PT1511845E - Oligonucleótidos imuno-estimuladores e suas utilizações - Google Patents

Description

ΡΕ1511845 1

DESCRIÇÃO "OLIGONUCLEÓTIDOS IMUNO—ESTIMULADORES E SUAS UTILIZAÇÕES"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se especialmente a oligonucleótidos tendo até 100 nucleótidos e compreendendo um motivo de sequência de ácido nucleico não palindrómica tendo a fórmula que se segue: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ ID N°2).

Demonstrou-se que estes oligonucleótidos são imuno-estimuladores em animais da ordem Primate, incluindo seres humanos.

REFERÊNCIAS RELEVANTES

DOCUMENTOS DE PATENTES US 5 ,663,153; US 5,723,335; US 6, 090,791; US 6,194,388; US 6,207, 646; US 6,239, 116 ; US 6, 429, 199; US 6,544,518; US 6,514,948; US 6,498,148 ; US 6, 429, 199; US 6, 426, 336; US 6, 406, 705; US 6455689; US 20010044416; US 20020156033 ; US 20020165178; US 20020198165; US 2002137714;

US 20030050268; US 2003040499; EP 0468520; WO 95/26204; WO

PE1511845 2 - 96/02555; WO 98/40100; WO 98/52962; WO 99/33488; WO 99/56755; WO 00/62802; WO 01/00231; WO 01/00232; WO 01/22972; WO 01/55370; WO 00/014217; WO 00/061151; WO 00/067023; WO 00/067787; WO 00/075304; WO 01/002007; WO 01/007055; WO 01/022990; WO 01/048018; WO 01/055341; WO 01/062909; WO 01/062910; WO 01/068077; WO 01/068116; WO 01/068143; WO 01/068144; WO 01/083503; WO 01/093905; WO 02/026757; WO 02/056909; WO 02/069369; WO 02/095027; WO 02/102825; WO 03/002065; WO 94/25588; WO 99/56755; WO 99/62923.

OUTRAS REFERÊNCIAS

Ahmad-Nejad P et al., Bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. Eur. J. Immunol. 32:1958-1968, (2002).

Angier N. Microbe DNA Seen as Alien By Immune System, New York Times, 11, (1995).

Auf G et al., CpG-oligodeoxynucleotide rejection of a neuroblastoma in A/J mice does not induce a paraneoplastic disease. Neurosci. Lett. 327:189-192, (2002) .

Ayash-Rashkovsky M et al., Generation of Thl immune responses to inactivated, gpl20-depleted HIV-1 in mice with a dominant Th2 biased immune profile via 3 ΡΕ1511845 immunostimulatory oligonucleotides--relevance to AIDS vaccines in developing countries. Vaccine. 20:2684-2692, (2002).

Azad RF et al., Antiviral Activity of a Phosphorothioate Oligonucleotide Complementary to RNA of the Human Cytomegalovirus Major Immediate-Early Region, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37:1945-1954, (1993).

Azuma, Biochemical and Immunological Studies on Cellular Components of Tubercle Bacilli. Kekkaku, 69. 9:45-55, (1992).

Bailas ZK et al., Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J. Immunol. 157, 5:1840-1845, (1996) .

Bauer M et al., Bacterial CpG-DNA triggers activation and maturation of human CDllc-, CD123+ dendritic cells. J. Immunol. 166:5000-5007 (2001).

Bauer S et al., H. Bacterial CpG-DNA licenses TLR9. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 270:145-154 (2002).

Bauer S et al., Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 98: 9237-9242, (2001). 4 ΡΕ1511845

Beignon AS et al., Immunization onto bare skin with synthetic peptides: immunomodulation with a CpG-containing oligodeoxynucleotide and effective priming of influenza virus-specific CD4+ T cells. Immunology, 105:204-2012 (2002).

Boggs RT et al., Characterization and modulation of iinmune stimulation by modified oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 5:461-471, (1997).

Bohle B. CpG motifs as possible adjuvants for the treatment of allergic diseases. Int. Arch. Allergy Iinmunol. 129:198-203, (2002) .

Bozza S et al., Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Microbes Infect. 4:1281-1290, (2002).

Branda RF et al., Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. J. Lab. Clin. Med. 128, 3:329-338, (1996).

Carlson GA. Postexposure prophylaxis against transmissible spongiform encephalopathies: CpG oligodeoxynucleotides in mice. Lancet, 360:184, (2002).

Carpentier et al., Oligodeoxynucleotides con- 5 ΡΕ1511845 taining CpG motifs can induce rejection of a neuroblastoma in mice. Câncer Res. 59, 5429-5432, (1999).

Chace JH et al., Bacterial DNA-induced NK cell IFN production is dependent on macrophage secretion of IL-12. Clin. Immunol. Immunopathol. 84, 185-193, (1997).

Chen W et al., Enhancement of antigen-presenting ability of B lymphoma cells by immunostimulatory CpG-oligonucleotides and anti-CD40 antibody. Immunol. Lett. 77 :17-23 (2001) .

Choudhury BK et al., In vivo role of p38 mitogen-activated protein kinase in mediating the anti-inflammatory effects of CpG oligodeoxynucleotide in murine asthma. J. Immunol.169:5955-5961, (2002).

Chu RS et al., CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Thl) immunity. J. Exp. Med.186, 1623-1631, (1997).

Chuang TH et al., Toll-like receptor 9 mediates CpG-DNA signaling. J. Leukoc. Biol. 71:538-544, (2002).

Cowdery JS et al., Bacterial DNA induces NK cells to produce IFN-gamma in vivo and increases the toxicity of lipopolysaccharides. J. Immunol. 156, 12:4570-4575, (1996).

Dalpke AH et al., Phosphodiester CpG oligo- 6 ΡΕ1511845 nucleotides as adjuvants: polyguanosine runs enhance cellular uptake and improve iinmunostimulative activity of phosphodiester CpG oligonucleotides in vitro and in vivo. Immunology, 106:102-1012, (2002).

Davis HL et al., CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol.160, 870-876, (1998).

Decker T et ai., Effect of immunostimulatory CpG-oligonucleotides in chronic lymphocytic leukemia B cells. Leuk. Lymphoma. 42:301-307 (2001).

Decker T et al., Immunostimulatory CpG-oligo-nucleotides cause proliferation, cytokine production, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood, 95:999-1006 (2000).

Decker T et al., Peschel C. Immunostimulatory CpG-oligonucleotides induce functional high affinity IL-2 receptors on B-CLL cells: costimulation with IL-2 results in a highly immunogenic phenotype. Exp. Hematol. 28:558-68 (2000).

Decker T et al., Sensitization of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells to recombinant immunotoxin by immunostimulatory phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Blood, 99:1320-1326, (2002). 7 ΡΕ1511845

Diwan M et al., Enhancement of immune responses by co-delivery of a CpG oligodeoxynucleotide and tetanus toxoid in biodegradable nanospheres. J. Control Release. 85:247-62, (2002).

Dumais N et al., Mucosal immunization with inactivated human immunodeficiency vírus plus CpG oli-godeoxynucleotides induces genital immune responses and protection against intravaginal challenge. J. Infect. Dis. 186:1098-105 (2002) .

Erb KJ et al., Infection of mice with Myco-bacterium bovis-Bacillus Calmette-Guerin (BCG) suppresses allergen-induced airway eosinophilia. J. Exp. Med. 187, 4:561-569, (1998).

Fattorini L et al., Recombinant GroES in combination with CpG oligodeoxynucleotides protects mice against Mycobacterium avium infection. J. Med. Microbiol. 51:1071-1079, (2002).

Gierynska M et al., Induction of CD8 T-cell-specific systemic and mucosal immunity against herpes simplex virus with CpG-peptide complexes. J. Virol. 76:6568-6576 (2002).

Gill RF et al., Enhancement of rat tear IgA antibody responses following intranasal immunization with antigen and CpG ODN. Curr. Eye Res. 24:228-233, (2002) . 8 ΡΕ1511845

Gursel M et al., CpG oligodeoxynucleotides induce human monocytes to mature into functional dendritic cells. Eur. J. Immunol. 32:2617-2622 (2002).

Gursel M et al., Differential and competitive activation of human immune cells by distinct classes of CpG oligodeoxynucleotide. J. Leukoc. Biol. 71:813-820, (2002).

Hadden J et al., Immunopharmacology, JAMA, 268, 20:2964-2969, (1992).

Hadden J et al., Immunostimulants. TIPS, 141:169-174, (1993).

Halpern MD et al., Bacterial DNA induces murine interferon-gamma production by stimulation of interleukin-12 and tumor necrosis factor-alpha. Cell Immunol. 167, 1:72-78, (1996).

Harandi AM et al., A protective role of locally administered immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in a mouse model of genital herpes infection. J. Virol. 77:953-962 (2003).

Hartmann et al., Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J. Immunol.164, 944-952, (2000). 9 ΡΕ1511845

Hartmann G et al., Delineation of a CpG phos-phorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. J. Immunol.164, 1617-1624, (2000) .

Heckelsmiller K et al., Combined dendritic cell-and CpG oligonucleotide-based immune therapy cures large murine tumors that resist chemotherapy. Eur. J. Immunol. 32:3235-45, (2002).

Heckelsmiller K et ai., Peritumoral CpG DNA elicits a coordinated response of CD8 T cells and innate effectors to cure established tumors in a murine colon carcinoma model. J. Immunol. 169:3892-3899, (2002).

Horner AA et al., Immunostimulatory sequence oligodeoxynucleotide-based vaccination and immunomodula-tion: two unique but complementary strategies for the treatment of allergic diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 110:706-712 (2002).

Horner AA et al., Optimized conjugation ratios lead to allergen immunostimulatory oligodeoxynucleotide conjugates with retained immunogenicity and minimal anaphylactogenicity. J. Allergy Clin. Immunol. 110:413-420, (2002) .

Hornung V et al., Quantitative expression of toll-like receptor 1-10 mRNA in cellular subsets of human 10 ΡΕ1511845 peripheral blood mononuclear cells and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides. J. Immunol. 168:4531-4537, (2002).

Hussain I et al., Modulation of murine allergic rhinosinusitis by CpG oligodeoxynucleotides. Laryngoscope, 112 :1819-1826, (2002) .

Ioannou XP et al., CpG-containing oligodeoxynucleotides, in combination with conventional adjuvants, enhance the magnitude and change the bias of the immune responses to a herpesvirus glycoprotein. Vaccine 21:127-37, (2002).

Ioannou XP et al., The immunogenicity and protective efficacy of bovine herpesvirus 1 glycoprotein D plus Emulsigen are increased by formulation with CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 76:9002-9010, (2002) .

Ishii KJ, et al., Potential role of phos-phatidylinositol 3 kinase, rather than DNA-dependent protein kinase, in CpG DNA-induced immune activation. J. Exp. Med. 196:269-274 (2002).

Jahrsdorfer B et al., CpG DNA increases primary malignant B cell expression of costimulatory molecules and target antigens. J. Leukoc. Biol. 69:81-88 (2001).

Jahrsdorfer B et al., Modulation of malignant B cell activation and apoptosis by bcl-2 antisense ODN and 11 ΡΕ1511845 iinmunostimulatory CpG ODN. J. Leukoc. Biol. 72:83-92, (2002).

Jain VV et al., CpG-oligodeoxynucleotides inhibit airway remodeling in a murine model of chronic asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 110:867-872, (2002).

Jiang W et al., Mucosal immunization with helicobacter, CpG DNA, and cholera toxin is protective. Infect. Immun. 71:40-46, (2003).

Joseph A et al., Liposomal immunostimulatory DNA seguence (ISS-ODN): an efficient parenteral and mucosal adjuvant for influenza and hepatitis B vaccines. Vaccine. 20:3342-3354 (2002) .

Juffermans NP et al., CpG oligodeoxynucleotides enhance host defense during murine tuberculosis. Infect. Immun. 70:147-152 (2002).

Jung J et ai., Distinct response of human B cell subpopulations in recognition of an innate immune signal, CpG DNA. J. Immunol. 169:2368-2373, (2002).

Kadowaki N et al., Distinct CpG DNA and polyinosinic-polycytidylic acid double-stranded RNA, respectively, stimulate CDllc- type 2 dendritic cell precursors and CDllc+ dendritic cells to produce type I IFN. J. Immunol., 166, 2291- 2295, (2001). 12 ΡΕ1511845

Kadowaki N et al., Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J. Exp. Med. 17/194:863-869 (2001).

Kataoka T et al., Antitumor Activity of Synthetic Oligonucleotides with Sequences from cDNA Encoding Proteins of Mycobacterium bovis BCG. Jpn. J. Câncer Res., 83:244-247, (1992).

Kimura T et al., Binding of Oligoguanylate to Scavenger Receptors Is Requiered for Oligonucleotides to Augment NK Cell Activity and Induce IFN. J. Biochem. 116, 5:991-994, (1994) .

Kitagaki K et al., Immunomodulatory effects of CpG oligodeoxynucleotides on established th2 responses. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:1260-1269, (2002).

Kline JN et al., CpG oligonucleotides can reverse as well as prevent TH2-mediated inflammation in a murine model of asthma. J. Invest. Med., 45, 7:298A, (1997).

Kline JN et al., Immune redirection by CpG oligonucleotides. Conversion of a Th2 response to a Thl response in a murine model of asthma. J. Invest. Med., 45, 3:2 82A, (1997) . 13 ΡΕ1511845

Kline JN et al., Modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of asthma. J. immunol. 15, 2555-2559, (1998).

Kline JN et al., Treatment of established asthma in a murine model using CpG oligodeoxynucleotides. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283:170-179, (2002).

Klinman DM et al., CpG motifs present in bactéria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7:2879-2883, (1996).

Krieg AM el al., A Role for Endogenous Retroviral Sequences in the Regulation of Lymphocyte Activation. J. Immunol., 143, 2448-2451, (1989).

Phosphorothioate Anti-Protein?,

Krieg AM et al,

Oligodeoxynucleotides: Antisense or Antisense Res. Develop. 5:241, (1995).

Krieg AM et al. Leukocyte Stimulation by Oligodeoxynucleotides. Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 431-448, (1998).

Krieg AM et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nation, 374:546-549, (1995). 14 ΡΕ1511845

Krieg AM et al., Oligodeoxynucleotide modifi-cations determine the magnitude of B cell stimulation by CpG motifs. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 6, 2:133-139, (1996).

Krieg AM et al., The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends in Microbiology, 6, 23-37, (1998).

Krieg AM, An innate immune defense mechanism based on the recognition of CpG motifs in microbial DNA. J. Lab. Clin. Med., 128, 2:128-33, (1996).

Krieg AM. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu. Rev. Immunol. 20:709-760 (2002).

Krieg AM. GpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760, (2002).

Krug A et al., Identification of CpG oligo-nucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol. 31:2154-2163 (2001) .

Krug A et al., Toll-like receptor expression reveals CpG DNA as a unique microbial stimulus for plasmacytoid dendritic cells which synergizes with CD40 ligand to induce high amounts of IL-12. Eur. J. Immunol. 31:3026-3037, (2002). 15 ΡΕ1511845

Kuramoto, et al., Oligonucleotide Sequences Required for Natural Killer Cell Activation. Jpn. J. Câncer Res. 83:1128-1131, (1992).

Liang H et al., Activation of human B cells by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. J. Clin. Invest. 98, 1119-1129, (1996).

Lingnau K et al., Poly-L-arginine synergizes with oligodeoxynucleotides containing CpG-motifs (CpG-ODN) for enhanced and prolonged iinmune responses and prevents the CpG-ODN-induced systemic release of pro-inflammatory cytokines. Vaccine. 20:3498-3508, (2002).

Lipford GB et al., CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol., 27:2340-2344, (1997).

Lipford GB et al., Immunostimulatory DNA: sequence-dependent production of potentially harmful or useful cytokines. Eur. J. Immunol. 27:3420-3426, (1997).

Macfarlane DE and Manzel L, Antagonism of immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides by quinacrine, chloroquine, and structurally related compounds. J. Immunol., 160, 3:1122-1131, (1998).

Magone MT et al., Systemic or mucosal adminis- 16 ΡΕ1511845 tration of immunostimulatory DNA inhibits early and late phases of murine allergic conjunctivitis. Eur. J. Immunol. 30, 1841-1850, (2000) .

Mariotti S et al., Immunogenicity of anti-Haemophilus influenzae type b CRM197 conjugate following mucosal vaccination with oligodeoxynucleotide containing immunostimulatory sequences as adjuvant. Vaccine. 20:2229-2239, (2002).

Matson S et al., Nonspecific suppression of [3H]thymidine incorporation by "control" oligonucleotides. Antisense Res. Dev., 2, 4:325-330, (1992).

