JP2001510981A

JP2001510981A - Ｉｘ型コラーゲンおよびキメラ

Info

Publication number: JP2001510981A
Application number: JP51901497A
Authority: JP
Inventors: ヴオリオ，アロ; マーチン，ジョージ; ネフ，トマス，ビー．; アラーコッコ，リーナ
Original assignee: フィブロゲン，インコーポレーッテッド
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2001-08-07
Also published as: NO982181D0; IL124437A0; NO982181L; WO1997017988A1; MX9803801A; BR9611547A; EP0861086A1; CA2237900A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規なコラーゲン、この新規なタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、ならびに病気の診断および治療におけるこの新規なタンパク質およびポリヌクレオチドの使用に関する。さらに、本発明は、特定のコラーゲンおよび誘導体、具体的にはIX型コラーゲンとII型および／またはXI型コラーゲンとの融合タンパク質、ならびに治療剤としてのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 IX 型コラーゲンおよびキメラＩ．発明の分野本発明は、新規ヒトコラーゲンタンパク質、該コラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、および疾病の診断および治療における該新規タンパク質の使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒトα３（IX）コラーゲンおよびその誘導体、IX型コラーゲンとII型および／またはXI型コラーゲンサブユニットとの融合タンパク質および誘導体、ならびに診断薬および治療薬としてのこれらのタンパク質およびポリヌクレオチドの使用に関する。 II．背景コラーゲン原繊維、プロテオグリカン凝集体および糖タンパク質は、一緒になって関節接合中に生じる圧迫、引っ張り力および剪断力に抵抗する軟骨細胞外マトリックスの重要な成分である（HeinegirdおよびOldberg，FASEB J．3:2042-20 51(1989);MayneおよびBrewton，Cartilage Degradation:Basic and Clinical As pects（Woessner，J.F.およびHowell，D.S.編集），Marcel Dekker inc.，ニューヨーク，pp.81-108(1993)）。生合成、組立て（assembly）または前記の種々のマトリックス成分間の相互作用に影響を及ぼす軟骨マトリックス遺伝子における突然変異は、軟骨マトリックスの分解および正常な軟骨機能の消失の一因となり得る。ヒトコラーゲンにおける突然変異は、重篤度が致死性軟骨無形性II型からStickler関節眼疾患にまで及ぶ一連の軟骨形成不全および早期発症家族性骨関節炎を引き起こすことがわかっている（Sprangerら，Eur．J．Pediatr．153:56- 65(1994);Vikkulaら，Ann．Medicine 26:107-114(1994);ProckopおよびKivirikk o，Annu．Rev．Biochem．64:403-434(1995)に概説）。 IX型コラーゲンの分析によって、この分子が、硝子軟骨およびその他の組織（硝子体液を含む）中のII型コラーゲン含有原繊維の表面に位置しているということがわかっている（BrewtonおよびMayne，Extracellular Matrix Assemblyand S tructure（Yurchenco，P.D.，Birk，D.E.，Mecharm，R.P.編集）Academie Press ， Inc.，サンディエゴ，pp.129-170(1994)に概説）。IX型コラーゲンは、３つのポリペプチドサブユニット、α１（IX）、α２（IX）およびα３（IX）（これらは、別個の遺伝子の産物であり、交互に非三重ヘリックス性または非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１−４）と、三重ヘリックス性またはコラーゲン性ドメイン（ＣＯＬ１−３）とを含有する。）とから構成されるヘテロ三量体である。３つのトリペプチドサブユニットは、構造α１（IX）α２（IX）α３（IX）を有する成熟コラーゲン分子に組立てられる（van der RrestおよびMayne，Structure and Fu nction of Collagen Types（Mayne，R．およびBurgeson，R.編集）Academic Pre ss，オーランド，フロリダ，pp.195-221(1987)）。種々の供給源由来の硝子軟骨は、II型およびIX型コラーゲンに加えて、少なくとも３つの他のコラーゲン分子、VI型、Ｘ型およびXI型も有意な量で含有する（Thomasら，Ann．Rheumat．Dise ases 53:488-496(1994);MayneおよびBrewton，Cartilage Degradation:Basic an d Clinical Aspects（Woessner，J.F．およびHowell，D.S.,編集）Marcel Dekke r，Inc.，ニューヨーク，pp.81-108(1993)）。XI型コラーゲンは、IX型コラーゲンに類似しており、３つの異なるポリペプチドサブユニット、α１（XI）、α２（XI）およびα３（XI）から構成されるヘテロ三量体である。また、コラーゲン XII型およびXIV型も、ウシ関節軟骨から単離された（Wattら，J．Biol．Chem．2 67:20093-20099(1992)）。天然IX型コラーゲン分子は、ドメインＮＣ１、ＣＯＬ１、ＮＣ２、ＣＯＬ２およびＮＣ３がコラーゲン原繊維の表面に沿って位置するように、非常に特異的な様式でII型コラーゲン分子と相互作用する。IX型コラーゲンとII型コラーゲンとの相互作用は、特定のリシン残基から誘導される多数の共有結合架橋によって安定化される（van der RestおよびMayne，J．Biol．Chem．263:1615-1618(1988); Shimokomakiら，Ann．N.Y．Acad．Sci．580:1-7(1990);Wuら，J．Biol．Chem．2 67:23007-23014(1992)参照）。II型コラーゲン原繊維に沿ったIX型コラーゲンの周期的な局在は、コラーゲン性ドメインＣＯＬ３と大きな球状ドメインＮＣ４がその原繊維の表面から突き出ているので、ロータリーシャドウイング(rotary sh adowing)によって容易に視覚化することができる（Vaughanら，J．Cell Biol．1 06:991-997(1988);Shimokomakiら，Ann．N.Y．Acad．Sci．580:1-7(1990)）。それとは対照的に、XI型コラーゲンヘテロ三量体は原繊維の中心部にあると考えられる（Mendlerら，J．Cell Biol．108:191-97(1989)）。ヒトII型コラーゲン遺伝子および３つのヒトXI型コラーゲン遺伝子のクローニングおよび配列決定が報告されている。完全なヒトII型コラーゲン遺伝子配列は、Baldwinら，Biochem．J．262:521-28(1989)およびSuら，Nucleic Acids Res． 17:9473(1989)によって報告された。３つのXI型コラーゲンサブユニットの中で、α３（XI）鎖がII型コラーゲン遺伝子の産物であると考えられる。Bernardら，J．Biol．Chem．263:17159-66(1988)は、プロα１（XI）コラーゲンを意図的にコードするｃＤＮＡ配列を開示している。α２（XI）遺伝子をコードする配列は、Kimuraら，J．Biol．Chem．264:13910-16(1989)によって報告された。 IX型コラーゲンの３本の鎖をコードする遺伝子は、関節および／または硝子体液に影響を及ぼす軟骨形成不全および変形性障害に対する優れた候補である。というのは、IX型コラーゲンは、これらの組織の両方において重要な構造分子であるからである。したがって、３つのIX型コラーゲンサブユニットをコードする遺伝子のクローニングが集中的な研究の目的であった。Muragakiら，Eur．J．Bioc hem．192:703-8(1990)は、ヒトα１（IX）遺伝子由来の交互の転写物の双方の完全なｃＤＮＡ配列を提示した。ヒトα２（IX）コラーゲンｃＤＮＡの大部分がPe ralaら，FEBS Lett．319:177-80(1993)によって報告されており、Warmanら，Gen omics 23:158-62(1994)によって完全なものが示されている。ヒトのα３（IX）サブユニットについての完全な配列は、最近まで入手できなかった。同時に提出した出願（米国出願後譲渡）において記載したように、R.W.Brewton博士およびR .Mayne博士は、ヒトα３（IX）に対応する全長配列を同定し、特性付けた。Brew tonおよびMayneの仮出願に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。