KR20100087303A - 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 치료학적 생성물의 발현을 조절하는 치료학적 유전자 스위치 작제물을 피검자에게 도입함으로써 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 하나 이상의 치료학적 생성물의 발현을 조절하는 치료학적 유전자 스위치 작제물(gene-switch construct)을 피검자에게 도입함으로써 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 "생물반응기(bioreactor)", 즉 치료학적 단백질을 분비하는 세포 또는 세포들로 이루어진 치료학적 이식체(implant)를 피검자에게 도입함으로써 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 생물반응기는 캡슐화에 의해 면역-분리되거나 면역-분리되지 않을 수 있다. 특정한 양태에서, 생물반응기는 치료학적 유전자 스위치 작제물을 포함한다.
치료학적 분자를 코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 피검자의 세포에 도입하거나 치료학적 분자가 분비되도록 유전자 조작된 변형 세포를 피검자에게 도입하여 피검자의 질병을 치료하거나 예방하는 개념은 수년 동안 존재하여 왔다. 이러한 개념의 실시 양태에서의 몇가지 문제는 성공적 요법으로의 발전을 방해하였다. 유전자 물질을 치료되는 피검자에게 직접 도입하는 것은 전달 안전성, 충분한 시간 동안 치료학적 생성물의 충분한 발현 수준의 획득, 목적하는 세포에 대한 치료학적 생성물의 제한된 발현, 및 더이상 필요하지 않는 경우에 치료학적 생성물의 발현을 중단하는 능력을 포함하는, 치료학적 생성물의 발현을 조절하거나 자극하는 능력의 유지 등과 같은 문제를 노출시킨다. 세포 기반 요법들은 피검자의 면역 반응을 통해 거부되고 있으며, 따라서 세포 캡슐화 방법 등의 면역-분리 전략이 이식된 세포의 수명을 증가시키고 이종성 세포, 즉 상이한 종으로부터의 세포의 사용을 가능하게 하기 위해 개발되어 왔다. 현재 캡슐화 및 비캡슐화 세포 요법들은 치료학적 단백질을 구성적으로 분비하도록 유전자 조작되고 있다. 이식되는 경우, 단백질 분비는 조절되지 않을 수 있다. 치료학적 단백질 전달을 위한 직접 또는 세포 매개된 생물반응기의 안전성 및 임상적 적용을 개선시키기 위해서는, 단백질 생성을 중단하거나 단백질 생성 속도를 조절할 수 있는 것이 유리할 것이다.
따라서, 당해 기술분야에서는 이들 목적하는 특성을 제공하는 신규한 치료방법 및 조성물이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은,
(a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 구성적으로 활성인 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와의 작동성 연결로 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입(여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 리간드의 존재하에 이들이 발현되도록 도입된다)하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는,
(a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 치료되는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화되는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와의 작동성 결합으로 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입(여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 피검자에서 이들이 발현되도록 도입된다)하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는,
(a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드에 의해 치료가능한 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화되는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와의 작동성 연결로 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입(여기서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 제1 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 도입된다)하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 제공한다.
상기한 방법에서, 한 가지 양태에서, 치료학적 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 인자-조절된 프로모터에 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 하나의 거대 폴리뉴클레오티드(예: 벡터)의 일부이다. 또 다른 양태에서, 치료학적 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 인자-조절된 프로모터에 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 핵산 조성물로서 투여될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명은 추가로 상기한 방법에 유용한 치료학적 유전자 스위치 작제물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 치료학적 유전자 스위치 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 추가로,
(a) 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화되는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와의 작동성 연결을 통해 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형 세포를 생산하는 단계; 및
(b) 리간드를 변형 세포에 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 변형 세포에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 치료학적 유전자 스위치 작제물을 포함하는 변형 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 피검자의 유래된 시스템으로부터 세포를 차폐하도록 하는 방식으로 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 본 발명의 변형 세포를 포함하는 생물반응기 장치에 관한 것이다. 이러한 생물반응기는, 예를 들면, 피복된 세포, 마이크로-캡슐화 세포 또는 매크로-캡슐화 세포의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 유전자 스위치 작제물, 벡터, 리간드 등을 포함하는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
발명의 구체적인 설명
본 발명은 유전자 스위치를 사용하여 세포에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로 피검자에서 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 유전자 스위치를 사용하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 생체외(분리된 세포를 피검자 또는 비-동종 세포내로 도입하고, 변형된 세포를 피검자에게 또는 상이한 피검자에게 도입함으로써) 또는 생체내(유전자 스위치를 직접 피검자의 세포내로 도입함으로써)에서 수행할 수 있다. 본 발명의 방법은 리간드-의존성 전사 인자의 발현이 하나 이상의 치료학적 스위치 프로모터의 조절하에 존재하는 유전자 스위치의 사용을 수반한다. 본 발명의 방법은 또한, 이로써 제한되지는 않지만, 비캡슐화 및 캡슐화 세포 요법을 치료되는 피검자에게 직접 도입할 때의 유전자 스위치 기술의 적용을 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 치료학적 생성물의 발현 수준 및 발현 타이밍이 유전자 스위치를 포함하는 세포에 리간드를 투여함으로써 조절되는, 고도 특이적 및 엄격하게 조절된 치료학적 기술을 제공한다.
다음 정의가 제공되며, 이들은 본 발명의 범위 및 실시를 이해하는 데에 도움이 될 것이다.
본 발명의 목적을 위한 "분리된(isolated)"이란 용어는 원래의 환경(자연 상태에서 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)을 나타낸다. 예를 들면, 식물 또는 동물 내에서 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이 아니지만, 자연 상태로 존재하는 인접한 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "분리된" 것으로 간주된다.
생물학적 물질에 적용되는 "정제된"이란 용어는 당해 물질이 다른 화합물의 존재를 배제하고 절대 순도를 나타내는 형태로 존재할 것을 요구하지는 않는다. 이것은 다소 상대적인 정의이다.
"핵산", "핵산 분자", 올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 교대로 사용되고, 포스페이트 에스테르 고분자 형태의 리보뉴클레오티드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오티드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자") 또는 이들의 임의의 포스포에스테르 동족체, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 의미하며, 이들은 모두 단일 사슬 형태 또는 이중-사슬 헬릭스일 수 있다. 이중 사슬 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 헬릭스도 가능하다. 용어 핵산 분자 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하며, 이를 임의 특정 3차 형태로 한정하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들면, 제한효소 단편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중-사슬 DNA를 포함한다. 특정한 이중-사슬 DNA 분자의 구조를 논의함에 있어서, 서열은 통상의 관습에 따라 전사되지 않는 DNA의 사슬(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 사슬)을 따라 5'에서 3' 방향의 서열만으로 본원에서 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함한다. 본 발명의 "핵산 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열에 적용된 "단편"이라는 용어는 기준(reference) 핵산에 비해 길이가 감소되고 공통 부분에 걸쳐서 상기 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편은 더 큰 폴리뉴클레오티드에 일성분으로 적절하게 포함될 수 있다. 이러한 단편은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1,000, 1,500, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "분리된 핵산 단편"은 합성, 비-자연형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 임의로 포함하는 단일- 또는 이중-사슬의 RNA 또는 DNA 중합체이다. DNA 고분자 형태의 분리된 핵산 단편은 하나 이상의 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 세그먼트(segment)를 포함할 수 있다.
"유전자"는 작용성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 작용성 분자에는 전사 단독(예: 생활성 RNA 종) 또는 전사와 번역(예: 폴리펩티드)에 의해 생성된 작용성 분자가 포함된다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한, "유전자"는 코딩 서열을 선행하거나(5' 비-코딩 서열) 뒤따르는(3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함하는 특정한 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키는 핵산 단편을 의미한다. "자연형 유전자"는 그 자신의 조절 서열을 가지며, 자연 상태에서 발견되는 유전자를 의미한다. "키메라(chimera) 유전자"는 자연형 유전자가 아닌 임의의 유전자를 의미하며, 함께 자연 상태에서 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원(source)으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연 상태에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 코딩 서열 및/또는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성(endogenous) 유전자"는 생명체의 게놈 내에 자연 상태로 위치하는 자연형 유전자를 의미한다. "외인성" 유전자 또는 "이종형(heterologous)" 유전자는 숙주 생명체 내에서 정상적으로는 발견되지 않으며, 유전자 전달에 의해 상기 숙주 생명체 내로 도입된 유전자를 의미한다. 외인성 유전자는 비-자연형 생명체 내로 삽입된 자연형 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "이식유전자(transgene)"는 형질전환(transformation) 방법에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
"이종형 DNA"는 세포내, 또는 상기 세포의 염색체 부위에서 정상적으로는 존재하지 않는 DNA를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 이종형 DNA는 상기 세포에 대해 외인성인 유전자를 포함한다.
"게놈"이라는 용어는 염색체 뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는, 상기 핵산 분자의 단일 사슬 형태가 적절한 온도 및 용액의 이온 세기 조건하에서 다른 핵산 분자와 어닐링하는 경우, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 또 다른 핵산 분자와 "혼성화가능하다". 혼성화 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며, 샘브룩 등(Sambrook et al.)의 문헌에 예시되어 있다[참조: Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히 제11장 및 표 11.1 (이의 전체가 본원에 참조로 도입됨)]. 상기 온도 및 이온 세기 조건은 상기 혼성화의 "스트린전시(stringency)"를 결정한다.
스트린전시 조건은 연관성이 먼 생명체 유래의 상동성 서열과 같은 적절하게 유사한 단편, 또는 연관성이 밀접한 생명체 유래의 작용성 효소를 복제하는 유전자와 같은 매우 유사한 단편을 스크리닝(screening)하기 위해 조정될 수 있다. 상동성 핵산의 예비 스크리닝의 경우, 55℃의 Tm에 해당하는 낮은 스트린전시 혼성화 조건은, 예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크(milk), 및 포름아미드 부재; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS를 사용할 수 있다. 적당한 스트린전시 혼성화 조건은 더 높은 Tm, 예를 들면, 40% 포름아미드 및 5x 또는 6x SCC에 해당한다. 높은 스트린전시 혼성화 조건은 가장 높은 Tm, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 해당한다.
혼성화는, 혼성화의 스트린전시에 따라 염기 사이의 불일치(mismatch)가 가능하기는 하지만, 상기 2개의 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다. "상보적"이란 용어는 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들면, DNA에 있어서 아데노신은 티민과 상보적이고, 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에서 개시되거나 또는 사용된 완전한 서열 뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열에 상보적인 분리된 핵산 단편도 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 Tm이 55℃인 혼성화 단계를 포함하고 전술한 조건을 이용하는 혼성화 조건을 사용함으로써 검출된다. 다른 양태에서, 상기 Tm은 60℃, 63℃ 또는 65℃이다.
또한, 혼성화 후 세척이 스트린전시 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 6X SSC, 0.5% SDS로 15분간으로 시작하여, 이후 45℃에서 2X SSC, 0.5% SDS로 30분간 반복하고, 이후 50℃에서 0.2X SSC, 0.5% SDS로 30분간 2회 반복하는 일련의 세척을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 스트린전시 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 이때 세척 조건은 0.2X SSC, 0.5% SDS에서 30분간 세척하는 최종 2회의 온도가 60℃로 증가되는 것을 제외하고는 상기와 동일하다. 또 다른 바람직한 세트의 높은 스트린전시 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회 최종 세척을 사용한다.
핵산의 혼성화를 위한 적합한 스트린전시는 핵산의 길이 및 상보성 정도에 의존하며, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 다양하다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 및 상동성 정도가 클수록 이들 서열을 갖는 핵산의 혼성화를 위한 Tm 값은 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성(높은 Tm에 해당함)은 다음의 순서로 저하된다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 이상인 혼성화의 경우, Tm을 계산하기 위한 방정식이 유도되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화의 경우, 불일치 위치가 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 이의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
본 발명의 한 가지 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 미만의 염 및 적어도 37℃에서의 혼성화 단계 및 2X SSPE, 적어도 63℃에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용함으로써 검출된다. 또 다른 양태에서, 상기 혼성화 조건은 상기 혼성화 단계에서 200 mM 미만의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 혼성화 조건은 상기 혼성화 및 세척 단계 모두에 대해 2X SSPE 및 63℃를 포함한다.
또 다른 양태에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드 이상이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 약 20 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 약 30 뉴클레오티드이다. 더욱이, 당업자는 상기 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브(probe)의 길이와 같은 인자에 따라 필요시 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
"프로브"란 용어는 상보적인 단일 사슬 표적 핵산과 염기쌍을 형성하여 이중-사슬 분자를 형성할 수 있는 단일-사슬 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자와 혼성화할 수 있는 짧은 핵산을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 32P-뉴클레오티드 또는 바이오틴과 같은 표지(label)가 공유적으로 접합되어 있는 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(하나 또는 양쪽 모두 표지될 수 있음)는 핵산의 전장(full length) 또는 단편을 클로닝하고 DNA 서열분석하거나, 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 헬릭스를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 합성에 의해 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연 발생 포스포에스테르 동족체 결합으로 제조될 수 있다.
"프라이머"는 표적 핵산 서열과 혼성화하여 적당한 조건하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 이중 사슬 핵산 영역을 생성하기 위해 표적 핵산 서열과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프라이머는 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 또는 DNA 서열분석에서 사용될 수 있다.
"폴리머라제 연쇄 반응"은 PCR로 약칭되며, 특이적 핵산 서열을 효소적으로 증폭하기 위한 시험관내 방법을 의미한다. PCR은 반복되는 일련의 온도 사이클을 포함하며, 각 사이클은 3가지 단계를 포함한다: 표적 분자의 사슬을 분리하기 위한 주형 핵산의 변성, 단일 사슬 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 주형 핵산의 어닐링, 및 DNA 폴리머라제에 의한 상기 어닐링된 프라이머(들)의 연장. PCR은 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건하에서 핵산의 출발 풀(pool) 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
"역전사-폴리머라제 연쇄 반응"은 RT-PCR로 약칭되고, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 생산하기 위한 시험관내 방법을 의미하며, 이후 상기 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특이적 핵산 서열 또는 서열들을 전술한 바와 같이 효소적으로 증폭한다. 또한, RT-PCR은 상기 표적 분자의 존재를 검출하고, 정량적 또는 반-정량적 조건하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적 함량을 결정하기 위한 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 조절하에 놓여질 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 세포내에서 전사 및 폴리펩티드로 번역되는 이중-사슬 DNA 서열이다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 상기 연결된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 및 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열의 경계부는 상기 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 상기 3'(카복실) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 원핵생물 서열, mRNA 유래의 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 코딩 서열을 진핵생물 세포내에서 발현시킬 의도라면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상 상기 코딩 서열의 3' 쪽에 위치할 것이다.
"개방 판독 프레임(open reading frame)"은 ORF로 약칭되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 출발 신호 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하고, 잠재적으로 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있는 DNA, cDNA 또는 RNA 핵산 서열의 길이를 의미한다.
본원에서, "머리-대-머리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 사슬의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5' 말단과 인접할 때 머리-대-머리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 멀어지게 된다. "머리-대-머리"라는 용어는 (5')-대-(5')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(←→) 또는 (3´←5'5'→3')으로 표시될 수 있다.
본원에서, "꼬리-대-꼬리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 사슬의 3' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3' 말단과 인접할 때 꼬리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드 방향으로 향하게 된다. "꼬리-대-꼬리"라는 용어는 (3')-대-(3')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→←) 또는 (5'→3'3'←5')으로 표시될 수 있다.
본원에서, "머리-대-꼬리"라는 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 서로에 관해 설명하기 위해 사용된다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리노클레오티드의 코딩 사슬의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 3' 말단과 인접할 때 머리-대-꼬리 방향으로 위치하며, 이로부터 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 것과 동일한 방향으로 진행하게 된다. "머리-대-꼬리"라는 용어는 (5')-대-(3')으로 약칭될 수 있으며, 또한 기호(→→) 또는 (5'→3'5'→3')으로 표시될 수 있다.
"하류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 개시점을 뒤따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 개시 부위의 하류에 위치한다.
"상류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 서열을 의미한다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열 또는 전사 개시점의 5'측 상에 위치한다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사 개시 부위의 상류에 위치한다.
"제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 이중 사슬 DNA 내의 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하고 그 내부를 절단하는 효소를 의미한다.
"상동성 재조합"은 외인성 DNA 서열의 다른 DNA 분자로의 삽입, 예를 들면, 벡터의 염색체로의 삽입을 의미한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 상동성 재조합을 위해 특정한 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적 상동성 재조합을 위하여, 상기 벡터는 상보적인 결합 및 상기 벡터의 염색체로의 삽입을 가능하게 하도록 상기 염색체 서열과 상동성인 충분히 긴 영역을 포함할 것이다. 상동성 영역이 더 길고 서열의 유사성 정도가 커질수록, 상동성 재조합 효율은 증가될 것이다.
당해 기술 분야에서 공지된 몇 가지 방법이 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 증식을 위해 사용될 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터는 다량으로 증식 및 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 몇가지 언급하면, 하기 벡터 및 이들의 유도체를 포함한다: 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 바큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
"벡터"는 핵산을 숙주 세포로 클로닝 및/또는 전달시키기 위한 임의의 비히클이다. 벡터는 다른 DNA 세그먼트가 부착되어 상기 부착된 세그먼트의 복제를 일으킬 수 있는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자발적 단위로 작동하는, 즉 그 자신의 조절하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)이다. "벡터"라는 용어는 상기 핵산을 시험관내, 생체외(ex vivo) 또는 생체내에서 세포내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 모두를 포함한다. 당해 기술 분야에 공지되어 있는 대다수의 벡터가 핵산을 조작하고, 반응 요소(response element) 및 프로모터를 유전자 등 내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 가능한 벡터는, 예를 들면, 플라스미드 또는, 예를 들면, 람다 유도체와 같은 박테리오파지를 포함하는 변형된 바이러스, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 포함한다. 본 발명에 유용한 벡터의 또 다른 예는, 본원에 참조문헌으로 도입된 국제공개공보 제WO 2007/038276호에 기재된 울트라벡터(UltraVectorTM) 생성 시스템(Intrexon Corp., Blacksburg, VA)이다. 예를 들면, 반응 요소 및 프로모터에 해당하는 DNA 단편을 적합한 벡터내로 삽입하는 것은 적당한 DNA 단편을 상보적인 점착성(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터내로 접합시킴으로써 달성될 수 있다. 또는, 상기 DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형되거나, 또는 뉴클레오티드 서열(링커)을 상기 DNA 말단 내로 접합시킴으로써 임의의 부위가 생성될 수 있다. 이러한 벡터는 선별 마커(marker) 유전자를 포함하도록 유전자 조작되어, 상기 마커가 세포 게놈 내로 삽입된 세포를 선별하도록 할 수 있다. 이러한 마커는 상기 마커에 의해 코딩되는 단백질이 삽입 및 발현되는 숙주 세포의 동정 및/또는 선별을 가능하게 한다.
바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 세포 뿐만 아니라 살아있는 동물 피검자에서의 다양한 종류의 유전자 전달 적용분야에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스, 바큘로바이러스, 백시니아, 헤르페스 심플렉스, 엡스테인-바, 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 카울리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체 및 생고분자(biopolymer)를 포함한다. 핵산 이외에, 벡터는 또한 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현 기간, 등)를 선별, 측정 및 모니터하기에 유용한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
"플라스미드"라는 용어는 염색체 이외의 요소를 나타내며, 종종 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하고, 통상 원형의 이중-사슬 DNA 분자 형태이다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 자발적으로 복제하는 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 단일- 또는 이중-사슬 DNA 또는 RNA의 선형, 원형 또는 수퍼코일형이며, 다수의 뉴클레오티드 서열이 독특한 구조로 합류 또는 재결합되어 프로모터 단편 및 선별된 유전자 생성물에 대한 DNA 서열을 적당한 3' 비번역 서열과 함께 세포내로 도입할 수 있다.
"클로닝 벡터"는 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 "레플리콘"을 의미하며, 이는 순차적으로 복제하고, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하며, 여기에 다른 핵산 세그먼트가 부착하여 부착된 세그먼트의 복제를 일으킨다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 타입에서는 복제하고, 다른 곳에서는 발현할 수 있다("셔틀 벡터"). 클로닝 벡터는 당해 벡터 및/또는 목적하는 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함하는 세포의 선별에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 숙주 내로 형질전환된 후에 삽입된 핵산 서열이 발현될 수 있도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 비히클을 의미한다. 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 통상 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 조절하에 놓여 있다. 목적하는 숙주 세포내에서 핵산을 발현시키기에 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 다수가 있으며, 당업자에게 친숙하다. 이러한 유전자를 발현시킬 수 있는 실질적으로 모든 프로모터가 본 발명에 적합하며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 구성적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 병인 및 질병 관련 프로모터, 발달 특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 빛 조절성 프로모터; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 알칼린 포스페이트 프로모터(사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOX1 프로모터(피키아(Pichia)에서의 발현에 유용함); β-락타마제, lac , ara , tet , trp , lP L , lP R , T7 , tac 및 trc 프로모터(대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 유용함); 빛 조절성-, 종자 특이적-, 화분 특이적-, 난소 특이적-, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S, CMV 35S 최소, 카사바 베인(cassava vein) 모자이크 바이러스(CsVMV), 클로로필 a/b 결합 단백질, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제, 줄기(shoot)-특이적, 뿌리 특이적, 키티나제, 스트레스 유도성, 쌀 퉁그로바실리폼(rice tungro bacilliform) 바이러스, 식물 수퍼-프로모터, 감자 루신 아미노펩티다제, 니트레이트 리덕타제, 만노파인 신타제, 노팔린 신타제, 유비퀴틴, 제인 단백질 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서의 발현에 유용함); 이로써 한정되는 것은 아니지만, SV40 초기(SV40e) 프로모터 영역, 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 3' 긴 말단 반복(LTR)에 포함되어 있는 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 프로모터 또는 주된 후기 프로모터(MLP), 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티민 키나제(TK) 프로모터, 바큘로바이러스 IE1 프로모터, 연장 인자(elongation factor) 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 조절 영역, 유비퀴터스 프로모터(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간체 필라멘트(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터, 치료학적 유전자(MDR, CFTR 또는 인자 Ⅷ 타입 등)의 프로모터, 병인 또는 질병 연관성-프로모터, 췌장 애시나(acinar) 세포에서 활성형인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역과 같이 조직 특이성을 나타내고 유전자이식 동물에서 이용되고 있는 프로모터를 포함하는 당해 기술분야에서 공지된 동물 및 포유동물 프로모터; 췌장 베타 세포에서 활성형인 인슐린 유전자 조절 영역, 임파구 세포에서 활성형인 유래된글로불린 유전자 조절 영역, 고환, 유방, 임파구 및 비만 세포(mast cell)에서 활성형인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역; 알부민 유전자, 간에서 활성형인 Apo AI 및 Apo AII 조절 영역, 간에서 활성형인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역, 간에서 활성형인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역, 골수 세포에서 활성형인 β-글로빈 유전자 조절 영역, 뇌의 올리고덴드로사이트 세포에서 활성형인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역, 골격근에서 활성형인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 및 시상하부에서 활성형인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역, 피루베이트 키나제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 소장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등을 포함한다. 또한, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
벡터는 당해 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 형질감염(transfection), 전기천공(electroporation), 미세주입(microinjection), 형질도입(transduction), 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 지질감염(lipofection)(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터에 의해 목적하는 숙주 세포내로 도입될 수 있다[참조: Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963(1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621(1988); 및 Hartmut 등의 캐나다 특허출원 제2,012,311호].
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 지질감염에 의해 생체내로 도입될 수 있다. 지난 수십년간, 시험관내에서 핵산을 캡슐화 및 형질감염시키기 위한 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀-매개성 형질감염과 관련된 어려움 및 위험성을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온성 지질이, 마커를 코딩하는 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포좀 제조에 사용될 수 있다[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413(1987); Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:8027(1988); and Ulmer et al., Science 259: 1745(1993)]. 양이온성 지질의 사용은 음전하를 갖는 핵산의 캡슐화를 촉진시키고, 또한 음전하를 갖는 세포막과의 융합을 촉진시킬 수 있다[참조: Felgner et al., Science 337:387(1989)]. 핵산의 전달을 위해 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물은 국제 공개특허공보 제WO95/18863호, 제WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기재되어 있다. 외인성(exogenous) 유전자를 생체내에서 특정한 기관 내로 도입하기 위해 지질감염을 사용하는 것은 몇 가지 실질적인 이점을 갖는다. 특정한 세포로 리포좀을 분자 표적화하는 것이 한가지 유익한 측면이다. 특정한 세포 타입으로 형질감염을 유도하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포가 이형성(heterogeneity)을 갖는 조직에 있어서는 특히 바람직하다는 것이 명확하다. 지질은 표적화를 목적으로 다른 분자와 화학적으로 커플링될 수 있다[참조: Mackey, et al., 1988, supra). 표적화된 펩티드, 예를 들면, 호르몬 또는 신경전달물질(neurotransmitter) 및 항체와 같은 단백질 또는 비-펩티드 분자는 리포좀과 화학적으로 커플링될 수 있다.
또한, 양이온성 올리고펩티드(예를 들면, WO95/21931), DNA 결합 단백질 유래의 펩티드(예를 들면, WO96/25508), 또는 양이온성 고분자(예를 들면, WO95/21931)와 같은 다른 분자들도 생체내에서의 핵산의 형질감염을 촉진하는데 유용하다.
또한, 네이키드(naked) DNA 플라스미드와 같은 벡터를 생체내로 도입하는 것도 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호 참조). 수용체-매개된 DNA 전달 접근방법 또한 사용될 수 있다[참조: Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147(1992); 및 Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429(1987)].
"형질감염"이란 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA의 흡수를 의미한다. 세포는 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA가 세포의 내부로 도입될 때 이러한 RNA 또는 DNA에 의해 "형질감염" 되었다. 세포는 상기 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화를 나타낼 때 외인성 또는 이종형 RNA 또는 DNA에 의해 "형질전환" 되었다. 형질전환된 RNA 또는 DNA는 염색체 DNA 내부로 삽입되어(공유적으로 결합됨) 세포의 게놈을 구성할 수 있다.
"형질전환"은 숙주 생명체의 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 의미하며, 결과적으로 유전적으로 안정하게 유전된다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생명체는 "유전자이식된" 또는 "재조합된" 또는 "형질전환된" 생명체로 불리운다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 이들의 증폭 또는 이들의 발현을 목적하는 세포성 숙주 내에서의 하나 이상의 복제 기원, 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다.
"선별용 마커"라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전적 성질을 추적하거나 및/또는 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 동정하기 위해 사용되는 상기 마커 유전자의 효과, 즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 발색성 마커, 효소, 형광 마커 등에 의해 선별될 수 있는, 통상 항생제 또는 화학 내성 유전자와 같은 동정 인자(identifying factor)를 의미한다. 당해 기술분야에서 공지되고 사용되는 선별용 마커 유전자의 예로는 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 비알랍포스(bialaphos) 제초제, 설폰아미드 등에 내성을 나타내는 유전자; 및 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전달 유전자 등과 같은 표현형 마커로 사용되는 유전자를 포함한다.
"리포터 유전자"라는 용어는, 관심있는 핵산의 유전적 성질을 추적하거나, 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 생명체를 동정하거나 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용되는 상기 리포터 유전자의 효과에 의해 동정될 수 있는 동정 인자를 코딩하는 핵산을 의미한다. 당해 기술분야에서 공지되고 사용되는 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제(Luc), 초록 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 또한, 선별 마커 유전자는 리포터 유전자로 간주될 수도 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 서로 교대로 사용될 수 있고, 코딩 서열 또는 작용성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 이들의 전체가 자연형 유전자로부터 유래되거나, 또는 자연 상태에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 이루어지거나, 또는 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 타입, 또는 상이한 발달 단계, 또는 상이한 환경적 또는 물리적 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 대부분의 시간에 대부분의 세포 타입에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "구성적 프로모터"로 불리운다. 특정한 세포 타입에서의 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 불리운다. 특정한 발달 단계 또는 세포 분화 단계에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 불리운다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드(ligand), 빛 등에 세포를 노출하거나 처리한 이후에 유도되거나 유전자의 발현을 초래하는 프로모터는 통상 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터"로 불리운다. 추가로, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계부는 완전하게 정의되어 있지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 인식되어 있다.
상기 프로모터 서열은 통상 이의 3' 말단에 전사 개시 부위가 결합되어 있고, 상류(5' 방향)에는 배경(background) 이상으로 검출될 수 있는 레벨로 전사를 개시하기에 필요한 최소의 염기 또는 요소를 포함하도록 연장된다. 상기 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑에 의해 편리하게 정의됨) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 필요한 단백질 결합 도메인(공통(consensus) 서열)도 발견될 것이다.
"치료학적 스위치 프로모터"("TSP")는 유전자 스위치 성분의 발현을 조절하는 프로모터를 의미한다. 유전자 스위치 및 이들의 다양한 성분들은 본원의 다른 부분에 상세히 기재되어 있다. 특정한 양태에서, TSP는 구조성, 즉 연속적으로 활성형이다. 구조 TSP는 구조-유비퀴터스(즉, 임의의 조직 또는 세포에서 추가 인자 또는 조절제에 대한 요구없이 일반적으로 작용함) 또는 구성적-조직 또는 세포 특이적(즉, 특이적 조직 타입 또는 세포 타입에서 추가의 인자 또는 조절제에 대한 요구없이 일반적으로 작용함)일 수 있다. 특정한 양태에서, 본 발명의 TSP는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된다. 2개 이상의 TSP가 수반되는 본 발명의 특정한 양태에서, 프로모터는 구조 및 활성화가능한 프로모터의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 프로모터"는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 질병 특이적 프로모터, 특정한 생리적, 발달적, 분화 또는 병리적 상태에 반응성인 프로모터, 특정한 생물학적 분자에 반응성인 프로모터 및 질병, 장애 또는 이상과 관련된 특정한 조직 또는 세포 타입, 예를 들면, 종양 조직 또는 악성 세포에 특이적인 프로모터를 포함한다. TSP는 자연발생 프로모터 서열, 자연발생 프로모터로부터 유래하는 변형된 프로모터 또는 합성 서열(예를 들면, 반응 요소를 최소 프로모터 서열에 삽입하여 당해 프로모터의 반응성을 변경시킨 것)를 포함할 수 있다.
코딩 서열은 RNA 폴리머라제가 상기 코딩 서열을 mRNA로 전사할 때 세포내에서 전사 및 번역 조절 서열의 "조절하에" 있으며, 이후 트랜스-RNA 스플라이싱(상기 코딩 서열이 인트론을 포함하는 경우)되고 상기 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역된다.
"전사 및 번역 조절 서열"은 숙주 세포내에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 신호는 조절 서열이다.
"반응 요소"("RE")라는 용어는, 전사 인자의 DNA-결합 도메인과의 상호작용을 통해 매개되는 프로모터에 대한 반응성을 부여하는 하나 이상의 시스(cis)-작용성 DNA 요소를 의미한다. 이 DNA 요소는 당해 서열이 (완전하거나 또는 불완전한) 팔린드롬성(palindromic)이거나, 또는 다양한 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 하프 부위로 이루어질 수 있다. 상기 하프 부위는 동일하거나 유사하며, 직접 또는 역상 반복으로 배열되거나, 또는 단일 하프 부위이거나, 또는 인접한 하프 부위가 직렬로 연결된 다합체(multimer)로 배열될 수 있다. 상기 반응 요소는 당해 반응 요소가 삽입되는 세포 또는 생명체의 성질에 따라 다른 생명체로부터 분리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재하에 반응 요소의 조절하에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하여 상기 반응 요소의 조절하에 있는 하류 유전자(들)의 전사를 개시 또는 억제한다. 자연형 엑디손(ecdysone) 수용체의 반응 요소에 대한 DNA 서열의 예로는 RRGG/TTCANTGAC/ACYY(서열번호 1)[참조: Cherbas L., et. al., Genes Dev. 5, 120(1991)]; AGGTCAN(n)AGGTCA (서열번호 2) (여기서, N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드일 수 있다)[참조: D'Avino PP., et al., Mol, Cell, Endocrinol, 113, 1(1995)]; 및 GGGTTGAATGAATTT (서열번호 3)[참조: Antoniewski C., et al., Mol. Cell Biol. 14, 4465(1994)]를 포함한다.
"인자 조절된 프로모터"("FRP")는 본 발명의 유전자 스위치에 의해 코딩된 리간드-의존성 전사 인자의 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 적어도 하나의 반응 요소를 포함하는 프로모터를 의미한다.
"작동가능하게 연결된(operably linked)", "작동적으로 결합된", "작동성 연결을 통해" 등의 용어는, 핵산 서열이 단일 핵산 단편과 연관되어 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받는다는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠수 있을 때(즉, 상기 코딩 서열이 상기 프로모터의 전사 조절하에 있을 때) 상기 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 코딩 서열은 조절 서열과 센스 또는 안티센스 방향으로 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"이란 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래하는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 의미한다. 발현은 또한 단백질 또는 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 의미할 수도 있다.
"카세트(cassette)", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 상동성 재조합에 의해 특정한 제한효소 부위에서 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA 세그먼트를 의미한다. 상기 DNA 세그먼트는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 번역을 위해 상기 카세트가 적절한 판독 프레임 내에 삽입될 수 있도록 디자인된다. "형질전환 카세트"는, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 이외에 특정한 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 인자를 갖는 특정한 벡터를 의미한다. 또한, 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포내에서 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되도록 하는 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있다.
본 발명을 위해, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터에 연결된 반응 요소 및 리간드-의존성 전사 인자 기반 시스템의 조합을 의미하며, 상기 리간드-의존성 전사 인자 기반 시스템은 하나 이상의 리간드의 존재하에 반응 요소 및 프로모터가 도입되어 있는 유전자의 발현을 조절한다.
유전자 스위치와 관련하여 "엑디손 수용체 기반"이라는 용어는 자연발생 또는 합성 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인의 적어도 작용성 부분을 포함하고 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인에 결합하는 리간드에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 유전자 스위치를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물반응기" 또는 "생물반응기 장치"라는 용어는 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 세포 또는 세포들을 의미한다. 특정한 비제한적 양태에서, 생물반응기는 본원의 다른 부분에 기재된 변형된 세포를 포함한다. 특정한 일부 양태에서, 생물반응기 세포는 "유래된분리"될 수 있다. 생물반응기 세포는, 당해 세포가 처리되어, 피검자에게 도입되거나 이식되면, 당해 세포가 피검자의 면역 시스템으로부터 보호되도록 피검자로부터 "면역분리된" 것으로 간주된다. 예를 들면, 면역분리된 생물반응기 세포는 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 전파를 가능하게 하지만 생물반응기 세포와 피검자 면역 시스템 세포와의 직접적인 접촉을 방지하는 차단(barrier) 시스템 내에 포함될 수 있다. 면역분리된 세포는, 예를 들면, 피복되거나 캡슐화될 수 있다. 면역분리 방법은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 등각 피복, 세포를 생물적합성 재료에 현탁시키고 구형 매쓰로 분리하는 마이크로캡슐화, 또는 매크로캡슐화를 포함하며, 여기서 세포는 세포를 둘러싸기 위해 사용되는 자연 또는 합성 중합체로 이루어진 장치 내에 둘러싸여 있다.
"조절" 및 "조절하는"이란 용어는 핵산 또는 유전자의 발현을 유도, 감소 또는 억제하여, 결과적으로 단백질 또는 폴리펩티드 생산을 각각 유도, 감소 또는 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 변형된 세포에서 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 양태에서 사용될 수 있는 인핸서는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 연장 인자(elongation factor)-1(EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함한다.
본원에 정의된 "3' reg"는 유전자 또는 전사체의 코딩 영역에 3' 방향에 위치한 발현 조절 요소이다. 이러한 요소는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 1차 전사-코딩된 스플라이싱 요소, 가공된 전사체로부터의 UTR, 폴리아데닐화 신호 또는 DNA 코딩된 전사 종결 도메인을 포함한다.
종결 조절 영역, 즉 터미네이터 또는 폴리아데닐화 뉴클레오티드 서열은 또한 바람직한 숙주에 대해 자연형인 다양한 유전자로부터 유래할 수 있다. 임의로, 종결 부위는 불필요할 수도 있지만, 포함시키는 것이 대부분 바람직하다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 종결 조절 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 바이러스 터미네이터 서열 등으로 구성되거나 또는 이들로부터 유도될 수 있다.
"3' 비-코딩 서열" 또는 "3' 비번역 영역(UTR)"이라는 용어는 코딩 서열의 하류(3´)에 위치하는 DNA 서열을 의미하며, 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 통상 mRNA 전구체(precursor)의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙(track)을 부가하는데 영향을 미침으로써 특정된다.
"조절 영역"은 2번째 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 영역은 특정한 핵산(상동성 영역)의 발현에 자연적으로 관여하는 서열을 포함할 수도 있거나, 상이한 단백질 또는 심지어 합성 단백질(이종형 영역)의 발현에 관여하는 상이한 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 원핵생물, 진핵생물, 또는 바이러스 유전자의 서열이거나, 또는 특이적인 또는 비-특이적인 방식 및 유도가능한 또는 비-유도가능한 방식으로 유전자의 전사를 자극 또는 억제하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이싱 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 및 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 경로로 유도하는 신호 서열을 포함한다.
"이종형 공급원" 유래의 조절 영역은 발현된 핵산과 자연적으로는 연관되지 않는 조절 영역이다. 상기 이종형 조절 영역에 속하는 것으로는 상이한 종 유래의 조절 영역, 상이한 유전자 유래의 조절 영역, 혼성화 조절 서열 및 자연적으로 존재하지 않지만 당업자에 의해 디자인된 조절 서열을 포함한다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사체로부터 발생하는 생성물을 나타낸다. 상기 RNA 전사체가 DNA 서열과 완전히 상보적인 복사본일 때는 1차 전사체로 불리우거나, 상기 1차 전사체의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 때는 성숙한 RNA로 불리운다. "메신저 RNA(mRNA)"는 인트론이 없으며, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 의미한다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이고 이로부터 유래된 이중-사슬 DNA를 의미한다. "센스" RNA는 상기 mRNA를 포함하는 RNA 전사체를 의미하며, 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부와 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 의미한다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정한 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열 또는 상기 코딩 서열에 존재할 수 있다. "작용성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 아직 번역되지 않은 것으로서 세포 작동에 영향을 미치는 다른 RNA를 의미한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 서로 교대로 사용되고, 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 중합체 화합물이다.