Maurer T et al., CpG-DNA aided cross-presentation of soluble antigens by dendritic cells. Eur. J. Immunol. 32:2356-2364.

McCluskie MJ et al., Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 32:179-185, (2002).

Messina et al., Stimulation of in vitro Murine Lymphocyte Proliferation by Bacterial DNA. J. Immunol., 147, 6:1759-1764, (1991).

Messina, et al., The Influence of DNA Structure on the in vitro Stimulation of Murine Lymphocytes by 17 ΡΕ1511845

Natural and Synthetic Polynucleotide Antigens. Cell. Immunol., 147:148-157, (1993).

Miconnet I et al., CpG are efficient adjuvants for specific CTL induction against tumor antigen-derived peptide. J. Immunol. 168:1212-1218 (2002).

Mojcik C et al., Administration of a Phos-phorothioate Oligonucleotide Antisense Murine Endogenous Retroviral MCF env Causes Immune Effect in vivo in a Sequence-Specific Manner. Clin. Immunol. Immunopathology. 67, 2:130-136, (1993) .

Moldovenu GJ et al., CpG DNA, a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunization with influenza virus. Vaccine.16, 1216-1224, (1998). 0'Hagan DT et al. Synergistic adjuvant activity of immunostimulatory DNA and oil/water emulsions for immunization with HIV p55 gag antigen. Vaccine. 20:3389-98, (2002) .

Olbrich AR et al., Effective postexposure treatment of retrovirus-induced disease with immunostimulatory DNA containing CpG motifs. J. Virol. 76:11397-404, (2002).

Pal S et al., Immunization with the Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis major outer membrane protein 18 ΡΕ1511845 by use of CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant induces a protective immune response against an intranasal chlamydial challenge. Infect. Immun. 70:4812-4817, (2002).

Park Y et al., Cutting Edge: CpG DNA inhibits dendritic cell apoptosis by up-regulating cellular inhi-bitor of apoptosis proteins through the phosphatidyl-inositide-3'-OH kinase pathway. J. Immunol. 168:5-8 (2002).

Pisetsky et al., Stimulation of Murine Lymphocyte Proliferation by a Phosphorothioate Oligonucleotide with Antisense Activity for Herpes Simplex Virus. Life Science, 54, 101-107 (1994).

Pisetsky, Immunological Consequences of Nucleic Acid Therapy. Antisense Res. Development, 5:219-225 (1995).

Pisetsky, The Immunological Properties of DNA. J. Immunol., 421-423 (1996).

Rachmilewitz D et al., Immunostimulatory DNA ameliorates experimental and spontaneous murine colitis. Gastroenterology. 122:1428-1441, (2002).

Rankin R et al., CpG motif Identification for veterinary and laboratory species demonstrates that sequence recognition is highly concerved. Antisence Nucleic Acid Drug Dev., 11:333-340 (2001). 19 ΡΕ1511845

Rankin R et al., CpG-containing oligodeoxynu-cleotides augment and switch the immune responses of cattle to bovine herpesvirus-1 glycoprotein D. Vaccine, 20:3014 — 3022, (2002) .

Rhee EG et al., Vaccination with heat-killed leishmania antigen or recombinant leishmanial protein and CpG oligodeoxynucleotides induces long-term memory CD4+ and CD8+ T cell responses and protection against leishmania major infection. J. Exp. Med. 195:1565-1573 (2002).

Rothenfusser S et ai., Plasmacytoid dendritic cells: the key to CpG. Human Immunol. 63:1111-1119, (2002).

Santeliz JV et ai., Amb a 1-linked CpG oligodeoxynucleotides reverse established airway hyperresponsi-veness in a murine model of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 109:455-462, (2002).

Sato et al., Immunostimulatory DNA Sequences Necessary for Effective Intradermal Gene Immunization. Science, 273:352-354, (1996).

Schultz KR et ai., Chloroquine prevention of murine MHC-disparate acute graft-versus-host disease correlates with inhibition of splenic response to CpG oligodeoxynucleotides and alterations in T-cell cytokine production. Biol. Blood Marrow Transplant, 8:648-655 (2002). 20 ΡΕ1511845

Schwartz DA et al., CpG motifs in bacterial DNA cause inflammation in the lower respiratory tract. J. Clin. Invest., 100, 1:68-73, (1997).

Senuma A et al., Therapeutic effect of CpG motifs on the development of chronic graft-versus-host disease in mice. Cytokine. 20:23-29, (2002).

Sethi S et al., Postexposure prophylaxis against prion disease with a stimulator of innate immunity. Lancet, 360:229-230, (2002) .

Sfondrini L et al., Absence of the CD1 molecule up-regulates antitumor activity induced by CpG oligodeoxy-nucleotides in mice. J. Immunol. 169:151-158, (2002).

Shirota H et al., B cells capturing antigen conjugated with CpG oligodeoxynucleotides induce Thl cells by elaborating IL-12. J. Immunol. 169:787-94, (2002).

Sparwasser T et al., Bacterial DNA and immunos-timulatory CpG oligodeoxynucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur. J. Immunol. 28, 2045-2054, 1998.

Stern BV et al., Vaccination with tumor peptide in CpG adjuvant protects via IFN-gamma-dependent CD4 cell immunity. J. Immunol. 168:6099-6105, (2002). 21 ΡΕ1511845

Sweet MJ et al., Colony-stimulating factor-1 suppresses responses to CpG DNA and expression of toll-like receptor 9 but enhances responses to lipopolysaccharide in murine macrophages. J. Immunol. 168:392-399 (2002).

Takauji R et al., CpG-DNA-induced IFN-alpha production involves p38 MAPK-dependent STATl phosphoryla-tion in human plasmacytoid dendritic cell precursors. J. Leukoc. Biol. 72:1011-1019 (2002).

Takeshita F et al., Cutting edge: Role of Toll-like receptor 9 in CpG DNA-induced activation of human cells. J. Immunol. 67:3555-3558, (2001).

Tokunaga T et al. Synthetic Oligonucleotides with Particular Base Sequences from the cDNA Encoding Proteins of Mycobacterium bovis BCG Induce Interferons and Activate Natural Killer Cells. Microbiol. Immunol., 36, 1:55-66, (1992).

Tokunaga T et al., A synthetic single-stranded DNA, poly(dG,dC), induces interferon-alpha/beta and -gamma, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth. Jpn. J. Câncer Res., 79:682-686, (1988).

Van der Stede Y et al., CpG-oligodinucleotides as an effective adjuvant in pigs for intramuscular immuni-zations. Vet. Immunol. Immunopathol. 86:31-41, (2002). 22 ΡΕ1511845

Verthelyi D et al., CpG oligodeoxynucleotides as vaccine adjuvants in primates. J. Immunol. 168:1659-1663 (2002) .

Verthelyi D et al., Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. J. Immunol. 166: 2372-2377, (2001).

Vicari AP et al., Reversal of tumor-induced dendritic cell paralysis by CpG immunostimulatory oligonucleotide and anti-interleukin 10 receptor antibody. J. Exp. Med. 196:541-549, (2002).

Vollmer J et al., Highly immunostimulatory CpG-free oligodeoxynucleotides for activation of human leukocytes. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.12:165-175, (2002).

Warren TL and Weiner GJ. Synergism between cytosine-guanine oligodeoxynucleotides and monoclonal antibody in the treatment of lymphoma. Semin. Oncology, 29:93-97 (2002) .

Weeratna R et al., CpG DNA induces stronger immune responses with less toxicity than other adjuvants. Vaccine, 18, 1755-1762, (2000) .

Wernette CM et al., CpG oligodeoxynucleotides 23 ΡΕ1511845 stimulate canine and feline immune cell proliferation. Vet. Immunol. Immunopathol. 84:223-236 (2002).

Wooldridge JE et al., Immunostimulatory oligo-deoxynucleotides containing CpG motifs enhance the efficacy of monoclonal antibody therapy of lymphoma. Blood, 89, 2994-2998, (1997).

Yamamoto S et al., In vitro augmentation of natural killer cell activity and production of interferon alpha/beta and gamma with deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. Jpn. J. Câncer Res., 79:866-873, (1988).

Yamamoto S. et al., DNA from Bactéria, but Not from Vertebrates, Induces Interferons, Activates Natural Killer Cells, and Inhibits Tumor Growth. Microbiol. Immunol. 36, 9:983-997, (1992).

Yamamoto S. et al., Unique Palindromic Sequences in Synthetic Oligonucleotides are Required to Induce INF and Augment INF-Mediated Natural Killer Activity. J. Immunol., 148, 12:4072-4076, (1992).

Yamamoto S., Mode of Action Of Oligonucleotide Fraction Extracted From Mycobacterium bovis BCG. Kekkaku, 69, 9:29-32, (1994).

Yamamoto T et al.

Ability of Oligonucleotides ΡΕ1511845 - 24 - with Certain Palindromes to Induce Interferon Produtin and Augment Natural Killer Cell Activity Is Associated with Their Base Length. Antisense Res. Devei., 4:119-123, (1994).

Yamamoto T et al., Lipofection of Synthetic Oligodeoxyribonucleotide Having a Palindromic Sequence AACGTT to Murine Splenocytes Enhances Interferon Production and Natural Killer Activity. Microbiol. Immunol. 38, 10:831-836, (1994).

Yamamoto T et al., Synthetic Oligonucleotides with Certain Palindromes Stimulate Interferon Production Of Human Peripherie B Lymphocytes in vitro, Jpn. J. Câncer Res., 85:775-779, (1994).

Yi A et al., IFN-.gamma. Promotes IL-6 and IgM Secretion in Response to CpG Motifs in Bacterial DNA and Oligonucleotides. J. Immunol. 558-564 (1996).

Yi AK et al. Role of mitogen-activated protein kinases in CpG DNA-mediated IL-10 and IL-12 production: central role of extracellular signal-regulated kinase in the negative feedback loop of the CpG DNA-mediated Thl response. J. Immunol. 168:4711-4720, (2002).

Yi Ae-Kyung et al., Rapid Immune Activation by CpG Motifs in Bacterial DNA. J. Immunol., 5394-5402 (1996). 25 ΡΕ1511845

Yu D et al., Iminunomers novel 3'-3'-linked CpG oligodeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents. Nucleic Acids Res. 30:4460-4469. (2002).

Zelenay, S. Et al., Immunomodulatory effects of plasmid DNA and synthetic oligodeoxynucleotides. J. Eur. J. Immunol. 33: 1382-92 (2003)

Bylund, et al. European Journal of Immunology (2002), 32(10), 2847-2856

Dalpke, et al. Immunology (2002), 106(1), 102-112

Kandimalla, et al. Bioorganic & Medicinal

Chemistry (2001), 9(3), 807-813

Lang, et al. European Journal of Immunology (1999), 29(11), 3496-3506

McCluskie, et al. Vaccine (2001), 19(17-19), 2 657-2 660

Monteith, et al. Anti-Cancer Drug Design (1997), 12(5), 421-432

Oumouna, et al. Developmental & Comparative Immunology (2002), 26(3), 257-269

Parronchi, et. al. Journal of Immunology (1999), 163(11), 5946-5953 26 ΡΕ1511845

Vollmer, et al. Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002), 12(3), 165-175

Zhao, et al. Biochemical Pharmacology (1996), 51(2), 173-82

FUNDAMENTO DO INVENTO O sistema imune A principal função do sistema imune é proteger o hospedeiro de agentes patogénicos invasores. Uma série de diferentes tipos celulares, independentes de antigénio e específicos de antigénio, evoluíram para detectar e neutralizar estes agentes patogénicos invasores. Entre eles, os linfócitos possuem uma característica importante, que é a sua capacidade para reconhecer especificamente antigénios, uma propriedade não possuída por qualquer outra célula. Isto significa que qualquer função do linfócito estimulada por um antigénio é dirigida apenas para esse antigénio. Os linfócitos podem ser divididos em duas populações principais: T e B. Os linfócitos T possuem um papel central na regulação da resposta imune e por isso produzem e secretam linfocinas (i.e. interleucinas) . Por outro lado, os linfócitos B são as únicas células que produzem anticorpos, os quais são proteínas que reconhecem e se ligam aos antigénios. 27 ΡΕ1511845

Alguns linfócitos são conhecidos como auxiliares (linfócitos Th) devido a ajudarem as células B a produzirem anticorpos. Os linfócitos T expressam uma molécula de membrana caracteristica designada CD4. Outros linfócitos T são conhecidos como citotóxicos (CTL) devido a serem capazes de matar determinadas células. Eles expressam uma proteína de membrana diferente caracteristica designada CD8. Nos murganhos, os linfócitos Th foram subdivididos em em grupos que são designados ThO, Thl e Th2, de acordo com as linfocinas que produzem. Em geral, os linfócitos Thl produzem linfocinas que estimulam macrófagos e CTLs (IL2, IFNy, TNF-β); os linfócitos Th2 produzem linfocinas(IL2, IL5, IL6, IL10, IL13) que estimulam os linfócitos B a proliferarem e a produzirem anticorpos; e os linfócitos ThO produzem uma mistura de linfocinas e pensa-se que sejam uma fase intermédia de onde derivam os linfócitos Thl e Th2. Nos seres humanos, foram demonstrados os linfócitos tipo Thl e Th2, ainda que pareçam apresentar uma divisão menos restrita relativamente aos seus padrões de secreção de citocinas.

Uma terceira população de linfócitos, a qual não possui as principais marca das células T e B, inclui as células assassinas naturais (células NK) , as células assassinas (células K) e as células assassinas activadas por linfocinas (células LAK) . As células NK podem ainda matar determinadas células tumorais e algumas células infectadas por vírus, mas ao contrário dos linfócitos T citotóxicos, não são capazes de reconhecer um antigénio 28 ΡΕ1511845 específico. Primeiro, podem fazer buracos numa célula alvo ao secretarem moléculas de perforina para formar um complexo de ataque a membrana na superfície do alvo. As células NK podem então secretar enzimas que entram na célula alvo e fazem com que cometam suicídio. Um segundo mecanismo de destruição, ligando Faz, uma proteína presente nas células NK pode interagir com Faz, uma outra proteína presente na superfície da célula alvo, induzindo a célula alvo a cometer suicídio por apoptose. As células NK são também capazes de se ligarem a células, as quais possuem anticorpos ligados através das suas regiões de ligação a antigénio, e matá-las. As células LAK não reconhecem especificamente um antigénio mas são capazes de destruir uma gama mais larga de alvos que as células NK.

Os macrófagos e as células dendríticas desempenham um papel crítico na iniciação das respostas imunes, ajudando as células T a responderem a antigénios.

Existem várias classes de anticorpos. A classe IgG compreende a maioria dos anticorpos circulantes e possui quatro subclasses designadas IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A classe IgM compreende cerca de 10% dos anticorpos circulantes. Estes são os principais anticorpos produzidos durante a resposta imunológica primária. A classe IgA compreende a maioria dos anticorpos secretados nas membranas mucosas e exerce o seu efeito protector através do bloqueio do acesso do antigénio ao interior do corpo. A classe IgD constitui menos de 1% dos anticorpos do soro e o 29 ΡΕ1511845 seu papel biológico é largamente desconhecido. A classe de IgE compreende anticorpos que estão principalmente ligados à superfície da maior parte das células e basófilos. Estes anticorpos estão associados a reacções que ocorrem nos indivíduos que sofrem reacções alérgicas.

Vacinas e adjuvantes de vacinas

As vacinas são preparações usadas para estimular os animais a montarem uma resposta imune contra os antigénios incluídos na vacina.

