JPH03501921A - 改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法 - Google Patents
改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法Info
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- JPH03501921A JPH03501921A JP63506813A JP50681388A JPH03501921A JP H03501921 A JPH03501921 A JP H03501921A JP 63506813 A JP63506813 A JP 63506813A JP 50681388 A JP50681388 A JP 50681388A JP H03501921 A JPH03501921 A JP H03501921A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法発明の背景
本発明は、プロティンC1並びにプロティンCを製造するための組換えDNA法
の使用、に関する。
凝血カスケードは、傷害に応答して生ずる多数の血漿タンパク質の関与する一連
の反応である。これらの血漿タンパク質の一つであるプロティンCは、血液系に
おける2つの重要なメカニズム、すなわち血餅形成及び血餅溶解が適当なバラン
スを保って、出血が余りに長く続かずしかも傷害を受けた特定部位以外の場所て
凝血しないようにする働きがある。
プロティンCはその活性型において、血液凝固経路に。
おける2つの補因子、Va因子及び■a因子を不活性化する。プロティンCは、
プロト−ロンビン及び■因子、■因子、X因子を含めた他のビタミンに一依存性
凝固因子とかなりの相同性を持ったアミノ酸配列を有する(Foster他、P
roc、 Natl、 Acad、 Sc1. USA 82. 4873頁(
1985) )。プロティンC1■因子、■因子、X因子、及びプロトロンビン
は、通常肝臓に存在する特異的酵素によって各タンパク質の7−カルボキシグル
タミン酸ドメインのグルタミン酸残基がγ−カルボキシル化されて、翻訳後に修
飾されるという点で類似している。これらのタンパク質はかかる修飾を受けない
限り不活性である。例えばヒト■因子をコードする遺伝子でマウス繊維芽細胞L
tk細胞を形質転換することに関して(Anson他、Nature 315.
8H頁(1985) ) 、著者らは以下のように述べている。
「1つの細胞系統が詳細に特徴付けられて、ELISA(酵素免疫固相測定法;
enzyge−11nked 1a+gunosorbent assay)で
検出可能ななヒト■因子を分泌したが、分泌された■因子は硫酸バリウムに吸収
されなかった。・・・このように、発現プラスミドはタンパク質産生に機能して
いることが証明された。しかしながら予想゛されたように、このマウス繊維芽細
胞の系統は生物学的活性に必要とされるヒト■因子のN末端グルタミル残基のγ
−カルボキシル化に必要な酵素を欠いている。」
著者らは同じプラスミドをラット肝がん細胞系統H4−11−E−C3中に形質
転換させたところ、γ−カルボキシル化機能性■因子が産生じたと報告している
。
ヒートプロティンCをコードする遺伝子が単離、クローン化、及び配列決定され
ている( Foster他、Pr0e、Natl。
Acad、Sc1.USA 82 、 4673頁(19ε5) 、Beckm
ann他、Nac 。
Acad、Res、 18.503 (1985) ) o活性型タンパク質が
ヒト肝がん細胞(HEPG−2)細胞系統中(Little他、1985年、第
10回インターナショナル・コングレスΦオン・トロンボシス・アンド・ヘモス
タシス、要旨集0989) 、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)
細胞系統中(L1tt+e他、1985年、第1O回インターナショナル・コン
で、43%のタンパク質が活性であると報告されている。
トロンビンによるインビトロでのプロティンCチモーゲンの活性化は10年以上
も前の文献に記載されている(Blochemistry 165824−58
21頁(1977) ) 、 しかしながら、この活性化に関する実験条件に対
しては余り注意が払われなかった。ある文献の著者は比較的低イオン強度化で活
性化を行っているが(J、Cl1n、Invest、64761−769頁(1
979) ) 、別の文献の著者は、恐らくトロンビン活性が塩で刺激されるこ
とを示唆した文献(Arch。
Bioches、Biophys、 20263−75頁(1980) )に応
じたものと思われるが、イオン強度を1100−150i NaCj2まで増加
させている(J、Bjol、Chem、 2588581J534頁(19H)
)。これらの塩に関する条件は、可溶性トロンビンとセファロースビーズに結合
したトロンビンとを(ThrombosisResearch 45413−4
19頁(1987) ) 、或いはトロンボモデニリンとの複合体を形成したト
ロンビンと内皮細胞上に見い出されるトロンビンレセプターとを(J、Cl1n
。
Invest、 739H−972頁(1984))識別するために変化させて
はいない。さらに、最近報告されたヘビ毒抽出物による組換えプロティンCチモ
ーゲンの活性化(Thro■bos i 5ResearCh 4785−91
頁(1987) )は低塩濃度でのトロンビン活性化の半分しかもたらさなかっ
た。本発明の目的の一つは、活性化の改良方法を提供することである。
本発明の概要
本発明は、一般的には、真核生物(好ましくは哺乳類)のメタロチオネインプロ
モーターの転写制御下にヒトプロティンCを巳−ドするDNA配列を含むベクタ
ーにしてウシ乳頭腫ウィルスの形質転換領域69%以上をさらに含むベクターを
供し、該ベクターで真核生物のホスト細胞をトランスフェクションさせ、トラン
スフェクションさせた細胞を担体粒子に付着させ、担体粒子に結合させた細胞を
培地中で培養して組換えプロティンCを生産させ、該培地又は該細胞から該組換
えプロティンCを単離することを特徴とする組換えヒトプロティンCを製造する
方法に関する。
本発明の上記の特徴は、ミクロ担体培養と組合せて用いた発現系が、a織培養に
おける同一発現系で生産した時の活性よりもかなり高い生物学的活性を存するプ
ロティンCを生産するという我々の発明に基づく。プロティンCチモーゲンを活
性化型のプロティンCに活性化する改良方法はこの発見に関連したものである。
好ましい哺乳類細胞は鰯歯動物(例えばラット又はマウス)の細胞、例えばマウ
スC127細胞、マウス骨髄腫細胞、及びラット肝癌細胞である。C127細胞
は、それが容品にトラスフェクション及び培養できるという点、及び選択しなく
ても高いコピー数(細胞当り100コピーを超える)でプロティンC含有プラス
ミドを維持することができるという点で特に存利である。
本発明の好ましいベクターは、DNA(ゲノム又はcDNA)及びウシ乳頭腫ウ
ィルス(BPV)ゲノム(noνIey他の米国特許第4419485号に記載
、その内容は引用によって本明細書に取り込まれる)の形質転換領域の69%以
上、より好ましくはそのゲノム全体を含む。好ましくは、プロティンCをコード
するDNAの下流にはSV40のDNAフラグメント、好ましくはポリアデニル
化部位が存在する。
以下でより詳細にべろように、本発明の一つの実施態様における組換え細胞によ
って産生されるプロティンCは、−4番目の位置にアルギニン残基を有する点で
天然に存在する分子とは異なっており、かかる修飾を行うとプロセッシングに幾