"분리된 폴리펩티드", "분리된 펩티드" 또는 "분리된 단백질"은 이의 자연 상태에서는 정상적으로 연결되어 있는 화합물들(예를 들면, 상이한 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 제거된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. "분리된"은 다른 화합물들과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 불순물의 존재를 배제하는 의미는 아니며, 상기 불순물은, 예를 들면, 불완전한 정제, 안정제의 첨가, 또는 약제학적으로 허용되는 제제로의 혼합으로 인해 존재할 수 있다.
"치환 돌연변이체 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이체"는 적어도 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 폴리펩티드로 치환된 것을 포함하는 돌연변이체 폴리펩티드를 의미하는 이해될 것이다. 치환 돌연변이체 폴리펩티드는 단지 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, "점 돌연변이체" 또는 "단일 점 돌연변이체" 폴리펩티드로서 언급될 수 있다. 또는, 치환 돌연변이체 폴리펩티드는 2개 이상의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 폴리펩티드에 대해 2개 이상의 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이체를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 적어도 하나의 야생형 또는 자연발생 아미노산이 당해 야생형 또는 자연발생 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드에 대해 상이한 아미노산으로 치환된 것을 포함한다.
치환 돌연변이체 폴리펩티드가 2개 이상의 야생형 또는 자연발생 아미노산의 치환을 포함하는 경우, 이러한 치환은 치환을 위해 결실된 동수의 야생형 또는 자연발생 아미노산, 즉 2개의 비-야생형 또는 비-자연발생 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 또는 자연발생 아미노산을 포함하거나, 또는 치환을 위해 결실된 비동수의 야생형 아미노산, 즉 1개의 비야생형 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 아미노산(치환 + 결실 돌연변이) 또는 3개의 비야생형 아미노산으로 치환된 2개의 야생형 아미노산(치환 + 삽입 돌연변이)을 포함할 수 있다.
치환 돌연변이체는 약칭 명명 시스템을 사용하여 기재함으로써 기준 폴리펩티드 서열 내에 치환된 아미노산 잔기와 수 및 새롭게 치환된 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 20번째(20th) 아미노산 잔기가 치환된 치환 돌연변이는 "x20z"로 약칭될 수 있고, 여기서 "x"는 치환되는 아미노산이고, "20"은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치 또는 번호이며, "z"는 새롭게 치환된 아미노산이다. 따라서, "E20A" 또는 "Glu20Ala"로 교대로 약칭된 치환 돌연변이체는 당해 돌연변이체가 폴리펩티드의 20번 위치에서 글루탐산(당해 분야에서 통상 "E" 또는 "Glu"로 약칭됨) 대신에 알라닌 잔기(당해 분야에서 통상 "A" 또는 "Ala"로 약칭됨)를 포함하는 것을 나타낸다.
치환 돌연변이체는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 돌연변이 유발 기술로 제조될 수 있으며, 여기에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시험관내 부위 지시된 돌연변이 유발[참조: Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551(1978); Zoller et al., DNA 3:479(1984); Oliphant et al., Gene 44:177(1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710(1986)], TABR 링커(Pharmacia)의 사용, 제한 엔도뉴클레아제 소화/단편 결실 및 치환, PCR-매개된/올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이 유발 등이 포함된다. PCR 기반 기술은 부위 지시된 돌연변이 유발이 바람직하다[참조: Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70].
폴리펩티드에 적용되는 "단편"이라는 용어는 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열보다 짧고 이들 기준 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 전체 부분에 걸쳐 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 단편은, 적합한 경우, 이들이 일부인 보다 큰 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 이러한 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, 300 또는 그 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 유사체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체로서, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 보유하는 것을 의미한다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 상이한 변이체는 자연 상태에서 존재할 수 있다. 이러한 변이체는 상기 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열상의 차이에 의해 특정되는 대립 변이이거나, 또는 상이한 스플라이싱 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 당업자는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 교환을 갖는 변이체를 제조할 수 있다. 이들 변이체는 특히 (a) 하나 이상의 아미노산이 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 상기 폴리펩티드 또는 단백질에 부가된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체 및 (d) 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 또 다른 폴리펩티드와 융합된 변이체를 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적 및 효소적 기술을 포함하는 이들 변이체를 수득하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 한 가지 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함한다.
"상동성"이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 잔기 사이의 동질성 퍼센트(%)를 나타낸다. 하나의 잔기와 다른 잔기 유래의 서열 사이의 일치 정도는 해당 분야에서 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 배열하고 즉시 사용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 또는, 상동성은 상동성 영역 사이에 안정한 이중체(duplex)를 형성하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화시킨 후, 단일-사슬-특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고 소화된 단편의 크기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 모든 문법적인 형태 및 철자 변형에 있어서 "상동성"이란 용어는 수퍼패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼패밀리) 유래의 단백질 및 상이한 종(예를 들면, 미오신 경쇄 등) 유래의 상동성 단백질을 포함하는 "공통의 진화적 기원"을 갖고 있는 단백질들 간의 유연관계(relationship)를 나타낸다[참조: Reeck et al., Cell 50: 667(1987)]. 이러한 단백질들(및 이들의 코딩 유전자들)은 이들의 높은 서열 유사성 정도에 의해 반영된 바와 같이 서열 상동성이 있다. 그러나, 통상의 관행 및 본원에 있어서, "상동성" 이란 용어는 "고도"와 같은 부사어와 함께 한정될 때는 서열의 유사성을 의미하고 공통의 진화적인 기원을 의미하지 않을 수도 있다.
따라서, 모든 문법적인 형태에서 "서열 유사성"이란 용어는 공통의 진화적 기원을 갖거나 갖지 않을 수 있는 핵산 또는 단백질의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 일치 정도를 의미한다[참조: Reeck et al., Cell 50: 667(1987)]. 한 가지 양태에서, 2개의 DNA 서열은 적어도 약 50%(예를 들면, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 95%)의 뉴클레오티드가 정해진 길이의 DNA 서열에 걸쳐서 일치할 때 "실질적으로 상동성"이거나, 또는 "실질적으로 유사하다". 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 뱅크에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 예를 들면, 특정한 시스템에 대해 정의되어 있는 엄격한 조건하에 서던 블롯(Southern blot) 실험으로 동정할 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 해당 분야의 기술 범위 이내이다[참조: Sambrook et al., 1989, supra].
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 발생하지만, 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 작용성 특성에는 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 매개하는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 생성 전사체의 작용성 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 본 발명은 특정한 예시적인 서열 이상을 포괄하는 것으로 이해된다. 제시된 변형 각각은, 코딩된 생성물의 생물학적 활성 유지의 결정과 같이, 해당 분야의 일상적인 기술 범위 이내이다.
더욱이, 당업자는 본 발명에 의해 포괄되는 실질적으로 유사한 서열은 또한 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS, 이어서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척)하에 본원에 예시된 서열과 혼성화할 수 있는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있음을 인지한다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 당해 DNA 서열이 본원에 기재된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 단편이다.
2개의 아미노산 서열은 약 40% 이상의 아미노산 서열이 동일하거나, 또는 60% 이상이 유사할 때(기능적으로 동일함) "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사하다". 바람직하게는, 상기 유사한 또는 상동성 서열은, 예를 들면, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업(pileup) 프로그램을 이용하여 배열함으로써 동정된다.
"대응하는"이란 용어는, 그 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 상이한, 유사하거나 상동성인 서열을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열의 배열은 스페이스(space)를 포함할 수도 있다. 따라서, "대응하는"이란 용어는 서열의 유사성을 의미하며, 아미노산 잔기 또
는 뉴클레오티드 염기의 수를 의미하는 것은 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분(substantial portion)"은, 당업자가 수동으로 서열을 평가하거나, 또는 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215: 403(1993); www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 이용가능함)와 같은 알고리즘을 이용한 동정에 의해 상기 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 동정하기 위하여 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 충분히 포함한다. 일반적으로, 공지된 단백질 또는 유전자에 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 동정하기 위해서는 10개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 서열 또는 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 20 내지 30개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열-의존성 유전자 동정(예를 들면, 서던 혼성화법) 및 분리(예를 들면, 박테리아 콜로니(colony) 또는 박테리오파지 플라크(plaque)의 인 시투(in situ) 혼성화법)에 사용될 수 있다. 또한, 12 내지 15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정한 핵산 단편을 수득하기 위한 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 상기 서열을 포함하는 핵산 단편을 구체적으로 동정 및/또는 분리하기 위한 서열을 충분히 포함한다.
"퍼센트 동일성(percent identity)"라는 용어는, 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이, 당해 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 상관관계이다. 종래 기술에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서 일련의 서열 사이의 일치에 의해 결정되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 연관성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기에 개시된 공지된 방법에 의해 즉시 계산될 수 있다[참조: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G. eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최적의 일치를 제공하기 위해 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 정리되어 있다. 서열의 배열 및 퍼센트 동일성의 계산은 LASERGENE 생명정보학 컴퓨팅 수트(suite)의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 서열의 다중 배열은 디폴트 파라미터(default parameter)(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)로 상기 클러스트 배열 방법(Higgins et al., CABIOS. 5:151(1989))을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 클러스트 방법을 이용한 페어와이즈(pairwise) 배열의 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5로 선택될 수 있다.
"서열 분석 소프트웨어"라는 용어는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 의미한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, GCG 수트 프로그램(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX [참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403(1990)] 및 DNASTAR [참조: DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA]를 포함한다. 본 발명의 문맥 내에서, 서열 분석 프로그램이 분석을 위해 사용될 때, 그 분석 결과는, 달리 특정하지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "디폴트 값"은 처음 시작할 때 당해 소프트웨어에 원래 부여된 임의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
DNA의 서열과 관련된 "화학적으로 합성된"은 당해 성분 뉴클레오티드가 시험관내에서 조립됨을 의미한다. DNA의 수동 화학적 합성은 잘 확립된 공정을 사용하여 달성할 수 있거나, 자동화 화학적 합성은 상업적으로 시판되는 다수의 기계 중의 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스를 반영하기 위해 뉴클레오티드 서열의 최적화에 근거한 최적 유전자 발현을 위해 맞춰질 수 있다. 당업자는, 코돈 사용이 숙주에게 호의적인 이들 코돈을 향해 바이어스되는 경우에 성공적인 유전자 발현이 가능함을 인지한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 입수할 수 있는 숙주 세포 유래의 유전자 검사를 기반으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 개개 작동성 유전자 조절 시스템은, (a) 선택된 농도에서 이의 각 리간드에 의해 주어진 시스템 각각의 조절이 당해 시스템의 유전자 발현의 정도에 있어서 측정가능한 변화를 발생시키고, (b) 당해 변화가, 실제 조절의 조절의 동시성 또는 연속성과 관련없이, 세포, 조직 또는 생물체에서 동시에 작동하는 모든 다른 시스템의 발현시의 변화보다 통계학적으로 유의한 차이가 있는 경우에 "직교"인 것으로 언급된다. 바람직하게는, 각각 개별적으로 작동성 유전자 조절 시스템의 조절은 세포, 조직 또는 생물체에서 유전자 발현을 모든 다른 작동성 시스템보다 적어도 2배, 예를 들면, 적어도 5배, 10배, 100배 또는 500배 더 변화시킨다. 실제로, 선택된 농도에서 이의 각 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절은 당해 시스템의 유전자의 변현 정도에 있어서 측정가능한 변화를 발생시키고, 세포, 조직 또는 생물체에서 작동성인 모든 다른 시스템에서는 측정가능한 변화가 없다. 이러한 경우, 다중 유도가능한 유전자 조절 시스템은 "완전 직교"인 것으로 언급된다. 본 발명은, 전체 내용이 본원에서 참조로서 도입된 미국 공개특허 제US 2000/0110861호에 기재된 것과 같은 직교 리간드 및 직교 수용체 기반 유전자 발현 시스템을 위한 탐색에 유용하다.
"외인성 유전자"라는 용어는 피검자에 대해 이질성 유전자, 즉 형질전환 공정을 통해 피검자 내로 도입된 유전자, 내인성 돌연변이된 유전자의 비돌연변이 이형 또는 내인성 비돌연변이 유전자의 돌연변이 이형을 의미한다. 형질전환 방법은 본 발명에서 중요하지 않으며, 당업자에게 공지된 대상에 적합한 임의의 방법일 수 있다. 외인성 유전자는, 역전사 효소에 의한 것과 같이 DNA 중간체를 통해 작동할 수 있는 DNA 또는 RNA 형태로 피검자 내로 도입된 자연 또는 합성 유전자일 수 있다. 이러한 유전자는 표적 세포에 도입될 수 있고, 피검자 내로 직접 도입될 수 있거나, 형질전환된 세포를 피검자 내로 전달함으로써 간접적으로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 "치료학적 생성물" 및 "치료학적 분자"라는 용어는 치료학적 폴리펩티드("TP", "치료학적 단백질 서열"("TPSQ")에 의해 코딩됨) 또는 치료되는 피검자에게 유리한 기능을 제공하는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 치료학적 폴리펩티드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 3개 아미노산 길이와 같이 작은 펩티드, 단일- 또는 다중쇄 단백질 및 융합 단백질을 포함할 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소정 간접 RNA, 리보자임 및 RNA 외부 가이드 서열을 포함할 수 있다. 치료학적 생성물의 비제한적 예는 본원의 다른 부분에 개시되어 있다. 치료학적 생성물은 자연발생 서열, 합성 서열 또는 자연발생 서열과 합성 서열의 조합물을 포함할 수 있다.
"리간드-의존성 전사 인자 복합체" 또는 "LDTFC"는 당해 복합체가 본원에 정의된 "인자 조절된 프로모터"에 의해 유도된 유전자 발현을 조절할 수 있는 하나 이상의 단백질 아단위를 포함하는 전사 인자를 의미한다. LDTFC는 "엑디손 수용체 복합체"이고, 이는 일반적으로 핵 수용체 부류의 적어도 2개 구성원, 즉 엑디손 수용체("EcR") 및 울트라스피라클("USP") 단백질을 갖는 이형이합체 단백질 복합체를 의미한다[참조: Yao et al, Nature 366:476 (1993); Yao et al, Cell 77:63 (1992)]. EcR 복합체 등의 작용성 LDTFC는 또한 추가의 단백질(들), 예를 들면, 이뮤노필린(immunophilin)을 포함할 수 있다. 전사 인자로서 공지된 핵 수용체 부류의 추가의 구성원(예; DHR38, betaFTZ-1 또는 곤충 동족체)는 EcR 및/또는 USP에 대한 리간드-의존성 또는 독립성 파트너일 수 있다. EcR 복합체 등의 LDTFC는 또한 EcR 단백질의 이형이합체 및 울트라스피라클 단백질의 척추 동족체, 레틴산-X-수용체("RSR") 단백질 또는 USP 및 RXR의 키메라일 수 있다. "LDTFC" 및 "EcR 복합체"라는 용어는 또한 단일 폴리펩티드 또는 동일한 기능을 이용하는 삼합체, 사합체, 및 다른 다합체 뿐만 아니라 EcR 단백질 또는 USP의 동형이합체 복합체를 포함한다.
EcR 복합체 등의 LDTFC는, EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지는 않는, 복합체 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비스테로이드 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, LDTFC 기반 유전자 스위치, 예를 들면, EcD 복합체 기반 유전자 스위치에 적용된 "리간드"라는 용어는 유전자 스위치를 활성화시켜 코딩된 폴리펩티드의 발현을 자극하는 능력을 갖는 소형 및 가용성 분자를 나타낸다. 리단드의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 엑디스테로이드(예: 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A 등), 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 동족체, N,N'-디아실하이드라진, 예를 들면, 미국 특허 제6,013,836호; 제5,117,057호; 제5,530,028호; 및 제5,378,726호 및 미국 공개특허원 제2005/0209283호 및 제2006/0020146호에 기재된 것들; 미국 공개특허원 제2004/0171651호에 기재된 옥사디아졸린; 유럽 특허원 제461,809호에 기재된 것과 같은 디벤조일아킬 시아노하이드라진; 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것과 같은 N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진; 유럽 특허원 제234,994호에 개시된 것과 같은 N-아실-N-알킬카보닐하이드라진; 미국 특허 제4,985,461호에 기재된 것과 같은 N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진; 미국 공개특허원 제2004/0049037호에 기재된 것과 같은 아미도케톤; (이들 각각은 본원에서 참조로서 도입된다) 및 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하파자이드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유충 호르몬 III 등을 포함하는 다른 유사한 물질을 포함한다. 본 발명에 유용한 디아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819 (3,5-디메틸-벤조산 N-(l-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), RG-115932 ((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG-115830 (3,5-디메틸-벤조산 N-(l-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)를 포함한다. [참조: 본원에 전체가 참조로서 도입되는 미국 특허원 제12/155,111호 및 PCT 특허출원 제PCT/US2008/006757호].
EcR 복합체와 같은 LDTFC는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하고, 여기서 모든 구성원은 아미노산-말단 전이활성화 도메인("AD", "TF" 또는 "TA", 본원에서 상호 교대로 사용됨), DNA 결합 단백질("DBD"), 및 리간드 결합 도메인("LBD")를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 아단위의 존재를 특징으로 한다. AD는 "이형이합체화 파트너" 또는 "HP"와의 융합으로 존재할 수 있다. 본 발명의 AD 및 HP를 포함하는 융합 단백질은 본원에서 "공활성화 단백질" 또는 "CAP"로서 언급된다. DBD 및 LBD는 본원에서 "리간드 유도가능한 전사 인자("LTF")로서 불리우는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 파트너는 링커, 예를 들면, 힌지 영역에 의해 분리될 수 있다. LTF 부류의 일부 구성원은 또한 LBD의 카복시 말단측 위에 또 다른 전이활성화 도메인을 가질 수 있다. DBD는 2개의 아미노산 모티프, 즉 P-박스 및 D-박스 사이에 2개의 시스테인 아연 핑거의 존재를 특징으로 하고, 이들은 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 제공한다. 이들 도메인은 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 자연형, 변형 또는 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소 및 LDTFC(예: EcR 복합체)를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포(예: 대장균, 바실루스 서브틸리스) 또는 기타 장내 세균, 또는 진핵 세포(예: 식물 또는 동물 세포) 내로 도입될 수 있다. 그러나, 당해 유전자에 의해 발현된 단백질의 다수는 세균에서 부정확하게 처리되기 때문에, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체의 형태로 존재할 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소 및 수용체 복합체의 뉴클레오티드 서열은 또한 RNA 분자로서 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스 등의 작용성 바이러스 RNA 형태로 도입될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추 세포가 바람직한데, 이는 EcR를 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 제공하는 분자를 자연적으로 결여하고 있기 때문이다. 결과적으로, 이들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 비감수성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포 또는 전체 생물체에 대하여 무시가능한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 세포는 성장하고, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는 목적하는 생성물을 발현할 수 있다.
"피검자"라는 용어는 순수한 곤충, 식물 또는 동물을 의미한다. 또한, 당해 리간드는 피검자가 곰팡이 또는 효모인 경우에 동등하게 작동할 것으로 예상된다. 피검자가 순수한 동물인 경우, 바람직하게는 당해 동물은 척추동물, 가장 바람직하게는 포유동물이다.
EcR 리간드는, 외인성 유전자(예: 리포터 유전자)에 연결된 반응 요소에 또한 결합되는 LDTFC(예: EcR 복합체)와 함께 사용되는 경우, 외인성 유전자의 발현을 외부적으로 일시 조절하는 수단을 제공한다. 다양한 성분들이 서로 결합하는 순서, 즉 리간드가 수용체 복합체에 결합하고 수용체 복합체가 반응 요소에 결합하는 순서는 중요하지 않다. 통상적으로, 외인성 유전자의 발현의 조절은 LDTFC(예: EcR 복합체), 특이적 제어 또는 조절된 DNA 요소의 결합에 대한 반응이다. 핵 수용체 부류의 다른 구성원과 같이 EcR 단백질은 적어도 3개의 도메인, AD, DBD 및 LBD를 보유한다. 이들 수용체는, 핵 수용체 부류의 서브세트와 같이, 이형이합체화 특성에 관여하는 확실히 정의되지 않은 영역(본원에서 "이형이합체화 파트너" 또는 "HP"로서 언급됨)을 보유한다. LTF(예: EcR 단백질)의 리간드 결합 도메인에 대한 당해 리간드의 결합은, 예를 들면, AD 및/또는 HP(예: USP 또는 RXR 단백질)을 포함하는 CAP와의 이형이합체화 후, 이형이합체화 단백질의 DNA 결합 도메인이 활성화 형태로 반응 요소에 결합할 수 있게 하고, 이에 의해 외인성 유전자를 발현 또는 억제시킨다. 이러한 메카니즘은 개개 아단위, 예를 들면, LTF 또는 CAP(예: EcR 또는 USP)에 대한 리간드 결합의 가능성 및 활성 동형이합체 복합체(예: EcR+EcR 또는 USP+USP)의 생성 정보를 배제하는 것이 아니다. 한 가지 양태에서, 키메라 유전자 스위치를 생성하는 하나 이상의 수용체 도메인은 달라질 수 있다. 통상적으로, 3개 도메인 중의 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과는 상이한 공급원으로부터 선택되어 키메라 수용체가 전이활성화, 리간드의 상보적 결합 및 특이적 반응 요소의 인식을 위해 선택된 숙주 세포 또는 생물체에서 최적화된다. 또한, 반응 요소 자체는, 효모로부터의 GAL-4[참조: Sadowski et al, Nature 555:563 (1988)] 또는 대장균으로부터의 LexA 단백질[참조: Brent et al, Cell 43:729 (1985)]과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 변형 또는 치환되어 키메라 LDTFC(예: EcR 복합체)를 수용할 수 있다. 키메라 시스템의 또 다른 잇점은 이들이 목적하는 최종 결과에 따라 외인성 유전자의 유도에 사용된 프로모터의 선택을 가능하게 한다는 점이다. 이러한 이중 조절은 유전자 치료 분야에서, 특히 세포독성 단백질이 생성되는 경우에 특히 중요한데, 이는 발현이 발생하는 세포 뿐만 아니라 발현 타이밍 둘 다가 조절될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자가 피검자의 세포 내로 도입되는 경우, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드의 존재에 의해 조절된다. 프로모터는 구성적으로 또는 유도가능하게 조절될 수 있거나, 조직 특이적(즉, 특정한 세포 타입에서만 발현됨) 또는 생물체의 특정한 발달 단계에 특이적일 수 있다.
다양한 폴리펩티드를 코딩하는 다수의 게놈 및 cDNA 핵산 서열, 예를 들면, 전사 인자 및 리포터 유전자는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 당업자는 실질적으로 모든 공지된 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 접근하고, 공공 수탁기관, 즉 당해 서열을 공개한 단체로부터 직접 핵산 분자를 입수하거나, 통상의 방법을 사용하여 당해 분자를 제조할 수 있다.
생체내 사용을 위해, 본원에 기재된 리간드는 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐제, 연고, 엘릭서 및 주사가능한 조성물로 구성될 수 있다. 약제학적 조성물은 리간드를 0.01중량% 내지 99중량% 함유할 수 있다. 조성물은 단일 또는 다중 용량형으로 존재할 수 있다. 특정한 약제학적 조성물 중의 리간드의 양은 유효 용량, 즉 목적하는 유전자 발현 또는 억제를 유도하는데 필요한 용량에 따라 달라질 것이다.
약제학적 제제를 투여하는 적합한 경로는 경구, 직장, 국소(경피, 구강 및 설하 포함), 질내, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 경피내, 협막내 및 경막내 포함) 및 비위관(naso-gastric tube)에 의한 것을 포함한다. 당업자는 바람직한 투여 경로가 치료되는 상태에 의존하고, 수용자의 상태 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 한 가지 양태는,
(a) 피검자의 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하고, 상기 전사 인자 서열은 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하며, 상기 프로모터는 질병, 장애 또는 이상 동안 활성화된다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계(여기서, 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드는 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는데 충분한 수준으로 발현된다)를 포함하는, 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 가지 양태는,
(a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와 작동가능하게 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입(여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체가 발현되도록 도입된다)하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자에서 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는,
(a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함한다) 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와 작동가능하게 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입(여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 리간드-의존성 전사 인자 복합체가 발현되도록 도입된다)하는 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명의 방법에 기재된 치료학적 스위치 프로모터는 구조성이다. 특정한 양태에서, 치료학적 스위치 프로모터는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된다. 예를 들면, 당해 프로모터는 질병과 반응하여, 특정한 생리학적, 발달학적, 분화 또는 병인적 상태와 반응하여 및/또는 하나 이상의 생물학적 분자와 반응하여 활성화되고/되거나, 당해 프로모터는 특정한 조직 또는 세포 타입에서 활성화된다. 특정한 양태에서, 질병, 장애 또는 이상은 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 반응성이다. 예를 들면, 특정한 비제한적 양태에서, 치료학적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 증상을 치료, 예방, 완화 또는 감소시키고, 진행을 방지하거나 질병, 장애 또는 이상을 치유하는 데에 유용하지만, 이들 중 하나 또는 모두를 달성할 필요는 없다. 특정한 양태에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 리간드-의존성 전사 인자 복합체가 발현되도록 도입된다. 한 가지 양태에서, 치료학적 방법은 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드가 당해 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는데 충분한 수준으로 피검자를 통해 발현 및 전파되도록 수행된다. 본원에 사용된 바와 같이, "전파"는 당해 폴리펩티드가 변형된 세포로부터 충분히 발현 및 방출되어 피검자에서 효과 또는 활성을 가짐을 의미한다. 전파는 전신, 국소 또는 이들의 중간일 수 있다. 예를 들면, 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드는 혈류 또는 림프계를 통해 전신적으로 전파될 수 있다. 또는, 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드는 치료되는 조직 또는 기관에 국소적으로 전파될 수 있다.
한 가지 양태에서, 치료학적 방법은 본 발명의 조성물, 예를 들면, 상기한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 치료되는 피검자에게 직접 투여하여 폴리뉴클레오티드가 생체내에서 치료되는 피검자의 세포에 의해 흡수되도록 함으로써 실시되고, 하나 이상의 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본원의 다른 부분에 상세히 기재된 바와 같이 적절한 조건하에 이들 세포에 의해 발현될 것이다. 폴리뉴클레오티드는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 예를 들면, 백시니아 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 벡터 또는 엡스테인-바 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 제미니바이러스(geminivirus) 벡터 또는 카울리모바이러스(caulimovirus) 벡터; 비바이러스 벡터, 예를 들면, 리포좀과 복합체화된, 전달될 수 있는 플라스미드, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), 생고분자(biopolymer)를 포함하는 다양한 방법 또는 DNA-단백질 복합체로서 치료되는 피검자에게 직접 전달될 수 있다.
또 다른 양태에서, 치료학적 방법은 상기한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 변형된 세포에 함유된 치료되는 피검자 내로 도입함으로써 수행된다. 변형된 세포의 투여 후에, 하나 이상의 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본원의 다른 부분에서 상세히 기재된 바와 같이 적절한 조건하에 변형된 세포에 의해 발현된다. "변형된 세포"라는 용어는 상기한 적어도 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 세포 또는 세포들을 의미한다. 그 자체로서, "변형된 세포"는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 의미하고, 이는 치료되는 피검자로부터의 세포, 이와 관련된 세포이거나 세포가 아닐 수 있다. 이러한 세포는 본원에 기재된 "생물반응기" 또는 "생물반응기 장치"의 정의에 포함된다. 그러나, 본원에 정의된 바와 같이, "생물반응기" 또는 "생물반응기 장치"는 반드시 변형된 세포일 필요는 없고, 본원에 정의된 생물반응기 또는 생물반응기 장치는, 당해 세포(들)가 "변형된 세포"인지에 상관없이, 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 모든 세포 또는 세포들이다.
한 가지 양태에서, 치료학적 방법은 상기한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 조성물을 피검자로부터 분리된 세포, 즉 동종성 세포 내로 도입하여 변형된 세포를 생산함으로써 수행되고, 변형된 세포는 상기 피검자에게 다시 도입된다.
또는, 변형된 세포는 상기한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드와 같은 본 발명의 조성물을 피검자로부터 분리되지 않은 세포, 즉 이들이 피검자에 대해 비동종성인 세포 내로 도입하여 변형된 비동종성(MNA) 세포를 생산함으로써 수행된다. 이러한 MNA 세포는 치료되는 피검자에 대해 동종이계(allogeneic)일 수 있다. 즉, 이들은 피검자와 동일한 종의 유전학적으로 비동일한 구성원으로부터 유래된다. 예를 들면, 인간 피검자를 치료함에 있어서, 세포는 인간 세포일 수 있지만, 치료되는 피검자로부터 직접 유도되지는 않는다. 또는, MNA 세포는 치료되는 피검자에 대해 이종성일 수 있다. 즉, 이들은 치료되는 피검자와는 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들면, 인간 피검자를 치료함에 있어서, 당해 세포는 마우스 세포, 원숭이 세포 또는 돼지 세포일 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 MNA 세포는 다수의 세포 타입으로부터 생성될 수 있으며, 여기에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 비사멸 세포, 원시 세포 및 말단 분화 가능한 세포가 포함된다. 본 발명을 위해 MNA 변형된 세포를 생산하는데 적합한 세포의 비제한적 예는 C2C12 마우스 근아세포, HEK293 인간 태아 신장 세포, ARPE-19 세포, hMSC 세포, 췌장 섬 세포, MDCK 세포, BHK 세포, 하이브리도마 세포 CHO 세포, 성상세포 유래 세포, 올리고덴드로사이트 유래 세포, 근아세포 유래 세포, 부갑상선 유래 세포가 포함된다. 췌장 섬 세포를 사용하여 인간 피검자 치료용 변형 세포를 생산하는 특정한 양태에서, 췌장 섬 세포는 이종성, 예를 들면, 돼지 섬 세포일 수 있거나, 동종이계, 예를 들면, 해부용 시체로부터 유래된 인간 섬 세포일 수 있다.
한 가지 양태에서, 치료학적 방법은 생체내에서 수행된다.
한 가지 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터에 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 보다 큰 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 벡터의 일부분이다. 또 다른 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터에 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 조합하여 "핵산 조성물"을 형성할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
특정한 양태에서, 본 발명의 생물반응기는 피검자 내로 도입되기 전에 배리어에 의해 둘러싸여 있는(예를 들면, 캡슐화됨) 변형된 또는 비변형된 세포를 포함한다. 이러한 생물반응기는 각 개체로부터 동종 세포를 변형시키는 대신에 임의의 피검자에서 사용될 수 있다. 세포 캡슐화 방법은, 선택적 또는 비선택적으로 목적하는 생물학적 물질을 방출시키면서, 세포를 면역분리시키는 데에 사용되어 왔다. 개선된 구성적 특징 및/또는 면역 보호를 제공할 수 있는 캡슐화 조성물 및 이의 제조방법이 바람직할 수 있다. 이러한 조성물 및 방법은, 캡슐화된 세포가 치료되는 피검자 내에서 기계적, 화학적 또는 면역 파괴를 견딜 수 있고 추가로 조직을 유지하고 정상 대사 기능을 담당하는데 필요한 영양, 이온, 산소 및 기타 물질을 투과시키지만 면역화학 반응에 관여하는 타입의 세균, 임파구 및 거대 단백질을 투과시키지 않는 경우에 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 배리어는 당해 배리어 내에 함유된 변형된 또는 비변형된 세포에 의해 발현된 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전파하지만, 당해 세포와 피검자의 면역 시스템의 세포와의 직접적인 접촉을 방지한다. 배리어는 또한 비동종 또는 동종 변형된 또는 비변형된 세포가 도입 부위, 예를 들면, 순환되는 경우에 피검자에게 해를 유발할 수 있는 악성 세포로부터 이탈하는 것을 방지하는 기능을 할 수 있다. 한 가지 양태에서, 배리어는 선택적으로 투과가능한 배리어, 예를 들면, 호르몬 및 작은 펩티드와 같은 소형 분자에는 투과성이지만 항체와 같은 보다 큰 폴리펩티드에는 불투과성인 배리어이다. 예를 들면, 배리어는 분자량이 약 100,000 달톤 초과, 약 50,000 달톤 초과, 약 25,000 달톤 초과, 약 10,000 달톤 초과, 약 5,000 달톤 초과 또는 약 1,000 달톤 초과인 분자에 대해 불투광성일 수 있다.
소정수의 배리어 시스템이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 한 가지 양태에서, 예를 들면, 배리어는 하나 이상의 세포를 둘러싸는 등각 피막을 포함한다. 통상적으로, 등각 피막은 중합체 물질, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 하이드록시에틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(HEMA-MMA)로 제조된다. 등각 피막은 통상 소수의 변형된 세포, 예를 들면, 1 내지 10개 세포, 1 내지 20개 세포, 1 내지 30개 세포, 1 내지 50개 세포, 1 내지 70개 세포 또는 1 내지 90개 세포를 둘러싼다. [참조: Shoichet MS, Winn SR., Adv Drug Delivery Rev. 42:81-102 (2000), 이는 본원에서 참조로서 도입됨].
다른 양태에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배리어 시스템은 캡슐화 세포를 포함하는 생물반응기를 포함한다. 2개의 비제한적 캡슐화 방법, 마이크로캡슐화 및 매크로캡슐화는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 마이크로캡슐화에 있어서, 세포는 생물학적 적합성 캡슐화 물질에 현탁시킨 다음 비드형 구조체로 형성하는 반면, 마크로캡슐화에 있어서 당해 장치는 일반적으로 세포의 첨가 전에 제조되고 하나 이상의 합성 구성원으로 구성될 수 있다. 등각 피막과 비교하면, 캡슐화 세포를 포함하는 배리어 시스템은 크기를 보다 균질화시키는 경향이 있으며, 기공 크기가 균일하여 단백질 전파를 보다 잘 조절하는 경향이 있다. 캡슐화를 위해, 살아있는 세포 및 다른 감수성 물질은, 당해 세포 또는 생물질이 캡슐화 공정에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는 상태로 유지하고 장기간에 걸쳐 충분한 강도의 캡슐 형성을 지속시키기에 충분히 온화한 조건하에 처리할 수 있다.
살아있는 세포(들)는 캡슐화시킬 수 있고, 생성된 캡슐화된 세포(들)는 생물적합성 반투과성 막 내에 세포를 캡슐화시킴으로써 생체내 활성을 장기간 유지한다. 생물적합성을 증가시키는 한 가지 방법은 음전하를 갖는 생물적합성 물질의 외부 표면을 부가하는 것이다. 본원에 사용된 "생물적합성"이라는 용어는 순수한 캡슐 및 이의 내용물 모두를 공통으로 의미한다. 구체적으로, 이는 이식된 순수 캡슐화된 세포가 면역 시스템 또는 이물질 섬유화 반응과 같은 신체의 다양한 보호 시스템의 유해한 효과를 피하고 상당한 기간 동안 기능을 유지하는 능력을 의미한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 캡슐화된 세포를 포함하는 생물반응기는 특히, 세포에 대한 동물의 면역 반응이 최소화되어야 하는, 세포를 동물에게 투여하는 데에 유용하다. 항체, 효소 및 다른 생활성 물질을 생성하는 세포를 또한 투여할 수 있다. 본 발명의 피검자 내에서 작은 크기의 생성된 캡슐화된 세포는 주사, 주입 또는 이식에 의한 마이크로캡슐의 투여를 촉진시킨다.
살아있는 세포는 다양한 겔, 예를 들면, 알기네이트에 캡슐화되어 이식가능한 비드형 구조체, 예를 들면, 마이크로비드 또는 미소구체를 형성함으로써 치료되는 피검자에 이식되는 경우에 세포를 물리적으로 분리시킬 수 있다. 보다 작은 분자량의 물질, 예를 들면, 항체 및 보체(분자량 약 150 kDa)가 이들 비드형 구조체 내로 도입되는 것을 방지하기 위해, 이들은 기공 크기가 조절된 외부 쉘을 제공하는 폴리-L-리신, 키토산 또는 PAN-PVC 등의 물질로 피복시킬 수 있거나, 예를 들면, 가교결합에 의해 처리되어 이들의 내부 다공도를 조절할 수 있다. 유용한 물질의 추가의 예는 자연 또는 합성 중합체 또는 공중합체로 구성된 통상의 생물적합성 물질, 예를 들면, 폴리-L-리신-알기네이트, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 메틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크리레이트, MATRIGEL, VIRTOGEN, 폴리비닐알콜, 아가로즈, 폴리에틸렌 글리콜, 하이드로겔, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리하이드록시부티레이트-폴리하이드록시발레레이트, 공중합체, 폴리(락티드-코-카프롤락톤), 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리 13-하이드록시부티르산, 폴리안하이드라이드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테르라플루오로에틸렌, 폴리아크릴레이트(아크릴 공중합체 포함), 폴리비닐리덴, 폴리비닐 클로라이드 공중합체, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아미드, 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 니트레이트, 폴리설폰(폴리에테르 설폰 포함), 폴리포스파젠, 폴리아크릴로니트릴 및 폴리(아크릴릴/코비닐 클로라이드)를 포함한다.
캡슐화의 한 가지 형태는 마이크로캡슐화이고, 이는 세포를 액체 또는 젤라틴 캡슐화 물질에 현탁시킨 다음, 지지 입자 매트릭스, 예를 들면, 하이드로겔 매트릭스 내에서 형성하여 이식가능한 장치의 코어로서 사용하는 비드형 구조체를 형성한다. 당해 코어는 적절한 세포 분포를 유지하고, 강도를 제공하며, 세포 생존성, 수명 및 기능을 향상시킨다. 코어는 또한 면역분리에 관여할 수 있다. 또한, 이는 치료되는 피검자 내에서 바람직하지 않은 면역 반응을 유도할 수 있는 직접 세포-세포 상호작용으로부터 비드형 구조체 내에 함유된 내부 세포를 보호한다.
