CN114577954B - 检测吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法。本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法包括:配制磷酸盐缓冲液作为解吸附剂;将解吸附剂与待测疫苗样本混合,室温反应,并于室温条件下离心,取上清溶液,用针式过滤器过滤,即得解吸附后的样本;采用高效液相色谱仪,对解吸附后的样本通过梯度洗脱的方式进行CpG ODN含量的检测。本发明的方法适用于各种含有CpG ODN和铝佐剂的吸附型疫苗中CpG ODN含量的检测。
Description
技术领域
本发明是关于一种检测含有CpG ODN复合佐剂的吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法。
背景技术
CpG ODN(CpG oligonucleotide)作为一种疫苗佐剂,可以被T淋巴细胞样受体9识别,是脊椎动物免疫系统识别病原微生物的一种固有免疫应答机制。已有许多临床研究评价了CpG ODN的疫苗佐剂活性,研究发现,无论是单独使用CpG ODN还是与其他佐剂(如铝佐剂、MF59)联用,都能显著增强抗原特异性体液免疫效应和细胞免疫效应。
含有CpG ODN佐剂的疫苗的检定中,除了抗原外,CpG ODN作为疫苗产品的重要成分之一,其质量控制也是关键技术瓶颈。
现有技术CN104195235A公开了一种检测CpG ODN序列纯度的方法及应用。“反相色谱检测CpG ODN纯度方法的建立”(王丽丽,《药物生物技术》,2015,22(4):335-339)公开了一种反相色谱检测CpG ODN的方法。然而,这些现有技术的方法中,柱温较高,且梯度洗脱时间过长,流动相成分复杂;并且,这些方法均是用于CpG ODN合成产物中检测其纯度,对高近似度的杂质检定(n-)结果良好,可以有效分辨出目的产物纯度,但对样品要求较高,需要保证测试样品溶解性好,样品溶液在进样前还要用0.22μm或0.45μm针式过滤器过滤。并不适用于对疫苗产品中的CpG ODN进行检测。
此外,对于含有CpG ODN与铝佐剂的吸附型疫苗,疫苗尺寸为微米级别,其中铝佐剂因其表面特征和带正电荷的性质不仅可以吸附抗原,同时对带负电荷的CpG ODN亦具有较强吸附能力,不能直接进样检测,若是用针式过滤器过滤,则会将有效成分全部截留,从而,无法通过高效液相色谱法准确定量。
另一方面,CN111812313A公开了一种铝佐剂吸附型新型冠状病毒灭活疫苗中抗原的解离方法,该方法中采用的解吸附剂包括表面活性剂聚山梨酯-80。然而,对于液相色谱检测技术,如果供试品溶液中含有表面活性剂,多次进样后,由于表面活性剂会在色谱柱筛板及硅胶表面形成表面膜,导致峰变宽、拖尾甚至分叉,因此,这种解离方法并不适用于检测吸附型疫苗中CpG ODN含量时进行解离。
因此,有必要针对CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗中CpG ODN的检测开发一种检定方法,实现生物制品中CpG ODN的准确定量检测。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检测含有CpG ODN佐剂的吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法,避免检定过程中铝佐剂和抗原对CpG ODN检测的干扰,实现生物制品中CpGODN的准确定量检测。
为达上述目的,本发明提供了一种检测疫苗中CpG ODN含量的方法,所述疫苗为含有CpG ODN和铝佐剂的吸附型疫苗,所述方法包括:
配制磷酸盐缓冲液作为解吸附剂;
将解吸附剂与待测疫苗样本混合,室温反应,并于室温条件下离心,取上清溶液,用针式过滤器过滤,即得解吸附后的样本;
采用高效液相色谱仪,对解吸附后的样本通过梯度洗脱的方式进行CpG ODN含量的检测。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述解吸附剂中,磷酸盐缓冲液成分为磷酸氢二钾与磷酸二氢钾,或磷酸氢二钠与磷酸二氢钠。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述解吸附剂中,磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为90%:10%-60%:40%;
