JPH05509301A - 肺胞界面活性タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛　ンバク 皮血豆上 本発明は、特定の呼吸疾患の治療に有用な肺胞界面活性タンパク質（ＡＳＰ）一 般に関する。

！量艮歪 ヒトの肺は多数の小さな嚢すなわち肺胞よりなり、この肺胞中で血液と肺の気室 との間でガスが交換される。健康な個体では、この交換は、ＩＩ型の肺胞細胞の ミクロソーム膜中で合成されるタンパク質含有界面活性複合体の存在により媒介 される。この複合体が適正なレベルで存在しない場合には、肺は適切に機能し得 ない。すなわち、肺胞が排気中に崩壊し、そして引き続く吸気により再膨張し得 ない。従って、この複合体の合成不全を治療せずに放置すると、死または重度の 身体的損傷を引き起こし得る。

界面活性複合体のレベルが不十分な例として最も多く報告された症例は、未熟児 または複合妊娠（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ　ｐｒｅｇｎａｎｃｆｅｓ）後に生ま れた乳児に起こり、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）として広く知られている。この症 候群の広く公表されている形態はビアリン膜症、または特発性ＲＤＳと呼ばれて いる。ＲＤＳは現在米国および他の先進国の幼児の死亡および罹患の最大の原因 であり、診断および治療に向けて多大な努力がなされている。現在の治療は、機 械的な（加圧）換気に集中しており、この方法は良くても侵襲性の一時しのぎの 方法に過ぎず、肺の損傷および例えば気管支肺形状異常症、間質性気腫、および 気胸症などの合併症を含む他の有害な副作用をもたらすことが多い。この治療を 用いると、精神遅滞が起こる場合もある。　（Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、ら、Ｐｅ ｄｉａｔｒｉｃ　Ｃ１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒ辷胆（１９８２） 　２９：１０５７−１０７５゜）界面活性物質の置換によりこの症候群を治療す る試みが限定されたものであるがなされている。この方法は一般に、投与は１回 だけでよいため優良な方法であり、損傷の可能性は低減する。例えば、Ｆｕｊｉ ｖａｒａら、ハ匹虹（１９８０）　１：５５は、ウシの肺由来のタンパク質欠損 の界面活性物質調製物を使用し、一方、Ｈａｌｌｌａｎ、　Ｍら、ム■■且ａｓ 　（１９１１３）　７１：４７３−４８２はヒトの羊水から単離した界面活性物 質を使用して、限られた数の乳児の治療を行い、ある程度の成功を治めている。

Ｃ１ｅ＋＋ｅｎｔｓの米国特許第４．３１２．８６０号は、タンパク質を含有し ない合成界面活性物質を開示し、データは示していないがこの方法に有用である としている。要約すると、界面活性物質置換は臨床的に広く使用されてはいない 。

好適な界面活性置換物質は、肺の界面活性複合体自体である。この複合体、はア ポタンパク質、大量に存在する２つのりん脂質（ジパルミトイルホスホコリン（ 、ＤＰＰＣ）およびホスファチジル−グリセロール（ＰＧ））、極めて僅かな量 で存在するいくつかの脂質成分、およびカルシウムイオンからなる。

アポタンパク質は、分子量３２，０００ダルトンのタンパク質、および約１０． ０００ダルトンの疎水性の強いタンパク質を含有する（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、ら 、組ユ」ｎ■ユ（１９７３）　２２４ニア８８−７９５）。この３２、０００ダ ルトンのタンパク質はグリコジル化され、ヒドロキシブコリンを含有する。

界面活性物質置換療法の進歩が制限されている主な理由は、複合体のタンパク質 部分が入手し得ないためであった。置換療法は、脂質成分単独を使用する試みに 集中しており、このような治療の成績は、アポタンパク質の添加により著しく向 上し得るようである（　Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｃ１１ ｎｉｃｓ　ｏｆＮｏｒｔｈ　ＡＩＩＩｅｒｉｃａ　（１９８２＞　（前出））。

しかし、現在のところ、これらのタンパク質は正常なヒト成人の肺から、および 羊水からしか入手し得ない。効率的な単離方法によっても、十分な供給を提供し 得ない。従って、単独でまたは複合体の飽和りん脂質部分との結合で使用するた めの、実用的な量のアポタンパク質を製造する方法の実現が望まれている。

関連するＰＣＴ特許出願第ＷＯ３６７０３４０８号は、約３２ｋｄのヒトＡＳＰ タンパク質の組み換えによる製造、種々のイヌＡＳＰタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列の回収、および約１０ｋｄの分子量のヒトＡＳＰタンパク質グループの １つの代表例の回収を開示している。

十分な治療に使用するためにｒ　ｌ０ＫＪグループの効率的な製造が必要である ことが現在では明白である。

１９８７年１１月５日に公表された別の関連するＰＣＴ特許出願第ＶＯ３７７０ ６５８８号は、これらＩＱＫタンパク質およびこれらをフードするＤＮＡに関す るさらなる記載を与えている。該出願の表１および２は、イヌおよびヒトの５Ｐ −１８由来タンパク質の前駆体をコードする全長ｃＤＮＡを示している。成熟ヒ トタンパク質は、この全長配列のコドン２０１でコードされるフェニルアラニン 残基から開始されることが記載されている。哺乳類および細菌の細胞の両方の中 での、５Ｐ−１８前駆体の発現のためのベクターの構築が詳細に記載されている 。哺乳類の細胞中での全長前駆体の発現は、４３ｋｄおよび２５ｋｄの前駆体タ ンパク質を与えることが、５ＤＳ−ＰＡＧＥで判明した。この２５ｋｄの生成物 は、この配列内にコードされたＰｈｅ−２０１からＧｌｕ−３８１にわたる、１ ８１アミノ酸配列のグリコジル化した形態であると記載されている。

前駆体の成熟形態のより均一な製造に有用となり得る開裂部位を提供するための ヒトタンパク質の特定の改変した形態もまた記載されている。５Ｐ−１８ｃＤＮ Ａの細菌による発現もまた記載されている。

ＰＣＴ特許出願第［０１１７１０８５８８の図５および６は、５Ｐ−５と命名さ れた５ｋｄ−８ｋｄの分子量が小さい方のタンパク質の前駆体をコードする２つ のｃＤＮＡクローンのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示している。５Ｐ−１８ ｃＤＮＡと同様に、これらのクローンは、単離サレタ５ｋｄ−８ｋｄの分子量が 小さい方のタンパク質の前駆体をコードすることが開示されている。推定のＮ− 末端は、この配列のコドン２４および２５のＰｈｅまたはＧｌｙであると述べら れている。

これらのタンパク質の成熟Ｃ−末端は、８ｋｄタンパク質ではＧｌｎ−１０８で あり、そして５ｋｄタンパク質ではＧｌｕ−８０またはＴｈｒ−６５であると推 定されている。哺乳類および細菌の細胞中でのこのｃＤＮＡの発現もまた記載さ れている。

上記の２つのＰＣＴ出願、ＷＯ３６１０３４０８およびＷＯ１１７１０６５８８ を本明細書では参考文献として援用する。

本出願は、肺胞界面活性タンパク質として有効な種々の５Ｐ−５関連ペプチドを 記載する。これらの５Ｐ−５類似体および断片は、化学合成により、または組換 法により調製し得、呼吸器疾患および徴候（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｉｅｓ）の 治療に有用な肺胞界面活性タンパク質に属する特定の構成物を提供する。

本出願の親出願である米国特許出願第０７７１１７．００９号もまた、１０にグ ループのタンパク質を幾分詳細に記載している。その出願の開示の全体を本明細 書ではに参考文献として援用し、本明細書では明確に記載または説明していない 物質は該出願を参考とされたい。本出願は、ヒト５ｐ−ｓタンパク質のさらなる 研究に基づき、特に、ＡＳＰ活性を有することが判明したタンパク質の類似体に 関する。本出願で記載し、特許請求した類似体は、天然ポリペプチドの安定性お よび生物学的活性を保持しているのに加え、天然の５ｋｄタンパク質よりも凝集 しにくい。

発」１Ｑ１Ｌ玉 本発明は、特定の形態のヒ）ＳＰ−１８および５Ｐ−５由来のタンパク質を提供 する。コードされた配列の類似体であるこれらのタンパク質のいくつかは、天然 タンパク質に比べて、凝集性が著しく減少している。すなわち、分子内および分 子間の相互作用、主として共有結合のジスルフィドに起因する凝集が減少してい る。そのため、これらの類似体の抽出および精製は、天然ポリペプチドと比べて 非常に容易である。

本発明の５Ｐ−５由来のペプチドは、ヒト５ｐ−ｓの長さおよびアミノ酸配列の 両方を改変し得たものであるが、天然ポリペプチドの生物学的活性のみならず化 学的および物理的安定性を保持している。

本発明の別の局面では、呼吸窮迫症候群の治療用の、５Ｐ−１８および／または ５Ｐ−５関連ペプチドを含有するように処方された、薬学的組成物が提供される 。本発明は、５Ｐ−１８および／または５Ｐ−５関連ペプチドの投与により呼吸 窮迫症候群の治療方法をも包含する。

区証東１星ユ笠■ 図１は、ヒ）　５Ｐ−５由来のタンパク質（配列番号：１）および（配列番号： ２）をコードするｅＤＮＡのＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を示す。

図２は、ヒ）　５Ｐ−５由来タンパク質（配列番号：３）および（配列番号−４ ）をコードする類似のｃＤＮＡ変異体を示す。

図３は、印で示したＮ末端およびＣ末端を有する、５Ｐ−５ＤＮＡのフドン１− ７４でコードされるアミノ酸配列（配列番号：５）および（配列番号＝６）であ る。

図４は、Ｓ＋’−１８前駆タンパク質（配列番号−７）および（配列番号＝８） をコードするヒトｅＤＮＡ＃３である。

図５は、印で示したＮ末端およびＣ末端を有する、イヌの５ｋｄタンパク質のア ミノ酸配列（配列番号＝９）でアル。

図６は、ＩＯＫ　ＡＳＰ混合物（配列番号、１０）および（配列番号＝１１）中 のヒトおよびイヌの１８ｋｄタンパク質の相関を示す。

図７は、クロラムフェニコールアミノトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびヒト 心房性ナトリウム利尿タンパク質（ｈＡＮＰ）（配列番号：１２）および（配列 番号＝１３）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

図８は、ｐｃ２１０３Ｐ−Ｃ（配列番号：１４）および（配列番号＝１５）中へ の挿入物をコードするタンパク質を示す。

図９は、ＣＡＴ−ＳＰ−５融合タンパク質（配列番号：１６）および（配列番号 ＝１７）をコードするｐｃ１４９ｓＰ−ＣのＢａｍＨＩ／Ｂｉｎｄｌ１１挿入物 である。

図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関し て得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１ １は全長ヒト５ｋｄタン／ずり質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、 図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。

■を　る 定義 本明細書で用いる用語、「肺胞界面活性タン、ｆり質（ＡＳＰ）Ｊは、肺胞界面 活性複合体に関連し、以下に定義するＡＳＰ活性を有するアポタンパク質を意味 する。試験したすべての種のＡＳＰは、本明細書でｒ３２Ｋ　ＡＳＰＪと呼ばれ る、比較的高分子量（はぼ３２　ｋｄ）の１またはそれ以上の構成成分、および 、本明細書でｒｌＯＫ　ＡＳＰＪと呼ばれる、比較的低分子！（約５−２０　ｋ ｄ）の疎水性の強い構成成分を１またはそれ以上包含するようである。（Ｋｉｎ ｇ、Ｒ，Ｊ、ら、Ｊ　Ａ　Ｉ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９７７）　４２：４８３− ４９１；Ｐｈ１ｚａｃｋｅｒｌｅｙ、　Ｐ、Ｊ、Ｒ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（ １９７９）　１８３ニア３ｌ−７３６）。

哺乳類に存在することが知られている界面活性タンパク質の性質に関する、さら なる議論が、第［１ｇ？１０６５８８号に見られる。それに記載されていること を要約すると、ｒｌＯＫＪグループのタンパク質は、２つの異なるＤＮＡによっ てコードされた前駆体に由来する。５Ｐ−１８と呼ばれるこれらのＤＮＡの一方 のセットは、ゲル上の約１８　ｋｄに現れる、タンパク質の前駆体をコードする が、還元条件下では、１０　ｋｄの分子量を示す。５Ｐ−５と呼ばれるもう一方 のＤＮＡは、ゲル上で８　ｋｄまたは５　ｋｄの分子量を示すタンパク質の前駆 体をコードする。本出願の発明は、５Ｐ−１８および５Ｐ−５の前駆体タンパク 質によって生成するペプチドに関連した特定のペプチドに関する。

