KR101201020B1 - 감마-카르복실화된 단백질의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 다량의 감마-카르복실화된 단백질을 제조하는 방법 및 수단에 관한 것이다.

Description

감마-카르복실화된 단백질의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING GAMMA-CARBOXYLATED PROTEINS}
본 발명은 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감마-카르복실화를 요하는 단백질을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
출혈은 일반적인 임상적 문제이다. 출혈은 질병, 외상, 수술 및 의료적 처치로 인하여 발생한다. 출혈을 물리적으로 차단하는 하는 일은 긴급한 일이다. 그러나 출혈의 위치로 인하여 또는 출혈은 수많은 (작은) 혈관으로부터 확산하여 발생하기 때문에 출혈의 차단은 쉽지 않은 일이거나 또는 심지어 불가능할 수도 있다. 따라서 출혈이 있는 환자는 지혈을 촉진하는 제제를 사용하여 처리할 필요가 있을 수 있다. 이 제제는 혈액 유래의 제품(혈액요법), 내인성 지혈제의 방출을 유발하는 제제, 재조합 응고 인자(F), 또는 응혈의 분해를 지연시키는 제제일 수 있다.
흔히 지역의 병원으로부터 입수되는 혈액 유래 제품 중에서도 1차적 치료제 로는 용적 대체 및 지혈 촉진을 위한 전혈, 산소 수송능의 향상을 위한 포장된 적혈구, (혈소판의 수가 적거나 결함이 있다면) 혈소판의 수를 증가시키기 위한 혈소판 농축물 및 지혈(혈액 응고 및 혈소판 응집)의 촉진을 위한 신선한 냉동 혈장이 있다. 지혈을 촉진하는 2차적 혈장 유래 제품으로는 혈장 냉동침전물, 프로트롬빈 복합 농축물, 활성화된 프로트롬빈 복합 농축물 및 정제된 응고 인자가 있다. 몇 종의 응고 인자가 오늘날 인간 재조합 단백질, 불활성 응고 인자 VIII 및 IX 및 활성화 응고 인자 VIIa로서 시판되고 있다.
혈우병은 비정상 또는 결함성 응고 인자를 보유하거나 향응고 기능을 억제하는 응고 인자에 대해 생성된 항체를 보유하는 유전병 또는 후천성 출혈병이다. 가장 흔한 혈우병은 A형 혈우병(응고 인자 VIII 결함) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX 결함)이다. 정제된 또는 재조합 단일 응고 인자는 혈우병 환자의 주요 치료제이다. 억제성 항체를 보유한 환자는 그 항체가 이들 환자에게 투여된 응고 인자를 중화시킬 수도 있기 때문에 치료에 어려움을 부과한다. 단백질 C(APC)의 활성형은 활성화된 응고 인자 Va 및 VIIIa의 분해에 의한 혈장 응고의 억제제이다. 재조합 APC는 패혈증 환자에 나타나는 과도한 혈장 응고의 효과적인 치료제인 것으로 확인되었다.
치료용 응고 인자는 인간의 혈장으로부터 입수할 수도 있지만, 그 정제 과정이 간단하지 않고 여러 단계를 거쳐야 하는데, 그 중 몇 단계는 오염성 바이러스를 제거하기 위한 단계이다. 그러나 혈액 유래 제품의 철저한 안전성 기준 및 테스트에도 불구하고 감염성 바이러스 또는 프리온에 의한 오염은 배제할 수가 없다. 이러한 위험 요인으로 인하여, 동물 유래 성분이 함유되지 않은 배지에서 배양한 재조합 세포 유래의 치료용 인간 단백질을 제조할 것이 절실히 요구되고 있다. 다수의 단백질은 포유동물 숙주에 의해 완벽한 기능을 갖는 형태로 생성될 것, 즉 정확하게 번역후 변형될 것을 요하기 때문에 상기와 같은 단백질의 제조가 항상 수월한 일은 아니다. 재조합 세포에서 제조하여 시판되고 있는 응고 인자에는 FVII(NovoSeven), FVIII(Kogenate, Recombinate, Refacto) 및 FIX(BeneFix)(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997) 및 활성 단백질 C(Xigris)가 있다. 완전한 기능을 갖는 재조합 인간 응고 인자를 다량으로 얻는 데 있어 주된 장애 요인 중 하나는 FII, FVII, FIX, FX 및 단백질 C에 존재하는 Gla-도메인에 있다. 이 도메인은 카르복실기의 추가에 의해 번역후 변형된 글루탐산 잔기를 포함한다. 이러한 인자들의 생산은, 이들의 과발현이 카르복실화 정도를 감소시키고 그로 인하여 불활성 단백질을 생성하게 된다는 점에서 장애가 되고 있다. Gla 변형은 γ-글루타밀 카르복실라제(γ-glutamyl carboxylase; GGCX)로 불리는 비타민 K 의존성 효소의 작용에 의한 것이다. 이 효소는 여러 과학자들, 특히 응고 인자 연구에 관여하는 과학자들에 의해 집중적으로 연구되었다(WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038):1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). 적어도 두 그룹의 연구진에 의해 GGCX와 응고 인자 FIX를 동시에 발현시킴으로써 수율을 증가시키고자 하는 시도가 이루진 바 있으나 성공하지 못하였다(Rehemtulla, et al. 1993, ibid Hallgren et al. 2002, ibid). γ-카르복실화 단백질의 중요성이 크다는 점을 고려하면, 훨씬 더 많은 동시 발현 시도가 행해졌으나 실패하였기 때문에 보고되지 않았음을 추측할 수 있다.
인간 FII(프로트롬빈)의 경우 완전한 기능의 프로트롬빈을 얻기 위해서는 10개의 Glu 잔기 중 적어도 8개가 정확하게 변형되어야 한다(Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and Walz 'Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986). CHO 세포, BHK 세포, 293 세포 및 백시니아 바이러스 발현 시스템과 같은 몇 종의 상이한 시스템을 이용하여 높은 생산량의 rhFII를 얻고자 많은 노력이 기울여졌으나 모두 실패하였거나 아니면 카르복실화 정도가 낮은 생성물이 생성되어 기능적 불활성의 프로트롬빈이 생성되었다(Jorgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). 그보다 전에는 카르복실화 재조합 인간 프로트롬빈에 대한 생산성이 낮은 것으로 보고되었는데, 즉, 돌연변이 프로트롬빈의 경우 20 mg/L(Cote et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), CHO 세포에서 발현된 인간 프로트롬빈의 경우 0.55 mg/L(완전 카르복실화, Jorgensen et al. 1987, ibid), CHO 세포에서는 25 mg/L(카르복실화 정도가 제시되지 않음, Russo et al. 1997, ibid)이었다.
WO 92/19636은 인간 및 소의 비타민 K 의존성 카르복실라제의 클로닝 및 서열 확인 결과를 개시한다. 이 출원은 비타민 K 의존성 단백질을 제조하기 위해 비타민 K 의존성 카르복실라제와 비타민 K 의존성 단백질을 적절한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 방법을 제안한다. 그러나 카르복실라제와 비타민 K 의존성 단백질의 동시 발현이 예시되어 있지는 않다.
따라서, 활성화된 혈액 응고 인자를 고수율로 생산할 수 있는 개선된 방법이 요구되는 실정이다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하기 위한 방법을 제시한다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따르면, 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터는 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 (ii) γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하도록 조작된 세포가 제공되는데, 이때 상기 단백질 (i) 및 (ii)는 10:1～500:1의 비로 발현된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
(i) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질을 코딩하고, 세포에 의한 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(ii) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의한 카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 상기 카르복실화를 요하는 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포가 제공되는데, 이때 상기 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질과 카르복실화를 요하는 단백질을 적어도 1:10의 비로 발현할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 감마-카르복실화 단백질의 제조 방법이 제공되는데, 이 방법은, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 인자 IX를 제조하는 데 이용되며, 다른 구체예에서 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 프로트롬빈을 제조하는 데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 제조된 감마-카르복실화 단백질은 인간 감마-카르복실화 인자 X이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물 세포주에서 감마-카르복실화 단백질을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 포유동물 세포주에서의 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 동시에 발현시키는 단계로서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질의 발현량이 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현량보다 10배 이상 더 많은 것인 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 인자 IX의 제조에 이용되며, 다른 구체예에서 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 프로트롬빈을 제조하는 데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 제조된 감마-카르복실화 단백질은 인간 감마-카르복실화 인자 X이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질 및 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질을 응고 치료에 사용하는 용도 또는 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질을 응고 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하는 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 혈액 응고를 유도하거나 응고 증가 또는 응고 감소를 촉진하는 데 적합한 약학 조성물의 제조 방법 및 이 방법으로부터 얻을 수 있는 약학 조성물이 제공되는데, 상기 방법은 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 10:1～500:1의 비로 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 활성형 카르복실화 단백질을 정제하는 단계; 및 정제된 카르복실화 단백질을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인간 인자 IX이며, 또 다른 구체예에서 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인간 프로트롬빈이다. 또 다른 구체예에서, 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인자 X이다.