分かの改良が見られ、かつ哺乳類細胞中での発現の増加が観察された。本発明の
別の好ましい実施態様は、この修飾に関連させて、−5番目の位置のアルギニン
をグルタミン酸で置換したものである。
本明細書中で用いる「組換えプロティンC」という用語は酵素の活性化型のみな
らず不活性なプロティンC前駆体をも指すものである。プロティンCは細胞内で
1本鎖として合成された後、インビボにて4つの部位で切断される。グリシン残
基とスレオニン残基との間の第1の切断によって、細胞内の区画への輸送に必要
とされるシグナルペプチドが除去される。アルギニン残基とアラニン残基との間
の第2の切断によってγ−カルボキシラーゼ系によるタンパク質認識に必要とさ
れる「プロペプチド」片が除去される。アルギニン残基とリジン残基との間の第
3の切断によって、ジスルフィド結合で結合した重鎮(H鎖)と軽鎖(L鎖)が
生じる。完全に活性化された酵素を生じる第4の切断はH鎖のN末端から12個
のアミノ酸セグメントを切り取る。実際に起こっているかどうかは現在のところ
不明であるが、酵素の活性化はさらに別の切断をもたらす可能性がある。この1
56番目のアミノ酸(リジン)及び157番目のアミノ酸(アルギニン)を切り
取る切断は、成熟型2本鎖ウシプロティンCの場合と同様に、カルボキシ末端の
アミノ酸としてロイシンを与える。簡略化のため、第3図は156番目と157
番目のアミノ酸の存在を示して描かれている。
我々の作製したある組換えプロティンC(「新型」プロティンCと名付だ、下記
参照)の場合、精製画分中に存在するプロティンCは第4の切断を受けているに
もかかわらず第3の切断は受けておらず、天然に存在する活性プロティンCとは
構造的に区別される生物学的に活−性な2本鎖分子を形成することを、我々は発
見した。
本発明は以下でより詳細に述べるように、医療用として有用な生物学的に活性な
γ−カルボキシル化プロティンCを供する。好ましくは、本発明の組換えプロテ
ィンCは9511量%よりも高い純度、より好ましくは98重量%よりも高い純
度にある。
プロティンCチモーゲンの完全な活性化は、理想的にはセファロースビーズに結
合させたトロンビンにより低イオン強度下においてのみ得られることを我々は発
見した。予想もしなかったが、このときの活性は、従来受は入れられて来た10
0−150mM NaCfの条件下で観察される活性の2倍であった。
本発明の他の特徴や利点は、以下の好ましい実施態様の説明、並びに請求の範囲
から明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明
第1図は2つのヒトプロティンCのcDNAクローンを図示したものである。
第2図は上記クローンの1つの5′末端配列である。
第3図は組換えプロティンCのプロセッシングを説明する図である。
第4図及び第5図は中間ベクターProC−5及びBPv発現ベクターの構築法
を図示したものである。
6図はプロティンCの濃度と凝血時間との間の関係をグラフで示したものである
。
7図はヘビ毒とトロンビン−セファロースビーズ活性化とを比較したものである
。
詳細な説明及び最良の態様
一般的方法
以下に述べる手順において、先ず成熟型プロティンCの一部に対して作製したオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成するクローンから、ヒトプロティンCの一
部をコードするcDNA配列を単離した。次にこのクローンから得たフラグメン
トを、全タンパク質をコードするcDN^配列を含んだクローンの同定用第2プ
ローブとして用いた。その発現ベクターへの挿入を促進するため、完全cDNA
をインビトロ突然変異誘発によって修飾して5′末端のスプライシングされてい
ないイントロンを除去した。これらのステップを以下でより詳細に説明する。
プロティンCに対するcDNA
第1図を参照すると、pA123は哺乳類細胞中でのプロティンC発現用の発現
ベクター中に挿入するために処理されたプラスミドである。プラスミドpA12
3は全プロティンCコード領域(第1図の太線部分)を含み、さらにN末端イン
トロン(これは以下で説明するようにして除去された)をも含む。第1図にはp
A46も示しであるが、これは以下で述べるように、pA123を得るために用
いた350塩基対(bp)のプローブを与えるcDNA含有プラスミドである。
翻訳開始点(、ATG(−42))と成熟型タンパク質の1番目のアミノ酸残基
(Ala(1))との間の配列は「プレプロ」配列を表わす。第3図を参照する
と、プロセッシングの一25番目の残基と一24番目の残基との間で切断するこ
とを発見した。この第1の切断は「シグナルjペプチドすなわち「ブレ」ペプチ
ドを除去する。第2のプロセッシングによる切断は、未知の機構によって一1番
目の残基と1番目の残基との間で起こり、成熟型り鎖のAlaで始まる1本鎖プ
ロティンCをもたらす。さらにプロセッシングされると、プロティンCは「新型
」プロティンCと名付けた天然には存在しない活性種を生じるように切断される
。
2つのポリアデニル化及びプロセッシング部位は第1図の3′末端にPo1y(
A)として示した。第2の^TG開始部位の上流の、遺伝子の5′末端近くに唯
一のStu 1部位が存在する(第2図に示した)。この第2の開始部位は38
個のアミノ酸ポリペプチドの出発点を表わし、プロティンC遺伝子に対するcD
NA中のスプライシングされていないイントロンの一部によってコードされてい
る。
pA4Bは、プロティンC配列のアミノ酸64−77に対して作製したオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、ヒト肝MacDNAライブラリーから得たプラス
ミドクローンである。プロティンC遺伝子の5′末端はpA4Bを欠いているの
で、その350塩基対の5’Pst−■フラグメントをcDNAライブラリーの
再プローブとして用いて、完全なcDNAクローンpA123を得た。
cDNAのATG開始開始コドン付記列がXho I部位を与えるように修正さ
れていること、並びに修正された配列の上流のDNAが欠失し、cDNAクロー
ンのイントロンが除去されていることを除いては、前駆体ProC−3(第4図
)に類似したProC−5(第6図)のような発現ベクター中への、プロティン
Cに対するcDNAの挿入を促進するために、pA123の誘導体を以下に述べ
るようにして作製した。
成人肝臓cDNAライブラリー
cDNAライブラリーは、例えばMichelson他(Proc。
Natl、Acad、Sej、tlSA 80472頁(19113) )によ
って記載されているような慣用的方法によって構築される。ここで用いた方法は
、塩酸グアニジンの存在下でヒト肝臓をホモジナイズし、次いでオリゴ(clT
)−セルロースに2回通過させることによってポリ(A) RNAを単離するこ
とを含んでいた。次にcDNAを胎盤RNアーゼインヒビター(RNasins
バイオチック、ウィスコンシン州、マジソン)の存在下で肝臓@RNAから合成
した。400ヌクレオチドよりも長いcDNAがアルカリ性ショ糖勾配遠心分離
によつて単離され、2本目の鎖の合成は大腸菌(Escherichiacol
t) DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメント(ベーリンガーマンハイム
)の存在下に行った。得られた二重鎖cDNAを81ヌクレアーゼ(シグマ)で
処理し、400塩基対(bp)より長いサイズの二重鎖DNAの画分を中性ショ
糖密度勾配中で沈降させて得た。このcDNAの3′末端にdcホモポリマー束
を加え、次にこの3′末端にdCをつないだcDNAを、Pst Iで切断し3
′末端にdGをつないだプラスミドベクターpK721g (Talmadge
