CN1781930A - 含CpG单链脱氧核苷酸作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种佐剂，该佐剂至少包括一个含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，该含CpG的单链脱氧核苷酸含一个或多个CpG二核苷酸，该佐剂与乙型肝炎病毒疫苗联合应用时，能够显著增强乙型肝炎病毒疫苗的免疫效果。

Description

含CpG单链脱氧核苷酸作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂

发明领域

本发明涉及一种含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，特别是涉及作为乙型肝炎病毒疫苗佐剂的含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，本发明还涉及含CpG二核苷酸单链脱氧核苷酸的序列。

发明背景

乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝脏 炎性损害，是危害全球人群健康的严重疾病。到2004年，全球范围内已经有4亿人感染了乙型肝炎病毒(Lin KW，Kirchner JT.Hepatitis B.Am Fam Physician，2004 Jan 1，69(1)：75-82.)，在感染者中，亚洲人占多数，我国人群乙型肝炎病毒携带率高达10％以上。接种以铝(Alum)为佐剂的乙型病毒肝炎表面抗原基因工程疫苗(HbsAg)是预防和控制乙型肝炎病毒传播的主要措施。据WTO报道，自1982年以来，全世界已经使用了10 亿剂量的乙型肝炎病毒疫苗，对预防和控制乙型肝炎病毒的传播起到了非常重要的作用。这种疫苗预防乙型肝炎的主要机制是诱导机体产生和分泌保护性抗体IgG1，这种抗体虽能中和掉细胞外的病毒，但不能彻底清除掉潜伏在感染细胞中的乙型肝炎病毒，往往导致患者体内乙型肝炎病毒的藏匿。而且人群中有10％左右的人对该疫苗反应力低下或无反应。如何提高现有乙型肝炎病毒疫苗的免疫活性或研制出能有效激发清除藏匿于细胞中的乙型肝炎病毒机制的疫苗尤为重要。目前国内外学者从多方面开展了新型HBV基因工程疫苗的研究，其中一个很重要的研究内容是寻找出乙肝疫苗的有效免疫佐剂。CpG ODN是近年来发现的一种新型的免疫佐剂。

CpG ODN是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为核心的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides，ODN)，其中CpG两个侧翼紧邻的碱基排列大多遵循以下规律：5’PurPurCGPyrPyr 3’，即5’端为两个嘌呤，3’端为两个嘧啶(G.Mutwiri，R.Pontarollo，S.BaBIUK.Bological activity of immunostimulatory CpG ODN motif in domestic animals.Veterinary Immunopathol ogy，2003，91：89-103)。研究表明，CpG ODN可激活多种免疫效应细胞，其中未甲基化CpG双核苷酸是CpG ODN序列具有免疫学活性的重要条件。细菌、病毒、无脊椎动物的DNA因具有有未甲基化CpG双核苷酸而有免疫激活作用，而脊椎动物的DNA其含有的CpG是甲基化的，所以不具有免疫激活作用。免疫系统通过对这些特定未甲基化的CpG序列的识别来诱发针对外源性DNA的免疫应答(YiAK，Klinman DM，Martin TL，et al.Rapid immuneactivation by CpG motifs in bacterial DNA.Systemic induction of IL-6transcriptionthrough an antioxidant-sensitive pathway.Immunol，1996，157(12)：5394-402)。

经过大量的实验研究结果表明，CpG ODN能协同乙肝疫苗促进鼠、人类、及人类以外的灵长类动物产生特异性抗体及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应(Weeranta RD，McCluskie MJ，XuY，et al.CpG ODN isa novel non-toxic adjuvant which induces stronger immune responsesthan many conventional adjuvants.Vaccine，2000，18：1755-62.)，是乙肝疫苗安全有效的佐剂。

1988年，Davis等将HBsAg和CpG ODN1826(作为佐剂)免疫BALB/c小鼠，乙型肝炎病毒表面抗原抗体(HBsAb)测定的结果显示，HBsAg加CpG ODN作为佐剂小鼠产生的HBsAb比HBsAg加铝佐剂小鼠产生的HBsAb高五倍，HBsAg加CpG ODN和铝佐剂小鼠产生的HBsAb比HBsAg加铝佐剂小鼠产生的HBsAb高35倍，而HBsAg加不含CpG ODN对照组小鼠，则不产生HBsAb或产生低水平的HBsAb。上述结果说明：CpG ODN作为HBsAg佐剂刺激小鼠产生HBsAb的作用强于铝佐剂，且CpG ODN与铝佐剂间有较强的协同作用。ELISA和⁵¹Cr杀伤试验结果表明：CpG ODN和HBsAg或CpG ODN与铝佐剂和HbsAg联合应用能刺激小鼠产生Th1型免疫应答，表现为产生IgG2aHBsAb，且伴有HBV特异性的CTL反应；而铝佐剂和HBsAg联合应用主要刺激小鼠产生Th2型免疫应答，表现为产生IgG1HBsAb且不伴有HBV特异性的CTL反应。体外细胞表面分子抗体染色的结果表明，CpG ODN增强HBsAg免疫效果的机制和CpG诱导抗原呈递细胞表达共刺激分子、协同刺激B淋巴细胞产生的抗体发生类别转换(Hartmann G，Weeratna RD，Ballas ZK，et al.Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responsesin vitro and in vivo.Immunol，2000，164：1617-24)密切相关。以上的研究结果表明，CpG ODN作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂具有广阔的前景。