あるタンパク質のｒ　ＡＳＰ活性」は、脂質のみ、または、脂質および他のタン パク質と共に組み合わされた場合に、Ｒｏｂｅｒ　ｔｓｏｎ、　Ｂ、、　−（１ ９８０）　１５８：５７−６８のインビボアッセイで活性を示す能力と定義され る。このアッセイでは、評価すべき試料を、帝王切開術によって未熟児の状態で 出産させたウサギの胎児または子羊の胎児に、気管内チューブを通して投与する 。（これらの「未熟児」は当身のＡＳＰを欠き、人工呼吸器で維持されている。

）肺の伸縮性、血液ガスおよび人工呼吸器の圧力の測定により、活性の指数を得 る。例えば、Ｋｉｎｇ、　Ｒ。

Ｊ、ら、　Ａｍ上」工■ユｏｌ　（１９７２）　２２３ニア１５−７２６１ｉ： 記載の、マタハ、ＨａｖｇｏｏｄらのＰＣＴ出願第ＷＯ３７１０６５１１８号に 記載され、説明されているインビトロアッセイにより、活性の予備評価を行い得 る。

後者は、タンパク質をリン脂質小胞調製物と混合した時の、空気−水の界面の表 面張力の直接測定を利用している。本明細書に記載し、特許請求した、５Ｐ−１ ８および５Ｐ−５由来ペプチドは、すべてＡＳＰ活性を示す。

本発明のｒ　ｈＳＰ−５由来ペプチド」は、図１および２に示すヒ）　５Ｐ−５ ＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列に基づくペプチド、特に、図３に示す 前駆体アミノ酸配列の部分をコードし、且つ、上記で定義したＡＳＰ活性を有す る部分を含む。これらの５Ｐ−５ペプチドあるいは薬学的に許容され得るその塩 あるいはアミドは以下のアミノ酸配列で定義される：ここで、ＡＡ２．はＣｙｓ あるいはＳ　ｅ　ｒ　ｓＡＡ２ｇはＣｙｓあるいはＳｅｔ。

ＡＡ３．はＰｒｏあるいはＡｌａ、 ＡＡ３．はＶａｌあるいはＧｉｎ。

ＡＡ３２はＨｉｓあるいはＬｙ　ｓ。

ＡＡ３３はＬｅｕあるいはＡｌａ。

Ａ　Ａ　３ａはＬｙｓあるいは０１１１％ＡＡ３ＳはＡｒｇあるいはＧｉｎ。

Ｚは、Ｖａｌあるいはｌｉｅのいずれか、Ｙは０１１．　Ｇｕｙ−ＯＨ１Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｆ［１ｓ−ＯＨ。

あるいはＧｌｙ−Ｌｅｕ−旧ｓ−Ｙ　１、ここで、Ｙ、は、図３の６０〜７４位 のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミノ酸のＣ末端伸長配列、そしてＸは、Ｈ あルイＩｔ　Ｈ−Ａ　Ａ　２７−１Ｈ−Ａ　Ａ　２ｓ−Ａ　Ａ　２７−１あるい はＸ　’　−Ａ　Ａ　２８−Ａ　Ａ　２７−１ここで、ＡＡ２７は、Ｐｒｏある いはＡｌａ。

ＡＡ２．は、Ｉｌｅあるいは５ｅｒ１　そしてＸ゛は、Ｈあるいは図３の１〜２ ５位のアミノ酸に相当する１〜２５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；ここで、条 件として、Ｘがｐｈ６−Ｑｌｙ−１１ｅ−Ｐｒｏのとき、Ｙは■１ｓ−Ｙ１であ り、ここでＹｌは６０〜６６位のアミノ酸のＣ末端伸長配列であり、そしてすべ てのＺはＶａｌであり、ＡＡ２８−ＡＡ３５は−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ ｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−０上記のグループ中ｈｓｐ−ｓ由来ペプ チドのＹの、好適な実施態様は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＲ，またはＧｌｙ−Ｌｅｕ −Ｈｉｓ−Ｙ＋である。但しＹｌは、図３で６０−７４の番号を付した１５個の アミノ酸に対応するＣ末端伸張部である。Ｘの好適な実施態様は、■、Ｈ−ＡＡ ２７−１Ｈ−ＡＡ２８−ＡＡ２７−１Ｇｌｙ−ＡＡ２ａ−ＡＡ２７−または、Ｐ ｈ６−Ｇｌｙ−ＡＡ２ｅ−ＡＡ２７−である。

以下に述べるように、上記のグループ内の特に好適な５Ｐ−５類似体は、ＡＡ２ ．およびＡＡ２．が両方Ｓｅｒのものである。いかなる理論にも束縛されること を望まないが、これらの部位の、２つの天然Ｃｙｓ残基をＳｅｒで置換すると、 分子内および分子間ジスルフィド結合が減少し、従って、タンパク質の凝集が減 少することを本発明の発明者は実証した。

本発明のｒ　ｈＳＰ−１８由来ペプチド」は、図４に示すアミノ酸配列を有する ペプチドを含む。図４は、２０１位から２７５−２８１位のカルボキシ末端まで にわたるヒトクローン＃３を示す。特に好適なものは、２０１−２７９位にわた る５Ｐ−１８タンパク質である。

久Ｚ二りに生１ 本発明のｈＳＰ−１８およびｈｓｐ−ｓ由来ペプチドの、より短い形態のものは 、固相ペプチド合成、または、他の＊＊的ペプチド合成手段によって、調製し得 る。これらのペプチドはまた、組換えベクターおよび宿主を用いて簡便に製造し 得る。

ベクターの構築、細胞の形質転換、形質転換細胞中での発現、等に用いられる技 術のほとんどは、当該分野で広〈実施されており、はとんどの当業者は、特定の 条件および方法を記載した標準的な手引書を熟知している。本発明のペプチドに 用いられる方法の例は、特に、第ＷＯ３６１０３４０８号および第ＷＯ３７１０ ６５８８号に実際的に記載されている。

特に哺乳類系および細菌系および酵母系を含む様々な宿主体系で、発現を行ない 得る。加えて、他の細胞系も当該分野で使用可能になり、例えば、バキニロウィ ルスベクターが、昆虫の細胞内でタンパク質をコードする遺伝子を発現するため に用いられている。以下に述べる発現系は、本発明の例示を目的とするものであ り、当業者は、様々な発現系が使用され得ることを理解している。

ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの回収、および／または合成方法の使用によって、 様々なｈｓｐ−ｓおよびｈｓＰ−１１１由来ペプチドをコードするヌクレオチド 配列が得られ、様々な系中で、これらのヌクレオチド配列を発現し得る。原核系 が用いられる場合は、適切な対照配列と共にイントロンを含有しないコード配列 を用いるべきである。上記のＡＳＰタンパク質のいづれに対応するｃＤＮＡクロ ーンは、適切な制限酵素で切り出し、このような発現のための原核ベクターに連 結され得るか、または、合成のフード配列が使用され得る。ＡＳＰゲノムＤＮＡ を原核系で発現させるためには、部位特異変異誘発により、または、ｃＤＮＡの 対応部分を回収し、それらをイントロン含有ゲノム配列で置換することにより、 ＤＮＡからイントロンを除去する修飾をすべきである。イントロンを含有しない コードＤＮＡを次に、原核発現用の発現ベクターに連結する。

例示するように、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、または合成（または一部合成）　 ＡＳＰコード配列は、イントロンをプロセッシング可能な発現系、通常、哺乳類 の宿主細胞培養系に、直接使用し得る。このような発現を実施するために、ゲノ ム配列または他の配列を、適合性のある細胞内でこれらの配列の発現を調節する 制御可能な哺乳類プロモーターの下流に連結され得る。

組換え体産生に加えて、５Ｐ−５コードタンパク質に関連するタンパク質のよう な、長さの十分短い、本発明のタンパク質は、標準タンパク質合成方法によって 調製し得る。

ンバク　の口 ＡＳＰタンパク質は、成熟タンパク質もしくは融合タンパク質として産生され得 、または分泌するためにシグナル配列をプロセシングし得る細胞中で、シグナル 配列と共に産生され得る。タンパク質が分泌されると、精製の困難性が最小限に なるため、時として有利な場合がある。従って、適切なブロモ・／シンクをし得 る細胞中で、天然のシグナル配列のコドンを含むヒトＡＳＰ遺伝子を発現させる ことが好ましい。培養された哺乳類細胞は、シグナル配列を有する異種の哺乳類 タンパク質を開裂し、プロセシングし、それらを培地中に分泌することが示され ている（ＭｃＣｏｒ＋ｕｉｃｋ、　Ｆ、ら、Ｍｏｌ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１ ９８４）圭：１６６）。

培地に分泌されると、ＡＳＰタンパク質は、標準タンパク質精製技術により回収 される。比較的少数のタンパク質が、培地に分泌され、そこで分泌されたタンパ ク質の大部分は、すでにＡＳＰであるため、精製工程は筒略化される。方法はよ り困難であるが、融合または成熟の形態で細胞内に生産される細胞の音波処理物 または溶解産物からこのタンパク質を精製することは、当該技術分野で公知の手 段である。このような方法の１つを以下に例示する。

ＡＳＰ゛　のアッセイ 表面張力を減少させる（表面圧力を増加させることと同義）ことにより、ＡＳＰ タンパク質が水／空気の界面に膜を形成する能力を評価するインビトロの試験法 が考案された。これらの方法を用いた研究が、単離された天然の１０にのイヌＡ ＳＰに関して行われた（Ｂｅｎｓｏｎ、　Ｂ、Ｊ、ら、ヒ郊」ｌ狙ユｅｓ　（１ ９８４）　ＪＪ二８３−９２；　Ｈａｖｇｏｏｄ、Ｓ、ら、Ｂｉｏｃ　ｅ＋ａｉ ｓｔｒ　（１９８５）　２４：　１８４−１９０）。

これらの方法はまた、個々の合成ペプチドおよび組み換えペプチドにも適用され る。インビボでの界面活性物質複合体の機能は、表面張力を減少させるために、 空気／水の界面に膜を形成することであるため、インビトロのモデルの表面で脂 質またはりボタンバク質の拡がりにより生成する膜の形成を促進するＡＳＰタン パク質の能力は、明かにその有用性と関連している。

１０８７／Ｑ６５８８ｉのセクシ１ン０．ｌＯに詳述されている、インビボのモ デルもまた使用される。

交１互主Ｕ使亙 精製されたタンパク質および類似体は、小児または成人の呼吸窮迫症候群の治療 のために投与されるのに適切な薬学組成物に、単独でおよび組み合わせて使用さ れ得る。本発明の組成物はまた、肺炎および気管支炎のような関連の呼吸疾患を 治療するのに有用である。この複合体は、約５０％からほぼ１００％（ｖｔ／ｖ ｔ）の脂質および５０％から１％未満のＡＳＰを含み、好ましくはＡＳＰが、複 合体の５％から２０％である。脂質部分の７０％から９０％（ｖｔ／ｖｔ）がＤ ＰＰＣであり、その残りの部分が、不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジ ルグリセロール、トリアジルグリセロール類、パルミチン酸、バルミトイルオレ イルホスホグリセリド（ＰＯＰＧ）　、またはその混合物であるのが好ましい。

複合体は、＾ｓＰ溶液と脂質リポソームの懸濁液とを混合させるか、または洗浄 剤または有機溶媒の存在下に直接脂質タンパク質溶液を混合することにより形成 される。次いで、洗浄剤または溶剤は、透析または蒸発により除去され得る。

複合体を構築するために肺洗浄物からの天然の脂質成分を用い、それに適切な量 のＡＳＰタンパク質を補給することが可能であるが、合成脂質を使用することが 明らかに好ましい。第１に、自明なことであるが、十分な供給が問題なためであ る。

第２に、調製物の純度および、天然の脂質が単離される肺に存在し得る感染性の タンパク質を含む、外来タンパク質による汚染がないことは、合成調製物でのみ 保証される。もちろん、有効な複合体の再構成は、合成成分を使用する方がより 困難である。

好ましいＡＳＰ組成物は、単離されたＩＯＫ混合物との複合体、５Ｐ−５−もし くは５Ｐ−１８−がコードするタンパク質単独、単独または組合せた活性５Ｐ− ５類似体、１０におよび３２に混合物の複合体、または５Ｐ−１８もしくは５Ｐ −５−関連タンパク質と３２に混合物との複合体を含む。後者の場合、好ましい タンパク質比、すなわち３２に：　１０にもしくは３２に：５Ｐ−１８もしくは ３２に：５Ｐ−５−は、通常、３：１から２００：１の範囲、好ましくは約１ｏ ：１から５；１の範囲である。

３２にタンパク質は、リン脂質小胞の水性懸濁液に水溶液で直接加え得る。１０ にタンパク質は疎水性が強いため、りＣ２１ニアホルムのような有機溶媒の溶液 中の脂質に加えられ、溶媒を蒸発させ、次いで、水和により水小庖を再形成させ る。