トランスジェニックマウスを利用する実験は、IX型コラーゲンが硝子軟骨の完全性を維持することにおいて重要な役割を果たしているということを示唆するものである。α１（IX）鎖に欠失を有するミニ遺伝子が発現するか（Nakataら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90:2870-2874(1993)）、または分断されたα１（ IX）遺伝子を有する（Fesslerら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:5070-507 4(1994)）動物は、ヒト骨関節炎に似ている変形性関節症が発生する。ヒトの疾患におけるIX型コラーゲンの重要性は、エキソン３のスキッピング(skipping)を生じ、そして多発性骨端形成異常（ＥＤＭ２）を引き起こすＣＯＬ９Ａ２における突然変異の同定（Muragakiら，発表のために提出，(1995)）によって立証された。 III．発明の要旨本発明は、新規コラーゲン誘導タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド配列に関する。また、本明細書にはコラーゲン合成または構造における異常に起因する病気の診断方法も記載されている。本発明の１つの態様は、ヒトIX型コラーゲンサブユニットがヒトII型コラーゲンおよび／またはヒトXI型コラーゲンサブユニットに共有結合しているヒトIX型コラーゲンの融合タンパク質が産生され得るという発見である。本発明の１つの実施態様においては、融合タンパク質は、ヒトIX型コラーゲンサブユニットに対するポリヌクレオチドコード配列をヒトII型コラーゲンおよび／またはヒトXI型コラーゲンに対するポリヌクレオチドコード配列と読み枠を合わせて結合することによってキメラとして組換え的に産生される。このキメラコード配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞の形質転換に用いる。次いで、宿主細胞を誘導してキメラコード配列を発現させ、それによってキメラコラーゲン融合タンパク質を産生させる。これらの融合タンパク質はコラーゲンが関係した疾患および症状の治療に有用である。また、本発明は、部分的に、本発明のキメラコラーゲンをコードするヌクレオチド配列および発現ベクターにも関する。また、本明細書には、コラーゲン産生またはコラーゲンに対する自己免疫における異常と関係した疾患または症状の治療方法も開示されている。そのような異常によって、例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、自己免疫聴覚疾患、細菌またはウイルス感染による軟骨炎症（例えばライム病）、寄生虫病、滑液包炎、角膜疾患、および強直性脊椎炎（脊椎の固定）が生じる可能性がある。本発明の新規タンパク質は、これらのコラーゲン関連疾患の治療方法において有用である。 IV．図面の簡単な説明図１：非還元８％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における、α１（IX）、α２（IX）およびα３（IX）からなる組換えヒトIX型コラーゲンヘテロ三量体の塩分画。図２：還元１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける、α１（IX）、α２（IX）および α３（IX）からなる組換えヒトIX型コラーゲンヘテロ三量体の塩分画。Ｖ．詳細な説明本発明は、II型コラーゲンタンパク質および／またはXI型コラーゲンタンパク質とのIX型コラーゲン誘導体の組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび核酸配列ならびにかかる融合タンパク質に関する。また、コラーゲン関連障害および症状を治療するためにこれらのコラーゲン融合タンパク質を使用する方法も本発明の範囲に含まれる。Ａ．定義「コラーゲンサブユニット」という用語は、単一の遺伝子ならびに欠失誘導体、保存的置換体等を含む誘導体によってコードされるコラーゲンタンパク質の１つのサブユニットのアミノ酸配列をいう。「融合タンパク質」とは、異なるタンパク質由来のペプチド配列が互いに共有結合しているタンパク質をいう。「キメラ」または「キメラの」という用語は、２以上のコラーゲンタンパク質サブユニットについてのポリヌクレオチドコード配列を読み枠を合わせて操作可能なように結合し、その結合したコード配列を１本のペプチド鎖として組換え的に発現させることによって産生された融合タンパク質をいう。「活性ヒトIX型コラーゲン」とは、その天然三量体タンパク質複合体をいい、組換え的に産生され得る。本明細書中で用いられる「ストリンジェントな条件」という語句は、（１）洗浄に、低イオン強度および高温、例えば０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ、５０℃を用いる；（２）ハイブリダイゼーションの際に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０％(vol/vol)ホルムアミド／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍピロリン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストランサルフェートを４２℃ で用い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃にて洗浄する、ハイブリッドダイゼーション条件をいう。本発明にしたがって、特許請求した融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするあらゆるヌクレオチド配列を用いて、融合タンパク質の発現を指令する組換え分子を作製することができる。本明細書中でコラーゲンに関して用いられる「精製された」という用語は、その指摘した分子が、その他の生体高分子、例えばポリヌクレオチド、タンパク質などを実質的に含まない状態で存在するということを示す。本明細書中で用いられる「精製された」という用語は、指摘した生体高分子が好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９．８重量％存在することを意味するものである（しかし、水、緩衝液、およびその他の小さい分子、特に分子量が１０００ダルトン未満の分子は存在してもよい。）。本明細書中で用いられる「単離された」という用語は、そのタンパク質の天然供給源中に存在するその他のタンパク質のみならず、それ以外のタンパク質からも分離されたタンパク質分子をいい、好ましくは（むしろ）溶媒、緩衝液、イオン、または同じ溶液に通常存在するその他の成分のみの存在下で見出されるタンパク質をいう。「単離された」および「精製された」という用語は、その天然供給源中に存在するタンパク質は包含しない。Ｂ．本発明のコラーゲン融合タンパク質の発現１．コード配列本発明にしたがって、IX型、II型、およびXI型コラーゲンタンパク質またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、適切な宿主細胞中で、IX型コラーゲンサブユニットとII型コラーゲンおよび／またはXI型コラーゲンサブユニットとの融合タンパク質またはその機能的均等物の発現を指令する組換えＤＮＡ分子を作製し得る。また、かかるコラーゲンポリヌクレオチド配列ならびにかかるコラーゲンポリヌクレオチドまたはそれらの相補物の少なくとも一部に選択的にハイブリダイズするその他のポリヌクレオチドを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに用いてもよい。遺伝暗号の固有の縮重により、本発明の実施においては、実質的に同一または機能的に等価のアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を、クローニングおよびこれらのコラーゲンタンパク質の発現に用いてもよい。そのようなＤＮＡ配列としては、ストリンジェントな条件下で適切なヒトコラーゲン配列にハイブリダイズすることができるものが挙げられる。本発明にしたがって用い得る改変ＤＮＡ配列としては、同一または機能的に等価の遺伝子産物をコードする配列になる種々のヌクレオチド残基の欠失体、付加物または置換体が挙げられる。遺伝子産物自体がコラーゲン配列内にアミノ酸残基の欠失体、付加物または置換体（これらはサイレント変化であり、機能的に等価のコラーゲンが産生されることになる）を含んでいてもよい。そのようなアミノ酸置換体は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としては、リシン及びアルギニンが挙げられ；同様の親水性値を有する帯電していない極性の頭部基(head groups)をもつアミノ酸としては、下記のもの：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アルパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。本発明のＤＮＡ配列は、コラーゲンコード配列を種々の末端について改変するために操作し得るが、それには、限定するものではないが、プロセッシングおよび遺伝子産物の発現を変更する改変が含まれる。