TWI355419B - Expression system and method for producing gamma-c - Google Patents

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1355419 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種表現系統’該系統包含將需要γ_羧化 作用之蛋白質編碼的核酸分子及相關表現控制序列及將γ_ 縠胺酿基缓化酶編碼的核酸分子及相關表現控制序列。本 發明係進一步關於一種包含該表現系統之宿主細胞及關於 一種以高產量生成需要γ-羧化作用之蛋白質之方法。 【先前技術】 出血係普通的臨床問題。其為疾病、外傷、外科手術及 醫干/合療之後果。必須機械地停止出。由於出也之位置 或因為其擴散自許多（小）jk管，止灰可能較困難或甚至不 可能。因此，正在流血之患者可能需要以支持止血之試劑 治療。該試劑可為血液衍生產物（血液療法）、引起内生止 血劑釋放之試劑、重組凝血因子（F)，或延遲血栓溶解的 試劑。 通韦由地方醫院所獲得之血液衍生產物中的第一線治療 為用於大量置換及支持止血的全血、用於改良氧傳輸能力 的壓縮紅細胞、以提高血小板數量（若數量低或有缺陷）之 血小板濃縮物及用於支持止血（血液凝聚及血小板聚集）之 新鮮冷束血聚。支持止血的第二線企數衍生產物為金毁冷 沉澱物、前凝血酶複合濃縮物、活化前凝血酶複合濃縮物 及純化凝血因子。如今若干凝血因子可由失活（凝血因子 VIII及IX)及活化（凝血因子VIIa)的人類重組蛋白質而獲得。 企友病為具有異常凝血因子或缺乏凝血因子或具有直接 96250.doc 1355419 針對凝血因子之抗體的遺傳性或後天性血液病症該病症 抑制促凝血功能。最普通的血友病為血友病a(缺乏凝血因 子νπΐ)及血友病B(因子印。純化或重組單個凝血因子係對 血友病患者之主要治療。具有抑制性抗體之患者存在治療 問題’因為他們可能使投予患者之凝血因子無效。 藉由降解活化凝血因子％及v„Ia，蛋白質c(Apc)之活 性形式為血漿凝聚之抑制劑。已顯示重組APC係對患有敗 血症之患者不當血漿凝聚的有效治療。

用於治療用途之凝血因子可獲自人類血漿，儘管純化方 法不簡單且需要許多步驟，其中若干步驟針對消除污染病 f °但即使對ik液衍生產物進行大量安全措施及測試，仍 不排除傳染病毒或朊病毒（prion)之污染。因為該風險， 迫切希望自無動物衍生組份之介質中所生長的重組細胞生 成人類治療蛋白質。因為許多蛋白質需要哺乳動物宿主， 所以其一般不直接生成全功能形式’意即，其經正確的轉 譯後修飾。重組細胞中商業生產之凝血因子為 FVII(NovoSeven) 、 FVIII(Kogenate 、 Recombinate 、

Refacto)及 Flx(BeneFix)(Roddie 及 Ludlam，Blood Rev. 11:169 - 177, 1997)及活性蛋白質C(Xigris)。獲得大量全功 能重組人類凝血因子之一主要障礙在於FII、FVII、FIX、 FX及蛋白質c中存在Gla-區域。該區域含有藉由加成羧基 來後轉譯修飾的榖胺酸殘基。由於其過表現導致低羧化， 且因此失活的蛋白質之事實，妨礙該等因子之生成。Gla-修飾為稱作γ-穀胺醯基羧化酶（GGCX)的維生素K-依賴型酶 96250.doc -6· 1355419 作用之結果。該酶已經許多科學家廣泛研究，尤其係涉及 凝血因子研究之科學家（WO-A-8803926 ; Wu等人， Science 254(5038): 1634-1636，1991 ; Rehemtulla等人，

Proc Natl Acad Sci USA 90:461 1-4615, 1993 ； Stanley J.

Biol. Chem. 274(24): 16940-16944，1999 ; Vo等人，FEBS letters 445:256-260，1999 ; Begley等人，The Journal of

Biological Chemistry 275(46): 36245-36249, 2000 ； Walker 等人，The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001 ; Bandyopadhyay等人，Proc Natl Acad Sci USA 99(3): 1264-1269，2002 ; Czerwiec等人，Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002 ; Hallgren等人，Biochemistry 41(50): 15045-15055， 2002 ; Harvey 等人，The Journal of

Biological Chemistry 278(10):8363-_8369, 2003)。至少兩個 科學小組曾試驗企圖以凝血因子FIX來共同表現GGCX，但 沒有成功（Rehemtulla 等人，1993，ibid ; Hallgren 等人， 2002，ibid)。鑒於對GGCX酶之濃厚興趣，據假設可能更 多的試驗已失敗且因此未報導。 為獲得全功能前凝血酶，對於人類FII(前凝血酶）的10個 Giu殘基中之至少8個須經正破修飾（Malhotra等人，J. Biol·

Chem. 260:279-287, 1985 ; Seegers 及 Walz ’Prothrombin and other vitamin K proteins’，CRC Press, 1986)。使用諸如 CHO細胞、BHK細胞、293細胞及牛痘病毒表現系統之若 干不同系統，已進行廣泛的努力以獲得高產量水平之 rhPT，但全部已失敗或導致低羧化產物且因此呈功能失活 96250.doc 1355419 之前凝血酶（Jorgensen等人，J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987 ; Russo 等人，Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233，1991 ; Fischer 等人，J Biotechnol 38(2):129-136, 1995 ; Herlitschka等人，Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996 ; Russo等人，Protein Expr. Purif. 10:214-225，1997 ; Vo 等人，1999，ίδίί/ ,· Wu&SuttieThrombRes96(2):91· 98，1999)。早期報導的用於羧化重組人類前凝血酶之生 成率較低；對於突變前凝▲酶20 mg/L(C6te等人，J. Biol. Chem 269:1 1374-11380，1994)，對於CHO細胞中所表現的 人類前凝血酶0.55 mg/L(全叛化）（j0rgensen等人，1987， AW)，在CHO細胞中25 mg/L(未顯示叛化程度）（Russo等 人，199Ί，ibid)。 WO 92/19636揭示人類及牛維生素K依賴型羧化酶之選 殖及序列識別。為製備維生素K依賴型蛋白質，該申請案 建議在適當的宿主細胞中共同表現維生素K依賴型羧化酶 及維生素K依賴型蛋白質。無羧化酶及維生素K依賴型蛋 白質之共同表現作為示範。 需要生成高產量的活化血液凝固因子之改良方法。本發 明闡述了對該需要的滿足。 【發明内容】 吾人已設計用於以高含量表現適當羧化重組維生素K依 賴型凝血因子的不同方法，其涉及以不同比率共同表現維 生素K依賴型凝血因子及γ-穀胺醯基羧化酶（GGCX)。吾人 已證明其使用人類前凝血酶（rhPT)及人類GGCX »並非如 96250.doc 1355419 同其他人已嘗試（Rehemtulla等人 ’ 1993，i6zi//Hallgren 等人，2002，的對rhPT及GGCX二者使用強啟動子， 吾人使用一種策略，其目的在於以PT之強表現與GGCX之 弱或非常弱的表現組合，以便所表現GGCX的量小於所表 現rhPT的1/10。令吾人驚奇的是，此策略導致高含量之所 分泌的正確修飾之rhPT及較好生存能力的宿主細胞，即使 當細胞在無化學界定之介質之動物組份中生長時。 吾人已將GGCX及人類前凝血酶以下述方法選殖至表現 載體：前凝血酶mRNA含量以至少10倍超過GGCX mRNA含 量。其導致前凝血酶蛋白質較GGCX蛋白質產量大量過剩。 作為進一步實例，吾人已使用相同GGCX共同表現載體來 表現rhFIX。其導致在一種情況中細胞株生成因子lx mRNA 含量以至少10的因子超過GGCX mRNA含量。在另一細胞株 中’因子IX:GGCX mRNA比率為大約4·5:1。僅細胞株得到 至少10:1之比率顯示rhFIX之生成率實質上增加（表1)。 表1·生成率及缓化蛋白質：GGCX mRNA比率之概述 純系名稱/组 成物 所生成的蛋 白質 全活性蛋白質 之產量 羧化蛋白質： GGCX， 近似MRNA比率 資料來源 P1E2/PN32 人類前凝 血酶 40 250:1 實例3 B2F4/PP6 26 50:1 實例5 H3B10/PP6 30 30:1 實例5 ElA9/PText5 3.5 無 GGCX 實例3 N4D5/F9NopA 人類FIX 7.1 45:1 實例7 P1G9/F9hgk 1.3 4:ϊ 實例7 IC4 ία 無 GGCX Rehemtulla 1993, US 5,460,950 *在相似生長條件下由旋轉培養（spinner culture)量測生 96250.doc •9· 1355419 成率8 口資料來自Rehemtulla 1993及美國專利第546〇95〇號。 以GGCX共同表現的維