他、Gene 12.235頁(IH(1))とハイブリッド形成させ、E、
co目MC1061株(旧chelsonaProc、Nat1.Acad、S
ci、USA 80.472頁(1983) )を形質転換させた後でテトラサ
イクリン耐性コロニーを選択した。およそ120000の独立した組換えクロー
ンが元のプレートから得られたが、これらは回収してそれ以上増幅させずにグリ
セロールストックとして一70℃で貯蔵した。
cDNAライブラリーからのpA4Bとp^123の単離オリゴヌクレオチドプ
ローブは、標準固相リン酸トリエステル法を用い、プロティンCのアミノ酸64
−77をコードする配列と相補的に作製した。このプローブは5’ TGAAG
CTGCCGATGCCGTCGATGCACGTGCACGTGCCCTTG
3’の配列を有していた。
オリゴヌクレオチドプローブと相同のDNAをもつコロニーを同定するために、
32Pでラベルしたオリゴヌクレオチドを用いてニトロセルロースフィルター(
ミリボア)IA)IY)上でスクリーニングした。インキニベーション温度が4
0℃であるということを除けば、Wood s他(Proc、Nat 、^ca
d、sc1.79:5B81頁(1982))の記載した方法で、フィルターを
予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成させた。このプローブとハイブリッ
ド形成するクローンpA46を制限酵素消化及びDNA配列分析によって特徴付
けたところ、Fosterの上記文献に記載された配列全体に加えて5′末端の
42bpを含むことが判明した(第1図)。Pst Iクローニング部位と内部
Psi 1部位を用いて5′欠欠失列(第1図)を含む350bPフラグメント
を単離した。このフラグメントをニックトランスレーションによって標識し、上
記成人ヒト肝* eDNAライブラリ−のスクリーニング用プローブとして用い
た。およそ120000のクローンをこのプローブでスクリーニングしたところ
、幾つかの陽性クローンが単離された。単離したクローンの大部分はpA4Bと
同一であったが、クローンの1つpA123はp^4Bよりもかなり大きく、プ
ロティンCを完全にコードする配列に加えて243bpの5′不翻訳配列及びB
Obpの3′不翻訳配列を含んでおり、3′不翻訳配列における最初のポリアデ
ニル化部位のみ含んでいた。
ProC−3の構築
プロティンCeDNAを発現ベクター中に挿入するために、ユニークな制限酵素
部位をプロティンCクローンの5′及び3′末端上に導入」5なくてはならなか
った。その制限酵素部位、Xholは自然界では非常に稀で、プロティンCをコ
ードする配列中には存在しない。この制限酵素は形質転換性BPVウィルスを含
むベクター中に遺伝子を挿入するために以前から用いられていた。プロティンC
cDNAにおける制限酵素部位の種類と分布のために、末端にXho 1部位を
導入するには殻つもの工程から成る構築が必要であった。用いた工程は第4図に
示したが、以下のようにして実施した。pAj23を5tul/Avalで消化
したが、5tul部位はプロティンCeDNA配列中には一つしかなく 、AT
II;から1a4bp上流の5′不翻訳配列中に位置している。^v a、 1
部位はTAG終結コドンから約25[1bp上流のeDNAのコード領域中に位
置している(第1図)。
この5tui/Avalフラグメントはアガロースゲルのスライスから電気泳動
的溶出によって精製した。
pA123をPstlでも消化してl180bi)の7ラグメントを単離した。
このHObpフラグメントは、ATC開始コドンから51flibp下流のコー
ド領域中のPsi 1部位、及びTAC終結コドンから10bp下流の3′不翻
訳領域中のPst1部位を含む。Pstl −Pstlフラグメントをプラスミ
ドベクターptlc9のPst1部位にクローン化した。キメラpUC9の雑多
なりローンを単離して、挿入の方向性について試験した。
1つの単離されたクローン、ProC−1において、Pstlフラグメントの5
’Pst1部位はプラスミドベクターにおけるEeoR1部位の近くに位置して
いた。このクローンを!Saa、Iq次いでAvalで消化して、5tul −
Avalフラグメントと混合して連結させた。Avalプラント末端同士を連結
し、Stu!と5ealとのプラント末端同士も同様に連結した。得られるキメ
ラプラスミド、ProCJはIII所づつしかないEeoRl及び旧ndIII
制限酵素部位によって限定されるプロティンCに対する再構成コード配列を含む
。次項で述べる特定部位の突然変異誘発のために、ProC−2中のプロティン
Cコード領域を旧ndm / EcoRI制限酵素を用いて切断し、M13ベク
ター% apl&にクローン化した。このクローンをmProc−2と名付けた
。
Hjnam / EeoRiでこのプラスミドの消化し、E、coliポリメラ
ーゼ1で末端を埋め、そのDNAにXholリンカ−を連結させると、5vaa
1部位をXho1部位に変えたpUc9ベクター中にクローン化し得る分子が得
られる。得られたプラスミドProC−3は大量培養で成育させて=、 Xho
l−プロティンC−Xhol DNAフラグメントの材料を提供する。ProC
−3の配列が操作の間にうつかり変わっていないことを確認するために、Pro
e−30Xho1部位及びAva1部位の周りの配列を決定した。このような配
列分析の結果はこのような変化は何ら起こっていないことを示していた。
ProC−5の構築
ProC−5の構築法を第4図及び第5図に示した。プロティンCのeDNAの
5′末端を合成オリゴヌクレオチド(オリゴB)を用いて変化させた(これは第
2図に示した配列中の下線部である)。このオリゴヌクレオチドの配列は天然の
プロティンCのcDN^配列と一致しない2箇所の塩基対(星印で示す)を含ん
でおり、この部分はプロティンCeDNAの翻訳開始メチオニンの直ぐ5′側に
Xhol制限酵素部位を提供する。この部位は、cDNAクローンProC−3
の3′末端に導入したXho 1部位と共に、RPV発現ベクター中へのクロー
ン化に適した1本のXholフラグメント上に全プロティンCコート領域を与え
た。この突然変異を達成するために、先ずf’roe−2のEeoRI−旧nd
m挿入フラグメントをに、113フア一ジベクターmpla中にサブクローン化
させた(得られたクローンはpUc9 ProC−2クローンと区別するために
mProc−2と名付けた。第4図参照)。次にmProc−2の一重鎖型を単
離して、以下に示すように、オリゴBを用いて特定部位突然変異誘発法によりて
塩基対を変化させた。ハイブリッド形成分析によって、突然変異を同定し、クロ
ーン(口5’ XhoProC−2と命名)が大量に分離された。
mProc−2中にXho1部位を導入するために、5uDの一重鎖mProC
−2(100−200ng / u 11 )を、L’julの再蒸留水及び3
aDの0.2MTrfis、 pH1,4,0,1M MgCf1.0.5NN
aCD及び110ff1 D丁T中で、5μgのキナーゼ処理したオリゴB(下
記参照、80ug/μg)でアニールした。混合物を65℃で6分、37℃で6
0分、室温で10分、次いで次のステップまで0℃でインキュベートした。
ファージDNAの2本目の鎖は50ugの301M Trfs 、 pH7,5
,10wM )Igc1! 、 2μMβ−メルカプトエタノール、10uりの
10uM ATP、 3 u DのE、eoliポリメラーゼ(クレノーフラグ
メント)、5μl T4DNAリガーゼ、(2U=82
/’uO) 、2 μfJの[a P]dATP、及びそれぞれ1Mgの100
膠)l dATP、 dGTP%dcTP、 dTTPを加えることによ、フて
