RU2372401C2 - Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии витамин к-зависимого белка, вектор экспрессии в эукариотических клетках, способ получения гамма-карбоксилированного витамин к-зависимого белка и способ получения фармацевтической композиции для индукции свертывания крови или стимулирования повышения или понижения коагуляции - Google Patents
Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии витамин к-зависимого белка, вектор экспрессии в эукариотических клетках, способ получения гамма-карбоксилированного витамин к-зависимого белка и способ получения фармацевтической композиции для индукции свертывания крови или стимулирования повышения или понижения коагуляции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2372401C2 RU2372401C2 RU2006110147/13A RU2006110147A RU2372401C2 RU 2372401 C2 RU2372401 C2 RU 2372401C2 RU 2006110147/13 A RU2006110147/13 A RU 2006110147/13A RU 2006110147 A RU2006110147 A RU 2006110147A RU 2372401 C2 RU2372401 C2 RU 2372401C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- vitamin
- promoter
- dependent protein
- expression
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 16
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 title claims description 11
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 title claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 title 1
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 title 1
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 claims abstract description 126
- 108010013113 glutamyl carboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 151
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 142
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 58
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 48
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 42
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 36
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 26
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 26
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 26
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 23
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 20
- 108091005606 gamma-carboxylated proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 17
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 14
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 13
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 13
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 13
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 13
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 13
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 13
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 12
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 12
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 12
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 claims description 7
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150014526 Gla gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 claims description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 6
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 claims description 6
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 claims description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 5
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 5
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 5
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 5
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 claims description 5
- 229940105756 coagulation factor x Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 claims description 5
- 241000143336 Acanthophiinae Species 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 125
- 101000742236 Homo sapiens Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Proteins 0.000 description 76
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 38
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 25
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 21
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 20
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 17
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 16
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- -1 FIX Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 102000045338 human GGCX Human genes 0.000 description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 4
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000237974 Conus textile Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000283323 Delphinapterus leucas Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101150083125 GGCX gene Proteins 0.000 description 3
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940052349 human coagulation factor ix Drugs 0.000 description 3
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000957106 Homo sapiens Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD1 Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100038828 Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD1 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000276398 Opsanus tau Species 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 229920000785 ultra high molecular weight polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000276401 Batrachoididae gen. sp. Species 0.000 description 1
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- 241000237970 Conus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000018683 Conus episcopatus Species 0.000 description 1
- 241000032205 Conus omaria Species 0.000 description 1
- 241000288030 Coturnix coturnix Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000272060 Elapidae Species 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000142520 Myxine Species 0.000 description 1
- 241000251752 Myxine glutinosa Species 0.000 description 1
- 102100031475 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 241000282515 Papio hamadryas Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- UZHDGDDPOPDJGM-UHFFFAOYSA-N Stigmatellin A Natural products COC1=CC(OC)=C2C(=O)C(C)=C(CCC(C)C(OC)C(C)C(C=CC=CC(C)=CC)OC)OC2=C1O UZHDGDDPOPDJGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000209147 Triticum urartu Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000520892 Xanthomonas axonopodis Species 0.000 description 1
- WERKSKAQRVDLDW-ANOHMWSOSA-N [(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO WERKSKAQRVDLDW-ANOHMWSOSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 108010008250 drotrecogin alfa activated Proteins 0.000 description 1
- 108010085662 ecarin Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010228 ethyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004403 ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000002642 gamma-glutamyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940047434 kogenate Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- JIDVGUQUQSOHOL-UHFFFAOYSA-N myxin Chemical compound C1=CC=C2[N+]([O-])=C3C(OC)=CC=CC3=[N+]([O-])C2=C1O JIDVGUQUQSOHOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001206 natural gum Polymers 0.000 description 1
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000008181 tonicity modifier Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гамма-карбоксилированного белка, и может быть использовано в медицине. Витамин К-зависимый белок получают путем выделения после культивирования эукариотической клетки, содержащей экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-зависимый белок и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию. Ассоциированные последовательности содержат первый промотор и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гамма-глутамилкарбоксилазу, и второй промотор. В качестве первого промотора используют предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV), а в качестве второго промотора - предранний промотор SV40. При этом соотношение экспрессии витамин К-зависимого белка и гамма-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1. Изобретение позволяет получить гамма-карбоксилированный витамин К-зависимый белок в промышленных масштабах. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор. Кроме того, изобретение относится к способу получения белка, требующего гамма-карбоксилирования, с высоким выходом продукта.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Кровотечение представляет собой общую клиническую проблему. Оно является следствием заболевания, травмы, хирургического вмешательства и медикаментозного лечения. Крайне важно механически остановить это кровотечение. Это может оказаться трудным или даже невозможным из-за местоположения кровотечения или из-за того, что оно происходит из многочисленных (мелких) сосудов. Поэтому пациентам с кровотечением может потребоваться лечение агентами, которые поддерживают гемостаз. Эти агенты могут представлять собой продукты, происходящие из крови (гемотерапия), агенты, которые вызывают высвобождение эндогенных гемостатических агентов, рекомбинантные факторы свертывания крови (F) или агенты, которые замедляют растворение сгустков крови.
Происходящие из крови продукты первой линии обработки, часто получаемые из местной больницы, представляют собой цельную кровь для замещения объема крови и поддержки гемостаза, эритроцитарную массу для улучшения способности транспортировать кислород, концентраты тромбоцитов для увеличения количества тромбоцитов (если их мало или они дефектные) и свежезамороженную плазму для поддержки гемостаза (свертывания крови и агрегации тромбоцитов). Происходящие из плазмы продукты второй линии, которые поддерживают гемостаз, представляют собой криопреципитат плазмы, концентраты протромбинового комплекса, концентраты активированного протромбинового комплекса и очищенные факторы свертывания крови. В настоящее время имеется несколько факторов свертывания крови в виде рекомбинантных белков человека, неактивных (факторы свертывания крови VIII и IX) и активированных (фактор свертывания крови Vila).
Гемофилия представляет собой наследственное или приобретенное нарушение кровотечения, характеризующееся либо аномальным фактором свертывания крови, либо дефицитом фактора свертывания крови, либо антителами против фактора свертывания крови, который ингибирует прокоагулирующую функцию. Большинство часто встречающихся гемофилий представляют собой гемофилию А (дефицит фактора свертывания крови VIII) и гемофилию В (дефицит фактора IX). Очищенные или рекомбинантные одиночные факторы свертывания крови представляют собой основной способ лечения пациентов с гемофилией. Пациенты с ингибиторными антителами имеют проблемы в лечении, так как эти антитела могут нейтрализовать также фактор свертывания крови, который вводят такому пациенту. Активная форма белка С (АРС) представляет собой ингибитор коагуляции плазмы путем деградации активированных факторов свертывания крови Va и VIlla. Показано, что рекомбинантный АРС представляет собой эффективный способ лечения чрезмерной коагуляции плазмы у пациентов с сепсисом.
Факторы свертывания крови для терапевтического применения могут быть получены из плазмы человека, хотя процесс очистки не является простым и требует многих стадий, из которых некоторые направлены на элиминацию контаминирующих вирусов. Но даже при расширенных мерах безопасности и тестировании продуктов, происходящих из крови, контаминация инфекционными вирусами или прионами не может быть исключена. Из-за этого риска крайне желательно получать терапевтические белки человека из рекомбинантных клеток, выращенных в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Это не всегда является эффективным, так как для многих белков необходим хозяин-млекопитающее для того, чтобы продуцироваться в полностью функциональной форме, то есть правильно посттрансляционно модифицироваться. К факторам свертывания крови, получаемым в рекомбинантных клетках в промышленных масштабах, относятся FVII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) и FIX (BeneFix) (Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11: 169-177,1997), и активный белок С (Xigris). Одно из основных препятствий при получении больших количеств полностью функциональных рекомбинантных факторов свертывания крови человека заключается в Gla-домене, присутствующем в FII, FVII, FIX, FX и белке С. Этот домен содержит остатки глутаминовой кислоты, которые подвергаются посттрансляционной модификации путем присоединения карбоксильных групп. Получению этих факторов препятствует тот факт, что их сверхэкспрессия приводит к недокарбоксилированному и, следовательно, неактивному белку. Модификации Gla являются результатом действия витамин К-зависимого фермента, известного как γ-глутамилкарбоксилаза (GGCX). Этот фермент подробно изучали многие исследователи, в частности те, которые занимались изучением факторов свертывания крови (WO-A-8803926; Wu et al., Science 254 (5038): 1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc NatI Acad Sci USA 90: 4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274 (24): 16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445: 256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275 (46): 36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276 (11): 7769-7774, 2001; Bandyopadhyay et al., Proc Natl Acad Sci USA 99 (3): 1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 289: 6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41 (50): 15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278 (10): 8363-8369, 2003). По меньшей мере двумя научными группами предприняты попытки увеличить выход продукции путем совместной экспрессии GGCX и фактора коагуляции FIX, но они оказались безуспешными (Rehemtulla et al., 1993, там же; Hallgren et al., 2002, там же). Принимая во внимание большой интерес к γ-карбоксилированым белкам, можно предположить, что гораздо больше попыток совместной экспрессии окончились неудачей и поэтому не были описаны.
В случае человеческого FII (протромбина), по меньшей мере 8 из 10 Glu-остатков должны быть правильно модифицированы для получения полностью функционального протромбина (Malhotra et al., J. Biol. Chem. 260: 279-287, 1985; Seegers and Walz 'Prothrombin and other vitamin К proteins', CRC Press, 1986). Для получения высоких уровней выхода rhFII были предприняты экстенсивные попытки с использованием нескольких различных систем, таких как клетки СНО, клетки ВНК, клетки 293, и системы экспрессии на основе вируса осповакцины, но все они закончились неудачей или имели результатом недокарбоксилированный продукт, и соответственно функционально неактивный протромбин (Jorgensen et al., J. Biol. Chem. 262: 6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol AppI Biochem 14 (2): 222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38 (2): 129-136, 1995; Herlitschka et al., Protein Expr. Purif. 8 (3): 358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10: 214-225, 1997; Vo et al., 1999, там же; Wu and Suttie Thromb Res 96 (2): 91-98, 1999). Ранее описанные продуктивности карбоксилированного рекомбинантного протромбина человека являются низкими; 20 мг/л - для мутантного протромбина (Côte et al., J. Biol. Chem 269: 11374-11380, 1994), 0,55 мг/л - для протромбина человека, экспрессированного в клетках СНО (полностью карбоксилированного, Jorgensen et al., 1987, там же), 25 мг/л - в клетках СНО (степень карбоксилирования не показана, Russo et al., 1997, там же).