及治療有或沒有低含量蛋白質C的凝結增加之病症。該方 法亦應用於需要後轉譯致化作用的其它蛋白質。 可期望藉由本發明方法所生成的 生素Κ依賴型滅血_因子（fh、fvii、FI， 或凝血酶、FVIIa、FIXa、FXa)用於預Η 出企或肝、腎 '血小板或血潘湓肜丨 【實施方式】 根據本發明之第一態樣， 其提供一種表現系統，該系統 包含將需要γ-羧化作用之蛋白質編碼的核酸分子及相關表 現控制序列’及將γ-穀胺醯基羧化酶編碼的核酸分子及相 關表現控制序列，其中兩種相關表現控制序列以至少丨〇: i 之出率有效表現包藏核酸分子之細胞株中之需要γ•羧化作 用之蛋白質及γ-榖胺醯基羧化酶。 在一較佳具體實施例中，所表現蛋白質之比率在1 〇: 1及 1000:1之間’更佳在10:1及5〇〇:1之間且仍更佳在25:1及 250:1之間。尤其適當的比率為大約2〇〇:1。 在獨立的具體實施例中，兩種所表現蛋白質之比率可為 至少 10:1、50:1、100:1、200:1、250:1、300:1、400:1、 500:1 及 1000:1。 在另一具體實施例中，GGCX蛋白質相對於内因性含量 以約1.5-7、較佳1.5-7、更佳2-7或最佳2-5之因子過度表 96250.doc •10- 1355419 現。 在一特定具體實施例中，將需要γ-羧化作用之蛋白質編 碼的核酸分子及相關表現控制序列及將[榖胺醯基羧化酶 編碼的核酸分子及相關表現控制序列二者均位於相同表現 載體上。在另一具體實施例中，該等兩個核酸分子位於單 獨的表現載體上。 根據本發明之另一態樣，其提供ΡΝ32及ρρ6表現載體。 根據本發明之另一態樣，其提供以表現系統或載體ΡΝ32 及ΡΡ6轉染或轉換的宿主細胞。 根據本發明之另一態樣，其提供能夠表現人類前凝血酶 及人類γ羧化酶之宿主細胞，其中可將人類前凝血酶編碼 的核酸及將γ羧化酶編碼的核酸可操作鏈接至能夠分別表 現至少1 〇: 1比率的兩種蛋白質之控制序列。 根據本發明之另一態樣，其提供適於表現至少10:1比率 的人類前凝血酶及人類γ羧化酶之非人類真核細胞。在一 特定具體實施例中，使將人類前凝血酶編碼的核酸及將γ 羧化酶編碼的核酸可操作鏈接至能夠分別表現至少101比 率的兩種蛋白質之控制序列。 根據本發明之另一態樣，其提供收容外因性核酸之宿主 細胞，該外因性核酸包含將在hcMV啟動子控制下之人類 前凝血酶編碼的核酸及將在SV40啟動子控制下之人類羧化 酶編碼的核酸。 根據本發明之另一態樣，其提供F9N〇pA及F9hglx表現 載體。 96250.doc 11- 1355419 根據本發明之另一態樣，其提供以表現系統或載體 F9NopA及F9hglx轉染或轉換的宿主細胞。 根據本發明之另一態樣，其提供能夠表現人類凝血因子 IX及人類γ羧化酶之宿主細胞，其中使將人類凝血因子ιχ 編碼的核酸及將γ緩化酶編碼的核酸可操作鏈接至能夠分 別表現至少10: 1比率的兩種蛋白質之控制序列。 根據本發明之另一態樣，其提供適於表現至少1〇:1比率 的人類凝血因子IX及人類γ羧化酶之非人類真核宿主細 胞。在一特定具體實施例中，使將人類凝血因子ΙΧ編碼的 核酸及將γ羧化酶編碼的核酸可操作鏈接至能夠分別表現 至少10··1比率的兩種蛋白質之控制序列。 根據本發明之另一態樣，其提供收容外因性核酸之宿主 細胞，該外因性核酸包含將在hCMV啟動子控制下之核酸 編碼的人類凝血因子IX及將在SV4〇啟動子控制下之核酸 編碼的人類羧化酶。 已使用前凝血酶及凝血因子IX作為需要羧化之蛋白質示 範本發明。然而，若干不同於前凝血酶及因子仅的蛋白質 由於其完全的生物活性視正確的γ·羧化而定。吾人已知來 自人體之彼等蛋白質為凝血因子FVII，目前其僅以相對低 含量（大約10 mg/L或更低）在重組哺乳動物細胞中商業生 成本發明將可應用以改良視丫-缓化而定的任何蛋白質之 生成率，此類蛋白質包括（但不限於）：前凝血酶、凝血因 子II(FII)、凝血因子VII(FVn)、凝血因子ιχ(πχ)、凝血因子 X(FX)、蛋白質C、蛋白質S、蛋白質z、骨Gla蛋白質（亦稱 96250.doc •12· 1355419 作：BGP或骨鈣素）、間質Gla蛋白質（MGP)、富含脯胺酸 Gla多肽l(PRRGl)、富含脯胺酸Gla多肽2(PRRG2)、生長 停滯特異性蛋白質6(Gas 6)。其它合適的蛋白質為：在眼 鏡蛇（Acanthophiina亞科）毒液及雞心螺（芋螺屬）毒液中的類 FXa蛋白質。 每個該等蛋白質，包括其核酸及胺基酸序列為吾人所熟 知。表2識別可用於本發明的各種蛋白質的野生型及變異

形式的代表序列。 表2 說明 CDNA EMBLACC# 剪接變異體(蛋白質） 突變 基因 EMBL ACC# 穀胺酸 γ敌化 酶 BC013979 2 ； BC013979 ； AF253530 1 SNP(EMBL# U65896); 2 SNP(OMM# 137167) U65896 前凝血酶 V00595 1 ； V00595 大約100 SNP(EMBL# AF478696) AF478696 因子νπ AF466933 4 ； AF466933 ； AF272774 ； AR030786 ； ΑΑΝ60063 21 SNP(OMIM# 277500) J02933 因子IX Α01819 3 ； Α01819 ； Α34669 ； Μ19063 5 SNP(EMBL# AF536327) ； 108 SNP(OMIM# 306900) AF536327 因子X BC046125 4 ； BC040125 ； Μ57285 ； AR095306 ； ΑΒ005892 118SNP(EMBL# AF503510) ； 14 SNP(OMIM# 227600) AF503510 蛋白質C BC034377 7 ； ΑΒ083690 ； ΑΒ083693 ； 109623 ； S50739 ； S72338 57 SNP(EMBL# AF378903); 25 SNP(OMIM# 176860) AF378903 骨鈣素 AF141310 5 ； AF141310 ； AF141310 ； BC033656 ； Χ04143 ； Χ51699 X04143 96250.doc -13· 間貧GLA 蛋白質 BC005272 1 ； BC005272 生長停滯 特異性 6 ； AXL 刺激因子 BC038984 1 ； BC038984 蛋白質Z M55670 2 ； AB033749 ； AB033749 富含脯 胺酸 Gla(G- 羧基穀 胺酸） 多肽1 AF009242 2 ； AF009242 ； BC030786 富含脯 胺酸 Gla(G- 羧基穀 胺酸） 多肽2 AF009243 2 ； AF009243 ； BC026032 維生素K-依賴型蛋 白質S前 驅體 BC015801 1 ； BC015801 大約100SNP (EMBL# AY308744)； 8 SNP(OMIM# 176880) AY308744 1355419 應瞭解本發明不限於特殊蛋白質或將一種經共同表現之 該等蛋白質序列編碼的蛋白質。此外，且尤其關於血液凝 血因子，在此項技術中已揭示該等蛋白質之大量突變形 式。本發明同樣可類似野生型序列應用於該等蛋白質的突 變形式，其包括自然發生的對偶基因變異體。在一具體實 施例中，本發明可以任何野生型蛋白質或一種具有該蛋白 質至少90%，較佳至少95%序列一致性之蛋白質來進行。 藉由配對電腦比對分析，使用諸如BestFit、Gap或 Frame Align之程式，可測定在兩個序列之間的序列一致 性。較佳的比對工具為BestFit。在實施中，當自序列資料 96250.doc -14- 1355419 庫以查詢搜索來搜索相似/相同序列時，通常需要使用諸 如 Blast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA、 Fasta3及PILEUP之合適的軟體及諸如Blosum 62之計算矩 陣以執行相似序列的初始識別。此類軟體包力圖非常接近 Smith-Waterman之"黃金標準（gold_standard)”比對算法。因 而’用於評定相似性，即兩種初級多肽如何排列之較佳的 軟體/搜索引擎程式為Smith-Waterman。一致性係指直接匹 配，相似性允許保守取代。 如本文所使用術語"γ_榖胺醯基羧化酶”或"GGCX"係指催 化榖胺酸殘基羧化之維生素Κ依賴型酶。 GGCX酶分佈廣泛，且已選殖自許多不同物種，例如白 鯨（白鯨屬）、豹蟾魚（豹蟾魚屬）、小雞（原雞）、盲鰻（盲鰻 屬）、馬蹄蟹（鱟）及雞心螺（芋螺屬）(Begley等人，2000, ibid; Bandyopadhyay 等人，2002，ibid)。來自雞心螺中之 羧化酶類似於牛羧化酶且已在COS細胞中（Czerwiec等人， 2002，ibid)表現。類似於GGCX的另外蛋白質可在昆蟲及 諸如分別具有NCBI登記號：gi 31217234、gi 21298685、 gi 24216281、gi 24197548 的癔蚊（Anopheles gambiae)、黑 腹果繩（Drosophila melanogaster)及鉤端螺旋體（Leptospira) 之原核生物中發現（Bandyopadhyay等人，2002，ibid)。敌 化酶顯示值得注意的進化保守β若干非人類酶已顯示或可 預測具有類似於吾人已使用的人類GGCX的活性，且因此 可用作人類酶的替代選擇。 表3識別可用於本發明的與人類GGCX(經物種起源後篩 96250.doc -15- 1355419 選）同源的經預測蛋白質之代表序列。 表3