发明内容

本发明提供一种激发机体抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括给被施用者HBsAg抗原疫苗(以下简称HBsAg)和佐剂以诱导HBV特异性的免疫反应，其中所述的佐剂至少包括一个含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，该含CpG的单链脱氧核苷酸中含一个或多个CpG二核苷酸，该佐剂与乙型肝炎病毒疫苗联合应用时，能够显著增强乙型肝炎病毒疫苗的免疫效果。

本专利中的HBsAg可以与CpGODN联合应用，或者HBsAg与CpGODN及其它的非核酸佐剂联合应用，此处所述的非核酸佐剂包括：铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳剂等。

本专利所涉及的CpGODN的结构可以用下式所表示

1.(G)_n(L)_nX₁X₂CGY₁Y₂(M)_n(G)_n

X₁＝A，T，G；X₂＝A，T；Y₁＝A，T；Y₂＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。

X₁可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶；X₂可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y₁可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y₂可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。

2.(G)_n(L)_nCG(XY)_nCG(M)_n(G)_n

X＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。

X可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。

3.(TCG)_n(L)_nCG(M)_n(G)_n

L，M＝A，T，C，G；n为0-6。

L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。

4.(TCG)_n(L)_nX₁X₂CG(M)_n

X₁＝A，T，G；X₂＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。

X₁可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶；X₂可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。

5.TTCGTCG

目前使用的预防乙型病毒肝炎的HbsAg，虽安全有效，但注射后仍有10％左右的人群对该疫苗反应低下或无反应。CpG ODN能够提高机体对HBsAg的反应性。乙型肝炎病毒仅感染人类和猿类，如黑猩猩和猩猩。Davis等人以猩猩为实验动物，研究了CpG ODN(2006)对HBsAg免疫原性的增强作用。研究结果表明：HBsAg加CpGODN刺激猩猩产生的HBsAb水平显著高于HBsAg加铝佐剂，且HBsAg加CpGODN刺激猩猩产生的HBsAb水平随着CpGODN的浓度的增加而升高。上述结果说明：CpG ODN可以克服猩猩对乙型肝炎病毒疫苗的低反应性，并且CpG对猩猩无毒副作用(Davis HL，Suparto I，Weeratna R，et al.CpG ODN overcomes hyporesponsiveness to hepatitis Bvaccine in orangutans.Vaccine，2000，18：1920-1924)。这是第一例在猿类身上做的关于CpG ODN的实验，这个实验结果对于CpG ODN作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂应用于人类有重大的参考价值。人群中10％左右的人对乙型肝炎病毒疫苗呈现低反应性，这种低反应性与接受免疫者的遗传背景、年龄、吸烟状况、疾病等多种因素有关，而且可能与接受免疫者的基因类型也有关。

此外，CpG ODN还能协同乙型肝炎病毒表面抗原刺激幼鼠产生Th1型体液免疫反应和细胞介导的免疫反应(Cynthia L.Brazolot Millan，Risini Weeratna，Arthur.Krieg，et al.CpG ODN caninduce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen inyoung mice.[J]Immunol.，1998，15553-15558)。这说明CpG ODN能够提高机体对乙型肝炎病毒疫苗的反应性。

本专利所涉及的乙型肝炎病毒疫苗包括但不限于乙型肝炎病毒血源性疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白类疫苗、乙型肝炎病毒转基因植物疫苗、乙型肝炎病毒病毒载体疫苗、乙型肝炎病毒细菌载体疫苗、乙型肝炎病毒DNA疫苗；乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)可以是上述疫苗中的主要的抗原成分。

本发明将CpG ODN与HBsAg联合应用，CpG ODN能够增强乙型肝炎病毒疫苗的免疫原性，刺激机体迅速产生免疫反应，诱导Th1免疫应答，延长免疫反应时限，减少免疫次数，提高未成熟或衰老个体的免疫活性。综上所述，CpG ODN可以作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂使用。