도 1a는 PN32(프로트롬빈 + GGCX) 동시 발현 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 1b는 Ptext5(프로트롬빈) 발현 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 2는 PP6(프로트롬빈 + GGCX) 동시 발현 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 3a는 F9NopA(인자 IX + GGCX) 동시 발현 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸다.도
3b는 F9hglx(인자 IX + GGCX) 동시 발현 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸다.
본 발명자들은, 비타민 K 의존성 응고 인자와 γ-글루타밀 카르복실라제(GGCX)를 서로 다른 비율로 동시에 발현시키는 것을 포함하는, 적절히 카르복실화된 재조합 비타민 K 의존성 응고 인자를 다량으로 발현시키는 다른 방법을 개발하였다. 한 예로서 본 발명자들은 인간 프로트롬빈(rhFII) 및 인간 GGCX를 발현시켰다. 다른 연구자들이 시도했던 것 처럼(Rehemtulla et al., 1993, ibid Hallgren et al., 2002, ibid) rhFII 및 GGCX 둘 다에 대해 강력한 프로모터를 사용하는 대신에, 본 발명자들은 GGCX의 발현량이 rhFII의 발현량의 1/10 미만이 되도록 GGCX의 발현을 약하게 또는 매우 약하게 함과 동시에 FII를 다량 발현시키는 방법을 이용하였다. 놀랍게도 이 방법에 의하면, 심지어 세포가 동물 성분을 함유하지 않는 화학 조성이 규정된 배지에서 배양되는 경우에도, 정확히 변형된 rhFII가 다량 분비되었고 숙주 세포의 생존력이 우수하였다.
본 발명자들은 프로트롬빈 mRNA 수준이 GGCX mRNA 수준을 적어도 10배 초과하도록 GGCX 및 인간 프로트롬빈을 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 결과 GGCX 단백질에 비해 다량의 프로트롬빈 단백질이 생산되었다.
또 다른 예로서 본 발명자들은 상기 GGCX 동시 발현 벡터를 사용하여 rhFIX를 발현시켰다. 그 결과 한 사례에서는 인자 IX mRNA를 GGCX mRNA 수준보다 10배 이상 많은 수준으로 생산하는 세포주를 얻었다. 또 다른 세포주에서는, 인자 IX mRNA 대 GGCX mRNA의 비가 약 4～5:1이었다. 적어도 10:1의 비를 제공하는 세포주만이 rhFIX 생산성을 크게 증가시켰다(표 1).
[표 1]
생산성 및 카르복실화 단백질:GGCX mRNA 비의 요약
클론명/구성체 생산된
단백질		 활성이 완전한
단백질의 생산성*
(mg/l)		 카르복실화
단백질:GGCX,
근사 mRNA 비		 데이터 출처
P1E2/PN32 인간 프로트롬빈


 40 250:1 실시예 3
B2F4/PP6 26 50:1 실시예 5
H3B10/PP6 30 30:1 실시예 5
E1A9/PText5 3.5 GGCX 없음 실시예 3
N4D5/F9NopA 인간 FIX

 7.3 45:1 실시예 7
P1G9/F9hglx 1.3 4:1 실시예 7
IC4 1
Figure 112009062038406-pct00001
 GGCX 없음 Rehemtulla 1993,
US 5,460,950

* 생산성은 유사한 생육 조건 하에 스피너 배양물로부터 측정되었다.
Figure 112009062038406-pct00002
Rehemtulla 1993 및 미국 특허 제5,460,950호로부터의 데이터.
본 발명의 GGCX와의 동시 발현법에 의해 생산된 비타민 K 의존성 응고 인자(FII, FVII, FIX, FX 및 이들의 활성형 FIIa 또는 트롬빈, FVIIa, FIXa, FXa)는 간, 신장, 혈소판 또는 혈액 응고 인자의 질환(혈우병), 수술 또는 외상후 출혈의 예방 및 치료에 유용할 것으로 예상할 수 있다. 유사하게, 응고 인자 단백질 C 및 이것의 활성형 APC는 단백질 C 수준의 감소를 동반하거나 동반하지 않은 응고 증가에 기인한 질병의 예방 및 치료에 유용할 것으로 예상할 수 있다. 이 방법은 번역후 카르복실화를 요하는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터는 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다.
바람직한 구체예에서, 발현된 단백질의 비는 10:1～1000:1, 더 바람직하게는 10:1～500:1, 더욱 더 바람직하게는 25:1～250:1이다. 특히 적절한 비는 약 200:1이다.
또 다른 구체예에서, 발현된 두 단백질의 비는 적어도 10:1, 30:1, 45:1, 50:1, 100:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1, 500:1 및 1000:1이다.
특정한 한 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자 양자는 동일한 벡터 상에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 이러한 두 핵산 분자는 별개의 발현 벡터 상에 위치한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열 번호 14 및 서열 번호 15에 기재된 핵산 서열이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 인자 IX의 발현을 위한 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열을 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 응고 인자 IX 및 인간 감마 카르복실라제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포가 제공되는데, 이때 인간 응고 인자 IX를 코딩하는 핵산과 감마 카르복실라제를 코딩하는 핵산은 상기 두 단백질을 각각 적어도 10:1의 비로 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 응고 인자 IX와 인간 감마 카르복실라제 효소를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 비인간 진핵 숙주 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 인간 응고 인자 IX를 코딩하는 핵산과 감마 카르복실라제를 코딩하는 핵산은 상기 두 단백질을 각각 적어도 10:1의 비로 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, hCMV 프로모터의 조절 하에 인간 응고 인자 IX 코딩 핵산을 포함하고 SV40 프로모터의 조절 하에 인간 카르복실라제 코딩 핵산을 포함하는 외인성 핵산을 보유하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 기재된 핵산이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 프로트롬빈의 발현을 위한 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 프로트롬빈 및 인간 감마 카르복실라제 효소를 발현할 수 있는 숙주 세포가 제공되는데, 이때 인간 프로트롬빈을 코딩하는 핵산과 감마 카르복실라제를 코딩하는 핵산은 상기 두 단백질을 각각 적어도 10:1의 비로 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 인간 프로트롬빈 및 인간 감마 카르복실라제 효소를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 비인간 진핵 숙주 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 인간 프로트롬빈을 코딩하는 핵산과 감마 카르복실라제를 코딩하는 핵산은 상기 두 단백질을 각각 적어도 10:1의 비로 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, hCMV 프로모터의 조절 하에 인간 프로트롬빈 코딩 핵산을 포함하고 SV40 프로모터의 조절 하에 인간 카르복실라제 코딩 핵산을 포함하는 외인성 핵산을 보유하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명은 카르복실화를 요하는 단백질로서 프로트롬빈 및 응고 인자 IX를 사용하여 예시하였다. 그러나, 프로트롬빈 및 인자 IX 이외에도 몇 종의 단백질이 완전한 생물학적 활성을 위해 정확한 γ-카르복실화에 의존한다. 알려진 것으로는 응고 인자 FVII가 있는데, 이것은 현재 단지 재조합 포유동물 세포에서 비교적 낮은 수준으로(약 10 mg/L 이하) 상업적으로 생산되고 있다. 본 발명은 비한정적인 예로서 프로트롬빈, 응고 인자 II(FII), 응고 인자 VII(FVII), 응고 인자 IX(FIX), 응고 인자 X(FX), 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 골 Gla 단백질(BGP 또는 오스테오칼신으로도 알려짐), 기질 Gla 단백질(MGP), 프롤린 풍부 Gla 폴리펩티드 1(PRRG1), 프롤린 풍부 Gla 폴리펩티드 2(PRRG2), 성장 저지 특이적 단백질 6(Gas 6)을 비롯하여, γ-카르복실화에 의존하는 임의의 단백질의 생산성을 향상시키는 데 적용될 수 있다. 다른 적합한 단백질로는 코브라과 독사[아칸토피나(Acanthophiina) 아과]의 독액 및 청자 고둥(Conus textile) 중의 FXa 유사 단백질이 있다.
그 핵산 서열과 아미노산 서열을 포함하여 이들 단백질 각각은 잘 알려져 있다. 표 2는 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 단백질의 야생형 및 돌연변이형의 대표적인 서열을 제시한다.