合成した。室温で15分間インキュベートした後、混合物をIB”cで1晩放置
した。
プライマー及び伸長反応で二重鎖とならないベクターのバックグランドを低下さ
せるために、上記伸長100mM Trjs、pH7,5,7ulの81ヌクレ
アーゼ(0,5U/μI)及び再蒸留水553μgと混合し、87℃で1分間イ
ンキュベートし、次に65℃で10分間インキュベートした。次に、この51処
理した伸長反応液85m1を800m1のコンピテントJMf01 (E、co
lj細胞)中に形質転換させた。対照として、Slによって処理していない伸長
反応液2mlもJMIOI中に形質転換させた。
突然変異体を、S1処理した伸長反応液からのプラークを含むプレート上でフィ
ルターリフトを用いて固定した。オリゴBを32P−ATPで高い比放射能とな
るまで酵素的にリン酸化し、 750−M NaC11%150mM Tris
pH1,2,10dEDTA、 5倍デンハルト(Denhardt ’s)
液、0.1%ピロリン酸ナトリウム、0.1%SDS 、及び50μg/μgE
、eOIf tRNA中におけるハイブリッド形成用プローブとして用いた。フ
ィルターは37℃で4時間予備ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成は、
酵素的にリン酸化されたオリゴB L、5 X 105cH/ mlを用い37
℃で1晩行ったこと以外は同じ条件の下で行った。ハイブリッド形成後、フィル
ターは42℃、50℃、54℃及び最後に57℃で洗浄した。各洗浄物は0.5
倍SSC中に30分分間−た。得られたフィルターを3時間オートラジオグラフ
ィ分析にかけ、そのオートラジオグラフを培養プレートに1列に並べ、24個の
潜在的に陽性(すなわちある程度のハイブリッド形成を示す)プラークを選んで
5 ml培地中で1晩s5’ XhoProC−2導入物とProC−3の導入
3’ −Xho末端とを、一箇所しかないNaa1部位で2つのフラグメントを
切断することによって連結した。
特表千3−501921 (6)
その結果得られたpLIc9プラスミド、ProC−4を単離し、その特性を明
らかにした。一般に行われる新規なベクターの分析の慣例的部分は、構造に用い
た全ての制限酵素部位が適切に再生されているかどうかを決定することである。
この場合、ProC−4の作製に用いたNae1部位は再生されていなかった。
この問題を修正するために、ProC−4のBgl II−旧nd mフラグメ
ントを第5a図に示したように、ProC−3かその同じフラグメントに置き換
えた。Naa1部位はProc−3からのフラグメント上に含まれている。最終
的クローンProC−5はその完全さを確めるために制限酵素地図分析及びDN
A配列決定によってチェックした。
ProC−Gln−Argの構築
ビタミンに依存性タンパク質の保存されたプロペプチド配列を比較すると、プロ
ティンCだけがプロペプチド配列の一4位にアルギニン残基をもたない唯一のも
のであることが分る。Bentley他(Ce1145,343頁(198B>
)は、因子1xのプロペプチドの一4″−位にアルギニン残基が存在しないと不
安定なプロ因子中間体を生じるとの仮説を立てた。
このようにプロプロチインCの適切なプロセッシング(すなわち、哺乳類細胞中
における+1位での切断ンを促進するために、プロティンCの4位のイソロイシ
ン残基を、後述のような特定部位突然変異誘発法によってアルギニン残基に変え
た。さらに、この突然変異は非常にアルギニンの多い配列をもたらすので、−5
位のアルギニン残基を、再び特定部位突然変異誘発法によってグルタミンに変え
た。(多量に分泌されるタンパク質であるブレプロトロンビンは一5位にグルタ
ミンを有する)。
これらの変異を以下に示す。
アミノ酸位置 −5−4−3−2−1
野生型プロテイ、ンCarg iso arg Iys argProC−Gl
n−Arg gin arg arg Iys argこのように変化を加えた
タンパク質は野生型のタンパク質よりも良好にプロセッシングされるだけでなく
、より効率的な成熟型タンパクのγ−カルボキシル化を可能にする。
Prop−Gin−Arg作製に用いる方法を第5C図に図示した。プロティン
CcDNAのプロペプチド末端に、元のDNA配列に基づいた合成オリゴヌクレ
オチド(オリゴC)を用いて変化を加えた。オリゴCの配列は3’ GG CT
G GTTGAC’GTCGCG GCG TTT GCA COG 5’であ
る。この配列は天然のプロティンCcDNAと一致しない3塩基対を含んでいる
。この配列を2図に示し341−372に番号付けられる。この配列はプロティ
ンCにおいて2つのアミノ酸の変化をコードしており、1つは一4位のイソロイ
シンをアルギニンにもう1つは一5位のアルギニンをグルタミンにするものであ
る。突然変異を行うためにProC−5の1.4kb EcoRI−)11nd
Inフラグメントを単離し、EcoRI−)find■処理した5pillに連
結してmPro−5を作製した。 mProc−5の一重鎮型を単離し、上記塩
基対に、オリゴCを用いた特定部位突然変異誘発法、及びProC−5の作製に
関する上記方法(すなわちクレノーフラグメント及びT4 DNAリガーゼによ
る処理)によって変化を加えた。突然変異はハイブリッド形成分析及び大量に単
離したクローン(ProC−GIr+−Argと名付けた)によって同定した。
ProCの発現ベクターへの挿入
修飾cDNAは適当な哺乳類発現ベクター中に挿入させることができる。好まし
い発現ベクターは、191i5年10月1日に出願されたWet らの米国特許
出願番号第782888号、及び)lsuing他のJ、Mo1.and Ap
p、Genet、2497頁(IH4)に記載されているBPVベクターである
。このベクターは、挿入遺伝子がそこから転写され得るマウスメタロチオネイン
プロモーターと、哺乳類細胞のトランスフェクションを効果的にするためのウシ
乳頭腫ウィルスDNAとを含む。CLl13axBPV(第4b図)は、SV4
0から得られる後プロモーターポリアデニル化配列をも含んでいるが、この配列
はプロティンCの発現を促進し、かつ転写終結配列として機能する。1図示した
発現プラスミドはE、coljプラスミドpMLの一部も含んでいるが、これは
原核生物系と真核生物系との往来を可能にする。ホスト細胞中にこれらのプラス
ミドを維持するための選択は必要なく、高いコピー数c iooコピー/細胞の
程度)で維持される。
ProC−5中でXholリンカ−を連結したプロティンC配列は、Xholに
よる消化及び挿入バンドの切断によってアガロースゲルから単離された。このフ
ラグメントを次に、第5b図に示したように、2つのBPVベクターのそれぞれ
れのXho 1部位にクローン化した。これらのベクターを次に、E、eoli
88101株中に形質転換し、大量培養した。
DNAは哺乳類細胞にトランスフェクションする前にCsCf1密度勾配遠心法
によって精製した。発現ベクターットの制限酵素消化によってチェ”/りした。
最終的に作rAII、たベクターを第4b図に示す。簡略化のために、発現ベク
トルの名前はCL28XhoBPVPProC及びCLH3axBPVProC
のそれぞれについてPCMa及びPC8bと省略した。r PCJはProte
in Cの略称であり、「N1」及びrSJは四IyA付加配列の超厚を表わし
、(メタロチオ÷イン(h、i )叉は5V40(S)、raJは本明!11書
中で述べたように、5′ −イントロンの除去されたプロティンCeDNAを指
すのに対して、rbJはスプライシングされていないイントロンを表わす。これ
らのベクターの名に先行rる追加の文字は、DNAがトランスフェクトされる細