В WO 92/19636 раскрыто клонирование и идентификация последовательности витамин К-зависимой карбоксилазы человека и крупного рогатого скота. В этой заявке для получения витамин К-зависимого белка предложена совместная экспрессия витамин К-зависимой карбоксилазы и витамин К-зависимого белка в подходящей клетке-хозяине. Никаких примеров совместной экспрессии карбоксилазы и витамин К-зависимого белка не приведено.
Существует необходимость в улучшенных способах получения активированных факторов свертывания крови с высоким выходом продукта. Настоящее изобретение направлено на решение этой потребности.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор, где первый промотор значительно сильнее второго промотора, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка, которая создана для экспрессии (1) белка, который требует гамма-карбоксилирования, и (2) γ-глутамилкарбоксилазы, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1.
Согласно другому аспекту изобретения предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин, содержащая:
(1) полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок γ-глутамилкарбоксилазу, где указанная последовательность, кодирующая белок γ-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связана с последовательностями, контролирующими экспрессию и позволяющими указанной клетке экспрессировать белок γ-глутамилкарбоксилазу; и
(2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком γ-глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанным с последовательностями, контролирующими экспрессию и позволяющими указанной клетке экспрессировать указанный белок, требующий карбоксилирования;
где данная клетка способна экспрессировать белок γ-глутамилкарбоксилазу и белок, требующий карбоксилирования, в соотношении 1:10.
Согласно другому аспекту изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор, где первый промотор значительно сильнее второго промотора, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, адаптированной для экспрессии белка, который требует гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в соотношении по меньшей мере 10:1, при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка. В одном воплощении данный способ используют для получения гамма-карбоксилированного фактора IX человека, а в другом воплощении данный способ используют для получения гамма-карбоксилированного протромбина человека. В другом воплощении полученный гамма-карбоксилированный белок представляет собой гамма-карбоксилированный фактор Х человека.
Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка в линии клеток млекопитающих, включающий этап совместной экспрессии указанного белка, требующего гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в линии клеток млекопитающих, где количество экспрессирующегося белка, требующего гамма-карбоксилирования, по меньшей мере в 10 раз выше, чем количество экспрессирующейся γ-глутамилкарбоксилазы, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка. В одном воплощении данный способ используют для получения гамма-карбоксилированного фактора IX человека, а в другом воплощении данный способ используют для получения гамма-карбоксилированного протромбина человека. В другом воплощении полученный гамма-карбоксилированный белок представляет собой гамма-карбоксилированный фактор Х человека.
Согласно другому аспекту изобретения предложен выделенный гамма-карбоксилированный белок, получаемый согласно вышеизложенным способам, и применение выделенного гамма-карбоксилированного белка, получаемого согласно вышеизложенным способам, в коагулянтной терапии или применение выделенного гамма-карбоксилированного белка, получаемого согласно вышеизложенным способам, для изготовления лекарства для применения в коагулянтной терапии.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции, подходящей для индукции свертывания крови или стимуляции повышенной или пониженной коагуляции, включающий очистку активного карбоксилированного белка, экспрессирующегося в клетке-хозяине, адаптированной для экспрессии белка, требующего гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в соотношении от 10:1 до 500:1, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, и фармацевтическая композиция, получаемая этим способом. В одном воплощении активный карбоксилированный белок представляет собой гамма-карбоксилированный фактор IX человека, а в другом воплощении активный карбоксилированный белок представляет собой гамма-карбоксилированный протромбин человека. В другом воплощении активный карбоксилированный белок представляет собой гамма-карбоксилированный фактор Х человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1а приведена плазмидная карта вектора PN32 для совместной экспрессии (протромбин + GGCX).
На Фиг.1б представлена плазмидная карта экспрессирующего вектора Ptext5 (протромбин).
На Фиг.2 представлена плазмидная карта вектора РР6 для совместной экспрессии (протромбин + GGCX).
На Фиг.3а представлена плазмидная карта вектора F9NopA для совместной экспрессии (фактор IX+GGCX).
На Фиг.3б представлена плазмидная карта вектора F9hglx для совместной экспрессии (фактор IX+GGCX).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения разработали другой подход к экспрессии соответствующим образом карбоксилированных рекомбинантных витамин К-зависимых факторов свертывания крови, который включает совместную экспрессию витамин К-зависимого фактора свертывания крови и γ-глутамилкарбоксилазы (GGCX) в различных соотношениях. В качестве примера авторы изобретения экспрессировали протромбин человека (rhFII) и GGCX человека. Вместо использования сильных промоторов как для rhFII, так и для GGCX, как это уже пытались делать другие (Rehemtulla et al., 1993, там же; Hallgren et al., 2002, там же), авторы изобретения использовали стратегию, направленную на сильную экспрессию FII в комбинации со слабой или очень слабой экспрессией GGCX, при которой количество экспрессирующейся GGCX составляло менее 1/10 от экспрессирующегося rhFII. Неожиданно эта стратегия привела к высоким уровням секретируемого правильно модифицированного rhFII и хорошей жизнеспособности клеток-хозяев даже в том случае, когда эти клетки выращивали в среде с установленным химическим составом, не содержащей компонентов животного происхождения.
Авторы изобретения клонировали GGCX и протромбин человека в экспрессирующем векторе таким образом, что уровень мРНК протромбина превышает уровень мРНК GGCX по меньшей мере в 10 раз. Это приводит к большому избытку в продукции протромбинового белка по сравнению с GGCX-белком.
В качестве другого примера авторы изобретения экспрессировали rhFIX, используя те же самые векторы для совместной экспрессии с GGCX. Это привело к тому, что в одном случае клеточные линии продуцировали мРНК фактора IX на уровнях, превышающих уровни мРНК GGCX по меньшей мере в 10 раз. В другой клеточной линии соотношение мРНК фактора IX и мРНК GGCX составляло приблизительно 4-5:1. Существенно возросшую продуктивность rhFIX показала только клеточная линия, дающая соотношение по меньшей мере 10:1 (Таблица 1).
Таблица 1. | ||||
Сводные данные по продуктивности и соотношению мРНК карбоксилированного белка и мРНК GGCX | ||||
клон НАЗВАНИЕ/КОНСТРУКЦИЯ | Продуцируе- мый белок |
Получение* полностью активного белка (мг/л) | Карбоксилиро- ванный белок :GGCX, приблизит. соотношение мРНК |
Источник данных |
P1E2/PN32 | Протромбин человека | 40 | 250:1 | Пример 3 |
B2F4/PP6 | 26 | 50:1 | Пример 5 | |
Н3В10/РР6 | 30 | 30:1 | Пример 5 | |
E1A9/PText5 | 3,5 | Отсутств. GGCX | Пример 3 | |
N4D5/F9NopA | FIX человека | 7,3 | 45:1 | Пример 7 |
P1G9/F9hglx | 1,3 | 4:1 | Пример 7 | |
IC4 | 1 | отсутствует GGCX | Rehemtulla 1993, US 5460950 | |
* Продуктивность измеряли для постоянно перемешивающихся культур при сходных условиях роста. ¤ Данные из Rehemtulla 1993 и патента США №5460950. |
Можно ожидать, что витамин К-зависимые факторы свертывания крови (FII, FVII, FIX, FX и их активированные формы FIIa или тромбин, FVIIa, FIXa, FXa), полученные настоящим способом совместной экспрессии с GGCX, окажутся полезными в предупреждении и лечении кровотечения, являющегося следствием травмы, хирургического вмешательства или заболеваний печени, почек, тромбоцитов или факторов свертывания крови (гемофилии). Аналогично можно ожидать, что фактор свертывания крови белок С и его активированная форма АРС окажутся полезными в предупреждении и лечении расстройств, связанных с повышенной коагуляцией с уменьшением или без уменьшения уровней белка С. Данный способ является подходящим также для других белков, которые требуют посттрансляционного карбоксилирования.
Согласно первому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая зкспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор, где первый промотор значительно сильнее второго промотора, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.
В предпочтительном воплощении соотношение данных экспрессирующихся белков находится в диапазоне от 10:1 до 1000:1, более предпочтительно в диапазоне от 10:1 до 500:1 и еще более предпочтительно в диапазоне от 25:1 до 250:1. Особенно подходящее соотношение составляет приблизительно 200:1.
В отдельных воплощениях соотношение этих двух экспрессирующихся белков может составлять по меньшей мере 10:1, 30:1, 45:1, 50:1, 100:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1, 500:1 и 1000:1.
В одном конкретном воплощении как молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, так и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, расположены в одном и том же экспрессирующем векторе. В другом воплощении эти две молекулы нуклеиновой кислоты расположены в отдельных экспрессирующих векторах.
Согласно другому аспекту изобретения предложена нуклеиновая кислота, соответствующая SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, трансфицированная или трансформированная вектором, содержащим последовательность SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:15 для экспрессии фактора IX человека.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, способная экспрессировать ферменты фактор свертывания крови IX человека и γ-глутамилкарбоксилазу человека, где нуклеиновая кислота, кодирующая фактор свертывания крови IX человека, и нуклеиновая кислота, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связаны с регуляторными последовательностями, которые способны экспрессировать эти два белка в соотношении по меньшей мере 10:1 соответственно.
Согласно другому аспекту изобретения предложена эукариотическая клетка-хозяин из организма, не являющегося человеком, адаптированная для экспрессии ферментов фактора свертывания крови IX человека и γ-глутамилкарбоксилазы человека в соотношении по меньшей мере 10:1. В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая фактор свертывания крови IX человека, и нуклеиновая кислота, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связаны с регуляторными последовательностями, которые способны экспрессировать эти два белка в соотношении по меньшей мере 10:1 соответственно.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор свертывания крови IX человека, под контролем промотора hCMV, и нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоксилазу человека, под контролем промотора SV40.
Согласно другому аспекту изобретения предложена нуклеиновая кислота, соответствующая SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.
Согласно другому аспекту изобретения предложены клетки-хозяева, трансфицированные или трансформированные вектором, содержащим последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 для экспрессии протромбина человека.
Согласно другому аспекту изобретения предложены клетки-хозяева, способные экспрессировать ферменты протромбин человека и гамма-карбоксилазу человека, где нуклеиновая кислота, кодирующая протромбин человека, и нуклеиновая кислота, кодирующая гамма-карбоксилазу, функциональным образом связаны с регуляторными последовательностями, которые способны экспрессировать эти два белка в соотношении по меньшей мере 10:1 соответственно.
Согласно другому аспекту изобретения предложена эукариотическая клетка-хозяин из организма, не являющегося человеком, адаптированная для экспрессии ферментов протромбина человека и гамма-карбоксилазы человека в соотношении по меньшей мере 10:1. В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая протромбин человека, и нуклеиновая кислота, кодирующая гамма-карбоксилазу, функциональным образом связаны с регуляторными последовательностями, которые способны экспрессировать эти два белка в соотношении по меньшей мере 10:1 соответственно.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую протромбин человека, под контролем промотора hCMV и нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоксилазу человека, под контролем промотора SV40.