[표 2]
설명 cDNA EMBL
ACC#		 스플라이스 변이체
(단백질)		 돌연변이 유전자
EMBL ACC#
글루타메이트
감마
카르복실라제		 BC013979 2;
BC013979; AF253530		 1 SNP
(EMBL# U65896);
2 SNP
(OMIM# 137167)		 U65896
프로트롬빈 V00595 1; V00595 약 100 SNP
(EMBL# AF478696)		 AF478696
인자 VII AF466933 4;
AF466933; AF272774;
AR030786; AAN60063		 21 SNP
(OMIM# 277500)		 J02933
인자 IX A01819 3;
A01819; A34669;
M19063		 5 SNP
(EMBL# AF536327);
108 SNP
(OMIM# 306900)		 AF536327
인자 X BC046125 4;
BC040125; M57285;
AR095306; AB005892		 118 SNP
(EMBL# AF503510);
14 SNP
(OMIM# 227600)		 AF503510
단백질 C BC034377 7;
AB083690; AB083693;
I09623; S50739;
S72338		 57 SNP
(EMBL# AF378903); 25 SNP
(OMIM# 176860)		 AF378903
오스테오칼신 AF141310 5;
AF141310; AF141310;
BC033656; X04143;
X51699		 X04143
기질 GLA 단백질 BC005272 1; BC005272
성장 저지 특이적 6;
AXL 자극 인자		 BC038984 1; BC038984
단백질 Z M55670 2;
AB033749; AB033749
프롤린 풍부 Gla
(G-카르복시글루탐산) 폴리펩티드 1		 AF009242 2;
AF009242; BC030786
프롤린 풍부 Gla
(G-카르복시글루탐산) 폴리펩티드 2		 AF009243 2;
AF009243; BC026032
비타민 K 의존성
단백질 S 전구체		 BC015801 1; BC015801 약 100 SNP
(EMBL# AY308744);
8 SNP
(OMIM# 176880)		 AY308744
본 발명은 특정 단백질이나 동시에 발현될 수 있는 상기 단백질들 중 하나의 단백질 코딩 서열에만 한정되는 것은 아님을 이해할 것이다. 또한, 구체적으로 혈액 응고 인자와 관련하여 상기 단백질의 다수의 돌연변이 형태가 당해 기술 분야에 알려져 있다. 본 발명은 자연 발생 대립 유전자 변이체를 비롯하여 이들 단백질의 이러한 돌연변이 형태에도 동등하게 적용되며, 야생형 서열에도 동등하게 적용된다. 한 구체예에서, 본 발명은 임의의 야생형 단백질 또는 이에 대해 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다.
두 서열 간의 서열 동일성은 BestFit, PILEUP, Gap 또는 FrameAlign과 같은 프로그램을 이용하여 쌍대(pair-wise) 컴퓨터 정렬 분석에 의해 결정할 수 있다. 바람직한 서열 정렬 도구는 BestFit이다. 실제로, 서열 데이터베이스로부터 질의 서열에 대하여 유사하거나 동일한 서열을 검색하고자 할 때, 일반적으로 Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, 또는 Fasta3과 같은 적절한 알고리즘 및 Blosum 62와 같은 측정 행렬을 이용하여 유사한 서열의 초기 확인 작업을 수행할 필요가 있다. 이러한 알고리즘은 Smith-Waterman의 "골드-스탠더드(gold-standard)" 정렬 알고리즘에 근접하고자 한 것이다. 따라서, 유사성, 즉 두 개의 1차 폴리펩티드 서열이 어떻게 정렬되는지를 평가하는 데 사용하기 위한 바람직한 소프트웨어/검색 엔진 프로그램은 Smith-Waterman이다. 동일성이란 직접적 일치를 의미하며, 유사성은 보존 치환을 허용하는 의미이다.
본원에서 사용되는 용어 "γ-글루타밀 카르복실라제" 또는 "GGCX"는 글루탐산 잔기의 카르복실화를 촉진하는 비타민 K 의존성 효소를 의미한다.
GGCX 효소는 널리 분포되어 있으며, 흰돌고래 델피나프테러스 루카스( Delphinapterus leucas), 복어 옵사너스 타우(Opsanus tau), 닭(Gallus gallus), 먹장어(Myxine glutinosa), 투구게(Limulus polyphemus) 및 청자 고둥 코너스 텍스타일(Conus textile)과 같은 다수의 상이한 종으로부터 클로닝되었다(Begley et al., 2000, ibid Bandyopadhyay et al. 2002, ibid). 청자 고둥 유래의 카르복실라제는 소의 카르복실라제와 유사하며, COS 세포에서 발현되었다(Czerwiec et al. 2002, ibid). GGCX와 유사한 또 다른 단백질은 곤충 및 원핵생물, 예컨대 아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) 및 렙토스피라(Leptospira)에서 확인할 수 있으며, 이들의 NCBI 수탁 번호는 각각 gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548이다(Bandyopadhyay et al., 2002, ibid). 카르복실라제 효소는 두드러진 진화적 보존성을 나타낸다. 비인간 효소 중 몇 종은 본 발명자가 사용한 인간 GGCX의 활성과 유사한 활성을 나타내었거나 이를 보유하고 있을 것으로 예상되며, 따라서 인간 효소의 대용물로 사용될 수 있다.
표 3은 본 발명에 사용될 수 있는 인간 GGXC와 상동성인 예상 단백질(종의 유래에 따라 분류됨)의 대표적인 서열을 제시한다.
[표 3]
종 데이터 베이스
수탁 번호/ID
호모 사피엔스(Homo sapiens)(인간) NM_000821.2
HUMGLUCARB
HUMHGCA
BC004422
HSU65896
AF253530.1
파피오 하마드리아스(Papio hamadryas)(붉은털 개코원숭이) AC116665.1
델피나프테러스 루카스(Delphinapterus leucas)(흰돌고래) AF278713
보스 타우러스(Bos taurus)(소) NM_174066.2
BOVCARBOXG
BOVBGCA
오비스 아리스(Ovis aries)(가축 양) AF312035
라터스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(시궁쥐) NM_031756.1
AF065387
무스 무스컬러스(Mus musculus)(마우스) NM_019802.1
AF087938
옵사너스 타우(Opsanus tau)(경골어) AF278714.1
코너스 텍스타일(Conus textile)(연체동물) AY0044904.1
AF382823.2
코너스 임페리알리스(Conus imperialis)(연체동물) AF448234.1
코너스 에피스코파터스(Conus episcopatus)(연체동물) AF448233.1
코너스 오마리아(Conus omaria)(연체동물) AF448235.1
드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster)(초파리) NM_079161.2
아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae)(모기) XM_316389.1
세칼 세레알(Secale cereale)(외떡잎 식물) SCE314767
트리티컴 아에스티범(Triticum aestivum)(보통밀) AF280606.1
트리티컴 우라투(Triticum urartu)(외떡잎 식물) AY245579.1
호르데움 불가레(Hordeum vulgare)(보리) BLYHORDCA
렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)(파상균) AE011514.1
스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)
(고 GC 그램+ 박테리아)		 SCO939109
SCO939124
AF425987.1
스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)(고 GC 그램+ 박테리아) SLU22894
스트렙토마이세스 비기니아(Streptomyces viginiae)(고 GC 그램+ 박테리아) SVSNBDE
마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(고 GC 그램+ 박테리아) MLSPCOPER
클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)(녹조류) AF479588.1
딕티오스테리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)(점균류) AC115612.2
코투닉스 코투닉스(Coturnix coturnix)(조류) AF364329.1
브래디리조븀 자포니컴(Bradyrhizobium japonicum)(α-프로테오박테리아) AP005937.1
로도박터 스파에로이드(Rhodobacter sphaeroides)(α-프로테오박테리아) RSY14197
시노리조븀 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)(α-프로테오박테리아) RME603647
AF119834
메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti)(α-프로테오박테리아) AP003014.2
크로모박테리움 비오라세움(Chromobacterium violaceum)
(β-프로테오박테리아)		 AE016910.1
AE016918.1
슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(γ-프로테오박테리아) AE004613.1
AF165882
잔토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis)(γ-프로테오박테리아) AE011706.1
인간 허피스바이러스 8(Human herpesvirus 8) KSU52064
KSU75698
AF305694
AF360120
AF192756
상기한 GGCX 단백질 및 다른 종 유래의 GGCX 단백질 각각은 본 발명에서 카르복실라제 효소로서 사용될 수 있다.
2종의 동시 발현된 단백질을 차등적으로 발현시키기 위한 한 가지 방법은 각각의 발현 조절 서열의 일부로서 서로 다른 프로모터를 사용하는 것이다. 당해 기술 분야에는, 이종성 단백질을 상이한 정도 또는 수준으로 발현시킬 수 있는 다른 프로모터 및 기타 발현 조절 서열의 예가 충분히 존재한다. 재조합 발현 기법은 단백질 발현 분야의 기술자가 카르복실화를 요하는 단백질과 카르복실라제를 원하는 비로 동시 발현시킬 수 있는 프로모터 및 기타 조절 서열을 선택할 수 있도록 충분히 진보하였다. 사용할 특정 프로모터와 기타 발현 조절 서열의 선택은 개개의 선택 사항이다.