As vacinas frequentemente incluem adjuvantes, os quais são substâncias que usadas em combinação com um antigénio específico produzem mais imunidade do que o antigénio quando usado sozinho. (Ramon G., 1926. Procedes pour accroite la production des antitoxins. Ann. Inst. Pasteur. 40, 1-10). Muitos tipos de compostos funcionam como adjuvantes de vacinas (Edelman, R., 2000. An overview of adjuvant use, in: Vaccine Adjuvants. Preparation Methods and Research Protocols. D.T. 0'Hagan, Ed. Humana Press, Totowa, New Jersey. As referências citadas deste artigo são aqui incluídas como material de base). No entanto, actualmente, os únicos adjuvantes aprovados para uso em humanos são os sais de alumínio (Gupta, R.K. e Rost, B.E., 2000. Aluminum compounds as vaccine adjuvants. Preparation Methods and Research Protocols. D.T. 0'Hagan, Ed. Humana Press, Totowa, New Jersey) e a emulsão de óleo em água MF 59 (Ott, G. Radhakrishman, R. Fang, J. and Hora, M., 2000. 30 ΡΕ1511845

The adjuvant M F 59: A 10-Year Perspective, in: Vaccine Adjuvants. Preparation Methods and Research Protocols. D.T. 0'Hagan, Ed. Humana Press, Totowa, New Jersey). Ácidos nucleicos como compostos imuno-esti- muladores

Foi demonstrado que vários polinucleótidos possuem propriedades imuno-estimuladoras. Por exemplo, poli(I,C) é um indutor da produção de interferão (IFN), activação de macrófagos e activação de células NK (Talmadge, J.E., Adams, J., Phillips, H., Collins, M., Lenz, B., Schneider, M., Schlick, E., Ruffmann, R., Wiltrout, R.H., Chirigos, m.A. 1985. Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed wiyh poly-L-lysine and carboxymethilcellulose. Câncer Res. 45:1058; Wiltrout, R.H., Salup, R.R., Twilley, T.A., Talmage, J.E. 1985. Immunomodulation of natural killer activity by polyribonucleotides. J. Biol. Resp. Mod. 4:512), poli(dG,dC) é mitogénico para as células B (Messina, J.P., Gilkerson, G.S., Pisetsky, D.S. 1993. The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens. Cell. Immunol. 147:148) e induz actividade IFN e NK (Tocunaga, T., Yamamoto, S., Namba, K. 1988. A synthetic single-stranded DNA, poly(dG,dC), induces interferon-α/β and -γ augments natural killer activity and suppresses tumor growth. Jpn. J. Câncer Res. 79:682). 31 ΡΕ1511845 0 DNA bacteriano também foi descrito como tendo propriedades imuno-estimuladoras. Estas propriedades incluem a indução de citocinas (interferão gama (IFNy), alfa (IFNa) e beta (IFNP)), factor de necrose tumoral alfa (TNFa), interleucina 6 (IL6), 12 (IL12) e 18 (IL18), assim como a estimulação directa de células B (Yamamoto S et al., 1988 In vitro augmentation of natural killer cell activity and production of interferon alpha/beta and gamma with deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. Jpn. J. Câncer Res., 79:866-873; Yamamoto S. et al., 1992. DNA from Bactéria, but Not from Vertebrates, Induces Interferons, Activates Natural Killer Cells, and Inhibits Tumor Growth. Microbiol. Immunol. 36, 9:983-997; Klinman DM, Yi, A-Κ., Beaucage, S.L., Conover, J. and Krieg, A.M., 1996. CpG motifs present in bactéria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7:2879-2883. Halpern MD et ai., 1996. Bacterial DNA induces murine interferon-gamma production by stimulation of interleukin-12 and tumor necrosis factor-alpha. Cell Immunol. 167, 1:72-78. Sparwasser, T. et ai., 1997. Macrophages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor -α-mediated shock. Eur. J. Immunol. 27:1671-1679; Krieg AM. Et al., 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374:345-349).

Pelo contrário, foi descrito que o DNA de mamífero não tem efeitos imunes significativos (Pisetsky D.S. 1996. The Immunologic Properties of DNA. J. Immunol., 32 ΡΕ1511845 156: 421-423; Messina et al. 1991. Stimulation of in vitro Murine Lymphocyte Proliferation by Bacterial DNA. J. Immunol. 147:1759). 0 DNA sintético também tem sido descrito como imuno-estimulador se possuir motivos CpG não metilados. (Yamamoto S. et al., 1992. Unique Palindromic Sequences in Synthetic Oliqonucleotides are Required to Induce INF and Auqment INF-Mediated Natural Killer Activity. J. Immunol., 148:4072-4076; Bailas ZK et al., 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J. Immunol. 157:1840-1845; Hartmann, G., Krieg, A.M. 2000. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J. Immunol.164: 944; Hartmann G, Weeratna, R.D., Bailas, Z.K., Payette, P., Blackwell, S., Suparto, I., Rasmussen, W.L., Waldschmidt, M., Sajuthi, D., Purcell, R.H., Davis, H.L., Krieg, A.M. 2000. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. J. Immunol.164, 1617; Verthelyi D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F., Klinman, D.M. 2001. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. J. Immunol. 166: 2372). No entanto, encontrou-se que um oligonucleótido contendo ligações fosforotioato que não possui motivos CpG possui alguma actividade imuno-estimuladora em células B humanas (Liang, H., Nishioka, Y., Reich, C.F., Pisetsky, D.S., Lipsky, P.E. 1996. Activation of human B cells by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. J. Clin. Invest. 98:1119). Este oligonucleótido particular não-CpG contendo ligações 33 ΡΕ1511845 fosforotioato é uma cadeia poli-T, 20 nucleótidos de comprimento. Igualmente, Vollmer et al. (Vollmer J. Janosch A, Laucht M., Bailas ZK, Schetter C, Krieg AM. Highly immunostimulatory CpG-free oligodeoxynucleotides for activation of human leukocytes. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.12:165-175, 2002) descrevem estimulação imune por ODNs fosforotioato poli-T. Estes autores sublinham que os ODNs poli-T são activos apenas como ODNs fosforotioato e possuem actividade muito mais baixa que os ODNs CpG. Foi agora descoberto que os oligonucleótidos não CpG contendo o motivo de sequência não palindrómica que se segue: X1X2X3X4X5X6X7X8/ em que Xi é C ou T, X2 é C, T, G ou A, X3 é T ou A, X4 é T, C ou G, X5 é T, C ou G, Χδ é T ou G, X7 é G e Xs é T e em que pelo menos dois de X3, X4, X5 e X6 são Ts e em que C nunca precede G (noutros termos, o motivo de ácido nucleico não consiste num oligonucleótido CpG) possuem forte actividade imuno-estimuladora em animais da ordem Primate, incluindo seres humanos. Assim, estes oligonucleótidos podem ser administrados a individuos para tratar "deficiências do sistema imune" ou usados como adjuvantes, conjuntamente com uma vacina, para re-estimular o sistema imune de forma a ter uma melhor resposta à vacina. Eles podem ser igualmente administrados a individuos necessitados de aumentar a resposta a tumores. 34 ΡΕ1511845

SUMÁRIO DO INVENTO

Foi agora descoberto que os oligonucleótidos não-CpG contendo o motivo de sequência não palindrómica que se segue: X1X2X3X4X5X6X7X8, em que Xi é C ou T, X2 é C, T, G ou A, X3 é T ou A, X4 é T, C ou G, X5 é T, C ou G, X6 é T ou G, X7 é G e X8 é T e em que pelo menos dois de X3, x4, Xs e X6 são Ts e em que C nunca precede G (noutros termos, 0 motivo de ácido nucleico não consiste num oligonucleótido CpG) possuem a capacidade de estimular a resposta imune de animais da ordem Primate, incluindo seres humanos.

De acordo com uma forma de realização preferida, Xi consiste num C. É preferível se X3X4X5X6X7X8 do motivo imuno-estimulador consistir em TTTTGT, ATTGT ou ATTGGT. É ainda mais vantajoso se Χχ for C; X3 for T ou A; X4 for T; X5 for T; X6 for T ou G; X7 for G e X8 for T.

Os oligonucleótidos deste invento são úteis como adjuvantes numa formulação de vacina compreendendo um ou mais antigénios. Em formas de realização deste aspecto, a formulação de vacina pode ser na forma líquida ou liofi-lizada. Muitas formas de dosagem são conhecidas na área e podem ser aqui aplicadas. Em formas de realização deste aspecto, os oligonucleótidos deste invento estão presentes na composição numa dose entre cerca de 10 e 10000 yg por 35 ΡΕ1511845 dose. Nestas preparações, os oligonucleótidos deste invento podem ser combinados com outros compostos imuno-estimula-dores. São exemplos de estimuladores conhecidos: a-inter-ferão, β-interferão, γ-interferão, factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), interleu-cina 2 (IL2), interleucina 12 (IL-12) e oligonucleótido CpG.

Em formas de realização preferidas, o componente antigénico da vacina é um ou mais antigénios, naturais ou recombinantes, de virus tipo: virus da imunodeficiência humana, tais como HIV-1 e HIV-2, virus da poliomielite, virus da hepatite A, virus coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus, virus da encefalite equina, virus da rubéola, virus dengue, virus da encefalite, virus da febre amarela, coronavirus, virus da estomatite vesicular, virus da raiva, virus ébola, virus parainfluenza, virus da papeira, virus do sarampo, virus dos sincícios respiratórios, vírus da gripe, virus Hantaan, vírus bunga, vírus da febre hemorrágica, reovírus, orbivírus, rotavírus, vírus da Hepatite B, parvovírus, vírus do papiloma, vírus do polioma, adenovírus, vírus herpes simples (HSV) 1 e 2, vírus da varicela zoster, citomegalovírus (CMV), vírus da varíola, vírus da vacina, poxvírus, vírus da peste suína africana, o agente não classificado da hepatite delta, os agentes da hepatite não-A, não B; ou um ou mais antigénios de bactérias infecciosas tais como: Helicobacter pylori, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Staphylococcus aureus, 36 ΡΕ1511845

Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneu-moniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catharralis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida e Treponema pallidum; ou fungos infecciosos tipo: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioi-des immitis, Blastomyces dermatidis, Candida albicans; de protistas infecciosas tais como: Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzei, Leishmania donovani e Toxoplasma gondii; e de células tumorais humanas.

Em formas de realização deste aspecto, um ou mais oligonucleótidos deste invento e o antigénio são administrados simultaneamente localmente (por via oral, rectal, intranasal ou transdérmica) ou sistemicamente (por injecção intradérmica ou intramuscular).

Um aspecto deste invento é a utilização dos presentes oligonucleótidos para a produção de um medicamento para vacinação de uma pessoa. A pessoa pode ser vacinada profilacticamente ou terapeuticamente. Uma vacina profiláctica é desenhada para induzir protecção de uma doença causada por um agente infeccioso através da indução de imunidade especifica. Uma vacina terapêutica é desenhada para induzir remissão de uma doença (i.e. um tumor e metástases ou doença associada a um agente infeccioso tal como o virus da imunodeficiência humana). 37 ΡΕ1511845 0 método de vacinação inclui administração de um ou mais oligonucleótidos deste invento e um ou mais antigénios - ou seja, a vacina pode ser projectada contra uma doença alvo ou uma combinação de doenças alvo.

Um outro aspecto deste invento é um método de tratamento de uma pessoa com uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico, nomeadamente a utilização de um ou mais dos oligonucleótidos deste invento para a produção de um medicamento para estimular a sua resposta imune endógena. São exemplos de doença tumoral: leucemia mielogénica crónica, linfoma linfoblástico de células precursoras B, leucemia linfocitica crónica das células b, linfoma linfoplasmocitico, linfoma das células de Mantle, linfoma do centro folicular (folicular e difuso), linfoma B da zona marginal, linfoma extranodal, linfoma nodal das células B na zona marginal, linfoma esplénico das células B da zona marginal, tricoleucemia, plasmocitoma, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, linfoma das células B de grau elevado, tipo Burkitt, melanoma, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, carcinoma das células renais, cancro da bexiga, cancro do pulmão, cancro da pele, cancro da mama, cancro do cólon e cancro do útero. São exemplos de distúrbios imunológicos: alergia, imunodeficiência severa combinada, doença granulomatosa crónica e doença de imunodeficiência adquirida.

Nas formas de realização deste aspecto, um ou mais oligonucleótidos deste invento estão presentes na 38 ΡΕ1511845 formulação farmacêutica que pode ser liquida ou liofilizada na forma de dosagem. Na área são conhecidas muitas formas de dosagem e podem ser aqui aplicadas. Em formas de realização deste aspecto, um ou mais dos oligonucleótidos deste invento estão presentes na composição numa dose entre cerca de 10 e 10000 yg por dose. Nestas preparações um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem ser combinados com outros compostos imuno-estimuladores. São exemplos de imuno-estimuladores conhecidos: a-interferão, β-interferão, γ-interferão, factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), interleucina 2 (IL2), interlecuina 12 (IL12), oligonucleótidos CpG e células de Mycobacterium bovis BCG. Igualmente, um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem ser combinados com um fármaco anti-infeccioso ou anti-cancro, ou um procedimento cirúrgico. Em todos os casos, os oligonucleótidos deste invento podem ser administrados antes, após ou simultaneamente com o tratamento alternativo.

Um outro aspecto deste invento é que alguém com uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico possa ser tratado, através do contacto dos linfócitos ou células plasmacitóides dendriticas do individuo, com um ou mais oligonucleótidos deste invento "ex vivo" e re-administração das células activadas ao individuo. Nas formas de realização deste aspecto, um ou mais dos oligonucleótidos deste invento estão presentes no meio de incubação numa concentração entre cerca de 0,10 e 100 yg por ml. 39 ΡΕ1511845

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1 é um gráfico que representa o índice de proliferação de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) incubados com o ODN fosforotioato IMT023 (Seq ID N°9) ou o ODN f osf orotioato CpG 2006: 5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' ou o ODN fosforotioato não CpG IMT021 (SEQ ID NO:l). Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco ensaios independentes.

Fig 2 mostra os resultados de um estudo de citometria de fluxo usando leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) para determinar o efeito comparativo do ODN fosforotioato CpG 2006: 5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' ou o ODN f osf orotioato não CpG IMT 021 (SEQ ID NO:l) na activação da população de células B. A activação das células B foi medida através da indução de CD86 nas células positivas para CD69. (a) Diagramas representativos de citometria de fluxo comparando a activação de células B por ODNs IMT023 (Seq. ID N° 9) , 2006 ou IMT021 (SEQ ID NO:l); b) histogramas representativos dos diagramas de citometria de fluxo mostrados em (a).

Fig. 3 é um gráfico que representa o índice de proliferação de PBMC incubados com os ODNs fosforotioato 40 ΡΕ1511845 indicados. Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco ensaios independentes.

Fig. 4 mostra a indução de CD86 em células (B) CD19+ e CD69 em células (NK) CD56+ pelos ODNs não-CpG reivindicados em WO 01/22972. PBMC humanos foram cultivados durante 48 hr com os ODNs fosfodiéster indicados ou controlos e depois corados com anti-CDl9/anti-CD86 (a) ou anti-CD19/anti-CD40 (b) ou anti-CDl9/anti-MHCI (c) fluorescente. Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células na porta de duplos positivos. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas na presença de ODN. ODN (O): ODN fosfodiéster. ODN 2080, um ODN CpG com a seguinte sequência: 5'TCGTCGTTCCCCCCCCCCCC-3' foi usado como controlo positivo.

Fig. 5 mostra a influência da posição do motivo X!X2X3X4X5X6X7X8 da sequência imuno-estimuladora aqui descrito na actividade imuno-estimuladora de ODNs não CpG medidos em ensaios de proliferação de PBMCs. Os dados representam a média e desvio padrão de três ensaios independentes realizados em quadruplicado.

Fig. 6 mostra a indução de CD40, MHC I e MHC II em células CD19+ (células B) por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 da sequência imuno-estimuladora aqui descrito. PBMCs humanos foram cultivados durante 24 hr com 41 ΡΕ1511845 os ODNs indicados e depois corados com anti-CDl9/anti-CD40 (a) ou anti-CDl9/anti-MHC I (b) ou anti-CDl9/anti-MHC II (c) fluorescente. Os resultados da citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células CD19+. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas em presença de ODN. ODN(S) significa ODN fosforotioato.

Fig. 7 mostra a indução de CD86, CD40 e MHC I em células B purificadas por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 da sequência imuno-estimuladora aqui descrito. As células B humanas purificadas foram cultivadas durante 24 hr com os ODNs indicados e depois coradas com anti-CDl9/anti-CD86 (a) ou anti-CD19/anti-CD40 (b) ou anti-CDl 9/anti-MHCI (c) fluorescente. Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células CD19+. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas na presença de ODN. ODN (S) significa ODN fosforotioato.

Fig. 8 mostra a indução de CD86, CD40 e MHC I em células CD19+ (células B) por ODNs fosfodiéster não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 da sequência imuno-estimuladora aqui descrito. Os PBMCs humanos foram cultivados durante 48 hr com os ODNs fosfodiéster indicados e depois corados com anti-CDl9/anti-CD86 (a) ou anti-CDl 9/anti-CD40 (b) ou anti-CDl9/anti-MHCI (c) fluorescente. 42 ΡΕ1511845

Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células CD19+. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas na presença de ODN. ODN(S) significa ODN fosforotioato.

Fig. 9 mostra a estimulação da proliferação de PBMC por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 aqui descrito em primatas não humanos. PBMC de Cebus apella ou Macacca fascicularis foram cultivados durante 72 hr com os ODNs indicados (6 yg/ml). Os dados representam a média e o desvio padrão de quatro réplicas.

Fig. 10 mostra a indução de CD86, CD40 e MHC I em células B CD19+ de um doente que sofra de leucemia linfocitica crónica das células B (CLL) por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 aqui descrito. Os PBMCs foram cultivados durante 24 hr com os ODNs indicados e depois corados com anti-CD19/anti-CD86 (a) ou anti-CD19/anti-CD40 (b) ou anti-CDl9/anti-MHCI (c) fluorescente. Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células CD19+. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas na presença de ODN. ODN(S) significa ODN fosforotioato.

