CN116983401A - 基于sars1病毒的新冠加强免疫疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于SARS1病毒的新冠加强免疫疫苗。它是SARS1病毒的疫苗为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的加强免疫疫苗。动物实验结果表明，SARS1病毒的额外加强针优于多种新冠病毒毒株(包括毒株、德尔塔和奥密克戎)，在中和效价和中和谱方面效果更好。因此可以将SARS1病毒的疫苗作为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2SARS‑CoV‑2的加强免疫疫苗来使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及基于SARS1病毒的新冠加强免疫疫苗。
背景技术
目前，预防严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，简称SARS-CoV-2或新冠病毒)的疫苗均基于2019年12月的毒株，例如克尔来福(CoronaVac)、莫德纳疫苗(mRNA-1273)和辉瑞-拜恩泰科疫苗复必泰(BNT162b2)。这些疫苗可高效预防由毒株引起的新型冠状病毒病2019(COVID-19)。在标准疫苗接种后，多次额外加强免疫可以增强针对COVID-19的保护性免疫。然而，三剂疫苗接种后，免疫原性已经达到最大值，进一步重复接种疫苗已经不能再进一步提高保护效率2 , 3。疫苗提供的保护一方面会随时间下降，几个月后保护力将显著减弱；另一方面，重复接种基于毒株的疫苗，也难以针对变异株的有效保护。由于需要关注的变异株(VOC)的多阶进化跳跃，例如奥密克戎BA.1(B.1.1.529.1)和其他奥密克戎后代谱系(BA.2、BA.4、BA.5和BA.2.75)，现有的基于毒株的疫苗很难提供有效保护，迫切需要开发更好的加强免疫疫苗以预防感染，即基于标准疫苗接种后继续接种其他疫苗。为了实现这一目标，有若干不同开发疫苗的策略，包括泛冠状病毒候选疫苗、多价疫苗、诱导粘膜免疫反应、诱导更强的T细胞反应和异源增强策。
经典的策略是根据最近出现的变异株开发对应的加强免疫疫苗。例如流感疫苗的开发，就是每年根据流行流感病毒选择疫苗株。事实上针对新冠病毒，已经开发出几种针对贝塔和奥密克戎变异株的疫苗。这些疫苗大多数都显示出针对多种变异株的中和效价显著增加。然而，最初接触新冠病毒的印记会导致产生更多针对毒株的中和抗体，而不是更多针对新的变异株的中和抗体。换而言之，简单使用基于新变异株的加强免疫疫苗，增加的中和抗体滴度仍然主要针对新冠病毒毒株，较少针对新变异株中和抗体。考虑到全世界有数十亿人接触过新冠病毒抗原，我们需要更新加强疫苗，使其中和范围更广、持续时间更长，以对抗当前和未来的变异株。
与流感病毒或季节性冠状病毒相比，新冠病毒的进化显示出一种新模式，这需要一种疫苗设计策略，以针对新出现的新冠病毒变异株，设计具有广谱保护作用的加强免疫疫苗。流感病毒样进化较为传统，通过抗原漂移产生一个或两个连续进化的主要谱系，并且新的突变通常是从以前的主要谱系进化而来的。除了流感病毒，季节性冠状病毒的进化也主要遵循这种模式，例如HCoV-229E和HCoV-OC43。然而，具有间歇性加速突变的新冠病毒进化模式与此不同。新冠病毒突变进化以多突变跳跃进行，这可能导致显著的免疫逃逸，即新冠病毒毒株建立免疫不能预防新的毒株。这种现象在新冠病毒身上已经出现过多次。例如，德尔塔(B.1.617.2和AY.*)是一个新出现的谱系，但不是以前占主导地位的阿尔法(B.1.1.7)的子谱系。同样，奥密克戎(B.1.1.529和BA.*)也不是德尔塔(B.1.617.2和AY.*)的子谱系。因此，合理选择优化的加强疫苗株对于提供针对新出现的VOC的充分保护非常重要。
为了设计优化的加强疫苗，一种可能的策略是利用“抗原距离假说”选择加强株。“抗原距离假说”可以解释重复接种不同流感疫苗株带来的免疫印记现象。先前接触过第一种病毒株(或基于第一种病毒株的疫苗)可能会削弱对第二种疫苗株的免疫反应，这种现象被称为免疫印迹。免疫印记现象可能由下面的机理导致：第一种疫苗诱导产生预存交叉反应，部分清除了第二种疫苗中与第一种毒株相似但不同的抗原。为了克服免疫印迹，一种策略是选择与之前的疫苗种子株不太接近的疫苗种子株。不同疫苗株的接近程度可以通过抗原距离来定义。以前的论文和预印本绘制了主要流行新冠病毒变异株的抗原性图谱，促进了该策略在新冠病毒加强疫苗开发中的应用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基于SARS1病毒的新冠加强免疫疫苗，利用SARS1病毒的额外加强针优于多种新冠病毒毒株(包括毒株、德尔塔和奥密克戎)，在中和效价和中和谱方面效果更好。
本发明的基于SARS1病毒的新冠加强免疫疫苗，其是SARS1病毒的疫苗，例如以SARS1病毒或以其SARS1病毒为基础的亚单位疫苗、病毒样颗粒、核酸疫苗作为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2SARS-CoV-2的加强免疫疫苗。
本发明的第二个目的是提供SARS1病毒的疫苗在制备严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2SARS-CoV-2的加强免疫疫苗中的应用。
优选，所述的SARS1病毒的疫苗是以SARS1病毒或以SARS1病毒为基础的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗、灭活疫苗或减毒疫苗。
