液を取り、その中にHBsAg(1mg/ml)100μlを添加した。酵素標識プレートのウェル毎に希釈されたHbsAgを添加して、4℃の雰囲気中で1晩放置した。
1.コーティング:10mlのコーティング液を取り、その中にHBsAg(1mg/ml)100μlを添加した。酵素標識プレートのウェル毎に希釈されたHbsAgを添加して、4℃の雰囲気中で1晩放置した。
2.洗浄:翌日に酵素標識プレートを取り出して、その中の液体を除去した後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。ウェル毎に300μlの洗浄液を添加した。室温で3分間放置してから、その中の液体を振り捨てた後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。同様にして3回洗浄した。
3.ブロッキング:酵素標識プレートのウェル毎に300μlのブロッキング液を添加した後、室温で2時間放置した。
4.被測定サンプルの添加:上記方法と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液により異なる希釈度に希釈された被測定サンプルを酵素標識プレートのウェル毎に100μl添加した。各希釈度について二重ウェルで試験を行った。室温で2時間放置した。
5.HRP標識のsheep−anti−mouseのIgG2aとIgG1の添加:上記方法と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液でHRP標識のsheep−anti−mouseのIgG2aとIgG1を希釈した(1:1000)。酵素標識プレートのウェル毎に100μlの希釈されたHRP標識のsheep−anti−mouseのIgG2aとIgG1を添加した。室温、遮光条件下で、2時間放置した。
6.基質液の添加:上記方法と同じにして洗浄した後、酵素標識プレートのウェル毎に100μlの新たに調製した基質液を添加した。室温、遮光条件下で、20分間放置した。
7.終止液の添加:酵素標識プレートで20分間孵化させてから、直接に酵素標識プレート中に50μlの終止液を添加した。
8.酵素標識機による測定(A492nm):終止液を添加してから5分間以内に酵素標識機による測定を行った(A492nm)。
9.陽性値の判断:サンプルのOD値/陰性対照のOD値≧2である場合、陽性値であると判断した。測定結果から分かるように、CpG ODNをアジュバントとして使用する場合、IgG2aの生成比率が高く、アルミニウムアジュバント組のIgG2a抗体に比べ、分散解析を行い、有意差ありとした(P<0.05)。その結果を図11に示した。
CTL特異性殺傷結果の測定
(1)効果細胞の調製:マウスを免疫してから12週間経た後、無菌条件下でマウスの脾臓を分離して、10%子牛血清含有IMDM(Gibcol会社製)平皿の上に置かせた。すりガラス板でマウスの脾臓を軽く研磨した。200メッシュのメンブランフィルターでマウスの脾臓の研磨液を濾過した後、ろ液中に赤血球分解液(139.6mmol/L NH4Cl,16.96mmol/L Tris, 1mol/HClでpHを7.2に調節した)を3−5ml添加して、10分間放置した。その後、生理食塩水にて脾臓細胞を2回洗浄して、脾臓細胞の数を計数した。10%子牛血清含有IMDMにて、脾臓細胞の数を3×107/mlに調節した。B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子をトランスフェクションされたP815細胞(ATCC)に、マイトマイシン(Sigma、無血清IMDMで500μg/mlに調製した)を終濃度が50μg/mlになるまで添加した。37℃で2時間孵化してから、生理塩水にて3回洗浄した。1×106個のP815細胞を採集して、脾臓細胞内に添加して、37℃、5%CO2で5日間孵化させた。5日間後、脾臓リンパ細胞を採集して効果細胞とした。
(1)効果細胞の調製:マウスを免疫してから12週間経た後、無菌条件下でマウスの脾臓を分離して、10%子牛血清含有IMDM(Gibcol会社製)平皿の上に置かせた。すりガラス板でマウスの脾臓を軽く研磨した。200メッシュのメンブランフィルターでマウスの脾臓の研磨液を濾過した後、ろ液中に赤血球分解液(139.6mmol/L NH4Cl,16.96mmol/L Tris, 1mol/HClでpHを7.2に調節した)を3−5ml添加して、10分間放置した。その後、生理食塩水にて脾臓細胞を2回洗浄して、脾臓細胞の数を計数した。10%子牛血清含有IMDMにて、脾臓細胞の数を3×107/mlに調節した。B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子をトランスフェクションされたP815細胞(ATCC)に、マイトマイシン(Sigma、無血清IMDMで500μg/mlに調製した)を終濃度が50μg/mlになるまで添加した。37℃で2時間孵化してから、生理塩水にて3回洗浄した。1×106個のP815細胞を採集して、脾臓細胞内に添加して、37℃、5%CO2で5日間孵化させた。5日間後、脾臓リンパ細胞を採集して効果細胞とした。
(2)51Cr標識ターゲット細胞:B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子をトランスフェクションされたP815細胞を1×106個採集して、100μlの51Cr(Perkin Elmer life Science)を添加した。37℃で1時間孵化させた。5〜10分間毎に、P815細胞を軽く均一に1回揺り、10%子牛血清含有IMDM にて、P815細胞を3回洗浄して、ターゲット細胞とした。
(3)CTLの殺傷:10%子牛血清含有IMDMにて、効果細胞を異なる濃度に希釈した後、51Cr標識ターゲット細胞を添加して、効果細胞:ターゲット細胞の比率を100:1〜12.5:1に調節した。37℃で4時間孵化させた後、上澄み液を収集してc.p.m値を測定した。
(4)測定結果から分かるように、CpG ODNはアジュバントとして使用される場合、HbsAgにてマウスを刺激しHBV特異性CTLを生成させる作用を顕著に増強させることができ、CpGODN+HbsAgとアルミニウムアジュバント+HbsAgを比較する場合、CpGODN+HbsAgの方がHBV特異性CTLの生成に対して、もっと強い作用を発揮できることが明らかになった(P<0.05)。その結果を図12に示した。
(実施例15:若齢マウスのB型肝炎ウィルスワクチンに対する反応性を増強させるCpG ODNの作用)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/c若齢マウス、雌、6〜8日(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/c若齢マウス、雌、6〜8日(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいるか(25mgA13+/mgHbsAg)、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:10μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させてCpG ODN応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。若齢マウスの筋肉に注射するとき、10μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、若齢マウスの筋肉に注射した。