                               图例说明

图1不同CpG ODN增强HBsAg刺激抗体产生作用的比较

图2不同剂量CpG ODN增强HBsAg刺激抗体产生作用的比较

图3不同剂量CpGODN与铝佐剂联合增强HBsAg刺激抗体产生作用的比较

图4CpG ODN与铝佐剂联合应用对HBsAg免疫效果的增强作用

图5不同佐剂对HBsAg刺激机体产生抗体亚型的比较

图6CpG ODN对HBsAg诱生HBV特异性CTL的作用

图7CpG ODN增强乳鼠对HBsAg的反应性

图8CpG ODN增强老龄鼠对HBsAg的反应性

图9CpG ODN增强恒河猴对HBsAg的反应性

实施例1CpG单链脱氧核苷酸的设计

设计序列如下：

(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n

X1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

5’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：1)[121]

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(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n

X＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

5’-ggggACgATACgTCggggggg-3’(SEQ ID NO：33)[546]

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(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n

L，M＝A，T，C，G；n为0-6

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5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO：108)[319]

5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO：109)[647]

5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO：110)[417]

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5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO：112)[421]

5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO：113)[453]

5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO：114)[580]

(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n

X1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6

设计序列如下：

5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO：115)[470]

5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO：116)[502]

5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：117)[601]

5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO：118)[625]

5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO：119)[430]

5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO：120)[480]

5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：121)[108]

5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO：122)[102]

5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO：123)[406]

5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO：124)[560]

5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO：125)[629]

5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO：126)[440]

5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO：127)[207]

5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO：128)[615]

5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO：129)[610]

5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO：130)[206]

5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO：131)[119]

5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO：132)[570]

5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO：133)[631]

5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO：134)[115]

5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO：135)[370]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：136)[309]

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5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO：139)[203]

5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：140)[501]

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包含TTCGTCG的序列

5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO：179)[507]

5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’(SEQ ID NO：180)[210]

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5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO：185)[633]

实施例2CpG单链脱氧核苷酸的合成

采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。

DNA化学合成不同于酶促的DNA合成，酶促的DNA合成过程是从5’→3’方向延伸，而DNA化学合成是由3’端开始。具体的反应步骤如下：

一、脱保护基

用三氯乙酸脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应使用。

二、活化

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

三、连接

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

四、封闭

缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

五、氧化

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一个DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

固相合成寡核苷酸是在DNA合成仪上进行的，上述方法合成的寡核苷酸在脱去保护基后，目的寡核苷酸纯度是极低的，含有大量的杂质，主要杂质有脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等，以至于粗产品中寡核苷酸含量仅为15％左右。尽管合成时每一步的效率都在97％～98％，但累积的效率并不高。因此，在粗产品中目的寡核苷酸含量很低，甚至达不到10％。这些杂质，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，而且影响下一步的反应，因此必须对寡核苷酸进行纯化。建议采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化，该方法纯化的产品纯度高，可用于绝大部分的分子生物学实验，还可避免许多意想不到的麻烦。若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用脱盐纯化即可。

寡核苷酸片段是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的寡核苷酸溶液定义为1OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成不尽相同，但1260OD的寡核苷酸重量约为33μg。

实施例3用ELISA法检测乙型肝炎病毒抗体

一、试剂

1.HBsAg(不含铝佐剂，北京生物制品研究所)疫苗的配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液(1mg/ml)。

2.HRP-马抗鼠二抗：北京鼎国生物技术有限公司

3.PBS：1000ml

NaCl…………………………………  8g(北京化工厂)

KCl…………………………………… 0.2g(北京化工厂)

Na₂HPO₄·12H₂O………………………2.9g(北京化工厂)

KH₂PO4…………………………………0.2g(北京化工厂)

用800ml超纯水充分溶解后，HCl或NaOH调节PH7.2-7.4，定容至1000ml

4.包被液：100ml

PBS……………………………………80ml

50％戊二醛………………………… 1.6ml(北京化工厂)

充分溶解后，用PBS定容至100ml

5.洗涤液：500ml

PBS……………………………………400ml

Tween20………………………………0.5ml(北京化工厂)

NaCl………………………………… 14.625g(北京化工厂)

充分溶解后，用PBS定容至500ml

6.封闭液：100ml

PBS……………………………… 80ml

脱脂奶……………………………5g(北京鼎国生物技术有限公司)

BSA……………………………… 1g(北京鼎国生物技术有限公司)

充分溶解后，用PBS定容至100ml，加入叠氮钠0.05克

7.样品稀释液：1000ml

Tris………………………………2.42g(北京化工厂)

NaCl………………………………8.77g(北京化工厂)

用800ml超纯水溶解，用HCl调节PH7.1；然后加入

BSA………………………………1g

Tween20…………………………0.5ml

超纯水定容至1000ml

8.底物液：

甲液：

     柠檬酸………………………19.2g(北京化工厂)

     用800ml超纯水充分溶解后，用超纯水定容至1000ml

乙液：

     Na₂HPO₄·12H₂O……………71.7g(北京化工厂)

     用800ml超纯水充分溶解后，然后用超纯水定容至1000ml

底物液：

     甲液……………………47.276ml

     乙液……………………50ml

分别量取上述体积的甲液、乙液混合，用0.22μm滤膜滤过除菌

9.终止液：100ml

     浓硫酸……………………………20ml(北京化工厂)