界面活性複合体を投与するために、ＩＯＫタイプに３２にタンパク質を添加する と、相乗効果があるように思われる。すなわち、３２におよびＩＯＫタイプのタ ンパク質を組み合わせると、１０にタンパク質単独の場合に必要なタンパク質濃 度よりも低い濃度で所望の活性を示す。従って、本発明の好ましい方法では、投 与される界面活性複合体は、有効な量の１０に混合物または個々の５Ｐ−５また は５Ｐ−１８タンパク質、または本発明のｈＳＰ−５またはｈｓｐ−ｉａ由来の ペプチドと、３２にのＡＳＰとの混合物を含む。もちろん、個体のｈｓｐ−ｓま たはｈＳＰ−１８由来のペプチド混合物が使用され得る。特に好ましい組成物は 、全組成物の通常５０％からほぼ１００％の範囲の適切な量の脂質成分と共に、 上記のような３２に：ＩＯＫ比のタイプのタンパク質を含む。

複合体を含む組成物は、気管内投与に適切な、すなわち、一般に脂質懸濁液、乾 燥粉末「ダスト」、またはエアロゾルが好ましい。直接気管内投与するためには 、複合体は、例えば水、生理食塩水、デキストロースまたはグリセロール等ノ適 切な賦形剤を含む液体中に懸濁される。組成物はまた、例えば酢酸ナトリウムま たはリン酸ナトリウム等のｐＨ緩衝剤のような無毒性補助物質を少量含み得る。

「ダスト」を調製するために、上記のように任意に混合された複合体を、凍結乾 燥し、次いで乾燥粉末として回収する。

エアロゾル投与に用いる場合には、複合体は、付加的な界面活性剤および噴射剤 と共に、微細に分割された形態で供給される。投与され得る典型的な界面活性剤 は、脂肪酸およびエステルであるが、本発明の場合、界面活性剤複合体の他の成 分のＤＰＰＣおよびＰＧを用いるのが好ましい。有用な噴射剤は、通常、通常条 件で気体であり、加圧下で凝縮される。低級アルカンおよびフレオン（Ｆｒｅｏ ｎ）のようなフッ素化アルカンが使用され得る。エアロゾルは、適切なバルブを 備えたコンテナー中に充填し放出されるまで、加圧下に成分を維持する。

界面活性複合体は、気管内挿入管、エアロゾル投与、または吸気中への懸濁液ま たはダストの噴霧による、等の投与形態に応じて適切に投与される。体重１ｋｇ 当り約０．１Ｂと２００ｍｇとの間、好ましくは５０−６０ｍｇの量の複合体が 一回の投与で投与される。新生児に使用する場合は、−回の投与で一般に十分で ある。成人では、再構成された複合体が、示された欠損レベルを補うのに十分な 量、投与される（ＨａｌｌｍａｎＳＭ、ら、Ｌ立り置皿１１ｎ１１江註■並（１ ９８２）測：６７３−６８２）。

さらに、本願に記載のｈｓＰ−１８−およびｈｓＰ−５−由来のペプチドを含む １つまたはそれ以上のＡＳＰタンパク質が、他の生物学的に活性で重要な分子を 、肺および／または肺を通じて血管系に運搬するためのキャリヤーまたはビヒク ルとして使用され得る。後者の場合、身体の他の器官にとって重要な物質の運搬 がなされ得る。

本発明は、好ましい特定の実施態様に関連させて記載しているが、上記の説明お よび以下の実施例は、本発明を例示することを口約とし、本発明の範囲を限定す るものではない。

本発明の範囲内にある他の局面、利点および改変は、本発明が関連する当業者に 自明である。

（以下余白） 実」【凱 調ｊｌＡ ＡＳＰ　ンパク　の ＷＯ３６１０３４０ｇおよびＷＯ３７１０６５８ｇに記載されているように、イ ヌ、ヒトおよびウンＡＳＰタンパク質を精製した形態で得たが、これらの出願願 書には、ヒトおよびイヌの３２にのタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにヒト およびイヌの５Ｐ−１８タンパク質をコードするＤＮＡが回収され開示された。

ヒ）　ＡＳＰの５Ｐ−５前駆体タンパク質をコードする、完全なｃＤＮＡ配列の ２つの改変型が、ＷＯ３７７０６５８ｇに記載されているように回収されており 、本願の図１および２に示すように再生される。

寛血五工 されたＩＯＫ　ンパク　のＮ　およびＣの６ｎ先りとへム質： １０に混合物中の５ｋｄタンパク質のカルボキシ末端は、このタンパク質が分子 量約２０．５００ダルトンの大きな前駆体に由来しているため、確認が難しい。

単離された、天然のイヌタンパク質の質量スペクトル分析では、図５のイヌタン パク質のアミノ酸配列において示したように、明らかにカルボキシ末端がＨ４５ −５９であることが示された。ヒトの肺洗浄液から単離された天然５Ｐ−５タン パク質の、酵素開裂フラグメントのアミノ酸配列分析では、カルボキシ末端がＬ ｅｕ−５８にあることが示された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｊ、ら、ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔｅｒｓ、　２３２．　Ｎｏ、　１　（１９８８）、　６１−６４参照）。

イヌの天然型５ｐ−ｓおよびヒトの天然型５Ｐ−５を質量スペクトルによって再 分析すると、観察される分子量は、Ｌｅｕ−５８にカルボキシ末端を有する種類 と一致する。この種類は、（イヌではＡＡ−２８の、ヒトではＡＡ−２８，２９ の）システィン残基がチオエステル結合を介してパルミチル化されている。パル ミチル基を除去するために、還元剤によってこの天然型を処理し、次に質量スペ クトル分析およびＨＰＬＣ分析を行って、これらの種類が存在することが確認さ れた。従って、本発明の好ましいアナログは、図１．２および３に示すように、 Ｌｅｕ−５８またはＨｉｓ−５９にカルボキシル末端を有し得る。組換え産生技 術を用いて、本願の発明者らは、Ｌｅｕ−５８とＨｉｓ−５９の双方にカルボキ シル末端を有する５Ｐ−５アナログを生成し、本明細書に説明する、インビトロ およびインビボ両方のアッセイで、それらが本質的に同等であるということを示 した。特に、比較して同等であるということが示されたアナログは、アミノ酸末 端をＧｌｙ−２５に、Ｓｅｒ残基をＡＡ−２８およびＡＡ−２９に、そしてカル ボキシル末端をＬｅｕ−５８または旧５−５９に有するヒト５Ｐ−５アナログタ ンパク質である。

ヒト５ｋｄタンパク質のＮ−末端は、アミノ酸の直接配列決定によってフェニル アラニン（図３に示すように、２４位において）であることがわかるが、２５位 のグリシンおよび２６位のイソロイシンを代わりにＮ末端として有する先端切断 型もまた見いだ１０に混合物中の１８ｋｄタンパク質のカルボキシ末端を、アミ ノ酸組成定量と、Ｎ末端から始まるタンパク質のアミノ酸配列決定と、カルボキ シペプチダーゼＹ消化（タンパク質のＣ末端からアミノ酸を開裂させる酵素）と 、質量スペクトルとを用いて分析した。図６に、ヒトおよびイヌのタンパク質の アミノ酸配列を示す。

臭化シアンによるメチオニンでの開裂の後、イヌおよびウシ１８ｋｄタンパク質 の配列分析を行うと、イヌタンパク質のＣ末端はＨｉｓ−２７９に、ウシタンパ ク質のＣ末端は５ｅｒ−２７８にあることが示された。カルボキシペプチダーゼ Ｙを用いた酵素分析では、Ｌｅｕ−２７５が、イヌおよびウシタンパク質両方の Ｃ末端であった。イヌタンパク質の質量スペクトル分析では、Ｃ末端はＡｒｇ− ２７６であり、臭化シアン開裂の後のアミノ酸配列決定によって予測されるとこ ろによると、小さな配列が［１ｉｓ−２７９に伸びている。要するに、カルボキ シ末端はイヌタンパク質においてはＨｉｓ−２７９に近く、類推すると、ヒ）１ ８ｋｄタンパク質においてはＭｅｔ−２７９に近い。上記の結果に基づくと、特 定の調製物および種類に応じて、タンパク質の先端切断型のＣ末端、および先端 切断型またはゆらぎ型Ｎ末端が存在すると思われる。従って、本願の発明者らは 、特定の種類について、おそらく多数のＣ末端が存在すると仮定する。図６に示 すように、ヒトタンパク質の推定Ｎ−末端は、１８７７０６５８Ｂに記載されて いるように２０１位のフェニルアラニンである。カルボキシ末端は、同様に図６ に示すように、２７９位のメチオニンコドンに近い。

１盃ｌ のためのベク　一 本明細書に開示されるｈＳＰ−１ｌｌ由来タンパク質およびｈＳＰ−５由来タン パク質は、組換え技術を用いて調製され得る。イントロンを含むＤＮＡをプロセ シングすることもできる、哺乳類細胞中で様々なＡＳＰをコードする配列を発現 させるのに適したベクターが構築された。これらのベクターにおいては、ＷＯ３ ７１０６５８８に記載されているように、メタロチオネインＩＩ（ｈＭＴＩＩ） フントロール配列によって発現が調節される。この公開出願では、宿主ベクター ｐＭＴ、　ｐＭＴ−Ａｐｏ、ｐＭＴ−ＳＶ（９）、ｐＭＴ−３Ｖ　（１０）、お よびｐＭＴ−ＡｐｏｌＯの調製を詳細に記載している。これらのベクターはすべ て挿入部位を有しており、メタロチオネインプロモーターの制御下にコードする 配列を置くことができる。名称に°ＡｐＯ”のつくベクターは、挿入領域の下流 のＡｐｏＡＩ遺伝子に伴う、３°末端調節シグナルをも含んでいる。名称に“９ ”または”１０°がつくベクターは、作動可能な５Ｖ−４０ウィルスエンハンサ −をも含んでいる。

上記公開出願に記載されているように、ｐＭＴＡｐｏｌｏをＢａｎ旧で消化し、 平滑化し、５Ｐ−１８前駆体をコードする１２７５ｂｐのクローン＃３から得た ｃＤＮＡ配列（平滑末端フラグメント）に連結した。

このことは、ヌクレオチド６６３位のＢａＩＩ旧部位を避けつつ、ＥｃｏＲＩ／ Ｂａ＋＊ＨＩ　（パーシャル）フラグメントをｃＤＮＡ＃３から単離し、これを ＥｃｏＲＩ／Ｂａｎ旧消化ｐＵＣ９にサブクローニングすることによって行われ た。所望の７ラグメントをＥｃｏＲＩおよび■ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで取り出し、 フレノウで平滑化し、そしてｐＭＴＡｐｏｌｏに挿入した。

得られたベクターであるｐＭＴ　（Ｅ）　：５Ｐ−１１１−４０ｋを、Ｃ１（○ 細胞に形質転換した。これらの形質転換細胞の培養物中でプロモーターを誘導す ることにより、２５ｋｄおよび４３ｋｄタンパク質が産生された。これらのタン パク質はヒト１８　ｋｄ　ＡＳＰに対する抗血清で免疫沈降される。前駆体の残 基３３６−３５３に伸びるペプチドに対する抗血清を用いたウェスタンプロット にかけると、２５ｋｄおよび４３ｋｄタンパク質が検出された。２５ｋｃ！生成 物は、Ｎ結合グリコジル化部位を有する、Ｐｈｅ−２０１：Ｌｅｕ−３８１に伸 びる、１８１個のアミノ酸配列を示すと考えられている。

さらにＷＯ３７１０６５１１７に記載されているように、５Ｐ−１８をコードす るＤＮＡを含有するアナログベクターを構築し、このベクターは、明らかにＣＩ （○細胞中で全長配列から産生された前駆体タンパク質の、インビトロでの開裂 のための部位を提供する、標準部位特異的突然変異導入の技術を用いて作られた 。このような構築物の１つにおいて、３８１個のアミノ酸前駆体を改変して、Ｇ ｌｎ−１９９：Ｇｌｎ−２００およびＡｒｇ−２８６：５ｅｒ−１８７のそれぞ れを、Ａｓｎ：Ｇｌｙに置き換えて、（ＡｓｎとＧｌｙとの間を開裂する）ヒド ロキシルアミンによって開裂可能な部位を得た。このヨウニジて生成したヒドロ キシルアミンによる前駆体の開裂部によって、推定される成熟形態が生じる。こ の成熟型は、アミノ末端に付加的ｇｌｙ残基を有し、Ａｓｎ残基に変換された推 定カルボキン末端Ａｒｇ−２８６を有する。別の構築物では、Ｐｈｅ−２０１お よび５ｅｔ−８７がＡｓｐ残基に変換されている。酸を用いた（ＡｓｐとＰｒｏ と）間の）開裂によって、Ｎ末ｍＰｈｅ−２０１がなく、カルボキシ末端に付加 的Ａｓｐ残基を有する、５Ｐ−１８タンパク質の成熟形態が生じる。別の構築物 では、Ｇｌｕ残基の後を開裂する５ｔａｐｈ　Ｖ８ペプチダーゼを用いて、イン ビトロで、前駆体をより緩やかな酵素工程によって処理することができる。Ｇｌ ｕ−２５１をＡｓｐに変換することによって、Ｇｌｕ−１９８およびＧｌｕ−２ ９１の天然Ｇｌｕ残基が利用される。４３ｋｄ前駆体は、５ｔａｐｈ　Ｖ８で開 裂され、アミノ末端に付加Ｇｉｎ−Ｇｉｎを持ち、カルボキシ末端にＰｒｏ−Ｔ ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｕを有する推定の成熟５Ｐ−１８タンパク質が生ずる。さ らに別の構築物では、Ｇｌｕ残基が２００位および／または２８７位に位置させ られ得る。