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述解吸附剂中,磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的质量比为90%:10%-60%:40%。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述解吸附剂中磷酸根离子的总浓度为0.5M-2M。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述解吸附剂与疫苗样本是按照1:1体积比混合。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,室温反应时间为30分钟至3小时。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,离心条件为:室温条件下离心转速为8000-15000rpm/min,离心时间为5-30分钟。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,针式过滤器为0.22μm或0.45μm的针式过滤器。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,所述高效液相色谱仪检测系统为UV/Vis检测器或PDA检测器,色谱柱为C18柱。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,色谱柱柱温为20-60℃,样品温度为4-25℃。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,流动相A为25-100mmol/L的TEAA水溶液,pH为5.0-9.0;流动相B为乙腈。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,控制高效液相色谱检测条件为:流速为0.1-1mL/min,进样量为10-20μL。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,控制高效液相色谱检测条件为:检测波长为254-260nm;
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,控制高效液相色谱检测条件为:洗脱过程中初始流动相B的比例为5%-15%,洗脱过程中最终流动相B的比例为25%-35%。
根据本发明的具体实施方案,本发明的检测疫苗中CpG ODN含量的方法中,控制高效液相色谱检测条件为:洗脱时间为10-20分钟。
本发明的方法,通过样品处理,使吸附在铝佐剂上的CpG ODN快速解离,并保持其原有结构,同时避免制品中抗原对检测造成的干扰;进一步通过反向色谱检测方法,可获得精确度高的检定结果。本发明的方法适用于各种含CpG ODN复合佐剂的疫苗,包括针对不同疾病的疫苗,如新型冠状病毒疫苗、乙肝疫苗、流感疫苗、联合疫苗等;以及针对同种疾病但不同类型的疫苗,如灭活疫苗、重组疫苗、mRNA疫苗等。
附图说明
图1A-图1D为本发明具体实施例1中各样品的色谱图。
图2A-图2F为本发明具体实施例2中各样品的色谱图。
图3为CpG ODN标准品线性曲线图。
图4A-图4J为本发明具体实施例9中各样品的色谱图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明,应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中,各原始试剂材料均可商购获得,未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义,本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
本发明提供的检测含有CpG ODN佐剂的吸附型疫苗中CpG ODN含量的方法,主要包括样品处理及高效液相色谱法检测。
1. 样品处理
解吸附剂的配制:配制含有60%-90%磷酸氢二钾和10%-40%磷酸二氢钾的水溶液,其中磷酸根离子的总浓度为0.5M-2M。
CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗样品的处理:按1:1体积比将疫苗成品和解吸附剂混合,室温放置反应30min-3h;将解吸附后的样品于室温条件下8000-15000rpm/min离心5-30min,取上清溶液,用0.22μm的针式过滤器过滤后转移至液相样品瓶中,盖上盖子后备用。
2. 高效液相色谱法检测
本方法中,使用的检测设备为高效液相色谱仪,检测系统为UV/Vis检测器或PDA检测器,使用的色谱柱规格为C18柱。将25-100mmol/L TEAA水溶液(pH5.0-9.0)作为流动相A,乙腈作为流动相B,通过梯度洗脱的方式对CpG ODN含量进行检测。检测过程中,供试品被流动相带入色谱柱中,由于柱中的固定相与供试品中各组份之间的分子作用力不同,导致各组份从色谱柱中流出时间不同,从而使各组份分离。通过采用合适的积分方法对结果进行处理,绘制含有各组份峰的色谱图,并根据图中标明的出峰时间和顺序,对化合物进行定性分析;根据峰的高低和面积大小,可对化合物进行定量分析。
(1)仪器:高效液相色谱仪(检测器:UV/Vis检测器或PDA检测器)。
(2)色谱柱:C18柱。
(3)流动相的制备:
流动相A:配制25-100mmol/L的TEAA水溶液,pH为5.0-9.0。
流动相B:色谱纯乙腈。
流动相使用前均须使用0.45µm流动相过滤膜进行真空抽气过滤,并水浴超声10-20分钟,使其充分脱气。
(4)CpG ODN复合佐剂疫苗样品的处理:
见1. 样品处理。
(5)CpG ODN标准品的制备:
CpG ODN标准品母液(1mg/mL):取2瓶1mg的CpG ODN标准品粉末,分别加入1mL纯化水溶解,得到2瓶浓度为1mg/mL的CpG ODN标准品母液。以上配制可按比例配制。
CpG ODN工作标准液(20μg/mL):取其中一瓶CpG ODN标准品母液,用移液枪吸取200μL至10mL容量瓶中,配制浓度为20μg/mL的标准品溶液;采用同样方法吸取另一支CpGODN标准品母液,配制浓度为20μg/mL的CpG ODN标准溶液检查品。
(6)根据表1色谱参数设置该HPLC系统。
表1
(7)应用已建立的运行方法,用流动相将系统平衡至基线稳定(用时大约1小时)。
(8)执行序列,在注射序列完成后,处理每一针的数据,保证目标分析物峰能得到正确的积分。打印出已执行的注射序列,仪器方法,数据处理方法及所有的图谱。
(9)清洗仪器,仪器降温后关机。
实施例1
本实施例为确认该样品处理方法是否可以用于检测CpG ODN复合佐剂疫苗(即含有CpG ODN和铝盐的复合佐剂的吸附型疫苗)成品中CpG ODN含量,具体疫苗为CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)。
实验方法:
(1)材料及试剂
0.22µm针式过滤器、0.45µm流动相过滤膜、一次性注射器、CpG ODN标准品、分析纯无水磷酸氢二钾、分析纯无水磷酸二氢钾、分析纯三乙胺、分析纯乙酸、色谱级乙腈、色谱级甲醇、超纯水。
(2)设备
高效液相色谱仪(检测器:UV/Vis Detector)、液相色谱柱(C18柱)、pH计、日立高速离心机、电子天平、超纯水仪、真空抽气泵、微量移液器、超声波清洗器。
(3)流动相的制备
流动相A:配制pH值为6.5-6.9、50mmol/L的TEAA水溶液。
流动相B:量取色谱纯乙腈1000mL。
流动相使用前均须使用0.45µm流动相过滤膜进行真空抽气过滤,并水浴超声10-20分钟,使其充分脱气。
(4)CpG ODN标准液配制:
取CpG ODN标准品粉末,加入适量无菌纯化水溶解,得到浓度为1mg/mL的CpG ODN标准品母液。用移液枪吸取200μL至10mL容量瓶中,配制浓度为20μg/mL的标准品溶液。
(5)色谱学条件如表2所示。
表2
(6)样品处理
配制含有磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的水溶液,其中磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的质量比为84%:16%,磷酸根离子的总浓度为1M。
CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗样品的处理:按1:1的比例将疫苗成品和解吸附剂混合,室温放置反应1h;将解吸附后的样品于室温条件下15000rpm/min离心15min,取上清溶液。
采用上述HPLC检测方法对按步骤(6)处理后样品进行分析,对照为未经解吸附剂处理样品,实验结果如表3所示,各样品的色谱图见图1A-图1D。
表3
实施例2
本实施例通过该方法检测了6批CpG ODN复合佐剂疫苗,具体为CpG ODN佐剂新型冠状病毒病毒灭活疫苗成品。
实验方法同实施例1。
编辑序列表,应用已建立的运行方法,用流动相将系统平衡至基线稳定(用时大约1小时)。执行序列,在注射序列完成后,处理每一针的数据,保证目标分析物峰能得到正确的积分。
实验结果如表4所示:
表4
6批成品检测色谱图如图2A-图2F所示。
CpG ODN标准品线性曲线图如图3所示。
实施例3:
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对专属性进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
在该验证研究中,专属性测试的目的是确保供试品背景中的成分不会对实验造成干扰。使用供试品背景溶液进行检测,结果总结于表5。测试结果满足预设的专属性测试的接受标准,即供试品背景溶液在CpG ODN滞留时间上的峰面积不大于工作标准溶液中CpGODN峰面积的1%。
表5
注:%干扰峰 =供试品背景溶液在CpG ODN滞留时间上的峰面积/工作标准溶液中CpG ODN峰面积×100。
实施例4
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对线性进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
线性标准液的制备:
按照表6配制5种浓度的CpG ODN标准溶液。每次移取规定体积的标准母液至容量瓶中,加纯化水至刻度线,混匀。20μg/mL的CpG ODN也可用作工作标准液。
表6
线性结果总结在表7中。测试结果满足预设的线性接受标准,线性相关系数R2≥0.99。
表7
实施例5
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对重复性和中间精密度进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
重复性CpG ODN样品溶液的制备:
取1批疫苗成品,将10瓶混匀,共5mL,分6次解吸附后制备样品溶液,结果如表8所示。