Данное изобретение подтверждено примером, где в качестве белков, требующих карбоксилирования, использованы протромбин и фактор свертывания крови IX. Однако и у некоторых других белков, отличных от протромбина и фактора IX, полная биологическая активность зависит от правильного γ-карбоксилирования. К этим известным специалисту белкам принадлежит фактор свертывания крови FVII, который в настоящее время в промышленном масштабе получают только в рекомбинантных клетках млекопитающих с относительно низкими уровнями (приблизительно 10 мг/л или менее). Настоящее изобретение можно использовать для улучшения продуктивности любого белка, который зависит от γ-карбоксилирования, такие белки включают, но не ограничены ими, протромбин, фактор свертывания крови II (FII), фактор свертывания крови VII (FVII), фактор свертывания крови IX (FIX), фактор свертывания крови Х (FX), белок С, белок S, белок Z, костный Gla-белок (также известный как BGP или остеокальцин), Gla-белок матрикса (MGP), пролин-обогащенный Gla-полипептид 1 (PRRG1), пролин-обогащенный Gla-полипептид 2 (PRRG2), белок 6, специфический в отношении остановки роста (Gas 6). Другие подходящие белки представляют собой FXa-подобный белок из яда змей элапид (подсемейство Acanthophiina) и яда улиток-конусов (Conus textile).
Каждый из этих белков, включая их нуклеотидные и аминокислотные последовательности, хорошо известен. В таблице 2 идентифицированы типичные последовательности различных белков дикого типа и мутантных форм, которые могут быть использованы по настоящему изобретению.
Следует принимать во внимание, что данное изобретение не ограничено конкретным белком или белок-кодирующей последовательностью одного из тех белков, которые должны быть совместно экспрессированы. Более того, и в особенности это касается факторов свертывания крови, в данной области раскрыты многочисленные мутантные формы этих белков. Настоящее изобретение применимо в равной степени и к этим мутантным формам, включая природные аллельные варианты, данных белков, а также к последовательности дикого типа. В одном воплощении изобретение можно применять к любому белку дикого типа или белку, который по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичен последовательности белка дикого типа.
Идентичность двух последовательностей может быть определена путем анализа попарного выравнивания с использованием таких компьютерных программ, как BestFit, PILEUP, Gap или FrameAlign. Предпочтительная программа выравнивания представляет собой BestFit. На практике при поиске сходных/идентичных последовательностей на запрос о поиске в базе данных обычно необходимо выполнить первичную идентификацию сходных последовательностей, используя подходящие алгоритмы, такие как Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA или Fasta3, и матрицу весовых коэффициентов, такую как Blosum 62. Такие алгоритмы стремятся к близкой аппроксимации алгоритма выравнивания "золотого стандарта" по Смиту-Уотерману (Smith-Waterman). Таким образом, предпочтительное программное обеспечение/программа реализации поиска для использования при определении схожести, то есть насколько две исходные полипептидные последовательности выровнены, представляет собой алгоритм Смита-Уотермана. Идентичность относится к прямым совпадениям, сходство допускает консервативные замены.
Термин "γ-глутамилкарбоксилаза", или "GGCX", в контексте данного описания относится к витамин К-зависимому ферменту, который катализирует карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты.
GGCX-ферменты широко распространены и клонированы из многих разных видов, таких как кит белуха Delphinapterus leucas, рыба-жаба Opsanus tau, курица (Gallus gallus), миксина (Myxine glutinosa), мечехвост (Limulus polyphemus) и улитка-конус Conus textile (Begley et al., 2000, там же; Bandyopadhyay et al., 2002, там же). Карбоксилаза улитки-конуса сходна с карбоксилазой крупного рогатого скота и экспрессировалась в клетках COS (Czerwiec et al., 2002, там же). Дополнительные белки, сходные с GGCX, можно обнаружить у насекомых и прокариот, таких как Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster и Leptospira (регистрационные номера NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548 и (Bandyopadhyay et al., 2002, там же) соответственно). Фермент карбоксилаза проявляет значительную эволюционную консервативность. Показано или может быть прогнозировано, что некоторые ферменты из организма, не являющегося человеком, проявляют активность, сходную с активностью GGCX человека, которую использовали авторы изобретения, и поэтому могут быть использованы в качестве альтернативы данному человеческому ферменту.
В таблице 3 идентифицированы типичные последовательности предсказанных белков, гомологичных GGCX человека (сортированы по видовому происхождению), которые могут быть использованы по настоящему изобретению.
Таблица 3. | |
Вид | Регистрационный # в базе данных/ID |
Homo sapiens (человек) | NM_000821.2 HUMGLUCARB |
HUMHGCA | |
BC004422 | |
HSU65896 | |
AF253530.1 | |
Papio hamadryas (павиан-гамадрил) | AC116665.1 |
Delphinapterus leucas (белуха) | AF278713 |
Bos taurus (крупный рогатый скот) | NM_174066.2 |
BOVCARBOXG | |
BOVBGCA | |
Ovis aries (домашняя овца) | AF312035 |
Rattus norvegicus (серая крыса) | NM_031756.1 |
AF065387 | |
Mus musculus (мышь) | NM_019802.1 |
AF087938 | |
Opsanus tau (костистые рыбы) | AF278714.1 |
Conus textile (моллюски) | AY0044904.1 |
AF382823.2 | |
Conus imperials (моллюски) | AF448234.1 |
Conus episcopatus (моллюски) | AF448233.1 |
Conus omaria (моллюски) | AF448235.1 |
Drosophila melanogaster (дрозофила) | NM_079161.2 |
Anopheles gambiae (комар) | XM316389.1 |
Secale cereale (однодольные растения) | SCE314767 |
Triticum aestivum (пшеница мягкая) | AF280606.1 |
Triticum urartu (однодольные растения) | AY245579.1 |
Hordeum vulgare (ячмень) | BLYHORDCA |
Leptospira interrogans (спирохеты) | AE011514.1 |
Streptomyces coelicolor (грамположительные бактерии, обогащенные GC) | SC0939109 |
SC0939124 | |
AF425987.1 | |
Streptomyces lividans (грамположительные бактерии, обогащенные GC) | SLU22894 |
Streptomyces viginiae (грамположительные бактерии, обогащенные GC) | SVSNBDE |
Micrococcus iuteus (грамположительные бактерии, обогащенные GC) | MLSPCOPER |
Chlamydomonas reinhardtii (зеленые водоросли) | AF479588.1 |
Dictyostelium discoideum (слизевики) | AC115612.2 |
Coturnix coturnix (птицы) | AF364329.1 |
Bradyrhizobium japonicum (α-протобактерии) | AP005937.1 |
Rhodobacter sphaeroides (α-протобактерии) | RSY14197 |
Sinorhizobium meliloti (α-протобактерии) | RME603647 |
AF119834 | |
Mesorhizobium loti (α-протобактерии) | AP003014.2 |
Chromobacterium violaceum (β-протобактерии) | AE016910.1 |
AE016918.1 | |
Pseudomonas aeruginosa (γ-протобактерии) | AE004613.1 |
AF165882 | |
Xanthomonas axonopodis (γ-протобактерии) | AE011706.1 |
Human herpesvirus 8 | KSU52064 |
KSU75698 | |
AF305694 | |
AF360120 | |
AF192756 | |
ID - идентификатор |
Каждый из GGCX-белков, идентифицированных выше, и GGCX-белков из других видов можно применять в качестве фермента карбоксилазы в настоящем изобретении.
Один из способов осуществить дифференциальную экспрессию двух совместно экспрессирующихся белков состоит в том, чтобы использовать разные промоторы в качестве части соответствующих последовательностей, контролирующих экспрессию. Данная область техники изобилует примерами разных промоторов и других последовательностей, контролирующих экспрессию, которые способны экспрессировать гетерологичные белки на различающихся уровнях и в разной степени. Рекомбинантная технология экспрессии достаточно развита, чтобы специалист в области экспрессии белков был способен выбрать промоторы и другие регуляторные последовательности для осуществления совместной экспрессии белка, требующего карбоксилирования, и карбоксилазы в желательном соотношении. Выбор того, какие конкретные промоторы и другие последовательности, контролирующие экспрессию, должны быть использованы, зависит от личного предпочтения.
В одном воплощении регуляторные последовательности, ассоциированные с белком, требующим гамма-карбоксилирования, включают сильный промотор. В одном воплощении этот промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV). Сильный промотор в данном контексте определен как промотор, приводящий к образованию более 1000 транскриптов/клетку. Слабый промотор в данном контексте определен как промотор, приводящий к образованию менее 1000 транскриптов/клетку.
В другом воплощении регуляторные последовательности, ассоциированные с γ-глутамилкарбоксилазой, включают слабый промотор. В одном воплощении этот промотор представляет собой ранний промотор SV40. В другом воплощении белок, требующий гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилаза находятся под контролем разных промоторных элементов, при этом промотор, контролирующий экспрессию γ-глутамилкарбоксилазы, является более слабым, чем промотор, контролирующий экспрессию белка, требующего гамма-карбоксилирования.
В другом воплощении γ-глутамилкарбоксилаза находится под контролем раннего промотора SV40, а белок, требующий гамма-карбоксилирования, находится под контролем предраннего промотора цитомегаловируса человека (hCMV). В одном воплощении в соответствии с данным конкретным аспектом изобретения белок, требующий гамма-карбоксилирования, представляет собой фактора Х человека. В другом воплощении белок, требующий гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин человека. В другом воплощении белок, требующий гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор IX человека.
Данное изобретение подтверждено примером, в котором для сверхэкспресии фактора IX или протромбина используют сильный промотор CMV (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985), а для контроля экспрессии GGCX более слабый промотор SV40 (Wenger et al., Anal Biochem 221: 416-418, 1994). Другие сильные промоторы, которые можно было бы использовать по настоящему изобретению, включают pEF-1α (ген субъединицы фактора-1α элонгации человека) (Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18: 5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21: 1013-1015, 1996), pRSV [вирус саркомы Рауса (German et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6777-6781, 1982)] и pUbC [убиквитин человека (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24: 1787-1788, 1996)], но не ограничены ими.
Важно обеспечить, чтобы белок, который должен быть получен (белок, требующий карбоксилирования), находился в избытке по сравнению с ферментом модификации с получением соотношения по меньшей мере 10:1. Способы достижения низкого уровня экспрессии фермента модификации (γ-глутамилкарбоксилазы) включают:
1) Использование слабого промотора для контроля экспрессии фермента модификации, включая, но не ограничиваясь ими, предранний промотор SV40, минимизированный промотор FIX (Rouet et al., The Journal of Biological Chemistry 267: 20765-20773, 1992) или промотор тимидинкиназы HSV (вируса простого герпеса) (Wenger et al., 1994, там же).