例えば、天然ヒト分泌シグナルを代替の分泌シグナルで置き換えてもよく、および／または、新たな制限部位の挿入や、グリコシル化パターン、リン酸化の変更のために、当技術分野で周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異を生じさせてもよい。さらに、非ヒト細胞において発現させる場合、特定の宿主生物のコドンの利用頻度 (codon preference)により適合するように、本発明のコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、あらゆるトリプレットアミノ酸コドンのサイレント位置において改変し得る。本発明の別の実施態様においては、融合タンパク質をコードするようにコラーゲン配列を異種配列に連結してもよい。例えば、α３（IX）コラーゲンが異種部分から切断され得るように、融合タンパク質を操作してα３（IX）コラーゲン配列と異種タンパク質配列の間に位置する切断部位を含ませてもよい。特に好ましい実施態様においては、キメラ融合タンパク質は、IX型コラーゲンサブユニットまたはその誘導体をコードする配列を、II型コラーゲンおよび／またはXI型コラーゲンサブユニットをコードする配列に連結することによって構築される。当業者には、IX型コラーゲンサブユニットについてのコード配列の全部または一部分を、II型およびXI型コラーゲンについてのコード配列の全部または一部分に連結するのを可能にするいくつかの技術が利用可能であるということがわかるであろう。例えば、適切に選択した制限エンドヌクレアーゼ部位でそれらのコード配列を連結し得る。しがしながら、選択したコラーゲンのコード配列を正確な翻訳枠で連結することを確保するために、部位特異的突然変異によって制限部位を操作することが必要であり得る。２以上のポリヌクレオチド配列を連結するためのさらに都合のよい方法は、Ausubelら，Current Protocols in Molecu lar Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Intersciece，ニューヨーク(1990)の３．１７．１節に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応および適切に設計されたプライマーを利用するものである。この方法を用いた場合、当業者であれば２以上のポリヌクレオチド配列をあらゆる立体配置で連結し得る。別の本発明の実施態様において、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、本発明のコラーゲンのコード配列を全体的にまたは部分的に合成することができる。例えば、Caruthersら，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233(1980);CreaおよびHorn，Nuc．Acids Res．9(10):2331(1980);MatteucciおよびCarthers，Tetr ahedron Letters 21:719(1980);ならびにChowおよびKempe，Nuc．Acids Res．9( 12):2807-2817(1981)を参照されたい。あるいはまた、所望のコラーゲンアミノ酸配列の少なくとも一部を合成するために化学的方法を用いてタンパク質自体を製造することもできる。例えば、ペプチドを固相法によって合成し、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Creighton，Proteins Structure And Molecular Principle，W.H.Freeman and Co.，ニューヨーク，pp.50-60(1983)参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認し得る（例えば、エドマン分解法;Creighton、 Proteins Structures And Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，ニューヨーク，pp.34-49(1983)参照）。本発明のコラーゲンを発現させるために、コラーゲンまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入する。２．発現系当業者に周知の方法を用いて、本発明のコラーゲンについてのコラーゲンコード配列および適切な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。そのような方法としては、in vitro組換えＤＮＡ法、合成法、および in vivo組換え／遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら，Molecular C loning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク( 1989)およびAusubelら，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub lishing Associates and Wiley Intersciece，ニューヨーク(1990)を参照されたい。種々の宿主−発現ベクター系を利用してコラーゲンコード配列を発現させ得る。かかるベクター系としては、限定するものではないが、コラーゲンコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；コラーゲンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；本発明のコラーゲンをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；コラーゲンコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染させた植物細胞系もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。さらに、本発明のコラーゲンを、トランスジェニック非ヒト動物中で発現させてもよく、その場合、所望のコラーゲン産物はそのトランスジェニック動物の乳から回収され得る。これらの系の発現エレメントは、その強さおよび特異性の点で相違する。用いる宿主／ベクター系に依存して、構成的および誘導プロモーターを含む多数の適当な転写および翻訳エレメントのいずれもがその発現ベクターに用いられ得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、バクテリオファージ１のpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導プロモーターを用いることができ；昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルス多角体プロモーターなどのプロモーターを用いることができ；植物細胞系においてクローニングする場合、植物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば熱ショックプロモーター、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニット用のプロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用のプロモーター）または植物ウイルスから誘導されるプロモーター（例えばＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーター、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を用いることができ；哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を用いることができ；コラーゲンＤＮＡの多数のコピーを含有する細胞系を作製する場合、ＳＶ４０、ＢＰＶおよびＥＢＶに基づくベクターを適切な選択マーカーとともに用いることができる。細菌系においては、発現するコラーゲンに対して使用目的に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、抗体の産生のために本発明のコラーゲンを大量に産生させたい場合、容易に精製される融合タンパク質産物を高レベルに発現することを指令するベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、Ｅ．コリ発現ベクターpUR278(Rutherら，EMBO J．2 : 1791(1983))（ここで、コラーゲンコード配列は、ハイブリッドAS-lac Zタンパク質が産生されるように、そのベクターに、lac Zコード領域と読み枠を合わせて連結され得る。）；pINベクター(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res．13:3 101-3109(1985);Van Heeke & Schuster，J．Biol．Chem．264:5503-5509(1989)) などが挙げられる。