     缓慢加入到80ml超纯水中，边加入边搅拌

二、方法

1.包被：吸取10ml包被液，加入HBsAg(1mg/ml)100μl，即用包被液稀释HBsAg至终浓度10μg/ml，往酶标板中每孔加入稀释后的HBsAg 100μl，将酶标板放置于4℃，过夜

2.洗涤：次日取出酶标板，弃净其中的液体；每孔加入300μl洗涤液，室温放置3min，甩掉其中的液体，在吸水纸上拍干。同样方法洗涤3次。

3.封闭：向酶标板中每孔加入300μl封闭液，室温放置2h。

4.加入待测样品：同方法2的洗涤方式，加入用样品稀释液按不同稀释度稀释的待测样品，每孔加入100μl稀释后的待测样品，每个稀释度作两复孔，室温放置2h。

5.加入HRP-马抗鼠二抗：同方法2的洗涤方式，用样品稀释液稀释HRP-马抗鼠二抗(1∶1000稀释)，每孔中加入100μl稀释后的HRP-马抗鼠二抗，室温避光条件下放置2h。

6.加入底物液：同方法2的洗涤方式，每孔中加入100μl新鲜配制的底物液，室温避光20min。

7.加入终止液：酶标板孵育20min后，直接向酶标板中加入50μl终止液。

8.酶标仪检测(A492nm)：加入终止液5min内，酶标仪检测(A492nm)。

9.阳性值的判断：样品OD值/阴性对照OD值≥2即为阳性值。

实施例4不同CpG ODN增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较

一、动物和试剂

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg：不含铝佐剂，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解100μg CpG ODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。小鼠肌肉注射时，取50μl CpG应用液和1μl HBsAg应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

6.对照CpGODN序列：

5’-TCgTCgTTTTgTCgTTTTgTcgTT-3’[2006]

二、方法

1.小鼠分组：10只/组

1)HBsAg组

2)HBsAg+2006(100μg)组

3)HBsAg+647(100μg)组

4)HBsAg+684(100μg)组

5)HBsAg+685(100μg)组

6)HBsAg+640(100μg)组

7)HBsAg+656(100μg)组

2.不同CpG ODN增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较：HBsAg应用液与不同序列CpG ODN应用液分别给小鼠免疫，免疫部位是小鼠胫骨前肌，分别在免疫前3天(阴性血清)及免疫后4周小鼠尾静脉采血，每10μl血中加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，血样经4,000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。用ELISA方法检测HbsAb滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明：加入不同序列CpGODN作为佐剂可以不同程度地提高小鼠产生HbsAb的滴度。和单独应用HBsAg疫苗比较，HBsAg+CpG能够显著刺激小鼠产生较高水平的HBsAb，经方差分析，差异具有显著性(P＜0.05)，各组间抗体滴度的比较见图1。

实施例5不同剂量CpGODN增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较

一、动物和试剂

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周(北京维通利华实验动物有限公司)

2.HBsAg：不含铝佐剂，购自北京生物制品研究所

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解不同剂量CpGODN制备成相应浓度的CpGODN溶液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。

小鼠肌肉注射时，取50μl CpGODN溶液和1μl HBsAg应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

二、方法

1.小鼠分组：10只/组

          1)HBsAg组

          2)HBsAg+CpG(684)(1μg)组

          3)HBsAg+CpG(647)(1μg)组

          4)HBsAg+CpG(685)(1μg)组

          5)HBsAg+CpG(640)(1μg)组

          6)HBsAg+CpG(684)(10μg)组

          7)HBsAg+CpG(647)(10μg)组

          8)HBsAg+CpG(685)(10μg)组

          9)HBsAg+CpG(640)(10μg)组

          10)HBsAg+CpG(684)(50μg)组

          11)HBsAg+CpG(647)(50μg)组

          12)HBsAg+CpG(685)(50μg)组

          13)HBsAg+CpG(640)(50μg)组

          14)HBsAg+CpG(684)(100μg)组

          15)HBsAg+CpG(647)(100μg)组

          16)HBsAg+CpG(685)(100μg)组

          17)HBsAg+CpG(640)(100μg)组

          18)HBsAg+CpG(684)(200μg)组

          19)HBsAg+CpG(647)(200μg)组

          20)HBsAg+CpG(685)(200μg)组

          21)HBsAg+CpG(640)(200μg)组

          22)HBsAg+CpG(684)(400μg)组

          23)HBsAg+CpG(647)(400μg)组

          24)HBsAg+CpG(685)(400μg)组

          25)HBsAg+CpG(640)(400μg)组

          26)HBsAg+CpG(684)(800μg)组

          27)HBsAg+CpG(647)(800μg)组

          28)HBsAg+CpG(685)(800μg)组

          29)HBsAg+CpG(640)(800μg)组

2.不同剂量CpG ODN增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较：HBsAg与不同剂量CpGODN分别给小鼠免疫，免疫部位是小鼠胫骨前肌，分别在免疫前3天(阴性血清)及免疫后4周小鼠尾静脉采血，每10μl血中加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，血样经4，000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。用ELISA方法检测HBsAb滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明：不同剂量CpGODN可以不同程度提高小鼠产生HbsAb的滴度。当佐剂CpGODN的应用剂量≥10μg时，与单独HBsAg组比较，均能显著提高小鼠产生HbsAb的滴度(P＜0.05)，各组间的抗体滴度比较见图2。