表8
中间精密度CpG ODN样品溶液的制备:
取1批疫苗成品,将10瓶混匀,共5mL,分6次解吸附后制备样品溶液,结果如表9所示。
表9
重复性的所有结果都总结在表10中。由表10可知,100%浓度级样品6次检测结果的RSD6不高于5%,满足重复性的接受标准。
表10
中间精密度的所有结果都总结在表11中。分析员1和分析员2分别测定的100%浓度级样品6次检测结果的RSD6不高于5%,两名分析员检测结果的RSD12不高于8%,满足中间精密度的接受标准。
表11
实施例6
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对准确性进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
准确性CpG ODN样品溶液的制备:
配制CpG ODN终浓度为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的试验苗,分别解吸附后制备样品溶液,结果如表12所示。
表12
准确性的所有结果都总结在表13中。不同浓度级测试结果满足预设的准确性接受标准,每一浓度级的回收率均在90%-110%之间。
表13
注:1:用以下公式计算测量浓度:
检测浓度=样品的峰面积/标准品峰面积×标准品浓度;
其中,“标准品峰面积”是整个工作标准品注射剂的峰面积的平均值。
2:用以下公式计算回收率:
回收率%=检测浓度/理论浓度×100%。
实施例7
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对系统适用性进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
系统适用性检测样品为20μg/mL CpG ODN标准溶液。
前、后系统适用性结果总结在表14和表15中。测试结果满足预设的前系统适用性的接受标准,即20μg/mL CpG ODN标准溶液六针连续注射的CpG ODN峰面积的相对标准偏差RSD6不大于2%、理论塔板数不小于8000、拖尾因子不大于1.5;测试结果满足预设的后系统适用性的接受标准,即20μg/mL CpG ODN标准溶液六针连续注射的CpG ODN峰面积和所有包夹注射的CpG ODN峰面积的相对标准偏差RSD(6+n)不大于3%。
表14
表15
实施例8:
本实施例为确认该方法是否满足检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求,对耐用性进行了方法学验证。
实验方法同实施例1。
耐用性检测样品同实施例5。
耐用性是在测定条件发生微小变动时,为确保测定结果不受影响所建立的方法验证,为日常检验提供依据。本验证研究主要针对液相色谱柱温度、初始流动相比例、流速、流动相pH值、溶液稳定性等条件进行了测试,耐用性测试结果总结于表16中,以下实验均在系统适用性达到要求的条件下进行。在以下条件发生微小变动时,检测结果都满足所有预设的耐用性接受标准。
表16
注:1:用以下公式计算测量浓度:
检测浓度=样品的峰面积/标准品峰面积×标准品浓度;
其中,“标准品的峰面积”是整个工作标准品注射剂的峰面积的平均值。
2:用以下公式计算回收率:
回收率%=检测浓度/理论浓度×100%。
实施例9:
本实施例将本发明中HPLC法与两种已报道的现有HPLC法比较,同时结合了本发明解吸附方法与现有解吸附方法,为确认本发明中HPLC法与其解吸附方法结合适用于检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量的需求。
在该实施例中,实验样品为20μg/mL的CpG ODN标准品,试验苗为自配的含有CpGODN铝复合佐剂的新型冠状病毒灭活疫苗,其中CpG ODN浓度为40μg/mL。选用三种成分的解吸附剂,两种为本发明解吸附剂,一种为现有技术的解吸附剂。分别用三种解吸附剂将试验苗解离后,采用三种HPLC法对CpG ODN含量进行检测。
HPLC法1(“反相色谱检测CpG ODN纯度方法的建立”,王丽丽,《药物生物技术》,2015,22(4):335-339):
液相条件:流动相A为15mmol/L TEA和400mmol/L六氟异丙醇)溶液组成;流动相B为50%甲醇的15mmol/L TEA和400mmol/L六氟异丙醇)溶液组成;线性梯度洗脱条件:0-35min,B液33%-40%,35-39min,B液40%-40%,39-39.9min,B液40%-33%。柱温为60℃,流量为0.25mL/min,进样量为5μL,检测波长:260nm。
样品处理:同实施例1。
HPLC法2(CN104195235A:一种检测CpG ODN序列纯度的方法及应用):
液相条件:流动相A为30mmol/L TEA和400mmol/L六氟异丙醇溶液组成;流动相B为40%甲醇的30mmol/L TEA和400mmol/L六氟异丙醇)溶液组成;洗脱方式是在60min内流动相A从100%-0%,流动相B从0%-100%的顺序梯度浓度进行洗脱。柱温为50℃,流量为0.5mL/min,进样量:20μL,检测波长为245nm。
样品处理:同实施例1。