배리어 시스템은 다층을 함유할 수 있고, 예를 들면, 각각의 층은 상이한 목적(예를 들면, 지지, 투과성의 조절)을 위해 사용된다. 배리어는 이식된 세포의 적절한 배치를 보장하기 위해 배리어의 이미지화(예를 들면, x-선, 초음파 진단기 등)를 가능하게 하는 대비 제제 또는 다른 특성을 포함할 수 있다. 세포 이식에 유용한 배리어 시스템의 예는 각각 이의 전체가 본원에 참조로서 도입되는 미국 특허 제7,226,978호, 제RE39,542호 (아가로즈), 제6,960,351호, 제6,916,640호, 제6,911,227호 (폴리에틸렌 글리콜), 제6,818,018호, 제6,808,705호, 제6,783,964호, 제6,762,959호, 제6,727,322호, 제6,610,668호 (폴리-14-N-아세틸글루코사민(p-GlcNAc) 폴리사카라이드), 제6,558,665호, 제RE38,027호, 제6,495,161호, 제6,368,612호, 제6,365,385호, 제6,337,008호, 제6,306,454호 (폴리알킬렌), 제6,303,355호, 제6,287,558호 (겔 수퍼 매트릭스), 제6,281,015호, 제6,264,941호, 제6,258,870호, 제6,180,007호, 제6,126,936호 (폴리아민 산), 제6,123,700호, 제6,083,523호, 제6,020,200호, 제5,916,790호, 제5,912,005호, 제5,908,623호, 제5,902,745호, 제5,858,746호, 제5,846,530호 (폴리사카라이드), 제5,843,743호, 제5,837,747호, 제5,837,234호, 제5,834,274호, 제5,834,001호, 제5,801,033호, 제5,800,829호, 제5,800,828호, 제5,798,113호, 제5,788,988호, 제5,786,216호, 제5,773,286호, 제5,759,578호, 제5,700,848호, 제5,656,481호, 제5,653,975호, 제5,648,099호, 제5,550,178호, 제5,550,050호, 제4,806,355호, 제4,689,293호, 제4,680,174호, 제4,673,566호, 제4,409,331호, 제4,352,883호 및 U.S. 특허원 제2006/0263405호 (알기네이트/중합체) 및 제2004/0005302호 (알기네이트-폴리-L-라이신)에 기재되어 있다.
특정한 양태에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 배리어 시스템은 마이크로캡슐화 세포를 포함한다. 마이크로캡슐화는 캡슐화된 세포를 포함하는 대략 구형의 비교적 균일한 비드형 구조체를 생성하고, 여기서 비드형 구조체는 직경이 약 100-700㎛, 예를 들면, 직경이 약 100, 200, 300, 400, 500, 600 또는 700㎛이다. 본 발명의 마이크로캡슐화 세포는 상기한 바와 같은 다양한 캡슐화 물질을 사용하여 생산할 수 있다. 한 가지 양태에서, 캡슐화 물질은 하이드로겔을 포함한다. 또 다른 양태에서, 캡슐화 물질은 중합체를 포함한다. 적합한 중합체에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 셀룰로오즈, 예를 들면, 셀룰로오즈 설페이트 및 알기네이트가 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 마이크로캡슐은 상호작용하여 물리적 선택투과성 막 배리어를 형성하기 위해 폴리음이온성 알기네이트 및 폴리양이온성 중합체를 포함한다. 또 다른 마이크로캡슐화 방법은 폴리(L-락티드) 산 (PLLA) 또는 폴리-L-오르니틴 (PLO) 알기네이트 미소구체의 형성을 포함한다[참조: Darrabie, M.D. et al. Biomaterials 26:6846-6852 (2005) and Blasi, P. et al. Int J Pharm. 324:27-36 (2006)]. 알기네이트 기반 마이크로캡슐화 물질은 또한 생물분해성일 수 있는 초고점도(UHV) 중합체를 추가로 포함할 수 있다[참조: Zimmermann, U. et al. Ann N Y Acad Sci. 944: 199-215 (2001)].
마이크로캡슐화 세포를 포함하는 본 발명의 생물반응기는 통상 "비드"당 적어도 1개 내지 약 1000개 이하의 세포, 예를 들면, 본원에 기재된 목적하는 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 세포를 포함한다. 예를 들면, 마이크로캡슐화 세포를 포함하는 본 발명의 생물반응기는 "비드"당 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 800개 내지 약 1000개 또는 그 이상의 세포를 제공할 수 있다.
특정한 양태에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 생물반응기는 매크로캡슐화 장치에 함유된 세포를 포함한다. 마이크로캡슐화 세포를 포함하는 생물반응기와 비교하여, 매크로캡슐화 장치를 포함하는 생물반응기는 통상적으로 보다 큰 종종 비구형의 캡슐화 세포 물질이며, 상이한 조성의 동일한 조성물일 수 있는 하나 이상의 합성 막, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 8개, 10개 또는 그 이상의 막으로 구성될 수 있다. 명칭으로 표시한 바와 같이, 매크로캡슐화 세포 장치는 개개 물질이 용이하게 조작될 수 있도록 하는 크기를 갖는다. 예를 들면, 전형적인 매크로캡슐화 장치는 길이 약 3mm, 4mm, 5mm, 6mm, 7mm, 8mm, 9mm, 10mm 또는 그 이상 및 직경 약 1mm, 2mm, 3mm, 4mm, 5mm 또는 그 이상의 직사각형 형상일 수 있다. 예시적이나 비제한적인 본 발명의 매크로캡슐화 장치는 길이 약 6mm 및 직경 약 1mm이다.
특정한 양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 매크로캡슐화 장치는 2개 이상의 합성 막을 포함하고, 여기서 합성 막은 당해 장치를 통한 치료학적 분자의 통행 및 환경으로의 이들의 전파를 조절하기 위해 상이한 기공 크기를 갖는다. 특정한 양태에서, 본 발명의 매크로캡슐화 장치는 반투과성 중합체 외부 막 및 세포를 지지하기 위한 내부 골격을 포함한다. 비제한적 예에서, 외부 막은 약 15nm의 기공을 포함하여 치료학적 분자의 영양 교환을 가능하게 한다. 내부 골격은 소정 수의 물질을 포함할 수 있다. 한 가지 비제한적 예에서, 당해 골격은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 사(yarn)(Neurotech로부터 시판됨 (www.neurotechusa.com))를 포함한다.
또 다른 비제한적 예에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 매크로캡슐화 장치는 고분자성 막 이중층을 포함하고, 여기서 이중층은 보다 내부 밀착성의 기공 0.45 μM PTFE 면역배리어 층(Theracyte로부터 시판됨(www.theracyte.com)) 위에 적층된 5㎛ 폴리(테트라플루오로에틸렌)(PTFE) 막의 외부 층을 포함한다. 이러한 매크로캡슐화 장치는 고분자성 막 이중층의 외부에 있는 부직포 폴리 메쉬 층을 포함한다. 또 다른 비제한적 예에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 매크로캡슐화 장치는 폴리에테르설폰(PES) 중공 섬유로 구성된다[참조: Li, Y., et al. J. Membrane Sd. 245:53-60 (2004)].
본 발명에서 사용하기에 적합한 매크로캡슐화 장치는 임의로 추가의 구조체를 포함하여 치료되는 피검자 내로의 편리한 이식 및 피검자로부터의 회수를 가능하게 한다. 예를 들면, 매크로캡슐화 장치는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 봉합 클립, 적재 포트, 사슬 또는 사용을 용이하게 하기 위한 기타 구조물을 포함할 수 있다.
본 발명의 매크로캡슐화 장치의 내부 공간은 통상 적어도 1개 내지 약 105개 세포, 예를 들면, 목적하는 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 변형된 또는 비변형된 세포를 포함시키는 데에 적합하다. 예를 들면, 본 발명의 매크로캡슐화 장치는 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 2,000개, 적어도 4,000개, 적어도 5,000개, 적어도 8,000개 내지 약 10,000개 또는 그 이상의 세포를 포함한다.
일부 생물반응기 장치, 예를 들면, 목적하는 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 본 발명의 캡슐화된 또는 피복된, 변형된 또는 비변형된 세포는 보호 세포를, 예를 들면, 배리어 또는 캡슐의 내부에 추가로 포함할 수 있고, 여기서 보호 세포는 목적하는 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 변형된 또는 비변형된 세포를 보호할 수 있다. 이러한 보호 세포의 비제한적 예에는 변형된 또는 비변형된 세르톨리 세포 및 적혈구가 포함된다. 추가로, 일부 생물반응기 장치, 예를 들면, 목적하는 치료학적 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 분비하도록 의도된 본 발명의 캡슐화된 또는 피복된, 변형된 또는 비변형된 세포는 보다 적합성 또는 보호성의 마이크로 환경을 생성할 수 있는 외부 피막을 추가로 포함할 수 있다. 생성될 수 있는 예시의 비제한적인 마이크로 환경에는 소염 마이크로 환경 및 전-혈관형성 마이크로 환경이 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 생물반응기 장치는 "안전성-차단" 메카니즘을 갖는 변형된 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 생물반응기 장치에 함유된 변형된 세포는 치사 폴리펩티드를 코딩하는 조절된 자살 유전자를 포함하고, 여기서 당해 유전자는 활성화시에 변형된 세포 자체의 파괴를 유도할 수 있다. 예를 들면, 변형된 세포는 배리어 시스템으로부터 벗어나거나 종양원성 전환를 받는 경우에 사멸하도록 프로그래밍될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 치사 폴리펩티드의 비제한적 예에는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
치료학적 방법이 수행되는 피검자는 치료 또는 예방이 요구되는 임의의 피검자일 수 있다. 예를 들면, 피검자는 질병, 장애 또는 이상의 하나 이상의 징후를 나타내는 것일 수 있다. 피검자는 또한 유전적, 가계력 또는 환경상 노출에 기인하여 질병, 장애 또는 이상에 걸리기 쉬운 것일 수 있다. 피검자는, 예를 들면, 모집단에서 질병, 장애 또는 이상에 대한 보호차원의 면역화의 일부로서 일반 공중의 구성원일 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료 또는 예방되는 질병, 장애 또는 이상은 하나 이상의 치료학적 스위치 프로모터가 이용될 수 있는 임의의 질병, 장애 또는 이상일 수 있다. 본 발명의 방법으로 치료 또는 예방될 수 있는 질병 또는 장애의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 과증식성 질병, 장애 또는 이상(예: 암), 심혈관 질병, 장애 또는 이상, 신경 질병, 장애 또는 이상, 자가면역 질병, 장애 또는 이상, 골 질병, 장애 또는 이상, 위장 질병, 장애 또는 이상, 혈액 질병, 장애 또는 이상, 대사 질병, 장애 또는 이상, 염증 질병, 장애 또는 이상 및 감염 질병, 장애 또는 이상이 포함된다.
본 발명의 치료학적 스위치 프로모터는 특정한 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 데에 유용한 임의의 프로모터일 수 있다. 이의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 특정한 질병, 장애 또는 이상의 기간 동안에만 증가된 발현을 나타내는 유전자 프로모터, 특정한 세포 조건(예: 증식, 아폽토시스, pH 변화, 산화 상태, 산소 수준)하에 증가된 발현을 나타내는 유전자 프로모터가 포함된다. 유전자 스위치가 하나 이상의 전사 인자 서열을 포함하는 일부 양태에서, 치료학적 방법의 특이성은 질병- 또는 이상-특이적 프로모터를 조직- 또는 세포 타입-특이적 프로모터와 조합하여 치료학적 생성물이 발현되는 조직을 제한함으로써 증가시킬 수 있다. 따라서, 조직- 또는 세포 타입-특이적 프로모터는 치료학적 스위치 프로모터의 정의 내에 포함된다.
질병-특이적 프로모터의 예로서, 암의 치료에 유용한 프로모터에는 종양유전자의 프로모터가 포함된다. 종양유전자 부류의 예로서는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 단백질 키나제, 프로그램화 세포 치사 조절제 및 전사 인자가 포함된다. 종양유전자의 구체적인 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc 및 bcl-2 및 TERT가 포함된다. 기타 암-관련 유전자의 예에는, 신생물 세포에서 과발현되는 종양 관련 항원 유전자 및 기타 유전자(예를 들면, MAGE-I, 암배아 항원, 티로시나제, 전립선 특이적 막 항원, p53, MUC-I, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-I, gplOO, GM2, Tn, sTn, 및 Thompson-Friedenreich antigen(TF))가 포함된다.
당해 기술분야에 공지되어 있고 본 발명에서 치료학적 스위치 프로모터로서 유용한 프로모터 서열 및 기타 조절 요소(예: 인핸서)의 예는 각 프로모터와 관련된 질병/장애(표 1) 또는 조직 특이성(표 2)과 함께 하기 표 1 및 2에 수록된 참조에 개시되어 있다. 이들 참조에 개시된 프로모터 서열은 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
프로모터 서열 | 질병/장애 | 등록/공개 번호 |
Her-2/neu (ERBB2/c-erbB-2) | 암 | 5,518,885 |
오스테오칼신(osteocalcin) | 칼신화된 종양(calcified tumor) | 5,772,993 |
스트로멜신-1(stromelysin-l) | 암 | 5,824,794 |
전립선 특이 항원(prostate specific antigen) | 전립선암(prostate cancer) | 5,919,652 |
hSIN(human sodium-iodide symporter) | 갑상선 암종 (thyroid carcinoma) |
6,015,376 |
H19, IF-I, IGF-2 | 암 | 6,306,833 |
티모신(thymosin) β15 | 유방암(breast cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer) | 6,489,463 |
T 세포 인자(T cell factor) | 암 | 6,608,037 |
연골-유래 레티노산-민감성 단백질(cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein) | 연골 육종(chondrosarcoma), 유방 종양(mammary tumor) | 6,610,509 |
인슐린(insulin) | 췌장암(pancreatic cancer) | 6,716,824 |
PEG-3 | 암 | 6,737,523 |
텔로머라아제 역전사효소 (telomerase reverse transcriptase, TERT) |
암 | 6,777,203 |
멜라노마 분화 관련 유전자-7 (melanoma differentiation associated gene-7, MDA-7) |
암 | 6,841,362 |
프로스타신(prostasin) | 암 | 6,864,093 |
텔로머라아제 촉매 소단위체 (telomerase catalytic subunit); 사이클린-A(cyclin-A) |
암 | 6,936,595 |
MK(midkine); c-erbB-2 | 암 | 7,030,099 |
전립선-특이 막 항원 (prostate-specific membrane antigen) |
전립선암 | 7,037,647 |
p51 | 암 | 7,038,028 |
텔로머라아제(telomerase RNA) | 암 | 7,084,267 |
PAP(prostatic acid phosphatase) | 전립선암 | 7,094,533 |
PCA3dd3 | 전립선암 | 7,138,235 |
DF3lMUCI | 암 | 7,247,297 |
hex II | 암 | 2001/0011128 |
사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase-2) |
암 | 2002/0107219 |
슈퍼 PSA(super PSA) | 전립선암 | 2003/0078224 |
skp2 | 암 | 200310109481 |
PRL-3 | 전이성 결장암(metastatic colon cancer) | 2004/0126785 |
CA125/M17S2 | 난소암(ovarian cancer) | 2004/0126824 |
IAI.3B | 난소암 | 2005/0031591 |
CRG-L2 | 간암(liver cancer) | 2005/0124068 |
TRPM4 | 전립선암 | 2006/0188990 |
RTVP | 신경교종(glioma) | 2006/0216731 |
TARP | 전립선암, 유방암 | 2007/0032439 |
텔로머라아제 역전사효소 | 암 | 2007/0059287 |
A4 아밀로이드 단백질 (A4 amyloid protein) |
알츠하이머(Alzheimer's disease) | 5,151,508 |
아밀로이드 β-단백질 전구체 (amyloid β-protein precursor) | 알츠하이머(Alzheimer's disease) | 5,643,726 |
알츠하이머 A4 아밀로이드 단백질의 전구체(precursor ofthe Alzheimer's Disease A4 amyloid protein) | 알츠하이머(Alzheimer's disease) | 5,853,985 |
신경펩티드 FF(neuropeptide FF) | CNS 장애(CNS disorders) | 6,320,038 |
ER 스트레스 요소(endoplasmic reticulum stress elements) | 스트레스 |
7,049,132 |
우로코르틴 II(urocortin II) | 정신병(psychopathologies) | 7,087,385 |
타이로신 수산화효소 (tyrosine hydroxylase) |
신경학적 장애 (neurological disorders) |
7,195,910 |
보체 3(complement factor 3); 세럼 아밀로이드 A3(serum amyloid A3) |
염증(inflammation) | 5,851,822 |
금속단백분해효소-3의 조직 억제제(tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3) | 류머티즘(rheumatism), 암, 자가면역질환(autoimmune disease), 염증 |
5,854,019 |
p75 종양괴사인자 수용체(tumor necrosis factor receptor) | 자가면역질환 |
5,959,094 |
종양괴사인자-α | 염증 | 6,537,784 |
퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator activated receptor)/IIA-1 췌장이 아닌 곳에서 분리된 포스포리파제 A2(IIA-1 nonpancreatic secreted phospholipase A2) | 염증 | 6,870,044 |
SOCS-3 | 성장 장애, 자가면역질환, 염증 | 2002/0174448 |
SR-BI | 지질 장애(lipid disorders) | 5,965,790 |
Ob | 비만(obesity) | 5,698,389 |
영역-1 프로테아제 (site-l protease) |
비만, 당뇨병(diabetes) |
7,045,294 |
TIGR | 녹내장(glaucoma) | 7,138,511 |
VL30 | 무산소증(anoxia) | 5,681,706 |
흥분성 아미노산 수용체-2 (excitatory amino acid transporter-2) |
신경계 극소빈혈 (nervous system ischemia) |
2004/0171108 |
MDTS9 | 신장부전증(renal failure) | 2006/0014931 |
LIM, 피롤린 5-카복실레이트 리덕타제(pyrroline 5-carboxylate reductase), SIM2 |
전립선 장애 (prostate disorders) |
2006/0134688 |
Bax | 아폽토시스(apoptosis) | 5,744,310 |
fas | 아폽토시스 | 5,888,764 |
bbc3 | 아폽토시스 | 7,202,024 |
PINK-l | PI-3 키나아제/Akt 경로 장애 | 2006/0228776 |
프로모터 서열 | 조직 특이성 | 등록/공개 번호 |
트로포닌 T(troponin T) | 골격근(skeletal muscle) | 5,266,488 |
미오D(myoD) | 근육 | 5,352,595 |
액틴(actin) | 근육 | 5,374,544 |
평활근 22a(smooth muscle 22a) | 동맥 평활근 (arterial smooth muscle) |
5,837,534 |
유트로핀(utrophin) | 근육 | 5,972,609 |
미오스타틴(myostatin) | 근육 | 6,284,882 |
평활근 미오신 중쇄(smooth muscle myosin heavy chain) | 평활근(smooth muscle) | 6,780,610 |
심장 안키린 반복 단백질 (cardiac ankyrin repeat protein) | 심근(cardiac muscle) | 7,193,075 |
MLP | 근육 | 2002/0042057 |
스무테린(smoothelin) | 평활근 | 2003/0157494 |
MYBPC3 | 심근(cardiomyocytes) | 2004/0175699 |
Tαl α-튜불린(tubulin) | 뉴런 | 5,661,032 |
세포간 부착 분자-4 (intercellular adhesion molecule-4, ICAM-4) |
뉴런 | 5,753,502 |
γ-아미노뷰티르산 형태 A 수용체 β1 소단위체 (γ-aminobutyric acid type A receptor β1 subunit) |
해마(hippocampus) | 6,066,726 |
신경성 니코닌 아세틴콜린 수용체 β2-소단위체(neuronal nicotinic acetylcholine receptor β2-subunit) | 뉴런 | 6,177,242 |
프리세닐린-1(presenilin-1) | 뉴런 | 6,255,473 |
칼슘-칼모둘린-의존 키나아제 IIα (calcium-calmodulin-dependent kinase IIα) |
전뇌(forebrain) | 6,509,190 |
CRF2 α 수용체 | 뇌 | 7,071,323 |
신경 성장 인자 (nerve growth factor) |
뉴런 | 2003/159159 |
GLP-2 수용체 | 내장(gut), 뇌 | 2002/0045173 |
타입 I 트랜스글루타미나아제 | 케라티노사이트 (keratinocytes) |
5,643,746 |
K14 | 케라티노사이트 | 6,596,515 |
스테아릴-CoA 디새튜레이스 (stearoyl-CoA desaturase) |
피부 | 2002/0151018 |
멕신(megsin) | 신장 세포(renal cells) | 6,790,617 |
프로락틴(prolactin) | 뇌하수체(pituitary) | 5,082,779 |
GDF-9 | 난소(ovary), 고환(testes), 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체, 태반(placenta) |
7,227,013 |
PSP94 | 전립선 | 2003/0110522 |
NRL;NGAL | 젖샘(mammary gland) | 5,773,290 |
long whey acidic protein | 젖샘 | 5,831,141 |
유방 관련 아밀로이드 A (mammary associated amyloid A) | 유방 관 상피 세포 (mammary ductal epithelial cells) |
2005/0107315 |
엔도셀린-1(endothelin-1) | 내피세포(endothelial cells) |
5,288,846 |
세르글라이신(serglycin) |
조혈세포(hematopoietic cells) |
5,340,739 |
혈소판-내피세포 부착 분자 (platelet-endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1) |
혈소판, 백혈구(leukocytes), 내피세포 |
5,668,012 |
Tie 수용체 티로신 키나아제 | 내피세포, 골수(bone marrow) |
5,877,020 |
KDR/flk-1 |
내피세포 |
5,888,765 |
엔도글린(endoglin) |
내피세포 |
6,103,527 |
CCR5 |
골수 및 임파 세포 (myeloid and lymphoid cells) |
6,383,746 |
CD11d |
골수세포 |
6,881,834 |
혈소판 당단백질 lIb (platelet glycoprotein lIb) |
조혈세포 |
6,884,616 |
프리프로엔도셀린-1 (preproendothelin-1) |
내피세포 |
7,067,649 |
인터루킨-18 결합 단백질 (interleukin-18 binding protein) |
단핵세포 | 2006/0239984 |
CD34 | 조혈간세포 (hematopoietic stem cells ) |
5,556,954 |
Tee 티로신 키나아제 | 조혈간세포, 간 | 6,225,459 |
특정한 질병 또는 장애 동안 발현 수준의 변화를 나타내고 따라서 본 발명에서 유용한 프로모터를 제공할 수 있는 기타 유전자에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 하기 표 3에 수록된 유전자(관련 질병/장애와 함께)가 포함된다.
유전자 | 질병/장애 | 등록/공개 번호 |
MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, APC | 대장암(Colorectal cancer) | 7,148,016 |
LEF-1 | 결장암(Colon cancer) | 2002/0169300 |
F2 수용체 | 결장암 | 2002/0187502 |
TGF-β 타입 II 수용체 | 결장암 | 2004/0038284 |
EYA4 | 결장암 | 200510003463 |
PCA3 | 전립선암 | 7,138,235 |
K2 | 전립선암 | 6,303,361 |
PROST 03 | 전립선암 전이 (Prostate cancer metastases) |
2002/0009455 |
PCAM-1 | 전립선암 | 2002/0042062 |
PCADM-1 | 전립선암 | 2003/0100033 |
PCA3dd3 | 전립선암 | 2003/0165850 |
PCAV | 전립선암 | 2006/0275747 |
PAcP | 안드로겐-불감성 전립선암 (Androgen-insensitive prostate cancer) | 2006/0294615 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 등록특허 제5,866,329호의 SEQ ID NO: 1 | 간암 | 5,866,329 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2002/0115094호의 SEQ ID NOS: 1,3 | 간세포암 (Hepatocellular cancer) |
2002/0115094 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2005/0037372호의 SEQ ID NO: 1 | 간세포 암종(Hepatocellular carcinoma) | 2005/0037372 |
ATB0 | 간세포 암종 | 2006/0280725 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0042420호의 SEQ ID NOS: 1,3 | 간암 | 2007/0042420 |
CSA-1 | 연골육종(Chondrosarcoma) | 2001/0016649 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2001/0016651호의 SEQ ID NOS: 1-15 | 췌장암(Pancreatic cancer) | 2001/0016651 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2003/0212264호의 SEQ ID NOS: 1-15 | 췌장암 | 2003/0212264 |
SYG972 | 유방암(Breast cancer) | 2002/0055107 |
Urb-ctf | 유방암 | 2003/0143546 |
BCU399 | 유방암 | 2003/0180728 |
TBX2 | 유방암 | 2004/0029185 |
Cyr61 | 유방암 | 2004/0086504 |
DIAPH3 | 유방암 | 2005/0054826 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0134669호의 SEQ ID NOS: 1-24 | 유방암 | 2007/0134669 |
사람 아스파틸(아스파라지닐)베타-하이드시스레이스 (Human aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase) |
CNS 암 | 2002/0102263 |
BEHAB | CNS 암 | 2003/0068661 |
IL-8 | 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma) | 2003/0096781 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2002/0198362호의 SEQ ID NOS: 1-278 | 혈액 암(Hematological cancer) | 2002/0198362 |
BLSA | B-세포 암 | 2003/0147887 |
BPI | 백혈병(Leukemia) | 2003/0171273 |
DAP-키나아제, HOXA9 | 비-소세포폐암 (Non-small cell lung cancer) |
2003/0224509 |
ARP | 투명 세포 신장 암종(Clear cell renal carcinoma), 염증성 장애(inflammatory disorders) |
2004/0010119 |
Nbk | 신장암(Renal cancer) | 2005/0053931 |
CD43 | 난소암 | 2006/0216231 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0054268호의 SEQ ID NOS: 1-84 | 난소암 | 2007/0054268 |
β7-hcG, β6-hCG, β6e-hCG, β5-hCG, β8-hcG, β3-hCG |
자궁종양(Uterine tumors) | 2006/0292567 |
MTAls | 호르몬 불감성 암 (Hormone insensitive cancer) |
2006/0204957 |
Old-35, Old-64 | 종양 증식 (Tumor proliferation) |
2003/0099660 |
LAGE-l | 암 | 6,794,131 |
CIF150/hTAFII150 | 암 | 6,174,679 |
P65 종양세포생성 단백질 (oncofetal protein) | 암 | 5,773,215 |
텔로머라아제 | 암 | 2002/0025518 |
CYPIBI | 암 | 2002/0052013 |
14-3-3cσ | 암 | 2002/0102245 |
NESI | 암 | 2002/0106367 |
CAR-l | 암 | 2002/0119541 |
HMGI,MAG | 암 | 2002/0120120 |
ELL2 | 암 | 2002/0132329 |
Ephrin B2 | 암 | 2002/0136726 |
WAF1 | 암 | 2002/0142442 |
CIF130 | 암 | 2002/0143154 |
C35 | 암 | 2002/0155447 |
BMP2 | 암 | 2002/0159986 |
BUB3 | 암 | 2002/0160403 |
폴리머라제 카파 (Polymerase kappa) |
암 | 2003/0017573 |
EAGl,EAG2 | 암 | 2003/0040476 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2003/0044813호의 SEQ ID NOS: 18,20,22 | 암 | 2003/0044813 |
HMGI | 암 | 2003/0051260 |
HLTF | 암 | 2003/0082526 |
Barx2 | 암 | 2003/0087243 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2003/0108920호의 SEQ ID NOS: 18,20,22,32,34,36 | 암 | 2003/0108920 |
케이블(Cables) | 암 | 2003/0109443 |
Pp 32r1 | 암 | 2003/0129631 |
BMP4 | 암 | 2003/0134790 |
TSlOq23.3 | 암 | 2003/0139324 |
핵 스핀들-관련 단백질 (Nuclear spindle-associating protein) |
암 | 2003/0157072 |
PFTAIRE | 암 | 2003/0166217 |
SEMA3B | 암 | 2003/0166557 |
MOGp | 암, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 염증성 질환(inflammatory disease) | 2003/0166898 |
포틸린(Fortilin) | 암 | 2003/0172388 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2003/0215833호의 SEQ ID NOS: 1 | 암 | 2003/0215833 |
IGFBP-3 | 암 | 2004/0005294 |
폴리호메오 2(Polyhomeotic 2) | 암 | 2004/0006210 |
PNQALRE | 암 | 2004/0077009 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2004/0086916호의 SEQ ID NOS: 1,3 | 암 | 2004/0086916 |
SCN5A | 암 | 2004/0146877 |
miRl5, miR16 | 암 | 2004/0152112 |
헤드핀(Headpin) | 암 | 2004/0180371 |
PAOh1/SMO | 암 | 2004/0229241 |
Hippo, Mst2 | 암 | 2005/0053592 |
PSMA-유사(PSMA-like) | 암, 신경학적 장애 | 2005/0064504 |
JAB1 | 암 | 2005/0069918 |
NF-AT | 암 | 2005/0079496 |
P28ING5 | 암 | 2005/0097626 |
MTG16 | 암 | 2005/0107313 |
ErbB-2 | 암 | 2005/0123538 |
HDAC9 | 암 | 2005/0130146 |
GPBP | 암 | 2005/0130227 |
MG20 | 암 | 2005/0153352 |
KLF6 | 암 | 2005/0181374 |
ARTS1 | 암 | 2005/0266443 |
독 3(Dock 3) | 암 | 2006/0041111 |
아넥신 8 | 암 | 2006/0052320 |
MH15 | 암 | 2006/0068411 |
델타-N p73 | 암 | 2006/0088825 |
RapR6 | 암 | 2006/099676 |
스타DI0(StarDI0) | 암 | 2006/0148032 |
Cizl | 암 | 2006/0155113 |
HLJ1 | 암 | 2006/0194235 |
RapR7 | 암 | 2006/0240021 |
A34 | 암 | 2006/0292154 |
Sef | 암 | 2006/0293240 |
킬린(Killin) | 암 | 2007/0072218 |
SGA-IM | 암 | 2007/0128593 |
TGFβ 타입 II 수용체 | 암 | 2002/0064786 |
GCA-관련 유전자 | 거대 세포 동맥염 (Giant cell arteritis) |
6,743,903 |
PRV-l | 적혈구증가증 (Polycythemia vera) |
6,686,153 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 등록특허 제5,948,637호의 SEQ ID NOS: 2, 4 | 극소빈혈 | 5,948,637 |
Vezf1 | 혈관성 장애 (Vascular disorders) |
2002/0023277 |
MLP | 확장성 심근증 (Dilatative cardiomyopathy) |
2002/0042057 |
VEGI | 병리학적 혈관신생 (Pathological angiogenesis) |
2002/0111325 |
PR0256 | 심혈관성 장애 (Cardiovascular disorders) |
2002/0123091 |
AOP2 | 죽상동맥경화증 (Atherosclerosis) |
2002/0142417 |
레모델린(Remodelin) | 동맥 재협착(Arterial restenosis), 섬유증(fibrosis) | 2002/0161211 |
포스포디에스터레이즈 4D (Phosphodiesterase 4D) |
뇌졸증(Stroke) | 2003/0054531 |
프로스타글란딘 수용체 서브타입 EPS(Prostaglandin receptor subtype EP3) | 말초동맥폐쇄증(Peripheral arterial occlusive disease) | 2003/0157599 |
CARP | 심장 장애(Heart disorders) | 2004/0014706 |
HOP | Congenital heart disease | 2004/0029158 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2004/0087784호의 SEQ ID NOS: 1-4 | 중풍(Apoplexy) | 2004/0087784 |
PLTP | 죽상동맥경화증, 혈관성 장애, 과다콜레스테롤(hypercholesterolemia), 탕헤르 질환(Tangier's disease), 가족성 HDL 결핍증(familial HDL deficiency disease) | 2006/0252787 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0160996호의 SEQ ID NOS: 1,3-8, 15, 16 | 혈전(Thrombosis) | 2007/0160996 |
UCP-2 | 뇌졸증 | 2002/0172958 |
FLJ1lO11 | 판코니 빈혈(Fanconi's Anemia) | 2006/0070134 |
코다닌-1(Codanin-l) | 빈혈(Anemia) | 2006/0154331 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 등록특허 제5,763,591호의 SEQ ID NOS: 1,6,8 | 인슐린 의존성 당뇨병 (Insulin-dependent diabetes mellitus) |
5,763,591 |
레시스틴(Resistin) | 타입 II 당뇨병 (Type II diabetes) |
2002/0161210 |
아치페린(Archipelin) | 당뇨병 | 2003/0202976 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2004/0053397호의 SEQ ID NOS: 2, 7, 16,27 | 당뇨병, 고지혈증 | 2004/0053397 |
뉴로나틴(Neuronatin) | 대사 장애 (Metabolic disorders) |
2004/0259777 |
NcbSor | 당뇨병 | 2005/0031605 |
7B2 | 내분비 장애 (Endocrine disorders) |
2005/0086709 |
PTHrP, PEX | 대사성 골 질환(Metabolic bone diseases) | 2005/0113303 |
KChIPl | 타입 II 당뇨병 | 2005/0196784 |
SLIT-3 | 타입 II 당뇨병 | 2006/0141462 |
CX3CRI | 타입 II 당뇨병 | 2006/0160076 |
SMAP-2 | 당뇨병 | 2006/0210974 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2006/0228706호의 SEQ ID NOS: 2, 8, 12, 16, 22, 26, 28, 32 | 타입 II 당뇨병 | 2006/0228706 |
IC-RFX | 당뇨병 | 2006/0264611 |
E2IG4 | 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만 | 2007/0036787 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0122802호의 SEQ ID NOS: 2, 8, 10, 14, 18,24,26,30,34,38,44,50,54,60,62,68,74,80,86,92,98,104,110 | 당뇨병 | 2007/0122802 |
UCP2 | 체중 장애(Body weight disorders) | 2002/0127600 |
Ob 수용체 | 체중 장애 | 2002/0182676 |
Ob | 체중 장애 | 2004/0214214 |
Dpl | 퇴행성 신경계 장애 (Neurodegenerative disorders) |
2001/0021771 |
NRG-l | 정신분열증(Schizophrenia) | 2002/0045577 |
시냅신 III(Synapsin III) | 정신분열증 | 2002/0064811 |
NRG1AG1 | 정신분열증 | 2002/0094954 |
AL-2 | 신경 장애(Neuronal disorders) | 2002/0142444 |
프롤린 탈수소효소 (Proline dehydrogenase) |
양극성 장애(Bipolar disorder), 우울증(major depressive disorder), 정신분열증, 강박장애(obsessive compulsive disorder) | 2002/0193581 |
MNR2 | 만성 퇴행성 신경계 장애(Chronic neurodegenerative disease) | 2002/0197678 |
ATM | 모세혈관확장성운동실조증 (Ataxia-telangiectasia) |
2004/0029198 |
Ho-l | 치매(Dementing diseases) | 2004/0033563 |
CON202 | 정신분열증 | 2004/0091928 |
Ataxin-I | 퇴행성 신경계 장애 | 2004/0177388 |
NR3B | 운동 뉴런 장애(Motor neuron disorders) | 2005/0153287 |
NIPA-l | 유전성 강직성 대마비 (Hereditary spastic paraplegia) |
2005/0164228 |
DEPP,아드레노메둘린 (adrenomedullin), csdA |
정신분열증 | 2005/0227233 |
Inf-20 | 퇴행성 신경계 질환 | 2006/0079675 |
EOPA | 뇌발달 및 퇴행성 장애(Brain development and degeneration disorders) | 2007/0031830 |
SERT | 자폐증(Autism) | 2007/0037194 |
FRP-1 | 녹내장(Glaucoma) | 2002/0049177 |
세럼 아밀로이드 A (Serum amyloid A) |
녹내장 | 200510153927 |
BMP2 | 골다공증(Osteoporosis) | 2002/0072066 |
BMPR1A | 연소성 용종증 (Juvenile polyposis) |
2003/0072758 |
ACLP | 배벽결손증(Gastroschisis) | 2003/0084464 |
레시스틴-유사 분자 β (Resistin-like molecule β) | 가족성 선종성 용종증(Familial adenomatous polyposis), 당뇨병, 인슐린 저항성, 결장암, 염증성 장 장애(inflammatory bowel disorder) |
2003/0138826 |
Dlg5 | 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease) |
2006/0100132 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2002/0119452호의 SEQ ID NOS: 1-82 | 골관절염(Osteoarthritis) | 2002/0119452 |
TRANCE | 면역계 장애 (Immune system disorders) |
2003/0185820 |
마트릴린-3(Matrilin-3) | 골관절염 | 2003/0203380 |
시노비올린(Synoviolin) | 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis) |
2004/0152871 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0028314호의 SEQ ID NOS: 9, 35 | 골관절염 | 2007/0028314 |
HIV LTR | HIV 감염 | 5,627,023 |
SHIVA | HIV 감염 | 2004/0197770 |
EBI 1, EBI 2, EBI 3 | 엡스타인 바 바이러스 감염 (Epstein Barr virus infection) |
2002/0040133 |
NM23 패밀리 | 피부/장 장애(Skin/intestinal disorders) | 2002/0034741 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2002/0169127호의 SEQ ID NOS: 1 | 건선(Psoriasis) | 2002/0169127 |
Eps8 | 피부 장애(Skin disorders), 상처 치유(wound healing) | 2003/0180302 |
Beta-lO | 갑상샘 병리학 (Thyroid gland pathology) |
2002/0015981 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2003/0207403호의 SEQ ID NOS: 2 | 갑상선 상태(Thyroid conditions) | 2003/0207403 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2007/0020275호의 SEQ ID NOS: 3 | 갑상선 장애(Thyroid disorders) | 2007/0020275 |
모낭 성장 인자(Hair follicle growth factor) | 탈모(Alopecia) | 2003/0036174 |
코르네오데스모신(Corneodesmosin) | 탈모 | 2003/0211065 |
GCR9 | 천식(Asthma), 림프종(lymphoma), 백혈병 | 2003/0166150 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2004/0002084호의 SEQ ID NOS: 1-71 | 천식 | 2004/0002084 |
Bg | 체디악-히가시 증후군 (Chediak-Higashi syndrome) | 2002/0115144 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2002/0127555호의 SEQ ID NOS: 1-16 | 자궁내막증(Endometriosis) | 2002/0127555 |
FGF23 | 저인산혈증 장애(Hypophosphatemic disorders) | 2005/0156014 |
BBSR | 바뎃-비에들 증후군(Bardet-Biedl syndrome) | 2003/0152963 |
MIC-l | 태아 이상(Fetal abnormalities), 암, 염증성 장애, 낙태 (miscarriage), 조산(premature birth) | 2004/0053325 |
MIA-2 | 간 손상 | 2004/0076965 |
IL-17B | 연골 퇴행성 장애(Cartilage degenerative disorders) | 2004/0171109 |
포밀글라이신 생산 효소(Formylglycine generating enzyme) | 다발성 설파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency) | 2004/0229250 |
LPLA2 | 폐포단백증(Pulmonary alveolar proteinosis) | 2006/0008455 |
CXCL10 | 호흡기 병(Respiratory illnesses) | 2006/0040329 |
본원에서 참조로서 도입된, 미국 공개특허 제2006/0140945호의 SEQ ID NOS: 1,2 | 신장병(Nephropathy) | 2006/0140945 |
HFE2A | 철 대사 질환(Iron metabolism disease) | 2007/0166711 |
질병, 장애 또는 이상 동안 조절된 발현 패턴을 갖는 유전자가 동정되면, 유전자 프로모터를 본 발명의 유전자 스위치에 사용할 수 있다. 프로모터 영역을 포함하는 다수의 유전자 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있고 공공 데이타베이스, 예를 들면, GenBank에서 입수할 수 있다. 따라서, 적절한 유전자가 동정되면, 프로모터 서열은 용이하게 동정하고 수득할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 프로모터가 분리되어 유전자 스위치 내에 위치될 수 있는 적합한 유전자를 동정하는 것에 관한 것이다. 따라서, 유전자의 동정은 본 발명의 특정한 양태에 중요하지 않을 수도 있지만, 단 프로모터는 분리되어 후속 세팅 또는 환경에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 아직 동정되지 않은 유전자로부터 프로모터의 용도를 포함한다. 적합한 유전자가 동정되면, 프로모터 기능에 요구되는 유전자 서열을 결정하는 것은 통상의 기술 또는 실험에 관한 사항이다. 실제로, 몇몇 상업적 프로토콜이 관심있는 유전자의 프로모터 영역의 결정을 보조하기 위해 실존한다. 예를 들면, 딩(Ding) 등은 최근에 인간 Sprouty4 유전자의 5'-플랭킹 서열을 혁신적으로 결실시킴으로써 신규 Sprouty4 유전자를 설명하였다[참조: Am. J. Physiol. Lung Cell. MoI. Physiol. 287: L52 (2004), 이는 본원에서 참조로 도입됨]. 요약하면, 전이 개시 부위가 결정되면, 일방향 방식으로 5'-플랭킹 세그먼트의 세그먼트를 클로닝하기 위해 통상의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 단편을 생성한다. 생성된 세그먼트를 루시퍼라제 리포터 벡터 내로 클로닝하고, 루시퍼라제 활성을 측정하여 인간 Sprouth4 유전자의 프로모터 영역을 결정한다.