II.方法
1.若齢マウスの組み分け:10匹/組(表18)
1.若齢マウスの組み分け:10匹/組(表18)
2.若齢マウスのB型肝炎ウイルスワクチンに対する反応性を増強させるCpG ODNの作用の測定:若齢マウスをHBsAg組と、HbsAg+アルミニウムアジュバント組と、HBsAg+CpG ODN組と、HBsAg+CpG ODN+アルミニウムアジュバント組との4組に分けて、0wにそれぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。4週後、増強免疫をした。免疫後、1w(週)、4w、6w、8w、10w経過した時に採血して、10μl毎の血液サンプルに2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。血漿を分離させ、ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、CpG ODNをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも若齢マウス体内におけるHbsAgのタイターを向上させることができる。且つ、HBsAg 組、HBsAg(25mgA13+/mgHBsAg)組に比べ、有意差ありとした(P<0.05)。CpG ODNをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、若齢マウス体内におけるHbsAgのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図13に示した。本発明の実施例から分かるように、CpG ODNは、弱反応の個体がHbsAgに対して強い体液免疫応答を起こるようにすることができる。
(実施例16:老齢マウスのHbsAgに対する反応性を増強させるCpG ODNの作用)
I.動物と試薬
1.動物:BALB/cマウス、雌、20〜24個月(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:BALB/cマウス、雌、20〜24個月(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいるか(25mgA13+/mgHbsAg)、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させてCpG ODN応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、若齢マウスの筋肉に注射した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.マウスの組み分け:10匹/組(表19)
1.マウスの組み分け:10匹/組(表19)
2.抗体の測定:「老齢」マウスをHBsAg組と、HbsAg+アルミニウムアジュバント組と、HBsAg+CpG ODN組と、HBsAg+CpG ODN+アルミニウムアジュバント組との4組に分けて、0wにそれぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。4週後、増強免疫をした。免疫の3日間前に採血(陰性血清)して、10μl毎の血液サンプルに2μlのヘパリンナトリウム(0.2gを量り、100mlのddH2Oに溶解させて得る。濃度が0.2%で、15ポンド20分間にて滅菌した)を添加して凝固を防止した。血液サンプルを4000rpm、4℃の条件で、20分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−20℃で保存した。免疫を行ってから、2w(週)、4w、6w、8w、10w、12w経た後にそれぞれ採血し、血漿を分離して、ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した(実施例3に記載の方法を参照)。測定結果から分かるように、CpG ODNをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも老齢マウス体内におけるHbsAgのタイターを向上させることができる。且つ、HBsAg組、HBsAg(25mgA13+/mgHBsAg)組に比べ、有意差ありとした(P<0.05)。CpG ODNをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、老齢マウス体内におけるHbsAgのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図14に示した。本発明の実施例から分かるように、CpG ODNは、弱反応の個体がHbsAgに対して強い体液免疫応答を起こるようにすることができる。
(実施例17:赤毛猿のB型肝炎ウイルスワクチンに対する反応性を増強させるCpG ODNの作用)
I.動物と試薬
1.動物:赤毛猿、雌、2〜4kg(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
1.動物:赤毛猿、雌、2〜4kg(北京維通利華実験動物有限公司から購入)。
2.HbsAg:アルミニウムアジュバントを含んでいるか(25mgA13+/mgHbsAg)、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
3.CpG ODN:上海生工生物工程技術服務有限公司製。
4.CpG ODNの調製:50μlのPBSで100μgのCpG ODNを溶解させてCpG ODN応用液を調製した。
5.HbsAgの調製:1mlのPBSで1mgのHbsAgタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。赤毛猿の筋肉に注射するとき、50μlのCpG ODN応用液と、1μlのHbsAg(アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない)応用液を量り、均一に混合して氷の上に10分間放置してから、赤毛猿の筋肉に注射した。(B型肝炎ワクチンの用量は1μg/マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は25μg/mlである。)
II.方法
1.赤毛猿の組み分け(表20)
1.赤毛猿の組み分け(表20)