2) Мутирование промоторных или энхансерных последовательностей сильного промотора для уменьшения силы промотора.
3) Удаление или изменение последовательности Козака (Kozak) (сигнала инициации трансляции) для уменьшения эффективности трансляции (Kozak, Nuc Acids Res 15: 8125-8148, 1987; Kozak, Proc Natl Acad Sci USA 87: 8301-8305, 1987, 1990).
4) Клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который должен быть получен (белок, требующий карбоксилирования), и нуклеиновой кислоты, кодирующей GGCX, в отдельных векторах и трансфекцию большим избытком конструкции, содержащей белок, который должен быть получен, с тем чтобы получить клетку с множественными копиями конструкции, содержащей белок, который должен быть получен.
5) Клонирование ДНК, кодирующей белок, который должен быть получен, и ДНК, кодирующей GGCX-модификацию, в отдельных векторах, котрансфекцию или независимую трансфекцию и использование системы амплификации для усиления экспрессии белка, который должен быть получен.
6) Выделение стабильной клеточной линии с низкими уровнями экспрессии рекомбинантной GGCX (но превышающими эндогенные уровни) и использование ее в качестве линии клеток-хозяев для экспрессии белков, требующих γ-карбоксилирования.
7) Введение мутации(й) в GGCX для уменьшения сродства GGCX к субстрату.
Наряду с этими способами специалисту в области экспрессии рекомбинантных белков известны другие способы, которые можно было бы использовать для получения клетки-хозяина, которая экспрессирует белок, требующий карбоксилирования, и белок карбоксилазу в соотношении по меньшей мере 10:1.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка, которая создана или адаптирована для экспрессии (1) белка, который требует гамма-карбоксилирования, и (2) γ-гпутамилкарбоксилазы, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1. В конкретном воплощении γ-глутамилкарбоксилаза экспрессируется в диапазоне, превышающем эндогенные уровни (то есть уровни γ-глутамилкарбоксилазы в нерекомбинантной или неадаптированной клетке) от 2 до 5 раз.
Согласно другому аспекту изобретения предложена рекомбинантная клетка, адаптированная для экспрессии (1) белка γ-глутамилкарбоксилазы, превышающей конститутивные уровни, обнаруженные в эквивалентной неадаптированной клетке, и (2) белка, требующего карбоксилирования, где количество экспрессирующегося белка γ-глутамилкарбоксилазы и белка, требующего карбоксилирования, находится в соотношении по меньшей мере 1:10.
Согласно другому аспекту изобретения предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин, содержащая:
(1) полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок γ-глутамилкарбоксилазу, где указанная последовательность, кодирующая белок γ-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связана с последовательностями, контролирующими экспрессию и позволяющими указанной клетке экспрессировать белок γ-глутамилкарбоксилазу; и
(2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком γ-глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями, контролирующими экспрессию и позволяющими указанной клетке экспрессировать указанный белок, требующий карбоксилирования;
где данная клетка способна экспрессировать белок γ-глутамилкарбоксилазу и белок, требующий карбоксилирования, в соотношении по меньшей мере 1:10.
Согласно другому аспекту изобретения предложена клетка, адаптированная для экспрессии белка, который требует гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы, где нуклеиновая кислота, кодирующая белок, который требует гамма-карбоксилирования, и нуклеиновая кислота, кодирующая γ-глутамилкарбоксилазу, находятся под контролем регуляторных последовательностей, подходящих для того, чтобы обеспечить по меньшей мере 10-кратное превышение количества экспрессирующегося белка, который требует гамма-карбоксилирования, по отношению к количеству белка γ-глутамилкарбоксилазы.
В одном воплощении по меньшей мере один из белка, который требует гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы экспрессируется из нуклеиновой кислоты, которая введена в клетку с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Альтернативный способ работы данного изобретения представляет собой экспрессию эндогенного белка (белка, требующего карбоксилирования, или карбоксилазы), но с заменой эндогенных регуляторных последовательностей (промотора и так далее) гетерологичными последовательностями для осуществления желаемого уровня экспрессии.
Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки насекомых, клетки дрожжей и клетки млекопитающих. Особенно предпочтительными являются клетки млекопитающих. Подходящие линии клеток млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки СНО, НЕК, NSO, 293, Per С.6, ВНК и COS и их производные. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой линию клеток млекопитающих CHO-S.
Раньше сверхэкспрессия белков, зависимых от карбоксилирования, обычно приводила к недокарбоксилированным продуктам. Это обусловлено тем, что эндогенная карбоксилирующая способность клетки-хозяина ограничивается. С другой стороны, огромная (16-70-кратная) сверхэкспрессия активности GGCX не улучшает выход продукта (Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90: 4611-4615, 1993), (Berkner and Pudota, Proc Natl Acad Sci USA. 95:446-471, 1998), (Hallgren et al., Biochemistry 41 (50): 15045-15055, 2002). Причина этого не вполне понятна. Согласно настоящему изобретению требуется умеренная сверхэкспресия GGCX. Это обеспечивает экспрессию в клетке более высоких по сравнению с эндогенными уровней GGCX, например таких, где уровень активности GGCX повышается только в 1,5-5 раз. Как показано в примере 1, при этом умеренно повышенном уровне неожиданно были получены высокие уровни полностью карбоксилированного rhFII.
Поэтому необходимо принимать во внимание, что то соотношение в экспрессии белка, требующего карбоксилирования, и карбоксилазы, которое отличает данное изобретение от предшествующего уровня техники, исключает эндогенно продуцируемые уровни GGCX. Чтобы отвечать требованиям высокой продуктивности, карбоксилазу и белок, требующий карбоксилирования, необходимо экспрессировать на уровнях, превышающих уровни экспрессии, обнаруживаемые в обычных клетках.
В предпочтительном воплощении используют клетку или клеточную линию, которая обладает незначительной конститутивной экспрессией или в которой отсутствует конститутивная экспрессия карбоксилазы и/или белка, требующего карбоксилирования.
В одном воплощении γ-глутамилкарбоксилазу экспрессируют на уровне, меньшем или равном 10% от количества белка, который требует гамма-карбоксилирования. В альтернативных дополнительных воплощениях γ-глутамилкарбоксилазу экспрессируют на уровнях, меньших или равных 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0.1%, 0,05% или 0,01% от количества белка, который требует гамма-карбоксилирования.
Степень экспрессии этих двух белков может быть измерена путем использования методик, хорошо известных специалисту в данной области. Эти методики включают прямые измерения, например измерение биологической активности белка или количества белка (например с использованием антител), и косвенные измерения, например через измерение уровней транскрипции мРНК (например путем Taqman-анализа, как в примере 3). Следующие ссылки раскрывают способы измерения ферментативной активности GGCX (Lingenfelter et al., Biochemistry 35: 8234-8243, 1996; Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471, 1998; Hallgren et at., Biochemistry 41 (50): 15045-15055, 2002; и Berkner et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992).
Для целей данного изобретения соотношение в экспрессии этих двух белков определяют косвенно через уровень транскрипции мРНК (например путем Taqman-анализа).
В одном воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови. В другом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, предпочтительно выбран из группы, состоящей из протромбина, фактора свертывания крови II, коагуляционного FII, фактора свертывания крови VII, коагуляционного FVII, фактора свертывания крови IX, коагуляционного FIX, фактора свертывания крови X, коагуляционного FX, белка С, белка S, белка Z, костного Gla-белка, Gla-белка матрикса, белка 6, специфического в отношении остановки роста, и FXa-подобного белка из Acanthophiinae.
В одном из конкретных воплощений белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор IX. В другом конкретном воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин. В другом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор X.
Настоящее изобретение в общем случае применимо к белкам, которые требуют карбоксилирования, любого происхождения. Однако для использования экспрессирующегося белка в терапевтических целях человеком особенно предпочтительными являются человеческие белки.
В одном воплощении источником происхождения γ-глутамилкарбоксилазы является мышь, крыса, крупный рогатый скот или улитка-конус. В другом воплощении γ-глутамилкарбоксилаза является человеческим белком.
Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, адаптированной для экспрессии белка, который требует гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в соотношении по меньшей мере 10:1, при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка в линии клеток млекопитающих, включающий этап совместной экспрессии γ-глутамилкарбоксилазы с указанным белком, требующим гамма-карбоксилирования, в линии клеток млекопитающих, где количество экспрессирующегося белка, требующего гамма-карбоксилирования, по меньшей мере в 10 раз выше, чем количество экспрессирующейся γ-глутамилкарбоксилазы, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
Способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий:
а) генетическую модификацию эукариотической клетки с введением первого полинуклеотида, кодирующего белок, который требует карбоксилирования, и сопровождающих последовательностей, контролирующих экспрессию, и второго полинукпеотида, кодирующего γ-глутамилкарбоксилазу, и сопровождающих последовательностей, контролирующих экспрессию, с получением эукариотической клетки-хозяина, способной совместно репрессировать белок, который требует карбоксилирования, и белок γ-глутамилкарбоксилазу в соотношении по меньшей мере 10:1;
б) культивирование данной клетки в подходящей культуральной среде при условиях, которые позволяют экспрессироваться первой и второй полинуклеотидным последовательностям; и в) выделение карбоксилированного белка из среды или из клеток-хозяев.
Экспрессирующие векторы обычно включают точку инициации репликации, промотор, сайт инициации трансляции, возможно, сигнальный пептид, сайт полиаденилироавания и сайт терминации транскрипции. Для селекции эти векторы обычно также содержат один или более маркерных генов устойчивости к антибиотикам. Подходящими экспрессирующими векторами могут быть плазмиды, космиды или вирусы, такие как фаг или ретровирус. Кодирующую последовательность полипептида помещают под контроль соответствующего промотора (то есть HSV, CMV, TK, RSV, SV40 и так далее), регуляторных элементов и терминатора транскрипции (они представляют собой ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию), с тем чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид, транскрибировалась в РНК в клетке-хозяине, трансформированной или трансфицированной экспрессирующей векторной конструкцией. Кодирующая последовательность может содержать или не содержать сигнальный пептид или лидерную последовательность для секреции данного полипептида из клетки-хозяина. Предпочтительные векторы обычно содержат по меньшей мере один множественный сайт клонирования. В некоторых воплощениях обычно имеется сайт клонирования или множественный сайт клонирования, расположенный между промотором и геном, который должен быть экспрессирован. Такие сайты клонирования могут быть использованы для создания N-концевых слитых белков путем клонирования второй последовательности нуклеиновой кислоты в этот сайт клонирования таким образом, чтобы она прилегала к последовательности данного гена и находилась с ней в рамке. В других воплощениях может существовать сайт клонирования или множественный сайт клонирования, расположенный непосредственно ниже гена для облегчения создания С-концевых гибридов способом, сходным с описанным выше способом для N-концевых гибридов.