物種 資料庫登記碼#/ID 會乂 (人類） NM 000821.2 HUMGLUCARB HUMHGCA BC004422 HSU65896 AF253530.1 阿拉伯狒狒(Papio hamadryas){^i屬) AC 116665.1 白蘇屑(Delphinapterus leucas)[刍綠) AF278713 溫帶牛(Bos iaurus)(牛) NM 174066.2 BOVCARBOXG BOVBGCA 綿羊(Ovis aries )(家秦丰) AF312035 揭家虞(褐色大鼠） NM 031756.1 AF065387 </、家虞(小鼠） NM 019802.1 AF087938 毒廣於轉，庚(CipSWJMi ίίΖ“)(骨魚） AF278714.1 笋现#(軟體動物） AY0044904.1 AF382823.2 帝王字螺(Conus imperiaiis)(坎艘動物) AF448234.1 依普可斯芋螺(Conus ^iscopatus){^i態Μ 物） AF448233.1 歐瑪利亞(Conus omaria){東後動物、 AF448235.1 X瘦果確(果蠅） NM—079161.2 遽坟（蚊子） XM_316389.1 ，累麥(Secaie cereale)(單子葉植物) SCE314767 //、麥(Triticum aestivum)(普通小麥) AF280606.1 烏拉爾厨小麥(Triticum urartu)(單子葉植物) AY245579.1 大麥(fiordeum vulgare)(大參) BLYHORDCA 鉤端螺旋體(Uptospira interwgans)^螺、旋 菌） AE011514.1 天藍色鍵徽菌(Streptomyces coelicolor){^ GC革蘭氏+細菌） SCO939109 SC0939124 AF425987.1 青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)(^jGC 革蘭氏+細菌） SLU22894 位吉尼鍵黴菌(Streptomyces viginiae)(高 GC 革蘭氏+細菌） SVSNBDE 黃色微球菌(Micrococcus luteus)[高 GC 革 蘭氏+細菌） MLSPCOPER 96250.doc •16- 1355419 菜菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(綠 藻） AF479588.1 盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum){點氣 菌） AC115612.2 轉與(鳥類） AF364329.1 慢性大豆根瘤菌(Bradyrhizobium 蛋白質細菌） AP005937.1 類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides){pir 蛋 白質細菌） RSY14197 苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti){〇r蛋白 質細菌） RME603647 AF119834 百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)(、〇l·蛋白 質細菌） AP003014.2 紫色色桿菌(Chromobacterium Wo/acewwjOS-蛋白質細菌） AE016910.1 AE016918.1 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa){y-蛋白 質細菌） AE004613.1 AF165882 柑桔潰瘍病菌(Xcinthomonas axonopodis){y· 蛋白質細菌） AE011706.1 人類疱疹病毒8 KSU52064 KSU75698 AF305694 AF360120 AF192756

在本發明中可將每個上面已識別的GGCX蛋白質用作羧 化酶。

一種影響兩種共同表現蛋白質之不同表現的方法為使用 不同啟動子作為各自表現控制序列的部分。該技術有充足 的能夠表現不同程度或範圍的異源蛋白質的不同啟動子及 其它表現控制序列的實例。將重組表現技術係適當地改進 以致熟習蛋白質表現技術者能夠選擇啟動子及其它控制序 列以共同表現預期比率之需要羧化之蛋白質及羧化酶。選 擇使用特殊啟動子及其它表現控制序列係個體選擇。 在一具體實施例中，與需要γ-羧化作用之蛋白質相關的 控制序列包含強啟動子。在一具體實施例中，其為人類細 96250.doc -17- 1355419 胞巨化病毒（hCMV)即時·早期（immediate_eariy)啟動子。本 文將強啟動子定義為51起大於1000轉錄/細胞之啟動子。 本文將弱啟動子定義為引起小於1000轉錄/細胞之啟動 子。 在另-具體實施例中，與γ·縠㈣基缓化酶相關的控制 序列包含弱啟動子。在一具體實施例中，其為SV4〇早期啟 動子。在另一具體實施例令，需要γ_羧化作用之蛋白質及 γ-縠胺醯基羧化酶在不同啟動子元件控制下’其中控制丫_ 穀胺趨基叛化酶表現的啟動子弱於控制需要丫-缓化作用之 蛋白質表現的啟動子。 在另一具體實施例中，γ_穀胺醯基羧化酶在SV4〇早期啟 動子之控制下且需要γ-羧化作用之蛋白質在人類細胞巨化 病毒（hCMV)即時-早期啟動子之控制下。在一具體實施例 中，根據本發明之特殊態樣’需要γ·敌化作用之蛋白質為 人類前凝jk酶。在另一具體實施例中’需要丫_竣化作用之 蛋白質為人類因子IX。 藉由使用強CM V啟動子（Bo shart等人，Cell 41:521-530, 1985)來過表現前凝血酶及更弱的SV40啟動子（Wenger等 人 ’ Anal Biochem 221:416-418，1994)以控制 GGCX表現已 示範了本發明。根據本發明可使用的其它強啟動子包括 (但不限於）pEF-lcx(人類延伸因子-Ια亞單位基因） (Mizushima 及 Nagata，Nuc Acids Res 18:5322, 1990 ； Goldman等人，BioTechniques 21:1013-1015，1996)、pRSV [羅斯肉瘤（Rous sarcoma)病毒（Gorman 等人，Proc Natl 96250.doc -18- 1355419

Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982)]及 pUbC[人類泛素 (human ubiquitin)(Schorpp等人，Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)]。 重要的是應保證待生成的蛋白質（需要羧化之蛋白質）較 修倚酶至少過量10:1的比率。達成低含量表現修_酶（γ-榖 胺醯基羧化酶）之方法包括：