优选，所述的加强免疫疫苗包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸，或编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选，所述的加强免疫疫苗是包含氨基酸序列如SEQ ID No.2所述的重组蛋白疫苗或粘膜疫苗。
优选，所述的粘膜疫苗包含细菌毒素方面的粘膜辅助结构域与SARS1病毒刺突受体结合域相连。
优选，所述的相连通过连接序列连接，所述的连接序列为：GS连接子：GSGS或可切割连接子：LLSVGG。
所述的细菌毒素方面的粘膜辅助结构域可以是白喉棒状杆菌毒素CRM197，艰难梭菌毒素A/B受体结合结构域、金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白、霍乱弧菌毒素B亚基、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基。
进一步优选是如SEQ ID No.3氨基酸序列与SEQ ID No.4所示的粘膜辅助结构域相连
进一步优选是如SEQ ID No.5、No.6和No.7所示的氨基酸序列。
优选，所述的加强疫苗是SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的预测表位序列的多肽疫苗。
优选，所述的加强疫苗是包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的mRNA疫苗。
优选，所述的加强疫苗是包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA疫苗。
优选，所述的病毒样颗粒疫苗是包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
优选，所述的加强疫苗是包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的载体疫苗。
在本发明中，我们根据我们之前的研究，使用所有新冠病毒谱系的抗原图谱以及潜在的交叉反应性冠状病毒来选择优化的加强疫苗种子株。我们首先通过计算根据抗原距离选择候选加强疫苗。然后，我们测试了选定的加强疫苗并评估了它们对新冠病毒变异株的保护作用。利用重组水泡性口炎病毒(recombinant vesicular stomatitis virus，简称rVSV)递送刺突蛋白、以聚肌胞苷为佐剂构建了候选加强疫苗，包括严重急性呼吸系统综合症冠状病毒1(severe acute respiratory syndrome coronavirus 1，简称SARS1病毒)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome–related coronavirus，简称MERS病毒)、新冠病毒毒株、德尔塔和奥密克戎。我们在第1周和第3周对C57BL/10J小鼠进行第一次和第二次复必泰(BNT162b2)疫苗接种后，在第9周提供这些加强疫苗候选物作为额外的加强针，并评估了体内引发的免疫原性。与我们的计算预测一致，动物实验结果表明，SARS1病毒的额外加强针优于多种新冠病毒毒株(包括毒株、德尔塔和奥密克戎)，在中和效价和中和谱方面效果更好。因此可以将SARS1病毒的疫苗作为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2SARS-CoV-2的加强免疫疫苗来使用。
附图说明
图1是利用抗原距离理论选择更适合的新冠病毒疫苗种子株。a，冠状病毒在刺突氨基酸序列方面的进化关系。小图显示了新冠病毒不同子孙毒株的关系，包括毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株。b，两剂复必泰(BNT162b2)疫苗的抗原图谱和保护范围。c-e，使用新冠病毒毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株接种第三剂疫苗后的保护范围。f-g，使用SARS1病毒和MERS病毒接种第三剂疫苗后的保护范围。1个AU，即1个相对单位，表示1个单位的抗原距离，代表2倍的中和效价变化。
图2是抗原距离(接种疫苗者的中和滴度平均值除以恢复期患者的相应滴度平均值，log 2)与对新冠病毒感染的保护之间的关系。临床1期或2期研究报告的平均中和水平(表1)以及3期试验或真实世界研究(表2)对不同疫苗的保护功效或有效性。红线表示逻辑模型，红色阴影表示模型的95％置信区间。
图3是多种疫苗接种策略后的抗体反应。a，实验设计。b，按照标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划，测定受体结合域(RBD)和刺突蛋白(Spike)特异性免疫球蛋白G(IgG)反应变化。这里使用酶联免疫吸附(ELISA)测定血清稀释液在450nm处的光密度(OD)值，并计算曲线下面积(AUC)值作为IgG水平。c，在额外施用基于不同新冠病毒变异株和SARS1病毒和MERS病毒载体加强疫苗后，与标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种相比。通过ELISA以曲线下面积(AUC)表示的RBD和刺突特异性IgG。d，按照标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划，针对新冠病毒毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株的假病毒中和效价动态。e，与标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划相比，额外施用基于不同新冠病毒变异株、SARS1病毒和MERS病毒的病毒载体加强疫苗后，针对新冠病毒、德尔塔和奥密克戎毒株的假病毒中和效价两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种。