Клетка-хозяин может быть генетически модифицирована (иметь введенные дополнительные нуклеиновые кислоты) многочисленными способами, хорошо известными специалисту в данной области, такими как трансфекция, трансформация и электропорация.
Данное изобретение также распространяется на очищенный гамма-карбоксилированный белок, получаемый способами по настоящему изобретению, и на его применение в коагулянтной терапии.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ стимуляции повышенной или пониженной коагуляции у субъекта, включающий введение фармакологически эффективного количества выделенного гамма-карбоксилированного белка, полученного вышеописанными способами, пациенту, нуждающемуся в этом.
Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции, подходящей для индукции свертывания крови, включающий очистку активного карбоксилированного белка, экспрессирующегося в клетке-хозяине, адаптированной для экспрессии белка, требующего гамма-карбоксилирования, и γ-глутамилкарбоксилазы в соотношении по меньшей мере 10:1, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.
Терапевтические препараты на основе белков обычно хранят замороженными, охлажденными, при комнатной температуре и/или в лиофилизированном состоянии.
Композиции по данному изобретению могут быть получены с помощью общепринятых методик с использованием общепринятых фармацевтических эксципиентов, хорошо известных в данной области, но чаще всего существуют в форме, подходящей для инъекции, либо парентеральной, либо прямо в место ранения.
Водные суспензии обычно содержат активный ингредиент в тонкоизмельченной форме вместе с одним или более суспендирующими агентами, такими как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующими или увлажняющими агентами, такими как лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами (например полиоксэтиленстеарат), или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, происходящими из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, происходящими из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, происходящими из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитанмоноолеат. Эти водные суспензии также могут содержать один или более консервантов (таких как этил- или пропил-пара-гидроксибензоат), антиоксидантов (таких как аскорбиновая кислота), окрашивающих агентов, корригентов и/или подслащивающих агентов (таких как сахароза, сахарин или аспартам).
Масляные суспензии могут быть приготовлены в виде препарата путем суспендирования активного ингредиента в растительном масле (таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло) или в минеральном масле (таком как вазелиновое масло). Эти масляные суспензии могут также содержать загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для обеспечения приятного вкуса перорального препарата могут быть добавлены подслащивающие агенты, такие как агенты, указанные выше, и корригенты. Эти композиции могут быть сохранены путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Порошки, подходящие для приготовления водного препарата, предназначенного для инъекции, путем добавления подходящего разбавителя. обычно содержат активный ингредиент вместе с подходящими носителями и эксципиентами, суспендирующим агентом и одним или более стабилизаторами или консервантами. Разбавитель может содержать другие подходящие эксципиенты, такие как консерванты, модификаторы тоничности и стабилизаторы.
Фармацевтические композиции по данному изобретению также могут находиться в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, такое, как, например, вазелиновое масло, или смесь любых из этих масел. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть, например, природные камеди, такие как аравийская камедь или трагакантовая камедь, природные фосфатиды, такие как соя, лецитин, сложные эфиры или неполные эфиры, происходящие из жирных кислот и ангидридов гексита (например сорбитанмоноолеат) и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут находиться также в форме стерильного раствора или суспензии в нетоксичном разбавителе или растворителе, приемлемом для парентерального введения, которые могут быть приготовлены в виде препарата по известным методикам с использованием одного или более подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, которые упомянуты выше. Стерильный инъецируемый препарат может представлять собой также стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном разбавителе или растворителе, приемлемом для парентерального введения, например раствор в 1,3-бутандиоле.
За дополнительной информацией по препаратам читателя отсылают к Главе 25.2, Том 5 в Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board, Pergamon Press 1990); или к Тому 99 в Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, executive editor), Marcel Dekker Inc 2000.
Количество активного ингредиента, который объединяют с одним или более эксципиентами для получения стандартной лекарственной формы, обычно необходимо варьировать в зависимости от организма, который лечат, и конкретного пути введения. Например, препарат, предназначенный для инъекции людям, обычно содержит, например, от 0,5 мг до 2 г активного агента, смешанного с соответствующим и пригодным количеством эксципиентов, которое может варьировать от приблизительно 5 до приблизительно 98 процентов по массе от всей композиции. Стандартные лекарственные формы обычно содержат от приблизительно 1 мг до приблизительно 500 мг активного ингредиента. Белковые терапевтические препараты обычно хранят в замороженном или лиофилизованном виде. За дополнительной информацией по путям введения и режимам дозирования читателя отсылают к Главе 25.3, Том 5 в Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.
Величина дозы соединения для терапевтических и профилактических целей, конечно, варьирует в зависимости от природы и тяжести состояний, возраста и пола животного или пациента и пути введения, в соответствии с общеизвестными принципами медицины. При использовании соединения в терапевтических или профилактических целях его обычно вводят таким образом, чтобы полученная суточная доза находилась в диапазоне, например, от 0,5 мг до 75 мг на кг массы тела, причем, если требуется, давалась дробными дозами. Более низкие дозы обычно вводят тогда, когда используют парентеральный путь. Так, например, при внутривенном ведении обычно используют дозу в диапазоне от 0,5 мг до 30 мг на кг массы тела. Аналогично при введении путем ингаляции обычно используют дозу в диапазоне, например, от 0,5 мг до 25 мг на кг массы тела.
Изобретение будет дополнительно описано с помощью нижеследующих неограничивающих примеров.
Если не указано иначе, в практике по настоящему изобретению используют общепринятые методы молекулярной биологии и методы рекомбинантных ДНК в пределах компетентности специалиста в данной области. В литературе дано полное объяснение этих методов. Смотри, например, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3th ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I, II & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5th ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997).
Пример 1
Амплификация кДНК, кодирующей человеческий FII (hPT) и человеческую GGCX
мРНК из печени человека получали от Clontech, а синтез кДНК осуществляли, используя систему Superscript от Invitrogen. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для амплификации человеческого FII, используя:
праймер PTF0 5'-ATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACA-3' (SEQ ID NO:3) и
праймер РТЕХТ 5'-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCTGTATCCACTTCTT-3' (SEQ ID NO:4).
Человеческую GGCX амплифицировали, используя
праймер hglx5 5'-TCCGCAGAGCAATGGCGGTGTCT-3', (SEQ ID NO:5) и
hglx3 5'-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3', (SEQ ID NO:6).
ПЦР-продукт, кодирющий FII, клонировали непосредственно в ТА-ТОРО-обработанный вектор pCDNA3.1V5/His (Invitrogen). В результате селекции клона с кДНК hFII, встроенной в соответствующем направлении, получали контрольную конструкцию Ptext5 (Фиг.1б). кДНК, кодирующую GGCX, под контролем промотора SV40 получали путем переноса фрагмента, кодирующего GGCX, из pCDNA3.1V5/His ТА-ТОРО в вектор pZeoSV2+(Invitrogen) с использованием рестриктаз BamHI и Notl. Рестрикционные сайты EcoRV-Notl, расположенные ниже GGCX-вставки, удаляли. Затем ClaI-BclI-фрагмент с тупыми концами из полученной плазмиды pZeoSV2-GGCX (содержащей промотор SV40 и GGCX-содержащую вставку, но не сайт полиаденилирования и сигнал для полиаденилирования ниже последовательности, кодирующей GGCX) клонировали в рестрикционный сайт DraIII с тупыми концами плазмиды pCDNA3.1+(Invitrogen). Клон с pSV40-GGCX-фрагментом, встроенным в тандеме (то же самое направление транскрипции) относительно промотора CMV, а Kpnl-Notl-фрагмет с тупыми концами, кодирующий FII, из Ptext5 клонировали в EcoRV-сайт с получением конструкции PN32 (Фиг.1а). Последовательности ДНК PN32 и Ptext5 приведены в Приложении 2. Все методы клонирования соответствовали стандартным методам и/или методикам, рекомендованным производителями.
Конструкция PN32 содержит следующие ключевые признаки:
- Предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV), контролирующий трансксипцию кДНК протромбина человека, за которой следует сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH) для эффективной терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК.
- Ранний промотор SV40, контролирующий транскрипцию кДНК γ-карбоксилазы человека (GGCX) без выраженного сайта или сигнала полиаденилирования.
- Другие признаки, показанные на Фиг.1а.
Для сравнения использовали конструкцию PText5 без GGCX (Фиг.1б). Нуклеотидная последовательность PTEXT5 приведена в SEQ ID NO:1. Нуклеотидная последовательность PN32 приведена в SEQ ID NO:2.
Получение клеточных линий, продуцирующих протромбин
Две конструкции, приведенные на Фиг.1, трансфицировали в клетки CHO-S (Invitrogen). Стабильные трансфектанты подвергали селекции и проводили их скрининг для идентификации высокопродуктивных клонов, используя имеющийся в продаже набор для анализа активности протромбина (Chromogenix). В этом анализе пробы, содержащие протромбин, сначала обрабатывали токсином из змеиного яда (Экарин - доступен в Sigma) для того, чтобы вызвать образование тромбина. Активность тромбина затем анализировали путем добавления хромогенного субстрата (S-2238), который при обработке тромбином дает окрашивание. Трансфекцию и селекцию клонов осуществляли параллельно с обеими конструкциями. Культивирование клеток проводили в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко), содержащей 9% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, инактивированной нагреванием. Затем полученные клоны адаптировали к росту в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Наилучший продуцирующий клон, который давал до 400 мг/л рекомбинантного протромбина человека (в большом избытке по сравнению с любым из опубликованных уровней) при выращивании в среде установленного химического состава, не содержащей компонентов животного происхождения, был получен в результате трансфекции с PN32 (FII+GGCX). Рекомбинантно продуцируемый rhFII очищали (согласно способу, раскрытому в Josic et al., Journal of Chromatography B, 790: 183-197, 2003) и фракционировали с помощью ионообменной хроматографии, используя колонку с Q-сефарозой в соответствии со стандартными методами, с получением чистого полностью карбоксилированного rhFII. rhFII, продуцируемый в ферментере вплоть до уровня 78 мг/л, являлся полностью карбоксилированным и обладал такой же биологической активностью, что и протромбин, очищенный из человеческой плазмы. Карбоксилирование анализировали путем секвенирования N-конца белка и с помощью анализа протромбиназы (Мао et al., JBC, 273: 30086-30091, 1998). Образование тромбина инициировали в плазме человека с низким уровнем тромбоцитов путем добавления тканевого фактора и потенциал эндогенного тромбина измеряли по существу так, как описано у Stig с соавт. (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 14: 457-462, 2003).