同様の方法で、図１および図２に示す、５Ｐ−５クローンの平滑化ＥｃｏＲ１挿 入物をＢａｍＨ１消化ｐＭＴ−ＡｐｏｌＯ内に入れ、ｐＭＴ（Ｅ）　：５Ｐ−５ ベクターを得、ＣＦＩＯ細胞に形質転換した。

支旌勇１ ｈＳＰ−１１３ペプチドおよびｈＳＰ−５ペプチドをフード　るＤＮＡの 本明細書に説明する、本発明のｈＳＰ−５由来タンパク質およびｈＳＰ−１８由 来タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、Ｂａｍ旧消化ｐＭＴ−ＡｐｏｌＯに入 れ、適切な発現ベクターが得られる。好ましくは、所望のタンパク質をフードす るＤＮＡを、Ｃ１（Ｏ細胞において有効な／グナル配列へ、作動可能に連結する 。挿入された配列のＣ１（０細胞への形質転換および発現は、下記のように行わ れる。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋｌ細胞を、１０％の胎児分生血清を 添加した、クーンのＦ１２培地とＤＭＥ２１培地との１．１混合物からなる培地 で増殖させる。成分細胞は、目的のベクターおよびｐＳＶ２：ＮＥＯ（Ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ、　Ｐ、ら、Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）　ｉ：３ ２７−３４１）　Ｉｌｌ：よッテ同時形質転換される。ｐＳＶ２：ＮＥＯは、ネ オマイシンアナログＧ４１８に対する耐性を与える機能的遺伝子を含有している 。一般的な形質転換においては、０．５μｇのｐｓＶ２＋ＮＥｏおよび５μｇ以 上の発現ベクターＤＩＪＡが、１００ｍｎ＋デイノシコの細胞に付与される。Ｗ ｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら、堕■（１９７９）　［ニア７７−７８５のプロトコルに よる、リン酸カルシウムとＤＮＡの同時沈澱法では、Ｄ）ＪＡに４時間曝した後 、１５％グリセロールを含むＰＢＳでの２分間の「ショック」が用いられる。

簡単に言うと、細胞を１７１０集密で接種し、１晩増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄 し、ＣａＰＯ□・ＤＮＡ同時沈澱を含有する０、　５ｎ＋１のヘベス緩衝生理食 塩水内に１５分間置き、そして１０＋ｓｌの培地を加える。培地を吸引によって 除去し、１．５〜３分間、１５％グリセロールを含むＰＢＳに置き換える。シコ ソクを受けた細胞を洗浄し、培養培地を加える。ＭＴ−Ｉ＋制御発現が誘導され るまで、培地は１０％のＦＢＳを有する１：１のＦ１２／ＤＭＥＭ２１を含有す る。１日後、細胞を１ｍｇ／＋Ｉｌｌの０４１８に曝し、０４１８耐性のコロニ ーのプールを得る。所望のプラスミドの安定した遺伝形質も有する、うまく形質 転換した細胞を、クローン単離の精製のために、低濃度で培養する。

所望のタンパク質の産生について、まずプールとして、その後多重ウェルプレー トで単離されたクローンとして、形質転換細胞をアッセイする。培養アッセイレ ベルは、ある程度ウェルの大きさによる。例えば、２４ウエルプレートの結果を 、９６ウエルプレートの結果とは直接には比較しない。プレートアッセイによっ て、満足のいくレベルでタンパク質を産生じていることがわかったクローンを、 次にローターボトルでの製造作業で成長させることができる。一般に、スケール アンプを行うと、産生のレベルは上がる。このため、一般に１００〜２００以上 の個々のクローンが、プレート上での様々なスクリーニング法によってアッセイ され、最も高い生成を示したもののうち５〜１０個が、製造条件下（ローターボ トル）でアッセイされる。

形質転換された細胞のプールを多重ウェルプレートで成長させ、５ｘｌＯ−５か ら１ｘｌＯ−’の亜鉛イオン濃度に曝し、所望のＡＳＰタンパク質の産生を誘導 する。

１０％ＦＢＳを含有する、マツコイの５Ａ培地で成長する個々の細胞株の半集密 単層を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％ＦＢＳと、１ｘ４０ −’塩化亜鉛と、０．２５＋ｓＭのアスコルビン酸ナトリウムとを含有するマツ コイの培地でならす（ｒｅｆｅｄ）。（アスコルビン酸塩は、プロリン残基のヒ ドロキシル化に役立つ。

）誘導後２４時間で、細胞をＰＢＳで洗浄し、塩化亜鉛およびアスコルビン酸塩 を含有する、血清フリーのマツコイ培地でならす（ｒｅｆｅｄ）。１２時間後、 馴化培地を回収する。

（以下余白） 週１」エ ベタ　− ＷＯ８７１０６５８８号に記載されたように、ＡＳＰタンパク質のグリコジル化 されていない形態は、バクテリア中で生成され得る。５Ｐ−１８タンパク質では 、遺伝子は、発現して例えばｍｅｔ−に続＜２０１−３８１残基で表される１８ １アミノ酸前駆体を生成するか、または１５個残基のβ−ガラクトシダーゼリー ダーを有する、ヒドロキシルアミンで開裂し得る融合タンパク質前駆体として生 成され得る。ＡＴＧに先立つ、ｃ　ＤＮＡのアミノ酸２０１−３８１をコードす る改変ｃＤＮＡ　＃３は、Ｔｒｐ−７１８節ベクターｐＴｒｐ−２３３のＥｃｏ ＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入し、ｐＴｒｐ−２０を得る。これは ＷＯ３７１０６５８８号に記載されている。この構築物は分子量２０ｋｄのタン パク質を生成する。ｐＢＧａｌ宿主ベクターに類似した構築物であるｐＢＧａ　 １−２０は、ヒドロキシルアミン感受性のＡｓｎ−Ｇｌｙのダブレットを通して １５個残基のβ−ガラクトシダーゼリーダーと融合した、５Ｐ−１８ｃＤＮＡ　 ＃３とおなじ配列を含有し、ＭＷ＝２２ｋｄの融合タンパク質を生成する。

ｐＴｒｐ−２０およびｐＢＧａｌ−２０プラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｌ　Ｗ ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換する。Ｍ９培地（１ｘＭ９塩、０．４％ グルコース、２ｍｇ／ｍｌチアミン、２００μｇ／ｍｌのＭｇ５Ｏａ・７Ｈ２０ ゜０゜５％カザミノ酸）で速やかに増殖する、ｐＴｒｐ−２０／Ｗ３１１０また はｐ　ＢＧａ　１−２０／Ｗ３１１０の培養物を、１００μｇ／ｍｌのＩＡＡ（ ３−β−インドールアクリレート、シグマｌ−１６２５）で処理してｔｒｐプロ モーターを誘発する。

ＷＯ８７１０６５８８号はまた、バクテリアに発現させる開裂部位を提供する、 改変された５Ｐ−１８タンパク質配列をコードするベクターを開示する。ｐＴｒ ｐ−２０において、Ａｒｇ−２８６：　５ｅｒ−２８７をコードするコドンは、 Ａｓｎ−Ｇｌｙをコードするように変化されて；ヒドロキシルアミン感受性の開 裂部位を導入するか、または５ｅｒ−２８７のコドンをＡｓｐのコドンに置き換 えて、その結果、酸感受性のＡｓｐ−Ｐｒｏ開裂部位を生じるか、またはＧｌｕ −２５１のコドンがＡｓｐのコドンに置き換えられ、所定のタンパク質を開裂す ることな（Ｇｌｕ−２９１において５ｔａｐｈ　Ｖ８で開裂されるようにした。

これらの構築物は、２８７−３８１または２９１−３８１のアミノ酸配列を有す る５Ｐ−１８を生成することが予想された。また、ｐＴｒｐ−２０およびｐＢＧ ａｌ−２０の両方において、３′末末端列から推定されるカルボ牛シ末端Ａｒｇ −２８６までの配列を削除して停止コドンに置換されており、５Ｐ−１８コドン の２０１−２８６位を表すペプチドを生成すると推定された。しかしながら、ど ちらの構築物も、誘発後に適当なサイズの標識されたタンパク質を生成しなかっ た。

５Ｐ−５由来のタンパク質に関連して、ＷＯ８７１０６５８８号は、ｐＴｒｐ− ２０と同様にＡＴＧに続＜Ｇｌｙ−２５から、５ｐ−５ｒ前駆体」の１ｉｅ−１ ９７まで伸びるＣＤＮＡ　＃１８のフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／Ｈｉ　ｎｄ　 Ｉ　Ｉ１消化したｐＴｒｐ−２３３に挿入してｐＴｒｐ−５を作製すること、お よびｐＢＧａｌ宿主ベクターに挿入してｐＢＧａｌ−５を作製することを記載し ている。ここで５Ｐ−５配列は、ヒドロ牛ジルアミン感受性のＡｓｎ−Ｇｌｙを 通してβ−ガラクトシダーゼリーグ−と融合している。これらのベクターは推定 では、２５−１９７に及ぶ５Ｐ−５由来のタンパク質を生成する。同様に、この 構築物から予想されるタンパク質の５ｔａｐｈ　Ｖ８による、Ｐｈｅ−２４に続 ＜Ｇｔ　ｕおよびＧｌｕ−６６での開裂は、２４−６６位置にわたる５Ｐ−５白 来のペプチドを生じるであろう。

これらの構築物はすべてＥ　ｃｏｌｉＷ３１１０に変換され、上述のように発現 される。

爽皇勇ユ におけるｈＳＰ−１８およびｈｓＰ−５の　ンバク質１ａＬ成 ｈｓＰ−１８およびｈｓＰ−５由来のペプチドを、上流に安定化配列を有する開 裂可能な融合タンパク質として発現することは有益である。１９８８年８月１１ 日に出願された、同一譲受人による米国特許出願番号２３１，２２４号には、引 例としてここに包含されるが、ｈｓＰ−１８またはｈＳＰ−５ペプチドの特定部 分をコードするＤＮＡと結合した、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子の一部を含有する数種のベクターの構築物 が記載されている。５Ｐ−５由来のペプチドの３５個のアミノ酸をコードするベ クター、すなわち、６個のアミノ酸リンカ−１Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ −Ｐｈｅ−Ａｓｎを通してＣＡＴと結合したｈＳＰ−５（２４−５９）を例示し ている。上記に引用された出願に記載されているように、これらのベクターは以 下のように調製される。

５Ｐ−１８由来のタンパク質および５Ｐ−５由来のタンパク質を有するベクター は、ヒト心房のナトリウム排せつ増加性ペプチド（ｈＡＮＰ）をコードする挿入 部を用いて構築した宿主ベクターから得られる。この中間ベクター、ｐＣｈＮＦ １０９は以下のように構築される。

発現ベクターｐｃｈＮＦ１０９は、エンドプロテイナーゼのＧｌｕ−Ｃのタンパ ク質分解性開裂部位を含有する、２４１個のアミノ酸のＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブ リッドタンパク質をコードする。ＣＡＴおよびｈＡＮＰのＤＮＡおよびコードさ れたアミノ酸配列は、第７図に示されている。ＣＡＴ遺伝子の大部分（アミノ酸 １−２１０）は、リンカ−遺伝子（５個のアミノ酸）を通して、上述のようにｈ ＡＮＰ　（１０２−１２６）遺伝子および開裂部位（２６個のアミノ酸）インフ レームで結合している。このベクターは、プラスミドｐＴｒｐ２３３、ｐＣＡＴ ２１、およびｐｈＮＦ７５から構築された。このｐｃｈＮＦｌ　０９は、ｈＡＮ Ｐ遺伝子に先行するエンドプロテイナーゼのＧｌｕ−Ｃ開裂部位にインフレーム で融合したＣＡＴ遺伝子を有する。