한 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 관련된 조절 서열은 강력한 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서 이것은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기(immediate-early) 프로모터이다. 본원에서 강력한 프로모터는 세포당 1000개를 초과하는 전사체를 생성하게 하는 프로모터로서 정의된다. 본원에서 약한 프로모터는 세포당 1000개 미만의 전사체를 생성하게 하는 프로모터로서 정의된다.
또 다른 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제와 관련된 조절 서열은 약한 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, 이것은 SV40 초기 프로모터이다. 또 다른 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제는 상이한 프로모터 요소의 조절 하에 위치하며, 이때 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현을 조절하는 프로모터가 감마-카르복실화를 요하는 단백질의 발현을 조절하는 프로모터보다 더 약하다.
또 다른 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 SV40 초기 프로모터의 조절 하에 위치하며, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기 프로모터의 조절 하에 위치한다. 본 발명의 이러한 특정 측면에 따른 한 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인간 인자 X이다. 또 다른 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인간 프로트롬빈이다. 또 다른 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인간 인자 IX이다.
본 발명은 인자 IX 또는 프로트롬빈을 과발현시키기 위한 강력한 CMV 프로모터(Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985)와 GGCX 발현을 조절하기 위한 약한 SV40 프로모터(Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994)를 사용하여 예시하였다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 강력한 프로모터로는 pEF-1α[인간 연장 인자-1α 서브유닛 유전자](Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996), pRSV[라우스 육종 바이러스](Gorman et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982) 및 pUbC[인간 유비퀴틴](Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
생산하고자 하는 단백질(카르복실화를 요하는 단백질)이 변형 효소에 비하여 과량이 되도록, 적어도 10:1의 비가 되도록 하는 것이 중요하다. 변형 효소(γ-글루타밀 카르복실라제)의 발현 수준을 낮출 수 있는 방법은
1) 변형 효소의 발현을 조절하기 위해, SV40 즉시 초기 프로모터, 소형 FIX 프로모터(Rouet et al., The Journal of Biological Chemistry 267:20765-20773, 1992) 또는 HSV 티미딘 키나제 프로모터(Wenger et al., 1994, ibid)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 약한 프로모터를 사용하는 방법;
2) 프로모터 강도를 약화시키기 위해 강력한 프로모터의 프로모터 또는 인핸서 서열을 돌연변이시키는 방법;
3) 번역 효율을 감소시키기 위해 Kozak 서열(번역 개시 시그널)을 제거하거나 변경하는 방법(Kozak. Nuc Acids Res 15:8125-8148, 1987; Kozak. Proc Natl Acad Sci USA 87:8301-83051987, 1990);
4) 생산하고자 하는 단백질(카르복실화를 요하는 단백질)을 코딩하는 핵산 및 GGCX를 코딩하는 핵산을 별개의 벡터 상에 클로닝하고, 생산하고자 하는 단백질을 포함하는 구성체를 과량으로 사용하여 형질감염시켜, 생산하고자 하는 단백질을 포함하는 구성체를 복수 카피 갖는 세포를 생성하는 방법;
5) 생산하고자 하는 단백질을 코딩하는 DNA 및 GGCX 변형 벡터를 코딩하는 DNA를 별도의 벡터 상에 클로닝하고, 동시에 형질감염시키거나 별도로 형질감염시키고, 생산하고자 하는 단백질의 발현량을 증폭시키기 위한 증폭 시스템을 사용하는 방법;
6) 재조합에 의해 낮은 수준(단, 내인성 수준 이상)의 GGCX를 발현하는 안정한 세포를 분리하여 γ-카르복실화를 요하는 단백질 발현용 숙주 세포주로서 사용하는 방법;
7) GGCX에 돌연변이(들)를 도입하여 GGCX 기질 친화성을 감소시키는 방법
을 포함한다.
이 밖에도, 재조합 단백질 발현 분야의 기술자라면 카르복실화를 요하는 단백질과 카르복실라제 단백질을 적어도 10:1의 비로 발현하는 숙주 세포를 생성하는 데 이용될 수 있는 다른 방법들도 알 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 (ii) γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하도록 조작 또는 변형된 세포가 제공되는데, 이때 상기 단백질 (i) 및 (ii)는 10:1～500:1의 비로 발현된다. 특정 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 내인성 수준(즉, 비조작 또는 비변형 세포에서의 수준)보다 2～5배 많이 발현된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (i) 동등한 비조작 세포에서 관찰되는 항상적 수준보다 많은 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질 및 (ii) 카르복실화를 요하는 단백질을 발현하도록 조작된 재조합 세포가 제공되는데, 이때 발현된 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질 및 카르복실화를 요하는 단백질의 양은 적어도 1:10의 비가 된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포가 제공되는데, 이 세포는
(i) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(ii) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의한 카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 상기 카르복실화를 요하는 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드
를 포함하며, 이때 상기 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질과 카르복실화를 요하는 단백질을 적어도 10:1의 비로 발현할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하도록 조작된 세포가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하는 핵산과 γ-글루타밀 카르복실라제를 코딩하는 핵산은 감마-카르복실화를 요하는 단백질의 발현량이 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질의 발현량의 10배 이상이 되도록 하기에 적합한 조절 서열의 제어 하에 위치한다.
한 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제 중 적어도 하나는 재조합 기법에 의해 세포로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 본 발명의 또 다른 실시예는, 내인성 조절 서열(프로모터 등)을 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이종성 서열로 치환시켜, 내인성 단백질(카르복실화를 요하는 단백질 또는 카르복실라제)을 발현시키는 것이다.
숙주 세포는 바람직하게는 진핵 세포이다. 전형적 숙주 세포로는 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 포유동물 세포가 특히 바람직하다. 적절한 포유동물 세포로는 CHO, HEK, NS0, 293, Per C.6, BHK 및 COS 세포 및 이의 유도체를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포주 CHO-S이다.
카르복실화 의존성 단백질의 과발현은 이전에는 일반적으로 카르복실화 정도가 낮은 생성물을 산출하였다. 이것은 내인성 숙주 세포 카르복실화 능력이 제한되고 있기 때문이다. 반면에, GGCX 활성의 막대한(16～70배) 과발현은 생성물 수율을 향상시키지 못한다[Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90: 4611-4615, 1993; Berkner and Pudota, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 446-471, 1998; Hallgren et al., Biochemistry 41(50): 15045-15055, 2002]. 이의 원인은 완전히 규명되지는 못하였다. 본 발명은 GGCX를 적당한 수준으로 과발현시킬 것을 요한다. 이렇게 하면 GGCX가 내인성 수준보다 많이 세포로부터 발현되는데, 예를 들어 GGCX 활성 수준이 단지 1.5～5배 상승한다. 이와 같이 적당히 상승된 수준에서는, 실시예 1에 예시된 바와 같이 놀랍게도 다량의 완전 카르복실화 rhFII가 얻어졌다.
따라서, 본 발명을 종래의 동시 발현 기법으로부터 구별시키는, 카르복실화를 요하는 단백질과 카르복실라제의 발현 비는, 내인적으로 생성된 GGCX의 수준을 배제한다는 것을 이해할 것이다. 높은 생산성 요구를 충족시키기 위해서는 카르복실라제와 카르복실화를 요하는 단백질을 정상 세포에서 관찰되는 수준보다 높게 발현시킬 필요가 있다.
바람직한 구체예에서는, 항상적으로 발현된 카르복실라제 및/또는 카르복실화를 요하는 단백질을 거의 또는 전혀 함유하지 않는 세포 또는 세포주가 사용된다.
한 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 감마-카르복실화를 요하는 단백질량의 10% 이하의 양으로 발현된다. 또 다른 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 감마-카르복실화를 요하는 단백질량의 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이하의 양으로 발현된다.
상기 두 단백질의 발현 정도는 당업자에게 주지된 기법으로 측정할 수 있다. 이러한 기법은 직접 측정법, 예를 들어 (예를 들어 항체를 사용하여) 단백질의 생물학적 활성, 또는 단백질량을 측정하는 방법, 또는 간접 측정법, 예를 들어 mRNA 전사체 수준의 측정에 의한 방법(예를 들어, 실시예 3에서와 같은 Taqman 분석)을 포함한다. 하기의 참고 문헌은 GGCX 효소 활성을 측정하는 방법을 개시한다(Lingenfelter et al., Biochemistry 35: 8234-8243, 1996; Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471, 1998; Hallgren et al., Biochemistry 41(50): 15045-15055, 2002; and, Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992).