유전자 프로모터를 획득하고 입증하기 위한 또 다른 프로토콜의 예는 다음 단계를 포함한다: (1) 유사한/동일한 조직 타입의 발병 및 비발병 세포/조직 샘플을 획득하는 단계; (2) 샘플로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 분리하는 단계; (3) 발병 및 비발병 RNA의 차등 극소배열 분석을 수행하는 단계; (4) 후보 질병-특이적 전사체를 동정하는 단계; (5) 질병-특이적 전사체와 관련된 게놈 서열을 동정하는 단계; (6) 질병-특이적 전사체의 예상된 전사 개시 부위의 상류 및 하류에 있는 DNA 서열을 획득하거나 합성하는 단계; (7) 단계 6으로부터 상이한 길이의 DNA를 사용하여 프로모터 리포터 벡터를 디자인하고 생산하는 단계; 및 (8) 비관련된 세포/조직에서 뿐만 아니라 발병 및 비발병 세포/조직 중의 프로모터 리포터 벡터를 시험하는 단계.
유전자 스위치 내로 삽입되는 프로모터의 공급원은 자연형 또는 합성형일 수 있고, 프로모터의 공급원은 본원에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다. 달리 말하면, 당해 프로모터는 상이한 공급원으로부터 미리 클로닝될 수도 있거나, 합성될 수도 있다.
유전자 스위치 시스템
유전자 스위치는 특이적 리간드의 부가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 임의의 유전자 스위치일 수 있다. 한 가지 양태에서, 유전자 스위치는 유전자 발현의 수준이 존재하는 리간드의 수준에 의존하는 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에 사용될 수 있는 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이들의 각 리간드(예: 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로제스틴, 레티노이드, 엑디손 및 이들의 동족체 및 유사체)에 의해 활성화된 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원 및 테트라사이클린에 의해 활성화된 rTTA을 포함한다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 유전자 스위치는 EcR 기반 유전자 스위치이다. 이러한 시스템의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 미국 특허 제6,258,603호, 제7,045,315호, 미국 공개 특허원 제2006/0014711호, 제2007/0161086호, 및 국제 공개특허공보 제WO 01/70816호에 기재된 시스템을 포함한다. 키메라 엑디손 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 공개 특허원 제2002/0110861호, 제2004/0033600호, 제2004/0096942호, 제2005/0266457호 및 제2006/0100416호, 및 국제 공개특허공보 제WO 01/70816호, 제WO 02/066612호, 제WO 02/066613호, 제WO 02/066614호, 제WO 02/066615호, 제WO 02/29075호 및 제WO 2005/108617호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 전체가 참조로서 본원에 도입된다. 비스테로이드성 엑디손 길항제-조절된 시스템의 예는 RheoSwitch® 포유동물 유도가능한 발현 시스템(Mammalian Inducible Expression System)(New England Biolabs, Ipswich, MA)이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 유전자 스위치는 FK506 결합 단백질(FKBP)와 FKBP 라파마이신 연결된 단백질(FRAP)과의 이형이합체화에 기반하며, 라파마이신 또는 이의 비-면역억제 동족체를 통해 조절된다. 이러한 시스템의 예는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, ARGENT™ 전사 기술(Transcriptional Technology)(ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA) 및 미국 특허 제6,015,709호, 제6,117,680호, 제6,479,653호, 제6,187,757호 및 제6,649,595호에 기재된 시스템을 포함한다.
한 가지 양태에서, 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터의 조절하에 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 단일 전사 인자 서열을 포함한다. 전사 인자 서열은 자연 발생 또는 인공 리간드-의존성 전사 인자 복합체인 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩할 수 있다. 인공 전사 인자는 전사 인자의 자연 서열이, 예를 들면, 서열의 돌연변이 또는 상이한 전사 인자로부터의 도메인의 조합에 의해 변경되어 있는 것이다. 한 가지 양태에서, 전사 인자는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함한다. 한 가지 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 유비퀴터스 수용체(UR), 오르판 수용체 1(OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1(NER-1), 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15(RIP-15), 간 X 수용체 β(LXRβ), 스테로이드 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 X 수용체(LXR), 간 X 수용체 α(LXRα), 라프네소이드 X 수용체(FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(RIP- 14) 또는 파르네솔 수용체(HRR-1)로부터 유래한다. 또 다른 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 엑디손 수용체로부터 유래한다.
A.
엑디손
-기반 유전자 스위치
EcR 및 기타 그룹 H 핵 수용체는 모든 구성원이, 임의로 이형이합체화 파트너(HP)에 융합되어 공활성화 단백질(CAP)을 형성하는 아미노 말단 전이 활성화 도메인(AD, 또한 "TA" 또는 "TD"로서 상호 교대로 언급됨), DNA 결합 도메인(DBD), 및 힌지 영역을 통해 DBD에 융합되어 리간드-의존성 전사 인자(LTF)를 형성하는 LBD의 존재를 일반적으로 특징으로 하는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. 본원에 사용된 바와 같이, "DNA 결합 도메인"이라는 용어는, DNA 결합 도메인이 특정 반응 요소와 결합하도록 기능하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열부터 DNA 결합 단백질의 전체 길이까지를 포함한다. 또한, 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성은 4개 또는 5개의 도메인의 존재를 특징으로 한다: A/B, C, D, E 및 일부 구성원에서 F[참조: 미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889 (1988)]. "A/B" 도메인은 전이 활성화 도메인에 상응하고, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하며, "D"는 힌지 영역에 상응하고, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 당해 패밀리의 일부 구성원은 또한 "F"에 상응하는 LBD의 카복시-말단 부위 상에 또 다른 전이 활성화 도메인을 가질 수 있다.
다음 폴리펩티드 서열은 엑디손 수용체(엑시스테로이드 수용체)(20-하이드록시-엑디손 수용체(20E 수용체)(EcRH)(핵 수용체 서브패밀리 1 그룹 H 구성원 1)의 폴리펩티드 서열로서 보고되었고, Genbank에서 수탁번호 P34021을 갖는다.
드로소필라 멜라노가스터(초파리)로부터의 엑디손 수용체(878aa)(서열번호 5)
DBD는 2개의 아미노산 모티프, P-박스와 D-박스 사이의 2개 시스테인 아연 핑거의 존재를 특징으로 하고, 이는 반응 요소에 대한 특이성을 제공한다. 이들 도메인은 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 자연형, 변형된 것이거나 키메라일 수 있다. 핵 수용체 패밀리의 서브세트와 같이 EcR은 또한 이형이합체화 특성에 관여하는 확실히 정의되지 않은 영역을 보유한다. 핵 수용체의 도메인은 성질상 모듈러이고, LBD, DBD 및 AD는 상호교환될 수 있다.
또 다른 양태에서, 전사 인자는 AD, 발현이 조절되는 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 연결된 반응 요소를 인지하는 DBD 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 특정한 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
특정한 양태에서, 유전자 스위치는 제1 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1)의 조절하에 제1 전사 인자 서열(예: CAP) 및 제2 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)의 조절하에 제2 전사 인자 서열(예: LTF)를 포함하며, 여기서 제1 전사 인자 서열과 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩된 단백질은 상호작용하여 단백질 복합체(LDTFC), 즉 "이중 스위치" 또는 "2개 혼성화" 기반 유전자 스위치를 형성한다. 제1 및 제2 TSP는 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 양태에서, 치료학적 분자 발현에 요구되는 유전자 스위치에 2개의 상이한 TSP의 존재는 치료학적 방법의 특이성을 증강시킨다(도 2 참조). 도 2는 또한 적절한 TSP를 삽입함으로써 단순히 임의의 질병, 장애 또는 이상을 치료하기 위해 치료학적 유전자 스위치를 변형시키는 능력을 입증한다.
추가의 양태에서, 제1 및 제2 전사 인자 서열, 예를 들면, CAP 또는 LTF는 단일 치료학적 스위치 프로모터(예: 도 1의 TSP-1)의 존재하에 있다. 이 프로모터의 활성화는 단일 개방 판독 프레임을 갖는 CAP 및 LTF 모두를 생성할 것이다. 이는 IRES(내부 리보솜 도입 부위)와 같은 전사 링커의 사용으로 달성될 수 있다. 이런한 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 양 부분은 TSP-1을 활성화시키면 합성될 것이다. TSP-1은 구성적 프로모터가거나, 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에서만 활성화될 수 있다.
추가의 양태에서, 하나의 전사 인자 서열(예: LTF)은 질병, 장애 또는 이상과 관련된 조건하에서만 활성화된 치료학적 스위치 프로모터(예: 도 4에서 TSP-2 또는 TSP-3)의 조절하에 있고, 다른 전사 인자 서열(예: CAP)은 구성적 치료학적 스위치 프로모터(예: 도 4에서 TSP-1)의 조절하에 있다. 이러한 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 한 부분은 구성적으로 존재하는 반면, 제1 부분은 질병, 장애 또는 이상과 관련된 조건하에서만 합성될 것이다.
또 다른 양태에서, 하나의 전사 인자 서열(예: CAP)은 제1 TSP(예: 도 3에서 TSP-1)의 조절하에 있고, 2개 이상의 상이한 제2 전사 인자 서열(예: LTF-1 및 LTF-2)는 상이한 TSP(예: 도 3에서 TSP-2 및 TSP-3)의 조절하에 있다. 이러한 양태에서, 각각의 LTF는 상이한 인자-조절된 프로모터 서열을 인지하는 상이한 DBD를 가질 수 있고, 예를 들면, DBD-A는 인자-조절된 프로모터-1(FRP-1)과 관련된 반응 요소에 결합하고, DBD-B는 인자-조절된 프로모터-2(FRP-2)와 관련된 반응 요소에 결합한다. 인자-조절된 프로모터 각각은 상이한 치료학적 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 다중 처리가 동시 제공될 수 있다.
한 가지 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 AD, 발현이 조절되는 치료학적 생성물 서열과 결합된 반응 요소를 인지하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 제2 전사 인자 서열은 척추 레티노이드 X 수용체(RXR), 무척추 RXR 및 울트라스피라클 단백질(USP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 코딩하거나, 척추 RXR, 무척추 RXR 및 USP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체를 코딩한다[참조: 국제 공개공보 제WO 01/70816 A2호 및 미국 특허공개 제US 2004/0096942 Al호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 유전자 스위치는 발현이 조절되는 치료학적 생성물 서열에 연결된 반응 요소를 인지하는 핵 수용체 LBD 및 DBD를 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 전사 인자 서열, 및 AD와 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 전사 인자 서열을 포함하고, 여기서, 핵 수용체 LBD 중의 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 바람직한 양태에서, 제1 폴리펩티드는 실질적으로 A를 함유하지 않고, 제2 폴리펩티드는 실질적으로 DBD를 함유하지 않는다. 본 발명을 위해, "실질적으로 비함유"는 당해 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기 위해 당해 도메인의 충분한 서열을 함유하지 않음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 이형이합체 파트너 및 AD를 포함하는 단백질("CAP")을 코딩하고, 제2 전사 인자 서열은 BDB 및 LBD를 포함하는 단백질("LTF")를 코딩한다.
하나의 핵 수용체 LBD만이 그룹 H LBD인 경우, 다른 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 이합체를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD인 경우, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추 RXR, 무척추 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추 RSR, 무척추 RXR 및 USP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 유래할 수 있다[참조: 국제 공개공보 제WO 01/70816 A2호, 국제특허출원 제PCT/US02/05235호 및 미국 특허공개 제US 2004/0096942 Al호, 이들의 전체는 본원에서 참조로 도입됨]. "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
한 가지 양태에서, 척추 RXR LBD는 인간 호모 사피엔스(Homo sapiens), 마우스 무스 머스쿨러스(Mus musculus), 래트 라투스 노르베지커스(Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 돼지 수스 스크로파 도메스티카(Sus scrofa domestica), 개구리 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis), 제브라피쉬 다니오 레리오(Danio rerio), 멍게 폴리안드로카르파 미스아키엔시스(Polyandrocarpa misakiensis) 또는 젤리피쉬 트리페달리아 사이소포라(Tripedalia cysophora) RXR로부터 유래한다.
한 가지 양태에서, 무척추 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기 로커스타 미그라토리아 울트라스피라클(Locusta migratoria ultraspiracle) 폴리펩티드("LmUSP"), 참진드기 암블리오마 아메리카눔(Amblyomma americanum) RXR 동족체 1("AmaRXRl"), 참진드기 암블리오마 아메리카늄(Amblyomma americanum) RXR 동족체 2("AmaRXR2"), 피들러 크랩 셀루카 푸길라토(Celuca pugilator) RXR 동족체("CpRXR"), 벌 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor) RXR 동족체("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라(Apis mellifera) RXR 동족체("AmRXR"), 진디 미주스 퍼시카에(Myzus persicae) RXR 동족체("MpRXR") 또는 비-쌍시류/비-인시류 RXR 동족체로부터 유래한다.
한 가지 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추종 RXR 폴리펩티드 단편, 무척추종 RXR 폴리펩티드 단편 및 비-쌍시류/비-인시류 무척추종 RXR 동족체 폴리펩티드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2개의 상이한 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있고, 또는 당해 종이 동일한 경우, 2개 이상의 폴리펩티드 단편은 종 RXR 폴리펩티드 단편의 2개 이상의 상이한 이소형으로부터 유래할 수 있다.
한 가지 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2개의 척추종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 무척추종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추종 RXR 동족체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
핵 수용체(들)의 LBD와 조합되는 경우, 치료학적 생성물 서열과 연결된 FRP의 반응 요소에 또한 결합되는 리간드는 치료학적 생성물 서열의 발현의 외부적 일시 조절을 제공한다. 본 발명의 다양한 성분이 서로에 결합하는, 즉 리간드가 LBD에, DBD가 반응 요소에, AD가 프로모터에 결합하는 결합 메카니즘 또는 순서는 중요하지 않다.
특정한 예에서, 그룹 H 핵 수용체의 LBD 및 이의 핵 수용체 LBD 파트너에 대한 리간드 결합은 치료학적 생성물 서열의 발현을 가능하게 한다. 이 메카니즘은 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 이의 파트너에 대한 리간드 결합 가능성 및 활성 동종이합체 복합체(예: GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)의 생성되는 형성을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 하나 이상의 수용체 도메인은 혼성화 유전자 스위치를 생성하는데 가변적이다. 통상적으로, 3개의 도메인 DBD, LBD 및 AD 중의 1개 이상이 기타 도메인 공급원보다 상이한 공급원으로부터 선택되어 혼성화 유전자 및 생성되는 혼성화 단백질이 전이활성 활성, 리간드의 보충 결합 및 특이적 반응 원소의 인지에 대해 선택된 숙주 세포 또는 생물체에서 최적화되도록 할 수 있다. 또한, 반응 원소 그 자체는 기타 DNA 결합 단백질 도메인에 대한 반응 원소, 예를 들어, 효모로부터 GAL-4 단백질(참조: Sadowski et al, Nature 355:563 (1988)) 또는 대장균으로부터 LexA(참조: Brent et al, Cell 43:129 (1985)), 또는 혼성화 수용체를 조정하기 위한 상기 특이적 상호작용[참조: Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 94:3616 (1997)]을 위해 디자인되고, 변형되고 선택된 단백질과의 표적화 상호작용에 특이적인 합성 반응 원소로 변형되거나 치환될 수 있다. 2-혼성화 시스템의 또다른 이점은 이들이 목적하는 최종 결과에 따라 유전자 발현을 유도하는데 사용되는 프로모터를 선택하게 한다는 것이다. 이러한 이중 조절은, 발현 타이밍 뿐만 아니라 발현이 일어나는 세포 둘 다가 조절될 수 있기 때문에, 특히, 세포독성 단백질이 생성될 경우, 유전자 치료 분야에서 특히 중요할 수 있다. 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자가 목적 세포에 도입될 경우, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 시스템의 존재로 조절된다. 프로모터는 구성적으로 또는 유도적으로 조절될 수 있거나, 조직 특이적(즉, 특정 형태의 세포에서만 발현됨) 또는 생물체의 특정 발생 단계에서 특이적일 수 있다.
제1 혼성화 단백질의 DNA 결합 도메인은, 리간드의 존재 또는 부재하에, 반응 원소의 DNA 서열에 결합하여 본 반응 요소의 조절하에 하류 유전자(들)의 전사를 개시하거나 억제한다.
작용성 LDTFC, 예를 들면, EcR 복합체는 또한 추가의 단백질(들), 예를 들어, 이뮤노필린을 포함할 수 있다. 전사 인자(예: DHR38 또는 베타FTZ-1)로서 공지된, 단백질의 핵 수용체 부류의 추가의 수는 또한 EcR, USP 및/또는 RXR의 리간드 의존성 또는 독립성 파트너일 수 있다. 추가로, 기타 보조인자, 예를 들면, 일반적으로 공활성화제(또한 어댑터 또는 매개물질로서 칭명됨)로서 공지된 단백질이 필요할 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열 특이적으로 결합되지 않고, 기본 전사에 포함되지 않는다. 이들은 활성화제의 DNA-결합 자극을 포함하는 각종 메카니즘을 통해 크로마틴 구조에 영향을 미치거나, 활성화제-개시 복합체 상호작용을 중재하여 전사 활성화에 대한 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 공활성화제의 예는 RIP 140, TEFl, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-l, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIBl/RACS/pCIP 뿐만 아니라 불규칙한 공활성화제 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300[참조: Glass et ah, Curr. Opin. Cell Biol. 9:222 (1997)]을 포함한다. 또한, 일반적으로 보조 억제물질(또한, 억제물질, 사일런서 또는 사일런싱 매개체로서 공지됨)로서 공지된 단백질 보조인자가 리간드의 부재하에서 전사 활성화를 효과적으로 억제하는데 필요할 수 있다. 이들 보조 억제물질은 비리간드화 EcR와 상호작용하여 반응 원소에서 활성을 침묵시킬 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합이 수용체의 형태를 변화시키고, 이는 보조 억제물질이 방출 및 상기한 공활성화제의 보충을 유도하여 이들의 사일런싱 활성을 파괴한다고 제시한다. 보조 억제물질의 예는 N-CoR 및 SMRT(검토용으로, 참조: Horwitz et ah, MoI Endocrinol. 10:1167 (1996))를 포함한다. 이들 보조 인자는 세포 또는 생물체 내에서 내인성일 수 있거나, 조절 방식 또는 비조절 방식으로 발현되는 형질전환 유전자로서 외인성으로 부가될 수 있다.
B.
라파마이신계
유전자 스위치
본 발명은 추가로 리간드-의존성 전사 인자 복합체로서 FK506을, 리간드로서 라파마이신을 사용하는 유전자 스위치 시스템을 제공한다. 하나의 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 작제물은
(a) 라파마이신 또는 이의 동족체에 결합하고 적어도 하나의 FK506-결합 단백질(FKBP) 도메인 및 이의 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하고, 여기서 FKBP 도메인은 (1) 자연 FKBP, (2) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되고, 삽입되거나 치환체 아미노산으로 치환된 자연 FKBP의 변이체 및 (3) (1) 또는 (2)의 FKBP를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩된 FKBP로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 제1 키메라 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드;
(b) (a) 라파마이신 또는 라파마이신 동족체 및 (b) 제1 키메라 단백질 둘 다와 복합체를 형성하고, 적어도 하나의 FKBP:라파마이신 결합(FRB) 도메인 및 이의 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하고, 여기서 FKBP 도메인은 (4) 자연 FRB, (5) 10개 이하의 아미노산 잔기가 결실되고, 삽입되거나 치환체 아미노산으로 치환된 자연 FRB의 변이체 및 (6) (4) 또는 (5)의 FRB를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩된 FRB 도메인으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이 유전자 스위치 시스템에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드 각각은 본원에서 다른 경우에 기술된 바와 같은 하나 이상의 치료학적 스위치 프로모터의 조절하에 존재한다. 또한, 특정 양태에서, 제1 및 제2 키메라 단백질에서 FKBP 및/또는 FRB 도메인에 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인은 하나 이상의 "작용" 또는 "이펙터" 도메인일 수 있다. 이펙터 도메인은 DNA 결합 도메인, 전사 활성화 도메인, 세포상 편재화 도메인 및 신호화 도메인(즉, 클러스터링 또는 다합체화시 세포 성장, 증식, 분화, 아폽토시스, 유전자 전사 등을 유발할 수 있는 도메인)을 포함하는 광범위한 종류의 단백질 도메인으로부터 선택될 수 있다.
특정 양태에서, 하나의 융합 단백질은 적어도 하나의 DNA 결합 도메인(예: GAL4 또는 ZFHDl DNA-결합 도메인)을 함유하고, 다른 융합 단백질은 적어도 하나의 전사 활성화 도메인(예: VP 16 또는 p65 전사 활성화 도메인)을 함유한다. 융합 단백질의 리간드 매개된 연결은 전사 인자 복합체의 형성을 나타내고, 융합 단백질 중의 하나에서의 DNA-결합 도메인에 의해(즉, 결합시킬 수 있는) 인지되는 DNA 서열에 결합된 표적 유전자의 전사를 개시한다. 유전자 발현 시스템 뿐만 아니라 리간드에 대한 정보는 미국 특허 제6,187,757 Bl호, 제6,649,595 Bl호, 제6,509,152 Bl호, 제6,479,653 Bl호 및 제6,117,680 Bl호에 기재되어 있다.
기타 양태에서, 본 발명은 리간드의 부재하에 자체 응집되는 2개의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 (a) 제1 융합 단백질은 선택된 리간드에 결합하는 조건부 응집 도메인 및 전사 활성화 도메인을 포함하고, (b) 제2 융합 단백질은 선택된 리간드에 결합하는 조건부 응집 도메인 및 DNA 결합 도메인을 포함하고, (c) 리간드의 부재하에, 세포는 상기한 DNA 결합 단백질이 결합되는 조절 DNA에 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시키는 유전자 스위치 시스템을 제공한다. 유전자 스위치 시스템을 포함하는 변형된 세포는 리간드의 존재하에 유전자 억제에 충분한 양으로 팽창한다. 리간드 제거는 세포사를 유도하는 코딩된 단백질의 발현을 유도한다. 2개의 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 적어도 하나의 조건부 프로모터의 조절하에 존재한다. 조건부 응집 도메인을 사용하는 유전자 발현 시스템은 미국 공보 제2002/0048792호에 기재되어 있다.
C.
원핵
억제물질/작동물질 기반 유전자 스위치 시스템
하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 원핵 테트라사이클린("tet") 억제물질 및 진핵 전사 활성화제 단백질 도메인을 포함하는 전사활성인자 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b) 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기한 제2 폴리뉴클레오티드는 최소 프로모터 및 적어도 하나의 tet 작동물질 서열에 작동적으로 결합된 유전자 스위치 시스템을 제공한다. 전이활성화제 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드는 본원에서 다른 경우에 기술된 치료학적 스위치 프로모터를 포함할 수 있다. 치사 단백질의 발현은 테트라사이클린의 부재하에 상향 조절된다(참조: Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sd. 89: 5547-5551; Gossen et al. (1993) TIBS 18 : 471-475; Furth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. ScL 91 : 9302-9306; and Shockett et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sd. 92: 6522-6526). TetO 발현 시스템은 미국 특허 제5,464,758 Bl호에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 유전자 스위치 시스템은 세균 대장균으로부터 락토스("Lac") 억제물질-작동물질 시스템을 포함한다. 본 발명의 유전자 스위치 시스템은 또한 (a) 원핵 lac I 억제물질 및 진핵 전사 활성화제 단백질 도메인을 포함하는 전이활성화제 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (b) 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된다. Lac 시스템에서, lac 오페론은 락토스, 또는 합성 동족체, 예를 들어, 이소프로필-b-D-티오갈락토시드의 부재하에 불활성화된다.
추가의 유전자 스위치 시스템은 다음 특허문헌에 기술된 것들을 포함한다: US7,091,038; WO2004078924; EP1266015; US20010044151; US20020110861; US20020119521; US20040033600; US20040197861; US20040235097; US20060020146; US20040049437; US20040096942; US20050228016; US20050266457; US20060100416; WO2001/70816; WO2002/29075; WO2002/066612; WO2002/066613; WO2002/066614; WO2002/066615; WO2005/108617; US 6,258,603; US20050209283; US20050228016; US20060020146; EP0965644; US 7,304,162; US 7,304,161; MX234742; KR10-0563143; AU765306; AU2002-248500; 및 AU2002- 306550.
D. 유전자 스위치 시스템의 조합
본 발명은 핵산 조성물, 변형된 세포, 및 하나 이상의 리간드의 유효량에 의해 활성화되는 상이한 리간드 의존성 전사 인자 복합체를 포함하는 2개 이상의 유전자 스위치 시스템을 포함하고, 여기서 2개 이상의 유전자 시스템이 제1 유전자 스위치 및 제2 유전자 스위치를 포함하고, 이들은 모두 하나 이상의 리간드에 결합시 하나 이상의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 선택적으로 야기하는 생물반응기를 제공한다. 본 발명의 범위내에 다수의 유전자 스위치 시스템 및/또는 유전자 스위치 시스템의 조합이 존재한다.
하나의 양태에서, 본 발명은
(c) i. 1. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인자 조절된 프로모터를 활성화시키는 전사활성 도메인 및 2. 이종이합체 파트너 도메인을 포함하는 제1 혼성화 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트,
ii. 1. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인자 조절된 프로모터를 인지하는 DNA-결합 도메인 및 2. 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 혼성화 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트 및
iii. 1. 제2 혼성화 폴리펩티드의 전사활성 도메인에 의해 활성화되는 인자 조절된 프로모터 및 2. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트를 포함하는 제1 유전자 스위치 시스템 및
b. i. 1. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인자 조절된 프로모터를 활성화시키는 전이활성화 도메인 및 2. 이종이합체 파트너 도메인을 포함하는 제1 혼성화 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트,
ii. 1. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인자 조절된 프로모터를 인지하는 DNA-결합 도메인 및 2. 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 혼성화 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티들르 포함하는 제2 유전자 발현 카세트 및
iii. 1. 제2 혼성화 폴리펩티드의 전사활성 도메인에 의해 활성화되는 인자 조절된 프로모터 및 2. 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트를 포함하는 제2 유전자 스위치 시스템을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다.
다수의 유도성 유전자 발현 시스템은 상이한 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 소정의 치료학적 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리펩티드의 발현 또는 동일 질병, 장애 또는 이상과 관련된 동일한 상태하에 또는 상이한 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상이한 상태하에 다수의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 제공한다.
특정 양태에서, 2개 이상의 유전자 스위치 시스템의 조합은 (1) 이중 스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 발현 시스템 및 (2) 단일 스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치일 수 있다. 기타 양태에서, 조합은 (1) 단일 또는 이중 스위치 엑디손 기반 유전자 스위치 및 (2) 라파마이신 기본 유전자 스위치일 수 있다. 또는, 유전자 스위치 시스템의 조합은 상기한 2개의 동일한 라파마이신 기반 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 임의의 가능한 유전자 스위치 시스템의 조합은 본 발명의 범위내에 속한다.
리간드
본 발명의 리간드 의존성 전사 인자 복합체용 리간드는 하나 이상의 리간드 결합 도메인, 이종이합체 파트너 도메인, DNA 결합 도메인 및 전사활성 도메인을 포함하는 단백질 복합체에 결합한다. 리간드 의존성 전사 인자 복합체를 활성화시키는 리간드의 선택은 이용되는 유전자 스위치의 종류에 좌우된다.
예를 들어, 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치용 리간드는 임의의 적합한 리간드로부터 선택될 수 있다. 자연 엑디손 또는 엑디손 동족체(예: 20-하이드록시엑디손, 무리스테론 A, 포나스테론 A, 포나스테론 B, 포나스테론 C, 26-요오도포나스테론 A, 이노코스테론 또는 26-에실리노코스테론) 및 비스테로이드 유도제 둘 다가 본 발명의 유전자 스위치용 리간드로서 사용될 수 있다. 미국 특허 제 6,379,945 Bl호는 스테로이드 및 특정의 비스테로이드성 유도제 모두에 반응하는 유전자 스위치로서 작동할 수 있는 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens; "HEcR")로부터 분리된 곤충 스테로이드 수용체를 기술한다. 비스테로이드성 유도제는 본 시스템 및 스테로이드 및 비스테로이드 유도제 모두에 반응성인 다수의 기타 시스템에서, 예를 들어, 낮은 제조 비용, 대사 안정성, 곤충 부재, 식물, 또는 포유동물, 및 환경적 수용능력을 포함하는 다수의 이유로 인해, 스테로이드 유도제에 비해 뚜렷한 이점을 갖는다. 미국 특허 제6,379,945 Bl호는 엑디손계 유전자 스위치용 리간드로서의 2개의 디벤조일하이드라진, 1,2-디벤조일-l-3급-부틸-하이드라진 및 테부페노지드 (N-(4-에틸벤조일)-N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-3급-부틸-하이드라진)의 유용성을 기재한다. 기타 디벤조일하이드라진, 예를 들어, 미국 특허 제5,117,057 Bl호에 기술된 것들이 또한 본 발명에서 리간드로서 포함된다. 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터의 엑티손 수용체를 위한 화학적 리간드로서의 테부페노지드의 용도는 또한 미국 특허 제6,147,282호에 기재되어 있다. 엑디손 리간드의 추가의 비제한적 예는 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 1,2-디아실 하이드라진, N'-치환된 -N,N'-이치환된 하이드라진, 디벤조일알킬 시아노하이드라진, N-치환된-N-알킬-N,N-디아로일 하이드라진, N-치환된-N-아실-N-알킬, 카보닐 하이드라진 또는 N-아로일-N'-알킬-N'-아로일 하이드라진(참조: 미국 특허 제6,723,531호)이다.
한 가지 양태에서, 엑디손 기반 유전자 스위치 시스템에 대한 리간드는 디아실하이드라진 또는 키랄 디아실하이드라진 리간드이다. 유전자 스위치 시스템에 사용된 리간드는 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 수화물, 결정형 또는 무정형 형태일 수 있다.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이고,
B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이며,
R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬,할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이다.
또 다른 양태에서, 리간드는 화학식 II의 에난티오머 풍부한 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 수화물, 결정형 또는 무정형 형태일 수 있다.
[화학식 II]
상기 화학식 II에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고,
B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이며,
R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고,
단, R1은 R2와 동일하지는 않으며,
R1 및 R2를 포함하는 비대칭 탄소원자에서의 절대 배열은 주로 S이다.
특정한 양태에서, 리간드는 화학식 III의 에난티오머 풍부한 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 수화물, 결정형 또는 무정형 형태일 수 있다.
[화학식 III]
상기 화학식 III에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고,
B는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이며,
R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 임의로 치환된 사이클로알킬, 임의로 치환된 아케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 헤테로사이클로, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴이고,
단, R1은 R2와 동일하지는 않으며,
R1 및 R2를 포함하는 비대칭 탄소원자에서의 절대 배열은 주로 R이다.
한 가지 양태에서, 리간드는 적어도 95% 이상의 에난티오머 과량을 갖는 (R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(l-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 수화물, 결정형 또는 무정형 형태이다.
화학식 I의 디아실하이드라진 및 화학식 II 및 화학식 III의 키랄 디아실하이드라진 리간드는, 엑디손 기반 유전자 스위치 시스템과 함께 사용되는 경우, 본 발명의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 외부적으로 일시 조절하는 수단을 제공한다.
본 발명에 사용된 리간드는 염을 형성할 수 있다. 본원에 사용된 "염(들)"이라는 용어는 무기 및/또는 유기 산 및 염기로 형성된 산성 및/또는 염기성 염을 나타낸다. 또한, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이 염기성 잔기 및 산성 잔기를 둘 다 함유하는 경우, 쯔비터 이온("내부 염")이 형성될 수 있고, 이는 본원에 사용된 용어 "염(들)"에 포함된다. 약제학적으로 허용되는(즉, 무독성의 생리학적으로 허용되는) 염은, 다른 염들이 또한 유용하지만, 예를 들면, 제조 도중에 사용될 수 있는 분리 또는 정제 단계에서 사용된다. 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물의 염은, 예를 들면, 화합물을 당해 염이 침전되는 것과 같은 매질 또는 수성 매질 속에서 소정량, 예를 들면, 등량의 산 또는 염기와 반응시킨 다음 동결건조시킴으로써 형성할 수 있다.
염기성 잔기를 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 산과의 염을 형성할 수 있다. 예시전 산 부가 염은 아세테이트(예: 아세트산 또는 트리할로아세트산, 예를 들면, 트리할로아세트산으로 형성된 것들), 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드(염산으로 형성됨), 하이드로브로마이드(브롬화수소로 형성됨), 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트(말레산으로 형성됨), 메탄설포네이트(메탄설폰산으로 형성됨), 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트(예를 들면, 황산으로 형성된 것들), 설포네이트(예를 들면, 본원에 언급된 것들), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 예를 들면, 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함한다.
산성 잔기를 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 염기와의 염을 형성할 수 있다. 예시절 염기성 염은 암모늄 염, 알킬 금속 염, 예를 들면, 나트륨, 리튬 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예를 들면, 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기(예: 유기 아민), 예를 들면, 벤즈아틴, 디사이클로헥실아민, 하이드라브아민(N,N-비스(데하이드로아비어틸)에틸렌디아민), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카민, t-부틸 아민과의 염 및 아미노산(예: 아르기닌, 리신 등)과의 염을 포함한다.
FK506 결합 도메인을 이용하는 유도가능한 유전자 발현 시스템을 위한 리간드의 비제한적 예는 FK506, 사이클로프로핀 A, 또는 라파마이신이다. FK506, 라파마이신 및 이들의 동족체는 미국 특허 제6,649,595 B2호 및 제6,187,757호에 개시되어 있다. [또한, 미국 특허 제7,276,498호 및 제7,273,874호 참조].
본원에 기재된 리간드는 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 한 가지 양태에서, 약제학적 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 연고, 엘릭서 또는 주사가능한 조성물 형태로 존재한다.
약제학적 조성물
약제학적으로 허용되는 담체는 당류, 예를 들면, 락토즈 또는 수크로즈, 만니톨 또는 솔비톨과 같은 충전제, 셀룰로오즈 제제 및/또는 인산칼슘, 예를 들면, 인산삼칼슘 또는 인산수소칼슘 뿐만 아니라, 예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈, 및/또는 폴리비닐 피롤리돈을 사용하는 전분 페이스트와 같은 결합제를 포함한다. 경우에 따라, 붕해제, 에를 들면, 상술한 전분 및 또한 카복시메틸-전분, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들면, 나트륨 알기네이트를 첨가할 수 있다. 보조제는 유동 조절제 및 윤활제, 예를 들면, 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이다. 한 가지 양태에서, 당의 코어는, 경우에 따라, 위액에 내성이 있는 적합한 피막으로 제공된다. 이를 위해, 농축 당류 용액을 사용할 수 있으며, 이는 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있다. 위액에 내성이 있는 피막을 생산하기 위해, 아세틸셀룰로오즈 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸-셀룰로오즈 프탈레이트와 같은 적하한 셀룰로오즈 제제의 용액이 사용된다. 무수 물질 또는 안료를 정제 또는 당의정에 첨가하여, 예를 들면, 활성 화합물 용량의 배합물을 식별하거나 상기 배합물을 특성화할 수 있다.
경구 사용될 수 있는 기타 약제학적 제제는, 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 젤라틴 및 가소제로 제조된 연질의 밀봉된 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 푸시-피트(fush-fit) 캡슐을 포함한다. 푸시-피트 캡슐은, 락토즈 등의 충전제, 전분 등의 결합제 및/또는 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제 및 임의로 안정화제와 임의로 혼합될 수 있는, 과립 또는 나노입자 형태로 활성 화합물을 함유할 수 있다. 한 가지 양태에서, 캡슐은 임의로 안정화제와 함께 지방 오일 또는 액체 파라핀 등의 적합한 액체에 용해 또는 현탁된다.