实施例6不同剂量CpGODN与铝佐剂联合应用增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较

一、动物和试剂

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8w(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg：含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)，购自北京生物制品研究所。

3.CpG ODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpG ODN配制：用50μl PBS溶解不同剂量CpGODN制备成相应浓度的CpGODN溶液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。

小鼠肌肉注射时，取50μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

二、方法

1.小鼠分组：10只/组

1)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)组

2)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(1μg)组

3)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(1μg)组

4)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(1μg)组

5)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(1μg)组

6)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(10μg)组

7)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(10μg)组

8)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(10μg)组

9)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(10μg)组

10)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(50μg)组

11)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(50μg)组

12)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(50μg)组

13)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(50μg)组

14)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(100μg)组

15)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(100μg)组

16)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(100μg)组

17)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(100μg)组

18)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(200μg)组

19)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(200μg)组

20)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(200μg)组

21)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(200μg)组

22)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(400μg)组

23)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(400μg)组

24)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(400μg)组

25)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(400μg)组

26)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(800μg)组

27)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(800μg)组

28)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(800μg)组

29)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(800μg)组

2.不同剂量CpGODN与铝佐剂联合应用增强HbsAg刺激抗体产生作用的比较：HBsAg与不同剂量CpGODN分别给小鼠免疫，免疫部位是小鼠胫骨前肌，分别在免疫前3天(阴性血清)及免疫后4周小鼠尾静脉采血，每10μl血中加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，血样经4,000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。用ELISA方法检测HbsAb滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明：不同剂量CpGODN可以不同程度提高小鼠产生HbsAb的滴度，当佐剂CpGODN的应用剂量≥10μg时，CpGODN和HBsAg联合应用与HBsAg和铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)联合应用相比较，均能显著提高小鼠产生HBsAb的滴度(P＜0.05)，各组间抗体滴度的比较见图3。

实施例7CpG ODN与铝佐剂联合应用对HbsAg免疫效果的增强作用

一、动物和试剂

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8w(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg(含铝佐剂)、HBsAg(不含铝佐剂)，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解100μg CpGODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。

小鼠肌肉注射时，取50μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(含铝佐剂或不含铝佐剂)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

二、方法

1.小鼠分组：10只/组

1)HBsAg组

2)HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)组

3)HBsAg+CpG(684)(100μg)组

4)HBsAg+CpG(647)(100μg)组

5)HBsAg+CpG(685)(100μg)组

6)HBsAg+CpG(640)(100μg)组

7)HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(100μg)组

8)HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(100μg)组

9)HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(100μg)组

10)HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(100μg)组

2.CpG ODN与铝佐剂联合应用对HbsAg免疫效果的增强作用：实验小鼠分为四组，即HBsAg组、HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)组、HBsAg+CpGODN组、HBsAg含铝佐剂(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpGODN组，根据不同分组，分别免疫小鼠，免疫部位是小鼠胫骨前肌，在免疫前3天(阴性血清)小鼠尾静脉采血，每10μl血样中加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，血样经4，000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。在0w免疫后，4w加强免疫；分别在免疫后1w(周)，2w，4w，6w，8w，10w，12w小鼠尾静脉采血，分离血浆，用ELISA方法检测HbsAb滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明：CpGODN作为佐剂时，单独或者与铝佐剂联合应用均可以提高HbsAb的滴度，与HBsAg组、HBsAg(25mg Al³⁺/mgHBsAg)组比较，经过方差分析，均具有显著性差异(P＜0.05)，CpGODN与铝佐剂联合应用产生的HBsAb滴度最高，各组间抗体滴度的比较见图-4。

实施例8不同佐剂对HbsAg刺激机体产生抗体亚型的比较

一、试剂和动物

一)试剂和动物

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8w(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg(含铝佐剂)、HBsAg(不含铝佐剂)，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解100μg CpGODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。小鼠肌肉注射时，取50μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(含铝佐剂或不含铝佐剂)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

HBsAg(不含铝佐剂，北京生物制品研究所)配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液

6.HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1：Serotec公司产品

7.试剂配制：

PBS：1000ml

NaCl…………………………………  8g(北京化工厂)

KCl…………………………………… 0.2g(北京化工厂)