본 발명의 목적을 위해서는 상기 두 단백질의 발현비를 mRNA 전사체 수준을 통해 간접적으로(예를 들어, Taqman 분석에 의해) 측정한다.
한 구체예에서, 감마 카르복실화를 요하는 단백질은 비타민 K 의존성 응고 인자이다. 또 다른 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 바람직하게는 프로트롬빈, 응고 인자 II, 응고 FII, 응고 인자 VII, 응고 FVII, 응고 인자 IX, 응고 FIX, 응고 인자 X, 응고 FX, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 골(bone) Gla 단백질, 기질 Gla 단백질, 성장 저지 특이적 단백질 6 및 아칸토피나 FXa 유사 단백질로 구성된 군에서 선택된다.
특정 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인자 IX이다. 또 다른 측정 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 프로트롬빈이다. 또 다른 구체예에서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질은 인자 X이다.
본 발명은 임의의 공급원 유래의 카르복실화를 요하는 단백질에 대체적으로 적용된다. 그러나, 발현된 단백질이 인간을 대상으로 한 치료용으로 사용된다면, 인간 단백질이 특히 바람직하다.
한 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 마우스, 래트, 소, 또는 청자 고둥 유래의 것이다. 또 다른 구체예에서, γ-글루타밀 카르복실라제는 인간 단백질이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마 카르복실화된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물 세포주에서 감마-카르복실화된 단백질을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 (i) 포유동물 세포주에서의 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 동시에 발현시키는 단계로서, 감마 카르복실화를 요하는 단백질의 발현량이 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현량보다 10배 이상 더 많은 것인 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화된 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
감마-카르복실화 단백질의 제조 방법은
a) 카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질을 적어도 10:1의 비로 동시에 발현할 수 있는 진핵 숙주 세포를 생성하도록 카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 수반되는 발현 조절 서열과 γ-글루타밀 카르복실라제를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 및 수반되는 발현 조절 서열을 도입하기 위해 진핵 세포를 유전적으로 변형시키는 단계;
b) 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되도록 하는 조건 하에 적절한 배양 배지 중에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
c) 배지 또는 숙주 세포로부터 카르복실화 단백질을 분리하는 단계
를 포함한다.
발현 벡터는 일반적으로 복제 기점, 프로모터, 번역 개시 부위, 경우에 따라 시그널 펩티드, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이러한 벡터는 또한 선별을 위한 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자(들)를 포함한다. 적절한 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스, 예컨대 파지 또는 레트로바이러스일 수 있다. 폴리펩티드의 코딩 서열은, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 발현 벡터 구성체에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포에서 RNA로 전사될 수 있도록 적절한 프로모터(즉, HSV, CMV, TK, RSV, SV40 등), 조절 요소 및 전사 종결서열(이들은 관련된 발현 조절 서열임)의 제어 하에 배치된다. 코딩 서열은 숙주 세포 외부로 폴리펩티드를 분비시키기 위한 시그널 펩티드 또는 리더 서열을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 바람직한 벡터는 일반적으로 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현되어질 유전자와 프로모터 사이에는 단일 클로닝 부위 또는 다중 클로닝 부위가 위치하게 된다. 그러한 클로닝 부위는 제2 핵산 서열이 상기 유전자 서열과 연속하여 프레임내에(in-frame) 위치하도록 제2 핵산 서열을 클로닝 부위에 클로닝함으로써 N-말단 융합 단백질을 생성하는 데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 전술한 N-말단 융합에 대한 것과 유사한 방식으로 C-말단 융합의 생성을 촉진하도록 상기 유전자의 바로 하류에 단일 클로닝 부위 또는 다중 클로닝 부위가 배치될 수 있다.
숙주 세포는 형질감염, 형질전환 및 전기천공과 같은 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 유전적으로 변형시킬 수 있다(추가 핵산을 도입할 수 있다).
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 정제된 감마 카르복실화 단백질 및 이것을 응고 치료에 사용하는 용도에까지 확장된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피험체에서 응고 증가 또는 응고 감소를 촉진하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 전술한 방법에 의해 얻은 분리된 감마-카르복실화 단백질을 약학적 유효량으로 상기 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 혈액 응고를 유도하기에 적합한 약학 조성물을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 활성형 카르복실화 단백질을 정제하는 단계 및 상기 정제된 카르복실화 단백질을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함한다.
단백질을 주성분으로 하는 치료제는 일반적으로 냉동 보관하거나 냉장 보관하거나 실온에서 및/또는 동결 건조 상태로 보관한다.
본 발명의 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 약학적 부형제를 사용하여 통상의 절차에 의해 얻을 수 있으나, 흔히 비경구로 또는 상처 부위로 직접 주사하기에 적합한 형태로 존재할 수 있다.
수성 현탁액은 일반적으로 1종 이상의 현탁제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸-셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스 고무 및 아카시아 고무; 분산제 또는 습윤제, 예컨대 레시틴, 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물(예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 또는 지방산과 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트), 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물(예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 또는 지방산과 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트), 또는 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물(예를 들어, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트)과 함께 미세 분말 형태로 활성 성분을 함유한다. 수성 현탁액은 또한 1종 이상의 보존제(예컨대 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산), 착색제, 풍미제 및/또는 감미제(예를 들어, 수크로스, 사카린 또는 아스파탐)를 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일(예컨대 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일) 또는 미네랄 오일(예컨대 액체 파라핀)에 현탁시켜 조제할 수 있다. 유성 현탁액은 또한 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 상기한 것과 같은 감미제 및 풍미제를 첨가하여 맛이 좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이러한 조성물들은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여 보존할 수 있다.
적절한 희석제를 첨가하여 주사용 수성 제제를 제조하는 데 적합한 분말은 일반적으로 적절한 담체 및 부형제, 현탁제 및 1종 이상의 안정화제 또는 보존제와 함께 활성 성분을 함유한다. 희석제는 다른 적절한 부형제, 예컨대 보존제, 등장성 조절제 및 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 수중유 에멀션의 형태로 존재할 수 있다. 유성상은 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 아라키스 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라핀 또는 이들 중 임의의 것의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는, 예를 들어 천연 고무, 예컨대 아카시아 고무 또는 트래거캔스 고무, 천연 포스파타이드, 예컨대 대두, 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르(예를 들어 솔비탄 모노올레이트) 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 비경구적 사용이 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있으며, 이것은 전술한 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제 중 1종 이상을 사용하여 공지된 방법에 따라 조제할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적 사용이 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 용액일 수도 있다.
제제에 대한 추가 정보는 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990] 5권의 25.2장 또는 문헌[Drugs and the pharmaceutical sciences] 99권; 문헌[Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, executive editor), Marcel Dekker Inc 2000]을 참조할 수 있다.
단일 제형을 제조하기 위해 1종 이상의 부형제와 배합되는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 경로에 따라 달라지는 것이 당연하다. 예를 들어, 인간에게 사용하기 위한 주사용 제제는 일반적으로, 총 조성물의 약 5 중량%～약 98 중량%가 될 수 있는 적절하고 편리한 양의 부형제와 배합된 활성 제제 0.5 mg～2 g을 포함한다. 단위 제형은 일반적으로 약 1 mg～약 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 단백질성 치료제는 일반적으로 냉동 보관하거나 동결 건조시켜 보관한다. 투여 경로 및 투여 방법에 관한 추가적인 정보가 필요하다면 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990] 5권의 25.3장을 참조할 수 있다.
치료 또는 예방 목적으로 사용되는 화합물의 용량의 크기는 질병의 성질 및 중증도, 동물 또는 환자의 연령 및 성별 및 투여 경로에 따라, 또한 의약의 공지된 원리에 따라 당연히 달라지게 된다. 치료 또는 예방을 목적으로 화합물을 사용하는 경우, 이 화합물은 일반적으로 체중 1 kg당 약 0.5～75 mg 범위의 1일 용량이 전달되도록 투여되며, 필요에 따라 분할 투여도 가능하다. 일반적으로, 비경구 경로를 이용하는 경우에는 더 적은 용량이 투여된다. 따라서, 예를 들어 정맥 투여의 경우에는 예를 들어 체중 1 kg당 0.5～30 mg 범위의 용량이 일반적으로 사용된다. 마찬가지로, 흡입에 의한 투여의 경우, 예를 들어 체중 1 kg당 0.5～25 mg 범위의 용량이 사용된다.
본 발명을 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시한다.
본 발명의 실시는 달리 언급되지 않는다면 당해 기술 범위 내의 통상적인 분자 생물학 기법 및 재조합 DNA 기법을 이용한다. 이러한 기법들은 문헌에 상세히 기술되어 있다. 참고 문헌: Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I, II, & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5th ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997).