Продуктивность лучшего клона, полученного с PTextS-конструкцией, в среде установленного химического состава, не содержащей компонентов животного происхождения, не превышала 10 мг/л, что находится в том же самом диапазоне, который приводится в литературе. По приблизительным оценкам доля полностью карбоксилированного протромбина, полученного из PTextS-клона, составляла около 50%. Таким образом, конечный выход полностью ативного rhFII был по меньшей мере в 10 раз выше в том случае, когда использовали РМ32-конструкцию, содержащую структуру с низким уровнем экспрессии γ-карбоксилазы. Для каждой из этих конструкций было идентифицировано несколько клонов со сходными уровнями экспрессии.
Пример 2
Измерение ggcx-активности в клеточных линиях СНО
Две rhFII-продуцирующие клеточные линии CHO-S, полученные путем трансфекции соответственно РМ32-конструкцией (совместная экспрессия с GGCX человека) и РТЕХТ5 (отсутствует совместная экспрессия с GGCX), выращивали во вращающихся колбах, используя среду без белка с добавлением 5 мкг/мл витамина К. Одну десятую часть данной ростовой среды ежедневно меняли. Через 7 дней культивирования клетки собирали и микросомы готовили, как описано у Berkner с соавт. (Рrос Natl Acad Sci USA 89: 6242-6246, 1992). Рекомбинантный человеческий FII очищали из культурального супернатанта от собранных клеток. GGCX-активность измеряли, как описано у Berkner и Pudota (Proc Natl Acad Sci USA 95: 446-471, 1998) и Lingenfelter и Berkner (Biochemistry 35: 8234-8243, 1996). Измерения авторов изобретения показали, что при использовании одинаковых условий роста GGCX-активность в клеточной линии СНО, совместно экспрессирующей GGCX человека, в 1,5 раза выше по сравнению с клеточной линией СНО, экспрессирующей только rhFII.
Пример 3
Анализ экспрессии мРНК γ-карбоксилазы и протромбина в клеточной линии CHO-S с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени
Две клеточные линии CHO-S, полученные путем стабильной трансфекции соответственно конструкциями PN32 (FII+GGCX) и РТЕХТ5 (только FII), выращивали во вращающихся колбах, используя среду без белка с добавлением витамина К. Чтобы охватить установленные максимальные уровни в продуцировании мРНК, пробы культур отбирали через 4, 5 и 6 дней культивирования. РНК выделяли с помощью Trizol™ в соответствии с протоколом Invitrogen, прилагаемым производителем. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I, используя набор DNA-free™ от Ambion. Синтез кДНК осуществляли, используя случайные гексамерные праймеры и содержимое набора Superscript™ First-Strand Synthesis System для ОТ-ПЦР, Invitrogen.
Праймеры и Vic-меченые пробы для ОТ-ПЦР в режиме реального времени выбирали, используя программу Primer Express™, Applied Biosystems.
Олигонуклеотиды для γ-карбоксилазы человека
5' ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' Прямой праймер (SEQ ID NO:7)
5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' Обратный праймер (SEQ ID NO:8)
5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' Проба (SEQ ID NO:9)
Длина ампликона 86 п.н. (пар нуклеотидов)
Олигонуклеотиды для протромбина человека
5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' Прямой праймер (SEQ ID NO:10)
5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' Обратный праймер (SEQ ID NO:11)
5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' Проба (SEQ ID NO:12)
Длина ампликона 69 п.н.
Праймеры были изготовлены Operon/Qiagen, а пробы заказывали в Applied Biosystems. Также использовали контрольные праймеры и пробу GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) грызунов (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® Rodent GAPDH Control Reagents Protocol), длина ампликона 177 п.н. Реакции ОТ-ПЦР в реальном режиме времени осуществляли на детекторе ABI Prism™ 7700 Sequence. Ожидаемую длину амплифицированных ПЦР-продуктов подтверждали на агарозных гелях. Для исследования эффективности ПЦР-реакций для всех трех генов осуществляли серии разведений. Уровни экспрессии γ-карбоксилазы и протромбина представлены относительно экспрессии контрольного гена, GAPDH грызунов.
Протромбин | ||||||
CHO-S РТЕХТ5 день 4 | CHO-S РТЕХТ5 день 5 | CHO-S РТЕХТ5 день 6 | CHO-S PN32 день 4 |
CHO-S PN32 день 5 |
CHO-S PN32 день 6 |
|
2^-delta Ct | 0,008014 | 0,076239 | 0,066677 | 0,204948 | 0,322343 | 0,364334 |
γ-Карбоксилаза | ||||||
CHO-SРТЕХТ5 день 4 |
CHO-S РТЕХТ5 день 5 | CHO-S РТЕХТ5 день 6 | CHO-SPN32 день 4 | CHO-S PN32 день 5 |
CHO-S PN32 день 6 | |
2^-delta Ct | 3,39Е-07 | 0 | 0 | 0,000277 | 0,00159 | 0,001568 |
Из детектированных относительных уровней экспрессии rhFII:GGCX вычисляли соотношения приблизительно 74-232:1 в зависимости от дня сбора пробы. Для клеточной линии, трансфицированной PN32, совместная экспрессия rhFII и GGCX, количество транскриптов на клетку составляло приблизительно 8 для мРНК GGCX и приблизительно 2000 для мРНК rhFII, таким образом, полученное соотношение rhFII:GGCX составляло приблизительно 250:1. Количество транскриптов контрольной мРНК GAPDH на клетку для той же самой пробы составляло приблизительно 4000.
Пример 4
Получение человеческого FII
кДНК FII и GGCX человека, клонированную в примере 1, встраивали в pCDNA3.1 подобно тому, как описано в примере 1. Для получения более высоких уровней GGCX сигнал полиаденилирования из pZeoSV2+ включали в pSV40-GGСХ-рА-фрагмент, клонированный в DraIII-сайт с тупыми концами pCDNA3.1. Клон с GGCX-содержащим фрагментом в противоположной ориентации по сравнению с примером 1, подвергали селекции. Затем тем же самым способом, что и в примере 1, осуществляли клонирование FII-фрагмента. Конечная конструкция РР6 показана на Фиг.2, а нуклеотидная последовательность РР6 приведена в SEQ ID NO:13.
Две клеточные линии, продуцирующие протромбин, B2F4 и Н3В10, получали путем трансфекции CHO-S, как описано в примере 1. Протромбин из этих двух клеточных линий очищали и характеризовали его, как в примере 1. Полученная продуктивность культур B2F4 находилась в диапазоне от 30 до 70 мг/л, и доля полностью карбоксилированного белка составляла от 55 до 87% (чем больше rhFII, тем меньше доля полностью карбоксилированного белка). Добавление бутирата давало некоторое увеличение продуктивности, но уменьшало долю полностью карбоксилированного rhFII и не считалось выгодным. Н3В10 является медленно растущей, и ее продуктивность составляла приблизительно 50 мг/л, что являлось высоким относительно количества клеток в культуре, а доля полностью карбоксилированного rhFII составляла приблизительно 60%. По сравнению с клеточной линией, полученной в примере 1, при использовании конструкции РР6 для клеточной линии СНО получали меньше полностью карбоксилированного rhFII. Однако продукция полностью активного рекомбинантного протромбина является все же намного выше ранее опубликованных уровней.
Пример 5
ОТ-ПЦР-анализы в режиме реального времени экспрессии γ-каобоксилазы и протромбина в клеточных линиях CHO-S путем измерения количества мРНК
Клеточные линии B2F4 и Н3В10 из примера 4 исследовали путем ПЦР-анализов в режиме реального времени с помощью тех же самых способов и таких же праймеров, что и в примере 3. Пробы культур объемом 10 мл собирали при достижении ими максимальной продуктивности, чтобы они были эквивалентны пробам в примере 3. Для клона НЗВ10 пробы были 10-дневными вследствие медленного роста этого клона, а для клона B2F4 пробы были 6-дневными.
Вычисленное соотношение мРНК rhFII:мРНК GGCX составляло приблизительно 30: для клона Н3В10, приблизительно 50:1 для клона B2F4 и приблизительно 250:1 для клона Р1Е2.
Пример 6
Получение фактора свертывания крови IX (FIX) человека
кДНК фактора свертывания крови IX человека амплифицировали из пула кДНК генов печени человека, приобретенного у Invitrogen. Одигонуклеотидные праймеры представляли собой
F9f.ampl.: 5'-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3' (SEQ ID NO:16), для 5'-конца, и
F9r.ampl.: 5'-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-3' (SEQ ID NO:17), для 3'-конца.
Клонирование правильной последовательности подтверждали путем секвенирования ДНК. FIX-фрагмент человека амплифицировали с помощью ПЦР, используя полимеразу Pfx (Invitrogen) и клонирующие праймеры, с получением фрагмента с тупыми концами. Данный фрагмент, имеющий тупые концы, фосфорилировали, используя Т4-полинуклеотидкиназу, и клонировали в EcoRV-расщепленные и дефосфорилированные векторы pCDNA-GGCX из примера 1 и примера 4. Таким путем были получены конструкции для совместной экспрессии FIX и GGCX человека, аналогичные конструкциям для совместной экспрессии, применяемым для получения протромбина человека (примеры 1 и 4). Клонирование правильных последовательностей подтверждали путем секвенирования ДНК и кратковременной экспрессии в клетках COS-7. Векторную конструкцию F9NopA можно видеть на Фиг.3а, а векторная конструкция F9hglx показана на Фиг.3б. Различие между векторами F9NopA и F9hglx заключается в направлении транскрипции гена GGCX. Последовательность нуклеотидов F9NopA приведена в SEQ ID NO:14, а последовательность нуклеотидов F9hglx приведена в SEQ ID NO:15.