ｐｃｈＮＦ１０９内のｈＡＮＰをコードする配列を、５ｐ−５および５Ｐ−１８ 配列に置き換えることによって、ヒト５Ｐ−５由来ペプチドおよびヒ）ＳＰ−１ ８由来ペプチドは、細菌のＣＡＴの一部との融合物として発現する。その界面活 性ペプチドは、ヒドロキシルアミン感受性のアスパラギン−グリシン結合を通し て、ＣＡＴ配列のカルボキシル末端と結合している。ＣＡＴ−界面活性物質融合 物は、細菌のベクター　ｐ　Ｔ　ｒ　ｐ　２３３のトリプトファンプロモーター から発現される。

ベク　−　Ｃ２１０ＳＰ−Ｂ ＳＰ−１８発現ベクターｐＣ２１０３Ｐ−Ｂは、ヒドロキシルアミン感受性開裂 部位を含む７個のアミノ酸のリンカ−を通してＣＡＴの２１０個のアミノ酸が５ Ｐ−１８の７６個のアミノ酸に結合している、２９３残基の融合タンパク質をコ ードする。ヒドロキシルアミンによる融合物の開裂によって、５Ｐ−１８の７６ 残基を含む７７個のアミノ酸の５Ｐ−１８生成物、およびアミノ末端のグリシン 残基が放出される。

ｐＣ２１０３Ｐ−Ｂを構築するために、ｈＡＮＰ配列を含む短いＥｃｏＲＩ−Ｈ ｉｎｄｌ　Ｉ　ＩセグメントをｐＣｈＮＦ１０９から除去し、ヌクレオチド（ｎ ｔ）６４３のＰｓｔＩ部位からｎｔ８０４の５ｐｈ１部位まで伸長するヒ）ＳＰ −１８ｃＤＮＡ　＃３　（表３）の一部分によって置換した。ＥｃｏＲ１部位を 、ヒドロキシルアミン感受性開裂部位および成熟５Ｐ−１８のアミノ末端残基を コードする２つの相補的（配列番号：１８） （配列番号：１９） を通してＰｓｔＩ部位に結合させた。５ｐｈ１部位を、５Ｐ−１８ペプチドのカ ルボキシ末端残基をコードする２組目の（配列番号＝２０） （配列番号：２１） を通して、ｐＴｒｐ２３３のＨｆｎｄｌｌＩ部位に結合させた。

この発現プラスミドを使用してＥニ一旦」し上１−株Ｗ３１１０をアンピシリン 耐性に形質転換した。Ｍ９培地中で速や力）（こ増殖するｐｃ２１０ｓＰ−Ｂ／ Ｗ３１１０の培養物を、２５μｇ　／　ｍ　１のＩＡＡ（３−βインドールアク リレート、シグマｌ−１６２５）とし、ｔｒｐプロモーターを誘導した。誘導か ら１時間後までに、まだ増殖し続けている細胞内部の位相差顕微鏡検査により、 屈折性の細胞質封入体が認められた。

誘導の５時間後、１０．　Ｄ、　５ｓｆ１に相当する細胞を遠心分離によってペ レット化し、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に用いるた めに、ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間沸騰して、次にクマシーブルーで染色し た。ＣＡＴ：５Ｐ−１８融合タンパク質の推定分子量は、４５，０００ダルトン である。ノ翫イブリッドＣＡＴ：５Ｆ−１８タンノくり質は、誘導した培養物中 の１５−２０％の総細胞タンノくり質のを含有すると推定された。

Ｃ２１０ＳＰ−Ｃ ２５１残基の融合タンパク質のアミノ酸配列がプラスミドｐＣ２１０３Ｐ−Ｃ内 にコードされている。ＣＡＴの２１０個のアミノ酸は、６個のアミノ酸のリンカ −を通して成熟５Ｐ−５の３５個のアミノ酸に結合している。５Ｐ−５は総融合 物の１４％を含む。

第８図に、ｐｃ２１０３Ｐ−Ｃの挿入部のヌクレオチド配列が示されている。こ のヌクレオチド配列では、５Ｐ−１８配列を含むｐｃ２１０ｓＰ−ＢのＥｃｏＲ Ｉ−ＨｉｎｄＩ　ＩＩフラグメントが、ヌクレオチド１２３の、６．ｐａＬ１部 位力ゝらヌクレオチド１６１のＡｖａ１１部位まで伸長した、ヒト５Ｐ−５ｃＤ ＮＡ　＃１８のセグメントによって置換されている。ＣＡＴベクターのＥｃｏＲ １部位を、ヒドロキシルアミン感受性開裂部位、および成熟５Ｐ−５のアミン末 端残基をフードする２つの相補的オリゴヌクレオチドｏＬｉｇｏ　＃２４６２： 　５’−ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＣＴ　ＧＣＴＧＣＣＣＡＧ −３′ （配列番号：２２） （配列番号＝２３） を通して、５Ｐ−５のＡｐａＬＩ部位に結合させた。５Ｐ−５のＡｖａ１１部位 を、成熟５Ｐ−５のカルボキシ末端残基および停止コドンをコードする２組目の 相補的ヌクレオチドｏ１ｉｇｏ　＄２８７１：　５’−ＡＧＣＴＴＡ　ＧＴＧ　 ＧＡＧ　ＡＣＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＣ（配列番号：２４） （配列番号＝２５） を通して、ｐｃ２１０ｓＰ−ＢのＨｌｎｄｌ　Ｉ　１部位に結合ｐｃ１７９３Ｐ −Ｃによってコードされる２１７残基の融合タンパク質のアミノ酸配列は、第８ 図に示す配列をわずかに改変したものである。ｐｃ１７９３Ｐ−Ｃにおいて、Ｃ ＡＴの１７９個のアミノ酸を、３個のアミノ酸（Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ）のリ ンカ−を通して成熟５Ｐ−５の３５個のアミノ酸に結合させる。５Ｐ−５は、総 融合物の１６％を含む。

ｐｃ１７９３Ｐ−Ｃを構築するために、ＣＡＴ配列の一部をｐｃ２１０３Ｐ７ｃ から除去した。ｐｃ２１０ｓＰ−Ｃから始めて、ｎｔ６０３のＮｃｏＩ部位（第 ８図）からｎｔ７２８のＥＣｏＲＩ部位まで伸長するＤＮＡフラグメントを除去 し、Ｎｃｏ　ＩおよびＥｃｏＲＩの粘着末端を、２つの相補的オリゴヌクレオチ ド （ｏｌｉｑｏ　ｄ３０［］３：　５’−ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＴＴ Ａ　ＴＡＣＧＣＡ　ＡＧ−３’（配列番号：２６） （配列番号＝２７） によって再結合させた。要するに、ベクターｐｃ１７９３Ｐ−〇によってコード される新しい融合タンパク質においてはＣＡＴの３１残基、およびリンカ−ポリ ペプチドの３残基が欠失している。

パ１封またヱ ｐｃ１４９３Ｐ−Ｃによってコードされる１８７残基の融合タンパク質のアミノ 酸配列は、図８に示される配列が僅かに改変されたものである。プラスミドｐｃ １４９ｓＰ−Ｃにおいて、ＣＡＴの１４９個のアミノ酸は３個のアミノ酸（Ｇｌ ｕ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ）からなるリンカ−によって５Ｐ−５の３５個のアミノ 酸に結合させる。５Ｐ−５は総融合タンパク質の１８．７％を含む。

ｐｃ１４９ｓＰ−Ｃを構築するために、ｎｔ５２３のＤｄｅ　１部位（図８）か らｎｔ７２８のＥｃｏＲ１部位へ伸長されたｐｃｚｔｏｓｐ−ｃのＣＡＴセグメ ントの一部分を取り除き、２本の相補的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇ。

＃３０８２：　５−ＴＣＡ　ＧＣＣＡＡＴ　ＣＣＣＧ−３°（配列番号：２８） 　ｏｌｉｇｏ＃３０８１：　５−ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＴＴＧ　ＧＣ−３° （配列番号：２９））の１組で置換した。得られた配列を図９に示す。

匹旦μ迂匹 ｐｃ１０６ｓＰ−Ｃによってコードされる１４４残基の融合タンパク質のアミノ 酸配列は、図８に示される配列が僅かに改変されたものである。プラスミドｐｃ １０６３Ｐ−Ｃにおいて、ＣＡＴの１０６個のアミノ酸は３個のアミノ酸（Ｇｌ ｕ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ）からなるリンカ−によって５ｐ−ｓの３５個のアミノ 酸に結合させる。５Ｐ−５は総融合タンパク質の２４％を含む。

アニーリングしたあと相同性領域を介して連結した２組の相補的オリゴヌクレオ チド（ｏｌｉｇｏ　＄３０？９：　５°−ＡＡＴ　ＴＣＣＧＴＡ　ＴＧＧ　ＣＡ Ａ　ＴＧＡ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＧＣＴＧＧ　ＴＧＡ　ＴＡＴ　ＧＧＧ 　ＡＴＡ　ＧＴＧ　ＴＴＣＡＣＣＣＴＴ　ＧＴ−３°（配列番号＝３０）をｏｌ ｉｇｏ　＄３０８５：　５−ＡＣＡ　ＣＴＡ　ＴＣＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＣＣＡＧ ＣＴＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＴＴ　ＧＣＣＡＴＡ　ＣＧＧ−３’　（配 列番号、３１）とアニーリングし；　ｏｌｉｇｏ　３３０８０：　５’−ＴＡＣ ＡＣＣＧＴＴ　ＴＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴ Ｔ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＣＴＣＴＧＧ　Ｇ−３゜（配列番号：３２）をｏｌｉｇｏ 　＃３０７８：　５−ＡＡＴ　ＴＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＧＡＴ　ＧＡＡＡＡＣＧＴ Ｔ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＡＡ 　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ−３’　（配列番号、３３）とアニーリングした）で ｐｃ２１０ｓＰ−ＣのＥ、ｃｏＲ１フラグメントを置換することにより、ｐｃ１ ０６３Ｐ−Ｃを構築した。

各５Ｐ−５発現ベクターを使用してＥ、ｃｏｌｉの！３１１０株をアンピシリン 耐性に形質転換した。発現株の急速な増殖培養物を上述のように誘導した。誘導 より１時間後までに、さらに増殖を続ける細胞内で屈折性の細胞質封入体が位相 差顕微鏡によって観察された。誘導の５時間後、１０．Ｄ、５５［１に相当する 細胞を遠心によりベレット化し、次に１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動用にＳＤＳサンプルバッファーデー５分間煮沸し、続いてクマシーブルー で染色した。これらのベクターから適切な分子量のタンパク質が得られた。各ベ クターによって生産されたハイブリッドＣＡＴ：　５Ｐ−５タンパク質は、誘導 された培養物中の総細胞タンパク質の１５−２０％を含むと推定される。

汁」ｙ仄二改変 ｈＳＰ−５アナログをコードする改変された配列を得るために、部位特異的変異 誘発を使用し得る。例えば、ｐｃ１４９３Ｐ−Ｃを出発物質として、図９に示す ＢａｍＨＩ／）ｌｉｎｄｌｌｌフラグメントを切り出し、ｍｐ８にクローニング した。この挿入断片について次に、図に示すようにプライマー５°−ＧＴＧ−Ｃ ＡＣ−ＴＧＧ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−ＧＧＧ−ＡＡＴ−ＧＣＣ−３゛（配列番号・３ ４）を用いて部位特異的変異誘発を行う。この結果、成熟タンパク質の２８位お よび２９位のシスティンのコドンがこれらの位置でそれぞれセリンのコドンに改 変される。

次に、変異したＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを単離し、その後発現 ベクターｐＴｒｐ２３３に連結しもどす。

次に例えばＣ１４９ＳＰ−Ｃあるいは対応する変異ベクターのような構築物でＥ 、　ｃｏｌ　ｉを形質転換し、この形質転換細胞を標準的な技法を用いて培養す る。培養物をＩＡＡで処理することによってｔｒｐプロモーターを誘導し、所望 の５Ｐ−５由来のペプチドをコードする遺伝子の発現が得られる。

ｈＳＰ−５−のペプチドの 次に細菌細胞をホモジナイザーに通して溶解する。この処置によって放出される 不溶性封入体を５０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって、あるいは０． １ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｄｕｒａｐｏｒｅメンブレンで濾過すること によって回収する。得られる封入体を１％トリトンＸ−１００で、あるいは１． ０Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ８， ０中で３回洗浄し、上述の遠心あるいは濾過によって１００ｍＭを回収する。封 入体をｐＨ８，０の２０ｍＭ　トリス−塩酸、６Ｍの塩酸グアニジン、５０ｍＭ のＤＴＴに１５５−２５ｎ／ｍ　ｌの濃度で溶解する。