1) 使用弱啟動子來控制修飾酶之表現，弱啟動子包括（但不 限於）S V40即時-早期啟動子、最小化FIX啟動子（Rouet等 Λ » The Journal of Biological Chemistry 267:20765-20773, 1992)或HSV胸苷激酶啟動子（Wenger等人，1994, ibid)。 2) 突變啟動子或強啟動子之增強子序列以降低啟動子強 度。 3) 移除或改變Kozak序列（轉譯初始訊號）以降低轉譯功效 (Kozak，Nuc Acids Res 15:8125-8148，1987 ; Kozak，Proc Natl Acad Sci USA 87:8301-83051987, 1990) » 4) 在單獨載體上選殖將待生成之蛋白質（需要羧化之蛋白 質）編碼的核酸及將GGCX編碼的核酸且以含有待生成之蛋 白質大量過量的組成物轉染以便產生具有含待生成之蛋白 質的組成物的多重複製之細胞。 5) 在單獨載體上選殖將待生成之蛋白質編碼的DNA及將 GGCX修飾載體編碼的DNA，共同轉染或單獨轉染，且使 用擴增系統以擴增待生成之蛋白質的表現。 6) 分離重組表現低含量之GGCX(但高於内因性含量）的穩 定細胞株且用作表現需要γ-羧化作用之蛋白質的宿主細胞 96250.doc -19· 1355419 株。 7)為降低GGCX間質親合力將突變體引入GGCX令。 除此以外，熟習重組蛋白質表現之技術者應知道可用來 產生表現至少10:1比率的需要γ·缓化作用之蛋白質及羧化 酶蛋白質的宿主細胞的其它方法。 根據本發明之另一態樣，其提供一種經基因工程化或使 適於表現⑴需要γ-羧化作用之蛋白質，及（Η)γ_穀胺醯基羧 化酶的細胞’其中蛋白質⑴及（丨丨）以1〇:1及5〇〇:1之間的比 率來表現。在一特定具體實施例中，γ_縠胺醯基羧化酶表 現為高於内因性細胞含量2至5倍之間（意即其為非工程化 或使適應的細胞）。 根據本發明之另一悲樣，其提供一種適於表現⑴高於在 等量非適應細胞中所發現的組成含量的丫_穀胺醯基羧化酶 蛋白質及（ii)需要羧化之蛋白質的重組細胞，其中所表現 的γ-穀胺醯基羧化酶蛋白質及需要羧化之蛋白質之量為至 少1:10的比率。 根據本發明之另一態樣，其提供一種經一般修飾的真核 宿主細胞，該細胞包含： (i) 將γ-榖胺醯基叛化酶蛋白質編碼的聚核苷酸序列，其中 使將序列編碼之γ-穀胺醯基羧化酶蛋白質可操作鍵接至允 許由該細胞表現γ-穀胺醯基羧化酶蛋白質之表現控制序 列；及 (ii) 將需要藉由γ-榖胺醯基叛化酶蛋白質來竣化之蛋白質編 碼的聚核苷酸，該γ-縠胺醯基羧化酶蛋白質可操作鍵接至 96250.doc •20- 允許由該細胞表現需要幾化 “ ㈣化之蛋白質之表現控制序列. ==能夠表現至少1:1〇比率的γ_穀胺…化酶 白貝及需要竣化之蛋白質。 贫 其提供一種適於表現需要γ_羧 基羧化酶之細胞，其中將需要 核酸及將γ-縠胺醯基羧化酶編 現需要γ-缓化作用之蛋白質之 質之量的至少10倍的調節序列 根據本發明之另一態樣， 化作用之蛋白質及γ·穀胺醯 [羧化作用之蛋白質編碼的 碼的核酸係在適於保證所表 量為穀胺酿基幾化酶蛋白 之控制下。 在一具體實施例中，至少—種需要γ邊化作用的蛋白質 及γ·縠胺醯基純酶由核酸來表現，核酸已藉由重組技術 引入細胞中。儘管實施本發明的替代方法為表現内因性蛋 白質（需要羧化之蛋白質或羧化酶），但其中内因性控制序 列之代替物（啟動子等）具有異源序列會影響所需表現水 0 宿主細胞較佳為真核細胞。典型的宿主細胞包括（但不 限於）昆蟲細、胞、酵母細胞、哺乳動物細胞。哺乳動物細 胞尤其較佳。合適的哺乳動物細胞株包括（但不限 於）CHO、HEK、NS0、293、Per c.6、BHK及 COS 細胞， 及其衍生物。在一具體實施例中，宿主細胞為哺乳動物細 胞株CH0-S。 叛化依賴型蛋白質之過表現一般已導致低羧化產物。此 事實歸因於内因性宿主細胞的羧化能力受到限制。另一方 面’ GGCX活性之高度（16至70倍）過表現沒有改良產物產 96250.doc -21· 1355419 量（Rehemtulla等人，Proc Natl Acad Sci USA 90: 461卜

4615，1993)、（Berkner及 Pudota，Proc Natl Acad Sci USA. 95: 446-471，1998)、（Hallgren等人，Biochemistry 41(50): 15045-15055，2002)。其中原因未全部清楚。本發明需要 GGCX適度過表現。此保證自細胞中表現高於GGCX之内 因性含量，例如，將GGCX之活性水平提高僅1.5至5倍。 在此適度提高之含量下，獲得了如實例1所示的出乎意料 的高含量之完全羧化的rhFII。 因此，應瞭解將本發明與先前共同表現學說區別之需要 羧化之蛋白質及羧化酶的表現比率，排除内因性生成的 GGCX含量。為滿足所需要的高生成率，有必要以蒿於正 常細胞中所發現的含量來表現羧化酶及需要羧化之蛋白 質。 在一較佳具體實施例中，使用具有較少或無組成表現的 羧化酶及需要羧化之蛋白質的細胞或細胞株。

在一具體實施例中，以低於或等於需要γ-羧化作用之蛋 白質之10%的量來表現γ-穀胺醯基羧化酶。在替代的、另 一具體實施例中，以低於或等於需要γ-羧化作用的蛋白質 之 5%、2% ' 1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05% 或 0.01% 的 量來表現γ-穀胺醯基羧化酶。 使用熟習此項技術者所熟知的技術可量測兩種蛋白質之 程度表現。該等技術包括直接量測，例如，量測蛋白質之 生物活性或蛋白質之量（例如，使用抗體），或間接量測， 例如，經由量測mRNA之轉錄水平（例如，如在實例3中之 96250.doc -22- 1355419

Taqman分析）。下列參考文獻揭示量測GGCX酶活性之方法 (Lingenfelter等人，Biochemistry 35: 8234-8243，1996 ; Berkner等人，Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471，1998 ; Hallgren等人，Biochemistry 41(50): 15045-15055，2002 ; 及 Berkner 等人，Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992)。 在一具體實施例中，需要γ-羧化作用之蛋白質為維生素 Κ依賴型凝血因子。在另一具體實施例中，需要γ-羧化作 用之蛋白質較佳係選自由下列各物組成之群：前凝血酶、 凝血因子II、凝血FII、凝血因子VII、凝血FVII、凝血因子 IX、凝血FIX、凝血因子X、凝血FX、蛋白質C、蛋白質 S、蛋白質Z、骨Gla蛋白質、間質Gla蛋白質、生長停滯特 異性蛋白質6及Acanthophiinae類FXa蛋白質。 在一特殊具體實施例中，需要γ-羧化作用之蛋白質為因 子IX。在另一特殊具體實施例中，需要γ-羧化作用之蛋白 質為前凝血酶。 本發明對任何來源的需要羧化作用之蛋白質具有通用 性。然而，若所表現蛋白質待用於人類治療目的，則人類 蛋白質尤其較佳。 在一具體實施例中，γ-縠胺醯基羧化酶為自小鼠、大 鼠、牛或雞心螺的起源。 在另一具體實施例中，γ-穀胺醯基羧化酶為人類蛋白 根據本發明之另一態樣，其提供一種用於生成γ-羧化蛋 96250.doc -23- 1355419 白質之方法，其包含：(1)在適於表現需要㈣化之蛋白質 及γ-縠胺酿基幾化酶之兩種蛋白質之條件下， 至少㈣之比率表現需要7，化 … _ 玄白貝及穀胺醯基羧 化鉍之細胞，及（W分離γ_羧化蛋白質。 根據本發明之另一態樣，其提 種用於在哺乳動物細 胞株中生成讀化蛋白質之方法，其包含以下步驟：⑴以 在哺乳動物細胞株中的該需&，化作用之蛋白質 胺酿基竣化酶共同表規，盆a 表％其中所表現需要㈣化作用之蛋 白質之量較所表現γ_穀胺醯錢化酶之量高出至少1〇倍； 及（Π)分離γ-羧化蛋白質。