胞系統を示したものである(すなわち、 Cl27に対しでは5日間毎日、2セ
ツ!・のC127細胞へのトランスフェクションを以下のようにして行なつた。
(5日のPCMaのトランスフェクション42− ]、 00 m+aプレート
、及びPC8aの5つのトランスフェクション42−100i+C127上皮細
胞(市販されている)をs Hsuing他の上記文献に記載されているような
、10%ウシ胎児血清(少量のビタミンに1約1μg / ml sを含む)、
ペニシリン/ストレプトマイシン、及び10aMグルタミンを添加したようなダ
ルベツコ修正イーグル(DME)培地中に維持した。
これらの細胞はエポキシドリ夛りターゼ活性を有するので、産生ずるプロティン
Cの7−カルボキシル化に関してビタミンKを再生し、かつ有効に利用すること
ができる。元々Faza 967から単離され(Klllary他38、523
頁(i984)) 、又ビタミンにの存在下で活性プロトロンビンを生じること
が既に示されている( Graves他、Bfiochemistry19、2
66頁(1980))肝カlv 細Di 系aFAO−101Pl?T−. 0
tlAr”) モ* タ使用t 6 m 、!:カT キル。エポキシドレダク
ターゼ活性をもつ他の鰯歯動物細胞14例えばNIH 3T3細胞(ATCC
CCL92)も使用することができる。この活性のない細胞では培地に大量のビ
タミンKを加える必要があり、タンパク質のγーカルボキシル化は効率が悪く、
生物学的に不活性なプロティンCを大量に生じる。これらの細胞によるビタミン
にの蓄積も起こり、細胞の他の酵素系を阻害する恐れがある。
C127細胞は、lsulng他の上記文献で修正されたV目get他、Ce1
l 11,223頁(1977)記載の方法に従ッテ、担体としてサケ精子細胞
を用い、l0115、及び20μgの3つの別々のトランスフェクションによっ
てPCMbでトランスフェクトさせた。トランスフェクションさせた翌日、細胞
を培養プレートに分植したが、プレートの幾つかはカバーグラスを含んでいた。
トランスフェクション後3臼目と4 1E目にカバーグラスを取り出して、プロ
ティンC抗体で染色した。2つのセットの対照実験を行った。最初の対照は、非
プロティンCベクターでトランスフェクトさせたCl27細胞の培養であってカ
バーグラス上に分植した。第2の対照は、試験細胞(下記)とは異なってホルム
アルデヒド固定後にNP−40で透過性としていないプロティンC感染細胞であ
った。対照細胞は免疫螢光が最小か全くなかった。反対に、透過させたプロティ
ンC感染培養細胞は染色されているのがはっきりと判別できた。
これは恐らくプロティンCベクターの遇途的発現に起因すると思われる。(4日
目の細胞は3日目の細胞よりも染色度が低かった)。
トランスフェクション後2過目に、トランスフェクトされた細胞コロニーをフィ
ルターリフト分析法によってスクリーニングした。多くの陽性コロニーがこの方
法によって同定された。同様に処理された対照細胞はこの分析法では陰性であっ
た。フィルター分析法により陽性であった79のコロニーが採取され、T−25
フラスコに移され・10μit / mlビタミンKを含有する培地中で培養さ
せた0これらのクローンの中で、72のクローンが培養液上清のELISA分析
によってスクリーニングされた◎最良031クローンをT−75フラスコに通し
た。24時間の細胞数と産生レベルとを1セツトのフラスコで計測し、他方重複
するT−75フラスコを保持して産生レベルを48時間毎に検定した。典型的に
はT−75フラスコは培地10m1中におよそ4 X 10B個の細胞を含んで
いた。これらの細胞を10日間検定をした。下の表1は4つの最良の産生細胞系
統を示したもので24時間につき細胞当り分泌されるプロティンC抗原のグラム
数として表わした。下の表2は、培養液”1 ml当りのngプロティンCとし
て表わした6つの細胞系統の産生レベルを示したものである。表に示されている
ように、2つの細胞系統、PCト4’eとPCM−8bは常に1μ&/ ml
/ 24時間(1■/fl培地/日)を越えるレベルで産生じた。
表 1
プロティンC抗原発現細胞系統
P CM −4d 5.40X to”表 2
プロティンC抗原発現細胞系統
P CM−4e 2058 2279
PCM−4b 1318 291
P CM−4311451084
1084PC97g 測定せず
P CM−4b 1224 27g4
PCM−4d 791 測定せず
組換えプロティンCの精製
典型的な精製方法は以下の通りである。組換えプロティンCを含む無血清培地2
01にTveen 80を加えて0.01%とする。次にこの液体をサルトリウ
ス・サルドブラン(Sartorius 5artobran) 0.5 μM
濾過カートリッジを通して濾過し、粒子や残渣を除去して清澄とする。濾過後、
培地のp)lを1.OMHcDの添加によって5.0に調整する。次に、液体は
50mM酢酸ナトリウム(Na0Ac)、pH8,0150Il+M NaC1
/ 0.01%Tveen 80を含む緩衝液で予め平衡化しておいた直径5.
0cm、ベッド容量100m1のQ−セファロースファーストフローカラム(フ
ァルマシア)にかけた。カラムに流す流速はさほど重要ではないが、通常20m
1Z分である。培地をのせた後、カラムを8−10ベツド容量の50mM酢酸ナ
トリウム(Na0Ac)、pH7,0150cM NaC#/ 0.01%Tv
een 80を含む緩衝液で洗浄した。500 raMNaCΩ/ 0.01%
Tveen150mM Na0Ac、 pH7,0の段階的溶出緩衝液をカラム
に流し、20m1の両分を同県した。ピークのプロティンC画分は、市販のプロ
ティンCELISAキット(ダイイグノスタチ力やスターゴ(Diagnost
icaStago))を用いてカラム画分をアッセイすることによって同定した
。ピーク画分をプールした。二〇カラムがらの組換えプロティンCの回収率は一
般に95−100%である。
Q−セファロースカラムからプールした画分をl 0aNTris、 pH8,
0/101M CACN 2/ 0.01%Tveen 80を含む緩衝液で1
:1に稀釈した。この物質は50gM Trls−pH7,5/150oMNa
CJ7 / 5+aM Ca(J! 2/ 0.0570 Tween 80を
含む緩衝液で予め平衡化させておいたイムノアフィニティ力ラムにかけた。イム
ノアフィニティ力ラムは、ビーズ1ミリリットル当り抗体5 mgの割合で、標
準手法に従って、ヒトプロティンC特異性モノクローナル抗体をCNBr活性化
セファロース4B(ファルマシア)に結合させることによって作製する。モノク
ローナル抗体はカルシウム依存性である。すなわち、カルシウムイオン存在下で
のみプロティンCと結合する。抗体は慣用的方法によってつくられる。カラムの
直径は5cll11で、ベッド容量はプールされたQ−セファロース画分中のプ
ロティンC1mg当りのベッド容量1mlの割合とした。組換えプロティンCを
のせた後、カラムは8−10ベツド容量の50taHTrls、pH7,5/1
50mM NaC1) 15gM (acfl 210.01%Tveen 8
0を含む緩衝液で洗浄した。次に、カラムは8−1Oベツド容量の50mMTr
ls、p)17.5/2.0MNaCN / 21MCaC4J 2/ 0.(
11%Tveen Hを含む緩衝液で洗浄する。組換えプロティンCは、100
mMグリシン/ 0.01%Tveen 80 pH4,0を含む緩衝液を用
いてカラムから溶出させた。カラムからの溶出液は両分に集め1110の容量の
1.OM Tris、 pH8,0/ 0.01%Tveen 80を含む緩衝
液を添加して中和したこのカラムからの組換えプロティンCの回収率は典型的に
は80%である。