遠心によって不溶性物質を取り除いた後、５Ｐ−５−由来のペプチドを含む融合 タンパク質を等量の６Ｍ塩酸グアニジン中等容量のヒドロキシルアミン（２Ｍ） 、０．２Ｍ　Ｋ２Ｃ（ｈを含有する５０ｍＭ　ＤＴＴを加えることにより開裂す る。開裂は４８時間行う。溶液を塩酸グアニジンの濃度が１．２Ｍになるように （５倍）　、ｐＨ８，０の１０ｍＭ）リス、２０ｍＭ　ＤＴＴで希釈する。この ことにより開裂反応中のタンパク質が沈澱し、この沈澱物を遠心により集める。

次にＳＰ〜５由来のペプチドを、多量の残りのタンパク質から１００＋ａＭ　Ｄ ＴＴを含むクロロホルム：メタノール（１：１　ｖ：ｖ）溶液を用いて抽出する 。５Ｐ−５由来のペプチドが１ｍｇ／ｍｌになるようにこの溶液の十分量を沈澱 物に加え、室温で６時間この物質を抽出する。次に不溶性物質を取り除くために 抽出物を遠心する。

次にこの遠心の上清を、抽出物中の５Ｐ−５ペプチド１ｍｇあたりスルホ−プロ ピルセルロース（０゜０４ｍ１のスルホ−プロピルセルロース）と混合する。塩 酸を用いて抽出物を酸性にし、５ｍＭの濃度にする。−晩５Ｐ−５と結合させた 後、スルホ−プロピルセルロースを１９部のクロロホルム、１９部のメタノール 、および２部のＯ，ＩＮ塩酸を含むバッファー（洗浄バ・ノファ−）で徹底的に 洗浄する。固体ＤＴＴでｊｏｍＭのＤＴＴ濃度に調整し、２Ｍの酢酸ナトリウム バッファーのストック溶液を加えてｐＨ４の２０ｍＭの酢酸ナトリウムとした洗 浄バッファー溶液でさらに洗浄する。次に５Ｐ−５ペプチドを、５０ｍＭのＤＴ Ｔを含みｐＨ６の２Ｍの酢酸ナトリウムのストック溶液を加えることにより５０ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６に調整した洗浄バッファーで溶出する。ＳＰ−セルロ ースを濾過によって取り除く。精製の最終工程は、溶出液として上述の洗浄バッ ファーを使用した、セフアゾ、クスＬＭ−６０でのゲル浸透クロマトグラフィー である。

実」１例１ 含式二二乙立上 ヒ）　５Ｐ−５によりコードされた混合物に基づく種々の合成ペプチドが標準的 な技法を用いて合成されている。図３に関しては、以下のペプチドが固相ペプチ ド合成を用いて合成されている： （１）ｈＳＰ−５（２４−７４）、すなわち、２４位のＰｈｅで始まり７４位の Ｇｌｙで終わる； （２）　ｈＳＰ−５（３４−７４）、すなわち、３４位のＬｙｓで始まり７４位 のＧｌｙで終わる；および （３）ｈＳＰ−５（２４−６１）、すなわち、２４位のＰｈｅで始まり６１位の ５ｅＬｅｕ−Ｌａｕ−Ｉ　１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌ ｅｕ−１１＝−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｉ　ｋ−ｖａｌ　−Ｇｕｙ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−１（ｉｓ　−Ｍｅｔ−５＝ｒ −Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＨＬｓ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ−Ｍａｔ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ（配列番号：５）および（配列番号＝６ ）■Ｆ江■ユＵ： Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｒ　１ｅ−Ｖａｌ　−ｖａ　１−Ｖａｌ−Ｖ ａｌ−ＶａＬ−Ｌ＋ａ＊−Ｉ　１＝−Ｖａ　ｌ　−’Ｊａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ−工 １ｅ−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ　−ＧＩＹ−Ｌｅｕ −Ｈｉｓ　−Ｍｅ@ｔ　− ５ｅｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅ　ｔ−５ｅｒ−Ｉ工ｅ−Ｇｕｙ胚ヱ」よりニＬユニ Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ヱ１９−ＰｒＯ−Ｃｙｓ−Ｃ１ｚｓ−Ｐｒｑ−Ｖａｌ−Ｈ＝ｓ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ、ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｖａｌ−”＋−ａｌ −’ｖ’ａｌ−’ｊｄ１−；ａＬ−Ｌｑｕ−ｒＬｅＡ−：；ａＬ−’ｖ’ａｌ− ’ｖａｌ−dｌ；− Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｉ　ｙ−Ａｌａ−Ｌ：ｕ−Ｌｅｕ−１−ｉｓｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅ ｕ−Ｈｉｓ　−ニー１＝ｔ−５＝ｒ合成ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａペプチド合成機を用いて、標’＄　ｔ−Ｂｏｃ固相ペプ チド合成法により調製する。使用する保護基は：　Ｃｙｓ−４−メチルベンジル 、Ｈｉｓ−ＢｏＣ，Ｌｙｓ−２〜クロロＣＢＺ％Ａｒｇ−）シルである。樹脂を Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＢｚｌ）−０−ＰＡＭ樹脂上に構築した（　０．５ｍ＋＋＋ ｏｌ、０．７２ｍ当量／負荷ｇ）　ａ　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｂｏａ）−ＯＨを、 左右対称形の無水物として用０て、すべての残基を二重に結合したＦＩＯＢＴエ ステルおよびＨｉｓ残基と単独で結合した。残基１２にＡｒｇを添加する前に樹 脂を取り除０た。この樹脂は、はとんどの側鎖が保護されておらず、真性ＰＴＩ （アミノ酸として働くので、この時点で気相ンークエンサー中で配列決定し得る 。配列がほぼ均一であることを確認した後、合成を終了した。樹脂を開裂し、す べての保護基を標準的なＨＦ開裂条件を用いて取り除く。１ｇのペプチド樹脂に 、１．５ｍｌのアニソール、０．２５ｍ１の硫化メチルエチルおよび１５ｍ１の 蒸留したＩＩＦを加え、標準的なＫｅｌＦ　ＨＦ開裂装置で開裂を行う。開裂（ よ３０分間１０３Ｃで行われ、次いで、０３Ｃでさらに３０分行った。凝集を最 小限にするためｉｆｆを即座にすばやく除去した。

しかしながら、開裂混合物から再溶解し得る選択されたペプチドはほんの少量で あるので、ある程度の凝集（まなお起こる。

−ド ）ＩＦ除去の後、樹脂−ペプチド混合物はエーテルおよびクロロホルムで交互に 洗浄され乾燥された。ペプチドは標準水抽出を用いては可溶化され得ず、メタノ ール／クロロポルム／ＨＣＩで可溶化することにより樹脂から分離しなければな らない。

７５％トリフルオロ酢酸に溶解した後、各ペプチドを精製した。

精製の好適な方法は、０．５％ＨＣＩを含むクロロホルムおよびメタノール（１ ：１　ｖ／ｖ溶液でＬＨ−６０カラムを用いたゲル濾過である。

各合成ペプチドは実施例５のようにインＥ′トロおよび什ヒ゛本゛活性を試験し た。

ＰＣ丁公開ＷＯ３７１０６５８８ノセクシａ　７　Ｄ、　９およびり、１０テそ れぞれ述べられている手順で、インビトロおよび佇ヒ゛本゛活性が評価された。

ペプチド３４〜７４は、４ｙヒ−’ｒ口でのリン脂質フィルム拡散で効果がなく 、この結果から予想されるように、また未成熟ウサギ肺で効果がなかった。従っ て、活性を最大にするにはＮ末端アミノ酸が必要なようである。

ヘフチＩ’２４〜７４は、Ｃ末端伸長ペプチドで、４７ヒ’　）口で空気−水界 面の表面張力の低下および動物における適度な肺機能作用のいずれにおいても極 めて有効でった。表１において、Ｐ。

、３は、肺で表面張力を低下させることにおいて界面活性剤調合物がどの程度有 効であるかの指標である。この張力低下は、吸気酸素圧の低下により示される。

ペプチド２４〜７４は、対照生理食塩水溶液に比較して極めて効果的であり、ポ ジイティブ対照のウサギ界面活性剤とほぼ同じ効果である。天然５ｋｄタンパク 質が、対照界面活性剤と同程度に効果的であることは注目すべきである。

（以下余白） 表ヨし Ｐ、。５ 界面活性剤　２５　２３　２０　６ １０：１　２７　２２．５　２０　５ １０：１　２８　２４　２２　３ ＮａＣ１３５３４３３４ １０，２０および３０分でのＰｉｎｓ値は、６−７＋ｓｌｓ／ｋｇ体重の肺の一 回換気容量を維持するのに必要な吸気圧（ｃ＋ｓ　Ｈ２Ｏ）である。

（換気装置への圧力が低い程良い） ペプチド２４〜６１は、４ンに’本゛で天然界面活性剤と同程度に効果的である ことが見い出された。事実、ある動物の実験で、Ｐｉｎｓは、２４〜６エで処理 された動物では界面活性剤対照におけるより低かった。すべての場合で、リン脂 質混合物は、ＤＰＰＣ二卵ＰＧ（７：３．　ｖ／ｗ）であり、ＰＬ対タンパク質 の比率は１０：１であった。ペプチドは、以下に述べるように別の脂質と共に投 与さ：３・１：Ｏ，ｓ）完全な長さのヒト５ｋｄタンパク質に関して得られた、 時間に対する表面圧のグラフ表示である。図１１は同様に同じ成分（７：３：１ ：１）で処方された完全な長さのヒト５ｋｄタンパク質でｐＨ７，５および３７ ℃で試験して得られた結果を表す。

合成ペプチドｈｓＰ−５＜２８〜５９）は、図１２に表された対照実験における ようにＤＰＰＣ：ＰＧおよびパルミチン酸塩と共にで処方され、天然ペプチドで 観察されたのと同じ初期拡散速度を示した。

５Ｐ−５由来の合成ペプチドｈＳＰ−５（３０〜５９）は活性が減り（図１３） 、この活性の喪失は特異的に２８位および２９位のシスティン残基の欠失よるも のでないことは、これらシスティン残基がセリンで置換されたＣ５に１１合成ペ プチド（Ｓ２８．５２９−ｈＳＰ−５（２４−５９））が、完全な活性を示す（ 図１５）ことにより示唆される。この結果は特定残基の喪失よりむしろポリペプ チド長さの減少が、ＡＳＰ活性の喪失になることを示している。

Ｃ５に＃１ペプチド（Ｓ”、　５２９−ｈｓＰ−５（２４〜５９））は、実施例 ２で述べたように組み換え法により生産され、精製された。組み換え５ｐ−ｓペ ブチ　ド（Ｓ２８．５２９−ｈＳＰ−５（２４〜５９））は、　インヒ゛トロア ッセイの標準プロトコールに次のような修正を加えて試験したニリン脂質調合物 を７部のＤＰＰＣ：３部ＰＯＰＧとした。ここでＰＯＰＧはくバルミトイル−オ レオイルＰＧ）である。最終調合物は、２０ｆ’ｊ１部’Ｊン脂質混合物：１重 量部タンパク質である。５ｅｔ−Ｓｅｒアナログは、４ｙｋ゛トａで活性が高く 、少な（とも佇ヒ゛本゛で精製ウサギ界面活性剤と同定度に有効であった。

Ｃ５に＄１合成ベブ＋　）’（Ｓ”８，５２９−ｈＳＰ−５（２４〜５９））ヘ ブｆ　）’７＋ログもまた、以下に示されるように、ＷＯ３７１０６５８８で提 示された手法に従って試験した時にｔｙｈ’！”で活性であった。

Ｃ５ＫＳＩ　５２８Ｓ２９−ｈＳＰ−５２４〜５９　ｃ　ｓ−＞５ｅｒ３０分で のＰｉｎｓ’ ｎ＝４　ａｙｓ−−＞　ｓｅｒ　１８．０±０．７　（ＳＤ）　ｅ＋ｍ　Ｈ２０ ウサギ　１８．５±１．２　ａｍ　■２０界面活性剤 ＮａＣ１３４，６±１．２　ａｍ　Ｈ２Ｏ３０分でのＣ７０丁： ｅｙｓ−−＞　ｓｅｒペプチド　０．４８６±０．３ウザキ　０−４９４±０． ７ 界面活性剤 ＮａＣｌ　０．２２４±０．２ 組み換えＳ”、５２９−ｈＳＰ−５（２４〜５９）ハマタ、４ｎ’ｌ”’Ｌ：’ 試験サ試験モレて少なくとも精製ウサギ界面活性剤と同程度に効果的である。