一種用於生成γ_羧化蛋白質之方法，其包含： a)將真核細胞遺傳修飾以引入將需要缓化之蛋白質編妈 伴隨表現控制序列的第—種聚核㈣及將γ_穀胺酿基幾 酶編碼及伴隨表現控制序列的第二種聚核苦酸以生成能 共同表現至少1G:1比率的需要γ•㈣作用之蛋白質及卜 胺醯基缓化酶的真核宿主細胞；b)在允許表現第一及第_ ^核Μ的條件下於合適的培養介質中培養細胞；及c)l 介質或宿主細胞中分離羧化蛋白質。 表現載體通常包括複製起點、啟動子、轉譯起動位點、 視情況之訊號肽、聚腺苷酸化位點及轉錄終止位點。該等 載體亦通*含有用於選擇的一或多種抗生素抗性標誌基 因。合適的表現載體可為質粒、黏質體或諸如噬菌體或逆 轉錄病毒之病毒。將多肽之編碼序列置於適當啟動子（即 HSV、CMV、TK、RSV、SV4G等）、控制元件及轉錄終結子之 96250.doc -24- 明5419 控制下以便使將多肽編碼的核酸序列轉錄至藉由表現載體 組成物所轉換或轉染的宿主細胞中之RNA中。編碼序列可 或不可含有訊號肽或用於將多肽分泌至宿主細胞外之前導 序列。較佳載體通常將包含至少一個多選殖位點。在某此 具體實施例中’將會有選殖位點或多選殖位點位於所表現 的啟動子及基因之間。藉由選殖第二核酸序列至選殖位 點，可使用此類選殖位點以產生N-終端融合蛋白質以使其 與基因序列鄰近且順序正確（in_frame)。在其它具體實施 例中，存在直接位於基因下游的一選殖位點或多選殖位點 以與上述用於N-終端融合類似方式促進c_終端融合之形 成。 藉由熟習此項技術者所熟知的許多方法（例如轉染、轉 換及電穿孔之類）可將宿主細胞經基因修飾（具有所引入之 額外的核酸）。

本發明亦延伸至藉由本發明之方法所生成的純化丫 _緩 蛋白質及在凝jk劑治療中其之用途。 根據本發明之另-態樣，其提供一種生成適於誘發血 凝固的醫藥組合物之方法1包含純化由適於表現至 1〇:二比率的需要γ_羧化作用之蛋白質及γ-穀胺酿基緩化 之伤主細胞所表現的活性羧彳 ^ 羧化蛋白質且將純化羧化蛋白 與一或多種醫藥上可接受之澈杰丨+ ， 任又之載劑或賦形劑混合。 基於蛋白質之治療劑通常 省存在冷凍、冷卻、室溫下 /或以凍乾態儲存。 本發明之組合物可藉由習 @ *私序使用此項技術中所熟 96250.doc •25· 1355419 之習知醫藥賦形劑來獲得，但最有可能以適於注射之形 式，非經腸或直接進入傷口處。 水性懸浮液一般含有細粉狀的活性成份連同—或多種以 下物質：懸浮劑，例如敌甲基纖維素納、甲基纖維素、經 丙基甲基纖維素、海藻酸納、聚乙稀-〇比略咬鋼、黃著勝 及阿拉伯膠，分散劑或濕潤劑，例如卵碟脂，或氧化歸與 脂肪酸之縮合產物（例如，聚氧乙燁硬脂酸醋），或氧化= 烯”長鏈月曰肪心之縮合產物（例如，十七伸乙基氧基十六 知）’或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合 產物（例如聚氧乙晞山梨糖醇單油酸@旨），或環氧乙規與長 鏈脂肪醇之縮合產物（例如十七伸乙基氧基十六醇），或環 二烷與竹生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物(例如 聚氧乙稀山梨糖醇單油酸醋），或環氧乙烧與衍生自脂肪 酸及己糖醇奸之偏醋的縮合產物（例如聚乙烯山梨聚糖單 ，)。水性懸浮液亦可含有-或多種防腐劑(例如對-經 本甲酸乙醋或丙酿）、抗氧化劑（例如抗壞灰酸）、著色劑、 調味劑，及/或甜味劑（例如薦糖、糖精或阿斯巴甜）。 藉由將活性成份懸料植物油（例如花生油、撖禮油、 芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液體石蠟)中可調配油狀懸 子液。油狀懸浮液亦可含有諸如蜂壞、硬石蠛或十六烧醇 之增稠劑。亦可添加如上所述之彼等甜味劑及調味劑以提 供味道佳的口服製劑。藉由添加諸如抗壞也酸之抗氧化劑 可保存該等組合物。 經添加合適的稀釋劑，適用於製備用於注射之水性製劑 96250.doc -26- 1355419 之粉末一般含有活性成份連同合適的載劑及賦形劑、懸浮 劑及一或多種穩定劑或防腐劑。稀釋劑可含有其它合適的 賦形劑，例如防腐劑、彈性改質劑及穩定劑。 本發明之醫藥組合物亦可為水包油（〇il in water)乳液的 形式。油相可為諸如撖欖油或花生油之植物油，或諸如液 體石蠟之礦物油或任何該等油之混合物。合適的乳化劑可 為諸如天然存在的膠，例如阿拉伯膠或黃蓍膠，諸如天然 存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、衍生自脂肪酸及己糖醇 酐（例如山梨糖醇單油酸酯）之酯或偏酯及該等偏酯與環氧 乙烷之縮合產物（例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯）。 本發明之醫藥組合物亦可以無菌溶液或懸浮液之形式存 在於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中，其可根據已知程 序使用上面已提及的一或多種適當的分散劑或濕潤劑及懸 浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為存在於無毒非經腸可 接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如在 1,3-丁二醇中之溶液。 關於調配物之進一步資訊’請讀者參閱Comprehensive

Medicinal Chemistry 之第 5 卷第 25.2 章（Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990;或 Volume 99 of Drugs and the pharmaceutical sciences^

Protein formulation and delivery(Eugen J. McNally，執行編 輯），Marcel Dekker Inc 2000。 與一或多種賦形劑組合以生成單一劑型之活性成份的量 有必要視待治療的主體及特定投藥途徑而定。例如，欲向 96250.doc •27· 1355419 患者注射之調配物一般含有（例如）與介於全部組合物約5至 約98重量百分比間變化的適當及便利量的賦形劑化合的 0.5 mg至2 g的活性劑。劑量單元形式一般將含有約丨mg至 約500 mg的活性成份。蛋白質治療劑通常儲存在冷床或床 乾下。關於投藥途徑及劑量投法之進一步資訊，讀者參閱

Comprehensive Medicinal Chemistry 之第 5 卷第 25 3 章 (Corwin Hansch;編輯委員會主任），Pergam〇n press 1990。 化合物用於治療或預防目的之劑量大小一般根據病情的 特性及嚴重性、動物或患者之年齡及性別及投藥途徑，根 據熟知的醫學原理而變化。 在使用用於治療或預防目的之化合物中，其一般將投予 以便在若需要分次給藥時接收、給定介於（例如）〇.5 „^至 75 mg每kg體重之範圍中的每曰劑量。當採用非經腸途徑 時，一般投予低劑量。因此，例如，對於經靜脈内投藥， 一般將使用（例如）0.5 mg至30 mg每kg體重之範圍中的劑 量。相似地，對於經吸入服藥，將使用（例如）〇.5 mg至25 mg 每kg體重之範圍中的劑量。 本發明將進一步藉由以下非限制性實例來描述。 除非另有說明’本發明之實施將採用熟習此項技術者所 知範圍内的分子生物學及重組DNA技術之習知方法。以下 文獻中全面解釋了該等技術。參見，例如：Sambrook等 人 ’ eds·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 96250.doc -28- 1355419 NY (2001) ; Ausubel 等人，eds·，Current Protocols in

Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002) ; Glover & Hames，eds·，DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I，II，& III，IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds.， Methods in Enzymology, Academic Press ; Weir 等人，eds·， Handbook of Experimental Immunology, 5th ed., Blackwell Scientific Publications，Ltd.，Edinburgh, (1997) 0 實例1 將人類FII(hPT)及人類GGCX編碼之cDNA之擴增 自Clontech購得人類肝臟mRNA且自Invitrogen使用Superscript系 統進行cDNA合成。將所獲得的cDNA用作人類FII之擴增的 模板，使用： 引子卩1¥0 5'-八11'(：(：1€人010八€0：八00入0010八€八-3'，（3£(^101^0:3)及 引子ΡΓΕΧΤ S'^dACTCrGCAAACrGArcAAIOACCnCIUlXrCCACnUra，，