실시예 1
인간 FII(hPT) 및 인간 GGCX를 코딩하는 cDNA의 증폭
인간의 간 mRNA를 Clontech으로부터 구입하여 Invitrogen으로부터 입수한 Superscript 시스템을 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 얻어진 cDNA는 하기의 프라이머를 사용하여 인간 FII의 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다:
프라이머 PTF0 5'-ATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACA-3', (서열 번호 3) 및
프라이머 PTEXT 5'-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCTGTATCCACTTCTT-3', (서열 번호 4).
인간 GGCX는 하기의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
프라이머 hglx5, 5'-TCCGCAGAGCAATGGCGGTGTCT-3', (서열 번호 5) 및
hglx3, 5'-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3', (서열 번호 6).
FII 코딩 PCR 생성물을 TA-TOPO 처리된 벡터 pCDNA3.1V5/His(Invitrogen)에 직접 클로닝하였다. 정확한 방향으로 삽입된 hFII cDNA를 가진 클론을 선별하여 Ptext5 대조군 구성체를 얻었다(도 1b). SV40 프로모터 제어 하에 GGCX를 코딩하는 cDNA는 제한 효소 BamH1 및 NotI을 사용하여 GGCX 코딩 단편을 pCDNA3.1V5/His TA-TOPO로부터 pZeoSV2+ 벡터(Invitrogen)로 이전하여 얻었다. GGCX 삽입체 하류의 EcoRV-NotI 제한 부위는 제거하였다. 그 후, 생성된 pZeoSV2-GGCX 플라스미드(SV40 프로모터 및 GGCX 함유 삽입체를 포함함, 하지만 GGCX 코딩 서열 하류의 폴리아데닐화 부위 및 폴리아데닐화 시그널은 포함하지 않음)로부터의 평활 말단 ClaI-BclI 단편을 pCDNA3.1+(Invitrogen)의 평활 말단의 DraIII 제한 부위로 클로닝하였다. CMV 프로모터에 대해 직렬로(동일한 전사 방향) 삽입된 pSV40-GGCX 단편을 가진 클론을 선택하여, Ptex5로부터의 평활 말단의 KpnI-NotI FII 코딩 단편을 EcoRV 부위로 클로닝하여 PN32 구성체를 얻었다(도 1a). PN32 및 Ptext5의 DNA 서열은 부록 2에 기재된 바와 같다. 모든 클로닝 방법은 표준 방법 및/또는 제조업자의 권장 절차에 준하였다.
PN32 구성체는 다음과 같은 주요 특징들을 포함한다.
- 인간 프로트롬빈 cDNA의 전사를 조절하는 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기 프로모터와 이에 이은 효율적 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화를 위한 소 성장 호르몬(Bovine Growth Hormone; BGH) 폴리아데닐화 시그널.
- 뚜렷한 폴리아데닐화 부위 또는 시그널 없이 인간 γ-카르복실라제 cDNA(GGCX)의 전사를 조절하는 SV40 초기 프로모터.
- 다른 특징들은 도 1a)에 도시된 바와 같다.
비교를 위해 GGCX가 없는 PTex5 구성체를 사용하였다(도 1b). PTEXT5 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다. PN32 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2에 제시되어 있다.
프로트롬빈을 생산하는 세포주의 제조
도 1의 두 구성체를 CHO-S 세포(Invitrogen)로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 선별하여, 프로트롬빈 활성에 대한 시판되는 분석(Chromogenix)을 이용하여 생산성이 높은 클론을 스크리닝하였다. 이 분석에서, 프로트롬빈 함유 샘플을 먼저 뱀 독액 독소(Ecarin - Sigma로부터 시판됨)로 처리하여 트롬빈을 생성하였다. 그 후 발색 물질(S-2238)을 첨가하여 트롬빈 활성을 분석하였다. 상기 발색 물질은 트롬빈에 의해 가공될 때 발색을 보인다. 클론의 형질감염 및 선별은 두 구성체로 동시에 수행하였다. 세포 배양은 9% 열 불활성화 우태 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 수행하였다. 그 후 얻어진 클론을 동물 성분이 없는 배지에서 성장할 수 있도록 적합화하였다. PN32(FII + GGCX)로 형질감염시켰을 때 생산성이 최상인 클론이 얻어졌는데, 이것은 동물 성분이 함유되지 않은 화학 조성이 규정된 배지에서 배양하였을 때 최대 400 mg/L의 인간 재조합 프로트롬빈을 생성하였다(어떠한 공지된 수준보다도 훨씬 과량임). 재조합에 의해 생산된 rhFII를 정제하고(문헌[Josic et al., Journal of Chromatography B, 790:183-197, 2003]에 개시된 방법에 따름)], Q-세파로스 컬럼을 사용하여 표준 기법에 따라 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 분별하여, 완전 카르복실화된 순수한 rhFII를 얻었다. 발효기 중에서 최대 78 mg/L로 생산된 rhFII는 완전히 카르복실화되었으며 인간 혈장으로부터 정제된 프로트롬빈과 동일한 생물학적 활성을 나타내었다. 카르복실화는 단백질의 N-말단 서열결정 및 프로트롬비나제 분석에 의해 분석하였다(Mao et al. JBC, 273:30086-30091, 1998). 트롬빈 생성은 조직 인자를 첨가하여 혈소판이 적은 인간의 혈장에서 유도하였으며, 내인성 트롬빈 잠재성은 Stig 등의 문헌[Blood Coagulation and Fibrinolysis, 14:457-462, 2003]에 기재된 바와 실질적으로 동일하게 측정하였다.
PText5 구성체를 사용하여 얻은 최상의 클론은 동물 성분을 함유하지 않은 화학적 조성이 규정된 배지에서 최대 10 mg/L의 생산성을 나타내었으며, 상기 생산성은 문헌에 보고된 것과 동일한 범위이다. PText5 클론으로부터 얻은 완전 카르복실화 프로트롬빈의 비율은 약 50%로 평가되었다. 따라서 완전 활성형 rhFII의 최종 회수율은 γ-카르복실라제의 저 발현 수준 정렬을 포함하는 PN32 구성체를 사용하는 경우에 적어도 10배 더 높았다. 각 구성체에 대하여 발현 수준이 유사한 몇 개의 클론이 확인되었다.
실시예 2
CHO 세포주에서의 ggcx 활성의 측정
PN32 구성체(인간 GGCX의 동시 발현) 및 PTEXT5(GGCX의 동시 발현 없음) 각각으로 형질감염시켜 얻은 두 개의 rhFII 생산 CHO-S 세포주를 5 ㎍/ml의 비타민 K가 보충된 단백질 무함유 배지를 사용하여 스피너 바틀(spinner bottle)에서 배양하였다. 배양 배지의 1/10은 매일 교환하였다. 배양 7일 후 세포를 회수하고 Berkner 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992]에 기재된 바와 같이 마이크로솜을 조제하였다. 회수된 세포의 배양 상청액으로부터 인간 재조합 FII를 정제하였다. GGCX 활성은 Berkner 및 Pudota의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471 1998] 및 Lingenfelter 및 Berkner의 문헌[Biochemistry 35: 8234-8243, 1996]에 기재된 바와 같이 측정하였다. 본 발명자들의 측정은 동일한 배양 조건을 이용하였을 때 rhFII만을 발현하는 CHO 세포주와 비교하여 인간 GGCX를 동시에 발현하는 CHO 세포주에서 GGCX 활성이 1.5배 더 높다는 것을 보여주였다.
실시예 3
CHO-S 세포주 내 γ-카르복실라제 및 프로트롬빈의 mRNA 발현의 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석
PN32(FII+GGCX) 및 Ptext5(FII 단독) 구성체 각각에 의한 안정한 형질감염에 의해 얻은 2종의 CHO-S 세포주를 비타민 K가 보충된 단백질 무함유 배지를 사용하여 스피너 바틀에서 배양하였다. mRNA 생산의 추정 최고 수준을 조사하기 위해, 배양 4일, 5일 및 6일 후에 배양 샘플을 수거하였다. 시판업체 Invitrogen에 의해 공급되는 프로토콜에 따라 Trizol™을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 Ambicon으로부터 입수한 키트 DNA-free™로 DNaseI 처리하였다. cDNA 합성은 랜덤 6-mer 프라이머와 Invitrogen이 시판하는 Superscript™ First-Strand 합성 시스템의 키트 내용물을 사용하여 수행하였다.
실시간 RT-PCR을 위한 프라이머 및 Vic 표지 프로브는 Applied Biosystems의 소프트웨어 Primer Express™를 사용하여 선택하였다.