ペプチドＳ２８．Ｓ”−ｈＳＰ−５（２５〜５９）は、実施例３で述べたように バクテリアを用いて組み換え法により生産され、そして精製された。部位特異的 突然変異導入の標準手法を用いて、このペプチドのためのベクターがＨｉｓ（５ ９）のコドンを欠失するように改変された。ベクターはベブｆ　）’Ｓ２８，５ ２９−ｈＳＰ−５（２４〜５８）を組み換え法により生産するのに使用された。

組み換えペプｆ　）”Ｓ２８，５２９−ｈＳＰ−５（２４〜５９）、オヨびｈｓ Ｐ−５（２４〜５９）、即ち、５ｅｔ−Ｓｅｔ変異のないペプチドは、インヒ゛ トα７ｙセイの標準プロトコールを次のように修正して用いて一緒に試験したニ リン脂質調合物は、７部ＤＰＰＣ：３部ＰＯＰＧである。最終調合物は、２０重 量部リン脂脂質台物：１重量部タンパク質である。図１７に示された表面圧の重 ねられたプロットは、５ｅｔ−Ｓｅｒアナログは、イへ゛トＤで、少なくとも天 然配列を持つ対応組み換えタン、ｆり質と同程度に有効であることを示す。

Ｓ２８．５２９−ｈＳＰ−５（２４〜５９）はまた、同じ修正をしたインビトロ アブセイで試験した。表面圧のプロットは、図１８に示すように、Ｈｉｓ（５９ ）の除去によってタンパク質の効力が変化しないことを示している。

組み換え法により生産されたペプチドＳ”、５２９−ｈｓＰ−５（２４〜５９） 、Ｓ２８，５２９−ｈＳＰ−５（２５〜５８）および、ｈＳＰ（２５〜５９）は 、インヒ゛本゛で試験され、そして単離されたウサギ界面活性剤と比較した０結 果を以下に示す： ３０分でのＰｌ、： ウサギ界面活性剤　１７．５ｃｍ＋（２０Ｓ２８，５２９−ｈＳＰ−５（２４〜 ５９）　１６．０　ｃｍ　Ｈ２Ｏ５２８，５２９−ｈＳＰ−５（２５〜５８）　 １６．０　ａｍ　）＋２０ｈＳＰ（２５〜５９）　１６．ＯＣｍ　Ｈ２０特定の アミン末端配列が完全な活性のための必要条件ではないことがさらに、Ｃ５に＄ ２およびＣ５Ｋ１３の分析により示唆された０これらのペプチドは、アミノ末端 領域でより範囲の広い置換が行われており、イへ゛トσで完全な活性を保持して ｔ）る（図１５および１６）。

本発明者らが本発明の方法に有用であると信じる他のペプチドは、図３に示され るヒト５ｐ−ｓがコードするタンパク質の３１−６１．３０−６１．２８−６１ および２６−６１ペプチドである。

（以下余白） 配列表 （１）一般情報 （２）配列番号：ｌについての情報： （１）配列の特徴： （以下余白） （ＩＫ）配列の特徴： （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：１ ｃＣＧＧＴＧＡＧＣＡ　Ｇ（、にＴｅＡＧＴＣＧ　ＡＡＧＣＣＣｅ■ＣＧＧＧ黒 ＧＧＩＡ　入ＣＧＣＣＣＣＧＧＧ　ｃＮ情ｃｃｃｒｃ’ｒ　U９３ ｆｆＴＧｃＡＧｃＴＴ　ＴＴＧＣＪＧｋＣＧＧ　ＧＣ八へへＡＡＧＣＴ　ＧＣＴ ＴＣＴＧＣＣＣ＾ＣＡＣＣＧＣＡＧＧ　ＧＡＣＡＡＡＣＣＣs　７５３ ＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧ　ＣＡＧＣＴ’ｒＣＧＣＧ　ＡＧＡＧＧＡＴにＧＧ　ｋＧ ＴにＧＣ；ＣＡＧＡ　ＧＣＴＧＧＣｋＣＣＣＡＧＧＣ，Ｃ；bＣＣＧＧ　８１３ （＾）長さ：１９７アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 Ｍ＠ｔ　）ｖｓｐ　ｖａＬ　Ｇｌｙ　３＊ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌ＊ｕ 　Ｍｅｔ　ＧＬｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙ■ ｌ　Ｓ　１０　１５ Ｖｌｌｌ　ｘｌｌｌ　ＶａＬ　Ｃ１ｙ　ＡＬａ　Ｌ＠ｕ　Ｌ＊ｕ　Ｍｅｔ　ＧＬ ｙ　ＬＩＩＬＩ　Ｆｌｉｔ　Ｍａｔ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ｌｙ香@Ｈｉｓ Ｍｐ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｐｈ＠　Ｌ＊ｕ　ＯＬＹ　Ｍｅｔ　Ａｌｍ　Ｖａｌ　Ａ ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌ＊ｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＶａｌｌｌｌＧ　１８５　１ ９０ （１）配列の特徴： （＾）長さ：１９７アミノ酸 ＣＢ）型：　アミノ酸 Ｖａｌ　ｒｌ＊　Ｖａｌ　ＧＬｙ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　ＭＩＩＣＧＬｙ　 Ｌｅｕ　ＨＬｓ　Ｍｅｔ　１＊ｒ　ＣＬｒ＋　Ｌｙｅ　Ｈｉ■ ｓｏ　ｓｓ　ｓ。

Ｇｉｎ　Ｍｅ＋：　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　５＠ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ｌｙｅ 　Ｐｒｏ　入Ｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　τｈｒ　Ｓｕｒ　Ｌｙ■ １４５　１５０　Ａｓｓ　１６０ （２）配列番号：５についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２３７塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の＄１１１：　ｃＤＮ＾ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号＝　５ＴＣＣ（：ＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＣＯＣＧ 　ＧＣ，ＣＣ（＋Ａ　ＴＴＴ　ＧＧＣＡＴＴ　ＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣｋ　ＧＴ Ｇ　ＣＡＣ９６ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣにＧＣＣＴＴ　Ｃ−、Ｔ　ＡＴＣＧＴＧ　Ｇ ＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧ　１４４Ｌ＊ ｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　ｔＬ＊　ＶａＬ　ＶａＬ　ＶａＬ　Ｖａ Ｌ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｌ＠ｕ　ＡＬａ　ＶａＬ　Ｖａ１ＧＴＧ　＾丁τ　ｃＴｃ 　ｃｃ入　ｃｃｃ　ｃＴｃ　ｃＴｃ　入ＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡに ＧＣＣＡＧ　入Ｍ　ＣＡＣ１９２（２）配列番号二〇についての情報： （２）配列番号ニアについての情報： （１）配列の特徴： （＾）長さ：１２７４塩基対 （Ｂ）盟：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本鎖 （Ｄ）トポクジー：　直鎖状 （ＩＩ）５！列のｆｌｌｌｌ：　ｅＤＮ＾（ＩＩ）記列の特徴： （＾）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１４．．１１５９ （ｌｘ）記列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍａｔ−ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：　６１４． ．１１５９（ＸＩ）配列の記載：　配列番号＝７ 丁ＣＡ　ＧＡＣＣＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＡＡＡ　Ｃ（Ｔ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＣ ＣＣＴ　ＣＴＧ　Ｃｃ入　ＧＡＣＣＣＴ　ＣＴＧ　５２９ＣＴＧ　ＧＡＣＭＣＦ 　ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＧＧＧ　ＧＣＣＣＴＣＣ ＡＧ　ＧＣＧ　ＡＧＧ　５７７Ｃ’ＴＣＴＣＣＡＴＧ　ＴＣＣＧＴＧ　ＡＣＣＡ ｃｅ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＧＧ　ＡＡＣ＾ＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣ９６ １ＧＡＧＧ＾τＣＣ１２７４ Ｇｌｙ＾Ｌａ　ｆ、＠ｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｖａｌ　ＡＬａ　にｉｎ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＶａＬ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｌ＊ｕ２Ｓ　３０　コ５　 ４０ （２）配列番号：９についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９１アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　一本鎮 Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｍｅ：　ＶａＬ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｓ＠ｒ　Ｍ＠ｔ　 Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＧＬｎ６５　フ０　７５　 ８０ （２）配列番号＝ＩＯについての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）４％さ：３８１アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　一本鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （目）配列の種類：　タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：！ＱＧＬｕ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ａｓ ｎ　Ｖａｌ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　１．、ａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｈ＠！： Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｃ凾■ ｌｏｏ　１０５　１１０ Ａ＊ｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　Ｌｓｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈ＠　Ｐｒｏ　 Ｌ＠ｕ　ＶａＬ　ＸＬ−Ａｓｐ　Ｔｙｒ：　Ｐｈｓ　Ｇ１ｎ１ｉｓ　１２０　１ ２５ ｋｍｎ　Ｇｉｎ　ＺＬａ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ：　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＺＬａ　Ｃｙａ 　Ｈ＠ｔ　Ｈｌｓｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙｓ　Ｌ凾■ １コｏ　１コｓ　１４０ （２）配列番号：１１についての情報：（１１配列の特徴： （Ａ）長さ：３６３アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　−木調 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （Ｉ　Ｉ）配列の種ａ：　タンパク質 （ｘｉ）配列の記載＝　配列番号；１１ＺＬ＠　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ ｕ　ＧＬｙ　にｌｕ　八ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅ ｕ　Ａｓｐ　λ１ａ２２５　２コ０　２３５　２４０ （２）配列番号：１２についての情報：（Ａ）長さ＝　７２３塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−木調 （ｐ）トポロジー：　直鎖状 （Ｉ　ｌ）配列の種Ｉ！［：　ｃＤＮ＾（Ｉ　ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．７２３ （ｘｉ）配列の記載：５！列番号＝１２（２）配列［１１３についての情報； （１）配列の特徴： （＾）長さ：２４１アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ＩＩ）配列の種［：　タンノイク質 （ｘｌ）配列の記載：　配列番号：１３τｙｔ （＾）長さ：　８０３塩基対 （Ｂ）盟：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本舗 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ＩＩ）配列の劃１１：ｃＤＮＡ （ｌｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　４４．、フ９９ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：１４Ｃτ八ＧＴτ入ＡＣ丁　入ＧＴへＣＧＣ ｋＡＧ　ＴＴＣＡＣＧτ入入入　入ｋ入面Ｇτ入ＴＣ入　ＧＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡ Ｇ　入面Ａ　入面Ａ@５５ ＣＣＣＴＧＧ　にＴＣ，Ａにτ　ττＣＡＣＣＡＯτ　丁τＴ　ＧＡＴ　ＴＴＡ 　入ＡＣＣＴＧ　ＧＣＣｊＬＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＣ５コ５（２）配列番号：１５ についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５１アミノ酸 （Ｂ）！！！　：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の［１１：　タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：１５ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｅ　Ｖａ Ｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｌｐ　ｎ−Ｔｈｅ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｌｙｖτｈ ｒ　ＶａＬコ５　４０　４５ Ｌｙ＊　ＬＹ−Ａｓｎ　Ｌ）４　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＴＹｒ　Ｐｒｏ　Ａ Ｌａ　Ｐｈｅ　ｕｓ　ＨＬｍ　Ｉｌ＠　Ｌ４１１Ｊ　＾１轟Ｐｈ・　入ｒｇ　Ｇ ｉｎ　Ｐｈｅ　Ｌ・ｕ　Ｈｌｓ　ＩＬ＠　ＴＹｒ　Ｓａｒ：　（ｉｌｎ　Ａｓｐ 　Ｖａｌ　入１ａ　Ｃｙ＊　丁ｙｔ　Ｇ撃■ （＾）長さ＝６６３塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本舗 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （目）配列の種類：　ｅＤＮ＾ （１り配列の特徴： （＾）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　９６．．６Ｓ８ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号＝１６ＱｃｈＴＣＣＧＧｋ＾　ττＣ入ＡＡτ ＡＴ：　ＣＴＣ入入入面にＡＧ　ＣＴＣτＴＣＡＣ入入　ＴＴ入Ａ入面ＡτＣＧ 　ＡＡＣＴＡＧＴＴ`Ａ　’＋０ ＣＴＡＣＴＡＣＧＣＡ　ＡＣττＣλＣＣ：＾　ＡＡＡＡＣ（：Ｃτ入τ　ＣＡ ＣＡ丁　ＡＴＣＧＡＧ　入ＡＡ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＣＴ　’|二３ ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＣＡＣＣＣＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣＡｃｅ　ＣＴＴ　ττＣＣ＾Ｔ 　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡｃＧ　てττ　４０P Ｓ＠ｒ　ＶａＬ　ＨＬｍ　ｌｒａ　Ｃ：／＠　Ｔｙ＋−τｈ＝　Ｖａｌ　Ｐｈ＠ 　Ｈｌｓ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｔ　Ｐｈ■ ＴＣ＾　τＣＧ　＋：？ＣＴＣ；Ｇ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＣＡＣＧＡＣＧＡ Ｔ　ＴＴＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ｔＴ’ｒ　ＣＴＡ　ＣＡＣ４４X ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＱＧＧ　ＴＴ−、ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　Ｔττ　 ＴＴＣＧＴＣＴＣ八　ＧＣｅ　ＡＡＴ　ＣＣＣＣＡＡ　５４T Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　＋Ｊｙ　Ｐｈａ　：Ｌ＠　Ｃ１ｕ　Ａ＠ｒ、Ｍａｃ　Ｐｈａ　 ）ｎ＊　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　入１ａ　八ａｎ　Ｐｒ＋　ＧＬｕ１３５　１４０　１ ４５　’　１５ｃ ＴＴＣ入ＡＣＧＧＣＡＴＴ　ＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡ　ＣＴＣ；　ＣＡＣＣＴ Ｃ入面Ａ　ＣＧＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＴＣ５９こｅＴＣＡＴＣＧＧＴ　ＣＴＣＣ ＡＣτＭＣＣＴＴ　６６３Ｌａｕ　Ｍ＠ＣＧＬｙ　Ｌ＠ＵＨＪ Ｂ５ （２）配列番号：１フについての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８７アミノ酸 （ＢＪ型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１＞配列の檀ａ：　タンパク質 （！ｌ）配列の記載：　配列番号：１７（ｘｌ）配列の記載：　配列番号：２５ ＧＴＣＣＴＣＡＴＣＧ　ＴＣＧＴＣにＴＳ；、？　フｃ：ｃｃｃ；ｔｃｃｃ　ｃ ：ｃｃ＝ｃｘ’ｒｃｃ　ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＡ（Ａ）長さ＝２３塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （］ｌ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：２６（Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の橿Ｋｉ：ＤＮ＾ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号＝２７（Ａ）長さ＝１３塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ＋）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：２８（２）配列番号：２９についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１４塩基対 （Ｂ）型；　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロンー：　直鎖状 （目）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：２９人ＡＴτＣＧＧＧ入Ｔ　ＴＧにＣ （２）配列番号、３０についての情報・（ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＝５９塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロンー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載：　配列番号：３０（２）配列番号：３１についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４５塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （百）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：３１（２）配列番号：３２についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ＋）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：３２ＴＡＣＡＣＣＧτＴτ　τＣＣｋＴＧｋ ＣＣＡ　λ＼ＣτＧλλλＣＯＴフτフＣλＴＣＧＣτＣτＣＧＧ（２）配列番 号：３３についての情報：（＋）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６０塩基対 （Ｂ）型：　核酸 ＧＬｙ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｍｅ：　Ｓｔ：　Ｃ４，ｎ　Ｌｙｓ　ＨＬ廖τｈｒ　 Ｇｌｕ　Ｍ＠ｔ　ＶｉｉＬ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ｓｅｔ　５ｅ■ （ｘｉ）配列の記載：　配列番号：３９φ−（Ｑ　υ−ψψ　０句　Ｑα　Ｑり 　１〜冨ｅ　：：；　＝＞　２こ　；＝　ｊ；写；二暮；Ａ又ＳＰ５ １０２０ＭＸ埼　’ＪＯ５０ＣＸｉ吟 １’１ＤＶＧＳＫＥＶＬＩ　ＥＳＰＰＤＹＳＡＡＰ　ＲＧＲＬＧＩＰＣＦＰ　５ ＳＬＫＲＬＬＩＩＶ　ＷＩＶＬＷＷＩ　ＶＧＡＬＬＭＧＬＨl ＴＬＣＧＥＶＰＬＦＹ　Ｉ　、　Ｆ　Ｉ　Ｇ、５じト　ズ４　イ入ＳＰ１８ ＦＩＧ、　７ ■τＴＡ　ＡＡＧ　ＡＣＣＧＴＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＣＡＣＡ ＡＧ　Ｔｎ　ＴＡＴ　ＣＣＧ　ＧＣＣＴＴＴ　ＡＴＴ　ＣＡb Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　 Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ｐｈｅ　PｉｅＨ１ｓ ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＡＧＴ’　ＧＴＴ 　ＣＡＣＣＣＴ　ＴＧＴτＡＣＡＣＣＧＴＴ　ＴＴＣＣＡＴ@ＧＡＧ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　ＴｒｐＡｓｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　） Ｉｔｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ@）Ｉｔｓ　Ｇｌｕ ＴＴＴ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＴＡ　ＴＡＴ　丁ＣＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　Ｇ ＣＧ　ＴＧＴ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＧＣbＴＡＴ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｏ　Ｖａｌ　 Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ@Ａｌａ　Ｔｙｒ ＡＧＴ　ＴＴＣＡＣＣＡＧＴ　ＴＴＴＧＡＴ　ＴＴＡ　ＡＡＣＧＴＧ　ＧＣＣＡ ＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＣＣＣ５ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ＭεＴ 　Ａｓｏ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ@Ａｌａ　Ｐｒ。