(SEQIDNO: 4)» 擴增人類GGCX係使用： hglx3, 5'-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3' - (SEQ ID NO: 6) 〇 將FII-編碼PCR產物直接選殖為經TA-TOPO處理的載體 pCDNA3.1V5/His(Invitrogen)中。選擇具有插入正破方向 之FII cDNA的純系得到Ptext5控制組成物（圖lb)。藉由使 將片段編碼之GGCX由pCDNA3.1V5/His TA-TOPO轉移至 pZeoSV2 +載體（Invitrogen)，使用限制酶BamHl 及 Notl，在 96250.doc -29- 1355419 SV40啟動子之控制下獲得將cDNA編碼之GGCX。移除 GGCX插入片段之EcoKV-Notl限制位點下游。然後自所得 pZeoSV2-GGCX質粒（含有SV40啟動子及GGCX，該GGCX 含有插入片段，但無將序列編碼之GGCX之聚腺苷酸位及 聚腺苷酸訊號下游）將平整Clal-Bcll片段選殖為 pCDNA3.1+(Invitrogen)之平整Dralll限制位點。選擇相對 於CMV啟動子具有前後排列（相同轉錄方向）插入之pSV40-GGCX片段之純系且使將自Ptext5之片段編碼之平整ΚρηΙ-Notl FII選殖為EcoRV位點以獲得ΡΝ32組成物（圖la)。ΡΝ32 及Ptext5之DNA序列如同附錄2。所有選殖方法係根據標準 方法及/或製造商之推薦程序。 PN32組成物含有以下關鍵特徵： -控制人類前凝血酶（PT)cDNA之轉錄的人類細胞巨化病毒 (hCMV)即時-早期啟動子，隨後是用於mRNA之有效轉錄終 止及聚腺苷酸化之牛生長激素（BGH)聚腺苷酸化訊號。 -控制人類γ-羧化酶cDNA(GGCX)之轉錄的SV40早期啟動子， 無明顯聚腺苷酸化位點或訊號。 -其它特徵如在圖1 a)中所顯示。 為比較使用無GGCX之PText5組成物（圖lb)。在SEQ ID NO: 1中顯示PTEXT5核苷酸序列。在SEQ ID NO: 2中顯示PN32核苷 酸序列。 前凝血酶生成所獲得的細胞株 將圖1中兩種組成物轉染至CHO-S細胞（Invitrogen)中。 使用用於前凝血酶活性之商用檢定（Chromogenix)來選擇並 96250.doc .30- 1355419 篩檢穩定的轉染子用於高生成性的選殖。在此檢定中，首 先以蛇毒液毒素（Ecarin-獲自Sigma)處理含有樣本之前凝 血酶以產生凝血酶。然後藉由添加產色體間質（s_2238)(其 當經前凝血酶處理時產生顏色）檢驗凝血酶活性。對兩個 組成物平行進行純系之轉染及選擇。在含有9%熱滅活胎 牛企清之DMEM介質中進行細胞培養。然後使所獲得純系 適於在無介質之動物組份中生長。所獲得最佳生成純系為 以PN32 (PT+GGCX)轉染，當在無化學界定介質之動物組 份中生長時，其生成高達400 mg/L人類重組前凝血酶（遠 超過任何已公開含量）^將已重組生成的rhPT純化（根據

Josic 等人，journai 0f chromatography B，790:183-197, 2〇03中所揭示方法），且藉由離子交換色譜儀使用Q瓊脂 糖管柱根據標準技術分德’以獲得純的全羧化rhPT。發酵 罐所生成的rhPT高至78 mg/L為全羧化且具有與自人類血 聚t所提純的前凝血酶相同的生物活性。藉由蛋白質之N_ 終止序列及藉由凝血酶原酶檢定來分析羧化（Ma〇等人， JBC，273:30086-30091，1998)。藉由添加組織因子在人類 貧血小板血漿中引發凝血酶產生，且基本上如Stig等人所 述量測潛在的内因性凝血酶，（B1〇〇d c〇agulati〇n and

Fibrinolysis，14:457-462, 2003)。 以PText5組成物所獲得的最佳純系得到在無化學界定介 夤之動物組份中之高達1〇 mg/L之生成率，其在文獻中所 報道的相同範圍内。估計由PText5選殖所獲得的全羧化前 凝血酶之份額大約為5〇%。因此全活性rhpT之最後回收為 96250.doc -31· 1355419 至少10倍高於使用含有低表現水平排列之γ-羧化酶的PN32 組成物。對於每個組成物，可識別具有相同表現水平之若 干纯系。 實例2 在CHO細胞株中量測GGCX活性

以ΡΝ32組成物（人類GGCX之共同表現）及ΡΤΕΧΤ5(無 GGCX之共同表現）轉染所獲得的兩種rhFII生成CHO-S細胞 株，分別使用無介質之蛋白質在增補5 gg/ml維生素K之旋轉 瓶中生長。每日替換十分之一的生長介質。培養7天後收 獲細胞且如 Berkner 等人（Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246 1992)所述製備微粒體。自收穫細胞之培養上清液中 將人類重組FII純化。如 Berkner與 Pudota(Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471 1998)，及 Lingenfelter 與 Berkner (Biochemistry 35: 8234-8243, 1996)所述量測GGCX活性。

吾人之量測顯示使用相同生長條件，在人類GGCX共同 表現CHO細胞株中之GGCX活性較僅表現rhFII之CHO細胞株 高出1.5倍。 實例3 藉由量測RNA之量對CHO-S細胞株中y·羧化酶及前凝血酶之 表現作實時RT-PCR分析。 藉由分別以PN32(PT+GGCX)及Ptext5(僅PT)組成物之穩 定轉染所獲得的兩種CHO- S細胞株，使用無介質之蛋白質 在增補維生素K之旋轉瓶中培養。培養4' 5及6天後撤出培 養樣本以覆蓋在mRNA產物中之預估的峰值含量。根據由 96250.doc -32. 1355419 賣主，Invitrogen所提供方案以Trizol™分離RNA。經分離 的RNA以來自Ambion的DNA-freeTM套組進行DNasel處理。 使用六聚體引子及用於RT-PCR之Superscript™ First-Strand Synthesis System, Invitrogen的套組内容進行 cDNA合成。 使用軟體Primer Express™，Applied Biosystems，選擇 用於實時RT-PCR之引子及經Vic-標記之探針。 人類γ·羧化酶低聚核苷酸

5' ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' 前置引子(SEQ ID NO: 7) 5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' 反置引子(SEQ ID NO: 8) 5’ CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3'探針(SEQ ID NO: 9) 擴增子長度86bp。 人類前凝血酶寡核苷酸 5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' 前置引子(SEQ ID NO: 10) 5' CATCCGAGCCCTCCACAA3' 反置引子(SEQ ID NO: 11) 5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3'探針(SEQ ID NO: 12)

擴增子長度69 bp。 引子由Operon/Qiagen製造及探針訂購自Applied Biosystems。亦使用齧齒動物GAPDH控制引子及探針 (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® Rodent GAPDH Control Reagents Protocol)-擴增子長度 177 bp。在 ABI PrismTM 7700 序列積測器（Applied Biosystems)上執行 實時RT-PCR反應。在瓊脂糖膠中確定經擴增PCR產物之預 期長度。 對全部三種基因進行供研究PCR反應功效之稀釋系列。γ- 96250.doc • 33· ^355419 羧化酶及前凝血酶之表現水平相對於控制基因、齧齒動物 GAPDH之表現而給出。 前凝血酶 2Λ-δ Ct CHO-S PText5 d4 CHO-S PText5 d5 CHO-S PText5 d6 CHO-S PN32 d4 CHO-S PN32 d5 CHO-S N32d6 0.008014 0.076239 0.066677 0.204948 0.322343 0.364334 7 -羧化酶 2Λ-δ Ct CHO-S PText5 d4 CHO-S PText5 d5 CHO-S PText5 d6 CHO-S PN32 d4 CHO-S PN32 d5 CHO-S PN32 d6 3.39E-07 0 0 0.000277 0.00159 0.001568 由所偵測的相對表現水平，視樣本收集日來計算比率大 % 約為74-232:1樣本。對於以PN32、共同表現rhPT及GGCX 轉染的細胞株，計算每個細胞轉錄的數，對於GGCX mRNA大約為8及對於rhPT mRNA大約為2000，因而得到 rhPT:GGCX為250:1之比率。對於相同樣本，GAPDH控制 mRNA數/細胞大約為4000 » 實例4 人類FII之產量