지방 오일은 모노-, 디- 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 모노-, 디- 및 트리글리세라이드는 C6, C8, C1O, C12, C14, C16, C18, C20 및 C22 산으로부터 유도되는 것들을 포함한다. 예시적 디글리세라이드는 특히 디올레인, 디팔미톨레인 및 혼합된 카프릴린-카프린 디글리세라이드를 포함한다. 트리글리세라이드는 식물성 오일, 어유, 동물 지방, 수소화 식물성 오일, 부분 수소화 식물성 오일, 합성 트리글리세라이드, 변형 트리글리세라이드, 분별된 트리글리세라이드, 중간 및 장쇄 트리글리세라이드, 구성된 트리글리세라이드 및 이들의 혼합물을 포함한다. 예시적 트리글리세라이드는 아몬드 오일, 바바수 오일, 보리지 오일; 블랙커런트씨 오일, 카놀라 오일, 피마자유, 코코넛 오일, 옥수수 오일, 면실유, 달맞이꽃 오일, 포도씨 오일, 땅콩유, 겨자씨 오일, 올리브유, 팜유, 팜 커널 오일, 피너츠 오일, 평지씨유, 홍화 오일, 상어 간 오일, 대두유, 해바라기유, 수소화 피마자유, 수소화 코코넛 오일, 수소화 팜유, 수소화 대두유, 수소화 식물성 오일, 수소화 면실유 및 피마자유, 부분 수소화 대두유, 부분 대두 및 면실유, 글리세릴 트리카프로에이트, 글리세릴 트리카프릴레이트, 글리세릴 트리카프레이트, 글리세릴 트리운데카노에이트, 글리세릴 트리라우레이트, 글리세릴 트리올레에이트, 글리세릴 트리리놀레에이트, 글리세릴 트리리놀레네이트, 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트, 글리셀리 트리카프릴레이트/카프레이트/라우레이트, 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/리놀레에이트, 및 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트를 포함한다.
한 가지 양태에서, 트리글리세라이드는 상표명 LABRAFAC CC하에 상업적으로 시판되는 중쇄 트리글리세라이드이다. 다른 트리글리세라이드는 중성 오일, 예를 들면, 중성 식물성 오일, 특히 분별된 코코넛 오일, 예를 들면, 제품명: MIGLYOL 810, MIGLYOL 812, MIGLYOL 818 및 CAPTEX 355를 포함하여 상표명 MIGLYOL로 공지되고 상업적으로 시판되는 것들을 포함한다. 다른 트리글리세라이드는, 제품명 MYRITOL 813을 포함하여 상표명 MYRITOL하에 공지되고 상업적으로 시판되는 카프릴-카프라산 트리글리세라이드이다. 이러한 부류의 추가의 트리글리세라이드는 CAPMUL MCT, CAPTEX 200, CAPTEX 300, CAPTEX 800, NEOBEE M5 및 MAZOL 1400이다.
트리글리세라이드를 포함하는 약제학적 조성물은, 수성 용매로의 용해시에 투명한 용액을 형성할 수 있는 친유성 및/또는 친수성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 한 가지 계면활성제는 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트(비타민 E TPGS)이다. 이러한 조성물의 예는 미국 특허 제6,267,985에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 야게학적 허용되는 담체는 PEG-8 카프릴/카프릭 글리세라이드인 LABRASOL (Gattefosse SA)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 PL90G, 비타민 E TPGS, 및 Miglyol 812N을 포함한다.
직장내 사용될 수 있는 가능한 약제학적 제제는, 예를 들면, 하나 이상의 리간드와 좌제 기제의 배합물로 이루어진 좌제를 포함한다. 적합한 좌제 기제는, 예를 들면, 자연 또는 합성 트리글리세라이드 또는 파라핀 탄화수소이다. 또한, 리간드와 기제와의 배합물로 이루어진 젤라틴 직장 캡슐을 사용할 수 있다. 가능한 기제 물질에는, 예를 들면, 액체 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 파라핀 탄화수소가 포함된다.
비경구 투여에 적합한 제형은 수용성 형태, 예를 들면, 수용성 염 및 알칼리 용액 형태의 리간드 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 오일성 주사 현탁액으로서의 리간드의 현탁액을 투여할 수도 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면, 참기름 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드 또는 폴리에틸렌 글리콜-400을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오즈, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
국소 조성물은 적절한 담체의 선택에 따라 오일, 크림, 로션, 연고 등으로서 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 식물성 또는 무기 오일, 백색 석유(백샌 연질 파라핀), 분지쇄 지방 또는 오일, 동물 지방 및 고분자량 알콜(C12 초과)을 포함한다. 유화제, 안정화제, 습윤제 및 항산화제 뿐만 아니라, 필요한 경우, 착색 또는 향기를 제공하는 제제가 포함될 수 있다. 추가로, 경피 투과 증강제가 이들 국소 제형에 사용될 수 있다. 이러한 증강제의 예는 미국 특허 제3,989,816호 및 제4,444,762호에서 발견할 수 있다.
크림은 무기 오일, 자가 유화성 밀랍 및 물의 혼합물로부터 제형화될 수 있고, 여기서 아몬드 오일과 같은 소량의 오일에 용해시킨 리간드를 혼합한다. 이러한 크림의 전형적인 예는 물 약 40부, 밀랍 약 20부, 무기 오일 약 40부 및 아몬드 오일 1부를 포함하는 것이다.
연고는 아몬드 오일과 같은 식물성 오일 중의 리간드의 현탁액을 따뜻한 연질 파라핀과 혼합하고 혼합물을 냉각시킴으로써 제형화할 수 있다. 이러한 연고의 전형적인 예는 아몬드 오일 약 30중량% 및 백색 연질 파라핀 약 70%을 포함하는 것이다.
로션은 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 고분자량 알콜중에 리간드 현탁물을 제조함으로써 편리하게 제조될 수 있다.
약학적 조성물에 첨가될 수 있는 항산화제의 예로는 BHA 및 BHT가 포함된다.
일 구체예에 있어서, 약학적 조성물은 고체 젤라틴 캡슐중에 LABRASOL 1 mL당 30 mg의 리간드를 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 캡슐은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg의 리간드를 포함한다.
약학적 조성물은 0.01 내지 99 중량%의 리간드를 포함할 수 있다. 조성물은 단회 또는 다회 투여형일 수 있다. 임의의 특정 약학적 조성물중에 리간드의 양은 유효 용량, 즉 목적하는 유전자 발현 또는 억제를 유발하는데 필요한 용량에 따라 달라질 것이다. 일 구체예에 있어서, 0.1 내지 7.5 mg/kg이 대상에 투여된다. 다른 구체예에 있어서, 0.1 내지 3 mg/kg이 대상에 투여된다. 또 다른 구체예에 있어서, 0.1 내지 3 mg/kg이 투여된다.
약학적 조성물의 적절한 투여 경로는 경구, 직장, 국소 (피부, 구강 및 설하 포함), 질내, 비경구 (경피, 근육내, 정맥내, 피부내, 경막내, 종양내 및 경막외 포함) 및 코위 영양관을 포함한다. 당업자들은 투여 경로가 치료할 증상에 좌우될 것이며, 수용체의 증상과 같은 인자에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 약학적 조성물은 1일 1회 이상으로 투여될 수 있다.
치료학적 분자
치료학적 분자, 예를 들어, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 질환, 장애 또는 증상의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 임의의 서열일 수 있다. 치료 폴리펩티드는 질환, 장애 또는 증상을 치료, 개선 또는 예방하는데 효과적이라고 알려진 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 치료 폴리펩티드 부류의 예에는 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 공학적 면역글로불린-유사 분자, 단쇄 항체, 융합 단백질, 효소, 면역 공자극 분자, 면역조절 분자, 표적 단백질의 트랜스도미넌트 음성 돌연변이, 독소, 조건 독소, 항원, 종양 억제 단백질, 성장 인자, 막 단백질, 혈관작용 단백질 및 펩티드, 항바이러스성 단백질 또는 이들의 변이체가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 치료 폴리뉴클레오티드는 안티센스 서열, 소형 간섭 RNAs, 리보자임 및 RNA 외부 안내 서열을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 치료 폴리뉴클레오티드는 발현을 감소시키거나 제거하도록 의도되고 특정 질환, 장애 또는 증상과 연관되는 임의의 전사체에 표적화될 수 있다. 상기 표 1 내지 3에 열거된 유전자를 비롯하여, 질환, 장애 또는 증상 동안 고도의 발현을 나타내는 다수의 유전자가 당업계에 공지되었다.
치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치에 의해 코딩되는 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 DBD에 의해 인식되는 적어도 하나의 반응 요소를 포함하는 인자-조절 프로모터에 작동적으로 결합하거나, 그와 작동적으로 연관된다. 일 구체예에 있어서, 프로모터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 반응 요소 카피를 포함한다. 목적하는 반응 요소를 포함하는 프로모터는 자연 발생 프로모터 또는 당업계에 익히 공지된 기술을 이용하여 창제된 인공 프로모터, 예를 들어, 최소 프로모터에 작동적으로 결합된 하나 이상의 반응 요소일 수 있다.
치료학적 유전자-스위치를 이용하여 발현될 수 있는 특이적 치료 폴리펩티드는 모노클로날 항체, 최소 항체를 포함하는 항체, 융합 단백질, 내인성 단백질 모방체, 효소, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 임의의 이들 폴리펩티드의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 대표적인 치료학적 분자가 이하에 기술될 것이나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특허 공보물, 과학 문헌과 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 목록번호를 포함하여 이들 분자에 대한 참조문헌들은 그의 전체내용이 본 원에 참고로 원용된다.
모노클로날
항체
본 발명의 치료학적 유전자-스위치 작제물은 치료 모노클로날 항체 또는 이들의 단편, 변이체 또는 유사체 (총괄적으로 "모노클로날 항체")를 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 이러힌 모노클로날 항체는 암, 자가면역질환 (예를 들어, MS, 크론병, 류마티스성 관절염), 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 알레르기, 심장 질환 및 이식 거부를 들 수 있느나 이들에 한정되는 것은 아닌 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명에 사용하기 위한 항체에는 이하 예시되나 이들에 한정되지 않는 임의의 공지 치료 모노클로날 항체, 임의의 공지 모노클로날 항체와 동일한 에피토프 또는 표적에 결합되는 모노클로날 항체가 포함된다. 치료학적 유전자 스위치 작제물을 통한 발현에 적절한 모노클로날 항체 작제물에는 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs (scFv), 단쇄 항체, 디설파이드 결합된 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이 포함된다. ScFv 분자는 당업계에 공지되었으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되었다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 단쇄 항체를 비롯한 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의 조합을 포함하는 항원-결합 단편도 본 발명에 포함된다.
특정 구체예에 있어서, 본 발명은 CTLA4, CD25, HER-2/neu (ErbB2), CD20, TNFα, EGFR 및 VEGF를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 항원에 대한 모노클로날 항체를 코딩하는 치료학적 유전자 스위치 작제물을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-CTLA4 항체 및 그의 제조방법이 2000년 6월 29일에 WO 00/37504호로 공개된 국제 출원 제PCT/US99/30895호 (예를 들어, 티실리무마브, 11.2.1 및 CP-675,206으로도 알려짐), 2002년 4월 12일 공개된 유럽 특허 출원 제EP 1262193 A1호, 미국 특허 출원 제09/472,087호 (현재 미국 특허 제6,682,736호로 허여됨), 미국 특허 출원 제09/948,939호 (현재 미국 특허 출원 공개 제2002/0086014호로 공개됨) (예를 들어, 이필리무마브, 1OD1 및 MDX-010으로도 알려짐, Medarex, Princeton, NJ)에 기술되어 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-CD25 항체로는 다클리주마브가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다 (참조예: 미국 특허 제5,530,101호). 다클리주마브 (상표명: Zenapax®, 로슈사(Roche)에 의해 시판)는 CD25에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체 (IL-2 수용체)이다. IL-2 수용체 길항제로서의 기능화로, 이는 고친화성 IL-2 수용체 복합체의 Tac 서브유닛에 고친화성으로 결합한다. 다클리주마브는 사이클로스포린 및 코르티코스테로이드와 병용시 신장 이식 환자에서 급성 기관 거부를 예방하도록 적용된다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-HER-2/neu (ErbB2) 항체로는 트라스투주마브 (참조예: 미국 특허 제5,677,171호)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 트라스투주마브 (상표명: Herceptin®, 제넨텍사(Genentech)에 의해 시판)는 c-erbB2/HER2/neu 단백질 [특정 유방암 형태에서 과발현되는 막관통 수용체 단백질 (표피 성장 인자 수용체와 구성적으로 관련)임]의 세포외 도메인에 대해 표적화된 인간화된 모노클로날 항체이다. 항체-의존성 세포독성 매개체로서, 트라스투주마브는 HER2-발현 암 세포에 우선적으로 독성을 띤다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-CD20 항체로는 리툭시마브 (참조예: 미국 특허 제5,736,137)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 리툭시마브 (상표명: Rituxan®, 바이오겐 이디(Biogen Idee) 및 제넨텍사(Genentech)에 의해 시판)는 키메라 (뮤린/인간) 모노클로날 IgG1κ 항체이다. 리툭시마브는 최초에 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종 치료용으로 설계되어 승인을 받았으나, 최근에 항-TNF 불응 류마티스성 관절염 치료용으로 승인을 받았다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-TNFα 항체로는 아달리무마브 (참조예: 미국 특허 제7,223,394) 및 인플릭시마브 (참조예: 미국 특허 제7138118)가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 아달리무마브 (상표명: Humira®, 애보트사(Abbott)에 의해 시판)는 TNFα에 특이적으로 결합하여 TNFα와 p55 및 p75 표면 TNF 수용체의 상호작용을 차단하는 재조합 인간 IgG1κ 모노클로날 항체이다. 아달리무마브는 류마티스성 관절염 및 소아 특발성 관절염에 사용하도록 승인을 받았다. 아달리무마브에 대한 추가의 적응은 크론병, 플라크 건선, 건선성 관절염 및 강직성 척추염을 포함한다. 인플릭시마브 (상표명: Remicade, 센토코(Centocor)에 의해 시판)는 TNFα에 특이적으로 결합하여 TNFα와 p55 및 p75 표면 TNF 수용체의 상호작용을 차단하는 재조합 키메라 IgG1κ 모노클로날 항체이다. 인플릭시마브는 크론병에 사용하도록 승인을 받았다. 추가의 적응은 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 중증 만성 플라크 건선 및 강직성 척추염을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항 EGFR (표피 성장 인자 수용체) 항체로는 세툭시마브 (참조예: 미국 특허 제6,217,866)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 세툭시마브 (상표명: Erbitux®, 임클론(Imclone) 및 브리스톨-메어스 스퀴브(Bristol-Meyers Squibb)(북미) 및 머크 케이쥐에이에이(Merck KGaA) (기타 지역)에 의해 시판)는 EGFR에 특이적으로 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 세툭시마브는 전이 결장직장 암; 및 두경부 암용으로 처방된다.
본 발명에 사용될 수 있는 항-VEGF 항체로는 베바시주마브 (참조예: 미국 특허 제6,383,486)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 베바시주마브 (상표명: Avastin®, 제넨텍사(Genentech)에 의해 시판)는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 기능을 저해함으로써 종양 혈관신생을 억제하는 인간 모노클로날 항체이다. 베바시주마브는 다른 항암 화학요법제와 함께, 전이 결장직장 암 환자의 제1 및 제2선 치료 및 비-편평 비-소형 세포 폐암 (NSCLC)이 재발 또는 전이된 환자의 제1선 치료를 위한 치료제로 처방된다.
융합 단백질
본 발명의 치료학적 유전자-스위치 작제물은 치료 융합 단백질, 예컨대 키메라 TNFα 결합 단백질 2를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 종양 괴사 인자 결합 단백질 2 (Enbrel)는 단백질 분해 과정에 의해 막 형성으로 생성된다. Enbrel은 인간 IgG1 분자의 Fc 단편에 의해 결합된 두개의 가용성 TNF 수용체로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 이는 TNF-알파에 결합하여 TNF-알파와 그의 수용체와의 상호작용을 차단한다. Enbrel은 경증 내지 중증의 류마티스성 관절염을 치료하기 위해 사용된다. Enbrel을 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 P20333으로 입수할 수 있다.
Enbrel의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 DD292498 및 DD 292499으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
효소
본 발명의 치료학적 유전자-스위치 작제물은 조직 플라스미노겐 활성체를 포함하여, 치료 효소를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 플라스미노겐 활성체, 조직 타입의 아이소형 3 프레프로단백질 (tPA)은 효소전구체 플라스미노겐을 섬유소용해 효소인 플라스민으로 전환시키는 분비 세린 프로테아제이다. 이 효소는 세포 이동 및 조직 재형성을 담당한다. tPA를 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 NP_127509 및 NP_000921 (양자 공히 인간)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
tPA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 NM_033011 및 NM_000930 (양자 공히 인간)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
내인성 단백질
모방체
본 발명의 치료학적 유전자-스위치 작제물은, 예를 들어 다음과 같이 내인성 단백질의 치료 모방체를 발현하기 위해 사용될 수 있다.
알파네이트 (응고 인자 III)는 칼슘 및 인지질과 함께 인자 X를 활성형의 인자 Xa로 전환시키기 때문에, 인자 IXa에 대한 공인자로 작용한다. 알파네이트는 정제된 인자 VIII (또한 항혈우병 인자로도 알려짐) 및 폰빌브란트(von Willebrand) 인자이다. 알파네이트는 혈우병 A 또는 획득 인자 VIII 결핍으로 인한 인자 VIII 결핍 환자에서 출혈 예방 및 조절용으로 승인되었다. 인자 VIII을 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAA52485 (인간); 및 AAA37385 (마우스)로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
인자 VIII을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 M14113 (인간); 및 L05573 (마우스)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
아라라스트 (Aralast) (알파-1 단백질분해효소 저해제) 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAB59375 (인간 알파 1-항트립신); AAC28869 (마우스 알파-1 프로테아제 저해제); 및 AAA40788 (래트 알파-1 -항트립신)로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
알파-1 단백질분해효소 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 K01396 (인간) ; M75721 (마우스); 및 M32247 (래트)로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
네시리타이드 (Natrecor®)는 휴식시 호흡곤란이 있거나 또는 활동성이 최소인 급성 탈대상성 울혈성 심부전 (CHF) 환자의 정맥내 치료용으로 승인된 인간 B-형 나트륨 배설 촉진 펩티드 (hBNP)의 재조합 형태이다. 뇌의 나트륨 배설 촉진 펩티드를 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 NP_002512로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 원용된다.
뇌의 나트륨 배설 촉진 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 NM_002521로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
인간 인슐린을 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAH05255로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
인간 인슐린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 BC005255로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
과립구/대식세포 집락자극인자 (GM-CSF)는 백혈구 세포 성장 인자로서 기능하고, 줄기 세포를 자극하여 과립구 (중성구, 호산구 및 호염기구) 및 단핵구를 생성하는 사이토카인이다. 과립구/대식세포 집락자극인자 (GM-CSF)를 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAA52122 (인간); NP_034099 (마우스); NP_001032749 (래트 Csf2ra); 및 NP_598239 (Csf2rb)로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
GM-CSF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 M11734 (인간); NM_009969 (마우스); NM_001037660 (래트 Csf2ra); 및 NM_ 133555 (래트 Csf2rb)로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
에리스로포이에틴을 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAH93628 (인간); AAI19266 (마우스); 및 BAAO1593 (래트)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
에리스로포이에틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 BC093628 (인간); BC119265 (마우스); 및 D10763 (래트)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
성장 호르몬을 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 AAA98618 (인간); NP_032143 (마우스); 및 NP_001030020 (래트)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
성장 호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 M13438 (인간); NM_008117 (마우스); 및 NM_001034848 (래트)으로 입수할 수 있으며, 그의 서열은 본 원에 참고로 도입된다.
재조합 단백질
본 발명의 치료학적 유전자-스위치 작제물은 치료 재조합 단백질, 예컨대 보툴리눔 독소를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 보툴리눔 독소는 신경 말단에서 신경전달물질 아세틸콜린 방출을 억제하며, 근육긴장이상 및 자궁목 근육긴장이상을 동반한 사시 및 안검경련 치료를 위해 BOTOX 명으로 시판되고 있다. BOTOX는 또한 비정상 근육 수축이 특징인 반얼굴연축 및 다수의 기타 신경계 장애를 치료하기 위해 사용된다. 보툴리눔 신경독소 A 형 전구체 (BoNT/A) (본톡실리신-A) (BOTOX)를 코딩하는 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 목록번호 P10845로 입수할 수 있다.
심혈관 질환 치료
본 발명은 또한 치료를 요하는 대상에 앞에서 언급한 스위치 단백질 조절하에 심혈관 관련 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 치료학적 유전자 산물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방 방법에 관한 것이다. 이러한 치료는 치료할 대상에 직접 전달될 수 있거나, 또는 본 원의 다른 부분에 기술된 하나 이상의 치료 단백질 또는 치료 폴리펩티드를 분비하는 비-변형되었거나 유전적으로 변형된 캡슐화 또는 비-캡슐화 세포를 함유한 생물반응기를 통할 수 있다. 이러한 구체예에 따라, 세포는 대상에 이식되는 경우, 예를 들어, 심혈관 질환 환자의 경색 구역에서 심혈관 질환의 치료에 효과적인 하나 이상의 치료학적 유전자 산물을 발현할 것이다. 이와 같은 치료학적 유전자 산물의 예는 이후에 보다 상세히 기술될 것이다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 치료학적 유전자 산물을 구성적으로 발현하며, 즉, 하나 이상의 외래 치료학적 유전자 산물이 세포에서 연속적으로 발현된다. 또한, 세포에 의해 발현되는 1, 2, 3개 또는 그 이상의 외래 치료학적 유전자 산물 발현이 치료학적 유전자 스위치에 의해 조절된다. 특정 측면으로, 심혈관 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 생물반응기는 캡슐화 세포를 포함하며, 예를 들어, 세포는가 알기네이트를 기반으로 한 제제중에 캡슐화된다. 예를 들어, 치료 대상으로부터 물리적 또는 면역적 배리어를 제공하기 위한 세포 캡슐화의 예 및 빙법은 본 원의 다른 부분에서 상세히 설명된다.
본 발명은 또한 프로모터와의 작동가능한 조합을 통해 심혈관 질환을 치료, 개선 또는 예방하는데 유용한 치료학적 유전자 산물, 예를 들어, 치료 폴리펩티드 및/또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 특정 구체예로, 치료학적 유전자 산물의 발현을 조절하는 프로모터는 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되며, 여기에서 적어도 전사 인자의 일 부분은 하나 이상의 치료 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 발현되고, 치료 스위치 프로모터의 활성은 구성적이고/이거나, 조직 타입과 관련되거나, 질환, 장애 또는 증상과 관련된 조건하에 조절된다. 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방과 관련한 구체예에 있어서, 치료 스위치 프로모터는, 예를 들어 심장-특이적 프로모터, 또는 울혈성 심부전, 허혈성 심장 질환, 고혈압 심장 질환, 심장동맥 질환, 말초 혈관 질환 및 허혈성 심장 사건, 예를 들면, 심근 경색, 심장 발작, 심부전, 부정맥, 심근 파열, 심장막염 및 심인성 쇼크 등과 같은 증상동안 활성화되는 프로모터일 수 있다. 전형적인 프로모터가 표 1 내지 3에 예시되었다. 추가의 프로모터가 본 원의 다른 부분, 예를 들어 실시예 1 내지 8에 기술되었다. 추가의 프로모터가 또한 본 원에 기술된 방법을 이용하여 용이하게 동정될 수 있다.
심장 세포에서나, 심장 질환, 장애 또는 증상과 관련된 증상하에서 유전자 스위치 발현 조절에 유용한 치료 스위치 프로모터의 예로는 심장 근육세포에 조직-특이적인 S100A6 프로모터 (Tsoporis et al., J. Biol. Chem. (2008) (Epub ahead of print; PMID:18753141)); 심방 나트륨이뇨 인자 (ANF) 프로모터, 알파-미오신 중쇄 프로모터, c-fos 프로모터, BNP 프로모터 또는 알파 액틴 프로모터 [이들은 모두 심근육세포에 조직-특이적임] (Nelson et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 39(3):479 (2005)); 허혈 상태하에 심근에서 활성화되는 에리스로포이에틴 프로모터 (Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(14):9480 (2002)); 알파B-크리스탈린 (CRYAB) 프로모터, 예를 들면 척추동물의 접안 렌즈에 조직-특이적인 BRG1-반응 요소 (Duncan B. and Zhao K. DNA Cell. Biol. 26(10):745 (2007)); 시스-작용 조절 요소를 갖는 알파B-크리스탈린 (CRYAB) 프로모터, 예를 들어, 골격근에 조직-특이적인 알파 BE-1, 알파 BE-2, 알파 BE-3 및 MRF (Gopal-Srivastava et al., J. Mol. Cell Biol. 15(12):7081 (1995)); 심근육세포에 조직-특이적인 NCX1 프로모터 (Xu et al, J. Biol. Chem. 281(45):34430 (2006)); 심근육세포에 조직-특이적인 베타 미오신 중쇄 프로모터 (Nelson et al, J. Mol. Cell Cardiol. 39(3):479 (2005), Ross et al, Development. 122(6):1799 (1996) 및 Lee et al, Mol. Cell. Biol. 14(2):1220 (1994)), HF-1a/HF-1b/MEF-2 복합 요소 (Ross et al, Development. 122(6):1799 (1996)) 또는 HF-1a/HF-1b 요소 및 HF-3 조절 요소 (Lee et al, Mol. Cell. Biol. 14(2):1220 (1994))를 포함하는 심장 심실에 조직-특이적인 미오신 경쇄-2 심실 프로모터; 미오신 경쇄 프로모터, 예를 들어, 골격근 발달 중에 분화적으로 활성화되는 MLC1F 및 MLC3F (Kelly et al, J. Cell. Biol. 129(2):383 (1995)); 심장 근육에 조직-특이적인 미오신 경쇄 2v (MLC-2v) 프로모터 (Su et al, Proc. Natl Acad. Sd. U.S.A. 101(46):16280 (2004)); 및 심장 근육에 조직-특이적이고 발생 단계-특이적인 심장 트로포닌 I (TnIc) 프로모터 (Bhavsar et al, J. Mol. Cell Cardiol. 32(1):95 (2000))가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 언급된 핵산 조성물을 포함하는 하나 이상의 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 하나 이상의 유전자 변형된 세포를 제공한다. 이 세포는 치료 대상에 대해 동종이형, 자가형 또는 이종발생성일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 언급된 변형 세포를 포함하며, 이 세포는 대상에 도입시 대상의 면역 시스템으로부터 보호하고자 하는 방식으로 처리된 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 하나 이상의 캡슐화 방법을 제공한다. 이와 같은 치료는 공형 코팅, 마이크로캡슐화 또는 마크로캡슐화의 제공을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
심혈관 질환으로는 울혈성 심부전, 허혈성 심장 질환, 고혈압 심장 질환, 심장동맥 질환, 말초 혈관 질환 및 허혈성 심장 사건, 예를 들면, 심근 경색, 심장 발작, 심부전, 부정맥, 심근 파열, 심장막염 및 심인성 쇼크가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 이벤트의 원인으로는 혈전증, 색전증, 죽상동맥경화증 및 협착이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 경향을 띠는 군으로는 흡연가, 당뇨병, 고혈압 또는 지질이상증을 앓고 있는 사람이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방에 적절한 치료학적 분자에는 프로혈관형성 인자, 심장보호 인자 및 심장재생 인자가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
심혈관 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 본 발명에 유용한 치료학적 분자에는 심방 나트륨 배설 촉진 인자 (ANF), 카르페리타이드 (carperitide), 뇌의 나트륨 배설 촉진 인자 (BNP), 네시리타이드 (nesiritide), 렐락신(relaxin), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF165), 간세포 성장 인자 (HGF), 안지오포이에틴-1 (Ang-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 섬유모세포 성장 인자 4 (FGF-4), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 저산소증-유도성 인자1-알파 (HIF1-알파), 에리스로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성체 (tPA), 성장 호르몬, 기질-유래 인자-1 (SDF-1), 사르코-세포질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a),아데닐사이클라제 타입 VI (AC6), S100A1, 파르발부민, 포스파타제 저해제 2 및 포스파타제 저해제 1이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 분자는 다양한 기전, 예를 들어, 혈류역학, 혈관형성, 심장 재생, 항-섬유증 및/또는 심장 복원을 통해 심장 조직에 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 이들 치료학적 분자는 다중 치료 작용을 제공할 수 있으며, 상호 또는 공개된 다른 분자와 함께 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 프로-혈관형성 유전자 치료 임상 실험이 신생혈관화를 촉진하는데 유용한 치료 단백질을 이용하여 현재 진행중이다. 이들에는 프로-혈관형성 인자, 예컨대 VEGF, HGF, bFGF, Ang-1, FGF-4, IGF-1 및 HIF1-알파와 이들의 단편, 변이체 및 유도체가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 신생혈관화를 촉진하는 적절한 분자의 동정은 당업자들이 실시할 수 있는 수준이다. 이러한 프로-혈관형성 인자는 경색 구역에 산소 및 영양분을 공급하도록 신생혈관형성을 자극한다. 이는 경색 구역이 확장되는 것을 제한하고 경색으로 이동하는 임의의 심장 전구체를 유지할 것이다.
실제로, 프로-혈관형성 인자 VEGF165는 신생혈관화를 유도하는 것으로 알려졌다 (Benest et al, Microcirculation. 13(6):423 (2006); Riley et al, Biomaterials. 27(35):5935 (2006); Shyu et al, Life Sci. 73(5):563 (2003); Arsic et al., Mol Ther. 7(4):450 (2003); Ye et al., J. Heart Lung Transplant. 24(9):1393 (2005); Lubiatowski et al, Plast. Reconstr. Surg. 110(1):149 (2002) (Erratum in: Plast. Reconstr. Surg. 111(3):1380 (2003)); Kim et al., Ann. Thorac. Surg. 83(2):640 (2007) (Comment in: Ann. Thorac. Surg. 83(2):646 (2007)); Thurston G., J. Anat. 200(6):575 (2002); Ryu et al, Mol. Ther. 13(4):705 (2006); Chae et al, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20(12):2573 (2000); 및 Chen et al, Acta. Pharmacol. Sin. 28(4):493 (2007)). 신생혈관화를 치료하는데 있어서 초기 임상 실험의 결점은 부분적으로 고용량의 성장 인자를 단일 투여하는 것에 기인한다. 참조: Zacchigna et al., Hum. Gene Ther. 18(6):515 (2007) 및 Yla-Herttuala et al, J Am Coll Cardiol. 49(10):1015 (2007) (Comment in: J Am Coll Cardiol. 50(2):186 (2007)). 그때 이래로, VEGF 발현 및 방출에 대한 전임상 데이터는 장기 노출은 안정한 혈관 형성으로 이어지는데 반해, 단기 전달은 단지 용이하게 퇴행되는 누출 혈관을 생성함을 시사하고 있다. 예를 들어, VEGF-A-생성 근육모세포로 인한 고 국소 농도는 비정상 누출 혈관을 초래하는데 반해 적량의 성장 인자는 건강한 혈관의 성장이 개시되도록 하였다. 참조: Arsic et al., Mol Ther. 7(4):450 (2003); Benest et al., Microcirculation. 13(6):423 (2006); Yamauchi et al, J Gene Med. 5(11):994 (2003); Jiang et al, Acta Cardiol. 61(2):145 (2006); Ozawa et al, J Clin Invest. 113(4):516 (2004). 또한, VEGF (혈관형성 개시) 및 Ang-1 (혈관 성숙)의 조합으로 혈관 성장이 더욱 안정해 지는 것으로 나타났다. 참조: Thurston G., J Anat. 200(6):575 (2002); Jiang et al, Acta Cardiol. 61(2):145 (2006); Benest et al, Microcirculation. 13(6):423 (2006); Zhou et al, Gene Ther. 12(3):196 (2005) (Erratum in: Gene Ther. 12(6):552 (2005); Liu et al, Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007); Shyu et al, Life Sci. 73(5):563 (2003); Yamauchi et al, J Gene Med. 5(11):994 (2003); Arsic et al, Mol Ther. 7(4):450 (2003); Ye et al, J Heart Lung Transplant. 24(9):1393 (2005); Ye et al, Eur J Heart Fail 9(1):15 (2007); Lubiatowski et al, Plast Reconstr Surg. 110(1):149 (2002) (Erratum in: Plast Reconstr Surg. 111(3):1380 (2003)); Ryu et al, Mol Ther. 13(4):705 (2006); Chen et al, Eur J Pharmacol. 568(1-3):222 (2007); Chae et al, Arterioscler Thromb Vase Biol. 20(12):2573 (2000); 및 Chen et al, Acta Pharmacol Sin. 28(4):493 (2007).
따라서, 프로-혈관형성 인자 VEGF 165는 심근 경색 (Zhou et al, Gene Ther. 12(3):196 (2005) (Erratum in: Gene Ther. 12(6):552 (2005); Ye et al, Circulation. 116(11 Suppl): I113 (2007); Liu et al, Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007); Ye et al, Eur. J. Heart Fail. 7(6):945 (2005); Zhang et al, Cell Transplant. 14(10):787 (2005); Bonaros et al, Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. 7(2):249 (2008); Shyu et al, J. Biomed. Sci. 13(1):47 (2006); Ventura et al, J Biol Chem. 282(19):14243 (2007); Sugimoto et al., Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 51(5):192 (2003); Yau et al., Ann. Thorac. Surg. 83(3):1110 (2007) (Comment in: Ann Thorac Surg. 83(3):1119 (2007)); Rong et al., Chin. Med. J. (Engl). 121(4):347 (2008); Yang et al., Cardiology. 107(1):17 (2007); Wang et al, J. Mol. Cell Cardiol. 40(5):736 (2006); Chen et al, Eur J Clin Invest. 35(11):677 (2005); Suzuki et al, Circulation. 104(12 Suppl): I207 (2001); Ye et al, Ann. Acad. Med. Singapore. 32(5 Suppl):S21 (2003); 및 Haider et al, J Mol Med. 82(8):539 (2004) (Comment in: J Mol Med. 82(8):485 (2004))) 또는 허혈 또는 재관류 손상 (Becker et al, Int J Cardiol. 113(3):348 (2006); Gao et al, Can. J. Cardiol. 23(11):891 (2007); Ye et al Eur J Heart Fail 9(1):15 (2007); Chen et al, Eur. J. Pharmacol 568(1-3):222 (2007); 및 Jiang et al, Acta Cardiol 61(2):145 (2006))을 비롯하여 각종 심혈관 질환을 예방, 치료 또는 개선하는 것으로 공지되었다 (Yamauchi et al, J Gene Med. 5(11):994 (2003) 및 Xu et al, Cytotherapy. 6(3):204 (2004) (Comment in: Cytotherapy. 7(1):74 (2005))).
그밖에, 다능성 작용을 제공하는 다른 프로-혈관형성 인자 HGF (인간 뉴클레오티드 서열 목록번호: M29145, 인간 아미노산 서열 목록번호: NP_000592.3)가 본 발명에 유용하다. c-Met 수용체로 매개되는 HGF는 내피 세포상에서 분열촉진 활성을 통한 프로-혈관형성 효과, 심근육세포상에서 심장보호 항-아폽토시스 효과, TGF-베타1 신호전달 억제를 통한 항-섬유화 효과를 제공하며, CD117(+)/c-Met(+) 줄기 세포를 허혈성 심근으로 이동시키는 I 타입 콜라겐 재생 인자이다. 참조: Li et al, Chin Med J (Engl) 121(4):336 (2008); Guo et al, Arch. Med. Res. 39(2):179 (2008); Ventura et al, J. Biol. Chem. 282(19):14243 (2007); Yang et al, Gene Ther. 13(22):1564 (2006); Tambara et al, Circulation. 112(9 Suppl):I129 (2005); Zhang et al, Tissue Eng. Part A. 14(6):1025 (2008); 및 Sakaguchi et al, Ann. Thorac. Surg. 79(5):1627 (2005).
유사하게, bFGF (아미노산 서열 목록번호 NP_001997)는 혈관형성, 신생혈관화 및 조직 재생을 촉진함으로써 심장보호에 상보 효과를 가지는 것으로 입증되었다 (Doi et al, Heart Vessels. 22(2):104 (2007); Fujita et al, J. Surg. Res. 126(1):27 (2005); Fujita et al, Wound Repair Regen. 15(1):58 (2007); Hosaka et al, Circulation. 110(21):3322 (2004); Iwakura et al, Heart Vessels. 18(2):93 (2003); Lai et al, Tissue Eng. 12(9):2499 (2006); Nakajima et al, J. Artif. Organs. 7(2):58 (2004); Perets et al, J. Biomed. Mater. Res. A. 65(4):489 (2003); Pike et al, Biomaterials. 27(30):5242 (2006); Sakakibara et al, J Thorac Cardiovasc Surg. 124(1):50 (2002); Sakakibara et al, Eur J Cardiothorac Surg. 24(1):105 (2003); Shao et al, Circ J. 70(4):471 (2006); Tabata Y. and Ikada Y., Biomaterials. 20(22):2169 (1999); Yamamoto et al., Artif. Organs. 27(2):181 (2003); Yamamoto et al., Jpn. Circ. J. 65(5):439 (2001); Yang et al, Ophthalmic Res. 32(1):19 (2000); 및 Zhu et al., Chin. Med. Sci. J. 15(4):210 (2000)). 특정 구체예에 있어서, bFGF는 골관절염을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 참조; Inoue et al., Arthritis Rheum. 54(1):264 (2006).
IGF-1 (인간 아미노산 서열 목록번호: NP_001104753.1)은 아폽토시스로부터 심근육세포를 보호하고 신생혈관화를 증가시키는데 다능성 기능을 발휘하는 것으로도 알려졌으며 (Su et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284(4):H1429 (2003); Chao et al., J. Gene Med. (4):277 (2003); Rabinovsky E.D. and Draghia-Akli R., Mol Ther. 9(1):46 (2004); 및 Barton et al, Circulation. 112(9 Suppl):I46 (2005)), 본 발명에 사용될 수 있다.
또한, FGF-4는 심근 혈관형성/동맥형성을 유도함으로써 만성 허혈성 심장 질환을 예방, 치료 또는 개선하는데 치료학적 분자로서 사용될 수 있다 (Kapur N.K. and Rade J. J., Trends Cardiovasc. Med. 18(4):133 (2008); Henry et al, J. Am. Coll. Cardiol. 50(11):1038 (2007); Grines et al; Am. J. Cardiol 92(9B):24N (2003); (저자 목록 없음) BioDrugs. 16(1):75 (2002)).
그밖에, HIF1-알파 유전자 요법, 예를 들어, HIF1-알파 (aa 1-390)/VP16 (aa 413-490)은 BNP 유전자 발현을 증가시키거나 (Rajagopalan et al, Circulation. 115(10):1234 (2007) (Comment in: Circulation. 115(10):1180 (2007)); Wilhide M.E. and Jones W.K., Mol Pharmacol. 69(6):1773 (2006) (Comment on: Mol Pharmacol. 69(6):1953 (2006)); Luo et al, Mol Pharmacol 69(6):1953 (2006) (Comment in: Mol. Pharmacol 69(6):1773 (2006)), 심근 경색에서 혈관형성을 향상시킴으로써 (Shyu et al, Cardiovasc Res. 54(3):576 (2002); Vincent et al, Circulation. 102(18):2255 (2000)) 허혈성 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 것으로 입증되었다.