ＦＩＧ、８ ＴＡＴ　ＡＣＣＡＣＣＧＴＴ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＴＣＣＣＡＡ　丁ＧＧ　ＣＡＴ 　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＧＣ`　Ｔ丁Ｔ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔ１１ｒ　Ｖａｔ　ＡＳＤ　Ｉ　ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　丁ｒ ｏ　Ｈｌｓ　Ａｒ９　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｐｌ＋ｅ　fｌｕ　Ａｌａ　Ｐ ｌ＋［！ °口’Ｔ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　ＡＣＣＧＴＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　 ＣＡＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＣＣＧ　ＧＣＣＴＴＴ　ＡsＴ　ＣＡＣ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａ！　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　 Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ@Ｉｌｅ　ｌ−１１ ｓ ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＧＴＴ　 ＣＡＣＣＣＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＴＴ　ＴＴＣＣＡＴ@ＧＡＧ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＬｅＬＩ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　ＴｒＤ　ＡＳＩ）Ｓｅｒ　Ｖａｔ 　ＨＩＳ　Ｐｒｏ　ＣＹＳ　Ｔｙｒ　ＴＩＴｒ　Ｖａｔ　Ｐ■■@Ｈｌｓ　ＧＩ ＬＩ Ｔ丁Ｔ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　Ｇ ＣＧ　丁ＧＴ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＧＣbＴＡＴ Ｐｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｏ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅ普@Ａｌａ　Ｔｙｒ 表＆１ｆｆ−（−θ／ｆｆ’ｌ） Ｌ面ＦＬ（、−、Ｎ／、、、） 表６Ｄ　た　（ｍＮ／ｍ） 表　＆Ｊ　圧　（ｍＮ／ｍ） 表　ω　瓜　（ｍＮ／ｍ） 表命瓜　（ｍＮ／ｍ） 要約書 ヒ）ＳＰ−１８およびヒト５Ｐ−５由来の様々な特定のペプチドが、肺胞界面タ ンパク質（Ａ　Ｓ　Ｐ）活性を有している。

これらのペプチドは、合成法あるいは組換え技術によって調製される。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＳＰ活性を有し、かつ以下の配列を持つ精製ポリペプチドまたは薬学的に 許容され得るその塩あるいはアミド：【配列があります】 ここで、ＡＡ２８はＣｙｓあるいはＳｅｒ、ＡＡ２９はＣｙｓあるいはＳｅｒ、 ＡＡ３０はＰｒｏあるいはＡｌａ、 ＡＡ３１はＶａｌあるいはＧｌｎ、 ＡＡ３２はＨｉｓあるいはＬｙｓ、 ＡＡ３３はＬｅｕあるいはＡｌａ、 ＡＡ３４はＬｙｓあるいはＧｌｎ、 ＡＡ３５はＡｒｇあるいはＧｌｎ、 Ｚは、ＶａｌあるいはＩｌｅのいずれか、ＹはＯＨ、【配列があります】、【配 列があります】、【配列があります】、あるいは【配列があります】、 ここで、Ｙ１は、図３の６０〜７４位のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミノ 酸のＣ末端伸長配列、そしてＸは、Ｈあるいは【配列があります】、【配列があ ります】、あるいは【配列があります】、 ここで、ＡＡ２７は、ＰｒｏあるいはＡｌａ、ＡＡ２６は、ＩｌｅあるいはＳｅ ｒ、そしてＸ′は、Ｈあるいは図３の１〜２５位のアミノ酸に相当する１〜２５ 個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；ここで、条件として、Ｘが【配列があります】 のとき、ＹはＨｉｓ−Ｙ１であり、ここでＹ１は６０〜６６位のアミノ酸のＣ末 端伸長配列であり、そしてすべてのＺはＶａｌであり、ＡＡ２８−ＡＡ３５は【 配列があります】（配列番号５）および（配列番号６）となり得ない、ポリペプ チドまたはその塩あるいはアミド。 ２．前記Ｙが【配列があります】あるいは【配列があります】である、請求項１ に記載のポリペプチド。 ３．前記ＸがＨ、ＡＡ２７−、【配列があります】、【配列があります】、ある いは【配列があります】である、請求項１に記載のポリペプチド。 ４．前記ＸがＨ、ＡＡ２７−、【配列があります】、【配列があります】、ある いは【配列があります】である、請求項２に記載のポリペプチド。 ５．前記ＡＡ２８およびＡＡ２９の両方がＳｅｒである、請求項４に記載のポリ ペプチド。 ６．前記ＡＡ２７およびＡＡ３Ｂの両方がＡｌａである、請求項５に記載のポリ ペプチド。 ７．前記ＡＡ３１がＧｌｎ、ＡＡ３２がＬｙｓ、そしてＡＡ３３がＡｌａである 、請求項６に記載のポリペプチド。 ８．以下から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド ： 【配列があります】（配列番号：３５），【配列があります】（配列番号：３６ ），【配列があります】（配列番号：３７），【配列があります】（配列番号： ３８）および【配列があります】（配列番号：５）および（配列番号：６）．９ ．以下のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド： 【配列があります】（配列番号：３９）．１０．以下のアミノ酸配列を有する、 請求項１に記載のポリペプチド： 【配列があります】（配列番号：４０）．１１．哺乳類の呼吸逼迫症（ＲＤＳ） を治療するのに有効な製薬組成物であって、請求項１に記載のポリペプチドを薬 学的に許容され得る賦形剤との混合で含有する、製薬組成物。 １２．哺乳類の呼吸逼迫症（ＲＤＳ）を治療する方法であって、そのような治療 を必要とする哺乳類に請求項１に記載のポリペプチドを有効量与えることを包含 する、方法。 １３．請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡから実質的になる、単離さ れた形態の、組換えＤＮＡ。 １４．組換え宿主中に形質転換された場合に、請求項１３に記載のＤＮＡを発現 し得る発現系を含む、ＤＮＡ。 １５．請求項１４に記載の発現系で形質転換された、組換え宿主。 １６．以下の配列のペプチドまたはその塩あるいはアミドを産生する方法であっ て、 【配列があります】， ここで、ＡＡ２８はＣｙｓあるいはＳｅｒ、ＡＡ２９はＣｙｓあるいはＳｅｒ、 ＡＡ３０はＰｒｏあるいはＡｌａ、 ＡＡ３１はＶａｌあるいはＧｌｎ、 ＡＡ２２はＨｉｓあるいはＬｙｓ、 ＡＡ３３はＬｅｕあるいはＡｌａ、 ＡＡ３４はＬｙｓあるいはＧｌｎ、 ＡＡ３５はＡｒｇあるいはＧｌｎ、 Ｚは、ＶａＩあるいは１１ｅのいずれか、ＹはＯＨ、【配列があります】、【配 列があります】、【配列があります】、あるいは【配列があります】、 ここで、Ｙ、は、図３の６０〜７４位のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミノ 酸のＣ末端伸長配列、そしてＸは、Ｈあるいは【配列があります】、【配列があ ります】、あるいは【配列があります】からなる群から選択されるアミノ酸配列 、 ここで、ＡＡ２２７は、ＰｒｏあるいはＡｌ３、ＡＡ２６は、ＩｌｅあるいはＳ ｅｒ、そしてＸ′は、Ｈあるいは図３の１〜２５位のアミノ酸に相当する１〜２ ５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；ここで、条件として、Ｘが【配列があります 】のとき、ＹはＨｉｓ−Ｙ１であり、ここでＹ１は６０〜６６のアミノ酸のＣ末 端配列であり、すべてのＺはＶａｌであり、ＡＡ２８−ＡＡ３５は【配列があり ます】となり得ず、 請求項１５に記載の細胞を培養する工程、およびペプチドを回収する工程を含む 、方法。 １７．ＡＳＰ活性を有し、そして図３の２０１位から、２７５−２８１位のアミ ノ酸として示された配列を持つ、精製されたポリペプチド。