使用Student’s t检验。ns，无显著差异；*,p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图4是来自两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种小鼠或额外加强小鼠的血清的相关性分析和中和活性。a，按照标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划在小鼠血清样本中进行的替代病毒中和试验(sVNT)。b，与标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种相比，基于不同新冠病毒变异株、SARS1病毒和MERS病毒的第三剂rVSV载体疫苗加强后的sVNT分析。所有血清均以1:2500的稀释度对抗新冠病毒、1:500对抗德尔塔和1:100对抗奥密克戎。使用学生t检验。ns，无意义；*,p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图5是奥密克戎BA.2挑战后的保护性免疫反应。a，奥密克戎BA.2挑战实验的设计。b，新冠病毒RdRp基因与小鼠鼻腔中GAPDH的qRT-PCR结果比较。c，小鼠肺部的qRT-PCR结果。ns，无显著差异；*,p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。d，免疫荧光(IF)染色的代表性图像说明了鼻腔骨中的新冠病毒感染。放大10倍的图像，带有黑色比例尺(100μm)。细胞核标记为蓝色，新冠病毒核衣壳蛋白(NP)标记为绿色。e，苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像，说明肺部炎症的程度。放大10倍的图像，比例尺为100μm。
图6是多种疫苗接种策略后的长期免疫反应。a，长期免疫反应检测的实验设计。b，按照标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划，额外施用基于不同新冠病毒变异株、SARS1病毒和MERS病毒的病毒载体加强疫苗，用ELISA以曲线下面积(AUC)表示的RBD和Spike特异性IgG的动力学。c，针对新冠病毒肽库的T细胞反应。与标准两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种相比，基于不同新冠病毒变异株、SARS1病毒和MERS病毒的额外rVSV载体加强疫苗后，IFN-γELISpot结果根据每106个小鼠脾细胞的斑点形成单位计算。d，第18周针对新冠病毒和奥密克戎(BA.2.12.1和BA.4/BA.5)的假病毒中和效价。e,第18周针对新冠病毒、德尔塔和奥密克戎(BA.1)的真病毒中和效价。f，按照标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划，额外施用基于新冠病毒和SARS1病毒的病毒载体加强疫苗，第27周以ELISA以曲线下面积(AUC)表示的RBD特异性IgG。g，第18周针对新冠病毒和奥密克戎(BA.2.12.1、BA.4/BA.5和XBB)的假病毒中和效价。使用了Student’s t检验。h，遵循标准的两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种计划的RBD特异性IgG的对数线性拟合(左图)。列出了每组RBD特异性IgG的半衰期。右图详细说明了RBD特异性IgG衰减率。在这里，使用了Student’st检验。ns，无显著差异；*,p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图7是一种包含SARS1病毒刺突受体结合结构域和粘膜辅助结构域的粘膜疫苗。一种,粘膜疫苗的蛋白质设计。a、粘膜辅助结构域可以连接到SARS1病毒刺突RBD的N端或C端。b，根据细菌毒素的粘膜辅助结构域列表。c，粘膜疫苗通过金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A片段与粘膜细胞纤连蛋白结合的预测结构。
具体实施方式
为对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，发明人结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明的部分实施例，而非全部。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一、实验方法
1、冠状病毒进化分析和抗原图谱
新冠病毒以外的58种冠状病毒的刺突氨基酸序列取自UniProt数据库，新冠病毒不同突变株的1524个刺突蛋白氨基酸序列是从GISAID数据库中获得的，2022年1月31日。使用Nextstrain工具分析所有序列构建基于氨基酸序列的无根进化树(图1a)。在这里，我们使用MAFFT对序列进行比对，然后使用IQ-TREE构建最大似然系统发育树根据BLOSUM62替代模型。
新冠病毒变异株的抗原作图，也称为抗原制图。简而言之，基于中和效价数据计算抗原距离。对于a病毒株、b参考毒株和b毒株的β抗血清，我们有两种中和抗体滴度Taβ和Tbβ，分别是针对a病毒株和b毒株的β抗血清的滴度。然后我们根据对数中和滴度计算毒株a到b的抗原距离，如Hab＝log2Taβ-log2Tbβ。
对于没有数据的变异株，我们使用RBD氨基酸序列进行预测。对于病毒株a和病毒株b，我们首先根据抗原位点获得变异株a和b的两个n-mer病毒序列之间的不同氨基酸数量nd。假设每个位点的氨基酸替换数服从泊松分布，然后我们将a和b之间的距离计算为Dab＝-ln(1-nd/n)。以根据已知的中和数据，应用考虑最大中和滴度降低的模型来检查与中和数据Hab的抗原距离，我们的计算结果Dab为Hab＝Tmax·Dab/(D50+Dab)，其中Tmax是最大降低，D50是可能导致中和降低最大降低50％的抗原性差异。然后将预测的抗原距离给出为在这里，我们还在地图中包含了SARS1病毒。