約98%以上の純度を必要とする場合は、上記のように精製したプロティンCを
さらに以下の方法を用いて精製してもよい。イムノアフィニティ力ラムからの組
換えプロティンCを100mM Na0Ac、 pH6,0/80ieM Na
C110,01%Tveen 80を含む緩衝液を用いて1:1に稀釈する。次
に、この物質を、50gM Na0Ac、pne、oハ5mM NaCΩ/ 0
.01%Tveen 80を含む緩衝液で予め平衡化した30m1(ベッド容量
)、直径2.5 anのDEAE−)リスアクリル(LKB)カラムにかける。
試料をのせた後カラムを8−1Oベツド容量の50mM Na0Ac、 pH6
,0715mM NaC1t / 0.01%Tveen 80を含む緩衝液で
洗浄する。次に、組換えプロティンCを50+eMNaOAc、 p)1[1,
[l/750mM NaC11/ 0.01%Tveen 80を含む緩衝液で
バッチ溶出した。
このカラムからの組換えプロティンCの回収率は一般に95−100%である。
このようにして得られる組換えプロティンCは以下のプロトコルから判断すると
99%以上の純度であった。精製プロティンC2,0−2,5μgを8Xl。
X O,08cmの還元性SDSポリアクリルアミドゲルにのせ、標準Laem
m I I法によって電気泳動を行った。次に、ゲルを標準クーフシ−ブルー法
によって染色した。次に洗浄したゲルはレーザーデンシトメトリーでスキャンし
て組換えプロティンC及び不純物バンドを定量した。
組換え物質はプロティンCの天然のL鎖及び2本のH鎖のバンドと共に移動する
主要タンパク質を含んでいた。
これらのバンドに加えて、恐らく1本鎖プロティンCに対応するより高分子量の
バンドが存在する。このバンドにおける物質の量は、抗体カラムに流した培地の
量よりもむしろ培地中で発現したプロティンCのレベルにより密接に対応してい
る。同様のゲルのデンシトメーターの記録から、染色された物質の約70%がこ
の高分子量バンドの中に存在することが判明した。
精製した組換えプロティンCは凝血分析法でその生物学的活性を測定した。この
分析法は、プロティンCのγ−カルボキシグルタミン酸残基に依存性を有するた
めに選択した。プロティンCの凝血を分析するためのプロトコルは以下で詳細に
述べる。使用する標準物質は、Dr。
Johan 5tenflo (バンド大学(υn1vers!ty or L
und)、スウェーデン、マルモ)の提供によるこの上なく高度に精製されたヒ
トプロティンCである。
第6図は典型的な標準曲線を示し、表3は標準物質及び組換えプロティンC試料
の平均凝血時間を示している。試料#3はプロタックC(ProtacC)の存
在下及び不存在下の両方で測定した。プロタックCのない場合には、凝血時間は
緩衝液単独の場合と区別がつかず、このことは試料がプロティンC活性化剤によ
って活性化され、活性化型のプロティンCは標準中に存在しないことを示してい
る。各試料のプロティンC含量についてのELISA値を比較した時、#3及び
#4がおよそ50%の生物学的活性を有していたのに対して、#5は大体75%
の生物活性を有していた。これらの両分の生物学的活性が異なる理由は不明であ
る。これは精製に用いたモノクローナル抗体はCa”+依存性であり、しかもプ
ロティンCにおけるCa”+結合領域の1つはγ−カルボキシグルタミン酸残基
を含むので、十分にγ−カルボキシル化されてい・ないプロティンCの画分はカ
ラムに対する結合新和力が弱く、十分にγ−カルボキシル化された分子よりも早
く溶出するからであるとも考え得る。γ−カルボキシル化の程度と凝血分析法に
おける生物学的活性は直接的な関連性がある。
表 3
プロティンC依存性凝結試験
平均凝血 プロティンC
5105,94
6132,45
#3 (1: 5) 77.2 9.9(補正値)#3(1:5) 37.1
0
−プロタック
#4(1:5) 88.5 11.3(補正値)#5 (1: 5) 59.9
8.2(補正値)ミクロ担体を用いたプロティンCの製造プロティンCは以下
のようにしてミクロ担体上で生育させたCPM−4e細胞から製造した。
マイクロキャリアスピナー(Belleo GIass Co、)を洗浄し、空
気乾燥し、シリコン処理しくシグマコート、シグマ・ケミカル・カンパニー)、
乾燥した。次に、スピナーはガラス蒸留水で十分にすすいだ。
サイトデックス3(ファルマシア)不活性高分子ミクロ担体ビーズを各スピナー
に加え、次にスピナーはリン酸緩衝溶液(PBS)で最終作業容量の2分の1に
まで満【2だ。ビーズは室温で膨潤させ、その後デカントシてPBSで2度すす
ぎ、スビ)−容量を最終作業容量の2分の1に戻I7た。次に7、スピナーにゆ
るくふたを17、オート・りlノーズにか1.ブるために準偏し1、!21 ’
Cで1・・、2時間蒸気滅菌した。室温まで冷却した後、 ))BSを最終作業
容ユの20?6まで捨てで、DME、培地を加えて最終的容量にしt、−0得ら
れた培地を37℃で5分間撹拌し、た後、ビーズを沈降させ、その」置端の80
%を1096ウシ胎児血清を含む新鮮なりME培地で置き換えた。
集密的回転瓶からのトリグシ〕/処理1、たばかりのPCM−4e細胞をスピナ
ー培地中に加えた(最初の細胞濃度−1−2X 10’細胞/ml)。培地は次
に磁気撹拌器のj二に置き(撹拌速度−1リツトル容器について4.5rpei
)−1細胞を37℃で増殖させた。接種後3日日から細胞濃度が1.−2X 1
06細胞/mlになるまで2日毎に成育培地の8095を新しい培地と取り換え
た(細胞は核を計数して数えた)。
次に、培地細胞はビタミンK11oμH/mlを添加した無IG−1血清培地で
成育培地を置き換えてプロティンC産生期に導いた。この後、培地は24時間毎
に新鮮な培地と置き換えた。容器の酸素オーバーレイは20%に維持された。試
料をダイイアグノスチ力・スターゴ・アセ−ラブロチインCELISAキットを
用いてプロティンC抗原についてアッセイl、た。この条件下では、1リツトル
スピナーフラスコは6mg/n/24時間の平均発現レベルに30日間保ち得る
ことが判明した。培地からビタミンに1を除去するか、酸素オーバーレイを40
%に増やすとプロティンC産生が減少した。
3つのプロティンCミクロ担体産物から採取される試料の生物学的活性は以前に
述べられた凝血検定法を用いて測定した。少数の試料が低い(約30%)生物学
的活性を示したけれども、殆んどの試料が100%に近い生物学的活性と高いG
la含Q(タンパク質1モルにつき5モル)を示した。逆に、ビタミンK 、不
存在下にミクロ担体法によフて産生させたプロティンCは生物学的活性を全く承
さず、Gla含量は低かった。ミクロ担体上でなく11織培養でビタミンI(存
在下に増殖させた細胞からのPCM−4eの条件付き培地から分離したプロティ
ンCはGla含量は高いが生物学的活性は一貫して低かった。
用途
本発明の組換えプロティンCは、先天的及び後天的ブロチインC欠乏症患者の治
療に使用することができる。
現在有効な治療法のない先天的プロティンC欠乏症で16.000人に1人が苦
しんでおり、そのうちの75%が25才から35才に発病する再発性の血栓崩壊
を経験している。
後天的プロティンC欠乏症はビタミンに欠乏症、肝臓疾患、散在住血管内凝固(
血栓が全身にできる状態)である人に起り、又は術後期に起ることもある。股関
節を手術した患者は、米国では1年に187,000名に上るが、しばしば手術
後大体5日間はプロティンCレベルが減少した。この術後期の間、これらの患者
は深部静脈血栓症の危険性が高く、プロティンCを正常レベルに戻すとこの危険
性が低くなると期待される。
プロティンCの別の治療への応用は、線維素溶解剤、特に組織プラスミノーゲン
活性化因子(TPA)への補助療法としてである。プロティンCとTPAとの同