また、pGEXベクターを用いて、外来ポリヌクレオチドペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出を行うことによって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含み、そのことによって興味の対象であるクローン化ポリペプチドをＧＳＴ部分から放出するように設計される。好ましい発現系は酵母発現系である。酵母においては、構成的または誘導プロモーターを含有する多くのベクターが用いられ得る。概説として、Current Prot ocols in Molecular Biology，第２巻，Ausubelら編集，Greene Publish．Assoc ．& Wiley Interscience，第１３章(1988);Grantら，Expression and Secretion Vector for Yeast，in Methods in Enzymology，Wu & Grossman編集，Acad Pre ss，ニューヨーク153:516-544(1987);Glover，DNA Cloning，第ＩＩ巻，IRL Pre ss，ワシントンD.C.，第３章(1986);Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger & Kimmel編集，Acad．Press，ニューヨーク152:673-684(1987);およびThe Molecular Biology of the Yeast Sacchar omyces，Strathernら編集，Cold Spring Harbor Press，第ＩおよびＩＩ巻(1982 )を参照されたい。本発明のコラーゲンタンパク質のクローニングおよび発現に有用な特に好ましい系では、ピヒア属(Pichia)酵母由来の宿主細胞が用いられる。ピヒア・パストリス(Pichia Pastoris)などの非サッカロミセス属酵母種は、スケールアップした手順で組換えタンパク質を高収量で産生させることにおいて特別な利点を有するようである。さらに、ピヒア属発現キットは、Invitrogen Corporation（サンディエゴ、カリフォルニア州）から市販されている。ピヒア・パストリスなどのメチロトローフ酵母には、多数のメタノール応答遺伝子が存在し、各々の発現はメタノール応答調節領域（プロモーターともいう）によって制御されている。そのようなメタノール応答プロモーターのいずれもが、本発明の実施における使用に適している。特異的な調節領域の例としては、ピヒア・パストリス由来の第一級アルコールオキシダーゼ遺伝子AOX1のプロモーター、P.パストリス由来の第二級アルコールオキシダーゼ遺伝子AXO2のプロモーター、P.パストリス由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DAS)のプロモーター、P.パストリス由来のP40遺伝子のプロモーター、P.パストリス由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。ピヒア・パストリスにおける典型的な発現は、厳重に調節されたAOX1遺伝子由来のプロモーターによって得られる（Ellisら，Mol．Cell Biol．5:1111(1985) および米国特許第4,855,231号参照）。培養物にメタノールを添加した後、このプロモーターを誘導して、組換えタンパク質を高レベルで産生させることができる。続いて、同一の細胞を操作することによって、組換えタンパク質がプロリル４−ヒドロキシラーゼによって十分にヒドロキシル化され、したがって原繊維形成におけるそのタンパク質の正常な生物学的機能に必要な安定なヘリックスに折りたたまれることが可能な条件下で、本明細書に記載された本発明のコラーゲンに対する遺伝子の発現を行う。別の特に好ましい酵母発現系は、メチロトローフ酵母であるハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を使用する。メタノール上での増殖の結果、メタノール代謝の重要な酵素、すなわちＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）およびＦＭＨＤ（ホルメートデヒドロゲナーゼ）が誘導されることになる。これらの酵素は、全細胞タンパク質の最大３０〜４０％を構成することができる。ＭＯＸ、ＤＡＳおよびＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖によって誘導され、かつグルコース上での増殖によって抑制される、非常に強力なプロモーターによって制御される。これらの３つのプロモーターのいずれかまたは全部を用いてH.ポリモルファにおける高レベルの異種遺伝子の発現が得られ得る。本発明のコラーゲンをコードする遺伝子は、誘導H.ポリモルファ・プロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングされる。産物の分泌が望ましい場合、S.セレビシエ(S.cerevisiae)プレプロ交配α１因子などの、酵母における分泌についてのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、本発明のコラーゲンについてのコード配列と同じ読み枠で融合させる。発現ベクターは、好ましくは、URA3またはLEU２などの栄養要求性マーカー遺伝子を含有し、この遺伝子は、栄養要求性宿主の栄養不足を補うために用いられ得る。次いで、発現ベクターを用い、当業者に公知の技術を用いてH.ポリモルファ宿主細胞を形質転換する。H.ポリモルファ形質転換の興味深い有用な特徴は、最大１００コピーの発現ベクターのゲノムへの自発的な組込みである。大部分の場合、組み込まれたＤＮＡは、頭−尾配置を示す多量体を形成する。組み込まれた外来ＤＮＡは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株において有糸分裂的に安定であることがわかっている。この高コピー組込みの現象が、その系の高生産力にさらに加わる。植物発現ベクターを用いる場合、本発明のコラーゲンをコードする配列の発現は、多数のプロモーターの何れかによって誘導され得る。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター(Bri ssonら，Nature 310:511-514(1984)またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら，EMBO J．6:307-311(1987)）を用いることができ；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットなどの植物プロモーター(Coruzziら，EMBO J．3:1671-1680(1984));Broglieら，Science 224:838-843(1984);または熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell Biol．6:559-565(1986)を用いることができる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて植物細胞内に導入することができる。そのような技術の概説として、例えば、Weissbach & Weissbach，Met hods for Plant Molecular Biology，Academic Press，ニューヨーク，第VIII節，pp.421-463(1988);およびGrierson & Corey，Plant Molecular Biology，第２版，Blackie，ロンドン，第７−９章(1988)を参照されたい。本発明のコラーゲンを発現させるのに用いることができる別の発現系は、昆虫系である。１つのそのような系においては、オートグラファ・カリフォルニカ(A utographa californica)核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて外来遺伝子を発現させる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spo doptera frugiperda)細胞中で増殖する。本発明のコラーゲンについてのコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば多角体遺伝子）にクローニングすることができ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多角体プロモーター）の制御下に置かれ得る。コラーゲンコード配列の挿入が成功した場合、多角体遺伝子が不活性化され、非閉塞性(non-occluded)組換えウイルス（すなわち多角体遺伝子によってコードされるタンパク様の外殻がないウイルス）が産生される。次いで、これらの組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダ細胞に感染させ、そこにおいて挿入された遺伝子が発現する（例えば、Smithら，J．Virol．46:584(1983 );Smith，米国特許第4,215,051号参照）。哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づいた発現系が利用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、本発明のコラーゲンについてのコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよび三文節リーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子はin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）における挿入の結果、感染宿主において生存可能且つコラーゲンを発現することが可能な組換えウイルスになる（例えばLogan & Shenk，Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）81:365 5-3659(1984)）。一方、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを用いてもよい（例えばMackettら，Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）79:7415-7419(1982);Mackettら， J．Virol．49:857-864(1984);Panicaliら，Proc．Natl．Acad．Sci．79:4927-49 31(1982)参照）。挿入されたコラーゲンコード配列の効率のよい翻訳には、特異的な開始シグナルも必要であり得る。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含むコラーゲン遺伝子全体を適切な発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要ではない。しかしながら、コラーゲンコード配列の一部分のみを挿入する場合、 ATG 開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを付与しなければならない。さらに、確実に挿入断片全体を翻訳するために、開始コドンはコラーゲンコード配列の読み枠を有する相内に存在しなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の種々の起源由来のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって高められ得る（Bittnerら，Methods in Enzymol．153:516 -544(1987)参照）。本発明のコラーゲンの組換え産生のための一つの好ましい発現系は、トランスジェニック非ヒト動物におけるものであり、この場合、コラーゲンはそのトランスジェニック動物の乳から回収され得る。そのような系は、本発明のコラーゲンをコードするＤＮＡ配列を、プロモーター、および乳腺における発現をもたらすことが可能なその他の必要なまたは任意の調節配列に作動可能に連結することによって構築される。同様に、とりわけ米国特許出願第08/037,728号に記載されているように、標的乳タンパク質産生乳腺細胞において実施可能な適当な発現系を用いて、必要なまたは任意の翻訳後酵素が標的細胞内に同時に産生され得る。乳中に発現させるために、プロモーターは、好ましくは、αＳ１−カゼインまたはβ−ラクトグロブリンなどの豊富な乳特異的タンパク質の中の一つから選択される。例えば、ヒトラクトフェリンｃＤＮＡの発現のために、αＳ１−カゼインの５’および３’調節配列が好結果に用いられており、同様に、β−ラクトグロビンプロモーターによって、ヒツジ乳産生細胞中でヒト抗トリプシン遺伝子断片の発現がもたらされている（Wrightら，Biotechnology 9:830-833(1991)）。トランスジェニックヤギにおいては、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の発現のために、ホエー酸プロモーターが用いられており、その結果、トランスジェニックヤギの乳中にヒト組織プラスミノーゲン活性化因子が分泌されることになる（Ebertら，Biotechnology 9:835-838(1991)）。このような発現系を用いると、乳中に本発明のコラーゲンを分泌する動物が得られる。当業者に周知の手法を用いて、所望のコラーゲン鎖をコードする遺伝子を、選択された動物種の乳細胞において機能する適当な調節配列に簡単に連結することができる。必要とされる翻訳後酵素をコードする遺伝子についての発現系は、類似の方法で構築される。好ましくは、本発明のコラーゲンは分泌タンパク質として発現する。タンパク質の発現に用いる操作された細胞が非ヒト宿主細胞である場合、コラーゲンタンパク質のヒト分泌シグナルペプチドを、宿主細胞の分泌ターゲティング機構によってより効率的に認識される別の分泌シグナルペプチドで置換するのが都合がよいことが多い。その適切な分泌シグナル配列は、哺乳動物遺伝子の最適な真菌発現を得ることにおいて特に重要である。例えば、メチロトローフ酵母においては、読み枠内S.cerevisiae ａ−交配因子プレプロ配列をコードするＤＮＡ配列は、コード配列のアミノ末端に挿入され得る。ａＭＦプレプロ配列は、ａＭＦ前駆体分子に含まれるリーダー配列であり、タンパク質分解プロセッシング及び分泌に必要なlys-argコード配列を含む（Brakeら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，8 1:4642(1984)参照）。さらに、挿入された配列の発現をモジュレートし、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択してもよい。そのようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、そのタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的で特異的な機構を有している。発現した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確保するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適当なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化についての細胞機構を有する真核宿主細胞が用いられ得る。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等が挙げられる。さらに、コラーゲン分子の正確なプロセッシングを確保するために、宿主細胞は、種々の酵素を発現するように操作され得る。例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼの遺伝子が、宿主細胞においてコラーゲン遺伝子とともに共発現され得る。組換えタンパク質を長期にわたって高収量で産生させるには、安定な発現が好ましい。例えば、本発明のコラーゲンを安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって調節されるコラーゲンをコードするＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させて、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を付与するものであり、細胞におけるその染色体へのプラスミドの安定な組み込みを可能にし、増殖して順番に細胞系にクローニングされ、拡大され得るフォーカスを形成する。この方法は、所望のコラーゲンを発現する細胞株の操作に都合よく用いられ得る。多数の選択系を用いてもよく、限定するものではないが、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，Cell 11:223(1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 48:2026(1962))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら，Cell 22:817(1980))遺伝子は、それぞれ、tk-、hgprt-またはap rt-細胞中で用いることができる。また、dhfr（メトトレキセートに対する耐性を付与する）(Wiglerら，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567(1980);O'Haraら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527(1981))；gpt（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）(Mulligan & Berg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072(1981)) ；neo（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）(Colberre-Garap inら，J．Mol．Biol．150:1(1981))；およびhygro（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）(Santerreら，Gene 30:147(1984))についての選択の基礎としてアンチメタボライト抵抗性も用いることができる。