HPLC法3:同实施例1。
解吸附方法:同实施例1。其中解吸附剂1为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾组成的磷酸盐缓冲液;解吸附剂2为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸盐缓冲液;解吸附剂3为现有解吸附剂(CN111812313A:一种铝佐剂吸附型新型冠状病毒灭活疫苗中抗原的解离方法)。
表17给出HPLC法1色谱条件检测结果,各样品的色谱图见图4A-图4C,表18给出HPLC法2色谱条件检测结果,各样品的色谱图见图4D-图4F,表19给出HPLC法2色谱条件检测结果,各样品的色谱图见图4G-图4J。通过比较三种HPLC法检测条件下不同样品的色谱结果,结果发现,无论是HPLC法1和HPLC法2与本发明中解吸附方法结合还是与现有解吸附方法结合均不适用于检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpGODN含量。
从表19给出的实验结果发现,在本发明HPLC检测条件下,与CpG ODN标准品检测结果相比较,使用解吸附剂1和解吸附剂2都可以有效检测样品中的CpG ODN含量,且出峰时间和峰面积与CpG ODN标准品无明显差异。当使用解吸附剂3时,峰面积显著低于CpG ODN标准品,且拖尾因子偏低。因此本发明中两种解吸附剂配方适用于检测CpG ODN复合佐剂新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)成品中CpG ODN含量,而现有解吸附剂配方不适用。
表17
表18
表19
实施例10:
本实施例通过检测针对不同疾病的疫苗,如新型冠状病毒、乙肝、流感,以及含有不同CpG ODN序列的新型冠状病毒疫苗,从而确认该方法适用于检测含有CpG ODN复合佐剂的生物制品中的CpG ODN含量。实验方法同实施例1。
在该实施例中,配制了含有CpG ODN序列A的新型冠状病毒灭活疫苗、Omicron株新型冠状病毒灭活疫苗、重组乙肝疫苗、细胞流感疫苗;含有CpG ODN序列B的新型冠状病毒疫苗以及含有CpG ODN序列C的新型冠状病毒疫苗。使用本发明中提供的方法对疫苗进行处理和检测,检测结果如表20所示。可知本发明所提供的方法能有效检测样品中CpG ODN的含量,结果准确可靠,说明该方法可以用于检测含有CpG ODN复合佐剂的生物制品中的CpGODN含量。
表20
综上所述,本发明提供了一种专属性强的用于检测CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗中有效成分CpG ODN的检定方法,该方法能够保证检测结果的真实可靠;本发明的检测方法能够排除样品中其他成分对CpG ODN含量检测的干扰,具有重复性好、准确度高的特点,为CpG ODN复合佐剂吸附型疫苗中关键质量属性的评价提供重要工具。
Claims (4)
1. 一种检测疫苗中CpG ODN含量的方法,其特征在于,所述疫苗为含有CpG ODN和铝佐剂的吸附型新型冠状病毒灭活疫苗,所述方法包括:
配制磷酸盐缓冲液作为解吸附剂;其中,磷酸盐缓冲液成分为磷酸氢二钾与磷酸二氢钾,或磷酸氢二钠与磷酸二氢钠;磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的质量比为90%:10%-60%:40%;磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的质量比为90%:10%-60%:40%;所述解吸附剂中磷酸根离子的总浓度为0.5M-2M;
将解吸附剂与待测疫苗样本混合,室温反应,并于室温条件下离心,取上清溶液,用针式过滤器过滤,即得解吸附后的样本;其中,解吸附剂与疫苗样本是按照1:1体积比混合;
采用高效液相色谱仪,对解吸附后的样本通过梯度洗脱的方式进行CpG ODN含量的检测;其中,所述高效液相色谱仪检测系统为UV/Vis检测器或PDA检测器,色谱柱为C18柱;色谱柱柱温为20-60℃,样品温度为4-25℃;流动相A为25-100mmol/L的TEAA水溶液,pH为5.0-9.0;流动相B为乙腈;并且,控制高效液相色谱检测条件为:
流速为0.1-1mL/min,进样量为10-20μL;
检测波长为254-260nm;
洗脱过程中初始流动相B的比例为5%-15%;
洗脱过程中最终流动相B的比例为25%-35%;
洗脱时间为10-20分钟。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,室温反应时间为30分钟至3小时。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,离心条件为:室温条件下离心转速为8000-15000rpm/min,离心时间为5-30分钟。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,针式过滤器为0.22μm或0.45μm的针式过滤器。
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