Создание клеточных линий, продуцирующих rhFIX
rhFIX-конструкции трансфицировали в клетки CHO-S, используя методику, описанную в примере 1. Для каждой FIX-конструкции осуществляли скрининг приблизительно 3000 клонов для обнаружения экспрессии rhFIX с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) клеточных супернатантов. Использованные антитела получали от Haemathology Technology Inc. и DakoCytomation. Клоны селектировали и адаптировали к росту в среде СНО установленного химического состава, не содержащей белков. Клетки выращивали либо в Т-флаконах при температуре 37°С, либо во вращающихся колбах при 32-37°С. Концентрация СО2 для обоих типов культур составляла 5%. Продуцируемый rhFIX очищали до гомогенности с помощью анионообменной хроматографии на Q-сефарозе при рН 7,0. Активность рекомбинантного ППХ определяли путем анализа свертывания крови, используя дефицитную по FIX плазму крови (Precision Biologic). Лучшим полученным клоном, продуцирующим rhFIX, являлся N4D5, который был получен при использовании конструкции F9NopA и продуцировал до 4 мкг/мл активного rhFIX при выращивании в Т-флаконе в среде установленного химического состава, не содержащей белка. При выращивании во вращающейся колбе тот же самый клон продуцировал до 7,1 мкг/мл rhFIX. Общую продуктивность, включая также неполностью карбоксилированный неактивный rhFIX, оцененная с помощью вестерн-блоттинга, составляла по меньшей мере 30 мкг/мл. Лучшим продуцирующим клоном, полученным с rhFIX-конструкцией F9hglx, являлся P1G9, который продуцировал 0,7 (Т-флакон) - 1,3 (вращение) мкг/мл rhFIX при сходных условиях. Эти результаты указывают на то, что продуктивность rhFIX улучшалась в результате совместной экспрессии GGCX на низком уровне при использовании конструкции F9NopA, но при использовании конструкции F9hglx совместная экспрессия GGCX являлась менее полезной. Также было отмечено, что F9NорА-конструкция, давшая в результате клон N4D5, обычно давала более сильные ELISA-сигналы, чем F9hglx-конструкция, давшая начало клону P1G9, при одновременном скрининге на продуктивность во время процедуры создания клеточных линий.
Продуктивность клеточной линии N4D5 приблизительно в 4-6 раз лучше ранее опубликованных уровней при сравнимых условиях, где IC4, IG8, r-FIX ВНК и r-FIX 293 представляют собой названия клонов, упоминаемых в ссылках (Таблица 5).
Таблица 5. | ||||
Сравнение продуктивности клеточных линий, продуцирующих человеческий FIX. | ||||
Клеточная линия/конструкция | Количество продуцируемого активного rhFIX | Общая продуктивность (мкг/мл) | Ссылка | |
Т-флакон (мкг/мл) | Вращение (мкг/мл) | |||
N4D5/F9NopA CHO, низкая совместная экспрессия GGCX | 4 | 7,1 | >30 | Пример 6 |
P1G9/F9hglx СНО, средняя совместная экспрессия GGCX | 0,7 | 1,3 | н.о. | Пример 6 |
IС4 СНО, совместная экспрессия НА (контроль) | 0,9 | н.о. | 30 | Rehemtulla 1993. |
IС4 СНО, высокая совместная экспрессия GGCX | 1 | н.о. | 29 | Rehemtulla 1993. |
IC4 | 0,9 | н.о. | 20 | US 5460950 |
1G8 СНО | 1,5 | н.о. | 43 | Kaufman, RJ et al., 1986 JBC 261:9622-9628 |
r-FIX BHK | 0,004/24 ч | н.о. | 0,004/24 ч | Hallgren 2002 |
r-FIX 293 | 0,004/24 ч | н.о. | 0,004/24 ч | Hallgren 2002 |
н.о.=не определено |
Пример 7
ОТ-ПЦР-анализы в режиме реального времени экспрессии γ-карбоксилазы и фактора FIX в клеточных линиях CHO-S путем измерения количества мРНК
Рекомбинантные hFIX-продуцирующие клоны выращивали при 32-37°С во вращающихся колбах в 100 мл среды с химически установленным составом, не содержащей белка, с добавлением витамина К. При достижении максимальной концентрации rhFIX отбирали пробы объемом 5-10 мл и анализировали в них содержание транскриптов FIX и GGCX человека, а также транскриптов контрольного гена GAPDH (гена "домашнего хозяйства"). Методика была такой же, как в примере 3. Праймеры для rhFIX были следующими:
Праймеры для фактора IX человека
5' AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3' Прямой праймер (SEQ ID NO:18)
5' CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3' Обратный праймер (SEQ ID NO:19)
5' TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAAC 3' Проба (SEQ ID NO:20)
Длина ампликона 84 п.н.
Было обнаружено, что уровни матричной РНК достигают максимума в различные дни в зависимости от температуры культивирования и объема инокулированной культуры. Было обнаружено, что максимальные уровни мРНК находятся в хорошем соответствии с максимальной концентрацией rhFIX в культуральной среде.
Таблица 6. | ||||
Результаты ОТ-ПЦР-анализов в режиме реального времен для rhFIX-продуцирующих клонов. | ||||
Клеточная линия | День культивирования | 2^-delta Ct FIX | 2^-delta Ct GGCX | Соотношение мРНК FIX:GGCX |
N4D5-100 | 11 | 0,255253 | 0,005461 | 47:1 |
N4D5-2 | 14 | 0,264866 | 0,006201 | 43:1 |
PIG9-A | 6 | 0,022982 | 0,005601 | 4:1 |
P1G9-B | 8 | 0,04181 | 0,007687 | 5:1 |
Из ОТ-ПЦР-анализов в режиме реального времени авторы обнаружили, что, хотя 2^-delta Ct-значения изменяются в зависимости от времени и условий культивирования, соотношения мРНК FIX:GGCX являлись приблизительно одинаковыми для каждого клона. Для лучшего rhFIX-продуцирующего клона N4D5 это соотношение составляло приблизительно 45:1. Анализы другого клона PIG9 дали более низкое соотношение, составляющее приблизительно 4,5:1. Клон PIG9 продуцировал только 20% от количества rhFIX, продуцируемого N4D5.
Claims (29)
1. Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии витамин К-зависимого белка, содержащая по меньшей мере один экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-зависимый белок, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор,
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и где соотношение экспрессии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1.
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и где соотношение экспрессии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1.
2. Клетка-хозяин по п.1, где молекулы нуклеиновой кислоты находятся в одном экспрессирующем векторе.
3. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок выбран из группы, состоящей из: фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови IX, протромбина (фактора свертывания крови II), фактора свертывания крови X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla-белка, Gla-белка матрикса, белка 6, специфического в отношении остановки роста, и FXa-подобного белка из Acanthophiinae.
4. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови.
5. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор IX.
6. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор X.
7. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой протромбин.
8. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой белок С.
9. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор VII.
10. Клетка по п.1, где витамин К-зависимый белок представляет собой белок человека.
11. Клетка по п.1, где γ-глутамилкарбоксилаза представляет собой белок человека.
12. Клетка по любому из пп.1-11, где данная клетка выбрана из группы, состоящей из клетки млекопитающих, дрожжевой клетки или клетки насекомых.
13. Клетка по п.12, где данная клетка представляет собой клетку млекопитающих.
14. Вектор экспрессии в эукариотических клетках, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-зависимый белок и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор,
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1.
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1.
15. Вектор по п.14, где витамин К-зависимый белок выбран из группы, состоящей из: фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови IX, протромбина (фактора свертывания крови II), фактора свертывания крови X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla-белка, Gla-белка матрикса, белка 6, специфического в отношении остановки роста, и FXa-подобного белка из Acanthophiinae.
16. Вектор по любому из пп.14 и 15, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор IX.
17. Вектор по любому из пп.14 и 15, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор X.
18. Вектор по любому из пп.14 и 15, где витамин К-зависимый белок представляет собой протромбин.
19. Вектор по любому из пп.14 и 15, где витамин К-зависимый белок представляет собой белок С.
20. Вектор по любому из пп.14 и 15, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор VII.
21. Способ получения витамин К-зависимого белка, включающий: (1) культивирование эукариотической клетки, содержащей по меньшей мере один экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-зависимый белок и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор, где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1, и
(2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1, и
(2) выделение гамма-карбоксилированного белка.
22. Способ по п.21, где гамма-карбоксилированный белок выбран из группы, состоящей из: фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови IX, протромбина (фактора свертывания крови II), фактора свертывания крови X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla-белка, Gla-белка матрикса, белка 6, специфического в отношении остановки роста, и FXa-подобного белка из Acanthophiinae.
23. Способ по п.21, где витамин К-зависимый белок представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови или его активированную форму.
24. Способ по п.21 или 23, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор IX или его активированную форму.
25. Способ по п.21 или 23, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор Х или его активированную форму.
26. Способ по п.21 или 23, где витамин К-зависимый белок представляет собой протромбин или его активированную форму.
27. Способ по п.21 или 23, где витамин К-зависимый белок представляет собой белок С или его активированную форму.
28. Способ по п.21 или 23, где витамин К-зависимый белок представляет собой фактор VII или его активированную форму.
29. Способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимулирования повышения или понижения коагуляции, включающий очистку активного карбоксилированного белка, экспрессирующегося в эукариотической клетке-хозяине, содержащей по меньшей мере один экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-зависимый белок и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие первый промотор, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности, контролирующие экспрессию, содержащие второй промотор,
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1, и
и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.