最近、さらなる選択遺伝子、すなわちtrpB（細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させる）； hisD（細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させる）(Hartman & Mul ligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047(1988))；およびＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤に対する耐性を付与する）、２−（ジフルオロメチル）−DL-オルニチン、ＤＦＭＯ(McConlogue L.，分子生物学における最新情報(In:Current Communication in Molecular Bi ology)，Cold Spring Harbor Laboratory編(1987))が記載されている。Ｃ．本発明のコラーゲンタンパク質を発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定ならびに発現タンパク質の精製コード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的なアプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞におけるコラーゲンｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写のレベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイまたはその生物学的活性によって測定される遺伝子産物の検出、によって同定され得る。第１のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入されたコラーゲンコード配列の存在を、コラーゲンコード配列、またはその一部若しくは誘導体に相同のヌクレオチド配列を含むプローブを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。第２のアプローチにおいては、組換え発現ベクター／宿主系を、ある「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体形成(occlusion body formation)など）の有無に基づいて同定し、選択することができる。例えば、コラーゲンコード配列がそのベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、コラーゲンコード配列を含有する組換え細胞は、そのマーカー遺伝子機能が無いことによって同定することができる。一方、マーカー遺伝子は、コラーゲンコード配列の発現を制御するために用いられる同一または異なるプロモーターの制御下でコラーゲン配列とタンデムに置くことができる。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、コラーゲンコード配列の発現を示すものである。第３のアプローチにおいては、コラーゲンコード領域の転写活性をハイブリダイゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡを単離してコラーゲンコード配列またはその特定の部分に相同のプローブを用いてノザンブロットによって分析することができる。一方、宿主細胞の全核酸を抽出してかかるプローブへのハイブリダイゼーションをアッセイしてもよい。第４のアプローチにおいては、例えば、ウェスタンブロット、放射性免疫沈降、酵素結合イムノアッセイなどのイムノアッセイなどによってコラーゲンタンパク質産物の発現を免疫学的に評価することができる。発現した本発明のコラーゲンは、好ましくは培養培地に分泌されるが、例えばクロマトグラフィーによって均一に精製される。１つの実施態様においては、組換えコラーゲンタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む当該分野で公知のその他の精製技術も用いることができる。Ｄ．本発明のコラーゲンおよび操作された細胞株の使用１．抗体産生およびスクリーニング組換え的に産生させたコラーゲンのエピトープに対する抗体の産生には、当該分野で公知の種々の手法が用いられ得る。このような抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリによって産生されるフラグメントが挙げられる。抗体を産生させるために、コラーゲンタンパク質を注射することによって種々の宿主動物（限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられる）が免疫化され得る。宿主種に依存して、種々のアジュバントを用いて免疫応答を増強させ得る。アジュバントとしては、限定するものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン(polyanions)、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌(Bacilli Calmette-Guerin)）およびコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium pa rvum)などの有用である可能性のあるヒトアジュバントが挙げられる。コラーゲンに対するモノクローナル抗体は、培養における無限細胞株による抗体分子の産生をもたらすあらゆる技術を用いることによって調製され得る。このような技術としては、限定するものではないが、KoehlerおよびMilstein(Nature ， 256:495-497(1975))によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら，Immunology Today，4:72(1983);Coteら，Proc.N atl．Acad．Sci.，80:2026-2030(1983))；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(C oleら，モノクローナル抗体および癌治療(Monoclonal Antibody and Cancer The rapy)，Alan R．Liss社，77頁-96頁(1985))が挙げられる。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる、「キメラ抗体」(Morrisonら，Proc．Natl．Acad．Sci．81:6851-6855(1984);Neubergerら，Nature，312:604 -608(1984);Takedaら，Nature 314:452-454(1985))を産生させるため開発された技術を用いることができる。一方、１本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を適用してコラーゲン特異的１本鎖抗体を産生させることができる。特異的結合部位の欠失を含む抗体フラグメントは、公知の技術によって作製され得る。そのようなフラグメントとしては、限定するものではないが、例えば、抗体分子のペプシン消化によって生成させることができるF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成させることができるFabフラグメントが挙げられる。一方、Fab発現ライブラリーを構築して(Huseら，Science 246:1275-1281(1989))、目的のコラーゲンに対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの同定を迅速且つ容易に行うことができる。２．本発明のコラーゲンタンパク質の治療的使用本発明の別の局面は、本発明のコラーゲンタンパク質を用いて免疫系介在疾患を治療する方法を提供することである。本明細書中で病気に関して用いられる「治療」または「治療する」という用語はいずれも、予防および個体にすでに存在する症状の改善の両方をいう。病気の発症を予防し、病気に関連した症状を緩和することにおいて治療が完全に有効である必要はないということを、当業者は認識するであろう。患者にとっては、症状の重篤度の低減、発症の遅延、または症状の重篤度の進行の遅延が望ましい。所与の免疫系介在疾患が発生する危険のある人々は、免疫系介在疾患の発症の可能性を示唆する種々の要因、例えば家族暦、遺伝マーカー、初期症状などの何れかに基づいて予防的に治療され得る。主題の方法によって治療され得る免疫系介在疾患としては、限定するものではないが、慢性関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、自己免疫聴覚疾患、細菌またはウイルス感染による軟骨炎症（例えばライム病）、寄生虫病、滑液包炎、角膜疾患、および強直性脊椎炎（脊椎の固定）が挙げられる。本発明の主題の方法は、本発明の組成物、例えばコラーゲン、コラーゲン誘導体を有効量投与する工程を包含する。特異的免疫系介在疾患の治療に使用する好ましい組成物は、上記の節で記載したように、IX型コラーゲンの融合タンパク質であり、好ましくは IX型コラーゲンサブユニットとII型コラーゲンおよび／またはXI型コラーゲンのキメラ、ならびにその誘導体およびサブユニットである。