2.抗体の測定:免疫する前に赤毛猿から採血して、陰性血漿を分離した。0wに組み分けに基づいてそれぞれ免疫を行った。免疫部位は三角筋であった。第4週に、増強免疫をした。免疫を行ってから、2w(週)、4w、6w、8w、10w、12w経た後にそれぞれ採血し、血漿を分離して、ELISA法にてHbsAgのタイターを測定した。測定結果から分かるように、CpG ODNをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも赤毛猿体内におけるHbsAgのタイターを向上させることができる。且つ、HBsAg 組、HBsAg(25 mg A13+/mg HBsAg)組に比べ、有意差ありとした(P<0.05)。CpG ODNをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、赤毛猿体内におけるHbsAgのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図15に示した。
Claims (16)
- 1個又は多数個のCpGジヌクレオチドを含有している一本鎖デオキシヌクレオチド。
- 以下の構造式中のいずれかによって示されることを特徴とする請求項1に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
(i)(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n,但し、X1=A、T又はG;X2=A又はT;Y1=A又はT;Y2=A、T又はC;L、M=A、T、C又はG;nは0−6である;
(ii)(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n,但し、X=A又はT;Y=A又はT;L、M=A、T、C又はG;nは0−6である;
(iii)(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n,但し、L、M=A、T、C又はG;nは0−6である;
(iv)(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n,但し、X1=A、T又はG;X2=A又はT;L、M=A、T、C又はG;nは0−6である;或いは
(v)TTCGTCGを含む配列。 - SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:185の中のいずれかが示す配列を有していることを特徴とする請求項2に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
- SEQ ID NO:109、150、167、168の中のいずれかが示す配列を有していることを特徴とする請求項3に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
- 前記一本鎖デオキシヌクレオチドに含まれている塩基が、以下の修飾方式中のいずれかによって修飾されていることを特徴とする請求項1に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
非チオ化修飾,チオ化修飾,部分的チオ化修飾,希有塩基修飾(dI,dUなど),メチル基化修飾,メルカプト、Aminolinker C6、Thiol−C6 S−Sなどのほかの物質とのカップリング後に修飾を行う修飾方式。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の一本鎖デオキシヌクレオチドの、ワクチンのアジュバントとしての応用。
- 前記一本鎖デオキシヌクレオチドを単独、或いはアルミニウムアジュバント、Freund’sアジュバント、MPL又は乳剤の中の1種以上を含む非核酸アジュバントと組み合わせて使用されることを特徴とする請求項6に記載の応用。
- 前記一本鎖デオキシヌクレオチドが、ワクチンと混合されるか又はワクチンと化学的にカップリングされるか、或いは前記一本鎖デオキシヌクレオチドがDNAワクチン中にクローニングされることを特徴とする請求項6に記載の応用。
- 前記ワクチンが、B型肝炎ウイルス血液源性ワクチン、B型肝炎ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、B型肝炎ウイルスのウイルスベクターワクチン、B型肝炎ウイルスの細菌ベクターワクチン、B型肝炎ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、狂犬病ウイルス血液源性ワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、狂犬病ウイルスのウイルスベクターワクチン、狂犬病ウイルス細菌ベクターワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子導入植物ワクチンから選ばれ、前記DNAワクチンがB型肝炎ウイルスDNAワクチン、狂犬病ウイルスDNAワクチンから選ばれるものであることを特徴とする請求項8に記載の応用。
- ワクチンを、請求項1〜5に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド中の少なくとも1種と組み合わせて使用することを特徴とするワクチンの免疫原性を向上させる方法。
- さらに非核酸類アジュバントと組み合わせて使用することも含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 使用対象が、すべての人間であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 使用対象が、すべての哺乳動物であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の一本鎖デオキシヌクレオチドの、ウイルスの感染予防及び関連疾病の治療に用いられる医薬物の製造における応用。
- 前記一本鎖デオキシヌクレオチドが、単独或いは、ウイルスの感染予防に用いられるワクチンと組み合わせて使用されることを特徴とする請求項14に記載の応用。
- 前記使用が、筋肉、皮下、粘膜、胃腸、静脈、又は腹腔における使用を含むことを特徴とする請求項15に記載の応用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410096083 CN1781930A (zh) | 2004-11-29 | 2004-11-29 | 含CpG单链脱氧核苷酸作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂 |
CN 200410096082 CN1781929A (zh) | 2004-11-29 | 2004-11-29 | 含CpG单链脱氧核苷酸作为狂犬疫苗的佐剂 |
PCT/CN2005/002047 WO2006056142A1 (fr) | 2004-11-29 | 2005-11-29 | Desoxynucleotides cpg a brin unique a utiliser comme adjuvant |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008521385A true JP2008521385A (ja) | 2008-06-26 |