특정 구체예에 있어서, 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 심장보호 인자는 단독으로 제공되거나, 또는 혈관형성 인자 및/또는 심장 재생 인자와 함께 제공된다. 심장보호 분자는 존재하는 심근육세포에 항-섬유화, 항-아폽토시스 신호를 제공하여 경색 구역 크기를 제한하고, 이동 줄기 세포에 생존 신호를 공급한다. 특정 구체예에 있어서, 심장보호 인자는 에리스로포이에틴 알파 (EPO) (인간 아미노산 목록번호 CAA26095.1), 예를 들어, 인간 에리스로포이에틴 알파 또는 EPOGEN® (아메겐사(Amgen) 제품)이다. 에리스로포이에틴은 심장보호, 혈관형성 및 신경보호 효과를 가지는 것으로 입증되었다 (Ben-Dor et al, Cardiovasc Drugs Ther. 21(5):339 (2007); Lin et al, Circ J. 71(1):132 (2007); Prunier et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292(1):H522 (2007)).
실험적인 심근 허혈-재관류 손상으로부터 보호하는 것으로 입증된 그밖의 다른 심장보호 호르몬으로는 아드레노메듈린, 브래디키닌, 렐락신, 심방 나트륨 배설 촉진 펩티드 (ANP, 인간 뉴클레오티드 서열 목록번호: NM_006172, 인간 아미노산 서열 목록번호: NP_006163)로도 알려져 있는 ANF, B-형 나트륨 배설 촉진 펩티드 또는 GC-B (인간 아미노산 서열 목록번호: NP_002512.1; 인간 뉴클레오티드 서열 목록번호: M25296)로도 알려져 있는 BNP, C-형 나트륨 배설 촉진 펩티드 (CNP), 카르페리타이드, 조직 플라스미노겐 활성체 (tPA) 및 유로코르틴이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 섬유증을 감소시키거나, 혈류역학을 중재하는 것으로 입증된 것 또한 다수 있다. 네시리타이드 (상표명 Natrecor®, 시오스사(Scios) 판매), 인간 B-형 나트륨 배설 촉진 펩티드의 재조합형, ANF 및 카르페리타이드가 급성 탈대상성 심부전을 치료, 개선 또는 예방하는데 사용되며, 본 발명에 또한 사용될 수 있다 (Burnett J.C. Jr., J. Cardiol. 48(5):235 (2006)).
여성 생식기계통에 그의 효과가 있는 것으로 알려진 렐락신 (인간 아미노산 목록번호 NP_604390.1)이 또한 산화질소가 연루된 작용 기전으로 전신 및 심장 순환기의 효능있는 혈관확장제이며, 심장 박동수에 영향을 미친다. 렐락신은 또한 허혈성 심장 질환 (급성 및 만성 심근 경색), 심장 섬유증 및 폐쇄 말초 동맥 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있고, 세포 이식시 심장 기능을 복원하는 심혈관약으로도 알려져 있다 (Nistri et al., Pharmacol. Res. 57(1):43 (2008); Samuel et al, Adv. Exp. Med. Biol. 612:88 (2007); Du XJ., J. Cell Mol. Med. 11(5):1101 (2007); Formigli et al, J. Cell Mol. Med. 11(5):1087 (2007); Bathgate et al, Mol. Cell Endocrinol. 280(1-2):30 (2008); Nistri et al, Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5(2):101 (2007); Moore et al, Endocrinology. 148(4):1582 (2007); Lekgabe et al, Endocrinology. 147(12):5575 (2006); Samuel et al, Pharmacol. Ther. 112(2):529 (2006); Zhang et al, Peptides. 26(9):1632 (2005); Perna et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041:431 (2005); Perna et al, FASEB J. 19(11):1525 (2005); Samuel et al, Endocrinology. 145(9):4125 (2004); Masini et al, Br J Pharmacol. 137(3):337 (2002); Ndisang et al, Inflamm. Res. 50 Suppl. 2:S122-3 (2001); Dschietzig et al., FASEB. J. 15(12):2187 (2001); Bani et al, Am J Pathol. 152(5):1367 (1998); 및 Masini et al, Inflamm. Res. 45 Suppl 1 :S27 (1996)).
특정 구체예에 있어서, 심혈관 질환의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 본 발명의 치료 단백질은 복합적인 치료 이점을 지닌다. 예를 들어, 심근 경색후 초기 단계에, 상승 (SDF-1, 인간 뉴클레오티드 서열 목록번호: U16752, 인간 아미노산 서열 목록번호: NP_954637) 수준이 경색 구역에서 보고되었다. 이는 자연적인 복원 과정의 일 부분으로서 줄기 세포가 BM 소와에서 손상된 부위로 이동하는데 필요한 자극을 제공한다. SDF-1은 골수 조혈 줄기 세포 (주로 CD31+, C-kit+ 및 CD34+ 세포)를 경색된 심장에 동원하여 신생혈관형성 및 심장보호 활성 모두로 이어지게 한다. 또한, SDF-1은 G 단백질-결합 수용체 CXCR4 재생 인자를 통해 세포-생존 인자 단백질 키나제 B (PKB/Akt)를 활성화한다. 참조: 미국 특허 출원 공개 제20060111290 A1호; Elmadbouh et al., J Mol. Cell Cardiol. 42(4):792 (2007); Bonaros et al, Interact Cardiovasc Thorac Surg. 7(2):249 (2008); Zhang et al., J Mol. Cell Cardiol. 44(2):281 (2008); Ma et al, Basic Res Cardiol. 100(3):217 (2005); 및 Zhang et al, Tissue Eng. 13(8):2063 (2007).
또한, tPA (인간 아미노산 목록번호 28274638), 예를 들어, 인간 조직 플라스미노겐 활성체 또는 Retavase® (PDL BioPharma, Inc. 제품)은 이식편 죽상동맥경화증을 억제함으로써 심장 이식후 합병증을 예방, 치료 또는 개선하는 것으로 입증되었다 (Scholl et al, J Heart Lung Transplant. 20(3):322 (2001); Dunn et al, Circulation. 93(7):1439 (1996) (Comment in: Circulation. 93(7):1319 (1996)); 및 Gong et al, Gene Ther. 14(21):1537 (2007)). 그밖에, 성장 호르몬도 또한 혈관형성을 촉진하고, 아폽토시스를 약화시킴으로써 (Rong et al, Chin Med J (Engl). 121(4):347 (2008)) 심혈관 질환을 예방, 치료 또는 개선하는 것으로 알려졌으며, 본 발명에 사용될 수 있다 (Isgaard J. and Bergh C.H., BioDrugs. 12(4):245 (1999); Fazio et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 92(11):4218 (2007); Climent et al, Curr Med Chem. 14(13):1399 (2007); Perez-Berbel et al, Int J Cardiol. 124(3):393 (2008) (Comment on: Int J Cardiol. 110(3):313 (2006)); 및 Le Corvoisier et al, J Clin Endocrinol Metab. 92(l):180 (2007)).
또 다른 구체예에 있어서, 심장 기능을 복원하는 치료학적 분자가 본 발명에 포함된다. 심장 복원 분자는 SERCA2a, AC6, S100A1, 파르발부민, 포스파타제 저해제 2 및 포스파타제 저해제 1을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, SERCA2a는 생체내 및 시험관내에서 심장 수축 및 심부전에서 심장 기능을 향상시키는 것으로 알려졌다 (Asahi et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 101(25):9199 (2004); Cavagna et al, J Physiol. 528 Pt 1:53 (2000); Chaudhri et al., Mol. Cell Biochem. 251(1-2):103 (2003); Davia et al, J Mol. Cell Cardiol. 33(5):1005 (2001); del Monte et al, Circulation. 100(23):2308 (1999) (Comment in: Circulation. 100(23):2303 (1999); del Monte et al, Circulation. 104(12):1424 (2001); Hajjar et al, Circ Res. 81(2):145 (1997) (Comment in: Circ Res. 88(4):373 (2001) and Circulation. 101(7):790 (2000)); Kawase et al, JAm Coll Cardiol. 51(11):1112 (2008); Maier et al, Cardiovasc Res. 67(4):636 (2005) (Comment in: Cardiovasc Res. 67(4):581 (2005); Meyer M. and Dillmann W.H., Cardiovasc Res. 37(2):360 (1998); Miyamoto et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 97(2):793 (2000); Muller et al, Cardiovasc Res. 59(2):380 (2003); Sakata et al, J Mol. Cell Cardiol. 42(4):852 (2007); Sakata et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(2):H1204 (2007); Schmidt et al, Circulation. 101(7):790 (2000) (Comment in: Circulation. 101(7):738 (2000), Circ Res. 81(2):145 (1997), Circ Res. 83(9):889 (1998) and Circulation. 95(2):423 (1997)) Suarez et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287(5):H2164 (2004); Terracciano et al, Cell Calcium. 31(6):299 (2002); Trost et al, Diabetes. 51(4):1166 (2002); 및 Vetter et al, FASEB J. 16(12):1657 (2002)).
그밖에, AC6은 심근병증에서 근육세포질 세망에 의한 심장 칼슘 흡수의 최대 속도 및 칼슘에 대한 SERCA2a의 친화성을 회복시키는 것으로 알려졌다 (Gao et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 95(3):1038 (1998); Roth et al, Circulation. 99(24):3099 (1999); Lai et al, Circulation. 102(19):2396 (2000); Roth et al, Circulation. 105(16):1989 (2002) (Comment in: Circulation. 105(16):1876 (2002)); Gao et al, Cardiovasc Res. 56(2):197 (2002) (Comment in: Cardiovasc Res. 56(2):181 (2002)); Roth et al, Basic Res Cardiol. 98(6):380 (2003); Roth et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287(1):H172 (2004); Gao et al, J Biol Chem. 279(37):38797 (2004); Tang et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(5):H1906 (2004); Lai et al, Circulation. 110(3):330 (2004) (Comment in: Circulation. 110(3):242 (2004); Roth et al, Hum Gene Ther. 15(10):989 (2004); Timofeyev et al, J Mol. Cell Cardiol. 41(l):170 (2006) (Comment in: J Mol. Cell Cardiol. 41(3):424 (2006); Takahashi et al, Circulation. 114(5):388 (2006) (Erratum in: Circulation. 114(11):e497 (2006); Comment in: Circulation. 114(5):365 (2006); Sastry et al, J Am Coll Cardiol. 48(3):559 (2006); Rebolledo et al, Hum Gene Ther. 17(10):1043 (2006); Hammond H.K., Ann N Y Acad Sci. 1080:426 (2006); Phan et al, Trends Cardiovasc Med. 17(7):215 (2007); Tang et al, Circulation. 117(1):61 (2008); 및 Lai et al, J Am Coll Cardiol. 51(15):1490 (2008)).
특정 구체예에 있어서, Ca2+-결합 단백질 S100A1은 심장 기능을 복원시킬 수 있고, 따라서 본 발명에 사용될 수 있다. S100A1은 생체내에서 심근수축을 증가시키고, 심근 경색 후 심부전 경향을 감소시키는 것으로 알려졌다 (Most et al, J Clin Invest. 114(11):1550 (2004); Most et al, Circulation. 114(12):1258 (2006); Pleger et al, Mol Ther. 12(6):1120 (2005); Pleger et al, Eur J Med Res. 11(10):418 (2006); Remppis et al, J Gene Med. 6(4):387 (2004); Most et al, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 293(2):R568 (2007); Remppis et al, Basic Res Cardiol. 97 Suppl 1:I56 (2002); Pleger et al, Circulation. 115(19):2506 (2007); 및 Most et al, J Biol Chem. 278(36):33809 (2003)). 심장 기능을 개선하거나 복원시키는 치료학적 분자의 예는 파랄부민 (Hirsch et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286(6):H2314 (2004); Michele et al, Mol Ther. 10(2):399 (2004); 및 Sakata et al, J Mol. Cell Cardiol. 42(4):852 (2007)), 포스파타제 저해제 2 (Yamada et al, FASEB J. 20(8):1197 (2006); Gupta et al, Mol. Cell Biochem. 269(1-2):49 (2005); 및 Kirchhefer et al, Cardiovasc Res. 68(1):98 (2005)) 및 포스파타제 저해제 1 (Gupta et al, Mol. Cell Biochem. 269(1-2):49 (2005) 및 Gupta et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285(6):H2373 (2003))을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
질병 또는 장애를 예방, 치료 또는 개선하기 위해 본 발명에 유용할 수 있는 추가의 치료학적 분자는 모노클로날 항체 (예를 들어, HERCEPTIN®-HC, HERCEPTIN®-LC, TICILIMUMAB®-HC, TICILIMUMAB®-LC, ZENAPAX®-HC, ZENAPAX®-LC, HUMIRA®-HC, HUMIRA®-LC, RITUXAN®-HC, RITUXAN®-LC, IPILIMUMAB®-HC, IPILIMUMAB®-LC, AVASTIN®-HC, AVASTIN®-LC, Erbitux®-HC 및 ERBITUX®-LC), 재조합 효소 (예를 들어, RETAVASE®, ACTRAPID®-A 쇄, ACTRAPID®-B 쇄, NEULASTA®, 프레-프로 인슐린, EPOGEN® 및 NORDITROPIN®), 융합 단백질 (예를 들어, ENBREL®) 또는 임의의 정제 단백질 (예를 들어, ALPHANATE® 및 ARALAST®)을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 특정 질병 또는 장애를 예방, 치료 또는 개선하기에 적절한 치료학적 분자를 동정하는 것은 당업자들의 능력 범위내에 있다.
벡터 및 숙주 세포
폴리뉴클레오티드를 세포에 도입시키기 위하여, 벡터가 이용될 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 외가닥 또는 이중가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 DNA 및 RNA를 세포로 도입하기 위해 익히 공지된 기법으로 세포내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제가 가능하거나, 복제 결여성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 전파는 일반적으로 상보 바이러스 적격 세포에서만 일어날 것이다.
따라서, 최소한, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하여야 한다. 벡터의 다른 성분으로는 선별용 마커, 크로마틴 변형 도메인, 벡터상에 또한 존재할 수 있는 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 치사 폴리펩티드)의 발현을 유도하는 추가적인 프로모터, 게놈 통합 부위, 재조합 부위 및 분자 삽입 피봇(pivot)이 포함될 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 벡터는 의도하는 특정 치료 방법의 목적에 맞추어 질 수 있도록 벡터가 폴리뉴클레오티드내 또는 이곳이 아닌 곳에 임의 수의 이들 추가적인 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포로 도입되는 벡터는 발현시 본 발명의 치료학적 유전자 스위치 작제물이 변형된 세포의 게놈내로 통합되었음을 지시하는 "선별용 마커 유전자"를 추가로 포함한다. 이러한 방식으로 선별된 유전자는 게놈 통합에 양성적인 마커일 수 있다. 본 발명에서 중요한 것은 아니지만, 선별용 마커 유전자의 존재로 진료의는 벡터 작제물이 세포 게놈내로 통합된 생세포 군을 선택할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 벡터가 성공적으로 통합된 세포를 선별하는 것을 포함한다. 본 원에서 사용된 용어 "선별" 또는 그의 변형어는 세포와 관련하여, 표준의 익히 공지된 방법으로 특이적 유전 인격형 또는 표현형을 가지는 세포를 선택하는 것을 의미하고자 한다. 전형적인 방법은 세포를 항생제, 예컨대 G418, 네오마이신 및 암피실린의 존재하에 배양하는 것을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 선별용 마커 유전자의 다른 예로는 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신 또는 마이코페놀산에 내성을 부여하는 유전자가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 선별 방법은 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스포라제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스포라제를 선별제로 사용하도록 하는 선별용 마커 유전자를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 항생제 내성 유전자(들)를 포함하는 벡터 작제물을 갖는 세포는 배양시 항생제를 견딜 수 있다. 마찬가지로, 항생제 내성 유전자(들)를 포함하는 벡터 작제물을 갖지 않는 세포는 배양시 항생제를 견딜 수 없다.
본 원에 사용된 "크로마틴 변형 도메인" (CMD)이란 크로마틴 구조의 유지 및/또는 변경과 관련된 각종 단백질과 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 예컨대, DNA 단절체를 포함하나 이에만 한정되지 않는다. 참조: 본 원에 참고로 원용되는 Ciavatta et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 103:9958 (2006). CMDs의 예로는 치킨 β-글로불린 단절체 및 치킨 고감수성 부위 4 (cHS4)가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 유전자 프로그램 사이에 상이한 CMD 서열 (즉, 프로모터, 코딩 서열 및 3' 조절 영역)을 사용함으로써, 예를 들어, 기존 다중유전자 및 단일유전자 셔틀 벡터 사이의 "교환(swap)" 유전자 프로그램으로 시험관내에서 재결합시킨 기술 또는 다양한 미생물과 함께 "미니 상동성 암(mini homology arm)"과 상이한 CMD DNA 서열을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 크로마틴 변형 도메인의 다른 예는 당업계에 공지되었거나, 용이하게 동정할 수 있다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 특정 벡터는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 이러한 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 결합된 변형 세포에서 발현에 효과적인 시스-작용 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스-작용 인자는 변형 세포에 의해 공급되거나, 상보 벡터에 의해 공급되거나, 세포에 도입시 벡터 자체에 의해 공급된다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 각종 발현 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 에피솜(episomal) 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 예컨대 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 예컨대 SV40, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 수두 바이러스, 가광견병 바이러스 및 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 유래 벡터 및 이들 조합 유래 벡터, 예컨대 코스미드 및 파게미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소 유래 벡터를 포함한다. 이들 모두가 본 발명의 이러한 측면에 따른 발현을 위해 사용될 수 있다. 이와 관련한 발현을 위해, 일반적으로, 세포에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 전파하거나 발현하는데 적절한 임의의 벡터가 사용될 수 있다.
발현 벡터내 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 조절 서열(들), 예를 들어 mRNA 전사 지시 프로모터에 작동적으로 결합한다. 추가적인 프로모터의 대표적인 예로는 구성적 프로모터 및 조직 특이적 또는 유도성 프로모터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 구조 진핵세포 프로모터의 예로서 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터 (Hamer et al, J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (McKnight, Cell 31:355 (1982)); SV40 초기 프로모터 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)); 및 우두 바이러스 프로모터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 나열된 모든 것은 본 원에 참고로 포함된다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있는 프로모터의 추가적인 예에는 특이 단백질에 대한 조직-특이적 프로모터 및 다른 내인성 프로모터, 예컨대 알부민 프로모터 (간세포), 프로인슐린 프로모터 (췌장 베타 세포) 등이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 발현 작제물은 전사, 개시 및 종결 부위와 전사 영역에서 전사를 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 성숙 전사물의 코팅 부분은 개시부에 번역 개시 AUG 및 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적절히 위치하는 종결 코돈 (UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
또한, 작제물은 발현을 야기할 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 영역은 전사, 예컨대 무엇보다도 억제 결합 부위 및 인핸서를 제어함으로써 작동할 것이다
진핵세포 벡터의 예로 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG (Stratagene로부터 입수); pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Amersham Pharmacia Biotech로부터 입수); 및 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito 및 pCMV-EGFP (Clontech로부터 입수)가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 많은 다른 벡터들도 널리 공지되었으며, 상업적으로 입수가능하다.
유전자 프로그램 요소의 신속한 삽입 및 제거를 위해 분자 삽입 피봇을 포함하는 특히 유용한 벡터는 미국 공개 특허 출원 제2004/0185556호, 미국 특허 출원 제11/233,246호 및 국제 공개 출원 제WO 2005/040336호 및 WO 2005/116231호에 기술되어 있으며, 이들은 모두 참고로 원용되었다. 이러한 벡터의 예로는 본 원에 참고로 원용되는 WO 2007/038276호에 기술된 바와 같은 UltraVector™ 생성 시스템 (Intrexon Corp., Blacksburg, VA)을 들 수 있다. 본 원에 사용된, "유전자 프로그램"은 프로모터 (P), 발현 서열 (E) 및 3' 조절 서열 (3)을 포함하는 유전 요소의 조합이며, 여기에서 "PE3"은 유전자 프로그램이다. 유전자 프로그램내 요소들은 각 유전자 프로그램 요소를 플랭킹하는 분자 피봇 사이에서 용이하게 교환이 가능하다. 본 원에 사용된 분자 피봇은 선형 방식으로 배열된 적어도 두개의 비-가변 희귀 또는 진귀한 제한 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 일 구체예에 있어서, 분자 피봇은 선형 방식으로 배열된 적어도 세개의 비-가변 희귀 또는 진귀한 제한 부위를 포함한다. 전형적으로, 동일 유전자 프로그램내에서 임의의 한 분자 피봇은 임의의 다른 분자 피봇의 희귀 또는 진귀한 제한 부위를 포함하지 않을 수 있다. 주어진 제한 효소가 작용하는 6개 초과 뉴클레오티드의 동족 서열이 "희귀" 제한 부위로 언급된다. 그러나, 통계적으로 예측되는 것보다 빈번히 나타나는 6 bp의 제한 부위가 존재하며, 이들 부위 및 이들을 절단하는 엔도뉴클레아제가 "진귀한" 제한 부위로 언급된다. 희귀 또는 진귀한 제한 부위 효소의 예로는 AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, AflIII, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I 및 Sse8781 I가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
벡터는 또한 귀소 엔도뉴클레아제 (HE) 효소로 칭해지는 제 2 클래스의 제한 효소를 위한 제한 부위를 포함할 수도 있다. HE 효소는 대형 비대칭 제한 부위 (12-40 염기쌍)를 가지며, 이들의 제한 부위는 사실상 드물다. 예를 들어, I-SceI로 알려진 HE는 랜덤 서열의 7x1010 염기쌍 마다 단 한번 일어나는 것으로 예측되는 18 bp 제한 부위 (5'TAGGGATAACAGGGTAAT3' (서열번호 4))를 가진다. 이러한 발생율은 포유동물 게놈 크기의 20배인 게놈에서 단 한 부위에 상당한다. HE 부위의 희귀성은 HE 부위가 클로닝 벡터 플라스미드내에 적절한 위치에 포함되면, 유전자 조작이 유전자 프로그램의 통합성을 파괴시키지 않고 유전자 프로그램을 잘라낼 수 있을 가능성을 크게 증가시킨다.
숙주 세포에서 발현에 적절한 벡터 및 프로모터 선별은 주지의 절차이며, 벡터 작제 및 숙주 세포로의 도입을 위해 필요한 기술이고, 숙주 세포에서 그의 발현은 당업계에서는 일상적인 수준이다.
세포로의 폴리뉴클레오티드 도입은 일시적인 형질감염이면서 안정한 형질감염일 수 있거나, 또는 벡터의 부위-특이적 삽입일 수 있다. 벡터를 숙주 세포로 일시적이면서 안정하게 형질감염시키는 것은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 많은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 본 원에 참고로 원용되는 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185:527-37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.]에 기술되어 있다. 이들 안정한 형질감염 방법으로 세포의 게놈에 벡터가 랜덤하게 삽입될 수 있다. 더욱이, 벡터의 카피수 및 배향 또한 일반적으로 말해서 랜덤하다.
다른 구체예에 있어서, 부위-특이적 삽입은 리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입으로 수행될 수 있다. 요악하면, PhiC31 인테그라제가 예시될 수 있으나 이에 한정되지 않는 박테리아 리컴비나제 효소가 인간 게놈내의 "슈도" 재조합 부위에서 작용할 수 있다. 이들 슈도 재조합 부위는 리컴비나제를 사용하는 부위-특이적 삽입의 표적일 수 있다. 리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입은 본 원에 참고로 원용되는 문헌[Thyagarajan et al., Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001)]에 기술되어 있다. 리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입을 위해 사용될 수 있는 리컴비나제 및 그의 각 부위의 다른 예로는 세린 리컴비나제, 예컨대 R4 및 TP901-1 및 본 원에 참고로 원용되는 WO 2006/083253호에 기재되어 있는 리컴비나제가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
변형된 세포의 게놈에 하나 이상의 유전자 발현 시스템을 안정적으로 통합시키기 위하여, 본 발명의 목적상 임의의 공지된 통합 방법이 이용될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 부위-특이적 삽입은 리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입으로 수행될 수 있다. 요약하면, PhiC31 인테그라제가 예시될 수 있으나 이에 한정되지 않는 박테리아 리컴비나제 효소가 인간 게놈내의 "슈도" 재조합 부위에서 작용할 수 있다. 참조: 미국 공개 제2004/0003420 A1호; Groth et al., Proc. Natl. Acad. Science, 97, 5995-6000 (2000). 이들 슈도 재조합 부위는 리컴비나제를 사용하는 부위-특이적 삽입의 표적일 수 있다. 리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입은 문헌[Thyagarajan, B. et al, Mol. Cell Biol. 21(12):3926-34 (2001)]에 기술되어 있다.
특정 구체예에 있어서, 제1 유도성 유전자 발현 시스템은 추가로 제1 유전자 스위치 시스템을 표적화 세포의 게놈내 슈도-부위에 안정적으로 통합시킬 인테그라제를 포함한다. 제2 유전자 스위치 시스템은 또한 제2 유전자 스위치 시스템을 표적화 세포의 게놈내 슈도-부위에 통합시킬 인테그라제를 포함할 수 있다. 제1 유전자 스위치 시스템은 추가로 표적화 세포의 게놈내 사전 위치화된 수용체 부위에 제2 유도성 유전자 스위치 시스템을 통합시킬 수 있는 인테그라제 수용체 부위를 포함할 수 있다.
하기 폴리펩티드 서열이 스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 PhiC31 인테그라제 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리펩티드 서열로 보고되었으며, 유전자은행에 목록번호는 NP_047974이다.
스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 phiC31 인테그라제 (605 aa) (서열번호 6)
리컴비나제-부위 특이적 유전자 삽입을 위해 사용될 수 있는 리컴비나제 및 그의 각 부위의 다른 예로는 세린 리컴비나제, 예컨대 R4 및 TP901-1이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 부위-특이적 리컴비나제 (SSRs), 예컨대 박테리오파지 P1-유래 Cre 리컴비나제는 특이적 DNA 서열 ("인식 부위," "인식 서열," 또는 "인테그라제 수용체 부위")을 인식하며, 두 인식 부위간에 재조합을 촉매화한다. Cre 리컴비나제는, 예를 들어, 34 염기쌍 (bp) loxP 모티브를 인식한다 (Austin et al, Cell 25, 729-736 (1981)). 두 부위가 동일한 DNA 분자상에 동일한 배향으로 위치해 있으면, 간섭 DNA 서열은 모 분자로부터의 리컴비나제에 의해 폐쇄된 원으로 삭제되어 각 반응 산물상에 하나의 인식 부위를 남긴다. 두 부위의 배향이 반전되면, 인식-부위 플랭킹 영역은 리컴비나제 매개 재조합을 통해 역전된다. 다른 한편으로, 두 인식 부위가 상이한 분자상에 위치해 있으면, 리컴비나제-매개 재조합으로 원형 분자의 통합 또는 두 선형 분자간에 전위가 일어날 것이다.
Cre 외에, 수개의 리컴비나제가 포유동물 세포에서 일부 활성을 나타내는 것으로 입증되었다. 가장 좋은 특정화 예는 30 ℃에서 최적의 활성을 나타내고 37 ℃에서 불안정한 효모 유래 FLP 및 Kw 리컴비나제이다 (Buchholz et al, Nature Biotech., 16, 657-662 (1998); Ringrose et al, Eur. J. Biochem., 248,903-912). 포유동물 세포에서 일부 활성을 나타내는 다른 리컴비나제는 람다 파지의 돌연변이 인테그라제, HK022 파지의 인테그라제, 돌연변이 감마 델타-리솔베이스 및 베타-리컴비나제를 포함한다 (Lorbach et al, J. Mol. Biol, 296, 1175-81 (2000); Kolot et al, Moi. Biol Rep. 26,207-213 (1999); Schwikardi et al, FEBS Lett., 471,147-150 (2000); Diaz et al, J. Biol Chem., 274, 6634-6640 (1999)). 그밖에, phiC31 인테그라제 개량형이 개발되었다. 이렇게 변형된 C31-Int (C31-Int (CNLS))는 C-말단 핵 국소화 신호 (NLS)를 가지며, 포유동물 세포에서 야생형에 비해 상당히 증가되고, Cre 리컴비나제의 것에 견줄만한 재조합 효율을 나타낸다 (EP 1205490호; 미국 공개 제2004/0003420 A1호). 이에 따라 C31-Int는 포유동물 게놈 변형에 유용한 도구가 된다.
본 발명의 일 구체예로, 벡터는 게놈의 바이오-중성 부위로 삽입된다. 바이오-중성 부위는 세포의 정상 기능과 함께, 폴리뉴클레오티드 삽입 방해가 존재하여도 거의 없는 게놈내 부위이다. 바이오-중성 부위는 이용가능한 바이오정보학을 이용하여 분석될 수 있다. 많은 바이오-중성 부위가 당업계에 공지되었으며, 예를 들면, ROSA-등가좌가 있다. 당업계에 주지된 일상적인 기술을 이용하여 다른 바이오-중성 부위를 확인할 수 있다. 게놈 삽입 부위(들)의 특정화는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 벡터를 세포에 도입하는 경우, 폴리뉴클레오티드의 위치, 카피수 및/또는 배향 조절을 위해 부위-특이적 삽입 방법이 이용될 수 있다. 부위-특이적 삽입 방법은 당업계에 주지이며, 상동적 재조합 및 리컴비나제-매개 게놈 삽입이 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 물론, 부위-특이적 삽입 방법이 본 발명의 방법에 이용되는 경우, 벡터는, 예컨대 상동적 재조합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 부위-특이적 삽입을 도와 주는 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 게놈 통합 부위 (GISs)를 포함할 수 있다. 본 원에 사용된 "게놈 통합 부위"는 벡터를 게놈에 삽입시킬 수 있도록 뉴클레오티드 서열이 세포내 게놈 부분과 동일하거나 거의 동일한 벡터 서열 부분으로 정의된다. 특히, 벡터는 적어도 폴리뉴클레오티드가 플랭킹된 두개의 게놈 삽입 부위를 포함할 수 있다. 물론, GISs는 추가적인 요소 또는 심지어는 벡터상에 존재하는 모든 요소들이 플랭킹될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 벡터는 화학-내성 유전자, 예를 들어, 다제 내성 유전자 mdrl, 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 화학-내성 유전자는 구조 (예를 들어, CMV) 또는 유도성 (예를 들어, RheoSwitch®) 프로모터 조절하에 있을 수 있다. 이러한 구체예에 있어서는, 대상내에 변형된 세포를 유지하면서 대상에서 질환을 치료하려는 경우, 임상의는 적절한 화학-내성 유전자의 발현에 기인해 변형된 세포를 화학요법제로부터 보호하면서 이상 세포를 파괴시키기 위하여 화학요법제를 적용할 수 있으며, 질환, 장애 또는 증상의 치료, 개선 또는 예방에 계속 사용될 수 있다. 화학-내성 유전자가 유도성 프로모터하에 놓임으로써, 화학-내성 유전자의 불필요한 발현을 피할 수 있으며, 이는 여전히 연속적인 치료가 필요한 경우에도 이용이 가능할 것이다. 변형된 세포 자신에 이상이 있으면, 이들은 후술하는 바와 같은 치사 폴리펩티드의 발현을 유도함으로써 파괴될 수 있다.
본 발명의 방법은 유전자 스위치 및 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상의 세포에 도입함으로써 수행된다. 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하기 위하여 상술된 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 생체외로 세포에 도입되는 경우, 세포는 생검, 찰과 및 외과적 조직 제거를 예로 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 대상으로부터 얻을 수 있다. 단리된 세포는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되기에 충분한 시간, 예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 시간 또는 그 이상의 시간동안 배양될 수 있다. 단시간 초대 세포 배양방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 플레이트 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트)에서 부착된 상태 또는 현탁물로 배양될 수 있다.
생체외 치료 방법의 경우, 세포는 대상으로부터 단리되며, 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하기에 적절한 조건하에 배양된다. 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입되면, 세포는 리간드-의존성 전사 인자 복합체가 발현되도록 하기에 충분한 시간, 예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 또는 24 시간 또는 그 이상의 시간동안 인큐베이션된다. 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입된 후 특정 시점에 (충분한 수준의 리간드-의존성 전사 인자 복합체가 발현되기 전 또는 후), 세포가 대상으로 다시 도입된다. 재도입은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 조직 또는 강에 직접 주사에 의해 수행될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 세포내 폴리뉴클레오티드 존재는 세포를 대상으로 재도입하기 전에 결정된다. 다른 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포가 선별되며 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드내 선별용 마커의 존재를 기초로 하여), 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포만이 대상에 재도입된다. 세포가 대상에 재도입된 후, 리간드는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현 유도를 위해 대상에 투여된다. 또 다른 구체예에 있어서, 리간드는, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드가 세포 재도입전에 발현되도록 하기 위해 심지어 세포가 대상에 재도입되기 전에 세포에 첨가될 수 있다. 리간드는 임의의 적절한 방법에 의해 전신적으로 (예를 들어, 경구, 정맥내) 또는 국소적으로 (예를 들어, 복막내, 경막내, 심실내, 세포가 재도입되는 경우 조직 또는 기관에 직접 주사) 투여될 수 있다. 리간드의 최적의 투여 시기는 일상적인 기술을 이용하여 각 세포 타입 및 질환, 장애 또는 증상에 대해 결정될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 생체외 치료 방법은 대상으로부터의 자가형 세포 대신 비-자가형 세포, 예를 들어 대상에 대해 동종이형 또는 이종발생성인 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 세포를 생산하기 위해 비-자가형 세포에 생체외로 도입될 수 있으며, 이어서 변형된 세포가 대상에 도입될 수 있다. 비-자가형 세포는 대상에 이식 후 생육성인 임의의 세포일 수 있으며, 이로는 줄기 세포 (예컨대 배아 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포) 및 섬유모세포를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 생체내 치료 방법은 폴리뉴클레오티드를 대상의 세포에 직접 생체내로 도입하는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 대상에 전신적으로 또는 국소적으로 (예를 들어, 질환, 장애 또는 증상 부위) 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 대상에 도입되면, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현이 유도되도록 리간드가 투여될 수 있다. 리간드는 임의의 적절한 방법에 의해 전신적으로 (예를 들어, 경구, 정맥내) 또는 국소적으로 (예를 들어, 복막내, 경막내, 심실내, 질환, 장애 또는 증상이 발생한 조직 또는 기관에 직접 주사) 투여될 수 있다. 리간드의 최적의 투여 시기는 일상적인 기술을 이용하여 각 세포 타입 및 질환, 장애 또는 증상에 대해 결정될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 리간드는 대상에 연속적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있고, 리간드 투여 방식은 질환, 장애 또는 증상의 상태에 따라 필요에 따라 변경될 수 있다. 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은 치료 요법을 주의하여 제어하면서 리간드 투여 계획 및 투여되는 리간드 둘 다로 조정될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 또한 치료 결과를 개선하기 위하여 약물진단학 또는 세라노스틱스(theranostics)로서 당업계에 공지된 다양한 접근방법으로 진단 기술과 결합될 수 있다. 예를 들어, 리간드 투여는 질환, 장애 또는 증상의 상태 또는 진행을 모니터하는 것과 공조될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 질환, 장애 또는 증상을 진단하거나 모니터하도록 설계된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 함께 세포에 도입된다. 다른 구체예에 있어서, 진단 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일 벡터상에 존재한다. 이 구체예에 있어서는, 치료를 받는 모든 세포가 또한 진단 검사를 확실하게 받도록 치료 요법 및 치료 효과를 모니터하기 위한 진단 검사가 단일 유닛으로 함께 적용된다. 일 구체예에 있어서, 진단 폴리뉴클레오티드는 리포터 유전자에 작동적으로 결합하된 진단 스위치 프로모터 (즉, 질환, 장애 또는 증상 동안 활성이 조정되는 프로모터)를 포함하며, 질환, 장애 또는 증상의 상태 모니터링은 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 세라노스틱 구체예에 있어서, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은 리포터 유전자의 발현 수준을 검출함으로써 모니터링되며, 이때 리포터의 발현 수준은 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 직접 상관관계가 있다. 예를 들어, 인터류킨-12와 같은 치료 단백질의 발현 수준이 인간 2 형 소모스타틴 수용체와 같은 바이오중성 리포터를 통해 다양한 조직에서 비침습적으로 모니터링될 수 있으며, 이는 방사성 소모스타틴 유사체로 영상화될 수 있다 (참조예: Zinn et al., J. Nucl. Med 47:887-895 (2000)). 리포터는 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 동일한 프로모터에 결합될 수 있거나, 또는 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 조정되는 상이한 프로모터 하에 놓일 수 있다.
본 발명의 추가적인 구체예는
(a) 대상 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 [여기에서, 유전자 스위치는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 전사 인자 서열은 치료 스위치 프로모터에 작동적으로 결합된 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하며, 상기 프로모터는 질환, 장애 또는 증상 동안 활성화 됨] 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 프로모터에 결합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형된 세포를 생산하고;
(b) 리간드를 상기 대상에 투여하여 상기 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 것을 포함하여,
대상에서 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 있어서, 대상에서 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법은 실험 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 고양이, 개, 원숭이) 또는 가축 (예를 들어, 돼지, 양, 소)을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 동물에서 치료 산물을 발현하는 방법은 연구 목적으로 실시되거나, 또는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 대규모 생산을 위해 실시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는
(a) 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 [여기에서, 유전자 스위치는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 전사 인자 서열은 치료 스위치 프로모터에 작동적으로 결합된 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하며, 상기 프로모터는 질환, 장애 또는 증상 동안 활성화 됨] 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 프로모터에 결합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형된 세포를 생산하고;
(b) 리간드를 상기 변형된 세포에 투여하여 상기 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 것을 포함하는,
세포에서 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는
(a) 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 [여기에서, 상기 유전자 스위치는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 전사 인자 서열은 치료 스위치 프로모터와의 작동적인 조합으로 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하며, 상기 치료 스위치 프로모터는 질환, 장애 또는 증상과 관련된 조건하에 활성화 됨] 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터와 작동적으로 조합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형된 세포를 생산하고;
(b) 리간드를 상기 변형된 세포에 투여하여 상기 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 것을 포함하는,
하나 이상의 변형된 세포에서 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에 있어서, 세포에서 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법은 시험관내, 예를 들어, 배양 세포에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 치료 산물 발현의 시험관내 방법은 연구 목적으로 실시되거나, 또는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 대규모 생산을 위해 실시될 수 있다.