主題の方法の好ましい実施態様においては、被験者に投与される組成物は、不定にグリコシル化されたコラーゲンを含む。主題の方法において投与される組成物は、活性成分、すなわちコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が腸、例えばパイエル板またはその他の同様の部位のリンパ系組織に接触するように、免疫寛容が誘導されるように投与される。そのような投与は、多くの可能な方法の中の一つによって、経口投与用に、すなわち、活性成分が適切な腸リンパ系組織に接触する前に口、胃、または消化系のその他の部分内で破壊または不活性化されないように設計される主題の組成物を含む処方物の使用を通じて行われ得る。また、本発明の治療方法は、抗炎症剤などの免疫系介在疾患の治療用のさらなる医薬化合物を投与する工程も含み得る。主題の組成物を投与するときの用量は、広範囲に変わり得るものであり、例えば炎症の重篤度、患者の年齢などの種々の要因に依存するであろうし、個別的に調節する必要があるだろう。１日に投与され得るコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の量の可能な範囲は、約０．００１ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であり得る。投与されるコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体の量は少ないのが好ましく、それによってクローンアネルギーよりもむしろ抑制によって免疫寛容の誘導を与える。コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を含有する医薬組成物は、それらが単回投与単位または多数回投与単位のいずれかとしてかかる範囲内の用量を与えるように適切に処方され得る。本発明の方法における使用のための免疫寛容誘導組成物の最適用量は、多数の要因にしたがって変わるであろう。本明細書において用いられる「用量」という用語は、特に示さない限り、組成物の単回投与のみをいうだけでなく、選択された期間にわたって投与され、多数回の個々の投与を含む所与の医薬組成物の合計量をいうためにも用いられ得る。最適用量に影響を及ぼす要因としては、患者に投与するコラーゲン分子（および／またはコラーゲン誘導体）の選択、選択される特異的粘膜結合分子、患者の年齢、病気の重篤度、患者に存在し得るその他の病気、処方物中の不活性成分、アジュバントなどが挙げられる。所与の免疫障害を治療するのに有効な用量範囲にはかなりの変動があり得る。同一の医薬組成物の用量の違いによって、異なる機構による所望の免疫寛容作用を生じさせ得る。本発明の操作は、操作の特定の理論には依存しないが、当業者は、経口寛容が介在する２つの主要な機構があると考えられるということを認識することによって、本発明をより理解し、さらなる実施態様を提供するであろう。経口寛容は、免疫寛容が成立した抗原に特異的なリンパ球の活性化および増殖を調節Ｔ細胞が抑制する活性細胞抑制によって媒介され得る。経口寛容誘導のもう一つの機構は、適当な受容体を有するＴリンパ球を不応答にするクローンアネルギーである。一般的に、活性抑制寛容は、「低」用量の寛容抗原によって与えられ、クローンアネルギーは、相対的に「高」用量の同じ寛容抗原によって与えられる。経口寛容誘導についての原理および技術の総説は、Weinerら，Annual Review of Immunol ogy，809頁-835頁，Annual Review(1994)に見出すことができる。主題の組成物は、粘膜表面への一定の投与形態、例えば経口、局所、吸入に適合するように医薬組成物として処方され得る。経口投与のための好ましい処方形態は、組成物中のコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体が腸リンパ系組織、例えばパイエル板との接触に至るような処方形態である。本発明の組成物は、もとの化合物の状態、または必要に応じて薬学的に許容できるその塩の状態にあるコラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体を、固体、半固体または液体の希釈剤または摂取用カプセル剤であり得る薬学的に許容できる担体とともに含有する医薬組成物の状態で（そのような製剤も本発明の更なる側面を含む）、注射または吸入によって、局所的、経口的、鼻腔内的に投与され得る。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体ならびに粘膜結合性コラーゲン複合体も、担体材料とともに用いられ得る。医薬製剤の例としては、錠剤、点鼻液などの滴剤、軟膏などの局所施用用製剤、ゼリー剤、クリーム剤および懸濁剤、吸入用エアロゾル剤、鼻内スプレー、リポソームなどが挙げられ得る。通常、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体は、製剤の０．０５〜９９重量％または０．１〜９９重量％含まれ、例えば、注射の場合は製剤の０．５〜２０％であり、経口投与の場合には製剤の０．１〜５０％である。本発明の化合物を含有する経口施用用にこのような形態も用量単位で医薬製剤を製造するために、活性成分は、例えばラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、アミロペクチンなどのデンプン、コンブ杆粉末またはカンキツ類果肉粉末、セルロース誘導体またはゼラチンなどの固体の粉状担体と混合してもよく、また、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどの滑剤、またはカーボワックスもしくはその他のポリエチレングリコールワックスを含んでいてもよく、錠剤または糖衣丸用のコアを形成するために圧縮される。糖衣丸が要求される場合、コアは、例えばアラビアゴム、タルクおよび／または二酸化チタンを含有し得る濃縮糖溶液でコーティングし得るものであり、または、易揮発性の有機溶媒または有機溶媒の混合物に溶解した被膜剤でコーティングし得る。このコーティングには、例えば活性物質の含量の違いを区別するために、染料を添加することができる。ゼラチンおよび例えば、可塑剤としてのグリセロールからなる軟ゼラチンカプセル剤、または同様の密封カプセル剤の調製のために、活性物質をカーボワックスまたは安定な油、例えばゴマ油、オリーブ油、またはアラキス油(arachis o il)と混合してもよい。硬ゼラチンカプセル剤は、活性物質の顆粒を、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えばジャガイモデンプン、トウモロコシデンプンもしくはアミロペクチン）、セルロース誘導体またはゼラチンなどの固体の粉状担体とともに含んでいてもよく、また、滑剤としてステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸を含んでいてもよい。また、本発明の組成物は、徐放性を与えるように処方してもよい。いくつかの層の活性薬物を用いることにより、コーティングをゆっくりと溶解させることにより分離される徐放性錠剤が得られ得る。徐放性錠剤を調製する別の方法は、活性薬物の用量を異なる厚さのコーティングを有する顆粒に分け、それらの顆粒を担体物質とともに錠剤状に圧縮するという方法である。また、コラーゲンおよび／またはコラーゲン誘導体ならびに粘膜結合コラーゲン複合体は、例えば、脂肪物質およびろう物質から作られたゆっくりと溶解する錠剤中に取り込ませてもよく、生理学的に不活性な可塑性物質などの不溶性物質の錠剤に一様に分散させてもよい。胃液中への活性物質の放出および分解の可能性を防止するように設計される錠剤、カプセル剤などの経口製剤の用量単位を得るために、錠剤、糖衣丸等に、腸溶コーティング、すなわち、胃液中の酸性ｐＨで溶解しないような特性を有する胃液耐性腸溶フィルムまたはコーティングの層を付与してもよい。したがって、活性物質は、その製剤が腸に到達するまで放出されないであろう。このような公知の腸溶コーティングの例としては、商品名ＨＰ５５およびＨＰ５０ならびにＥｄｒａｇｉｔ（登録商標）およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）で市販されているようなセルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースフタレートが挙げられ得る。経口施用用の液剤は、エリキシル剤、シロップ剤または懸濁剤の剤形であり得る。例えば溶液は、約０．１〜２０重量％の活性物質、糖および混合物またはエタノール、水グリセロール、プロピレングリコールおよび任意の香気、分散剤としてサッカリンおよび／またはカルボキシメチルセルロースを含有する。 VI．実施例本発明は、下記の実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。この実施例は、本発明の単なる例示のためのものである。Ａ．実施例１：ピヒア・パストリスにおける組換えα３（IX）コラーゲンサブユニットの発現プラスミドp545およびｃＤＮＡライブラリクローンRB410由来のα３（IX）コラーゲンｃＤＮＡコード配列の増幅用ＰＣＲプライマーを調製する。