Family
ID=36497749
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007541653A Pending JP2008521385A (ja) | 2004-11-29 | 2005-11-29 | アジュバントとしてのCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチド |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20080003232A1 (ja) |
EP (1) | EP1829887B1 (ja) |
JP (1) | JP2008521385A (ja) |
AT (1) | ATE521621T1 (ja) |
WO (1) | WO2006056142A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012529464A (ja) * | 2009-06-10 | 2012-11-22 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規組成物 |
JP2013532140A (ja) * | 2010-05-28 | 2013-08-15 | ゾエティス・ベルジャム・エス・アー | 抗原および免疫調節ワクチンおよびコレステロール、ならびにその使用 |
JP2017524682A (ja) * | 2014-06-26 | 2017-08-31 | チャンチュン ファープ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド | CpGオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2536139A1 (en) * | 2003-09-25 | 2005-04-07 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid-lipophilic conjugates |
EP2471926A3 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-11 | Intervet International BV | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
CN105579582A (zh) | 2013-07-25 | 2016-05-11 | 埃克西奎雷股份有限公司 | 用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体 |
JP6312123B2 (ja) * | 2013-11-19 | 2018-04-18 | 国立大学法人京都大学 | 細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラム |
EP3164113B1 (en) | 2014-06-04 | 2019-03-27 | Exicure, Inc. | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
JP2017537619A (ja) | 2014-11-21 | 2017-12-21 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 球状核酸ナノ粒子複合体の配列特異的細胞内取込 |
US11364304B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-06-21 | Northwestern University | Crosslinked micellar spherical nucleic acids |
WO2021249116A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof |
CA3208643A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
CN114796476A (zh) * | 2021-09-24 | 2022-07-29 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种亚单位疫苗新型核酸佐剂系统及其应用 |
CN113797329A (zh) * | 2021-10-19 | 2021-12-17 | 启锰生物科技(江苏)有限公司 | 一种二价锰佐剂和CpG佐剂的疫苗佐剂组合物及其制作方法 |
CN114577954B (zh) * | 2022-05-09 | 2022-08-02 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 检测吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1526719A (zh) * | 2003-03-05 | 2004-09-08 | 长春华普生物技术有限公司 | 增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸 |
CN1526718A (zh) * | 2003-03-05 | 2004-09-08 | 长春华普生物技术有限公司 | 抗病毒和抗肿瘤的含CpG单链脱氧寡核苷酸 |
JP2006528491A (ja) * | 2003-07-25 | 2006-12-21 | 長春華普生物技術有限公司 | 人工合成CpG単鎖デオキシオリゴヌクレオチド及びその抗ウイルス作用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6406705B1 (en) * | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
AU4978100A (en) | 1999-04-29 | 2000-11-17 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Screening for immunostimulatory dna functional modifyers |
KR20050115913A (ko) | 2003-03-26 | 2005-12-08 | 사이토스 바이오테크놀로지 아게 | Melan―a 펩티드 유사체-바이러스-양-입자컨쥬게이트 |
CN1280303C (zh) | 2003-05-28 | 2006-10-18 | 长春华普生物技术有限公司 | 人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸及其抗SARS病毒作用 |
-
2005