在预测所有变异株的抗原距离后，我们使用R-3.6.6中的经典多维尺度变换(CMDS)绘制了抗原图谱。
2、不同新冠疫苗保护范围的模拟和计算
我们使用R-3.6.6中的逻辑模型来描述抗原距离(中和水平)与保护功效/有效性之间的关系：E＝1/(1+exp(-k(H-H50)))，其中E是特定中和水平H下的保护效力/有效性。H是接种者中的中和滴度平均值除以恢复期患者中相应的滴度平均值，即到恢复期患者的抗原距离，以log 2表示。H50是抗原个体将具有50％保护效能/有效性的距离。
我们可以根据任意单位(r2×BNT＝3.90AU)使用上述关系(图2)。考虑到第三剂复必泰(BNT162b2)后中和滴度增加1.83倍(50％活病毒中和滴度,然后我们可以得到助推器后的覆盖直径为r3×BNT＝3.90+log21.83＝4.77(AU)。使用最近的中和数据,我们然后可以估计由德尔塔和奥密克戎引起的覆盖范围(图1c)。与两次接种复必泰(BNT162b2)疫苗的滴度相比，针对德尔塔毒株的德尔塔恢复期血清的滴度降低了1.30倍。因此，我们可以获得德尔塔引起的覆盖率rDelta＝3.90-log21.92＝2.96(AU)。同样，我们可以估计由奥密克戎引起的覆盖率，rOmicron＝3.90-log214.83＝0.092(AU)。
由于没有SARS1病毒血清对新冠病毒的交叉中和数据，我们只能使用先前报告的中和数据来估计覆盖率.由于SARS1病毒幸存者血清中针对SARS1病毒的中和抗体滴度相对较高(～1:1280)且持续时间较长(>16个月)，我们可以假设基于SARS1病毒不会小于新冠病毒(图1f)。
对于MERS病毒，很难估计与SARS1病毒或新冠病毒的抗原距离，因为与SARS1病毒相比，MERS病毒刺突蛋白的RBD有150个氨基酸改变与新冠病毒相比有151处改变。这表明MERS病毒与SARS相关病毒之间没有交叉反应冠状病毒。这样，我们可以假设没有交叉反应保护范围(图1g)。
3、重组水泡性口炎病毒(rVSV)载体疫苗的构建
重组水泡性口炎病毒(rVSV)载体疫苗(简称rVSV载体疫苗)是在HEK293T细胞中进行构建的假病毒颗粒，这些假病毒颗粒同样可以用在中和试验中。
重组水泡性口炎病毒(rVSV)载体疫苗构建基于新冠病毒刺突蛋白(Spike)质粒(参考序列：EPI_ISL_402124)购自eEnzyme(SCV2-PsV-001)，新冠病毒突变株德尔塔(B.1.617.2)刺突蛋白(Spike)质粒(CB-97100-161)和奥密克戎(B.1.1.529)刺突蛋白(Spike)质粒(CB-97100-167)购自Codex BioSolutions，SARS1病毒(SARS1病毒的刺突蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和MERS病毒的刺突蛋白(Spike)编码质粒是根据微生物系SARS1病毒临床分离毒株GZ50和MERS病毒临床分离毒株EMC/2012的刺突蛋白(Spike)测序结果构建。我们将刺突蛋白(Spike)质粒序列统一构建到pCMV载体上，从而构建一系列载体，包括新冠病毒载体pCMV-SARS2、德尔塔载体pCMV-Delta、奥密克戎载体pCMV-Omicron、SARS1病毒载体pCMV-SARS1和MERS病毒载体pCMV-MERS。将上述质粒使用聚醚酰亚胺(PEI)分别转染到10cm培养皿中预备HEK293T细胞，以Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Life Technologies)培养，转染当天细胞密度达到约80％。转染48小时后加入G*ΔG-luciferase重组水泡性口炎病毒，24小时后收集上清液并以2000rpm离心10分钟，然后通过0.45μm过滤器去除细胞碎片，浓缩至108PFU/mL并储存在-80℃以备进一步使用。
4、基于重组水泡性口炎病毒(rVSV)载体疫苗假病毒中和试验(pVNT)
在HEK293T-hACE2细胞中进行假病毒中和试验(pVNT)。假病毒颗粒的构建与前述rVSV载体疫苗构建类似。这里，新冠病毒突变株奥密克戎(BA.2.12.1和BA.4/BA.5)刺突蛋白(Spike)质粒购自Codex BioSolutions，其余构建流程参见rVSV载体疫苗构建。从而获得rVSV载体的假病毒颗粒，包括了新冠病毒株、德尔塔(B.1.617.2)和奥密克戎(B.1.1.529、BA.2.12.1和BA.4/BA.5)以及SARS1病毒和MERS病毒的假病毒颗粒。
将预先培养的HEK293T-hACE2细胞进行计数，稀释转移到96孔板中，确保每孔细胞数～2×104，DMEM培养液终体积约50μL，培养至细胞贴壁。
将血清在108PFU/mL假病毒溶液中连续稀释，一般地对于小鼠的血清从1:40开始4倍稀释至1:10240，最后定量到50μL，在37℃孵育60分钟，然后添加到去除原培养液的96孔板中的HEK293T-hACE2细胞中。同时设置对照孔，加入50μL假病毒溶液。在37℃孵育42小时后，使用Steady-Glo萤光素酶测定系统(Promega，E2520)测定萤火虫萤光素酶活性，这表明有假病毒感染。荧光信号由Varioskan LUX多模式酶标仪(Thermo Scientific)获得，并由Thermo Scientific SkanIt软件导出。
我们可以获得相对于对照孔的相对荧光信号强度，对照孔的信号强度为100％，若血清含有中和抗体则血清和假病毒混合液孔的信号强度小于100％，这同时也是感染率的百分比，这样可以获得以血清稀释度为横坐标，感染率为纵坐标，获得血清稀释度相对感染率的曲线，选取感染率50％时的血清稀释度即为测定的中和抗体滴度。