인간 γ-카르복실라제 올리고뉴클레오티드
5' ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' 정방향 프라이머(서열 번호 7)
5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' 역방향 프라이머(서열 번호 8)
5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' 프로브(서열 번호 9)
앰플리콘 길이 86 bp
인간 프로트롬빈 올리고뉴클레오티드
5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' 정방향 프라이머(서열 번호 10)
5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' 역방향 프라이머(서열 번호 11)
5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' 프로브(서열 번호 12)
앰플리콘 길이 69 bp
프라이머는 Operon/Qiagen에 의해 제조되었고, 프로브는 Applied Biosystems로부터 주문 제작하였다. 설치류 GAPDH 대조군 프라이머 및 프로브 역시 사용하였다(Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan(등록상표) 설치류 GAPDH 대조군 시약 프로토콜)- 앰플리콘 길이 177 bp. 실시간 RT-PCR 반응은 Applied Biosystems의 ABI Prism™ 7700 서열 검출기로 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물의 예상 길이는 아가로스 겔에서 확인하였다. PCR 반응의 효율을 조사하기 위해 3개 유전자 모두에 대해 일련의 희석을 수행하였다. γ-카르복실라제 및 프로트롬빈의 발현 수준은 대조군 유전자인 설치류 GAPDH의 발현을 기준으로 제시된다.
프로트롬빈


2＾-델타 Ct		 CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S
PText5 4일 PText5 5일 PText5 6일 PN32 4일 PN32 5일 PN32 6일
0.008014 0.076239 0.066677 0.204948 0.322343 0.364334
γ-카르복실라제


2＾-델타 Ct		 CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S CHO-S
PText5 4일 PText5 5일 PText5 6일 PN32 4일 PN32 5일 PN32 6일
3.39E-07 0 0 0.000277 0.00159 0.001568
검출된 rhFII:GGCX의 상대적 발현 수준으로부터 샘플 수집일에 따라 대략 74～232:1의 비가 계산되었다. PN32(rhFII와 GGCX의 동시 발현)로 형질감염시킨 세포주의 경우, 세포당 전사체의 수는 GGCX mRNA의 경우 약 8, rhFII mRNA의 경우 약 2000으로 계산되었으며, 따라서, rhFII:GGCX의 비는 약 250:1이 되었다. 동일한 샘플에 대해, 세포당 GAPDH 대조군 mRNA 전사체는 약 4000이었다.
실시예 4
인간 FII의 생산
실시예 1에서 클로닝된 인간 FII 및 GGCX cDNA를 실시예 1에서와 유사하게 pCDNA3.1에 삽입하였다. GGCX 수준을 더 높이기 위해 pZeoSV2+ 유래의 폴리아데닐화 시그널을 pCDNA3.1의 평활 말단의 DraIII로 클로닝된 pSV40-GGCX-pA 단편에 포함시켰다. 실시예 1과 역순서로 GGCX 함유 단편을 갖는 클론을 선별하였다. 그 후 실시예 1에서와 동일한 방식으로 FII 단편의 클로닝을 수행하였다. 최종 구성체 PP6는 도 2에 도시되어 있으며 PP6 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 13에 제시되어 있다.
CHO-S를 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질감염시켜 2종의 프로트롬빈 생산 세포주 B2F4 및 H3B10을 얻었다. 이들 세포주로부터의 프로트롬빈을 정제하여 실시예 1에서와 같이 분석하였다. B2F4의 배양은 30～70 mg/L의 생산성을 나타내었으며 완전 카르복실화의 비율은 55～87%였다(rhFII가 많을수록 완전 카르복실화 정도가 감소됨). 부티레이트의 첨가는 생산성을 다소 증가시켰으나 완전 카르복실화 rhFII의 비율은 감소시켰으며, 이는 유익하지 않은 것으로 간주되었다. H3B10은 성장 속도가 느렸고 배양물 중의 세포의 양에 비해 높은 약 50 mg/L의 생산성을 나타내었으며, 완전 카르복실화 rhFII의 비율은 약 60%였다. CHO 세포주에 대하여 PP6 구성체를 사용하였을 때 실시예 1에서 얻은 세포주에 비해 완전 카르복실화 정도가 적은 rhFII가 생산되었다. 그러나 완전한 활성의 재조합 프로트롬빈의 생산성은 기존에 알려진 수준보다 여전히 훨씬 더 높다.
실시예 5
mRNA 양의 측정에 의한 CHO-S 세포주에서의 γ-카르복실라제 및 프로트롬빈 발현의 실시간 RT-PCR 분석
실시예 3에서와 동일한 방법과 동일한 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석에 의해 B2F4 및 H3B10 세포주를 분석하였다. 실시예 3에서의 샘플과 동등하게 되도록 최고 생산성에서 10 ml의 배양 샘플을 수집하였다. 클론 H3B10의 경우 이 클론의 느린 성장으로 인하여 10일째 샘플을 수집하였으며, 클론 B2F4의 경우 6일째 샘플을 수집하였다.
[표 4]
GGCX를 동시에 발현하는 프로트롬빈 생산 세포주의 실시간 RT-PCR 분석 결과. 실시간 RT-PCR 분석을 위해 B2F4 및 H3B10 각각에 대하여 2개의 독립적인 100 ml 스피너 배양물을 샘플링하였다.
Figure 112006033397847-pct00003
rhFII mRNA : GGCX mRNA의 계산된 비는 클론 H3B10의 경우 약 30:1이었고, 클론 B2F4의 경우 약 50:1이었으며, P1E2의 경우 약 250:1이었다.
실시예 6
인간 응고 인자 IX(FIX)의 생산
Invitrogen으로부터 구입한 인간 유전자 풀(pool) 간 cDNA로부터 인간 응고 인자 IX cDNA를 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는
5' 말단의 경우; F9f.ampl.: 5'-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3' (서열 번호 16)이고
3' 말단의 경우; F9r.ampl.: 5'-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-3'(서열 번호 17)이었다.
정확한 서열의 클로닝은 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다. 인간 FIX 단편을 Pfx 폴리머라제(Invitrogen) 및 클로닝 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 평활 말단의 단편을 생성하였다. 평활 말단의 단편은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 인산화하고, 실시예 1 및 실시예 4로부터의 EcoRV로 분해하고 탈인산화한 pCDNA-GGCX 벡터에 클로닝하였다. 이러한 방식으로, 인간 프로트롬빈의 생산에 사용되는 동시 발현 구성체(실시예 1 및 4)와 유사한 인간 FIX 및 GGCX의 동시 발현용 구성체를 얻었다. 정확한 서열의 클로닝은 DNA 서열 결정 및 COS-7 세포에서의 일시적 발현에 의해 확인하였다. 벡터 구성체 F9NopA는 도 3a에서 확인할 수 있고 벡터 구성체 F9hglx는 도 3b에서 확인할 수 있다. 벡터 F9NopA와 F9hglx 간의 차이는 GGCX 유전자의 전사 방향이다. F9NopA 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 14에 제시되어 있으며, F9hglx 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 15에 제시되어 있다.
rhFIX를 생산하는 세포주의 확립
실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 CHO-S 세포로 rhFIX 구성체를 형질감염시켰다. 각 FIX 구성체에 대해 약 3000개의 클론을, 세포 상청액의 ELISA에 의해 rhFIX 발현에 대하여 스크리닝하였다. 사용된 항체는 Haemathology Technology Inc. 및 DakoCytomation으로부터 입수하였다. 클론을 선별하여 단백질 무함유의 화학 조성이 규정된 CHO 배지에서 성장하도록 적합화하였다. T-플라스크에서 37℃로 또는 스피너 바틀에서 32～37℃로 세포를 배양하였다. 두 유형의 배양물에 이용된 CO2 농도는 5%였다. 생산된 rhFIX는 pH 7.0에서 Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제하였다. FIX 결핍 혈장(Precision Biologic)을 사용한 응고 분석에 의해 재조합 hFIX 활성을 측정하였다. 수득된 클론 중 생산성이 가장 좋은 rhFIX 클론은 N4D5였으며, 이것은 F9NopA 구성체를 사용하여 얻었고 T-플라스크에서 단백질 무함유의 화학 조성이 규정된 배지 중에서 최대 4 ㎍/ml의 활성형 rhFIX를 생산하였다. 스피너 바틀에서 배양할 경우 동일한 클론은 최대 7.1 ㎍/ml의 rhFIX를 생산하였다. 불완전하게 카르복실화된 비활성형 rhFIX 역시 포함하는 전체 생산성은, 웨스턴 블로팅에 의하면, 30 ㎍/ml 이상인 것으로 추정되었다. rhFIX 구성체 F9hglx를 사용하여 얻은 생산성이 최상인 클론은 P1G9였으며, 이것은 유사한 조건 하에 T-플라스크에서는 0.7 ㎍/ml, 스피너에서는 1.3 ㎍/ml의 rhFIX를 생산하였다. 이 결과는, F9NopA 구성체를 사용하여 GGCX를 낮은 수준으로 동시 발현시키는 것에 의하면 rhFIX 생산성은 향상되나, 구성체 F9hglx를 사용하여 GGCX를 동시 발현시키는 것은 덜 유익하다는 것을 나타낸다. 세포주 개발 절차 중의 생산성의 동시 스크린에서, N4D5 클론을 생성하는 F9NopA 구성체가 일반적으로 P1G9 클론을 생성하는 F9hglx 구성체보다 더 높은 ELISA 시그널을 나타내었다는 점 역시 관찰되었다.