Fig. 11 mostra a estimulação da apoptose de 43 ΡΕ1511845 células B malignas por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 aqui descrito. Os PBMCs foram cultivados durante 14 hr ou 5 dias com os ODNs indicados e depois corados com iodeto de propídio e anexina V-FITC usando o kit de ensaio ANNEXIN V:FITC da Serotec (Raleigh, NC, USA). Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como gráfico de pontos da fluorescência de anexina V-FITC versus iodeto de propidio (PI). Esta representação gráfica mostra três populações de células: a) baixo PI baixo-anexina baixa que são células viáveis, b) PI baixo-anexina alta que são células apoptóticas e c) PI alto-anexina alta que são células necróticas secundárias.

Fig. 12 mostra a indução de CD86, CD40 e MHC I em células plasmacitóides dendriticas purificadas por ODNs não CpG portadores do motivo X1X2X3X4X5X6X7X8 aqui descrito. Células plasmacitóides mais de 95% puras foram cultivadas durante 24 hr com os ODNs indicados e depois coradas com anti-CDll/anti-CD86 (a) ou anti-CD4/anti-CDllc/anti-CD40 (b) ou anti-CD4/anti-CDllc/anti-MHC I (c) fluorescente. Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como histogramas correspondendo a células CD4+CDllc-. Os histogramas abertos correspondem a células cultivadas na ausência de ODN e os histogramas a sombreado correspondem a células cultivadas na presença de ODN. ODN(S) significa ODN fosforotioato.

Fig. 13 é um gráfico que representa os niveis de IL-10 em sobrenadantes de cinco leucócitos mononucleares de 44 ΡΕ1511845 sangue periférico humano (PBMCs) independentes cultivados 72 hr com o ODN f osf orotioato não CpG IMT 504 (Seq. ID N°2), o ODN fosforotioato CpG 2006: 5'TCGTCGTTTTGTC- GTTTTGTCGTT3' , ou o ODN fosforotioato IMT 022 não CpG (SEQ ID NO:175). Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco ensaios independentes.

Fig. 14 é um gráfico que representa os níveis de IL-5 em sobrenadantes de cinco leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) independentes cultivados 96 hr com o ODN fosforotioato não CpG IMT 504 (Seq. ID N°2), o ODN fosforotioato CpG 2006: 5'TCGTCGTTTTGTCGTT- TTGTCGTT3', ou o ODN fosforotioato não CpG IMT 022 (SEQ ID NO:175). Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco ensaios independentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Definições: - Uma "alergia" refere-se a hipersensibilidade adquirida a uma substância (alergénio). São exemplos de alergias eczema, rinite alérgica, asma e urticária. - Uma "deficiência do sistema imune" refere-se a uma doença em que o sistema imune não funciona com a capacidade normal.

Como aqui usado, o termo "oligonucleótido" ou 45 ΡΕ1511845 "oligo" deverá significar múltiplos nucleótidos (i.e. moléculas compreendendo um açúcar (e.g. ribose ou desoxir-ribose) ligados a um grupo fosfato e a uma base orgânica permutável, a qual é uma pirimidina substituída (e.g., citosina (C) , timina (T) ou uracilo (U) ) ou uma purina substituída (e .g., adenina (A) ou guanina (G)). 0 termo "oligonucleótido" como aqui usado refere-se a oligorri-bonucleótidos (ORNs) e oligodesoxirribonucleótidos (ODNs). 0 termo "oligonucleótido" deverá também incluir oligonu-cleósidos (i.e. um oligonucleótido menos o fosfato) e qualquer outro polímero contendo bases orgânicas. Os oligonucleótidos podem ser obtidos a partir de fontes de ácido nucleico existentes (e.g. genómico ou cDNA), mas são preferencialmente sintéticos (e.g. produzidos por síntese de oligonucleótidos).

Um "oligonucleótido" refere-se a múltiplos nucleótidos ligados por ligações fosfodiéster. - Um "oligonucleótido imuno-estimulador" refere-se a um oligonucleótido que estimula (i.e. possui um efeito mitogénico ou induz ou aumenta ou diminui a expressão de citocinas) uma célula do sistema imune (i.e. um linfócito, um macrófago) numa forma estatisticamente significativa.

Um "oligonucleótido fortemente imuno-estimulador" refere-se a um oligonucleótido que estimula " in vitro” células do sistema imune de um animal da ordem Primate com uma actividade de pelo menos 60% da actividade 46 ΡΕ1511845 imuno-estimuladora do conhecido ODN CgP 2006, nas mesmas condições experimentais e usando idêntico esqueleto químico (i.e. esqueleto fosforotioato ou esqueleto fosfodiéster). - Um "CpG" refere-se a um dinucleótido citosina- guanina.

Um "oligonucleótido CpG" refere-se a um oligonucleótido que estimula uma célula do sistema imune e a sua actividade imuno-estimuladora depende criticamente da presença de pelo menos um CpG na sua sequência. - Um "oligonucleótido não CpG" refere-se a um oligonucleótido que estimula uma célula do sistema imune e a sua actividade imunomoduladora não depende criticamente da presença de um CpG na sua sequência. - Um "indivíduo" refere-se a um animal da ordem Primate, incluindo seres humanos. - Como aqui usado, o termo "tratamento" refere-se a um processo pelo qual os sintomas de uma doença, e mais particularmente, doenças infecciosas, doenças tumorais ou distúrbios imunológicos são melhorados ou totalmente eliminados. - Como aqui usado, o termo "prevenção" refere-se a um processo pelo qual uma doença, e mais particularmente doenças infecciosas ou doenças tumorais ou distúrbios imunológicos são travados ou retardados. 47 ΡΕ1511845 - Numa forma de realização preferida, os oligo-nucleótidos imuno-estimuladores do invento são vantajosamente modificados em oligonucleótidos estabilizados. Tais oligonucleótidos imuno-estimuladores estabilizados podem ser particularmente úteis para obter uma estimulação imune prolongada. Como aqui usado, um "oligonucleótido estabilizado" refere-se a um oligonucleótido que é relativamente resistente à degradação in vivo (e.g., via uma exonuclease ou endonuclease) . Os oligonucleótidos estabilizados preferidos do presente invento compreendem uma modificação do esqueleto de fosfatos. Mais particularmente, a modificação do esqueleto de fosfatos é, de preferência, uma modificação da ligação 5'-internucleótidos, por exemplo, nos dois primeiros nucleótidos do extremo 5' do oligonucleótido do invento. Ainda, a modificação do esqueleto de fosfatos pode ser uma modificação da ligação 3' internucleótidos. Nesse caso, a modificação pode ocorrer, por exemplo, nos dois últimos nucleótidos do extremo 3' do oligonucleótido do invento. Ainda, mais de preferência, o oligonucleótido imuno-estimulador do invento pode ser estavelmente modificado de forma a compreender um nucleótido ligado por fosforotioato (i.e. pelo menos um dos oxigénios do fosfato é substituído por enxofre). Na forma de realização mais preferida, a maior parte, senão todos, os nucleótidos dos oligonucleótidos imuno-estimuladores do invento compreendem um nucleótido ligado por fosforotioato.

Outros oligonucleótidos estabilizados podem em 48 ΡΕ1511845 alternativa incluir: análogos não iónicos de DNA, tais como alquilfosfonatos e arilfosfonatos (em que o oxigénio carregado do fosfonato é substituído por um grupo alquilo ou arilo), fosfodiéster e alquilfosfotriéster, em que o grupo oxigénio carregado é alquilado. Também se demonstrou que os oligonucleótidos que possuem um diol, como seja tetra-etilenoglicol ou hexa-etilenoglicpl, num ou em ambos os extremos são substancialmente resistentes à degradação por nucleases. 0 presente invento proporciona métodos para aumentar a resposta imune de animais da ordem Primate, incluindo seres humanos, adicionando um ou mais dos oligonucleótidos deste invento a vacinas, ou realizando um tratamento com base na administração de um ou mais oligonucleótidos deste invento a uma pessoa com uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico, ou contacto "ex vivo” das células brancas do sangue, obtidas de um indivíduo com uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico, com um ou mais dos oligonucleótidos deste invento e re-administração destas células brancas do sangue activadas à mesma pessoa.

As composições de vacina contendo um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem apresentar antigénios directamente (i.e. na forma de uma proteína ou polissacá-rido definido) ou como parte de uma entidade biológica complexa (i.e. vírus completos; células bacterianas completas; membranas bacterianas ou conjugados artificiais tipo conjugados de polissacárido-proteína). Estes antigénios podem ser combinados em múltiplas vacinas. 49 ΡΕ1511845

Uma composição de vacina incluindo pelo menos um antigénio é formulada para incluir um ou mais oligonucle-ótidos deste invento. Por exemplo, o antigénio pode ser células mortas de Moraxella catharralis ou fracções subcelulares destas células ou o antigénio da superficie do virus da hepatite B, natural ou produzido por meio da tecnologia de DNA recombinante.

Um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem ser formulados sozinhos ou conjuntamente com um ou mais antigénios numa composição farmacêutica, a qual pode também incluir veiculos, espessantes, diluentes, tampões, preservativos, agentes tensioactivos, agentes antimicrobi-anos, agentes anti-inflamatórios, anestésicos e similares. A formulação pode ser liquida ou liofilizada. A composição farmacêutica pode ser administrada numa série de formas dependendo se se pretende um tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser feita topicamente, oralmente, por inalação ou parenterica-mente. A formulação para administração tópica pode incluir pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos, bases aquosas, pós ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. As formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, comprimidos e similares. Os espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes e 50 ΡΕ1511845 similares podem ser necessários ou desejáveis. As formulações para administração parentérica incluem soluções aquosas estéreis, as quais podem conter igualmente tampões, diluentes e outros aditivos. Uma vacina contendo um ou mais antigénios e um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem ser formuladas e usadas para fins profilácticos ou terapêuticos,

Antigénios comuns usados em vacinas profilácticas virais são do virus da hepatite B, virus da hepatite A e virus da gripe. Antigénios comuns usados nas vacinas profilácticas bacterianas são de Streptococcus penumoniae, Harmophilis influenzae, Moraxella catharralis, Klebsiella pneumoniae e Mycobacterium bovis (BCG). Os antigénios comuns usados em vacinas terapêuticas são de virus do papiloma e células de melanoma.

Um outro melhoramento na formulação de uma vacina é incorporar um ou mais oligonucleótidos deste invento como adjuvantes e os antigénios num veiculo de entrega para proporcionar a libertação retardada dos compostos activos da vacina ao longo do tempo. Isto pode ser conseguido através de encapsulação em microparticulas de poli(lactido-coglicolido) (Kersten, G.F.A. and Gander, B. 1996. Biodegradable Micro Spheres as vechicles for antigens, in: S.H.E. Kaufmann, ed. Concepts in Vaccine Development. Walter de Gruyter. Berlin-New York), lipossomas (Gregoriadis, G. et al. 2000. Liposomes as Immunological Adjuvants and Vaccine Carriers, in: S.H.E. Kaufmann, ed. 51 ΡΕ1511845

Concepts in Vaccine Development. Walter de Gruyter. Berlin-New York) e nanopartículas de poli(metilmetacrilato) (Kreuter, J 2000. Poly (Methyl Methacrylate) nanoparticles as vaccine adjuvants, in: S.H.E. Kaufmann, ed. Concepts in Vaccine Development. Walter de Gruyter. Berlin-New York).

Uma outra optimização da formulação de vacinas é conjugar um ou mais antigénios com um ou mais oligonu-cleótidos deste invento, por meios quimicos (Mier W, Eritja R, Mohammed A, Haberkorn U, Eisenhut M. 2000. Preparation and evaluation of tumor-targeting peptide-oligonucleotide conjugates. Bioconjug. Chem. 11:855). São conhecidas muitas formulações de vacinas e podem ser usadas substituindo adjuvantes já conhecidos por um ou mais oligonucleótidos deste invento ou simplesmente adicionando um ou mais dos oligonucleótidos deste invento à formulação original.

Com base nas suas propriedades imuno-estimula-doras, um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem ser igualmente administrados a um individuo in vivo para tratar uma doença tumoral ou um distúrbio do sistema imune. São exemplos de doenças tumorais comuns: leucemia mielo-génica crónica, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, carcinoma das céwlulas renais, cancro da bexiga, cancro do pulmão, cancro da pele, cancro da mama, cancro do cólon e cancro do útero. Exemplos de distúrbios imunológicos são: alergia, imunodeficiência severa combinada, doença granulo-matosa crónica e doença de imunodeficiência adquirida. 52 ΡΕ1511845 A composição farmacêutica para estes tratamentos pode incluir um ou mais dos oligonucleótidos deste invento juntamente com veículos, espessantes, diluentes, tampões, preservativos, agentes tensioactivos, agentes antimicro-bianos, agentes anti-inflamatórios, anestésicos e similares. A formulação pode ser líquida ou liofilizada. A composição farmacêutica pode ser administrada numa série de formas dependendo se se pretende um tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica, oral, por inalação ou parentérica. A formulação para administração tópica pode incluir pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. As formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, comprimidos e similares. Os espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsionantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. As formulações para administração parentérica incluem soluções aquosas estéreis, as quais podem conter igualmente tampões, diluentes e outros aditivos. Como alternativa, um ou mais oligonucleótidos deste invento podem ser colocados em contacto "ex vivo" com células imunocompetentes (i.e. células B ou células plasma-citóides dendríticas) obtidas a partir de um indivíduo tendo uma doença tumoral ou um deficiência do sistema imune e as células activadas podem ser então reintroduzidas no indivíduo. 53 ΡΕ1511845

Como será aparente pelos exemplos que se seguem, os oligonucleótidos preferidos são aqueles que estimulam "in vitro" células do sistema imune de um animal da ordem Primate com uma actividade de pelo menos 60% da actividade imuno-estimuladora do conhecido ODN CpG 2006, nas mesmas condições experimentais e usando um esqueleto quimico idêntico (i.e. os oligonucleótidos fortemente imuno-estimuladores). Entre estes são preferidos os que possuem até 100 nucleótidos, mais de preferência até 40 nucleótidos e compreendendo o oligonucleótido imuno-estimulador IMT 504, nomeadamente TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ ID NO:2), os quais representam o principal objectivo do presente invento. EXEMPLO 1

Materiais e métodos

Os materiais e métodos que se seguem foram usados de um modo geral ao longo dos exemplos. 1) Oligonucleótidos

Os oligonucleótidos tendo as ligações fosforo-tioato internucleótidos foram adquiridos, purificados por cromatografia liquida de alta pressão (HPLC), à Operon Technologies (Alameda, Califórnia) ou Annovis (Aston, Pennsylvania) ou Oligos Etc (Bethel, Maine). Os ODNs foram 54 ΡΕ1511845 suspensos em água despirogenada, testados relativamente à contaminação com LPS usando o teste de Limulus e mantidos a -20°C até serem usados. A pureza foi avaliada por ensaios de HPLC e PAGE. As preparações de ODN foram usadas se os niveis de LPS fossem indetectáveis. 2) Anticorpos

Os anticorpos usados nos ensaios foram adquiridos à Serotec (Raleigh, NC). 3) Leucócitos mononucleares do sangue periférico (PBMC) 0 sangue foi obtido por venipunctura a partir de dadores saudáveis usando heparina como anticoagulante. Os PBMCs foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO) . Resumidamente, amostras de sangue diluidas a 1:2 em meio RPMI-1640 (laboratórios PAA GmbH, Linz, Áustria), suplementado com L-glutamina 2,0 mM e 50,0 yg/ml de gentamicina e HEPES 20 mM, foram centrifugados a 1000 xg durante 40 minutos a 20°C. Os PBMCs foram isolados, lavados e suspensos em meio suplementado com 10% de soro fetal de vitela. 4) Purificação das células