본 원에 기술된 임의의 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 함유하는 세포를 치사시킬 산물을 발현하도록 촉발될 수 있는 치사 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 치료가 더 이상 필요치 않거나, 변형된 세포가 일으키는 문제 때문에 (예를 들어, 과다증식 또는 독성), 치사 폴리펩티드 발현을 이용하여 대상으로부터 변형된 세포를 제거할 수 있다. 본 원에 이용된 치사 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체가 치사성이거나, 폴리펩티드가 치사성 화합물을 생성하기 때문에, 발현시에 폴리펩티드를 발현하는 세포를 치사시키는 폴리펩티드이다. 본 원에 이용된 치사 폴리펩티드는 괴사, 아폽토시스 및 세포독성이 예시되나 이들에 한정되지 않는 임의의 방식으로 세포사를 유도하는 폴리펩티드를 포함한다. 치사 폴리펩티드의 예로 p53, Rb 및 BRCA-1이 예시되나 이들에 한정되지 않는 아폽토시스 유도 종양 억제 유전자, 독소, 예컨대 몇가지 예를 들자면 디프테리아 독소 (DTA), 시겔라(shigella) 신경독소, 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 전갈 단백질 독소의 CSE-V2 및 다른 변이체, 사이토신 데아미나제 및 티미딘 키나제와 같은 자살 유전자 및 세포독성 유전자, 예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론-알파가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명이 확인된 치사 폴리펩티드로 제한되지 않지만, 폴리펩티드는 발현되는 세포를 치사시킬 수 있어야 한다. 변형된 세포가 단기 생존 세포 (예를 들어, 한정된 수명의 세포 (예를 들면, 약 10 일 이하, 예컨대 수지상 세포)인 경우에는, 세포가 단기간에 자연적으로 제거되기 때문에, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 치사 폴리펩티드를 포함시킬 필요가 없다.
상술된 각 방법에 대해, 일 구체예에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터에 결합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 더 큰 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 벡터의 일 부분이다. 다른 구체예에 있어서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터에 결합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드로서 결합하여 "핵산 조성물"을 형성할 수 있다.
일 측면으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 유전자 스위치를 코딩하고, 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 치료 스위치 프로모터에 작동적으로 결합된 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하며, 프로모터의 활성은 상기 질환, 장애 또는 증상동안 조정된다. 다른 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터에 결합된 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 추가로 코딩한다. 일 구체예에 있어서, 유전자 스위치는 EcR-을 기반으로 한 유전자 스위치이다. 다른 구체예에 있어서, 유전자 스위치는 제1 치료 스위치 프로모터의 조절하에 있는 제1 전사 인자 서열 및 제2 치료 스위치 프로모터의 조절하에 있는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자 복합체로서 작용하는 단백질 복합체를 형성한다. 일 구체예에 있어서, 제1 치료 스위치 프로모터 및 제2 치료 스위치 프로모터는 상이하다. 다른 구체예에 있어서, 제1 치료 스위치 프로모터 및 제2 치료 스위치 프로모터는 동일하다. 다른 구체예에 있어서, 제1 전사 인자 서열은 헤테로다이머 파트너 및 트랜스활성화 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩한다. 다른 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 또한 유도성 프로모터에 작동적으로 결합된 치사 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상술된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 구체예에 있어서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이다.
다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 방법과 함께 이용될 수 있는 키트를 제공한다. 이와 같은 본 발명의 측면에 따른 키트는 하나 이상의 핵산 분자, 제한 효소 및 상기 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분들을 함유할 수 있는 하나 이상의 컨테이너를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 배양중인 본 발명의 세포를 지지하기에 적절한 지지 세포를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 본 발명의 세포를 배양하기에 적절한 세포 배양 배지를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 본 발명의 세포를 배양하는데 사용하기에 적절한 항생제를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 완충제를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 형질감염제를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 효소 반응을 위한 기질 및/또는 유전자 스위치 활성화를 위한 하나 이상의 리간드를 함유하는 하나 이상의 컨테이너를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 광범위한 각종 핵산 분자를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트에 공급될 수 있는 핵산 분자의 예로는 프로모터, 유전자 스위치를 코딩하는 서열, 인핸서, 억제자, 선별용 마커, 전사 신호, 번역 신호, 프라이머 혼성화 부위 (예를 들어, 서열화 또는 PCR를 위한 것), 재조합 부위, 제한 부위 및 폴리링커, 억제 tRNA의 존재하에 번역 종결을 억제하는 부위, 억제 tRNA 코딩 서열, 복제 도메인 및/또는 영역, 기원을 코딩하는 서열, 텔로머(telomer), 센트로머(centromer) 등을 함유하는 것이 포함된다. 일 구체예에 있어서, 키트는 어떠한 치료 스위치 프로모터 없이 유전자 스위치를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이 폴리뉴클레오티드는 대상으로 하는 임의의 치료 스위치 프로모터를 삽입하기에 적절하다. 본 발명의 핵산 분자는 상술된 폴리뉴클레오티드 외에 임의의 하나 이상의 이들 특징을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 하나 이상의 재조합 단백질을 함유하는 컨테이너를 포함할 수 있다. 적절한 재조합 단백질은 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 리솔베이스, ΦC31, TndX, XerC 및 XerD를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 다른 적절한 재조합 부위 및 단백질은 인비트로겐사(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)로부터 이용가능한 GATEWAY™ 클로닝 기술과 관련된 것으로, GATEWAY™ 클로닝 기술 (E 버전, 2003년 9월 22일)의 제품 설명서에 기재되어 있으며, 이는 전체내용이 본 원에 참고로 원용된다.
본 발명의 키트에는 또한 프라이머가 제공될 수 있다. 이들 프라이머는 일반적으로 특이적 뉴클레오티드 서열을 가지는 분자에 어닐링되도록 설계될 것이다. 예를 들어, 이들 프라이머는 특정 핵산 분자를 증폭하기 위해 PCR 사용용으로 설계될 수 있다. 시퀀싱 프라이머가 또한 키트에 제공될 수 있다.
하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15개)의 완충제가 본 발명의 키트에 제공될 수 있다. 이들 완충제는 작업 농도로 제공될 수 있거나, 농축 형태로 제공된 후, 작업 농도로 희석될 수 있다. 이들 완충제는 완충제 자체 또는 완충제중 분자의 활성 또는 안정화를 증가시킬 목적으로 보통 염, 금속 이온, 공동인자, 금속 이온 킬레이트제 등을 함유할 것이다. 또한, 이들 완충제는 건조 형태 또는 수성 형태로 제공될 수 있다. 완충제가 건조 형태로 제공되는 경우, 이들은 일반적으로 사용전에 물에 용해될 것이다.
본 발명의 키트는 실제로 상기에 나열되었거나, 본 원에서 다른 부분에 기술되어 있는 성분들을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. 당업자들이라면, 본 발명의 키트와 함께 제공되는 성분들이 키트의 목적 용도에 따라 달라질 것임을 알 수 있을 것이다. 요컨대, 키트는 본 출원에 기재된 다양한 기능들을 수행하도록 설계될 수 있으며, 그에 따라, 이러한 키트의 성분들은 달라질 것이다.
도 1은, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 2개 분리 부분을 코딩하는 2개 전사 인자 서열이 단일 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태이다. "AD"는 전이활성화 도메인을 나타내고, "HP"는 이형이합체화 파트너 도메인을 나타낸다. AD 및 HP는 "공활성화 단백질" 또는 "CAP"이라 불리우는 융합 단백질로서 발현된다. "DBD"는 DNA 결합 도메인을 나타내고, "LBD"는 리간드 결합 도메인을 나타낸다. DBD 및 LBD 도메인은 "리간드-의존성 전사 인자" 또는 "LTF"라 불리우는 융합 단백질로서 발현된다. "전사 링커"는 단일 개방 판독 프레임으로부터 2개 분리 단백질 생성물을 발생시키는 IRES(내부 리보솜 도입 부위) 또는 수단을 나타낸다. "치료학적 생성물 서열"은 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, "치료학적 생성물"은 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 나타내며, "TSP-1"은 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 치료학적 스위치 프로모터 또는 치료학적 스위치 프로모터를 나타낸다. CAP 및 LTF는 조합되어, 리간드와 함께 인자-조절된 프로모터(FRP)를 활성화시키는 리간드-의존성 전사 인자 복합체(LDTFC)를 형성한다.
도 2는, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 2개의 분리 부분을 코딩하는 2개의 전사 인자 서열(CAP 및 LTF)가 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. "TSP-1" 및 "TSP-2"는 2개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 프로모터가고, TSP-2는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 프로모터이다. CAP 및 LTF는 조합되어 LDTFC를 형성하고, LDTFC는 리간드와 조합되어 FRP를 형성한다.
도 3은, 조합되어 2개의 분리 LDTFC를 형성할 수 있는 3개의 전사 인자 서열(CAP, LTF-1 및 LTF-2)이 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. DBD-A는, LBD와 융합되어 LTF-1을 형성하는 제1 DNA 결합 도메인을 나타내고, DBD-B는, LBD와 융합되어 LTF-2를 형성하는 제2 DNA 결합 도메인을 나타낸다. "치료학적 생성물 A"는 제1 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 나타내고, "치료학적 생성물 B"는 제2 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 나타내며, TSP-1, TSP-2 및 TSP-3은 3개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 치료학적 스위치 프로모터이고, TSP-2 및 TSP-3은 상이한 치료학적 스위치 프로모터이며, 이들은 각각 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 독립적으로 활성화된다. CAP 및 LTF-1은 조합되어 LDTFC-1을 형성하고, LDTFC-1은 리간드와 조합되어 FRP-1을 형성한다. CAP 및 LTF-2는 조합되어 LDTFC-2를 형성하고, LDTFC-2는 리간드와 조합되어 FRP-2를 활성화시킨다.
도 4는, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 CAP 및 2개의 분리 LTF 부분을 코딩하는 3개의 전사 인자 서열이 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. TSP-1, TSP-2 및 TSP-3은 3개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 프로모터가고, TSP-2 및 TSP-3은 상이한 프로모터이며, 이들은 각각 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 독립적으로 활성화된다. LTF-1 또는 LTF-2는 CAP와 조합되어 LDTFC-1 또는 LDTFC-2를 형성할 수 있다. LDTFC-1 또는 LDTFC-2는 리간드와 조합되어 FRP를 활성화시킨다.
도 5는, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 인슐린 성장 인자-1(IGF-1)을 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 6은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 염기성 섬유 모세포 성장 인자(bFGF)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 7은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 에리트로포이에틴(EPO)을 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 8은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 사람 B-세포 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 9는, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 염증 상태하에 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 10은, 도 3에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태하에 릴랙신을 발현시키고/시키거나 저산소증 상태하에 간세포 성장 인자를 발현시킨 벡터의 개략도이고, 여기서 상기 염증 상태 및 저산소증 상태는 모두 심허혈증과 관련된다.
도 11은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 EPO를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 발현은 심근 세포로 제한된다.
도 12는, 도 4에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태 또는 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 IGF-1을 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 발현은 심근 세포로 제한된다.
도 13은, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 류마티스 관절염 등의 염증 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 14는, 도 4에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 TNF 알파 발현에 반응하여 또는 염증성 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 상태는 모두 류마티스 관절염과 관련된다.
도 15는, 도 3에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키고/시키거나 HIP-유도 저산소증 상태하에 EPO를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 상태는 모두 류마티스 관절염과 관련된다.
도 16은, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 사람 인자 VIII:C를 구성적으로 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 17은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 혈우병과 관련된 저산소증 상태하에 사람 인자 VIII:C를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 2는, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 2개의 분리 부분을 코딩하는 2개의 전사 인자 서열(CAP 및 LTF)가 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. "TSP-1" 및 "TSP-2"는 2개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 프로모터가고, TSP-2는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 프로모터이다. CAP 및 LTF는 조합되어 LDTFC를 형성하고, LDTFC는 리간드와 조합되어 FRP를 형성한다.
도 3은, 조합되어 2개의 분리 LDTFC를 형성할 수 있는 3개의 전사 인자 서열(CAP, LTF-1 및 LTF-2)이 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. DBD-A는, LBD와 융합되어 LTF-1을 형성하는 제1 DNA 결합 도메인을 나타내고, DBD-B는, LBD와 융합되어 LTF-2를 형성하는 제2 DNA 결합 도메인을 나타낸다. "치료학적 생성물 A"는 제1 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 나타내고, "치료학적 생성물 B"는 제2 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 나타내며, TSP-1, TSP-2 및 TSP-3은 3개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 치료학적 스위치 프로모터이고, TSP-2 및 TSP-3은 상이한 치료학적 스위치 프로모터이며, 이들은 각각 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 독립적으로 활성화된다. CAP 및 LTF-1은 조합되어 LDTFC-1을 형성하고, LDTFC-1은 리간드와 조합되어 FRP-1을 형성한다. CAP 및 LTF-2는 조합되어 LDTFC-2를 형성하고, LDTFC-2는 리간드와 조합되어 FRP-2를 활성화시킨다.
도 4는, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 CAP 및 2개의 분리 LTF 부분을 코딩하는 3개의 전사 인자 서열이 상이한 프로모터의 조절하에 존재하는 본 발명의 치료학적 유전자 스위치의 양태를 나타낸다. 용어 AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "치료학적 생성물 서열", "치료학적 생성물", TSP, LDTFC 및 FRP는 도 1의 범례에서 정의되어 있다. TSP-1, TSP-2 및 TSP-3은 3개의 상이한 치료학적 스위치 프로모터를 나타내고, 이들은 각각 독립적으로 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 활성화된 구성적 프로모터 또는 프로모터이다. 한 가지 양태에서, TSP-1은 구성적 프로모터가고, TSP-2 및 TSP-3은 상이한 프로모터이며, 이들은 각각 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에 독립적으로 활성화된다. LTF-1 또는 LTF-2는 CAP와 조합되어 LDTFC-1 또는 LDTFC-2를 형성할 수 있다. LDTFC-1 또는 LDTFC-2는 리간드와 조합되어 FRP를 활성화시킨다.
도 5는, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 인슐린 성장 인자-1(IGF-1)을 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 6은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 염기성 섬유 모세포 성장 인자(bFGF)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 7은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 에리트로포이에틴(EPO)을 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 8은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 사람 B-세포 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 9는, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 염증 상태하에 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 10은, 도 3에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태하에 릴랙신을 발현시키고/시키거나 저산소증 상태하에 간세포 성장 인자를 발현시킨 벡터의 개략도이고, 여기서 상기 염증 상태 및 저산소증 상태는 모두 심허혈증과 관련된다.
도 11은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 EPO를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 발현은 심근 세포로 제한된다.
도 12는, 도 4에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태 또는 심허혈증 등의 저산소증 상태하에 IGF-1을 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 발현은 심근 세포로 제한된다.
도 13은, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 류마티스 관절염 등의 염증 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 14는, 도 4에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 TNF 알파 발현에 반응하여 또는 염증성 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 상태는 모두 류마티스 관절염과 관련된다.
도 15는, 도 3에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 염증 상태하에 종양 괴사 인자 결합 단백질 2(EnbrelR)를 발현시키고/시키거나 HIP-유도 저산소증 상태하에 EPO를 발현시키는 벡터의 개략도이며, 여기서 상기 상태는 모두 류마티스 관절염과 관련된다.
도 16은, 도 1에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 사람 인자 VIII:C를 구성적으로 발현시키는 벡터의 개략도이다.
도 17은, 도 2에 도시된 방식으로 작제되고 유전자 조작되어 혈우병과 관련된 저산소증 상태하에 사람 인자 VIII:C를 발현시키는 벡터의 개략도이다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것으로서, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기의 실시예를 포함하여 본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 속하는 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 형질전환 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA의 관용적 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에 완전하게 설명되어 있으며, 예를 들어 이들 문헌들(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), J. Sambrook, D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Genes VIII, B. Lewin, Prentice Hall (2003); PCR Primer, C. W. Dieffenbach and G. S. Dveksler, CSHL Press (2003); DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), P. Herdewijn (Ed.), Humana Press (2004); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, R. I. Freshney, Wiley-Liss (2000); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984); Mullis et. al U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Nucleic Acid Hybridization, M. L. M. Anderson, Springer (1999); Animal Cell Culture and Technology, 2nd edition, M. Butler, BIOS Scientific Publishers (2004); Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, IRL Press (1992); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins (Eds.) (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); A Practical Guide To Molecular Cloning, 3rd edition, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et. al (Eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, (Eds.), Academic Press, London (1987); 및 in Ausubel et. al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989))을 참조할 수 있다.
실시예 1
본 실시예는 혈관신생(angiogenesis) 촉진을 통한 허혈성 심장질환의 치료에 있어서 유용한 유전자요법 벡터를 기술한다. 인슐린 유사 성장인자 1은 허혈성 심장질환의 치료에 있어서 유용한 호르몬이다(IGF-1, 젠뱅크 등록번호: NP_001104753.1, 서열번호 20). 전임상 모델에서 IGF-1의 사용은 심장기능의 개선, 항-세포사멸(anti-apoptosis), 신혈관신생(neo-vascularizatio) 및 심근 재생에 연계된다(Santini, M. P., et al. Novartis Found Symp.274:228-38 (2006); discussion 239-43, 272-6; 및 Saetrum Opgaard, O., and Wang, P. H. Growth Horm IGF Res.15:89-94 (2005)에 개관). 이러한 목적으로 허혈 및/또는 염증에 반응하는 유도성 IGF-1 발현의 실시예를 제공한다. 허혈 조직에 발생하는 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 IGF-1의 발현을 위한 유도성 발현 시스템을 도 5에 나타낸다.
서열번호 20:
도 5에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 4에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 197 | 455 |
Neo | 역방향 | 795 | 462 | 1256 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1446 | 1723 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 1830 | 2050 |
LTF[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 2057 | 3523 |
TL(cMyc ires) | 역방향 | 408 | 3536 | 3943 |
CAP[VP16(AD):RXR(HP)] | 역방향 | 975 | 3950 | 4924 |
TSP-1(심장 저산소증-유도성) | 역방향 | 578 | 4958 | 5535 |
FRP[6xGalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 5946 | 6134 |
인슐린 유사 성장인자(IGF-1) 코딩 영역 | 정방향 | 477 | 6348 | 6824 |
3'Reg(hGH PolyA) | 정방향 | 627 | 6897 | 7523 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 7957 | 8545 |
AmpR | 역방향 | 858 | 8920 | 9777 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 9811 | 9849 |
도 5에 나타낸 벡터는 도 1에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서는, 리간드-의존성 전사인자 복합체(LDTFC: ligand-dependent transcription factor complex)의 LTF 서브유닛 및 CAP 서브유닛 양자 모두가, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)의 사용을 통하여 단일 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1: therapeutic switch promoter)와의 운영적 연계(operable association)를 통해 발현된다. 이 시스템에 이용되는 프로모터는 UV-순응 합성 저산소증-유도성 프로모터(UV-conformed synthetic hypoxia-inducible promoter)이다.
치료학적 생성물인 IGF-1에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 인자-조절성 프로모터(FRP: factor-regulated promoter)에 운영적으로 연계된다.
도 5에 나타낸 작제물은 적합한 벡터 시스템, 예를 들어 바이러스 벡터에 삽입되어 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 전달된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 유전자요법 벡터의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 적절한 생리적 조건하에 전사인자가 발현될 수 있다. 벡터에 의해 암호화되는 LTF는, 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 인자-조절성 프로모터의 제어하에 IGF-1의 발현을 유도한다. IGF-1 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 혈관신생을 촉진한다.
실시예 2
본 실시예는 혈관신생 및 심장보호의 촉진을 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 6에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF: basic fibroblast growth factor)(젠뱅크 등록번호: NP_001997, 서열번호 21)의 발현을 제공한다.
서열번호 21:
도 6에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 5에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(저산소증-유도성) | 역방향 | 870 | 5446 | 6315 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6648 | 6836 |
TSPq(bFGF) | 정방향 | 867 | 7050 | 7916 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7989 | 8615 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 9049 | 9637 |
AmpR | 역방향 | 858 | 9882 | 10739 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 10773 | 10811 |
도 6에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 치료학적 스위치 프로모터인 TSP-1과의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 제2 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 작제물에 이용되는 프로모터는 저산소증-유도성 제어 프로모터-1(hypoxia-inducible control promoter-1)이다.
치료학적 생성물인 bFGF에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 6에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염(transfection), 형질도입(transduction), 리포펙션(lipofection) 또는 전기천공(electroporation)을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템(barrier system)을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단(immunoisolation)을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 세포-기제 요법의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 벡터에 의해 암호화된 LTF가 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 bFGF의 발현을 유도한다. bFGF 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 혈관신생 및/또는 심장보호를 촉진한다.
실시예 3
본 실시예는 심장보호의 촉진을 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 7에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 에리트로포이에틴(EPO: erythropoietin)(젠뱅크 등록번호: CAA26095.1, 서열번호 22)의 발현을 제공한다. 에리트로포이에틴은 허혈에 반응하여 심장보호 및 항-재형성(anti-remodeling)에 작용하는 것으로 입증되었다.
서열번호 22:
도 7에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 6에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(저산소증-유도성) | 역방향 | 870 | 5446 | 6315 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6648 | 6836 |
TSPQ(Epo) | 정방향 | 582 | 7050 | 7631 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7704 | 8330 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 8764 | 9352 |
AmpR | 역방향 | 858 | 9597 | 10454 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 10488 | 10526 |
도 7에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 제2 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 벡터에 이용되는 유도성 치료학적 스위치 프로모터는 저산소증-유도성 제어 프로모터-1이다.
치료학적 생성물인 EPO에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 7에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 세포-기제 요법의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 벡터에 의해 암호화된 LTF가 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 EPO의 발현을 유도한다. EPO 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 심장보호를 촉진한다.
실시예 4
본 실시예는 혈관신생 및 혈류역학(hemodynamics)의 촉진을 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 8에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 뇌 나트륨 이뇨인자(BNP: brain natriuretic factor)(젠뱅크 등록번호: NP_002512, 서열번호 23)의 발현을 제공한다. 릴랙신, ANF, CNP 및 아드레노모듈린과 같은 다른 나트륨 이뇨 펩티드와 더불어 BNP는 심장에서 심장보호, 혈관확장 및 항-재형성에 작용하는 것으로 입증되었다. 이 목적을 위하여, 허혈에 반응하는 BNP의 유도성 발현의 실시예를 제공한다.
서열번호 23:
도 8에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 7에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF[GAL4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(저산소증-유도성) | 역방향 | 870 | 5446 | 6315 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6648 | 6836 |
TSPQ(BNP) | 정방향 | 405 | 7050 | 7454 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7527 | 8153 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 8587 | 9175 |
AmpR | 역방향 | 858 | 9420 | 10277 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 10311 | 10349 |
도 8에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 제2 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 벡터에 이용되는 유도성 TSP-2는 저산소증-유도성 제어 프로모터-1이다.
치료학적 생성물인 BNP에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 8에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 세포-기제 요법의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 벡터에 의해 암호화된 LTF가 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 BNP의 발현을 유도한다. BNP 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 심장보호, 혈관확장 및 항-재형성을 촉진한다.
실시예 5
본 실시예는 심장내 피브린 침착의 분해를 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 9에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 염증 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA: tissue plasminogen activator)(젠뱅크 등록번호: AAO34406, 서열번호 24)의 발현을 제공한다. 조직 플라스미노겐 활성인자는 세린 프로테아제로서 플라스미노겐이 활성화된 효소 플라스민으로 전환되는 반응을 촉매하며, 이는 피브린을 분해한다. 재조합 tPA의 사용은, 폐색전증(pulmonary embolism), 심근경색증(myocardial infarction) 및 뇌졸중(stroke)과 같은 질환에 있어서 피브린 응괴(fibrin clot)의 분해를 위한 혈전용해제(thrombolytic)로서 효과적인 것으로 입증되었다. 응괴 형성에 부과하여, 심장 및 혈관계 내의 과량의 피브린 침착은 염증에 반응하는 심근경색, 인슐린 저항성 당뇨병 및 죽상동맥경화에 연계된다. 이 목적을 위하여, 허혈에 반응하는 tPA의 유도성 발현의 실시예를 제공한다.
서열번호 24:
도 9에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 8에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF[GAL4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(저산소증-유도성) | 역방향 | 770 | 5446 | 6215 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6548 | 6736 |
TPSQ(레테플라제, tPA) | 정방향 | 1689 | 6950 | 8638 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 8711 | 9337 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 9771 | 10359 |
AmpR | 역방향 | 858 | 10604 | 11461 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 11495 | 11533 |
도 9에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 제2 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 벡터에 이용되는 유도성 치료학적 스위치 프로모터는 인간 플렉신 D1 프로모터이다.
치료학적 생성물인 tPA에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 9에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 세포-기제 요법의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 벡터에 의해 암호화된 LTF가 예를 들어 심장 허혈에 연계된 염증 반응의 경우에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 tPA의 발현을 유도한다. tPA 발현은 결국 허혈 조직 내에서 피브린 침착의 표적화된 분해를 촉진한다.
실시예 6
본 실시예는 심장보호, 혈관신생 및 혈류역학의 촉진을 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 10에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 각각 염증 조건 및/또는 저산소증 하에 리간드의 투여에 의한 2개의 치료학적 폴리펩티드, 인간 릴랙신(젠뱅크 등록번호: NP_604390.1, 서열번호 25) 및 인간 간세포 성장인자(HGF: hepatocyte growth factor)(젠뱅크 등록번호: NP_000592.3, 서열번호 26)의 발현을 제공한다. 릴랙신은 일산화질소가 관련되는 작용기전에 의한 체순환 및 관상동맥순환의 강력한 혈관확장제이며, 심장 박동 속도에 영향을 미친다. HGF는 혈관신생 전구 효과(pro-angiogenic effect), 심장보호 항-세포사멸 효과 및 항-섬유화 효과를 제공하며, 허혈성 심근에서 유형 I 콜라겐 재생인자(type I collagen regenerative factor)이다. 이 목적을 위하여, 허혈에 반응하여 독립적으로 제어되는 릴랙신 및 HGF의 유도성 발현의 실시예를 제공한다.
서열번호 25:
서열번호 26:
도 10에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 9에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 197 | 455 |
Neo | 역방향 | 804 | 462 | 1265 |
SV40e 프로모터 | 역방향 | 280 | 1385 | 1664 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1782 | 1830 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 1837 | 2811 |
TSP-1(편재성) | 역방향 | 571 | 2845 | 3415 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3538 | 3758 |
LTF-1[EcR(LBD):Gal4(DBD)] | 역방향 | 1467 | 3765 | 5231 |
TSP-2(염증 유도성) | 역방향 | 770 | 5265 | 6034 |
FRP-1[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6405 | 6593 |
TPSQ-1(릴랙신) | 정방향 | 558 | 6807 | 7364 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7437 | 8063 |
FRP-2[8X LexA RE:최소 프로모터] | 정방향 | 216 | 8437 | 8652 |
TPSQ-2(HGF) | 정방향 | 2187 | 8866 | 11052 |
3'Reg(SV40 얼리 pA) | 정방향 | 135 | 11112 | 11246 |
TSP-3(저산소증-유도성) | 정방향 | 870 | 11478 | 12347 |
LTF-2[LexA(DBD) CfEcR-DEF(LBD)] | 정방향 | 1629 | 12381 | 14009 |
EcR-LBD(DEF) | 정방향 | 1014 | 12996 | 14009 |
3'Reg(인간 S100 CABP) | 정방향 | 765 | 14016 | 14780 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 15114 | 15702 |
AmpR | 역방향 | 858 | 16038 | 16895 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 16929 | 16967 |
도 10에 나타낸 벡터는 도 3에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, 제1 LTF(LTF-1) 서브유닛은 제2 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현되며, 제2 LTF(LTF-2) 서브유닛은 제3 유도성 치료학적 스위치 프로모터(TSP-3)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 벡터의 TSP-2는 인간 플렉신 D1 프로모터이고, 이 벡터의 TSP-3은 저산소증-유도성 제어 프로모터 1이다.
제1 치료학적 생성물인 릴랙신에 대한 코딩 영역은, LTF-1의 제1 DNA 결합 도메인 DBD-A를 인식하는 반응 요소를 가진 제1 FRP(FRP-1)에 운영적으로 연계되고, 제2 치료학적 생성물인 HGF의 코딩 영역은, LTF-2의 제2 DNA 결합 도메인(DBD-B)을 인식하는 반응 요소를 가진 제2 FRP(FRP-2)와 운영적으로 연계된다. 2가지 FRP는 리간드의 존재하에 각각의 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화된다.
도 10에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 세포-기제 요법의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, LTF-1 및/또는 LTF-2는 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소증 및/또는 염증 반응의 경우에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 하나 이상의 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC(들)와 결합하여 FRP의 제어하에 릴랙신 및/또는 HGF의 발현을 유도한다.
실시예 7
본 실시예는 심장복원(cardiac repair) 및 심장보호의 촉진을 통해 허혈성 심혈관질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 11에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생하는 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 EPO(실시예 3 참조)의 발현을 제공한다. EPO는 허혈에 반응하여 심장보호 및 항-재형성에 작용하는 것으로 입증되었다. 본 실시예에서, EPO 발현은 심장 조직에 특이적으로 한정된다.
도 11에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, CAP 서브유닛은 심장 조직에 특이적인 프로모터(Nxc1 심근세포-특이성 프로모터)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LTF 서브유닛은 저산소증-유도성 제어 프로모터-1과의 운영적 연계를 통해 발현된다.
치료학적 생성물인 EPO에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 11에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 10에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(심장 특이적) | 역방향 | 240 | 3026 | 3265 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3388 | 3608 |
LTF[GAL4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3615 | 5081 |
TSP-2(허혈성, 유도성) | 역방향 | 870 | 5115 | 5984 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6317 | 6505 |
TPSQ(Epo) | 정방향 | 582 | 6719 | 7300 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7373 | 7999 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 8433 | 9021 |
AmpR | 역방향 | 858 | 9266 | 10123 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 10157 | 10195 |
도 11에 나타낸 작제물은 적합한 벡터 시스템, 예를 들어 바이러스 벡터에 삽입되어 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 전달된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 유전자요법 벡터의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 적절한 생리적 조건하에 LDTFC가 발현될 수 있다. 벡터에 의해 암호화되는 LDTFC는, 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에 심근세포에서 특이적으로 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 EPO의 발현을 유도한다. EPO 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 심장보호를 촉진한다.
실시예 8
본 실시예는 심장복원 및 혈관신생의 촉진을 통해 허혈성 심장질환의 치료에 유용한 유전자요법 벡터를 기술한다. 도 12에 나타낸 벡터는 허혈 조직에 발생할 수 있는 염증 반응 중의 저산소 조건하에 리간드의 투여에 의한 인간 IGF-1(실시예 1 참조)의 발현을 제공한다. 이 목적을 위하여, 저산소증 및/또는 염증 반응에 반응하는 유도성 IGF-1 발현의 실시예를 제공한다. 본 실시예에서, IGF-1의 유도성 발현은 심근세포에 특이적으로 한정된다.
도 12에 나타낸 벡터는 도 4에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, CAP 서브유닛은 심장 조직에 특이적인 프로모터(Nxc1 심근세포-특이성 프로모터)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛(LTF-1 및 LTF-2)은 2개의 유도성 TSP 중의 하나를 통해 발현되는데, 첫번째는 저산소증-유도성 제어 프로모터-1과의 운영적 연계에 의하고, 두번째는 인간 플렉신 D1 프로모터와의 운영적 연계에 의한다.
치료학적 생성물인 IGF-1에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 12에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 11에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
전이활성(Transactivation) 도메인 | 역방향 | 261 | 2732 | 2992 |
TSP-1(심장 특이적) | 역방향 | 240 | 3026 | 3265 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3388 | 3608 |
LTF-1[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3615 | 5081 |
TSP-2(저산소증-유도성) | 역방향 | 870 | 5115 | 5984 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6317 | 6505 |
최소 프로모터 | 정방향 | 60 | 6446 | 6505 |
TPSQ(IGF-1) | 정방향 | 477 | 6719 | 7195 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7268 | 7894 |
TSP-3(염증 유도성) | 정방향 | 770 | 8040 | 8809 |
LTF-2[Gal42(DBD):EcR(LBD)] | 정방향 | 1467 | 8843 | 10309 |
CfEcR-LBD(2) | 정방향 | 1014 | 9296 | 10309 |
3'Reg(인간 S100 칼슘 결합 단백질 pA) | 정방향 | 765 | 10316 | 11080 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 11414 | 12002 |
AmpR | 역방향 | 858 | 12247 | 13104 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 13138 | 13176 |
도 12에 나타낸 작제물은 적합한 벡터 시스템, 예를 들어 바이러스 벡터에 삽입되어 허혈성 심장질환의 치료를 요하는 대상에게 전달된다.
벡터는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 심장 조직에 직접, 예를 들어 혈관성형술을 통해 전달될 수 있다. 유전자요법 벡터의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 벡터가 전달되면 이는 세포, 예를 들어 심장 세포에 흡수되고, 적절한 생리적 조건하에 LDTFC가 발현될 수 있다. 벡터에 의해 암호화되는 LDTFC는, 예를 들어 심장 허혈에 연계된 저산소 조건하에, 및/또는 염증 반응의 경우에, 심근세포에서 특이적으로 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 전사인자와 결합하여 FRP의 제어하에 IGF-1의 발현을 유도한다. IGF-1 발현은 결국 허혈 조직 내에 표적화된 혈관신생을 촉진한다.
실시예 9
본 실시예는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 활성 강직척추염(active ankylosing spondylitis) 또는 판상 건선(plaque psoriasis)의 치료 또는 활성 관절염(active arthritis)에 의한 구조적 손상의 저해("RA" 또는 관련 질환")에 있어서 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. RA 및 관련 질환의 관용적 치료는 전통적인 질환조절성 항류머티스제(DMARD: Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug)와 더불어 생물학적 DMARD, 예를 들어 에타네르셉트, 인플릭시마브 및 아달리무마브를 포함한다. 예를 들어, 암젠에서 제조하는 에타네르셉트(Enbrel®)는 경첩 펩티드에 의해 Fc 부분에 융합된 인간 TNF-알파 수용체 2의 2개의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제7,276,477호를 참조한다. 에타네르셉트는 주당 1회 또는 2회 s.c. 투여해야 한다. 그러므로, 염증 또는 사이토카인 반응 프로모터를 이용하는 에타네르셉트 유전자 스위치 시스템을 사용하면, TNF 활성화가 없을 때의 에타네르셉트의 임의 생산을 제한함으로써 편리성 및 안전성이 증가한다.
도 13에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 12에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 197 | 455 |
Neo | 역방향 | 795 | 462 | 1256 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1446 | 1723 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 1830 | 2050 |
LTF[GAL4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 2057 | 3523 |
TL(cMyc ires) | 역방향 | 408 | 3536 | 3943 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 3950 | 4924 |
TSP-1(TNF-반응성 염증 유도성) | 역방향 | 800 | 4958 | 5757 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6168 | 6356 |
TPSQ(에타네르셉트) | 정방향 | 1407 | 6570 | 7976 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 8049 | 8675 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 9109 | 9697 |
AmpR | 역방향 | 858 | 10072 | 10929 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 10963 | 11001 |
도 13에 나타낸 벡터는 도 1에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서는, LDTFC의 LTF 서브유닛 및 CAP 서브유닛은 양자 모두가, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용에 의하여 단일 TSP-1과의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 시스템에 이용되는 프로모터는 혈관세포유착분자(VCAM1: vascular cell adhesion molecule) 프로모터로서, 이는 TNF-알파에 의해 활성화된다. 본 발명에 사용될 수 있는 TNF-알파 조절성 프로모터의 다른 예는 인간 펜트락신 3(PTX3) 프로모터로서, 이는 TNF-알파 또는 인터류킨(IL)-1 베타에 반응한다. 문헌(Basile et al., J. Biol. Chem.272(13): 8172 (1997))을 참조한다.
치료학적 생성물인 에타네르셉트에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 13에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 RA의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
세포는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 관절에 직접 전달될 수 있다. 유전자요법 세포의 전신적 및/또는 국소적 투여는 당업계에 주지되어 있다. 세포가 전달되면 적절한 생리적 조건하에 LDTFC가 발현될 수 있다. 벡터에 의해 암호화되는 LDTFC는, 예를 들어 RA에 연계된 TNF-알파의 존재하에 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 TNF-알파 조절성 프로모터의 제어하에 에타네르셉트의 발현을 유도한다. 에타네르셉트 발현은 결국 조직 내에서 TNF-알파를 포획하고 TNF-알파 농도를 감소시킨다.
실시예 10
본 실시예는 TNF-알파 수준의 저감을 통해 RA 및 관련 질환의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 14에 나타낸 벡터는, RA 또는 관련 질환에서 발생할 수 있는 TNF-알파 및/또는 심한 염증의 존재하에 리간드의 투여에 의한 에타네르셉트의 발현을 제공한다. 이 목적을 위하여, TNF-알파 및/또는 염증 반응의 존재에 반응하는 유도성 에타네르셉트 발현의 실시예를 제공한다.
도 14에 나타낸 벡터는 도 4에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, CAP 서브유닛은 구성성 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 2개의 유도성 전사 카세트 중의 하나를 통해 발현되는데, 첫번째(LTF-1)는 인간 플라스미노겐 활성인자 저해제 유형-2(PAI2) 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계에 의하고, 두번째(LTF-2)는 인간 혈청 아밀로이드 A1(SAA1) 프로모터(TSP-3)와의 운영적 연계에 의한다. 인간 PA12 프로모터는 TNF-알파의 존재하에 활성화된다. 문헌(Mahony et al. Eur. J. Biochem.263(3) (1999) 및 Matsuo et al., Biochem. J.405: 605 (2007))을 참조한다. SAA1 프로모터는 TNF-알파와 같은 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 의해 직접 상향조절되는 것이 아니고, 글루코코르티코이드와 같은 다른 급성 염증 신호에 의존한다. 문헌(Kumon et al., Scandinavian J. Immunol.56: 504 (2002))을 참조한다.