N4D5 세포주의 생산성은 유사한 조건 하에 얻어진 기존에 알려진 수준보다 약 4～6배 더 우수하다. 여기서 IC4, IG8, r-FIX BHK 및 r-FIX 293는 참고문헌에 언급된 클론의 명칭이다(표 5).
[표 5]
인간 FIX 생산 세포주로부터의 생산성의 비교
세포주/구성체 생산된 활성형 rhFIX의 양 총 생산성
(㎍/ml)
 참고
T-플라스크
(㎍/ml)		 스피너
(㎍/ml)
N4D5/F9NopA
CHO,
낮은 수준의 GGCX 동시 발현		 4 7.1 > 30 실시예 6
P1G9/F9hglx
CHO,
중간 수준의 GGCX 동시 발현		 0.7 1.3 nd 실시예 6
IC4,
CHO,
HA(대조군) 동시 발현		 0.9 nd 30 Rehemtulla 1993.
IC4,
CHO,
높은 수준의 GGCX 동시 발현		 1 nd 29 Rehemtulla 1993.
IC4 0.9 nd 20 US 5,460,950
1G8
CHO		 1.5 nd 43 Kaufman, RJ et al. 1986
JBC 261:9622-9628
r-FIX BHK 0.004/24 시간 nd 0.004/24 시간 Hallgren 2002
r-FIX 293 0.004/24 시간 nd 0.004/24 시간 Hallgren 2002
실시예 7
mRNA 양의 측정에 의한 CHO-S 세포주 내 γ-카르복실라제 및 인자 IX의 발현의 실시간 RT-PCR 분석
재조합 hFIX 생산 클론을, 비타민 K가 보충된 단백질 무함유의 화학 조성이 규정된 배지 100 ml 중에서 32～37℃로 스피너 바틀에서 배양하였다. 최고 rhFIX 농도에서 샘플 5～10 ml를 수집하고 인간 FIX 및 GGCX 전사체의 함량과 GAPDH 대조군(하우스-키핑) 유전자의 전사체 함량을 분석하였다. 절차는 실시예 3에서와 동일하였다. rhFIX에 대한 프라이머는 다음과 같았다:
인간 인자 IX 프라이머
5' AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3' 정방향 프라이머(서열 번호 8)
5' CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3' 역방향 프라이머(서열 번호 19)
5' TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAAC 3' 프로브(서열 번호 20)
앰플리콘 길이 84 bp
mRNA 수준은 배양 온도 및 배양 접종물 크기에 따라 서로 다른 날에 최고에 달하는 것으로 확인되었다. mRNA의 최고 수준은 배양 배지 중의 rhFIX의 최고 농도와 잘 일치하는 것으로 확인되었다.
[표 6]
rhFIX 생산 클론의 실시간 RT-PCR 분석 결과
세포주 회분 배양일 2^-델타 Ct FIX 2^-델타 Ct GGCX mRNA 비
FIX:GGCX
N4D5-100 11 0.255253 0.005461 47:1
N4D5-2 14 0.264866 0.006201 43:1
P1G9-A 6 0.022982 0.005601 4:1
P1G9-B 8 0.04181 0.007687 5:1
본 발명자들은 또한, 실시간 RT-PCR 분석으로부터, 2^-델타 Ct-값이 배양 시간 및 조건에 따라 달라짐에도 불구하고, 각 클론에 대한 FIX:GGCX mRNA 비가 거의 동일하다는 것을 확인하였다. 생산성이 최상인 rhFIX 생산 클론 N4D5의 경우, 그 비가 약 45:1이었다. 또 다른 클론 P1G9의 분석은 약 4.5:1의 더 낮은 비를 나타내었다. P1G9 클론은 N4D5에 의해 생산된 rhFIX의 양의 단지 20%만을 생산하였다.
Figure 112006033397847-pct00004
Figure 112006033397847-pct00005
Figure 112006033397847-pct00006
Figure 112006033397847-pct00007
Figure 112006033397847-pct00008
Figure 112006033397847-pct00009
Figure 112006033397847-pct00010
Figure 112006033397847-pct00011
Figure 112006033397847-pct00012
Figure 112006033397847-pct00013
Figure 112006033397847-pct00014
Figure 112006033397847-pct00015
Figure 112006033397847-pct00016
Figure 112006033397847-pct00017
Figure 112006033397847-pct00018
Figure 112006033397847-pct00019
SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca AB <120> Protein <130> 101165-1P WO <140> PCT/SE2004/001453 <141> 2004-10-12 <150> 0324044.7 <151> 2003-10-14 <160> 15 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Vector <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 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ggcgaagtgc 6780 cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 6840 atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 6900 aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 6960 tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca 7020 tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 7080 tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 7140 atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 7200 accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 7260 gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac 7320 gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt 7380 cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga 7440 gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 7500 catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 7560 actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta 7620 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 7680 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 7740 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 7800 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 7860 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7920 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 7980 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 8040 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 8100 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 8160 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 8220 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 8280 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 8340 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 8400 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 8460 cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 8520 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa 8580 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 8640 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 8700 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 8760 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 8820 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 8880 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 8940 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 9000 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 9060 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 9120 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 9180 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 9240 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 9300 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 9360 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 9420 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 9480 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 9540 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 9600 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 9660 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 9720 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 9780 c 9781

Claims (40)

  1. 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 상기 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력한 것인 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자들이 단일 발현 벡터 내에 존재하는 것인 숙주 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기 프로모터(immediate-early promoter), 인간 연장 인자-1α 서브유닛 유전자(pEF-1α) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터(pRSV) 및 인간 유비퀴틴 프로모터(pUbC)로 구성된 군에서 선택되는 것인 숙주 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 프로모터가 SV40 즉시 초기 프로모터, 소형 FIX 프로모터 및 HSV 티미딘 키나제 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것인 숙주 세포.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기 프로모터이고, 상기 제2 프로모터가 SV40 초기 프로모터(early promoter)인 숙주 세포.
  6. 제1항에 있어서, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 (ii) γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하도록 조작된 세포로서, 상기 단백질 (i)과 (ii)는 10:1～500:1의 비로 발현되는 것인 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 응고 FVII, 응고 FIX, 프로트롬빈, 응고 FX, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 골(bone) Gla 단백질, 기질 Gla 단백질, 성장 저지 특이적 단백질 6 및 아칸토피나(Acanthophiinae) FXa 유사 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것인 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 비타민 K 의존성 응고 인자인 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 인자 VII인 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 단백질 C인 세포.
  11. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 프로트롬빈인 세포.
  12. 제1항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 인간 단백질인 세포.
  13. 제1항에 있어서, 상기 γ-글루타밀 카르복실라제가 인간 단백질인 세포.
  14. 제1항에 있어서, 포유동물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
  16. 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포로서,
    (i) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (ii) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의한 카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 상기 카르복실화를 요하는 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하며, 상기 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질과 상기 카르복실화를 요하는 단백질을 적어도 1:10의 비로 발현할 수 있는 것인 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포.
  17. 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 상기 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력한 것인 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉시 초기 프로모터이고, 상기 제2 프로모터가 SV40 초기 프로모터인 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질이 응고 FVII, 응고 FIX, 프로트롬빈, 응고 FX, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 골 Gla 단백질, 기질 Gla 단백질, 성장 저지 특이적 단백질 6 및 아칸토피나 FXa 유사 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것인 벡터.
  20. 감마-카르복실화 단백질의 제조 방법으로서, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 포유동물 세포주에서 감마-카르복실화 단백질을 제조하기 위한 방법으로서, 포유동물 세포주에서의 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 동시에 발현시키는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 감마-카르복실화를 요하는 단백질의 발현량이 상기 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현량보다 10배 이상 더 많은 것인 제조 방법.
  22. 제20항 또는 제21항의 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 혈액 응고를 유도하거나 응고 증가 또는 응고 감소를 촉진하는 데 적합한 약학 조성물의 제조 방법으로서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 10:1～500:1의 비로 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 활성형 카르복실화 단백질을 정제하는 단계; 및 정제된 카르복실화 단백질을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  26. 삭제
  27. 감마-카르복실화된 인간 프로트롬빈의 제조 방법으로서, (i) 인간 프로트롬빈 및 인간 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화된 프로트롬빈을 분리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
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