時投与は必要とされるTPAレベルを減らし、従って、心臓血管系患者の対偶効
率のより高い治療法が得られると期待される。
本発明のプロティンCは薬学的に受容できる担体物質、例えば塩類と混合され経
口的、静脈内或いは患部組織への注入によって投与される。プロティンC欠乏症
(血中プロティンCの正常値の50%未満と定義)の治療に関しては、少なくと
も1,5 ミリ当量/ mlまで血中レベルが上るような十分なプロティンCを
投与する(3ミリ当量/ mlが正常である)。一般に平均的な成人でプロティ
ンCを約10−100mg、最も好ましくは約60mg投与する必要がある。
プロティンCのまた別の可能性を有する用途としては、インビトロでの抗凝血剤
としての用途がある。
現在、採血された血液はクエン酸ナトリウムかEDTAで抗凝血化される。この
血液を大量輸血するとクエン酸ナトリウム又はEDTAが毒として作用すること
がある。天然物質であるプロティンCはこのような毒作用をもたないと考えられ
る。
第2、同じような用途は手術中の「再循還」血液の場合である。手術中に腹部及
び胸部で通常失われる血液は機械に吸引され、そこで洗浄されて、患者に再投与
される。この血液はクエン酸ナトリウムやEDTAで抗凝血化され、長い手術の
間患者は毒作用を受けなければならない。このような血液を抗凝結化するため、
クエン酸ナトリウム又はEDTAに代えて活性型のプロティンCを用いると、患
者がこのような毒作用を受け−るのを防ぐことができる。
寄託
ベクターCL28XhoBPVPROCは、1986年7月24日にE、Co1
1株中で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ5ン(ATCC)、メリ
ーランド州、ロックビルに寄託され、ATCC受託番号67L64とされた。
プロティンCのユニークな特性
ベクターCL28XhoBPVPROC”i’形質転換されり0127ホスト細
胞で産生されるプロティンCは炭水化物部分の中にα−1−3ガラクト一ス結合
を含み、その結合は、ヒト免疫グロブリンとのその反応性によって照明されるよ
うに、ヒト血液型B決定因子と類似している。この結合は、通常免疫グロブリン
に存在すると考えられる免疫反応性の増加による霊長類におけるインビボ半減期
の増加のような追加の生物学的特性をプロティンC分子に与えている。同一のプ
ロティンCcDNA配列を組込んだ適当なベクターで形質転換したCHO細胞は
、α−1−3がラクトース結合を有するプロティンCを産生せず、それに伴った
生物学的利点をもったプロティンCを産生じない。
プロティンC凝血検定プロトコル
組換えプロティンCの生物学的活性を測定するために現在用いられているプロト
コルを以下に示す。
材料:
1、抗凝固C活性剤(Aserlcan Diagnostica、 Inc、
) −この試薬はマムシ毒から得られるプロティンC活性剤であるPI?0TA
CCを含み、これはAPTT試薬と共に共凍結乾傑する。
2、プロティンC欠乏血漿(American Diagnostica。
Inc、)−凍結乾燥標品
3、正常ヒト血漿(American Diagnostica、 Inc、)
−凍結乾燥。プロティンC抗原は、プールされた正常なヒト血漿標品を100%
として用いて免疫電気拡散(Laurellロケット法)によって測定した。
4、イミダゾール−緩衝溶液、10倍濃縮物(AmericanDiagnos
tica、 Inc、)5、ウシ血清アルブミン(シグマ# A −7638)
6、0.025)I塩化化成ルシウム溶液7 Coag−A−Mate XC(
Organon Teknika Corporation) −自動化写真光
学的凝血装置。
アッセイプロトコル
1、抗凝固C活性剤を1.5mlの精製水で再構成する。
2、プロティンC欠乏血漿を1.5mlの精製水で再構成する。完全に再構成す
るためには使用前に室温に15分間血漿を置く。使用まで氷上で貯蔵する。
3、正常ヒト血漿を0.5mlの精製水で再構成する。完全に再構成するために
は使用前に室温に15分間血漿を置く。使用まで氷上に貯蔵する。
4、装置の電源を入れてCoag−A−Made Xc装置に以下のようなアッ
セイパラメーターを導入した。
テスト: APTT 空白時間:20秒ポンプ1vol ニア5μJl 活性化
時間:300秒ポンプ2volニア5μg 最大凝血検出時間=150秒5、精
製水で10倍濃縮物を稀釈することによって緩衝液を調製し、1倍溶液を得て、
1 gg / mlの濃度までBSAを溶解する。この溶液は予め用意しておき
、4℃で2週間も貯蔵する。
6、再構成したヒト血漿から血漿プロティンC標準液(推定濃度3μgプロティ
ンC)を以下のようにして調製する。
−800ng/ mlプロティンCを含有する貯蔵溶液は、1.2mlイミダゾ
ール−BSA緩衝液で正常ヒト血漿8(10ggを稀釈することによって調製す
る。
残る標準溶液は貯蔵溶液から調製した。
Ong10+1 − 200gg
tliOng/ml 50μj2 450μD120 ng/ml 100μi
f 400μf1240 ng/ml 200gg 300μl11360 n
g/m1 300μ0 200μD480 ng/ml 400u fl 10
0μm7、抗凝血C活性他剤及塩化カルシウムの試薬貯蔵器を各々第1及び第2
分配ポンプにつないで操作のためのCOag−A−)lateを調製する。管に
液体を流し気泡をすべて除いたことを確認する。実験を行う前に気泡について管
をチェックし必要ならば管に液体を入れ直す。
8、検定トレーの適当なウェルに以下の試薬をピペットで入れて標準液/試料の
凝血時間を検定する(2通り)ニ
ア5μpプロティンC欠乏血漿
+75μg標準液又は試料
各検定トレーは12個の試料ウェルをもつ。
9、検定トレーを装置に置き、反応を開始させる。検定の残りは自動的に行われ
、次の順序に従うニア5μg抗凝血C活性剤
37℃で5分インキュベートする
+75μΩ塩化カルシウム((1,025M)凝血時間を測定する。
10、試料中のプロティンCの濃度は、2次方程式に基づくデータを計算して、
曲線にフィツトさせるコンピュータプログラムを用いて標準から決定した([プ
ロティンC〕−AX C1i血時間32+Bx [凝血時間〕+C)。
方程式に対するデータの相関係数は一般に0.98より大きく、データ変換に関
連した誤差を減じている。
検定実施:
検定の実施は内部対照として役立ち、全ての検定に含まれる精製プロティンC標
品によってモニターする。
内部検定変動性(n −28)は現在的10%の変動係数をもつ。内部対照に関
する検定の精度(n −11)は変動係数は1096以下である。既知の比活性
をもつ標準プロティンC標品がないことから検定のゆ力Cみは知られていない。
プロティンCアミド分解法
A、試薬及び緩衝液
1、サンプル稀釈緩衝液:
5倍ストック: D、25M Trls C,l! 、p)1g、0; 0.5
N CaC(10,5%BSA 、新鮮なストックを無菌濾過し、4℃で貯蔵す
る。
作業:5倍ストックを再蒸留水で1:5に稀釈する。
緩衝液100μN当りThrove 5top 4μElを加える。
2、イミダゾール緩衝液:
溶液A : Trls3.03グラム;イミダゾール1.7グラム;蒸留水1.
OOm+中にINHCF 50m1゜溶液B : Trls4.04グラム;イ
ミダゾール2.27グラム:蒸留水100m1中にNaC!11.95グラム。
YO倍作業:25℃でp、118.4の溶液200 mlを得るために溶液Aど
溶液Bを混ぜる。濃縮液を得るためにNaC123,4グラムを200m1の溶
液に加える。イオン強度−3,0゜4℃で貯蔵する。
nl!J:、を惠M : 1o倍濃縮物の水における! −0,3: 1/1.