Na₂HPO₄·12H₂O………………………2.9g(北京化工厂)

KH₂PO4…………………………………0.2g(北京化工厂)

用800ml超纯水充分溶解后，HCl或NaOH调节PH7.2-7.4，定容至1000ml包被液：100ml

PBS……………………………………80ml

50％戊二醛………………………… 1.6ml(北京化工厂)

充分溶解后，用PBS定容至100ml

洗涤液：500ml

PBS……………………………………400ml

Tween20………………………………0.5ml(北京化工厂)

NaCl………………………………… 14.625g(北京化工厂)

充分溶解后，用PBS定容至500ml

封闭液：100ml

PBS……………………………… 80ml

脱脂奶……………………………5g(北京鼎国生物技术有限公司)

BSA……………………………… 1g(北京鼎国生物技术有限公司)

充分溶解后，用PBS定容至100ml，加入叠氮钠0.05克

样品稀释液：1000ml

Tris………………………………2.42g(北京化工厂)

NaCl………………………………8.77g(北京化工厂)

用800ml超纯水溶解，用HCl调节PH7.1；然后加入

BSA………………………………1g

Tween20…………………………0.5ml

超纯水定容至1000ml

底物液：

甲液：

柠檬酸………………………19.2g(北京化工厂)

用800ml超纯水充分溶解后，用超纯水定容至1000ml

乙液：

Na₂HPO₄·12H₂O……………71.7g(北京化工厂)

用800ml超纯水充分溶解后，然后用超纯水定容至1000ml

底物液：

甲液……………………47.276ml

乙液……………………50ml

分别量取上述体积的甲液、乙液混合，用0.22μm滤膜滤过除菌

终止液：100ml

浓硫酸……………………………20ml(北京化工厂)

缓慢加入到80ml超纯水中，边加入边搅拌

二)小鼠的免疫

1小鼠分组

1)HBsAg组

2)HBsAg+CpG(684)(100μg)组

3)HBsAg+CpG(647)(100μg)组

4)HBsAg+CpG(685)(100μg)组

5)HBsAg+CpG(640)(100μg)组

6)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(684)(100μg)组

7)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(647)(100μg)组

8)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(685)(100μg)组

9)HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)+CpG(640)(100μg)组

2小鼠免疫：按不同的分组，于0周和4周对小鼠进行免疫，免疫部位是小鼠胫骨前肌，在免疫前3d(阴性血清)小鼠尾静脉采血，每10μl血样中加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，血样经4,000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。

二、方法

1.包被：吸取10ml包被液，加入HBsAg(1mg/ml)100μl，往酶标板中每孔加入稀释后的HBsAg，4℃过夜

2.洗涤：次日取出酶标板，甩掉其中的液体，在吸水纸上拍干；每孔加入300μl洗涤液，室温放置3min，甩掉其中的液体，在吸水纸上拍干。同样洗涤3次。

3.封闭：往酶标板中每孔加入300μl封闭液，室温放置2h。

4.加入待测样品：同上洗涤后，加入用样品稀释液按不同稀释度稀释的待测样品，往酶标板中每孔加入100μl稀释后的待测样品，每个稀释度两复孔室温放置2h。

5.加入HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1：同上洗涤，用样品稀释液稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1(1∶1000稀释)，往酶标板每孔中加入100μl稀释后的HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1，室温避光条件下放置2h

6.加入底物液：同上洗涤，往酶标板每孔中加入100μl新鲜配制的底物液，室温避光20min.

7.加入终止液：酶标板孵育20min后，直接向酶标板中加入50μl终止液

8.酶标仪检测A492nm：加入终止液5min内，酶标仪检测A492nm.

9.阳性值的判断：样品OD值/阴性对照OD值≥2即为阳性判定值测定结果表明CpG作为佐剂产生IgG2a的比例要高，与铝佐剂组的IgG2a抗体比较，经过方差分析，具有显著性差异(P＜0.05)。结果见图5

CTL特异性杀伤检测

效应细胞的制备：小鼠免疫后12周，无菌分离小鼠脾，将小鼠脾置于含有10％小牛血清的IMDM(Gibcol公司)平皿内，用毛玻璃片轻轻研磨小鼠脾，用200目滤网过滤小鼠脾研磨液，过滤液中加入红细胞裂解液(139.6mmol/L NH₄Cl，16.96mmol/L Tris，用1mol/HCl调pH至7.2)3-5ml，静置10分钟，然后用生理盐水洗涤脾细胞两次，计数脾细胞个数。用含10％小牛血清的IMDM调节脾细胞数为3×10⁷/ml。转染乙型肝炎病毒表面抗原基因的P815细胞加入丝裂霉素(Sigma，无血清IMDM配制成浓度为500μg/ml)至终浓度为50μg/ml，37℃孵育2h，生理盐水洗涤3次。取1×10⁶个P815细胞加入到脾细胞内，37℃，5％CO₂孵育5天。5天后收集脾淋巴细胞作为效应细胞。