Os linfócitos B e as células pasmacitóides 55 ΡΕ1511845 dendríticas foram purificados de PBMCs humanos por selecção positiva usando sistemas magnéticos de separação de células MCS (Miltenyi Biotec, Germany). 5) Ensaios de proliferação de células 0 sangue foi obtido por venipunctura a partir de dadores saudáveis usando heparina como anticoagulante. Os PBMCs foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO) . Resumidamente, amostras de sangue diluídas a 1:2 em meio RPMI-1640, (laboratórios PAA GmbH, Linz, Áustria) suplementado com L-glutamina 2,0 mM e 50,0 yg/ml de gentamicina e HEPES 20 mM, foram centrifugados a 1000 xg durante 40 minutos a 20°C. Os PBMCs foram isolados, lavados e suspensos em meio suplementado com 10% de soro fetal de vitela. Os PBMCs foram cultivados em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de vitela inactivado pelo calor (FCS), L-glutamina 2,0 mM e 50,0 yg/ml de gentamicina. 1 x 105 células/alvéolo foram incubadas em placas de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Denmark) , a 37°C, numa atmosfera húmida de 5% de CO2 durante 72 hr. Os PBMCs foram estimulados com ODNs a 0,375 yg/ml a menos que de outra forma especificado. Dezoito horas antes da colheita das células, 1 pCi de 3H-timidina (Amersham, actividade específica: 25 Ci/mmol) foi adicionado a cada alvéolo. As células foram colhidas em filtros de fibra de vidro e medida a incorporação de 3H por contagem de cintilação. Os desvios padrões de alvéolos em quadriplicado foram <10%. 56 ΡΕ1511845 6) Ensaio de IL-6 PBMCs (3 x 105/alvéolo) foram cultivados como descrito atrás com ODNs (6 yg/ml) durante 24 hr. Após isto, os sobrenadantes foram colhidos e os niveis de IL-6 medidos por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Denmark) foram revestidas com anticorpos anti-IL-6 e bloqueadas com meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de FCS inactivado pelo calor. IL6 foi detectado colorimetricamente usando anticorpos marcados com biotina seguido de estreptavidina conjugada com peroxidase e depois substrato colorimétrico especifico da peroxidase. Foram geradas curvas padrão usando quantidades conhecidas de IL-6 recombinante. O limite de detecção destes ensaios foi de 30 pg/ml. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 7) Ensaio de IL-10 PBMCs (3 x 105/alvéolo) foram cultivados como descrito atrás com ODNs (1,5 pg/ml) durante 72 hr. Após isto, os sobrenadantes foram colhidos e os niveis de IL-10 medidos por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Denmark) foram revestidas com anticorpos anti-IL-10 e bloqueadas com meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de FCS inactivado pelo calor. IL10 foi detectado colorimetricamente usando anticorpos marcados com biotina seguido de estreptavidina conjugada com peroxidase e depois substrato colorimétrico especifico 57 ΡΕ1511845 da peroxidase. Foram geradas curvas padrão usando quantidades conhecidas de IL-10 recombinante. 0 limite de detec-ção destes ensaios foi de 20 pg/ml. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 8) Ensaio de IL-5 PBMCs (3 x 105/alvéolo) foram cultivados como descrito atrás com ODNs (1,5 pg/ml) e IL-4 (5 ng/ml) durante 72 hr. Após isto, os sobrenadantes foram colhidos e os niveis de IL-5 medidos por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Denmark) foram revestidas com anticorpos anti-IL-5 e bloqueadas com meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de FCS inactivado pelo calor. IL6 foi detectada colorimetricamente usando anticorpos marcados com biotina seguido de estreptavidina conjugada com peroxidase e depois substrato colorimétrico especifico da peroxidase. Foram geradas curvas padrão usando quantidades conhecidas de IL-5 recombinante. O limite de detecção destes ensaios foi de 40 pg/ml. Todos os ensaios foram realizados em duplicado.

9) Ensaio de secreção de IgM PBMCs (3 x 105/alvéolo) foram cultivados como descrito atrás com ODNs (1,5 pg/ml) durante 72 hr. Após isto, os sobrenadantes foram colhidos e os niveis de IL-6 medidos por ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação 58 ΡΕ1511845 de 96 alvéolos (NUNC, Denmark) foram revestidas com anticorpos anti-IgM e bloqueadas com meio RPMI 1640. IgM foi detectada colorimetricamente usando anticorpos marcados com peroxidase seguido de substrato colorimétrico especifico da peroxidase. Foram geradas curvas padrão usando quantidades conhecidas de IgM purificada. O limite de detecção destes ensaios foi de 50 pg/ml. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 10) Citometria de fluxo A coloração dos antigénios de superfície foi realizada como descrito (J. Fló and E. Massouh. Age-related changes of native and memory CD4 rat lymphocyte subsets in mucosal and systemic lymphoid organs. Developmental and Comparative immunology 21:443-453, 1997). Os anticorpos anti-CDl9 (Clone LT19), CD86 (Clone BU63), CD40 (clone LOB 7/6), CD4 (clone S 3.5), MHC classe I (Clone W6/32), MHC classe II (Clone WR 18), anti CD4 (Clone S3.5) e anti CDllc (Clone BU15) foram comprados à Serotec (Raleigh, NC, USA) . A apoptose foi estimada usando o ensaio do kit ANNEXIN V:FITC da Serotec (Raleigh, NC, USA) . Os dados de citometria de fluxo de 10000 células por amostra foram adquiridos num FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Os dados foram analisados usando o programa de computador Win MDI, 2.8, Interface Flow Cytometry Application (Joseph Tritter Copyright 1993-1998). 59 ΡΕ1511845 11) Imunização de macacos contra o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) e avaliação da resposta humoral

Doze macacos da espécie Cebus apella (2,5-3,5 kg) foram imunizados com uma dose pediátrica de AgB (Pablo Cassará, Buenos Aires, Argentina) contendo 10 yg de HBsAg adsorvido a alumina (25 mg de Al3+/mg de HBsAg) . Este foi administrado sozinho (n=3, 1 fêmea, 2 machos) ou combinado com o ODN fosforotioato indicado (150 yg/dose) (n = 3, 1 fêmea, 2 machos). Todas as vacinas foram administradas intramuscularmente (i.m.) no músculo quadrícepe, num volume total de 1 ml. Os macacos foram mantidos no biotério do CEMIC (Centro Médico de Investigaciones Clínicas), Buenos Aires, Argentina. Os animais foram monitorizados diariamente por especialistas e pesados uma vez por semana. O plasma foi recuperado por punção intravenosa (i.v.) antes e a vários tempos após imunização e imediatamente testado relativamente a anticorpos usando o kit comercial AUSAB (Abbot Laboratories, Illinois, USA). Os títulos foram expressos em mili-unidades internacionais por ml. EXEMPLO 2

Selecção de sequências de oligonucleótidos

As patentes WO 96/02555 e US 6239116 descrevem que para serem imuno-estimuladores, os oligonucleótidos requerem sequências contendo motivos CpG não metilados (WO 60 ΡΕ1511845 96/02555, col. 13 linhas 19-20 e US 6239116, col. 6 linhas 1-3). EP 0468520 descreve que para serem imuno-estimuladores, os oligonucleótidos requerem uma sequência palindrómica de pelo menos 6 nucleótidos de comprimento para serem satisfatórios (EP 0468520, col. 11, linhas 34-37). Assim, vários oligonucleótidos não CpG, sem sequências palindrómicas, de pelo menos 6 nucleótidos de comprimento foram testados usando ensaio de proliferação, ensaios de diferenciação celular, ensaios de secreção da citocina IL6 e ensaios de secreção de IgM realizados em leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Como controlo positivo, foi usado o oligonucleótido CpG 2006 com a composição: 5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' e ligações fosforotioato descritas por Hartman e Krieg (Hartmann, G., Krieg, A.M. 2000. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J. Immunol.164, 944) . Como control do fundo, foi usado o oligonucleotide fosforotioato IMT 023 (SEQ ID N09) ou IMT022 (SEQ ID NO:8) com actividade muito baixa em células humanas. Igualmente como controlo "presumivelmente" negativo usou-se um oligonucleótido com a mesma composição do oligonucleótido 2006 mas em que todos os dinucleótidos CpG foram substituídos por dinucleótidos GpC: 5'TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT3'. 61 ΡΕ1511845

Este oligonucleótido foi designado ODN IMT021 (SEQ ID N01). A Fig. 1 mostra um ensaio de proliferação realizado com os oligonucleótidos atrás descritos. Encontrou-se, surpreendentemente, que o oligonucleótido CpG IMT021 foi tão activo como o oligonucleótido CpG 2006 nos ensaios de proliferação (Fig. 1 e Tabela 1) se usado a 1,5 yg/ml e aproximadamente 40-60% activo se usado a 0,375 yg/ml. TABELA 1

Indução de proliferação de células brancas periféricas por oligonucleótidos fosforotioatos CpG (2006) e não CpG (IMT021) ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO (ODN a 1, 5 μg/ml) (ODN a 0,375pg/ml) Méd. N DP Méd. N DP 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 17,95 4 2,39 13,83 14 1,55 IMT021 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 17,41 5 2,74 8,02 15 1,21 IMT 021 (SEQ ID NO:l) Méd.: Média; N: Número de resultados; DP: Desvio Padrão; ODN(S): ODN fosforotioato A estimulação imune foi igualmente avaliada por citometria de fluxo usando o marcador geral CD19 para as células B humanas e o marcador de activação CD86 para as células B humanas. A Fig. 2 mostra a activação de células B humanas incubadas com o ODN(S) não CpG IMT021 comparativamente com a activação induzida pela incubação com o ODN(S) CpG 2006. Como pode ser observado, ambos os ODNs mostram padrões de 62 ΡΕ1511845 activação semelhantes comparativamente com o controlo de fundo ODN(S) IMT023 quando usado a 1,5 yg/ml. A secreção de IL-6 foi também avaliada nos sobrenadantes de PBMCs incubados com o ODN(S) CpG 2006 e o ODN(S) não CpG IMT 021 (Tabela 2). TABELA 2

Indução da secreção de IL-6 humana pelos oligonucleótidos fosforotioatos CpG e não CpG 2006 e IMT 021 ODN (S) IL-6 (pg/ml) Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Células sozinhas 0 0 0 0 2006 568 159 597 374 IMT 021 348 384 836 596 IMT 021 (SEQ ID NO:1). ODNs a 1,5 yg/ml

Os resultados deste ensaio também indicam que o ODN(S) não CpG IMT021 é um imuno-estimulador eficaz quando usado a 1,5 yg/ml. Assim, foram investigadas outras variantes da sequência não CpG do oligonucleótido 2006. A tabela 3 mostra os resultados para seis destas variantes em que, o Cs ou Gs de todos os CpGs deste ODN foram substituídos por outros nucleótidos. Como pode ser observado, os Gs dos CpGs no ODN(S) 2006 não são necessários para a proliferação das células B ou para a secreção de IL6. No entanto, a modificação dos Cs dos CpGs é prejudicial se a substituição for para As ou Gs mas não se for para Ts. 63 ΡΕ1511845

Estes resultados indicam claramente que a estimulação da proliferação de células B e a secreção de IL-6 pelo ODN(S) 2006 não está de todo associada com a integridade do grupo CpG. TABELA 3

Indução da proliferação de células brancas do sangue periférico e secreção de IL6 por variantes não CpG do oligonucleótido ODN(S) 2006 ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 pg/ml) (ODN a 6, 0 μς/τηΐ) Méd. N DP Méd. N DP 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 13,83 14 1,55 215,8 4 83,4 ΙΜΙ504 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 13,08 2 3,80 285,2 2 39,5 IMT505 TCCTCCTTTTGTCCTTTTGTQCTT 12,98 2 4,73 218,9 2 3,1 IMT506 TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT 11,66 4 2,77 228,9 4 10 ΙΜΙ501 TAGTAGTTTTGTAGTTTTGTAGTT 5,42 2 2,03 66,8 2 54,0 IMT502 TGGTGGTTTTGTGGTTTTGTGGTT 7,16 2 3,24 89,7 2 91,4 IMT503 TTGTTGTTTTGITGTTTTGTTGTT 9,87 2 1,90 334,9 2 215,5 IMT504 (SEQ ID N02) ; IMT505 (SEQ ID NO:3); IMT506 (SEQ ID NO:4); ΙΜΓ501 (SEQ ID NO:5); IMT502 (SEQ IDNO:6); IMT503(SEQ ID NO:7) EXEMPLO 3

Efeito da modificação da estrutura na actividade imuno-estimuladora de oligonucleótidos não CpG: definição do motivo activo

Para estudar a influência da estrutura primária na actividade imuno-estimuladora dos ODNs não CpG, foram 64 ΡΕ1511845 sintetizadas várias variantes dos oligonucleótidos 2006 e IMT021. A Tabela 4 mostra a estrutura primária de algumas das variantes de IMT 021 e os resultados de ensaios de proliferação e de IL-6 realizados de forma a avaliar a sua actividade imuno-estimuladora. O ODN(S) IMT021 possui T nas posições 7, 8, 9, 10 , 12 , 15, 16, 17, 18, 20, 23 e 24. A substituição destes Ts com As (ODN IMT022) ou Cs (ODN IMT023) resulta numa perda muito significativa da actividade (cerca de 76% e 75% respectivamente) no ensaio de proliferação e também no ensaio de secreção de IL-6 (84% e 88% respectivamente). Estes resultados indicam que alguns ou todos os Ts nas posições 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 20, 23 e 24 são críticos para a actividade imuno- estimuladora do ODN IMT021. TABELA 4

Indução da proliferação de células brancas do sangue periférico e secreção de IL-6 por oligonucleótidos fosforotioatos não CpG derivados do oligonucleótido imuno- estimulador IMT021 ODN(S) SEQUÊNCIA (5’-3’) ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 pg/ml) (ODN a 6, 0 pg/ml Méd. N DP Méd. N DP IMT021 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 8,02 15 1,21 181,3 4 49,9 IMT022 TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 1,24 2 0,30 0,0 2 0,0 IMT023 TGCTGCOOCDGOGCOOCDGCGCOC 1,07 4 0,12 0,0 3 0,0 IMT 021 (SEQ ID NO:1); IMT 022 (SEQ ID NO:8); IMT 023 (SEQ ID NO: 9) 65 ΡΕ1511845

De forma a investigar a composição do centro activo (motivo) dos oligonucleótidos não CpG, vários ODNs foram testados a 0,375 yg/ml (Fig. 3). Encontrou-se que: a) A presença dos grupos TG num oligonucleótido não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma forte estimulação imune. Por exemplo, os ODNs IMT028, IMT046, IMT546, IMT547 e IMT550, todos eles possuem dois TGs, possuem actividade muito fraca. Por outro lado, o ODN IMT543 que não possui um dinucleótido TG possui a mesma actividade (baixa) que ODN IMT544, o qual é um ODN com a mesma composição geral, mas que possui dois dinucleótidos TG. b) A presença do tetranucleótido TTTT num oligonucleótido não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação imune forte. Por exemplo, os ODNs IMT034, IMT057, IMT028, IMT543 e IMT544, os quais possuem dois motivos TTTT, possuem actividade muito fraca. c) A presença de mais de 25% de Ts não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação imune forte. Por exemplo, ODNs IMT034 (50% T) , IMT057 (71% T), IMT028 (33% T), IMT543 (58% T), IMT544 (50% T), IMT059 (83% T), IMT040 (42% T), IMT046 (33% T), IMT545 (42% T) , IMT550 (33% T) e IMT546 (42% T) , todos eles possuindo mais de 25% de T, possuem actividade muito fraca. 66 ΡΕ1511845 d) A presença de mais de 25% de Ts mais a presença de dinucleótidos TG, não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação forte. Por exemplo, os ODNs IMT028, IMT046, IMT544 e IMT546, que possuem mais de 25% de Ts e dois TGs possuem actividade muito fraca. e) A presença de mais de 25% de Ts mais a presença do tetranucleótido TTTT, não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação forte. Por exemplo, os ODNs IMT059, IMT034, IMT057, IMT028, IMT543 e IMT544, que possuem mais de 25% de Ts e dois TTTT, possuem actividade muito fraca. f) A presença dos dinucleótidos TG mais a presença do tetranucleótido TTTT não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação forte. Por exemplo, ODN IMT028 e IMT544, os quais possuem dois TGs e dois TTTT, possuem actividade muito fraca. g) A presença de dinucleótidos TG mais a presença do tetranucleótido TTTT, mais a presença de mais de 25% Ts, não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação forte. Por exemplo, os ODNs IMT028 e IMT546, os quais possuem dois TGs, dois TTTT e mais de 25% Ts, possuem actividade muito fraca. 67 ΡΕ1511845 h) Alguns Ts podem ser relevantes para a actividade dos ODNs não CpG, mas não estão necessariamente relacionados com um dinucleótido TG ou com um motivo TTTT. Por exemplo, a substituição de 2 Ts em ODN IMT540, os quais não estão envolvidos em qualquer motivo TG ou TTTT, é fortemente prejudicial (ODN 545). Deve-se notar que os ODNs IMT540 e IMT545 possuem mais de 25% T e não possuem quaisquer motivos TTTT ou TG. Deve-se também mencionar que a substituição no ODN IMT54, fracamente imuno-estimulador, de dois Ts, que gera dois dinucleótidos TGs, dois motivos TTTT e aumenta o teor total de Ts (ODN IMT 544) não aumenta a actividade (em desacordo com WO 01-22972). i) A presença do tetranucleótido CCCC e/ou mais de 50% de Cs não é de todo suficiente (em desacordo com WO 01-22972) para uma estimulação imune forte. Por exemplo, os ODNs IMT023, os quais possuem dois CCCC e 63% de C, possuem actividade muito fraca. j) Substituição de alguns Ts por Cs ou Gs em alguns oligonucleótidos ricos em T aumenta a actividade (em desacordo com WO 01-22972). Por exemplo, a substituição de 3 Ts em ODN IMT059 por Cs (ODN IMT037) aumenta a actividade numa forma estatisticamente significativa. Portanto, a presença de Cs combinada com alguns Ts pode ser relevante para se conseguir uma forte estimulação imune. 68 ΡΕ1511845 k) Em geral, os oligonucleótidos ricos em T podem ter alguma actividade imuno-estimuladora num esqueleto de fosforotioato, mas são inactivos num esqueleto fosfodiéster (em desacordo com WO 01-22972). Por exemplo, a Tabela 5 mostra que IMT 053, o qual consiste numa cadeia poli T de 24 nucleótidos, é capaz de estimular a secreção de IL6 num esqueleto de fosforotioato, mas não num esqueleto fosfodiéster. O mesmo é verdadeiro para ODN IMT021, o qual possui mais de 25% T e 6 dinucleótidos TG. Estes dois ODNs são também incapazes, num esqueleto fosfodiéster, de estimular a expressão dos marcadores de activação CD 86, CD40 e MHC classe I em células B positivas para CD19 (Fig. 4) . 1) Em geral, os oligonucleótidos imuno-estimu-ladores num esqueleto fosfodiéster são inactivos como cadeia dupla (em desacordo com WO 01-22972). Por exemplo, os ODNs 2006 e IMT504 fortemente estimuladores são inactivos como cadeia dupla (não mostrado). Resultados semelhantes foram descritos em murganhos na publicação que se segue: Zelenay, S., Elias, F. e Fio, J. Eur. J. Immunol. 33:1382-92 (2003).