プライマーは、それらがα３（IX）コラーゲンコード配列の５’および３’末端にEco RI部位を導入するように設計され、唯一の制限酵素部位を用いてこれらの２つのクローンに見出される半分のコード配列２つを結合する。プライマー１およびプライマー２を用い、Ausubelら，分子生物学における最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates and Wiley Intersciece，N.Y.(1990)に記載されているような標準的なＰＣＲ条件を用いて、プラスミドp545由来のα３（IX）コラーゲンについての成熟アミノ末端コード配列を増幅させる。プライマー３およびプライマー４を用いて、上記のｃＤＮＡクローンRB410由来の停止コドンを含む残りのｃＤＮＡコード配列を増幅させる。得られるＰＣＲ産物を、選択した唯一の制限エンドヌクレアーゼ及びEcoR Iを用いて消化する。市販の発現ベクターpPIC9(Invitrogen，San Diego，CA)（これは、ピヒアパストリスにおいて分泌発現を指令する）を制限エンドヌクレアーゼEcoR I、その後子ウシ腸ホスファターゼ(Pharmacia)で消化し、次いで７０℃で５分間熱変性する。消化されたＰＣＲ産物およびpPIC9ベクターを実施例３に記載したようにしてゲル精製し、三系(three-way)ライゲーションを行う。コンピテントエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)に形質転換した後、正しく連結されたプラスミドを制限酵素分析によって同定し、市販のピヒア属配列決定プライマー(Invitro gen,San Diego,CA)を用いて配列決定することによって確認する。 α３（IX）ピヒア属発現ベクターを線状化し、これを用いてプロリル−４−ヒドロキシラーゼをも発現するhis4ピヒア・パストリス株のスフェロプラストを形質転換する。形質転換体をヒスチジン欠損培地上で同定し、メタノール培地上でゆっくりと増殖させることによりAOX１遺伝子の消失をアッセイすることによって確認する。α３（IX）遺伝子の発現を唯一の炭素源としてのメタノール上で細胞を増殖させることによって誘導する。α３（IX）コラーゲンサブユニットタンパク質が増殖培地中に分泌され、続いて標準的な遠心分離、濾過およびクロマトグラフィー技術を用いて精製する。Ｂ．実施例２：ピヒア・パストリスにおける三量体ヒトIX型コラーゲンの発現同様の方法で、α３（IX）コラーゲンサブユニットを産生するピヒア・パストリス株を操作して同一の細胞中にα１（IX）およびα２（IX）コラーゲンサブユニットを共発現させる。Ｃ．実施例３：スポドプテラ・フルギペルダSf9昆虫細胞における三量体ヒトI X型コラーゲンの発現組換えα１(IX)、α２(IX)およびα３(IX)構築物ならびに改変したオートグラファ・カリフォルニカ核多角体ウイルスＤＮＡを、バキュロゴールドトランスフェクションキット(Pharmingen)を用いてスポドプテラ・フルギペルダSf9昆虫細胞中に共トランスフェクトすることによって、３つの組換えウイルスを作製した。３つのａ（IX）鎖を構築するのに用いた配列は、van der RrestおよびMayne，コラーゲン型の構造および機能(Structure and Function of Collagen Types)(M ayne，R．およびBurgeson，R.編集)Academic Press，Orland，FL，185頁-221頁( 1987)に開示されている。得られたウイルスプールを集めて、増幅させ、Gruenwa ld，S.およびHeitz，J.,バキュロウイルス発現系:手順および方法マニュアル(Ba culovirus Exression System:Procedures and Methods Manual)，Pharmingen，S an Diego，CA(1993)に記載のようにしてプラーク精製した。スポドプテラ・フルギペルダSf9昆虫細胞を、１０％胎仔ウシ血清(BioClear) を補給したＴＮＨ−ＦＨ培地中で、単層として２７℃にて培養した。約５×１０⁶ 昆虫細胞に、組換えヒトα１（IX）、α２(IX)およびα３(IX)構築物ならびにヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼを感染させた。IX型コラーゲンα鎖についてのウイルスは、プロリル４−ヒドロキシラーゼウイルスの２〜３倍、過剰に用いた。アスコルビン酸塩８０μｇ／ｍｌを毎日培養培地に添加した。感染の７２時間後、培養培地を除去し、細胞層を、pH7.4の0.15 NaClおよび0.02Ｍリン酸塩を含む溶液で１回洗浄した。細胞を、0.5酢酸、0.75Ｍ NaCl、10mM ＥＤＴＡおよび１ｍＭＰＭＳＦを含むpH2.5の氷冷溶液1.4ｍｌ中に掻き取ることによって採収した。次いで、細胞をホモジナイズし、15000×ｇで２０分間遠心分離した。N aClを最終濃度１．２Ｍで用いて試料を４℃で１２時間混合することによって上清を沈殿させた。沈殿を15000×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。得られたペレットを冷５０ｍＭ酢酸500μｌ中に４℃にて３時間かけて溶解させた。試料１５μ ｌを、非還元または還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブリリアントブルーで染色することによって分析した。また、この材料を、ペプシンで２２℃にて４時間かけて消化し、ペプシン耐性組換えIX型コラーゲンの熱安定性を、Bucknerら，A nal．Biochem 110:360-368(1981)に記載されたようにトリプシンおよびキモトリプシンの混合物を用いる急速消化によって測定した。得られた材料を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、三重ヘリックスコラーゲンに対する抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。その結果は、図２に示したように等量のα１（IX）、α２(IX)およびα３(IX) 鎖からなる約３００kDAのヘテロ三量体（図１）としての、ヒトIX型コラーゲンの発現を示すものであった。この組換えヒトIX型コラーゲンの熱安定性を、短時間のプロテアーゼ消化後に分析した。組換えヒトIX型コラーゲンはの熱安定性は４０℃以上であった。Ｄ．実施例４：キメラII／IX／XI型コラーゲン分子のクローニングおよび発現上記のα３(IX)ピヒア属発現ベクターを、キメラII／IX／XI型コラーゲン分子の発現を指令するように改変する。具体的には、このベクターをα３(IX)コラーゲンコード配列の５’または３’のいずれかで切断し、II型コラーゲンについてのコード配列をインフレームに挿入する。さらに、このベクターを再度５’、３ ’のいずれか、またはII型およびIX型コード配列の間で切断し、キメラII／IX／ XI型コラーゲン分子を発現するようにXI型コラーゲンをコードする配列も正確な読み枠内に挿入する。コンピテントE.coliの形質転換体を、制限酵素消化することによって所望の方向を有するプラスミドに対してスクリーニングし、上記のように配列決定することによって確認する。当業者には本明細書に示され、記載されたものに加えて、前述の記載から種々の改変が明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。また、ヌクレオチドに与えた全塩基対サイズはおおよそのものであり、説明のために用いたものであることも理解されるであろう。本明細書中に引用した全ての参考文献が、参考として本明細書に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ネフ，トマス，ビー. アメリカ合衆国 94025 カリフォルニア州アセルトングレンウッドアベニュー 190 (72)発明者アラーコッコ，リーナフィンランド国エフアイエヌ−90220 ウール，カジャニンチェ 52エー，ユニバーシティーオブウール

Claims

【特許請求の範囲】１．異種ペプチド配列に結合したヒト型IXコラーゲンを含む、融合タンパク質。２．前記異種ペプチド配列がII型コラーゲンを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。３．前記異種ペプチド配列がXI型コラーゲンを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。４．前記異種ペプチド配列がII型およびXI型コラーゲンを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。５．組換えヒト融合タンパク質の産生方法であって、以下：（ａ）該融合タンパク質を発現する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び（ｂ）該細胞培養物から該融合タンパク質を回収する工程を包含する方法。６．ヒト組換えIX型コラーゲンを含むタンパク質。７．組換えヒトIX型コラーゲンを産生する方法であって、（ａ）該IX型コラーゲンを発現する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び（ｂ）該細胞培養物から該IX型コラーゲンを回収する工程を包含する方法。