5、ELISA抗体检测
RBD检测和刺突特异性IgG检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行。
简而言之，将RBD或刺突蛋白以终浓度0.5μg/mL的50mM包被缓冲液(pH 9.6Na2CO3/NaHCO3)包被在ELISA板(BIOFIL，#FEP100096)上，并在4℃下孵育过夜。在室温下用TBST(Thermo，目录号28360)中的5％脱脂牛奶(Bio-Rad，目录号1706404)封闭板3小时，然后在TBST中洗涤3次。人血清在含3％脱脂牛奶的TBST中连续稀释，加入孔中孵育1小时。将板在TBST中洗涤五次，并与1:2500辣根过氧化物酶(HRP)偶联的驴抗人IgG(BioLegend，#410902)孵育1小时。使用三甲基硼烷(TMB)显色剂溶液(Invitrogen，#002023)。使用ELISA读取器(Varioskan Flash 4.0，Thermo)在450nm处测量吸光度，并通过SkanIt Software2.4.5RE for Varioskan Flash(Thermo)进行分析。所有数据均在R版本3.6.6中进行分析和绘图。
6、RBD特异性IgG的对数线性回归
对于仅考虑抗体衰变的模型，我们假设新冠病毒RBD特异性抗体的产生率(β)和衰变率(δAb)是常数。两剂疫苗接种后，抗体水平(Ab)达到峰值(Abmax)。然后，水平下降，直到达到稳定状态(dAb/dt＝0)，然后保持在最低水平(Abmin)。动力学由以下等式描述。
dAb/dt＝β-δAbAb
因此，我们之间有关系抗体水平和时间。这里Abmin＝β/δAb。
Ab＝Abmin+(Abmax-Abmin)exp(-δAbt)
这样，可以使用对数线性回归来计算衰减率(δAb)的新冠病毒RBD特异性抗体(图4f)。
8、体内活病毒挑战实验
动物的使用得到了动物伦理委员会的批准(CULATR 5440-20和5370-20)。对于病毒挑战，C57/BL10J小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，然后鼻内接种20μL病毒液体，每只小鼠1×105PFU新冠病毒奥密克戎(BA.2)49，在病毒挑战后48和96小时，小鼠被安乐死，并收获器官用于病毒复制检测和组织学分析。
9、病毒复制检测
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号74106)从小鼠肺和鼻腔中提取病毒RNA。使用QuantiNova探针RT-PCR试剂盒(Qiagen，目录号208354)对靶向RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和内部基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的新冠病毒基因拷贝进行了量化。引物和探针序列可应要求提供。
10、组织学分析
小鼠组织样本在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时。如前所述，鼻腔骨在10％甲酸中脱钙7天.对于H&E染色，组织切片用Gill苏木精和曙红Y(Thermo FisherScientific)染色，如前所述.使用Akoya Vectra Polaris成像系统获取图像。对于免疫荧光染色，在脱蜡后进行抗原修复。新冠病毒的核衣壳蛋白(NP)由内部兔多克隆抗新冠病毒NP抗体检测，然后用Alexa488山羊抗兔抗体(Thermo Fisher Scientific)检测。在用Diamond Prolong Antifade安装缓冲液(Thermo Fisher Scientific)安装切片之前，先用DAPI染料(Thermo Fisher Scientific)对细胞核进行染色。
11、IFN-γELISpot检测
按照制造商的方案，通过小鼠IFN-γ酶联免疫吸附斑点(ELISpot)试剂盒(Mabtech，目录号3321-4HST-2)检测T细胞反应。从囊中收获脾细胞后小鼠，细胞在预包被抗IFN-γ抗体的多屏滤板上37℃培养过夜。通过与尖刺多肽文库(GL Biochem Ltd)包含130个15聚体肽，覆盖了原始新冠病毒刺突蛋白，5个残基在0.05处重叠每种肽的g/mL.所有样本均一式三份与检测阳性c一起进行检测对照物(佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸盐和离子霉素)和来自参考供体的细胞。使用CTL ImmunoSpot ELISpot分析仪对所有孔进行成像，并通过ImmunoCapture软件(Cellular Technology Ltd)进行分析。通过Student’s-t检验对新抗原的免疫原性进行统计分析，并与野生型抗原或阴性对照进行比较。
12、活病毒培养和灭活疫苗
SARS1病毒毒株GZ50在微生物学系存档临床分离株。所有涉及活新冠病毒和SARS1病毒的实验均遵循微生物学系生物安全3级设施批准的标准操作程序。分离物在FRhK-4细胞(ATCC)中培养，该细胞用或用无血清最低DMEM培养基，辅以100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，在37℃下5％二氧化碳培养。病毒接种后2-3天，培养的病毒液用1：1000-1：4000福尔马林溶液灭活3-12小时。灭活步骤重复三次。然后将灭活病毒液以2000-4000g离心力2-8℃离心10-35分钟。分离上清获得病毒超滤液以研制灭活疫苗。
二、实验结果
1、新冠额外加强疫苗毒株选择模型