Tendo em consideração todos estes factos, foi investigado qual a sequência mínima necessária e suficiente que deverá estar presente num oligonucleótido CpG de forma a obter uma forte actividade imuno-estimuladora, num fosfodiéster (natural) assim como em esqueletos modificados. 69 ΡΕ1511845 TABELA 5

Indução da secreção de IL6 por ODNs fosforotioatos ou fosfodiésteres PyNTTTTGT

Secreção de IL-6 _(pg/ml)_ ODN (0) Sequência Méd. N DP IMT 022 (S) TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 38 4 17 IMT 022 (0) TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 27 4 12 IMT 053 (S) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 123 4 21 IMT 053 (0) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 24 4 24 IMT 021 (S) TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 182 4 51 IMT 021 (0) TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 35 4 12 IMT 504 (S) TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 285 4 39 IMT 504 (0) TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 210 4 43 IMT 506 (S) TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT 228 4 70 IMT 506 (0) TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT 250 4 32 2006 (S) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 216 4 84 2006 (0) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 228 4 40 Nenhum — 28 4 14 IMT021 (SEQ ID NO: 1) ; IMT022 (SEQ ID NO :8) ; IMT053 (SEQ ID NO: 19) ; IMT504 (SEQ ID NO:2); IMT506 (SEQ ID NO: 4) (S) : fosforotioato. (0). Fosfodiéster. ODNs fosforotioatos foram adicionados (6 yg/ml) no tempo 0 da incubação. ODNs fos-fodiéster foram adicionados como se segue: 30 yg/ml no tempo 0, 30 yg/ml após 4 hr e 30 yg/ml após 16 hr de incubação._ 70 ΡΕ1511845 A análise de centenas de ODNs (não apresentada) permitiu a definição de uma sequência nuclear (motivo) responsável pela forte actividade imuno-estimuladora dos ODNs não CpG conforme medido pela proliferação de células B e secreção de IL-6. Este motivo é o seguinte: X1X2X3X4X5X6X7X8, em que 1—1 X é em que X2 é em que X3 é em que X4 é em que X5 é em que Xe é em que X7 é em que X8 é em que pelo C ou T; C, T, G ou T ou A; T, C ou G; T, C ou G; T ou G; G; T; menos dois de X3, X4, X5 e X6 são Ts A Tabela 6 mostra o efeito das alterações em cada um dos nucleótidos dos dois motivos não CpG presentes no ODN IMT504 (motivo: CATTTTGT) . A substituição do C na posição 1 do motivo por A (ODN IMT531) ou G (ODN IMT533) resultou numa perda de cerca de 50% da actividade. No entanto, a substituição deste C por T (ODN IMT532) não alterou a actividade. Assim, de forma a obter actividade máxima a primeira posição do motivo deverá ser ocupada por um nucleótido pirimidina (C ou T). Na posição 2 do motivo, 71 ΡΕ1511845 A (ODN IMT504) ou T (ODN IMT535) ou C (ODN IMT534) são opções equivalentes.

De forma a estudar a influência de um nucleótido G na posição 2 do motivo sem introdução de um dinucleótido CpG, foram sintetizados ODNs com um T na primeira posição do motivo (Tabela 7) . Como pode ser observado, qualquer nucleótido na segunda posição do motivo é equivalente. A substituição do G na posição 7 do motivo por A (ODN IMT541), T (ODN IMT542) ou C (ODN543) é prejudicial (Tabela 5) . Assim, de forma a obter actividade máxima a posição 7 do motivo deverá ser preferencialmente G. Relativamente às posições do motivo ocupadas por Ts, o mais sensivel é o da posição 8. A substituição deste T por A (ODN IMT543) ou C (ODN IMT6599) ou G (ODN IMT604) é prejudicial. Assim, de forma a obter actividade máxima, a posição 8 do motivo deverá ser preferencialmente T. Na posição 3 do motivo o T poderá ser substituído por A (ODN IMT 537) sem perda de actividade. No entanto, a substituição deste T por C (ODN IMT595) ou G (ODN IMT600) é prejudicial. Assim, para se obter actividade máxima, a posição 3 do motivo deverá ser preferencialmente T ou A. Na posição 4 do motivo o T poderá ser substituído por C (ODN IMT IMT596) ou G (ODN IMT601) sem perda de actividade significativa. No entanto, a substituição deste por A (ODN IMT538) é prejudicial. Assim, de forma a obter actividade máxima, a posição 4 do motivo deverá ser preferencialmente T ou C ou G. Na posição 5 do motivo, o T poderá ser 72 ΡΕ1511845 substituído por C (ODN IMT IMT597) ou G (ODN IMT602) sem perda de actividade significativa. No entanto, a substituição deste T por A (ODN IMT539) é prejudicial. Assim, de forma a obter actividade máxima, a posição 5 do motivo deverá ser preferencialmente T ou C ou G. Na posição 6 do motivo, o T poderá ser substituído por G (ODN IMT IMT603) sem perda de actividade significativa. No entanto, a substituição deste T por A (ODN IMT540) é prejudicial. Assim, de forma a obter actividade máxima, a posição 6 do motivo deverá ser preferencialmente T ou G. A substituição simultânea de T por A na posição 3 do motivo e T por G na posição 6 do motivo não resultou em qualquer perda de actividade (ODN IMT608). No entanto, neste caso e de forma a obter actividade máxima, as posições 4 e 5 deverão ser ocupados por Ts (ver ODNs IMT609, IMT610, IMT611, IMT612 e IMT614) . A substituição de dois ou mais dos Ts por As dentro do motivo resulta em mais de 7 0% de perda de actividade (ODNs IMT545, OMT 546, IMT547, IMT548, IMT 549, IMT550, IMT551 e IMT552).

Tendo estes resultados em consideração, pode-se concluir que para obter uma forte actividade imuno-estimuladora, duas ou mais das posições 3, 4, 5 e 6 do motivo deverão ser ocupadas por Ts. 73 ΡΕ1511845 TABELA 6

Indução da proliferação de células brancas do sangue periférico por oligonucleótidos fosforotioatos não CgP deste invento derivados de ODN IMT504

ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3 ') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO

(ODN a 0,375 pg/ml) Méd. N DP 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 13,35 16 2,23 IMT 022 TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 1,34 24 0,52 IMT 504 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 13,85 16 4,36 IMT 531 TCATAATTTTGTAATTTTGTCATT 7,59 12 2,71 IMT 532 TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT 13, 80 12 3,41 IMT 533 TCATGATTTTGTGATTTTGTCATT 6,20 12 2,71 IMT 534 TCATCCTTTTGTCCTTTTGTCATT 11, 67 12 4,49 IMT 535 TCATCTTTTTGTCTTTTTGTCATT 12, 49 12 2,51 IMT 537 TCATCAATTTGTCAATTTGTCATT 14,31 12 4,03 IMT 595 TCATCACTTTGTCACTTTGTCATT 9,16 15 2,30 IMT 600 TCATCAGTTTGTCAGTTTGTCATT 7,38 12 2, 69 IMT 538 TCATCATATTGTCATATTGTCATT 7,80 16 3,38 IMT 596 TCATCATCTTGTCATCTTGTCATT 12, 61 20 3,37 IMT 601 TCATCATGTTGTCATGTTGTCATT 11,47 8 1,35 IMT 539 TCATCATTATGTCATTATGTCATT 5, 63 16 3,52 IMT 597 TCATCATTCTGTCATTCTGTCATT 13, 98 20 3,78 IMT 602 TCATCATTGTGTCATTGTGTCATT 13,23 20 3,47 IMT 540 TCATCATTTAGTCATTTAGTCATT 9, 62 16 3,47 IMT 603 TCATCATTTGGTCATTTGGTCATT 13, 91 20 3,35 IMT 541 TCATCATTTTATCATTTTATCATT 9,30 12 2,20 IMT 542 TCATCATTTTTTCATTTTTTCATT 9,78 12 2, 60 - 74 - (continuação)

SEQUENCIA (5 ' ~3 ') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO (ODN a 0,375 pg/ml) Méd. N DP TCATCATTTTCTCATTTTCTCATT 4, 75 12 2, 25 TCATCATTTTGACATTTTGACATT 4,27 12 1, 30 TCATCATTTTGCCATTTTGCCATT 5, 39 16 1, 98 TCATCATTTTGGCATTTTGGCATT 7, 60 16 2, 63 TCATCAATTGGTCAATTGGTCATT 12, 98 12 2, 22 TCATCAAATGGTCAAATGGTCATT 8, 58 12 1, 53 TCATCAACTGGTCAACTGGTCATT 9, 07 12 1, 95 TCATCAAGTGGTCAAGTGGTCATT 5, 97 12 1, 79 TCATCAATAGGTCAATAGGTCATT 3, 15 12 0, 75 TCATCAATGGGTCAATGGGTCATT 5, 18 12 1, 54 T CAT CAT T TAGACATT TAGACAT T 4, 19 12 1, 81 T C AT C AT TAT GAC AT T AT GAC AT T 2, 90 12 1, 16 T C AT C AT AT T GAC ATAT T GAC AT T 3, 34 12 1, 16 T C AT C AT TAAGAC AT T AAGAC AT T 3, 40 12 1, 53 T C AT C AT AT AGAC ATATAGAC AT T 3, 51 12 1, 03 T C AT C AT AAT GAC ATAAT GAC AT T 1, 91 12 0, 71 T C AT C ATAAAGAC ATAAAGAC AT T 2, 17 12 0, 72 T C AT CAAAAAGAC AAAAAGAC AT T 1, 37 12 0, 83 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 13, 35 16 2, 23 TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 1, 34 24 0, 52 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 13, 85 16 4, 36 TCATAATTTTGTAATTTTGTCATT 7, 59 12 2, 71 TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT 13, 80 12 3, 41 TCATGATTTTGTGATTTTGTCATT 6,20 12 2, 71 ΡΕ1511845 75 (continuação)

ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3 ') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO (ODN a 0,375 pg/ml)

Méd. N DP IMT 534 TCATCCTTTTGTCCTTTTGTCATT 11, 67 12 4,49 IMT 535 TCATCTTTTTGTCTTTTTGTCATT 12, 49 12 2,51 IMT 022 (SEQ, ID N° 8); IMT 504 (SEQ ID N°2); IMT 531 (SEQ ID N°14); IMT 532 (SEQ ID N°15); IMT 533 (SEQ ID N°16) ; IMT 533 (SEQ ID N°17); IMT 534 (SEQ ID N°18); IMT 535 (SEQ ID N° 19) ; IMT 537 (SEQ ID N°30); IMT 538 (SEQ ID N°31); IMT 539 (SEQ ID N°32); IMT 540 (SEQ ID N°33); IMT 541 (SEQ ID N°34); IMT 542 (SEQ ID N°35); IMT 543 (SEQ ID N°36) ; IMT 544 (SEQ ID N°37); IMT 545 (SEQ ID N°38); IMT 546 (SEQ ID N°39) ; IMT 547 (SEQ ID N°40) ; IMT 548 (SEQ ID N°41) ; IMT 549 (SEQ ID N°42) ; IMT 550 (SEQ ID N°43); IMT 551 (SEQ ID N°44); IMT 552 (SEQ ID N° 45); IMT 539 (SEQ ID N° 82) ; IMT 597 (SEQ ID N° 83); IMT 602 (SEQ ID N° 84); IMT 540 (SEQ ID N°85); IMT 603 (SEQ ID N°87); IMT 544 (SEQ ID N°88); IMT 599 (SEQ ID N°89) ; IMT 604 (SEQ ID N° 90); IMT 608 (SEQ ID N°75); IMT 609 (SEQ ID N°7 6); IMT 610 (SEQ ID N° 77); (SEQ ID IMT 611 N°81) . (SEQ ID N°78); IMT 612 (SEQ ID N°79) ; IMT 614 TABELA 7

Indução da proliferação de células brancas do sangue periférico e secreção de IL-6 por oligonucleótidos fosforotioatos não CgP com alterações na segunda posição do motivo imuno-estimulador 76 ΡΕ1511845 ODN(S) SEQUÊNCIA (5’-3’) ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 μg/ml) (ODN a 6, 0 pg/ml) Méd. N DP Méd. N DP IMT532 TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT 10,10 4 1,61 221,7 4 35,3 IMT197 TCATlTTTTTGTTnTTTGTCATT 10,84 4 1,06 386,1 4 123,3 IMT198 TCATTGTTTTGTTGTTTTGTCATT 10,00 4 1,75 235,3 4 27,1 IMT199 TCATTCTTTTGTTCTTTTGTCATT 12,36 3 1,71 235,0 4 6,0 IMT 532 (SEQ ID NO: 15); IMT 197 (SEQ ID NO:10) ; IMT 198 (SEQ ID NO:11); IMT 199 (SEQ ID NO:12)

Para investigar o efeito de alterações na posição do motivo dentro da cadeia ODN, o motivo não CpG CATTTTGT presente em ODN IMT504 foi introduzido em diferentes localizações numa cadeia poli T longa de 24 nucleótidos (Fig. 5) . Como se pode observar, o ODN(S) poli T por si só possui uma actividade mitogénica significativa. Por outro lado, a introdução de apenas um motivo CATTTTGT resultou num aumento de 1,2 a 1,8 vezes (medido por ensaios de proliferação) ou 2,4 a 3,5 vezes (medido por ensaios de secreção de IL- -6) na actividade imuno- estimuladora da cadeia poli T, dependendo de onde estiver localizado o motivo. Uma distância de pelo menos dois nucleótidos a partir do extremo 5' ou quatro a partir do extremo 3' parece ser necessário de forma a atingir a actividade máxima (ODNs IMT174 a IMT 179). A introdução de dois motivos em posições óptimas (ODN IMT182) resultou num aumento de 1, 9 vezes (medido por ensaios de proliferação) ou 2, 9 vezes (medido por ensaios de secreção de IL-6) na actividade imuno-estimuladora da cadeia poli T. Isto indica que a contribuição do segundo motivo é negligivel. Por 77 ΡΕ1511845 outro lado, a actividade dos ODNs mais eficazes como seja o ODN IMT504 é mais de 3 vezes superior à actividade do poli T conforme medido por ensaios de proliferação, um facto que sugere também a existência de uma influência significativa da composição de pelo menos alguns dos nucleótidos que rodeiam o motivo deste invento na actividade global do ODN. EXEMPLO 4

Efeito da modificação da estrutura na actividade imuno-estimuladora dos oligonucleótidos não CpG deste invento: influência da composição de nucleótidos fora do motivo activo