- 2005-11-29 WO PCT/CN2005/002047 patent/WO2006056142A1/zh active Application Filing
- 2005-11-29 US US11/720,070 patent/US20080003232A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-29 EP EP05814016A patent/EP1829887B1/en active Active
- 2005-11-29 JP JP2007541653A patent/JP2008521385A/ja active Pending
- 2005-11-29 AT AT05814016T patent/ATE521621T1/de not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-12-05 US US12/329,398 patent/US7745598B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1526719A (zh) * | 2003-03-05 | 2004-09-08 | 长春华普生物技术有限公司 | 增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸 |
CN1526718A (zh) * | 2003-03-05 | 2004-09-08 | 长春华普生物技术有限公司 | 抗病毒和抗肿瘤的含CpG单链脱氧寡核苷酸 |
JP2006528491A (ja) * | 2003-07-25 | 2006-12-21 | 長春華普生物技術有限公司 | 人工合成CpG単鎖デオキシオリゴヌクレオチド及びその抗ウイルス作用 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012529464A (ja) * | 2009-06-10 | 2012-11-22 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規組成物 |
JP2015042646A (ja) * | 2009-06-10 | 2015-03-05 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規組成物 |
JP2016193912A (ja) * | 2009-06-10 | 2016-11-17 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 新規組成物 |
JP2013532140A (ja) * | 2010-05-28 | 2013-08-15 | ゾエティス・ベルジャム・エス・アー | 抗原および免疫調節ワクチンおよびコレステロール、ならびにその使用 |
JP2017048187A (ja) * | 2010-05-28 | 2017-03-09 | ゾエティス・ベルジャム・エス・アー | 抗原および免疫調節ワクチンおよびコレステロール、ならびにその使用 |
JP2017524682A (ja) * | 2014-06-26 | 2017-08-31 | チャンチュン ファープ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド | CpGオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1829887B1 (en) | 2011-08-24 |
WO2006056142A1 (fr) | 2006-06-01 |
ATE521621T1 (de) | 2011-09-15 |
EP1829887A4 (en) | 2008-06-25 |
US20090155303A1 (en) | 2009-06-18 |
US20080003232A1 (en) | 2008-01-03 |
EP1829887A1 (en) | 2007-09-05 |
US7745598B2 (en) | 2010-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2008521385A (ja) | アジュバントとしてのCpG含有一本鎖デオキシヌクレオチド | |
CN109843902B (zh) | 用于B型肝炎病毒感染的RNAi剂 | |
AU753688B2 (en) | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant | |
CN108271387A (zh) | 乙型肝炎病毒感染的RNAi疗法 | |
JPH10510435A (ja) | B型肝炎ウイルス複製のアンチセンス阻害 | |
JP2001526688A (ja) | オリゴヌクレオチドアジュバント | |
PT1511845E (pt) | Oligonucleótidos imuno-estimuladores e suas utilizações | |
JP2004530629A (ja) | 免疫刺激rna/dnaハイブリッド分子 | |
WO2008057529A2 (en) | Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp) | |
KR20210130736A (ko) | B형 간염 바이러스 감염에 대한 RNAi 작용제 | |
JP2015131852A (ja) | CD1dリガンドを使用する免疫化のための組成物および方法 | |
KR101898177B1 (ko) | 톨-유사 수용체 기반 면역 반응을 조절하기 위한 면역 조절 올리고누클레오티드 (iro) 화합물 | |
JP2003520568A (ja) | 高度な抗原提示プラットフォーム | |
TW202202623A (zh) | 治療和預防冠狀病毒之成分和方法 | |
Marshall et al. | Polymyxin B enhances ISS-mediated immune responses across multiple species | |
AU2021214939A1 (en) | Compositions and methods for treating and preventing hepatitis B and D | |
WO2022094102A1 (en) | Immunostimulatory oligonucleotides for the prevention and treatment of covid-19 | |
JPWO2021102505A5 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100526 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100819 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110420 |