⁵¹Cr标记靶细胞：取转染乙型肝炎病毒表面抗原基因的P815细胞1×10⁶个加入100μl⁵¹Cr，37℃孵育1h，每隔5～10min轻轻混匀P815细胞一次，用含10％小牛血清的IMDM洗涤P815细胞3次，作为靶细胞。

CTL杀伤：用含10％小牛血清的IMDM稀释效应细胞至不同浓度，加入⁵¹Cr标记的P815细胞，

使效应细胞：靶细胞的比例为100∶1～12.5∶1，37℃孵育4h，收集上清检测c.p.m值。

结果表明，CpGODN作为佐剂可以显著增强HBsAg刺激小鼠产生HBV特异性CTL的作用，CpGODN+HBsAg与铝佐剂+HBsAg相比较，CpGODN+HBsAg具有更强的诱生HBV特异性CTL的作用(P＜0.05)，结果见图6。

实施例8CpGODN增强乳鼠对乙型肝炎病毒疫苗的反应性

一、试剂和动物

1.动物：BALB/c乳鼠，雌性，6-8天(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg：含铝佐剂或不含铝佐剂，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用10μl PBS溶解100μg CpGODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。

乳鼠肌肉注射时，取10μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(含铝佐剂或不含铝佐剂)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给乳鼠肌肉注射。

二、方法

1.乳鼠分组：10只/组

1)HBsAg组

2)HBsAg+铝佐剂组

3)HBsAg+CpG(684)(100μg)组

4)HBsAg+CpG(647)(100μg)组

5)HBsAg+CpG(685)(100μg)组

6)HBsAg+CpG(640)(100μg)组

7)HBsAg+CpG(684)(100μg)+铝佐剂组

8)HBsAg+CpG(647)(100μg)+铝佐剂组

9)HBsAg+CpG(685)(100μg)+铝佐剂组

10)HBsAg+CpG(640)(100μg)+铝佐剂组

2.CpGODN增强乳鼠对乙型肝炎病毒疫苗反应性的测定：将乳鼠分为四组，即HBsAg组、HBsAg+铝佐剂组、HBsAg+CpGODN组、HBsAg+CpGODN+铝佐剂组，于0w按不同的分组分别免疫别乳鼠，免疫部位是胫骨前肌，4w加强免疫，在免疫后1w(周)，4w，6w，8w，10w取血，每10μl加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，4,000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。分离血浆，用ELISA方法检测HBsAb的滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明，CpG ODN单独作为佐剂或者与铝佐剂联合应用均可以提高乳鼠产生HBsAb滴度，且与HBsAg组、HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)组相比较，差异具有显著性(P＜0.05)，CpGODN与铝佐剂联合应用作为佐剂时，乳鼠产生的HBsAb滴度最高，各组间抗体滴度的比较见图7。本实施例的结果说明，CpG ODN可使弱反应的个体对HBsAg产生较强的体液免疫应答。

实施例9CpGODN增强老龄鼠对乙型肝炎病毒疫苗的反应性

一、试剂和实验动物

1.动物：BALB/c小鼠，雌性，20～24月(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg：含铝佐剂或不含铝佐剂，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解100μg CpGODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。

小鼠肌肉注射时，取50μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(含铝佐剂或不含铝佐剂)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后给小鼠肌肉注射。

二、方法

1.小鼠分组：10只/组

          1)HBsAg组

          2)HBsAg+铝佐剂组

          3)HBsAg+CpG(684)(100μg)组

          4)HBsAg+CpG(647)(100μg)组

          5)HBsAg+CpG(685)(100μg)组

          6)HBsAg+CpG(640)(100μg)组

          7)HBsAg+CpG(684)(100μg)+铝佐剂组

          8)HBsAg+CpG(647)(100μg)+铝佐剂组

          9)HBsAg+CpG(685)(100μg)+铝佐剂组

          10)HBsAg+CpG(640)(100μg)+铝佐剂组

2.抗体测定：将乳鼠分为四组，即HBsAg组、HBsAg+铝佐剂组、HBsAg+CpGODN组、HBsAg+CpGODN+铝佐剂组，于0w按不同的分组分别免疫老龄鼠，免疫部位是胫骨前肌，4周加强免疫，在免疫前3天(阴性血清)取血，每10μl加入2μl肝素钠(称取0.2克溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2％，15磅20分钟灭菌)抗凝，4,000rpm 4℃离心20分钟，吸取上层血浆，-20℃保存。分别在免疫后2w，4w，6w，8w，10w，12w取血，分离血浆，用ELISA方法检测HbsAb的滴度(见实施例3所示方法)。测定结果表明，CpGODN单独作为佐剂或者与铝佐剂联合应用均可以提高老龄鼠产生HbsAb滴度，且与HBsAg组、HBsAg(25mg Al³⁺/mg HBsAg)组相比较，差异具有显著性(P＜0.05)，CpGODN与铝佐剂联合应用作为佐剂时，老龄鼠产生的HBsAb滴度最高，各组间抗体滴度的比较见图8。本实施例的结果说明，CpG ODN可使弱反应的个体对HBsAg产生较强的体液免疫应答。