Os resultados mostrados na Fig. 5 indicam que a composição do oligonucleótido fora do motivo central não CpG é importante de forma a atingir actividade imuno-estimuladora óptima. Assim, uma série de oligonucleótidos foram sintetizados com alterações na composição dos nucleótidos que rodeiam os motivos. A Tabela 8 mostra o efeito de alterações na composição dos quatro primeiros nucleótidos no extremo 5' e de pelo menos quatro nucleótidos do extremo 3' na actividade imunoestimuladora do ODN IMT 504. Como pode ser observado, as melhores escolhas são: C ou G na posição -1 relativamente aos dois motivos, C, T ou G na posição -2, qualquer nucleótido nas posições -3 e -4, A ou T na posição +1, G na posição +2, qualquer nucleótido nas posições +3 e G na posição +4. Certamente, outras combinações de nucleótidos não 78 ΡΕ1511845 representadas nesta tabela pode ter um efeito igual ou melhor na actividade dos oligonucleótidos não CpG imuno-estimuladores. Os familiarizados com a matéria podem determinar empiricamente outras combinações eficazes. TABELA 8

Indução da proliferação de células brancas do sangue pelo ODN(S) não CpG IMT 504 com variações na composição fora dos dois motivos imuno-estimuladores ODN(S) SEQUÊNCIA(5’~3’) ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 pg/ml) (ODN a 6, 0 pg/ml Méd. N DP Méd. N DP IMT 552 TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 1,9 12 0,7 <39,9 4 — IMT 504 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 11,0 8 0,9 171 2 14 IMT 559 ACATCATTTTGTCATTTTGTCATT 13,4 4 1,0 128 3 3 IMT 560 CCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 12,1 4 0,9 145 4 32 IMT 561 GCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 9,5 4 1,1 209 4 74 IMT 562 TAATCATTTTGTCATTTTGTCATT 12,4 4 1,5 171 4 24 IMT 563 TTATCATTTTGTCATTTTGTCATT n,i 3 0,7 172 4 63 IMT 564 TGATCATTTTGTCATTTTGTCATT 12,8 4 0,9 118 4 38 IMT 565 TCCTCATTTTGTCATTTTGTCATT 14,1 4 0,5 135 4 25 IMT 566 TCTTCATTTTGTCATTTTGTCATT 13,9 4 2,2 157 4 28 IMT 567 TCGTCATTTTGTCATTTTGTCATT 12,9 4 0,7 259 4 25 IMT 568 TCAACATTTTGTCATTTTGTCATT 10,3 4 1,1 153 4 35 IMT 569 TCACCATTTTGTCATTTTGTCATT 15,0 4 1,2 199 3 12 IMT 570 TCAGCATTTTGTCATTTTGTCATT 12,5 4 0,4 181 3 2 IMT 571 TCATCATTTTGTCATTTTGTAATT 14,2 4 0,7 163 4 26 IMT 572 TCATCATTTTGTCATTTTGTTATT 13,2 4 1,4 182 3 67 IMT 573 TCATCATTTTGTCATTTTGTGATT 8,7 4 0,7 177 4 29 IMT 574 TCATCATTTTGTCATTTTGTCCTT 8,1 4 0,7 179 3 58 IMT 575 TCATCATTTTGTCATTTTGTCTTT 10,8 4 0,8 150 3 47 IMT 576 TCATCATTTTGTCATTTTGTCGTT 12,6 4 1,1 202 4 55 ΡΕ1511845 79 (continuação) ODN(S) SEQUÊNCIA (5’-3’) ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 μg/ml)_(ODN a 6,0 μg/ml

Méd. N DP Méd. N DP IMT 577 TCATCATTTTGTCATTTTGTCAAT 10,0 4 1,4 243 3 8 IMT 578 TCATCATTTTGTCATTTTGTCACT 10,9 4 0,9 213 2 9 IMT 579 TCATCATTTTGTCATTTTGTCAGT 10,7 4 1,7 182 4 18 IMT 580 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATA 11,7 4 1,4 194 4 36 IMT 581 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATC 10,7 4 1,0 173 4 18 IMT 582 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATG 12,1 4 0,8 242 3 231 IMT 552 (SEQ. ID N° 45); IMT 504 (SEQ ID N°2); IMT 559 (SEQ ID N°46); IMT 560 (SEQ . ID N° 47); IMT 561 (SEQ ID N°48) ; IMT 562 (SEQ 0 £ Q H IMT 563 (SEQ ID N°50); IMT 564 (SEQ ID N°51); ΙΜΓ 565 (SEQ ID N°52); IMT 566 (SEQ ID N°53); IMT 567 (SEQ ID N°54); IMT 568 (SEQ ID N°55); IMT 569 (SEQ ID N°56); IMT 570 (SEQ ID N°57); IMT 571 (SEQ ID N°58); IMT 572 (SEQ ID N°59); IMT 573 (SEQ ID N°60); IMT 574 (SEQ ID N°61); IMT 575 (SEQ ID N°62); IMT 576 (SEQ ID N°63); IMT 577 (SEQ ID N°64); IMT 578 (SEQ ID N°65); IMT 578 (SEQ ID N°66); IMT 580 (SEQ ID N°67); IMT 581 (SEQ ID N°68); IMT 582 (SEQ ID N°69) ._ EXAMPLE 5

Efeito da modificação da estrutura na actividade imuno-estimuladora de oligonucleótidos não CpG deste invento: influência do tamanho do oligonucleótido A Tabela 9 mostra que ODNs com um motivo imuno-estimulador são activos se a cadeia tiver 16 ou mais nucleótidos de comprimento. A actividade é máxima se o ODN tiver entre 20 e 25 nucleótidos de comprimento. Todos os ODNs dentro desta gama tendo pelo menos um motivo não CpG deste invento testados durante este estudo (mais de uma centena) eram muito activos. 80 ΡΕ1511845 TABELA 9

Efeito do tamanho dos oligonucleótidos fosforotioatos não CpG na proliferação das células B e na secreção de IL6

ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO IL6 (pg/ml) (ODN a 0,375 pg/ml) (ODN a 6, 0 pg/ml Méd. N DP Méd. N DP IMT 187 TTTTCATTTTGT 0,56 8 0,20 <50 4 - IMT 188 TTTTCATTTTGTTTTT 2,76 8 1,73 147 4 40 IMT 189 TTTTCATTTTGTTTTTTTTT 8,21 8 3,19 227 4 21 IMT 175 TTTTCATTTTGTTTTTTTTTTTTT 8,92 8 1,80 220 4 18 IMT 179 TTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTT 6,06 8 2,00 224 4 82 IMT 191 |J_||J 'TTCA' 1111 'TTG' 1111 llTl 1111 llTl 1111 llTl 1111 ^.L^J^T^-L^-UT 6,64 8 2,37 205 4 15 IMT 187 ID N°73) (SEQ ID N°70); IMT 188 (SEQ ; IMT 191 (SEQ ID N°77) 1—1 O o O IMT 189 (SEQ ID CM r-~ o S IMT 179 (SEQ EXEMPLO 6

Indução da secreção de IgM pelas células brancas do sangue periférico pelos oligonucleótidos fosforotioato não CpG deste invento A indução da secreção de IgM em células brancas de sangue periférico é um outro marcador importante da actividade imuno-estimuladora dos oligonucleótidos. A Tabela 10 mostra a estimulação da secreção de IgM por vários oligonucleótidos fosforotioatos não CpG atrás descritos. Como se pode observar, os ODN(S)s não CpG mais activos na indução de proliferação e secreção de IL-6 são também os melhores na indução da secreção de IgM. 81 ΡΕ1511845 TABELA 10

Indução da secreção de de IgM pelas células branca do sangue periférico pelos oligonucleótidos fosforotioatos não

CpG deste invento

ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO (ODN a 1, 50 μυ/ιηΐ) Méd. N DP células 76 9 50 sozinhas 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 778 47 204 IMT503 TTGTTGTTTTGTTGTTTTGTTGTT 640 19 220 IMT504 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 912 24 244 IMT505 TCCTCCTTTTGTCCTTTTGTCCTT 664 23 336 IMT506 TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT 751 43 237 IMT509 AAAAAAC TAAAAAAAAC TAAAAAA 195 17 77 IMT504 (SEQ ID NO:2); IMT505 (SEQ ID NO:4); IMT503 (SEQ ID NO:7); IMT509 NO:3); (SEQ ID IMT 506 NO:13) (SEQ ID EXEMPLO 7

Estimulação da expressão de CD40, MHC I e MHC II em linfócitos B pelos oligonucleótidos fosforotioatos não CpG deste invento PBMCs humanos foram incubados com ODN IMT504, ODN2006 como controlo positivo e ODN IMT022 como controlo 82 ΡΕ1511845 positivo (Fig. 6) . Como se pode observar, ODN IMT504 é tão activo quanto o ODN CpG 2006 para a estimulação da expressão de CD40, MHC I e MHC II nos linfócitos B. EXEMPLO 8

Estimulação de linfócitos B purificados pelos oligonucleótidos não CpG deste invento Células CD19+ (B) humanas foram purificadas até mais de 95% de pureza. A Tabela 11 e a Fig. 7 mostram que a actividade imuno-estimuladora destas células purificadas é comparável à observada usando PBMCs humanos. Estes resultados indicam que a estimulação pelos oligonucleótidos não CpG deste invento nas células humanas é directa. TABELA 11

Indução de proliferação, secreção de IL6 e secreção de IgM nas células B purificadas pelos oligonucleótidos fosforotioatos não CpG deste invento (CDN(S) SEÇJJENCIA (5'~3'J índice de proliferação IL6 (pg/ml) IgM (ng/ml) (CCN 0,375 pg/ml) (CCN 6,0 pg/ml) (CDN 1,5 pg/ml) Mád. N EE> Mád N EP Mád. N EP ΙΜΓ 022 TQÇIQC3ÃASGAGC!AAAAG?G2AA 1,28 16 0,80 1019 5 665 469 7 182 ΊΜΓ 504 TCMCATITIGTCATIT^ 47,95 16 6,41 11002 5 884 1274 9 252 ΊΜΓ 506 TCTILTlTlIGIClTmOICITI 25,58 16 7,84 10933 3 1628 1083 10 430 2006 ΊΌ3ΙΟ^Τ1ΊΊΌΙΌοΤ1ΊΊΌΙΌ3ΓΤ 60,82 24 9,79 7631 6 997 1292 12 245 MT 022 (SEQ. ID N° 8); MT 504 (SEg ID N°2); ΙΜΓ 506 (SEQ ID N°4) ΡΕ1511845 83 EXEMPLO 9

Imuno-estimulação pelos oliqonucleótidos fosfo- diésteres não CpG deste invento

A Fig 8 e a Tabela 12 mostram o efeito dos oligonucleótidos fosfodiésteres não CpG deste invento em PBMCs humanos. Uma vez que os oligonucleótidos fosfodiéster são muito sensiveis a nucleases, foram adicionados à cultura três vezes (0, 4 e 16 hr) para uma concentração final de 30 pg/ml. Usou-se um ODN fosfodiéster CpG muito potente (ODN 2080) como controlo positivo nos ensaios de citometria (Hartmann G, Weeratna R, Bailas ZK, Payette P, Suparto, I, Rasmussen WL, Wadschmidt M, Sajuthi D, Purcells RH, Davis HL, Krieg AM. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. J. Immunol.164, 1617-1624, (2000).). Como se pode observar, nestas condições, os ODNs fosfodiéster portadores de motivos não CpG deste invento possuem actividade imuno-estimuladora. Neste contexto, deve-se notar as diferenças destes ODNs não CpG relativamente aos ODNs não CpG reivindicados em WO 01/22972 (ver tabela 5 e Fig. 4). TABELA 12

Imuno-estimulação pelos oliqonucleótidos fosfodiésteres não

CpG deste invento 84 ΡΕ1511845 ODN(S) SEQUÊNCIA (5'-3') ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO (ODN a 6, 0 pg/ml) Méd. N DP IMT 022 T GC T GCAAAAGAGCAAAAGAGCAA 23 8 10 IMT 053 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 24 4 24 IMT 504 TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 207 6 46 IMT 506 TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT 403 3 220 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 228 4 40

ΙΜΤ 022 (SEQ. ID N° 8); IMT 504 (SEQ ID N°2); IMT 053 (SEQ ID N°19); IMT 506 (SEQ ID N°4) EXEMPLO 10

Indução da proliferação celular em células brancas do sangue periférico de macacos da espécie Cebus apella e Macaca fascicularis pelos ODN(S)s não CpG deste invento

Os ODN(S)s não CpG deste invento não são imuno-estimuladores muito eficazes em murganhos, porcos e carneiros. No entanto, eles são eficazes em macacos. Por exemplo, a Fig. 9 mostra a actividade imuno-estimuladora de ODN(S)s não CpG nas células brancas do sangue periférico de macacos da espécie Cebus apella e Macaca fascicularis. De acordo com estes resultados, os ODNs não CpG mais eficazes em primatas não humanos são os portadores do motivo 85 ΡΕ1511845 CATTTTGT. Assim, os macacos podem ser usados como modelos animais na pesquisa em aplicações clinicas destes ODN(S)s não CpG. EXEMPLO 11

Vacinação de indivíduos

As formulações de vacina contendo como adjuvante os ODNs não CpG deste invento podem ser usadas para vacinar indivíduos contra uma variedade de agentes patogénicos bacterianos e virais e contra células tumorais. A Tabela 13 mostra o efeito da inoculação de macacos da espécie Cebus apella com uma formulação de vacina que inclui o antigénio de superfície da hepatite B recombinante (rHBsAg) e alumina na presença ou ausência de ODN IMT504 como ajuvante. TABELA 13

Respostas anti-HBs em Cebus apella imunizado contra HBsAg

com ODNs IMT ODN (S) Pré-exposiçao Pós- exposição Pós-reforço 14 dias 28 dias 14 dias Nenhum 0 0,4±0,1 14+20 190+52 IMT504 0 10+14 113+114 659+296 2006 0 22+24 67+57 705+315 86 ΡΕ1511845

Como pode ser observado, existe um aumento dramático no titulo de anti-HBsAg nos animais vacinados com HBsAg mais IMT (ODN(S)504 comparativamente com os vacinados apenas com HBsAg. CpG ODN 200 6 tem um desempenho como adjuvante semelhante ao dos ODNs não CpG deste invento.

Em particular, um ser humano pode ser vacinado contra a hepatite B através da administração de uma formulação de vacina que inclui o antigénio de superfície da hepatite B recombinante (rHBsAg) e alumina e um ou mais dos oligonucleótidos deste invento como adjuvantes. A quantidade de rHBsAg em cada dose e o calendário de administração podem variar de acordo com a idade do ser humano. Por exemplo, para indivíduos até aos doze anos de idade, um esquema de três doses de cerca de 2,5 yg até cerca de 5 yg de rHBsAg pode ser administrado aos 0, 1-3 meses depois e 4-18 meses depois, de preferência aos 0, 2 e 6 meses. Um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem estar presentes na formulação e entre cerca de 10 yg e cerca de 1000 yg por dose.