將實例1中所選殖的人類FII及GGCX cDNA如實例1般插 入PCDNA3.1中。為得到更高GGCX含量，將自pZeoSV2 + 中之羧化訊號包括在選殖至pCDNA3.1之平整的Dralll位點 之pSV40-GGCX-pA片段中。選擇具有含GGCX片段相比實 例1為逆序之純系。然後如實例1之相同方法完成FII片段 之選殖。最後組成物PP6顯示於圖2中，且PP6核苷酸序列 顯示於SEQ ID NO:15中。 藉由如實例1所述的轉染CHO-S而得到生成細胞株， 96250.doc -34- 1355419 B2F4及H3B10的兩種前凝血酶。如實例1將來自該等兩種 細胞株中之前凝血酶純化且表徵。B2F4之培養得到介於 30-70 mg/L範圍中的生成率及55-87%全羧化份額（越多 rhFII越少全羧化）。添加丁酸酯得到稍高的生成率但降低 全羧化rhFII之份額且認為係無益的。H3B10生長較慢且得 到約50 mg/L之生成率，其與在培養中之細胞量高度相 關，且全羧化rhFII之份額為大約60%。

較實例1中所獲得之細胞株，對於CHO細胞株使用PP6組 成物生成較少的全缓化rhFII。然而，全活性重組前凝血·酶 之產量仍遠高於先前所公佈含量。 實例5 藉由量測RNA之量實時PCR分析在CHO-S細胞株中γ-羧化 酶及前凝血酶之表現。

藉由如實例3中之相同方法及相同引子進行實時PCR分析 來分析來自實例4中之B2F4及Η3Β10細胞株。為與實例3中 之樣本相等，在峰值生成率下收集10 ml培養樣本。由於 此純系生長較慢，對於H3B 10樣本自第10天選殖，對於 B2F4樣本自第6天選殖。 表4.實時PCR分析生成細胞株共同表現GGCX之前凝血酶結 果。對於每個B2F4及H3B10取樣兩獨立的100 ml旋轉培養物 用於實時PCR分析。 96250.doc -35- 1355419 轉錄 全部#細胞 全部RNA 所得量 用於PT-PCR之全 部RNA 在RT-PCR中之 mRNA 量 在.RT"PCR 中之細胞 量 Ct 複製 mRNA 複製 mRNA/ 細胞 P1E2* 第6天 PT 2.00E-K)7 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E-K)3 19 2.10E+06 2005 GGCX 2.00Ε+Ό7 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E+03 27 8.19E-KJ3 8 GAPDH 2.00ΕΉ)7 2.39E-04 1.25E-08 2.50E-09 1.05E-K)3 18 4.19E+06 4010 B2F4-1 第6天 PT 1.30E+07 2.20E-04 1.25E-08 2.50E-09 7.39E+02 19.2 1.83E+06 2472 GGCX 1.30E+07 2.20E-04 1.25E«08 2.50E-09 7.39E+02 24.1 6.11E+04 83 GAPDH 1.30E+07 2.20E-04 1.25E-08 2.50E-09 7.39E+02 19.8 1.20E+06 1631 B2F4-2 第6天 PT 1.10E+07 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 19.2 1.83E+06 1859 GGCX 1.10ΕΉ)7 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 24.1 6.11E+04 62 GAPDH 1.10Ε+07 1.40E-04 1.25E-08 2.50E-09 9.82E+02 19 2.10E+06 2135 H3B10-1 第10天 PT 1.10Ε+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 17.77 4.92E+06 10375 GGCX 1.10E+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 23.4 9.93E+04 210 GAPDH 1.10E+07 2.90E-04 1.25E-08 2.50E-09 4.74E+02 17.96 4.31E+06 9095 H3B10-2 第10天 PT 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 19.2 1.83E+06 5087 GGCX 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 25.3 2.66E+04 74 GAPDH 8.90E+06 3.10E-04 1.25E-08 2.50E-09 3.59E+02 18.9 2.25E+06 6263 *來自實例3中之P1E2資料用於比較。 因此FII mRNA: GGCX mRNA的計算比率對於純系 H3B10為大約30:1且對於純系B2F4為大約50:1。對於純系 P1E2相應比率為250:1。 實例6 人類凝血因子IX(FIX)之產量 自Invitrogen購得人類基因庫肝cDNA將人類凝血因子IX cDNA擴增。寡核苷酸引子用於y-末端；F9f.擴增子：5·- -36- 96250.doc 1355419 CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3’（SEQ ID NO: 16)及 (寡核苷酸引子）用於3’-末端；F9r.擴增子：5·-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA -3· (SEQ ID NO: 17)。 藉由DNA序列來確定選殖正確序列。使用Ρ/χ聚合酶 (Invitrogen)及選殖引子將人類FIX片段經PCR擴增以生成 平整末端片段。使用T4聚核酸激酶使平整末端片段磷酸 化，且將其選殖至經自實例1及實例4之經EcoRV消化且脫 填酸的pCDNA-GGCX載體中。在此方法中，獲得用於共同 表現人類FIX及GGCX之組成物，其類似於用於人類前凝血 酶（實例1及4)之生成的共同表現組成物。藉由DNA序列及 在COS-7細胞中之瞬時表現確定選殖正確序列。 細胞株生成rhFIX之建立 使用實例1中所述程序將rhFIX組成物轉染至CHO-S細 胞。對於每種FIX組成物藉由細胞上清液之ELISA篩檢大 約3000個純系用於rhFIX表現。所使用抗體來自 HaemathologyTechnoly Inc.及 DakoCytomation。選擇純系 且使其適應在無化學界定CHO介質之蛋白質中生長。細胞 或在T型燒瓶中於37°C下或在旋轉瓶中於32-37 °C下生長。對 於所培養的兩種類型，C02濃度為5%。藉由Q-瓊脂糖陰離 子交換色譜儀在pH 7.0下將所生成之rhFIX提純至同質《藉 由凝結檢定使用FIX缺陷血漿（Precision Biologic)測定重組 rhFIX活性。所獲得最佳生成rhFIX之純系為使用F9NopA 組成物所獲得的N4D5，將生成高達4 pg/ml之活性rhFIX在 無化學界定介質之蛋白質中於T型燒瓶中生長。在旋轉瓶 96250.doc •37- 1355419 中生長的相同選殖生成高達7.1 Mg/ml的rhFIX。藉由西方 轉潰（Western blotting)估計總生成率（包括不完全緩化無活 性rhFIX)為至少30 ptg/ml。以rhFIX組成物F9hglx所獲得的 最佳生成純系為P1G9，其在類似條件下生成〇·7(Τ型燒瓶）

-1.3(旋轉瓶）Mg/ml rhFIX的。結果顯示使用F9NopA組成物 藉由在低含量下共同表現GGCX使rhFIX生成率提高，而使 用組成物F9hglx共同表現GGCX益處較少。亦需注意的係 引起N4D5選殖之F9NopA組成物，一般較引起P1G9選殖之 F9hglx組成物得到更高的ELISA訊號，同時在細胞株發展 程序期間對生成率進行篩檢。在SEQ ID NO: 14中顯示 F9NopA核苷酸序列。在SEQ ID NO: 15中顯示F9hglx核苷 酸序列3 N4D5細胞株之生成率優於相當條件下所獲得的先前公 佈的含量大約4-6倍（表5)。