где первый промотор представляет собой предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV) и
второй промотор представляет собой предранний промотор SV40 и
где соотношение экспресии витамин К-зависимого белка и γ-глутамилкарбоксилазы составляет от 10:1 до 250:1, и
и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0324044.7 | 2003-10-14 | ||
GBGB0324044.7A GB0324044D0 (en) | 2003-10-14 | 2003-10-14 | Protein |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009123931/10A Division RU2009123931A (ru) | 2003-10-14 | 2009-06-24 | Способ получения гамма-карбоксилированных белков |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006110147A RU2006110147A (ru) | 2007-11-20 |
RU2372401C2 true RU2372401C2 (ru) | 2009-11-10 |
Family
ID=29559260
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006110147/13A RU2372401C2 (ru) | 2003-10-14 | 2004-10-12 | Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии витамин к-зависимого белка, вектор экспрессии в эукариотических клетках, способ получения гамма-карбоксилированного витамин к-зависимого белка и способ получения фармацевтической композиции для индукции свертывания крови или стимулирования повышения или понижения коагуляции |
RU2009123931/10A RU2009123931A (ru) | 2003-10-14 | 2009-06-24 | Способ получения гамма-карбоксилированных белков |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009123931/10A RU2009123931A (ru) | 2003-10-14 | 2009-06-24 | Способ получения гамма-карбоксилированных белков |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7842477B2 (ru) |
EP (2) | EP2292748B1 (ru) |
JP (1) | JP4658946B2 (ru) |
KR (1) | KR101201020B1 (ru) |
CN (2) | CN102443548B (ru) |
AR (1) | AR046180A1 (ru) |
AT (1) | ATE491789T1 (ru) |
AU (2) | AU2004281350B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0415277A (ru) |
CA (1) | CA2541764C (ru) |
CO (1) | CO5690657A2 (ru) |
DE (1) | DE602004030603D1 (ru) |
DK (1) | DK1678297T3 (ru) |
ES (2) | ES2532470T3 (ru) |
GB (1) | GB0324044D0 (ru) |
HK (1) | HK1155475A1 (ru) |
IL (2) | IL174633A (ru) |
IS (1) | IS8447A (ru) |
MX (1) | MXPA06004060A (ru) |
MY (1) | MY141859A (ru) |
NO (1) | NO339740B1 (ru) |
NZ (2) | NZ546584A (ru) |
PL (1) | PL1678297T3 (ru) |
PT (1) | PT1678297E (ru) |
RU (2) | RU2372401C2 (ru) |
TW (1) | TWI355419B (ru) |
UY (1) | UY28558A1 (ru) |
WO (1) | WO2005038019A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200603038B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2500816C1 (ru) * | 2012-07-19 | 2013-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАК380, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 1E6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ |
RU2712507C2 (ru) * | 2013-12-20 | 2020-01-29 | Новартис Аг | Новые эукариотические клетки и способы их получения для рекомбинантной экспрессии представляющего интерес продукта |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2380985B1 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-01 | University of North Carolina at Chapel Hill | Cells expressing vitamin K epoxide reductase and use thereof |
GB0324044D0 (en) | 2003-10-14 | 2003-11-19 | Astrazeneca Ab | Protein |
US20090325226A1 (en) | 2005-03-15 | 2009-12-31 | Stafford Darrel W | Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins |
CN101198696B (zh) * | 2005-04-13 | 2014-02-26 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 包含产生需要γ-羧化的蛋白质用的载体的宿主细胞 |
CA2624072A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for producing recombinant human thrombin by cultured cell |
US7745484B2 (en) | 2005-11-21 | 2010-06-29 | Amgen Inc. | Beta-secretase modulators and methods of use |
PT1969127E (pt) * | 2005-12-21 | 2014-09-23 | Univ North Carolina | Processo de produção de proteínas dependentes da vitamina k biologicamente activos por métodos recombinantes |
EP1996186A4 (en) * | 2006-03-06 | 2009-07-22 | Humagene Inc | PROCESS FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT HUMAN THROMBIN AND FIBRINOGEN |
EP2139499A4 (en) * | 2007-04-26 | 2010-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals | RECOMBINANT VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS WITH HIGH SIALIC ACID CONTENT AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
US8206967B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-06-26 | Medimmune Limited | Method for production of recombinant human thrombin |
CN103221061A (zh) * | 2010-10-06 | 2013-07-24 | 米迪缪尼有限公司 | 用于治疗止血障碍的因子ii以及纤维蛋白原 |
EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
AU2012304763A1 (en) | 2011-09-06 | 2014-03-06 | Medimmune Llc | Methods for processing coagulation factors |
JP5830486B2 (ja) | 2013-03-29 | 2015-12-09 | シスメックス株式会社 | 組換えバキュロウイルスおよびその利用 |
CN109207462B (zh) * | 2018-08-01 | 2021-05-11 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 异常凝血酶原及其制备方法和包含其的检测剂、试剂盒及应用 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3043857A1 (de) | 1980-11-21 | 1982-07-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung von blutgerinnungsfaktoren und danach hergestellte praeparation der faktoren ii und vii |
US4599308A (en) * | 1981-10-06 | 1986-07-08 | Hamer Dean H | Protein from SV40 recombinants |
EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
JPH01502080A (ja) | 1986-11-17 | 1989-07-27 | ニュー・イングランド・メディカル・センター | 組み換えビタミンk依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強 |
US6224864B1 (en) | 1986-12-03 | 2001-05-01 | Pharmacia & Upjohn Company | Antibiotic 10381A, and process for the preparation of anitbiotics 10381B |
WO1989012685A1 (en) | 1987-05-18 | 1989-12-28 | Integrated Genetics, Inc. | Improved protein c molecules and method for making and activating same |
US5648254A (en) * | 1988-01-15 | 1997-07-15 | Zymogenetics, Inc. | Co-expression in eukaryotic cells |
US5118614A (en) | 1988-01-18 | 1992-06-02 | Tessek Sdruzeni Praha | Concentrates of coagulation factors ii, vii, ix and x, method of their preparation and use |
EP0540650A1 (en) | 1990-07-23 | 1993-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Gamma-carboxylase and methods of use |
US5965789A (en) | 1991-01-11 | 1999-10-12 | American Red Cross | Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals |
US5268275A (en) | 1991-05-08 | 1993-12-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Vitamin K-dependent carboxylase |
US5219995A (en) | 1992-07-14 | 1993-06-15 | Alpha Therapeutic Corporation | Plasma fraction purification |
US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
US5639661A (en) * | 1994-03-23 | 1997-06-17 | The University Of Iowa Research Foundation | Genes and proteins for treating cystic fibrosis |
DE4430204A1 (de) | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, welches als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet ist und seine Verwendung |
DE59712322D1 (de) | 1996-03-20 | 2005-06-30 | Baxter Ag | Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
JP2001522230A (ja) * | 1997-02-14 | 2001-11-13 | アメリカン・レツド・クロス | トランスジェニック動物乳房組織における活性ヒト第▲ix▼因子の発現 |
AU2015799A (en) | 1997-12-24 | 1999-07-19 | Immunex Corporation | V201 dna and polypeptides |
US6413737B1 (en) | 1999-07-09 | 2002-07-02 | Cohesion Technologies, Inc. | Ecarin prothrombin protease and methods |
AU6366100A (en) | 1999-07-23 | 2001-02-13 | Case Western Reserve University | Novel methods and reagents for the treatment of osteoarthritis |
AU2001268373A1 (en) * | 2000-06-13 | 2001-12-24 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods for administering recombinant adeno-associated virus virions to humans previously exposed to adeno-associated virus |
DE60137950D1 (de) | 2000-10-02 | 2009-04-23 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Verfahren zur herstellung vitamin-k-abhängiger proteine |
CA2452768C (en) | 2001-07-06 | 2011-06-07 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for preparing human thrombin by genetic engineering technique |
CN1551918B (zh) | 2001-07-06 | 2011-04-20 | 财团法人化学及血清疗法研究所 | 基因重组伊卡因及其制备方法 |
CA2452395C (en) | 2001-07-10 | 2012-04-10 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Pharmaceutically stable hemostatic compositions |
EP2380985B1 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-01 | University of North Carolina at Chapel Hill | Cells expressing vitamin K epoxide reductase and use thereof |
EP2189523B1 (en) | 2003-10-14 | 2012-01-04 | Baxter International Inc. | Vitamin K epoxide recycling polypeptide VKORC1, a therapeutic target of coumarin and their derivatives |
GB0324044D0 (en) | 2003-10-14 | 2003-11-19 | Astrazeneca Ab | Protein |
ATE465245T1 (de) | 2003-10-24 | 2010-05-15 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Neue rekombinante tierzellen mit hoher proteinproduktion, verfahren zur konstruktion davon sowie verfahren zur massenproduktion von protein unter verwendung davon |
WO2006067116A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
CN101198696B (zh) | 2005-04-13 | 2014-02-26 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 包含产生需要γ-羧化的蛋白质用的载体的宿主细胞 |
WO2007065173A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Wake Forest University Health Sciences | Compositions and methods for increasing production of recombinant gamma-carboxylated proteins |
PT1969127E (pt) | 2005-12-21 | 2014-09-23 | Univ North Carolina | Processo de produção de proteínas dependentes da vitamina k biologicamente activos por métodos recombinantes |
US8206967B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-06-26 | Medimmune Limited | Method for production of recombinant human thrombin |
-
2003
- 2003-10-14 GB GBGB0324044.7A patent/GB0324044D0/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-10-12 DE DE602004030603T patent/DE602004030603D1/de active Active
- 2004-10-12 WO PCT/SE2004/001453 patent/WO2005038019A1/en active Application Filing
- 2004-10-12 PL PL04775534T patent/PL1678297T3/pl unknown
- 2004-10-12 CN CN201110241382.3A patent/CN102443548B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-12 CA CA2541764A patent/CA2541764C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-12 AU AU2004281350A patent/AU2004281350B2/en not_active Ceased
- 2004-10-12 KR KR1020067009338A patent/KR101201020B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-10-12 EP EP10185166.5A patent/EP2292748B1/en active Active
- 2004-10-12 EP EP04775534A patent/EP1678297B1/en active Active
- 2004-10-12 NZ NZ546584A patent/NZ546584A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-10-12 MX MXPA06004060A patent/MXPA06004060A/es active IP Right Grant
- 2004-10-12 BR BRPI0415277-8A patent/BRPI0415277A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-10-12 PT PT04775534T patent/PT1678297E/pt unknown
- 2004-10-12 MY MYPI20044176A patent/MY141859A/en unknown
- 2004-10-12 RU RU2006110147/13A patent/RU2372401C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-10-12 JP JP2006535301A patent/JP4658946B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-12 DK DK04775534.3T patent/DK1678297T3/da active
- 2004-10-12 AT AT04775534T patent/ATE491789T1/de active
- 2004-10-12 ES ES10185166.5T patent/ES2532470T3/es active Active
- 2004-10-12 ES ES04775534T patent/ES2357603T3/es active Active
- 2004-10-12 CN CN2004800300373A patent/CN1867669B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-12 NZ NZ578306A patent/NZ578306A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-10-13 UY UY28558A patent/UY28558A1/es not_active Application Discontinuation
- 2004-10-14 TW TW093131237A patent/TWI355419B/zh not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 AR ARP040103723A patent/AR046180A1/es unknown
- 2004-10-14 US US10/964,888 patent/US7842477B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-03-29 IL IL174633A patent/IL174633A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-03-31 NO NO20061470A patent/NO339740B1/no not_active IP Right Cessation
- 2006-04-12 CO CO06035799A patent/CO5690657A2/es not_active Application Discontinuation
- 2006-04-13 ZA ZA200603038A patent/ZA200603038B/xx unknown
- 2006-05-10 IS IS8447A patent/IS8447A/is unknown
-
2008
- 2008-08-14 AU AU2008205445A patent/AU2008205445A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-06-24 RU RU2009123931/10A patent/RU2009123931A/ru not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-11-19 US US12/950,713 patent/US8697440B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-09-09 HK HK11109595.7A patent/HK1155475A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-05-12 IL IL226313A patent/IL226313A0/en unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HALLGREN K.W. et al. Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins, Biochemistry, 2002, v.41, n.50, p.15045-15055. LUCAS B.K. et al. High-level production of recombinant proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector, Nucleic Acids Res., 1996, v.24, n.9, p.l774-1779. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2500816C1 (ru) * | 2012-07-19 | 2013-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАК380, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 1E6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ |
RU2712507C2 (ru) * | 2013-12-20 | 2020-01-29 | Новартис Аг | Новые эукариотические клетки и способы их получения для рекомбинантной экспрессии представляющего интерес продукта |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8697440B2 (en) | Compositions and methods for producing gamma-carboxylated proteins | |
RU2415934C2 (ru) | Клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования | |
US10465180B2 (en) | Factor IX polypeptide mutant, its uses and method for its production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181013 |