0稀釈。
3、 Throw St、op (American Di、agnostie
a> o水工ml中に1ボトル(1,0g店ole) 7ig取り出し、3週間
まで4℃で貯蔵する。
4、 Speclrozyme PCa (^rDerlean Diagno
stlea)。水265m1中に1ボトル(1,0gモル)を取り出し3週間ま
で冷凍し、て保存するか或いは数カ月間分υjし、凍結する(度々ではない)。
Iう 、 手 順
1、活性化プロティンCのストックを基1′−4稀釈用緩衝液中で稀釈しs 5
m ’C1/ mlのストックをつくる。
2、5 mU/mlのストックを用いて1乃至40tnLl/ウエルの標準曲線
をつくる(′1つのウェル当り1υuOを添加させると仮定)。使用するまで氷
の上に保存する。
3.96のウェルを有する柔軟なFalelプレートを用意し、各ウェルに以下
のものを添加する。
80μJ71−OJイミダゾール緩衝液標準又は試料 10gg
spectrozyIIe PCa 10gg4.37℃で30分間インキュベ
ートする。
5、氷酢酸20μgを用いて反応を停止させる8、 405gmで吸収を読み取
る
トロンビンビーズ検定
トロンビン−セファ0−スビーズ:
固定化したトロンビンは、製造業者の指示に従って精製したウシトロンビン(シ
グマT 7513.219[iU / IIlg)をCNBr−活性化セファロ
ース4B(ファルマシア)に結合することによって作成した。
未反応部位をブロックするためにエタノールアミンを用いたタンパク質の定量的
結合が得られた。活性トロンビンの収率は下記のトロンビン検定法によって測定
したところ1↓也均33−40%であ・フた。結合したビーズの活性は固定化し
たビーズの8O−120U / mlの範囲内であった。
アミド分解検定
名反応は1.5mlのエッペンドルフ遠心チューブ中で行う。トロンビン(シグ
マT 7518)をクエン酸塩50mM、 p+(8,5,/NaCl 150
gM/Tveen 80 Q、01%中で0.IU/mlに稀釈する。ビ・−ズ
スラリ−(固定化ビーズ1mlにつき緩衝液1m1)を一般に400分の1に稀
釈されるo SpeetrozymeTl((、American Dlagn
ostlea)は1バイアル当り1mlの再蒸留水中に懸濁させる。
標準曲線
0 5Qal Oμm200μg 50Bg1 50μm 10Bg190μm
150μg350μm 30μ47 170μm 50ugB 50μj!60
μJ7 140μf150μ110 50u 1 100u II 100uρ
50μρeads
50ug25μ9 175μ!J50Bg50μf150μN 150Bf15
0ug37℃で撹拌しながら30分間インキュベートする。反応は氷酢酸20μ
pを加えて停止させる。スピンビーズはエツペンドルフ微量遠心器中で1分間沈
降させる。250ulを取って405■の分光光度計中で測定する。ビーズ上の
トロンビン活性を可溶性トロンビンと比較する。
プロティンC活性化
精製又は部分精製したプロティンCチモーゲンを5mW Trls−Hcl (
pH8,3、範囲一 pH7,DJ、5) ; 1 mM EGTAを含む緩衝
液100倍容量に対して透析する。プロティンC試料の塩含量を低くするため透
析用緩衝液を新しく緩衝液と1回取り換える。
トロンビン−セファロースビーズは製造業者(ファルマシア)から入手できる「
ハンドブック・オブ・アフィニティ・クロマトグラフィ」に記載されているよう
に、湿潤状態で充填したCNBr−活性化セファロース4B(ファルマシア)1
ml当りト。ンビン(シグマ)25oユニツトを結合することによって作成した
。トロンビン−セファロースビーズは、湿潤状態で充填したビーズ1 mM当り
緩衝液1 mlの割合で50mMクエン酸ナトリウムCpH6,5) ;150
taM NaCl及び0.01%Tveen80を含む緩衝液中に40”Cで
保存した(長期間保存する場合には0.05%アジ化ナトリウムを緩衝液に加え
る)。ビーズに結合したトロンビン活性の単位(ユニット)は、合成基質み製造
業者記載しているように、合成色素生成基質、SpectrozymeT)I(
Agerfcan Djagnostlca)を用いて決定された。一般に、ビ
ード上でのトロンビン活性の回収率は30−60%であった。
プロティンCチモーゲンの活性化は約1(l乃至1000μgのプロティンC濃
度及び1ml当り約1乃至2oユニツトのトロンビン濃度で有利に行われた。1
価カチオン濃度(例えば、Na”、K”)は5o■H以下に保つのが理想的で、
インキュベーションは37℃で2〜6時間で行った。
第7図は蛇毒活性化及び本発明のトロンビン−セファローズビーズによって活性
化される2つの標品AB8.AB9(AとBおのおの2回試験した)の結果を比
較する。発明の利点は一目瞭然である。
ポリプロピレン製スクリューキャップ管に下記のものを加えた。5倍活性化用緩
衝液200 un (250mM Tris−HCJI! 、p)l ; 8.
4.0.05%Tweem80) ; 50BM EcTA20 u 1ニトロ
ンビン−セファロ−ススラリ−125μf!(スラリー−1m1充填ビーズに対
して13m1緩衝液):透析したプロティンCチモーゲン1.0ag ;及び最
終容量が1.0mlとなるように蒸留脱イオン水。
管をしっかりとふたをし、絶えず撹拌しながら37℃で4時間インキュベートし
た。インキユベートした後、トロンビンビーズは臨床用遠心機で5分間遠心して
除いた。活性化されたプロティンC上清は静かにデカントし、ELISA(Di
agnostfca Stago)によるアッセイ、及びプランフォードタンパ
ク質アッセイ(Brandf’ord、M:Anal。
Biocbem 72.24B頁(197B)によってタンパク質濃度について
、また前記のようにアミド分解及び凝血検定における活性について測定した。
以下の結果が得られたニ
プロティンC活性化
試験1 試験2 試験3
天然9C’ 98B +153448 +40 450 +47日数3 PBS
2470±85 348±68 225±45日数3 0C33471±35
345±28 280±74試験4 試験5
天然 pC1141±10 1097±312日数3 FB92879 ±11
3 429±24日数3 DO83849±112 468 ±511、冷却沈
殿した正常な貯蔵血漿から免疫精製された。
2、前記の寄託ベクターで形質転換されたC127細胞のから精製し、10%ウ
シ胎児血清を成長期の間に与えた。
38前記の寄託ベクターで転換されたC127細胞の5011マルビシ醗酵器で
つくられる3日目の条件培地から精製し、10%ドナー小ウシ血清を成長期の間
に与えた。
プロティンCに対するー’HD標準規格88ノロ22は定義によるとり、811
U/mlをもち、3μgプロティンC/ ml血漿の −の平均をとると、27
310./agに相当し、全ての場合に本発明の組換えプロティンCよりも相当
低い。
F工CIJRE 2
rcrccAccrccmcra。ccacccacrc7caccrcacc
cccaccracaccccccacccc云IG 3a
IG 3b
iG 3a
FIG 5b
FIG 5c
FIG 6
FIG 7
手続補正書輸発)
平成2年9月7日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.精製プロテインCの生物学的活性の50%以上、もしくはプロテインCに関 する世界保健機関(WHO)の標準規格(86/622)の活性の約100%以 上、の活性を有する組換えヒトプロテインCを製造する方法にして、(a)真核 生物のメロチオネインプロモーターの転写制御下にヒトプロテインCをコードす るDNA配列を含むベクターにして、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換領域の69 %以上をさらに含むベクター、を供する工程、(b)上記ベクターで真核生物の ホスト細胞をトランスフェクションさせる工程、 (c)上記のトランスフェクションさせた細胞を担体粒子に付着させる工程、 (d)上記の担体粒子に結合させた細胞をビタミンK添加培地中で培養して上記 組換えプロテインCを生産させる工程、及び (e)上記培地又は上記細胞から上記組換えプロテインCを単離する工程、 を含む方法。 2.前記ベクターが前記ウシ乳頭腫ウィルスのゲノム全体を含む、請求項1記載 の方法。 3.前記担体粒子が不活性高分子ビームである、請求項1記載の方法。 4.前記培養が、前記細胞に約40%未満のレベルで酸素を送ることを含む、請 求項1記載の方法。5.前記担体粒子に結合させた細胞を前記培養時に撹拌して 細胞を浮游状態に保つ、請求項1記載の方法。 6.前記ベクターが前記ヒトプロテインCをコードするDNAのC末端コード端 と前記ウシ乳頭腫ウィルスゲノムDNAとの間にSV40DNAの断片を含む、 請求項5記載の方法。 7.前記SV40DNAの断片が前記ヒトプロテインCをコードするDNAの発 現に関するポリアデニル化部位を含む、請求項6記載の方法。 8.工程(e)で単離されたプロテインCを、1価カチオン濃度が約50mM未 満の条件下に、ビーズに結合したトロンビンで活性化する工程をさらに含む、請 求項1記載の方法。 9.前記真核生物のホスト細胞がC127細胞である、請求項1記載の方法。 10.請求項1記載の方法で発現させた組換えヒトプロテインC。 11.請求項9記載の方法で発現させた組換えヒトプロテインC。 12.−4位にアルギニンを有する組換えプロプロテインC。 13.プロプロテインCをコードするDNAにして、−4位にアルギニンをコー ドするDNA。 14.−5位にグルタミンを有する粗換えプロプロテインC。 15.プロプロテインCをコードするDNAにして、−4位にグルタミンをコー ドするDNA。 16.95重量%より高い純度にある組換えヒトプロテインC。 17.組換えプロテインCが98重量%より高い純度にある、請求項13記載の 組換えプロテインC。 18.組換えプロテインCが98重量%より高い純度にある、請求項14記載の 組換えプロテインC。 19.請求項11記載の方法で製造し、α−1−3ガラクトース結合を含む、組 換えプロテインC。 20.α−1−3ガラクトース結合を含む組換えプロテインC。 21.天然のヒトブロテインCよりも長いインビボ(invivo)での半減期 を有する請求項20記載のタンパク質。 22.天然のヒトプロテインCよりも長いインビボでの半減期を有する組換えプ ロテインC。
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