表5比較自人類FIX產出細胞株之生成率。 細胞株/組成物 所生成的活性rhFIX 量 總生成率 (Mg/ml) 參考 T型燒瓶 旋轉式 (Mg/ml) N4D5/F9NopA CHO,低 GGXC 共 同表現 4 7.1 >30 實例6 P1G9/F9hglx CHO,介質 GGCX 共同表現 0.7 1.3 nd 實例6 IC4 CHO, HA(對照)共 同表現 0.9 nd 30 Rehemtulla 1993. 96250.doc -38 - IC4 CHO.高GGCX共同 表現 1 nd 29 Rehemtulla 1993. IC4 0.9 nd 20 US 5,460,950 1G8 CHO 1.5 nd 43 Kaufman, RJ 等 人，1986 JBC 261:9622-9628 r-FIXBHK 0.004/24h nd 0.004/24h Hallgren 2002 r-FIX 293 0.004/24h nd 0.004/24h Hallgren 2002 IC4+PACE 3.6 nd 22RIA US 5,460,950 1355419 實例7 藉由量測RNA之量實時PCR分析在CHO-S細胞株中γ-羧化 酶及因子IX之表現。 將重組hFIX生成之純系在旋轉瓶中於32-37°C下、在增 補維生素K之100 ml無化學界定介質之蛋白質中生長。在 峰值rhFIX濃度下收集5-10 ml樣本，且分析人類FIX及 GGCX轉錄之内容，以及GAPDH控制（house-keping)基因之 轉錄。程序如實例3。用於rhFIX之引子如下： 人類因子IX引子 5· AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3'前置因子(SEQ ID NO: 18) 5' CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3' 反置因子(SEQ ID NO: 19) 5' TCCTGTACTGAGGGATATCGACTrGCAGAAAAC 3'探針<SEQIDNO:20) 擴增子長度84 bp 吾人發現信使RNA含量視培養溫度及培養接種物大小在 不同天數中達到最高。吾人發現mRNA之峰值含量較好地 對應於培養介質中之rhFIX峰值水平。 96250.doc •39·

Claims (1)

1. m )9丄13丨237號專利申請案 丨日修正本 T入丁明寸们祀囷朁換尽（1〇〇年7 十、申請專利範圍： 1· 一種宿主細胞，其包含表現載體，該表現載體包含編碼 需要γ-羧化作用之蛋白質且與包含第一啟動子之表現控 制序列結合的核酸分子及編碼縠胺醯基羧化酶且與包 含第二啟動子之表現控制序列結合的核酸分子，其中該 第一啟動子之強度較該第二啟動子強，足以使得該需要 γ-羧化作用之蛋白質與該縠胺醯基羧化酶以至少1〇:1之 比率表現。 2. 如凊求項1之宿主細胞，其中該等核酸分子係在單一表 現載體内。 3. 如请求項1之宿主細胞，其中該第一啟動子為人類巨細 胞病毒（hCMV)即時-早期啟動子，且該第二啟動子為 SV40早期啟動子。 4. 一種細胞，其係經基因工程化以表現⑴需要卜羧化作用 之蛋白質’及（ϋ)γ-穀胺醯基羧化酶之細胞，其中該等蛋 白質⑴及（ii)係以10:1及500:1之間的比率表現。 5 .如請求項1至4中任一項之細胞，其中該需要γ·羧化作用 之蛋白質係選自由下列組成之群··凝血因子VII (FVII)、 凝血因子IX (FIX)、凝血因子π (FII，前凝血酶）、凝血 因子X (FX)、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、間質 Gla蛋白、生長抑制特異性蛋白6及Acanthophiinae類FXa 蛋白。 6.如請求項1至4中任一項之細胞，其中該需要丫·缓化作用 之蛋白質為維生素Κ依賴型凝血因子。 96250-1000701.doc 8 如咕求項1至4中任一項之細胞，其中該需要丫_羧化作用 之蛋白質為因子IX。 如凊求項1至4中任一項之細胞，其中該需要丫_羧化作用 之蛋白質為因子 如4求項1至4中任一項之細胞，其中該需要γ_羧化作用 之蛋白質為前凝金酶。 1 〇.如睛求項1至4中任一項之細胞，其中該需要丫_羧化作用 之蛋白質為人類蛋白質。 1 1 .如睛求項1至4中任一項之細胞，其中該γ_穀胺醯基羧化 酶為人類蛋白質。 1 2·如$求項1至4中任一項之細胞，其中該細胞係選自由哺 乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞組成之群。 13,如請求項12之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 14·—種經基因修飾之真核宿主細胞，其包含： (I) 編碼γ-穀胺醯基羧化酶蛋白的聚核苷酸序列，其中 該γ-榖胺醯基羧化酶蛋白之編碼序列係可操作地鏈接至 允許由該細胞表現γ-穀胺醯基羧化酶蛋白之表現控制序 列；及 (II) 編碼需要以該γ-榖胺醯基羧化酶蛋白羧化之蛋白質 的聚核苷酸，該聚核苷酸係可操作地鏈接至允許由該細 胞表現該需要羧化之該蛋白質之表現控制序列； 其中該細胞能夠表現至少1:1G之科的γ_穀賴基敌化 酶蛋白及需要羧化作用之蛋白質。 15. —種載體，其包含編碼需要γ·羧化作用之蛋白質且與包 96250-1000701.doc 1355419 含第一啟動子之表現控制序列結合的核酸分子及編碼γ_ 穀胺酿基幾化酶且與包含第二啟動+之表現控制序列結 合的核酸分子，#中該第一啟動子之強度較該第二啟動 子強，足以使得該需要γ-羧化作用之蛋白質與該γ_穀胺 醯基羧化酶以至少10:1之比率表現。 Ϊ6.如凊求項15之载體，其中該第一啟動子為人類巨細胞病 毋（hCMV)即時-早期啟動子，且該第二啟動子為^4〇早 期啟動子。 17·如明求項15之载體’其中該需要讀化作用之蛋白質係 、自由下列組成之群：凝血因子VII (FVII)、凝金因子 IX (FIX)、凝血因子u (Fn，前凝血酶）、凝血因子X )蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、間質Gla蛋 長抑制特異性蛋白6及Acanthophiinae類FXa蛋 其中該需要γ_幾化 其中6亥需要γ_緩化 士。月求項15至17項中任一項之載體 作用之蛋白質為因子IX。 19. 如請求項15至17項中任一項之載體 作用之蛋白質為因子X。 其中該需要γ_绩化 20. 如請求項15至17項中任一項之載體 作用之蛋白質為前凝血酶。 其包含：⑴在適於 種用於製造γ-羧化蛋白質之方 件下讀化作用之蛋白質及γ-穀㈣《化酶之條 之蛋白：養適於以至少10:1之比率表現需要γ-羧化作用 質及γ_穀胺醯基羧化酶的細胞，及(ii)分離γ,化 96250-100070i.doc 1355419 蛋白質。 ~ _ 22.種用於在哺乳動物細胞株中製造γ_羧化蛋白質之方 、、^ ^ 3以下步驟· G)在哺乳動物細胞株中將該需要 γ缓化作用之蛋白質與γ•榖胺酿基敌化酶共同表現，其 令該需要m作用之蛋白f之表現量較γ_榖胺酿基繞 化酶之表現量兩至少〗0倍，及（ϋ)分離丫_羧化蛋白質。 23·=種製造適於誘發血液凝固或促進增加或降低凝血之醫 藥組合物之方法，其包含將由適於以10:1及500:1之間之 ^ 比率表現需要y-缓化作用之蛋白質及γ-榖胺酿基叛化酶 的宿主細胞所表現的活性羧化蛋白質純化，及將經純化 之羧化蛋白質與-或多種醫藥上可接受之載劑或賦形劑 混合。^ 24. —種用於製造厂羧化人類因子χ之方法，其包含：⑴在 適於表現人類因子X及人類γ·穀胺醯基羧化酶之條件 下，培養適於以至少1 〇: 1之比率表現人類因子又及人類厂 縠胺醯基羧化酶之細胞，及（ii)分離丫_羧化因子χ。 • 25. —種用於製造γ-羧化人類因子Ιχ之方法，其包含：⑴在 適於表現人類因子IX及人類穀胺醯基羧化酶之條件 下，培養適於以至少1 0:1之比率表現人類因子Ιχ及人類 γ-縠胺醯基羧化酶之細胞，及（ii)分離厂羧化因子Ιχ。 26· —種用於製造γ-繞化人類前凝血酶之方法，立包含·（|) 在適於表現人類前凝企酶及人類γ_穀胺醯基羧化酶之條 件下，培養適於以至少10:1之比率表現人類前凝血酶及 人類γ-縠胺酿基缓化酶之細胞，及（ii)分離γ_羧化前凝血 酶。 96250-1000701.doc

   >93131237號專利申請案 十i圖式替換本(100年7月） 十一、圖式： a) 卜”月/ e修正本丨 on pUC SV40pA.f、/

   pSV40 人類GGCX 人類前凝血酶 /、；^Lbghpa 位點 BGHpolyA 序歹(J pSV40 b)

   1355419

   96250-flg-1000701.doc