Para os indivíduos entre cerca de 12 e cerca de 60 anos, um esquema de três doses de aproximadamente 5 yg a 40 yg de rHBsAg pode ser administrado aos 0, 1-3 meses depois e 4-18 meses depois, de preferência aos 0, 2 e 6 meses. Um ou mais dos oligonucleótidos deste invento podem estar presentes na formulação entre cerca de 10 yg e cerca de 1000 yg por dose. ΡΕ1511845 87 EXEMPLO 12

Estimulação da expressão de moléculas co-esti-muladoras em linfócitos B malignos pelos oligonucleótidos fosforotioatos não CpG A estimulação dos linfócitos B malignos recuperados do sangue de doentes que sofrem de leucemia linfocitica crónica (CLL) por oligonucleótidos fosforo-tioatos não CpG deste invento foi avaliada por análise de citometria de fluxo (FACS). Os resultados de uma análise FACS tipica estão apresentados na Fig. 10. Como se pode observar, o oligonucleótido fosforotioato não CpG IMT504 deste invento é capaz de estimular a expressão das moléculas co-estimuladoras de superfície CD86, CD40 e MHC classe I em linfócitos B malignos tão bem quanto ODN CpG 2006. EXEMPLO 13

Estimulação de apoptose de células B malignas por oligonucleótidos fosforotioatos não CpG A estimulação de apoptose em linfócitos B malignos recuperados de sangue de doentes que sofrem de leucemia linfocitica crónica (CLL) pelos oligonucleótidos ΡΕ1511845 fosforotioato não CpG deste invento foi avaliada por citometria de fluxo (FACS) usando como marcadores de apoptose iodeto de propídio e anexina V. 0 resultado de uma análise FACS tipica estão apresentados na Fig. 11. Como pode ser observado, o oligonucleótido não CpG IMT504 deste invento é capaz de aumentar a apoptose das células de leucemia tão bem quanto o ODN CpG 2006. EXEMPLO 14

Estimulação da expressão de moléculas co-es-timuladoras em células dendriticas plasmacitóides pelos oligonucleótidos fosforotioato não CpG deste invento A estimulação de células dendriticas plasmacitóides recuperadas do sangue de dadores normais pelos oligonucleótidos fosforotioato nãp CpG deste invento foi avaliada por análise de citometria de fluxo (FACS). Os resultados de uma análise FACS tipica estão apresentados na Fig. 12. Como se pode ver, o oligonucleótido fosforotioato não CpG IMT504 deste invento é capaz de estimular a expressão das moléculas de superfície CD86, CD40 e MHC classe I nas células plasmacitóides dendriticas tão bem quanto o ODN CpG 2006. A tabela 14 mostra que os oligonucleótidos não CpG deste invento são também capazes de estimular células plasmacitóides dendriticas humanas purificadas para 89 ΡΕ1511845 secretarem interferão alfa se o esqueleto oligonucleotídico for fosfodiéster. TABELA 14

Secreção de interferão alfa por células dendrlticas plas-macitóides purificadas incubadas com oligonucleótidos fosforotioatos e fosfodiésteres não CpG deste invento ODN(S) SEQUÊNCIA (5’-3’) Secreção de IFN alfa (pg/ml) Méd. N DP IMT 022 (S) TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA <31 3 — IMT 504 (S) TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT <31 3 — IMT 022 (0) TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA <31 3 — IMT 504 (0) TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 2300 3 632 IMT022 (SEQ ID NO:8); IMT504 (SEQ ID NO:2). Os ODNs fosforotioatos foram adicionados (1,5 yg/ml) no tempo 0 da incubação. Os ODNs fosfodiésteres foram adicionados como se segue: 30 yg/ml no tempo 0, 30 yg/ml após 4 hr e 30 yg/l após 16 hr de incubação._ EXEMPLO 15

Tratamento de indivíduos com doença tumoral

Formulações farmacêuticas contendo um ou mais dos oligonucleótidos estimuladores deste invento, podem ser 90 ΡΕ1511845 usados para tratar indivíduos contra uma variedade de doenças tumorais. Em particular, um ser humano com melanoma pode ser tratado pela administração de uma formulação farmacêutica contendo o oligonucleótido deste invento como componente activo. A quantidade de oligonucleótido em cada dose e o esguema de administração, podem variar de acordo com a massa corporal do indivíduo e fase de progressão do tumor. Por exemplo, para um ser humano com cerca de 7 0 kg gue tem um melanoma metástico avançado não removível, uma dose de aproximadamente 1 mg do oligonucleótido deste invento pode ser administrada 3 vezes por semana durante cerca de 10 semanas. EXEMPLO 16

Indução de secreção de IL-10 por células brancas do sangue periférico e inibição da secreção de IL-5 por oligonucleótidos fosforotioatos não CpG deste invento IL-10 é um supressor potente da produção e indução de IgE e a manutenção da anergia de células T específica de epitopos está associada com aumento de IL-10. A Fig. 13 mostra a estimulação da secreção de IL-10 pelo oligonucleótido fosforotioato não CpG IMT504 e controla em PBMCs de vários dadores. Como pode ser observado, IMT504 é tão activo como o controlo positivo CpG ODN 2006. As células Th2 específicas de alergénio produzem IL-5, a qual promove a diferenciação, activação e sobrevivência de 91 ΡΕ1511845 eosinófilos. Fig 14 mostra que o oligonucleótido fosforotioato não CpG IMT504 e o ODN controlo positivo CpG ODN 2006 são repressores da produção de IL-5 em vários PBMCs humanos induzidos por IL-4 + Con A. EXEMPLO 17

Tratamento de indivíduos com doença alérgica

Formulações farmacêuticas contendo um ou mais oligonucleótidos imuno-estimuladores deste invento, podem ser usados para tratar indivíduos contra uma variedade de doenças alérgicas.

Em particular, um ser humano com asma pode ser tratado pela administração no trato respiratório de uma formulação farmacêutica aerossolizada contendo o oligonucleótido deste invento como componente activo. A quantidade de oligonucleótido em cada dose e o esquema de administração pode variar de acordo com o indivíduo.

Sequências oligonucleotídicas que estão fora do âmbito deste invento

As sequências que se seguem (descritas na lista de bibliografia atrás apresentada) estão excluídas do âmbito das reivindicações: 92 ΡΕ1511845

ACTTCTCATAGTCCTTTGGTCCAG

TT GTTTTTTTGTTTTTTT GTTTTT TTTTTTTTGTTTTTTT GTTTTT TTTTGGGGTTTT GGG GTTTT CTGGT CTTT CTGGTTTTTTT CT GG CTGT GCTTT CTGT GTTTTT CTGTG GÀACGTTCGATGCTGTT GCTGAACCTTCC AT GCTG TT ΊΓΤΤΤΪ GTTTTGT GQTTTTGTQGTT TTGGTTTTTTT G&TTTTTTTTTGG ACATCTGGTTCTTACTTCAGG

GGTTCTTTTGGTCCTTGTCT

GGTTCTTTTGGTCCTTATCT

TGGTCTTTTGGTCCTTGTCT

TTCAGTTGTCTTGCTGCTTAGGTAA

GGTTCTTTTGGTGCTTGTCT

TGGTGGTTTT GTGGTTTTGIGGTT

TCGTCCTTTTGTCCTTTTGTCCTT

CTGTGCTTTCTGTGTTTTTCTGTG

TGCTGCT T GT GC TTQIGCTT

GGTTCTTTTGGTGCTTGTCT

CTGGTCTTTGTGGTTTTTTTCTGG

TNGTNGTTTTGTNGTTTTGTNGTT

CTGTGCTTTCTGTGTTTTTCTGTG

GAACCTTCGATGCTGTT

GCTGAAGGTTCCATGCTGTT

TTTTT GTTTTGT GGTTTT GTGG TT

TTCAGTT GTCTT GCT GCTTAGCTAA

ACATCT GGTTCTTACTTG AGG GGTTCTTTTGGTCCTTATCT

TGGTCTTTTGGTCCTTGTCT

TTGTTGTTGTTGTTTGTTGTTGTTG T CCATGTNG TTCCT GAT GCT ACTT CTCATAGTCGC TTT GGT CCAG TTGTTTTTTTGTTTTTTTGTTTTT TTTTTTTTGTTTTTTT GTTTTT

CTTAGGGGTGTTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTG

GAAAACCTT

GAAAACGTT

TTÂGTT GTT AG TTATT AGTT TTAGTT GTT AG TTTTTAGTT TTÂGTT GTTAGTTCTTAGTT TTÂGTT GTTAGTTGTTAGTT GGCTGAGCT GGCTTTTT CTT GTGG GT GGT CTTT CT GGTTTTTTT CT GG CT CCTATTGGT GGTTT CCT.AT CT CCTATTGGGTTTTTCCTAT CTCCTATT GGT GTTTTCCTAT CTCCT ATTGGTT GTTTCGTAT 93 ΡΕ1511845

CT CCTATTTG GTGTTT CCTAT CTCGTATTTG TGGTTT CCTAT CT CCTATTTT GG GTTT CCTAT TTGGAGTTTTTGGTGGGG TTGGAGTTTTTGGTTTTT CT G ATGTGTT GAÂGÂACA TGC TGTATTT CTGGTACA GTT AT CGCT GCTGT A.CCTTGCTGTACTG CT QGCTTTT GGGTT TGT GTTGTGACTCAAG

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: IMMUNOTECH SA suas (ii) TÍTULO DO INVENTO: Oligonucleótidos imuno-estimuladores utilizações. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 74 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Dragotti & Associati

(B) RUA: Galleria San Babila 4/C

(C) CIDADE: MilANO (D) ESTADO: (E) PAÍS: Italy (F) ZIP: 20122 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: (D) SOFTWARE: (vi) DADOS PO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE PEDIDO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: CA-2388049 (B) DATA DE PEDIDO: 2002-05-30 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: Roberto Pistolesi (B) NÚMERO DE REGISTO: 94880 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 03mg06e (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: +39 02 799340 (B) TELEFAX: +39 02 784427 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°1 (IMT 021): (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1: TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 94 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°2 (IMT 504) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°1 (IMT 505) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3: TCCTCCTTTTGTCCTTTTGTCCTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°4 (IMT 506) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4: TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°5 (IMT 501) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 5: TAGTAGTTTTGTAGTTTTGTAGTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°6 (IMT 502) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 6: TGGTGGTTTTGTGGTTTTGTGGTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°7 (IMT 503) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 95 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 7: TTGTTGTTTTGTTGTTTTGTTGTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°8 (IMT 022): (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 8: TGCTGCAAAAGAGCAAAAGAGCAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°9 (IMT 023): (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 9: TGCTGCCCCCGCGCCCCCGCGCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°10 (IMT 197) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 10: TCATTTTTTTGTTTTTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°ll (IMT 198) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 11: TCATTGTTTTGTTGTTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°12 (IMT 199) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 12: TCATTCTTTTGTTCTTTTGTCATT 96 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°13 (IMT 509) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 13: AAAAAACTAAAAAAAACTAAAAAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°14 (IMT 531) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 14: TCATAATTTTGTAATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°15 (IMT 532) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 15: TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°16 (IMT 533) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 16: TCATGATTTTGTGATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°17 (IMT 534) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 17: TCATCCTTTTGTCCTTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°18 (IMT 535) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 97 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 18: TCATCTTTTTGTCTTTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°19 (IMT 053) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 19:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°20 (IMT 173) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 20:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°21 (IMT 174) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 21:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°22 (IMT 175) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 22:

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°23 (IMT 176) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 23:

98 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°24 (IMT 177) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 24: TTTTTTTTCATTTTGTTTTTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°25 (IMT 178) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 25: TTTTTTTTTTCATTTTGTTTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°26 (IMT 179) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 26: TTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°27 (IMT 180) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 27: TTTTTTTTTTTTTTCATTTTGTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°28 (IMT 181) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 28: TTTTTTTTTTTTTTTTCATTTTGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°29 (IMT 182) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 99 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 29: TTTTCATTTTGTCATTTTGTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°30 (IMT 537) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 30: TCATCAATTTGTCAATTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°31 (IMT 538) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 31: TCATCATATTGTCATATTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°32 (IMT 539) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 32: TCATCATTATGTCATTATGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°33 (IMT 540) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 33: TCATCATTTAGTCATTTAGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°34 (IMT 541) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 34: TCATCATTTTATCATTTTATCATT 100 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°35 (IMT 542) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 35: TCATCATTTTTTCATTTTTTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°36 (IMT 543) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 36: TCATCATTTTCTCATTTTCTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°37 (IMT 544) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 37: TCATCATTTTGACATTTTGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°38 (IMT 545) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 38: TCATCATT T AG AC AT T T AG AC AT T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°39 (IMT 546) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 39: TCATCATTATGACATTATGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°40 (IMT 547) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 101 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 40: TCATCATATTGACATATTGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°41 (IMT 548) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 41:

T CAT CAT TAAGACAT TAAGACAT T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°42 (IMT 549) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 42: TCATCATATAGACATATAGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°43 (IMT 550) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 43:

TCATCATAATGACATAATGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°44 (IMT 551) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 44: TCATCATAAAGACATAAAGACATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°45 (IMT 552) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°45:

T CAT CAAAAAGACAAAAAGACAT T 102 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°46 (IMT 559) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 46: ACATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°47 (IMT 560) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 47: CCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°48 (IMT 561) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 48: GCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°49 (IMT 562) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 49: TAATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°50 (IMT 563) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 50: TTATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°51 (IMT 564) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 103 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 51: TGATCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°52 (IMT 565) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 52: TCCTCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°53 (IMT 566) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 53: TCTTCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°54 (IMT 567) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 54: TCGTCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°55 (IMT 568) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 55: TCAACATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°56 (IMT 569) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 56: TCACCATTTTGTCATTTTGTCATT 104 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°57 (IMT 570) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 57: TCAGCATTTTGTCATTTTGTCATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°58 (IMT 571) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 58: TCATCATTTTGTCATTTTGTAATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°59 (IMT 572) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 59: TCATCATTTTGTCATTTTGTTATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°60 (IMT 573) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 60: TCATCATTTTGTCATTTTGTGATT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°61 (IMT 574) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 61: TCATCATTTTGTCATTTTGTCCTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°62 (IMT 575) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 105 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 62: TCATCATTTTGTCATTTTGTCTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°63 (IMT 576) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 63: TCATCATTTTGTCATTTTGTCGTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°64 (IMT 577) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 64: TCATCATTTTGTCATTTTGTCAAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°65 (IMT 578) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 65: TCATCATTTTGTCATTTTGTCACT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°66 (IMT 579) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 66: TCATCATTTTGTCATTTTGTCAGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°67 (IMT 580) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 67: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATA 106 ΡΕ1511845 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°68 (IMT 581) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 68: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°69 (IMT 582) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 69: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°70 (IMT 587) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 70: TTTTCATTTTGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°71 (IMT 588) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 71: TTTTCATTTTGTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°72 (IMT 580) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 72: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°73 (IMT 179) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 107 ΡΕ1511845 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 73: TTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°74 (IMT 191) (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGia: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 74:

T T T T CATT T TGTTTTTTTTTTTTTTTTT

Lisboa, 4 de Abril de 2012

Claims (19)

1. ΡΕ1511845 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um oligonucleótido imuno-estimulador tendo até 100 nucleótidos e compreendendo um motivo de sequência de ácido nucleico não palindrómica tendo a fórmula que se segue: TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ ID N°2) .
2. 2. Um oligonucleótido imuno-estimulador de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter até 40 nucleótidos.
3. 3. Um oligonucleótido que é TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ ID N°2) .
4. 4. O oligonucleótido imuno-estimulador das reivindicações 1-3, em que o oligonucleótido imuno-estimulador é encapsulado num veiculo de libertação controlada.
5. 5. O oligonucleótido imuno-estimulador das reivindicações 1-3, em que o oligonucleótido imuno-estimulador está incluído num veículo farmaceuticamente aceitável .
6. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleótido imuno-estimulador de acordo com as reivindicações 1-3 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 2 ΡΕ1511845
7. 7. Uma composição de acordo com a reivindicação 6, em que o referido oligonucleótido imuno-estimulador está incluído num plasmídeo.
8. 8. Uma composição de acordo com a reivindicação 6 compreendendo ainda um antigénio.
9. 9. Uma composição de acordo com a reivindicação 8, em que o antigénio é seleccionado do grupo consistindo em virus, bactérias, fungos, parasitas, células tumorais, toxinas, alergénios, proteínas, glicolípidos e polissacá-ridos.
10. 10. Uma composição de acordo com a reivindicação 8, em que o antigénio é um antigénio virai, um antigénio bacteriano, uma célula tumoral humana ou animal e/ou um antigénio de fungo.
11. 11. Uma composição de acordo com a reivindicação 8, em que o antigénio é codificado por um plasmídeo.
12. 12. Uma composição de acordo com as reivindicações 6-11 na forma líquida ou liofilizada.
13. 13. Utilização de um oligonucleótido imuno-estimulador de acordo com as reivindicações 1-5 para a produção de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença tumoral. 3 ΡΕ1511845
14. 14. A utilização da reivindicação 13, em que a referida doença tumoral é seleccionada entre leucemia mielogénica crónica, linfoma linfoblástico de células precursoras B, leucemia linfocitica crónica das células b, linfoma linfoplasmocitico, linfoma das células de Mantle, linfoma do centro folicular (folicular e difuso), linfoma B da zona marginal, linfoma extranodal, linfoma nodal das células B na zona marginal, linfoma esplénico das células B da zona marginal, tricoleucemia, plasmocitoma, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, linfoma das células B de grau elevado, tipo Burkitt, melanoma, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, carcinoma das células renais, cancro da bexiga, cancro do pulmão, cancro da pele, cancro da mama, cancro do cólon e cancro do útero.
15. 15. Utilização de um oligonucleótido imuno-esti-mulador de acordo com as reivindicações 1-5 para a produção de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhoria de distúrbios imunológicos seleccionado entre alergia, imunodeficiência combinada severa, doença granulomatosa crónica e doença de imunodeficiência adquirida.
16. 16. A utilização das reivindicações 13-15, em que o medicamento se destina a um ser humano.
17. 17. A utilização das reivindicações 13-15, em que o oligonucleótido foi conjugado com um ou mais anti- génios. 4 ΡΕ1511845
18. 18. A utilização das reivindicações 13-15, em que o medicamento compreende um antigénio.
19. 19. A utilização das reivindicações 13-15, em que o medicamento é para administração por via intramuscular, oral, intranasal, anal, vaginal ou transdérmica. Lisboa, 4 de Abril de 2012