实施例10CpG增强恒河猴对乙型肝炎病毒疫苗的反应性

一、试剂和动物

1.动物：恒河猴，2～4Kg，雌性(北京维通利华实验动物有限公司)。

2.HBsAg：含铝佐剂或不含铝佐剂，购自北京生物制品研究所。

3.CpGODN：上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.CpGODN配制：用50μl PBS溶解100μg CpGODN制备成应用液。

5.HBsAg配制：用1ml PBS溶解1mg HBsAg蛋白冻干粉制备成应用液。给恒河猴肌肉注射时，取50μl CpGODN应用液和1μl HBsAg(含铝佐剂或不含铝佐剂)应用液混匀，冰上放置10分钟，然后肌肉注射。

二、方法

1.恒河猴分组：

1)HBsAg(10μg)+铝佐剂组

2)HBsAg(10μg)+CpG(684)(1000μg)组

3)HBsAg(10μg)+CpG(647)(1000μg)组

4)HBsAg(10μg)+CpG(685)(1000μg)组

5)HBsAg(10μg)+CpG(640)(1000μg)组

6)HBsAg(10μg)+CpG(684)(1000μg)+铝佐剂组

7)HBsAg(10μg)+CpG(647)(1000μg)+铝佐剂组

8)HBsAg(10μg)+CpG(685)(1000μg)+铝佐剂组

9)HBsAg(10μg)+CpG(640)(1000μg)+铝佐剂组

2.抗体的测定：恒河猴免疫前采血，分离阴性血浆。于0w按不同的分组分别免疫恒河猴，免疫部位是三角肌，第4周加强免疫。分别于2w(周)、4w、6w、8w、10w、12w采血，分离血浆。ELISA检测HbsAb的滴度。测定结果表明，CpGODN单独作为佐剂或者与铝佐剂联合应用均可以提高恒河猴产生HbsAb滴度，且与HBsAg组、HBsAg(25mg Al³⁺/mgHBsAg)组相比较，差异具有显著性(P＜0.05)，CpGODN与铝佐剂联合应用作为佐剂时，恒河猴产生的HbsAb滴度最高，各组间抗体滴度的比较见图9。

                                             seq

序列表

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<110>长春华普生物技术有限公司

<120>含CpG单链脱氧核苷酸作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂

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tcgactttcg tcgttctgtt                        20

<210>164

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial

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<212>DNA

<213>Artificial

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<213>Artificial

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<212>DNA

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Claims (10)

1.一种含CpG二核苷酸单链脱氧核苷酸，它含一个或多个CpG二核苷酸。

2.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，它们具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：179所示的序列。

3.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，其单链脱氧核苷酸中碱基上各个基团的修饰，基于权利要求1所述的单链脱氧核苷酸碱基的各种修饰方式

4.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，其修饰方式包括非硫代修饰，硫代修饰，部分硫代修饰，稀有碱基修饰(dI，dU等)，甲基化修饰，巯基、Aminolinker C6、Thiol-C6 S-S等用于与其他物质偶联所应用的修饰方式。

5.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，与乙型肝炎病毒疫苗混合或经化学偶联后应用；将其克隆到乙型肝炎病毒DNA疫苗中应用，可提高乙型肝炎病毒疫苗的免疫效果。乙型肝炎病毒疫苗包括但不限于乙型肝炎病毒血源性疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白类疫苗、乙型肝炎病毒病毒载体疫苗、乙型肝炎病毒细菌载体疫苗、乙型肝炎病毒转基因植物疫苗和乙型肝炎病毒DNA疫苗。

6.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，与其他佐剂(铝佐剂、弗氏佐剂、MPL等)联合应用作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂。

7.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，作为乙型肝炎病毒疫苗的佐剂用于防治乙型肝炎病毒感染及其相关的疾病。乙型肝炎病毒疫苗包括但不限于乙型肝炎病毒血源性疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白类疫苗、乙型肝炎病毒病毒载体疫苗、乙型肝炎病毒细菌载体疫苗、乙型肝炎病毒转基因植物疫苗和乙型肝炎病毒DNA疫苗。

8.应用方式包括肌肉、皮下、粘膜、胃肠、静脉、腹腔等应用方式，其中单链脱氧核苷酸与乙型肝炎病毒疫苗可以联合应用或者分别单独应用。

9.按照权利要求1～8所述，应用对象为所有人群。

10.按照权利要求1～8所述，应用对象为所有哺乳类动物。

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