我们首先分析了新冠病毒及其变异株与其他冠状病毒之间的进化关系，这些冠状病毒可能在刺突蛋白方面作为疫苗种子株提供潜在的交叉反应(图1a)。先前的研究表明，SARS1病毒和MERS病毒等高致病性或抗原性冠状病毒会引发更强的免疫反应，并可能与当前的新冠病毒VOC发生交叉中和作用，而致病性或抗原性较弱的冠状病毒表现出较低的交叉反应性。
为了选择最佳毒株，我们根据不同的疫苗接种策略绘制了不同的抗原图谱(图1b-g)。在图中，每个点都表示冠状病毒或新冠病毒变异株。50％的保护覆盖圈表示针对COVID-19的免疫保护有50％的有效性。位于此覆盖范围之外的点表示此变异株将被效率低于50％的疫苗接种策略中和。使用先前的中和数据计算每个覆盖范围的直径(图2)。接下来，我们分析了新冠病毒以两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种的形式提供的保护范围(图1b)。我们的结果表明，就50％的保护覆盖率而言，两剂复必泰(BNT162b2)疫苗可以勉强覆盖奥密克戎BA.1(B.1.1.529.1)。这被设定为保护功效的基线，这与最近的研究一致。
我们使用基于新冠病毒的疫苗计算了第三剂加强剂的保护范围。我们的结果表明，的新冠病毒第三剂加强剂在50％的保护范围内略微覆盖了奥密克戎(B.1.1.529)(图1c)。我们根据先前研究确定的新冠病毒德尔塔和奥密克戎的抗原性，使用新冠病毒德尔塔或奥密克戎毒株作为加强剂(图1d，e)，进一步绘制了第三剂疫苗接种后的抗原图谱.过去的研究表明，几种新冠病毒变异株的抗原性相似，例如阿尔法(B.1.1.7)、贝塔(B.1.351)和德尔塔(B.1.617.2和AY.*)，这意味着这些变异株可以在恢复期个体中引发针对相应变异株的类似中和抗体滴度.然而，奥密克戎(B.1.1.529和BA.*)诱导针对奥密克戎本身的较弱免疫反应，以及针对先前感染个体的其他变异株的较差交叉反应.我们的计算结果表明，德尔塔作为第三剂加强剂诱导的50％保护覆盖率与新冠病毒相似，而奥密克戎加强剂诱导的覆盖率相对较小。总之，这些发现表明奥密克戎和德尔塔加强疫苗接种策略都会扩大保护范围，尽管德尔塔诱导的覆盖率会大于奥密克戎(图1d，e)。
接下来，我们将计算机分析扩展到SARS1病毒和MERS病毒(图1f，g)。我们的结果表明，作为疫苗种子株的SARS1病毒与目前的疫苗株新冠病毒并不太接近。基于新冠病毒恢复期血清对SARS1病毒的交叉中和结果，这可能会克服免疫印记(图1f)。考虑到新冠病毒和MERS病毒之间的关系较远(图1a)，这两种冠状病毒之间没有交叉中和作用(图1g)。根据抗原图谱分析，新冠病毒德尔塔和SARS1病毒作为新冠病毒的加强疫苗时，可能比其他冠状病毒提供更大的保护范围。
3、一种包含SARS1刺突氨基酸序列的病毒载体疫苗
我们继续在体内验证我们的计算机预测。我们比较了接种不同VOC或不同冠状病毒的额外加强疫苗对免疫原性和抗奥密克戎BA.2感染的影响。我们选择了新冠病毒毒株、德尔塔毒株和奥密克戎毒株，以及SARS1病毒来构建我们的加强疫苗候选者。我们还将MERS病毒作为阴性对照，因为预计它不会提供针对新冠病毒的交叉中和作用。在这里，我们构建了由SARS1病毒(SEQ ID No.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、新冠病毒、新冠病毒德尔塔的重组刺突蛋白组成的疫苗，和奥密克戎由重组水泡性口炎病毒(rVSV)递送并辅以聚肌胞苷。C57BL/10J小鼠肌肉注射了两剂复必泰(BNT162b2)疫苗(第0周和第3周5μg)的临床相关主要方案。在第9周，他们通过肌内注射rVSV载体疫苗(1×106PFU)加强免疫。在第3、6、9和10周评估中和和抗原特异性抗体反应(图3a)。通过ELISA测量新冠病毒受体结合域(RBD)和刺突特异性免疫球蛋白G(IgG)。正如预期的那样，RBD特异性IgG和刺突蛋白特异性IgG在加强后以时间依赖的方式降低(图3b，c)。在第10周，即复必泰(BNT162b2)加强后大约2个月，免疫反应出现小幅但显著的减弱(图3b)。接下来，我们比较了两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种后的不同加强策略。我们发现所有额外的加强疫苗接种都会增加特异性IgG水平。与基于新冠病毒的加强疫苗相比，基于新冠病毒德尔塔和SARS1病毒的加强疫苗诱导了显著更高水平的刺突特异性IgG和RBD特异性IgG(图2c)。这一结果与我们使用抗原制图的分析一致。因此，我们的结果表明新冠病毒德尔塔和SARS1病毒都是加强疫苗的潜在候选者。
我们通过假型病毒中和试验进一步测试了每组对不同新冠病毒变异株的中和活性(图3d、e和图4)。与特异性IgG结果类似，在第10周时中和抗体有小幅但显著的减弱(图3d)。重要的是，与基于SARS1病毒的两剂复必泰(BNT162b2)加强疫苗相比，两剂复必泰(BNT162b2)加强疫苗提供了最高水平的针对新冠病毒、德尔塔AY.1和奥密克戎BA.1的中和抗体任何其他新冠病毒变异株(图3e)。相比之下，基于MERS病毒的加强疫苗对新冠病毒变异株提供了有限的额外交叉中和作用(图3d、e)。
疫苗接种诱导的鼻腔和肺部免疫反应可能在抑制新冠病毒复制的第一步中发挥主要作用。因此，我们将我们的分析扩展到C57BL/10J小鼠中的保护活性之外的外周抗体，因为它们容易受到新冠病毒变异株的感染，包括奥密克戎(B.1.1.529)及其亚系(BA.*)携带刺突蛋白N501Y突变.小鼠在第0周和第3周接受两剂复必泰(BNT162b2)疫苗，在第9周用疫苗加强免疫，并在第10周接受奥密克戎BA.2攻击(图5a)。在用奥密克戎BA.2感染后48和96小时，小鼠被安乐死，收集鼻腔骨和肺用于病毒负荷分析(图5a)。疫苗接种不能有效控制新冠病毒在接种动物鼻腔中的复制。在两次接种复必泰(BNT162b2)疫苗的C57BL/10J小鼠的鼻腔骨中，在感染奥密克戎BA.2后很容易检测到病毒RNA(图5b)。相比之下，基于任何变异株/冠状病毒的第三剂疫苗接种进一步减少了病毒复制。与抗体结果一致，在所有加强疫苗接种策略中，基于SARS1病毒的加强疫苗在48小时和96小时后均显示出对C57BL/10J小鼠鼻腔中新冠病毒复制的最有效抑制感染(图5b)。与鼻腔相比，疫苗接种有效地限制了新冠病毒在接种动物肺部的复制。此外，包括BA.2在内的奥密克戎亚系在受感染动物的肺部复制不良。在这方面，两剂复必泰(BNT162b2)疫苗接种已经有效地限制了奥密克戎BA.2在肺部的复制，而基于任何变异株/冠状病毒的额外加强疫苗接种并未进一步减少病毒复制(图5c)。
为了评估小鼠的鼻腔和肺部病理学，每组中的四只小鼠在奥密克戎(BA.2)或病毒挑战后48小时被安乐死(图5d、e)。其他三组在96小时后被安乐死。新冠病毒抗原只能在两次接种复必泰(BNT162b2)疫苗的C57BL/10J小鼠的鼻腔中检测到(图5d)。就肺部炎症而言，所有组之间没有差异(图5e)，这与我们的qRT-PCR结果一致。
由于免疫力减弱，疫苗接种诱导的保护性免疫力的持久性是开发下一代COVID-19疫苗接种的另一个关键因素。在这里，我们测量了额外加强疫苗接种后免疫反应的持续时间。我们在加强疫苗接种后两个月(第18周，图6a)从小鼠身上取样，然后检测了RBD特异性IgG滴度(图6b)，针对新冠病毒和流行奥密克戎亚系(BA.2.12.1和BA.4/BA.5)的中和抗体滴度(图6d、e)。SARS1病毒加强剂组在所有组中显示出最高水平的RBD特异性IgG和中和抗体。我们还在第18周处死小鼠后使用脾细胞分析了T细胞反应(图6c)。SARS1病毒和新冠病毒增强剂组都显示出对新冠病毒肽库的持久T细胞反应。
在加强疫苗接种后四个月(第27周，图6a)对接种了两剂复必泰(BNT162b2)和基于SARS1病毒或新冠病毒的额外加强疫苗的小鼠进行了采样。我们观察到SARS1病毒加强疫苗接种组显示出更持久、更高水平的抗体，特别是针对对新冠病毒和流行奥密克戎亚系(BA.2.12.1、BA.4/BA.5和XBB)的中和抗体滴度(图6f、g)，重要的是其下降速度明显慢于其他组(图6h)。
4、包含SARS1病毒刺突受体结合结构域和粘膜辅助结构域、金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A片段的粘膜疫苗
为了引发粘膜免疫，病毒抗原应进入鼻咽和口腔粘膜细胞，然后刺激局部免疫(图7a)。为了实现这一目标，可以使用细菌毒素，包括白喉棒状杆菌毒素CRM197、艰难梭菌毒素A/B受体结合域、霍乱弧菌毒素B亚基(CTB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)(图7b)。
在这里，来自金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白(FnBP)A的片段与SARS1病毒刺突受体结合域相连。由于FnBPs通过粘附到组织细胞外基质中存在的纤连蛋白而在金黄色葡萄球菌定植和感染宿主中的作用，与FnBP连接的病毒抗原可以帮助抗原被鼻咽和口腔粘膜细胞摄取，从而诱导强烈的粘膜免疫。所述的粘膜疫苗，包含氨基酸序列SEQ ID No.3，以及具有氨基酸序列SEQ ID No.4的粘膜辅助结构域，它们通过连接序列连接(所述的连接序列为GS连接子：GSGS或可切割连接子：LLSVGG)。实例列于SEQ ID No.5、No.6和No.7中。通过使用ColabFold，我们能够预测我们的粘膜疫苗分子与粘膜细胞胞外基质中的纤连蛋白的结合(图7c)。
5、一种制备抗COVID-19的SARS1病毒灭活疫苗作为附加加强疫苗的方法
我们还在微生物学系生物安全三级设施培养了存档的SARS1病毒临床分离株GZ50，以开发一种灭活疫苗，以实现“一种包含SARS-1刺突氨基酸序列的病毒载体疫苗”一节中提到的类似免疫反应。
SEQ ID No.1
核苷酸序列
ATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCACTAGTGGTAGTGACCTTGACCGGTGCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAATTACACTCAACATACTTCATCTATGAGGGGGGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTAGATCAGACACTCTTTATTTAACTCAGGATTTATTTCTTCCATTTTATTCTAATGTTACAGGGTTTCATACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAGTCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTAACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACAGACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCTGATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACCTATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTTAAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCTGTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTGAGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGATGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAATGCTACTAAATTCCCTTCTGTCTATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTGTTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCTATGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTTGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTTGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAA
SEQ ID NO.2
氨基酸序列
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID No.3
TNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGYQPYRVVVGPLSFELLNAPADLS
SEQ ID No.4
NGPIIQNNKFEYKEDTIKETTLGQYDKNLVTTVEEEYDSSTLDIDYHTAIDGGGGYVDGYIETIEETDSSAIDYHTAVDSEAGHVGGYTESSEESNP
GS连接子：GSGS
可切割连接子：LLSVGG
SEQ ID No.5
MKTIIALSYIFCLVFANGPIIQNNKFEYKEDTIKETLTGQYDKNLVTTVEEEYDSSTLDIDYHTAIDGGGGYVDGYIETIEETDSSAIDIDYHTAVDSEAGHVGGYTESSEESNPLLSVGGTNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDGSGHHHHHHHH
SEQ ID No.6
MKTIIALSYIFCLVFANGPIIQNNKFEYKEDTIKETLTGQYDKNLVTTVEEEYDSSLLSVGGTNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDGSGHHHHHHHH
SEQ ID No.7
MKTIIALSYIFCLVFATNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDGSGHHHHHHHH。
表1中和数据的数据源。在这里，中和抗体倍数变化(NAbFold)是使用疫苗诱导的滴度除以恢复期血清滴度来计算的。
表2针对COVID-19数据的疫苗效力数据来源
Claims (10)
1.一种基于SARS1病毒的新冠加强免疫疫苗，其特征在于，是SARS1病毒的疫苗为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)的加强免疫疫苗。
2.SARS1病毒的疫苗在制备严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)的加强免疫疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的SARS1病毒的疫苗以SARS1病毒或以SARS1病毒为基础的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗、灭活疫苗或减毒疫苗。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的加强疫苗是包含SEQ ID No.1的核苷酸序列、或与其具有至少90％的相似性的核苷酸序列、或编码氨基酸序如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的mRNA疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗或载体疫苗，或编码氨基酸序如SEQID NO.2所示的核苷酸序列编码的预测表位序列的多肽疫苗。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的加强免疫疫苗是包含氨基酸序列如SEQ ID No.2所述的重组蛋白疫苗或粘膜疫苗。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的粘膜疫苗包含细菌毒素方面的粘膜辅助结构域与SARS1病毒刺突受体结合域相连。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的相连通过连接序列连接，所述的连接序列为：GS连接子：GSGS或可切割连接子：LLSVGG。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细菌毒素方面的粘膜辅助结构域是白喉棒状杆菌毒素CRM197，艰难梭菌毒素A/B受体结合结构域、金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白、霍乱弧菌毒素B亚基、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的粘膜疫苗是如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列与如SEQ ID No.4所示的粘膜辅助结构域相连。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的粘膜疫苗是如SEQ ID No.5、No.6或No.7所示的氨基酸序列。
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