치료학적 생성물인 에타네르셉트에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 14에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 13에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
전이활성 도메인 | 역방향 | 261 | 2732 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF-1[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(TNF-반응성 염증 유도성) | 역방향 | 252 | 5446 | 5697 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 6030 | 6218 |
TPSQ(에타네르셉트) | 정방향 | 1407 | 6432 | 7838 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7911 | 8537 |
TSP-3(염증 유도성) | 정방향 | 253 | 8683 | 8935 |
LTF-2[Gal4(DBD):CfEcR(LBD)] | 정방향 | 1467 | 8969 | 10435 |
EcRLBD(2) | 정방향 | 1014 | 9422 | 10435 |
3'Reg(인간 S100 CABP) | 정방향 | 765 | 10442 | 11206 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 11540 | 12128 |
AmpR | 역방향 | 858 | 12373 | 13230 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 13264 | 13302 |
도 14에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 RA의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
세포는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 관절에 직접 전달될 수 있다. 유전자요법 세포의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 세포가 전달되면 적절한 생리적 조건하에 LDTFC가 발현될 수 있다. 벡터에 의해 암호화되는 LDTFC는, TNF-알파 및/또는 심한 염증의 존재하에 투여된 세포에서 특이적으로 발현된다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 FRP의 제어하에 에타네르셉트의 발현을 유도한다. 에타네르셉트 발현은 결국 조직 내에서 TNF-알파를 포획하고 TNF-알파 농도를 감소시킨다.
실시예 11
본 실시예는 RA의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 벡터는, RA 환자에게 발생하는 각각 TNF-알파의 존재 및/또는 염증 조건하에 리간드의 투여에 의한 2개의 치료학적 폴리펩티드, 에타네르셉트 및 인간 에리트로포이에틴(EPO)의 발현을 제공한다. EPO는 빈혈성 RA 환자에서 적혈구 생성을 유도한다. 문헌(Mercuriali et al. Transfusion 34(6): 501 (2003))을 참조한다. 이 목적을 위하여, RA 및 빈혈에 각각 반응하는 에타네르셉트 및 EPO의 독립적으로 제어되는 유도성 발현의 실시예를 제공한다.
도 15에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 14에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 197 | 455 |
NEO | 역방향 | 804 | 462 | 1265 |
SV40e 프로모터 | 역방향 | 280 | 1385 | 1664 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1782 | 1830 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 1837 | 2811 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 2845 | 3415 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3538 | 3758 |
LTF-1[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3765 | 5231 |
TSP-2(염증-유도성) | 역방향 | 253 | 5265 | 5517 |
FRP-1[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 5888 | 6076 |
TPSQ-1(에타네르셉트) | 정방향 | 1407 | 6290 | 7696 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 7769 | 8395 |
FRP-2[8X LexA:최소 프로모터] | 정방향 | 216 | 8769 | 8984 |
TPSQ-2(Epo) | 정방향 | 582 | 9198 | 9779 |
3'Reg(SV40 얼리 pA) | 정방향 | 135 | 9839 | 9973 |
TSP-3(저산소증-유도성) | 정방향 | 870 | 10205 | 11074 |
LTF-2[LexA(DBD):CfEcR-DEF(LBD)] | 정방향 | 1629 | 11108 | 12736 |
3'Reg(인간 S100 칼슘 결합 단백질 pA) | 정방향 | 765 | 12743 | 13507 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 13841 | 14429 |
AmpR | 역방향 | 858 | 14765 | 15622 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 15656 | 15694 |
도 15에 나타낸 벡터는 도 3에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, LDTFC의 CAP 서브유닛은 제1 구성성 TSP-1과의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 제1 LTF 서브유닛(LTF-1)은 제2 유도성 TSP-2와의 운영적 연계를 통해 발현되며, LDTFC의 제2 LTF 서브유닛(LTF-2)은 제3 유도성 TSP-3과의 운영적 연계를 통해 발현된다. 이 벡터에 사용된 제2 유도성 TSP-2는 인간 혈청 아밀로이드 A1(SAA1) 프로모터이고, 이 벡터에 사용된 제3 유도성 TSP-3은 저산소증-유도성 제어 프로모터 1이다.
제1 치료학적 생성물인 에타네르셉트에 대한 코딩 영역은, LTF-1에 연계된 제1 DNA 결합 도메인(DBD-A)을 인식하는 반응 요소를 가진 제1 FPR-1과 운영적으로 연계되고, 제2 치료학적 생성물인 EPO의 코딩 영역은, LTF-2에 연계된 제2 DNA 결합 도메인(DBD-B)을 인식하는 반응 요소를 가진 제2 FPR-2와 운영적으로 연계된다. 2가지 인자-조절성 프로모터는 리간드의 존재하에 각각의 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화된다.
도 15에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 RA의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
세포는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달되거나, 관절에 직접 전달될 수 있다. 유전자요법 세포의 전신적 및/또는 국소적 투여 방법은 당업계에 주지되어 있다. 세포가 전달되면, 적절한 조건하에 LDTFC(들)가 발현될 수 있다. 치료하고자 하는 대상에게 하나 이상의 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC(들)와 결합하여 FRP-1 또는 FRP-2의 제어하에 에타네르셉트 및/또는 EPO의 발현을 유도한다. 에타네르셉트 발현은 결국 조직 내에서 TNF-알파를 포획하여 TNF-알파 농도를 감소시키고, EPO 발현은 적혈구 생성을 유도하여 빈혈을 개선한다.
실시예 12
본 실시예는 혈우병의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 혈우병은 인자 VIII 또는 인자 IX의 결여에 의해 유발된다. 인자 VIII의 결핍은 혈우병 A라고 지칭하고, 인자 IX의 결핍은 혈우병 B라고 지칭한다. 혈우병 A 또는 B는 각각 재조합 방법으로 생산된 인자 VIII 또는 IX를 투여함으로써 치료할 수 있다. 문헌(Garcia-Martin et al., J. Gene Med.4(2): 215 (2002))을 참조한다. 예를 들어, 본 발명에 사용할 수 있는 재조합 방법으로 생산된 인자 VIII은, 전체 길이 인자 VIII, 예를 들어 RECOMBINATE®(Baxter에서 시판), BIOCLATE®(Aventis에서 시판), KOGENATE®(Bayer에서 시판), HELIXATE®(Aventis에서 시판) 또는 ADVATE®(Baxter에서 시판), B-도메인 결실 인자 VIII, 예를 들어 REFACTO® 및 XYNTHA®(양자 모두 Genetics Institute 및 Wyeth에서 시판), 또는 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자 복합체(von Willebrand Factor complex), 예를 들어 ALPHANATE®(Grifols Biologicals, Inc.에서 시판)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 목적을 위하여, 리간드 투여에 반응하는 생체반응기/세포요법을 위한 유도성 ALPHANATE® 발현의 실시예를 도 16에 나타낸다. 생체반응기/세포요법의 사용은 안정성 및 연속 주입의 문제를 개선한다. 문헌(Pipe S. W., J. Thromb. Haemost.3(8): 1692 (2005))을 참조한다.
도 16에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 15에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 318 | 576 |
Neo | 역방향 | 795 | 583 | 1377 |
3'Reg(SV40 초기 프로모터) | 역방향 | 278 | 1567 | 1844 |
3'Reg(합성 폴리A) | 역방향 | 49 | 1963 | 2011 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 2018 | 2992 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 3026 | 3596 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 3719 | 3939 |
LTF[Gal4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 3946 | 5412 |
TSP-2(구성성) | 역방향 | 1417 | 5446 | 6862 |
FRP[6xGalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 7195 | 7383 |
TSPQ(Hu 인자 VIII) | 정방향 | 7002 | 7597 | 14598 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 14671 | 15297 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 15731 | 16319 |
AmpR | 역방향 | 858 | 16564 | 17421 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 17455 | 17493 |
도 16에 나타낸 벡터는 도 2에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서, CAP 서브유닛은 제1 구성성 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현되고, LDTFC의 LTF 서브유닛은 제2 구성성 프로모터(TSP-2)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 제1 구성성 프로모터로 사용된 프로모터는 UbC(짧은) 프로모터이고, 제2 구성성 프로모터로 사용된 프로모터는 UbB(짧은) 프로모터이다.
치료학적 생성물인 ALPHANATE®에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 16에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 혈우병의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
세포는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달될 수 있다. 유전자요법 세포의 전신적 및/또는 국소적 투여는 당업계에 주지되어 있다. 세포가 전달되면, LDTFC가 구성적으로 발현될 수 있다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 인자 조절성 프로모터의 제어하에 ALPHANATE®의 발현을 유도한다. ALPHANATE® 발현은 결국 혈우병의 증상을 치료한다.
실시예 13
본 실시예는 혈우병의 치료에 유용한 생체반응기/세포요법 벡터를 기술한다. 도 17에 나타낸 벡터는 도 1에 나타낸 유전자 스위치 시스템에 따라 모델화된다. 이 시스템에서는, LDTFC의 CAP 서브유닛 및 LTF 서브유닛 양자 모두가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용에 의하여 단일 구성성 프로모터(TSP-1)와의 운영적 연계를 통해 발현된다. 구성성 프로모터는 UbC(짧은) 프로모터이다.
치료학적 생성물인 ALPHANATE®에 대한 코딩 영역은, 리간드의 존재하에 LDTFC와의 접촉에 의해 활성화되는 FRP에 운영적으로 연계된다.
도 17에 나타낸 작제물의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19에 제공된다. 작제물의 주요 요소에 대한 뉴클레오티드 편성은 표 16에 나타낸다.
표지 | 방향 | 길이 | 시작 | 종료 |
3'Reg(HSVTKpA) | 역방향 | 259 | 197 | 455 |
Neo | 역방향 | 795 | 462 | 1256 |
SV40 초기 프로모터 | 역방향 | 278 | 1446 | 1723 |
3'Reg(SV40pA) | 역방향 | 221 | 1830 | 2050 |
LTF[GAL4(DBD):EcR(LBD)] | 역방향 | 1467 | 2057 | 3523 |
TL(cMyc ires) | 역방향 | 408 | 3536 | 3943 |
CAP[VP16(AD):RxR(HP)] | 역방향 | 975 | 3950 | 4924 |
TSP-1(구성성) | 역방향 | 571 | 4958 | 5528 |
FRP[6x GalRE:최소 프로모터] | 정방향 | 189 | 5939 | 6127 |
TSPQ(인간 인자 VIII) | 정방향 | 7002 | 6341 | 13342 |
3'Reg(hGH 폴리A) | 정방향 | 627 | 13415 | 14041 |
복제 기점 | 역방향 | 589 | 14475 | 15063 |
AmpR | 역방향 | 858 | 15438 | 16295 |
bla 프로모터 | 역방향 | 39 | 16329 | 16367 |
도 17에 나타낸 작제물은 치료하고자 하는 대상에 도입하기에 앞서 세포 내로 도입하기에 적합한 벡터 내에 제조될 수 있다. 세포는 치료하고자 하는 대상으로부터 수거한 자가 세포 또는 비-자가 동종 또는 이종 세포로서, 1차 세포 또는 배양 중에 유지되는 세포주일 수 있다. 임의의 표준 방법, 예를 들어 형질감염, 형질도입, 리포펙션 또는 전기천공을 통해 벡터를 세포 내로 도입하여 개질된 세포를 생산한다. 벡터가 도입된 후에, 개질된 세포를 임의로 처리하여 장벽 시스템을 생산하도록 할 수 있으며, 예를 들어 면역차단을 제공하도록 세포를 코팅 또는 캡슐화할 수 있다. 이어서 개질된 세포는 혈우병의 치료를 요하는 대상에게 투여하기 위한 생체반응기로서 제형화된다.
세포는 대상에게 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주입을 통해 전달될 수 있다. 유전자요법 세포의 전신적 및/또는 국소적 투여는 당업계에 주지되어 있다. 세포가 전달되면, LDTFC가 구성적으로 발현될 수 있다. 치료하고자 하는 대상에게 리간드를 투여하면, 이는 발현된 LDTFC와 결합하여 인자 조절성 프로모터의 제어하에 ALPHANATE®의 발현을 유도한다. ALPHANATE® 발현은 결국 혈우병의 증상을 치료한다.
본 발명의 추가의 구체예들은 하기의 것들을 포함한다:
E1. (a) (1) 적어도 하나의 전사인자 서열을 포함하고, 적어도 하나의 전사인자 서열은 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된(operably linked) 리간드-의존성 전사인자를 코딩하며, 여기에서 상기 프로모터는 질병 또는 장애 중에 활성화되는, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 리간드-의존성 전사인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료학적 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상의 세포에 도입하여 개질된 세포를 생산하고;
(b) 대상에게 리간드를 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하며, 여기에서 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드는 질병 또는 장애를 치료, 개선 또는 예방하기에 충분한 수준으로 발현됨을 특징으로 하여, 대상의 질병 또는 장애를 치료, 개선 또는 예방하는 방법.
E2. (a) (1) 적어도 하나의 전사인자 서열을 포함하고, 적어도 하나의 전사인자 서열은 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 리간드-의존성 전사인자를 코딩하며, 여기에서 상기 프로모터는 질병 또는 장애 중에 활성화되는, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 리간드-의존성 전사인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료학적 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상의 세포에 도입하여 개질된 세포를 생산하고;
(b) 대상에게 리간드를 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도함을 특징으로 하여, 대상 내에 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
E3. E1 또는 E2에 있어서, 대상으로부터 분리된 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하여 개질된 세포를 생산하고, 개질된 세포를 대상 내로 재도입하는 방법.
E4. E1 또는 E2에 있어서, 생체내에서 실행되는 방법.
E5. E1 또는 E2에 있어서, 유전자 스위치가 엑디손(ecdysone) 수용체 (EcR)-기반의 유전자 스위치인 방법.
E6. E5에 있어서, 리간드가 EcR 리간드 결합 도메인에 결합하는 방법.
E7. E6에 있어서, 리간드가 디아실하이드라진인 방법.
E8. E7에 있어서, RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로 구성된 그룹으로부터 리간드가 선택되는 방법.
E9. E6에 있어서, 리간드가 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 방법.
E10. E1 또는 E2에 있어서, 유전자 스위치가 제1 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제1 전사인자 서열 및 제2 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제2 전사인자 서열을 포함하며, 여기에서 상기 제1 전사인자 서열에 의해 코딩되는 단백질과 제2 전사인자 서열이 상호작용하여 리간드-의존성 전사인자로 작용하는 단백질 복합체를 형성하는 방법.
E11. E10에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 상이한 방법.
E12. E10에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 동일한 방법.
E13. E10에 있어서, 제1 전사인자 서열이 이종이합체(heterodimer) 파트너 및 전이활성(transactivation) 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 방법.
E14. E10에 있어서, 제2 전사인자 서열이 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 방법.
E15. E1 또는 E2에 있어서, 폴리뉴클레오티드 중의 하나가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 치사 폴리펩티드(lethal polypeptide)를 추가로 코딩하는 방법.
E16. (a) (1) 적어도 하나의 전사인자 서열을 포함하고, 적어도 하나의 전사인자 서열은 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 리간드-의존성 전사인자를 코딩하며, 여기에서 상기 프로모터는 질병 또는 장애 중에 활성화되는, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (2) 리간드-의존성 전사인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료학적 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하여 개질된 세포를 생산하고;
(b) 개질된 세포에 리간드를 투여하여 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도함을 특징으로 하여, 세포 내에 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
E17. E16에 있어서, 시험관내에서 실행되는 방법.
E18. E16에 있어서, 대상으로부터 분리된 세포에서 생체외(ex vivo)에서 실행되는 방법.
E19. E16에 있어서, 생체내에서 실행되는 방법.
E20. E16에 있어서, 유전자 스위치가 EcR-기제의 유전자 스위치인 방법.
E21. E20에 있어서, EcR 리간드 결합 도메인에 리간드가 결합하는 방법.
E22. E21에 있어서, 리간드가 디아실하이드라진인 방법.
E23. E22에 있어서, RG-115819, RG-115932 및 RG-115830으로 구성된 그룹으로부터 리간드가 선택되는 방법.
E24. E21에 있어서, 리간드가 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 방법.
E25. E16에 있어서, 유전자 스위치가 제1 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제1 전사인자 서열 및 제2 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제2 전사인자 서열을 포함하며, 여기에서 상기 제1 전사인자 서열에 의해 코딩되는 단백질과 제2 전사인자 서열이 상호작용하여 리간드-의존성 전사인자로 작용하는 단백질 복합체를 형성하는 방법.
E26. E25에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 상이한 방법.
E27. E25에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 동일한 방법.
E28. E25에 있어서, 제1 전사인자 서열이 이종이합체 파트너 및 전이활성 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 방법.
E29. E25에 있어서, 제2 전사인자 서열이 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 방법.
E30. E16에 있어서, 폴리뉴클레오티드 중의 하나가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 치사 폴리펩티드를 추가로 코딩하는 방법.
E31. 적어도 하나의 전사인자 서열을 포함하고, 적어도 하나의 전사인자 서열은 치료학적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 리간드-의존성 전사인자를 코딩하며, 여기에서 상기 프로모터의 활성이 질병 또는 장애 중에 조정되는, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E32. E31에 있어서, 리간드-의존성 전사인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 리포터 유전자를 추가로 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E33. E31에 있어서, 유전자 스위치가 EcR-기제의 유전자 스위치인 폴리뉴클레오티드.
E34. E31에 있어서, 유전자 스위치가 제1 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제1 전사인자 서열 및 제2 치료학적 스위치 프로모터의 제어를 받는 제2 전사인자 서열을 포함하며, 여기에서 상기 제1 전사인자 서열에 의해 코딩되는 단백질과 제2 전사인자 서열이 상호작용하여 리간드-의존성 전사인자로 작용하는 단백질 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드.
E35. E34에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 상이한 폴리뉴클레오티드.
E36. E34에 있어서, 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 제2 치료학적 스위치 프로모터가 동일한 폴리뉴클레오티드.
E37. E34에 있어서, 제1 전사인자 서열이 이종이합체 파트너 및 전이활성 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E38. E34에 있어서, 제2 전사인자 서열이 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E39. E31에 있어서, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 치사 폴리펩티드를 추가로 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E40. E31에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
E41. E40에 있어서, 플라스미드 벡터인 벡터.
E42. E40에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
E43. E31에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트.
E44. E42에 따른 벡터를 포함하는 키트.
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 지침에 관한 것이다. 이러한 지침은 사용자에게 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 조건을 지시할 수 있다. 본 발명의 지침은 유형의 형태, 예를 들어 서면 지침(예를 들어 종이에 타이핑함) 또는 예를 들어 컴퓨터 디스크에 의하거나 인터넷을 통해 접근할 수 있는 무형의 형태일 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침, 또는 지침이 키트에 포함될 경우에 키트를 사용하기 위한 지침의 전문이 제공될 필요는 없음이 인정될 것이다. 본 발명의 키트가 예를 들어 이러한 전체 길이 지침을 포함하지 않는 상황의 예를 들면, 제공된 지시가 키트의 사용자에게 키트를 사용할 수 있는 방법의 실시를 위한 지침을 어디에서 얻는지를 안내하는 경우이다. 따라서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침은 인터넷 웹 페이지, 독립적으로 판매 또는 배포되는 메뉴얼 또는 다른 제품 문헌 등으로부터 얻을 수 있다. 따라서 본 발명은, 키트와 함께 직접 포장 및/또는 배포되지 않은 지침을 찾을 수 있는 하나 이상의 위치로 키트 사용자를 인도하는 키트를 포함한다. 이러한 지침은 전자 또는 인쇄 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 형태일 수 있다.
이상으로 본 발명을 완전히 기술하였으므로, 본 발명의 범위 또는 그의 임의의 구체예에 영향을 미치지 않으면서 넓고 균등한 범위의 조건, 제형 및 다른 변수 내에서 본 발명을 수행할 수 있음을, 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 완전히 포함된다.
<110> INTREXON CORPORATION
<120> THERAPEUTIC GENE-SWITCH CONSTRUCTS AND BIOREACTORS FOR THE
EXPRESSION OF BIOTHERAPEUTIC MOLECULES, AND USES THEREOF
<130> IPA100231
<150> US 61/047,899
<151> 2008-04-25
<150> US 60/975,986
<151> 2007-09-28
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ecdysone receptor response element
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
rrggttcant gacacyy 17
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ecdysone receptor response element
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> n is one or more spacer nucleotides
<400> 2
aggtcanagg tca 13
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ecdysone receptor response element
<400> 3
gggttgaatg aattt 15
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic I-SceI homing endonuclease restriction site
<400> 4
tagggataac agggtaat 18
<210> 5
<211> 878
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(878)
<223> Ecdysone receptor
<400> 5
Met Lys Arg Arg Trp Ser Asn Asn Gly Gly Phe Met Arg Leu Pro Glu
1 5 10 15
Glu Ser Ser Ser Glu Val Thr Ser Ser Ser Asn Gly Leu Val Leu Pro
20 25 30
Ser Gly Val Asn Met Ser Pro Ser Ser Leu Asp Ser His Asp Tyr Cys
35 40 45
Asp Gln Asp Leu Trp Leu Cys Gly Asn Glu Ser Gly Ser Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Asn Gly His Gly Leu Ser Gln Gln Gln Gln Ser Val Ile Thr Leu
65 70 75 80
Ala Met His Gly Cys Ser Ser Thr Leu Pro Ala Gln Thr Thr Ile Ile
85 90 95
Pro Ile Asn Gly Asn Ala Asn Gly Asn Gly Gly Ser Thr Asn Gly Gln
100 105 110
Tyr Val Pro Gly Ala Thr Asn Leu Gly Ala Leu Ala Asn Gly Met Leu
115 120 125
Asn Gly Gly Phe Asn Gly Met Gln Gln Gln Ile Gln Asn Gly His Gly
130 135 140
Leu Ile Asn Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Thr Thr Pro Leu His Leu
145 150 155 160
Gln Gln Asn Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Met Gly
165 170 175
Ile Leu His His Ala Asn Gly Thr Pro Asn Gly Leu Ile Gly Val Val
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Gly Val Gly Gly Gly Gly Val Gly
195 200 205
Gly Leu Gly Met Gln His Thr Pro Arg Ser Asp Ser Val Asn Ser Ile
210 215 220
Ser Ser Gly Arg Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr
225 230 235 240
Ser Ala Asn Glu Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala
245 250 255
Pro Arg Val Gln Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser
260 265 270
Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe
275 280 285
Arg Arg Ser Val Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg
290 295 300
Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg
305 310 315 320
Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro
325 330 335
Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu
340 345 350
Lys Asp Lys Met Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly
355 360 365
Ser Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu
370 375 380
Asp Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu
385 390 395 400
Pro Asp Glu Ile Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu
405 410 415
Thr Tyr Asn Gln Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp
420 425 430
Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln
435 440 445
Pro Asp Glu Asn Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr
450 455 460
Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly
465 470 475 480
Leu Pro Ala Phe Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu
485 490 495
Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr
500 505 510
Asp His Ser Ser Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr
515 520 525
Arg Asp Ser Tyr Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu
530 535 540
Leu His Phe Cys Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu
545 550 555 560
Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu
565 570 575
Glu Lys Ala Gln Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr
580 585 590
Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu
595 600 605
Val Phe Tyr Ala Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu
610 615 620
Gly Asn Gln Asn Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg
625 630 635 640
Lys Leu Pro Lys Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro
645 650 655
Pro Ser Val Gln Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg
660 665 670
Leu Glu Arg Ala Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr
675 680 685
Ala Gly Ile Asp Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala
690 695 700
Ala Gln His Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu
705 710 715 720
Thr Gln Asn Asp Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln
725 730 735
Leu Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln
740 745 750
Leu Gln Thr Gln Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu
755 760 765
Pro Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu
770 775 780
Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile
785 790 795 800
Gly Pro Ile Thr Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr
805 810 815
Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val
820 825 830
Gly Val Gly Val Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr
835 840 845
Ala Met Ala Leu Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu
850 855 860
Ile Gly Gly Val Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
865 870 875
<210> 6
<211> 605
<212> PRT
<213> Streptomyces
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(605)
<223> Streptomyces phage phiC31 integrase
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Met Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr Asp Arg Gln Ser Arg Glu Arg Glu
1 5 10 15
Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr Gln Arg Ser Ala Asn Glu Asp
20 25 30
Lys Ala Ala Asp Leu Gln Arg Glu Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe
35 40 45
Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu Arg Ile Leu Asn Glu Cys Arg Ala
65 70 75 80
Gly Arg Leu Asn Met Ile Ile Val Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg
85 90 95
Leu Lys Val Met Asp Ala Ile Pro Ile Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu
100 105 110
Gly Val Thr Ile Val Ser Thr Gln Glu Gly Val Phe Arg Gln Gly Asn
115 120 125
Val Met Asp Leu Ile His Leu Ile Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys
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Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys Ile Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gln
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Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu
165 170 175
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Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val Ile Arg Trp Trp Trp Arg Glu Ile Lys
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Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ile His
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Pro Gly Ser Ile Thr Gly Leu Cys Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val
245 250 255
Pro Thr Arg Gly Glu Thr Ile Gly Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp
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Asp Pro Ala Thr Val Met Arg Ile Leu Arg Asp Pro Arg Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Ala Ala Glu Val Ile Tyr Lys Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr
290 295 300
Thr Lys Ile Glu Gly Tyr Arg Ile Gln Arg Asp Pro Ile Thr Leu Arg
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Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro Ile Ile Glu Pro Ala Glu Trp Tyr
325 330 335
Glu Leu Gln Ala Trp Leu Asp Gly Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser
340 345 350
Arg Gly Gln Ala Ile Leu Ser Ala Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys
355 360 365
Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg Gly Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ser
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Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gln
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Ala Glu Arg Ile Phe Asn Lys Ile Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu
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Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr
435 440 445
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450 455 460
Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala
465 470 475 480
Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly Arg Lys His Phe Arg Lys Gln Gln
485 490 495
Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gln Gln Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu
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Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys Leu Pro Leu Asp Gln Trp Phe Pro
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Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg
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Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys
545 550 555 560
Ile Val Val Thr Lys Ser Thr Thr Gly Arg Gly Gln Gly Thr Pro Ile
565 570 575
Glu Lys Arg Ala Ser Ile Thr Trp Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp
580 585 590
Glu Asp Asp Ala Gln Asp Gly Thr Glu Asp Val Ala Ala
595 600 605
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic hypoxia-inducible gene switch constructor expressing
IGF-1
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taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
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gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1860
aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta 1920
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1980
attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 2040
atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt 2100
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gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga 2220
tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga 2280
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ccaggccggg cctgtcgctg aagatcacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt 2400
ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca 2460
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cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760
cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820
ggttggcggt cagctggggg atgttcttct gcctgttggt caccagcagc ttgtcgctca 2880
ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940
tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000
tctgggcctt cttctccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060
gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120
cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180
ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240
cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300
ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360
tcaggtgggc cctggtcagg gggctcctct tggtcttggg gctgtatctg cactcccagt 3420
tgttcttcag gcacttggcg cacttgggct tctccttgct gcacttcagc ttcttcagcc 3480
tgcagatgtc gcaagcctgc tcgatgctgc tcagcagctt catggtggca gatctggtcg 3540
cgggaggctg ctggttttcc actacccgaa aaaaatccag cgtctaagca gctgcaagga 3600
gagcctttca gagaagcggg tcctggcagc ggcggggaag tgtccccaaa tgggcagaat 3660
agcctccccg cgtcgggaga gtcgcgtcct tgctcgggtg ttgtaagttc cagtgcaaag 3720
tgcccgcccg ctgctatggg caaagtttcg tggatgcggc tagggttgcg caccgctggc 3780
tgggggatca gcgggagggc tgggccagag gcgaagcccc ctattcgctc cggatctccc 3840
ttcccaggac gcccgcagcg cagctctgct cgccgggctc ctccacccta gcccgccgcc 3900
cgctcgctcc ctctgcctct cgctggaatt actacagcga gttgccggct cagctgtcgc 3960
tggggctctc cagcatctcc atcaggaagg tgtcgatggg cacgtcgccg atcagcctga 4020
agaagaacag gtgctccagg cacttcaggc cgatgctcct caggctgggc agcctcagca 4080
gcagcttggc gaatctgccg ggctcgtcgg ggtgggtggt cctggtgtac tcctccaggg 4140
cggcgtacac cttctccctc agcagctcca cctcctgggc gcttttcagg cccctcacct 4200
cggggttgaa caggatgatg gccctcaggc agcccagctc ggtcttgtcc atcctcatgt 4260
ccctcatctt gctcaccagc tcggtcagca ccctgtcgaa gatggcgccc actccggcgc 4320
tgtgggcgct gttcctatgg acgtgcaggc cggtggccag caggatgccg tccctcacgt 4380
cgatgctcct gtggctgaag ctggcgatca gcagctcgtt ccatccggcc ctcagcagga 4440
tcacctggtc gtccaggggc aggctgctga agtggggaat cctcttggcc cactccacca 4500
gggtgaacag ctgcttgtcg gcggcctggc agatgttggt cacggggtcg ttggggctgc 4560
tgccgctgcc gccggttccg ccggggccct ccacgccctg gtcgcttttc tgctccacgg 4620
cgagttcggc ctccagaatc ctgtccacgg gcatctccat atggccgccg tactcgtcga 4680
tgcccagggc gtcggtgaac atctgctcga actcgaagtc ggccatgtcc agggcgccgt 4740
agggggcgct gtcgtggggg gtgaagccgg ggccggggct gtcgccgtcg cccagcatgt 4800
ccaggtcgaa gtcgtccagg gcgtcggcgt gggccatggc cacgtcctcg ccgtccaggt 4860
gcagctcgtc gcccaggctc acgtcggtgg ggggggccac cttccttttc ttcttggggc 4920
ccatggtggc caattgcccc cccccccccc cgcatgcggc tggctgctgc ctctgaagaa 4980
ttcaaggagc ctgctggtcg gcccctgctg tggaacaata aatacctctt ccctggggtt 5040
aaaaataacc ccatgaccac ttttggcagt tgtaggtgag gcagaggcca cctaagcccc 5100
cccaccccat gccgttcttc tgaagtaaga gccgttcaaa gtccgacacc cgcctgggtg 5160
gacacgtgag acccaaaaat gccttcaagg ttaaagagac agtggctggg gcctggcctg 5220
ggaacgatgc tctgtgctct gggtcctgcc attgccgaca ggcgctgtgt gagacagcac 5280
gtagggcgac aggcgctgtg tgagacagca cgtagggcga caggcgctgt gtgagacagc 5340
acgtagggcg acaggcgctg tgtgagacag cacgtagggc gacaggcgct gtgtgagaca 5400
gcacgtaggg cgacaggcgc tgtgtgagac agcacgtagg gcgacaggcg ctgtgtgaga 5460
cagcacgtag ggcgacaggc gctgtgtgag acagcacgta gggcgacagg cgctgtgtga 5520
gacagcacgt agggcctcga gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc tcttccaaaa 5580
atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcataagc caaatggaac 5640
tacgagacct gcatcgtggt gtaactataa cggtcctaag gtagcgaccg cggagactag 5700
gtgtatttat ctaagcgatc gcttaattaa ggccggccgc cgcaataaaa tatctttatt 5760
ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatccata gtactaacat acgctctcca 5820
tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtccagg 5880
tgccagaaca tttctctatc cataatgcag gggtaccggg tgatgacggt gaaaacctcc 5940
aattgcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg 6000
agcggagtac tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc 6060
ggagagtccc cggggaccta gagggtatat aatgggtgcc ttagctggtg tgtgacctca 6120
tcttcctgta cgcccctgca ggggcgcgcc acgcgtcgaa gaaggtgagt aatcttaaca 6180
tgctcttttt tttttttttt gctaatccct tttgtgtgct gatgttagga tgacatttac 6240
aacaaatgtt tgttcctgac aggaaaaacc ttgctgggta ccttcgttgc cggacacttc 6300
ttgtcctcta ctttggaaaa aaggaattga gagccgctag cgccaccatg ggaaaaatca 6360
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acaccatgtc ctcctcgcat ctgttctacc tggcgctgtg cctgctgacc ttcaccagct 6480
ctgccacggc tggaccggag accctctgcg gggccgagct ggtggatgcc ctgcaattcg 6540
tgtgtggaga caggggcttc tacttcaaca agcccacagg gtatggctcc agcagtcgga 6600
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tggagatgta ttgcgcaccc ctcaagcctg ccaagtcagc tcgctctgtc cgtgcccagc 6720
gccacaccga catgcccaag acccagaagt atcagccccc atctaccaac aagaacacga 6780
agtctcagag aaggaaagga agtacatttg aagaacgcaa gtagatcgat tgcgcaaagc 6840
tttcgcgata ggcgagacca atgggtgtgt acgtagcggc cgcgtcgacg atagcttgat 6900
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 6960
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 7020
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 7080
acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 7140
ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 7200
ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 7260
ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 7320
tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg 7380
attttaaaat aactatacca gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat 7440
gcccaaccgg tgggacattt gagttgcttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc 7500
actcagtaga tgcctgttga attctgattt aaatcggtcc gcgtacggcg tggtaggtcc 7560
gaacgaatcc atggattacc ctgttatccc tactcaagga catcatccct ttagtgaggg 7620
ttaattcacg cagtgggtac ggaactaaag gcagcacaca tcgtgtaatc atggtcatag 7680
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgcta cgtctctccc ccgcagtaag ggctagatta 7740
actcgtctcg tgaatatccg gaactccctt tagtgagggt taattgcgtt gcgctcactg 7800
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagcttaatc atggtcatag ctgtttcctg 7860
tgtgaaattg ttatccgcta ccggaaacgc ttccttcatg tgagcaaaag gccagcaaaa 7920
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 7980
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 8040
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ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 8220
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 8280
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tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 8400
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ataatgcttt taaaacttaa aaataatcta tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat 8760
ggcaaatcaa tgtcctcagc gaaatggcat acgagtaaac ttggtctgac accgctgcat 8820
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 8880
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 8940
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 9000
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 9060
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gcgccgagcg 9120
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaactgtt gccgggaagc 9180
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcggagcgtt gttgccattg ctacaggcat 9240
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 9300
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ggttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 9420
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt attcaaccaa 9480
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 9540
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attgggaagc gttcttcggg 9600
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccacacgagc 9660
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 9720
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatacg 9780
cttccttttt caatagtatt gaagcattta tcagggttat tgtctcggga gcgaatacat 9840
atttgaatgt atttagaaaa a 9861
<210> 8
<211> 10823
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ubiquitous and hypoxia inducible promoter gene switch
construct expressing bFGF
<400> 8
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
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ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
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cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
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ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
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gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
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gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
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cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
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tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
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ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
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ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060
gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca 3120
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cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc 3240
aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg 3300
gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc 3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa 3420
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cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc 3540
gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg 3600
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gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata 3720
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attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260
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cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt 4860
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ggctccgtca cgtactccga gtcccgcacg cactcagcgt cgctctgggg ccccacgtcc 5820
ggccctgacg tgcggcttcg tttgtcacgt cgcggacgtg cgggaaccca cgtgggggct 5880
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tactccgagt cccgcacgca ctcagcgtcg ctctggggcc ccacgtccgg ccctgacgtg 6180
cggcttcgtt tgtcacgtcg cggacgtgcg ggaacccacg tgggggctcc gtcacgtact 6240
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tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 6720
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 6780
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 6840
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 6900
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg 6960
acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa 7020
aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tggtgggtgt ggggggtgga gatgtagaag 7080
atgtgacgcc caggcccggc gggtgccaga ttagcggacg cggtgccaga ggctgcaacg 7140
gcatccccgg cgcagccgcc tgggaagccg ctctccccag gcggcgtccc agaaggcacc 7200
catccgtgaa ccccaggagc agagccgccg gatcgccgcg caccaggggc agaagaacag 7260
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ggaggctggg gggccggggc cggggccgtg ccccggagcg ggtcggaggc cggggccggg 7380
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cagggacaat ggccgccggg agcatcacca cgctgcccgc cttgcccgag gatggcggca 7500
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ctcacatcaa gctacaactt caagcagagg agagaggagt tgtgtctatc aaaggagtgt 7680
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cggatgagtg tttctttttt gaacgattgg aatctaataa ctacaatact tacagaagca 7800
ggaaatacac cagttggtat gtggcactga aacgaactgg gcagtataaa cttggcagca 7860
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cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa 8040
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ctttagtgag ggttaattca cgcagtgggt acggaactaa aggcagcaca catcgtgtaa 8760
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ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagcttaa tcatggtcat 8940
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ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9120
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9180
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atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 9840
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 9900
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 9960
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 10020
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagcgccgag 10080
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaactg ttgccgggaa 10140
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcggagcg ttgttgccat tgctacaggc 10200
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 10260
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 10320
atggttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 10380
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gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattgggaa gcgttcttcg 10560
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ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 10740
cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcgg gagcgaatac 10800
atatttgaat gtatttagaa aaa 10823
<210> 9
<211> 10538
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ubiquitous and hypoxia inducible gene switch construct
expressing EPO
<400> 9
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
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aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
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gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
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cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
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ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
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cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
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tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
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ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060
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aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260
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ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg 4740
cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800
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ggccctgacg tgcggcttcg tttgtcacgt cgcggacgtg cgggaaccca cgtgggggct 5880
ccgtcacgta ctccgagtcc cgcacgcact cagcgtcgct ctggggcccc acgtccggcc 5940
ctgacgtgcg gcttcgtttg tcacgtcgcg gacgtgcggg aacccacgtg ggggctccgt 6000
cacgtactcc gagtcccgca cgcactcagc gtcgctctgg ggccccacgt ccggccctga 6060
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tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 6540
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cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060
gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca 3120
aaaggtgcct aaaaaacttc acaaaacaca ctcgccaacc ccgagcgcac gtacccagcc 3180
cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc 3240
aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg 3300
gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc 3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa 3420
aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt 3480
cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc 3540
gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg 3600
agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg 3660
gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata 3720
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga 3780
aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260
ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa 4320
gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta 4380
agcctggttg ttggcgaaca ggatgctgtc gctggcggcg tcgtacctcc tggccaccct 4440
cagcatcatc acctcgctgc tgcaagcctt cagcagggtg atctggtcgg gctggctgat 4500
cttggcgaat ccgggcaggc ccttggcgaa ctccacgatc agctgcacgg tcaggatggt 4560
catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg 4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata 4680
ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg 4740
cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt 4860
ggtgctcacg ggcagcttgt ccttctcctt ctgggccttc ttctccttcc ttttcatggc 4920
gcactgggtc tcgggcacca cgcactcggg cctgatcccg ggaaactcgg ggctcacggt 4980
cagctgcctc tggcccttgt tgctgctctc ctcgctgctg ctggtggcgc tgatcctgtg 5040
ctgcctcagg gtcaggggca tgtcggtctc cacgctggcc agcctgtcgg tcacggcgtc 5100
cttgttcacg ttgtcctgca cgaacaggcc ggtcagcagg gccttgatgt cttgcaggct 5160
gtccatcttc aggatcatgt ccaggtcctc cctggggaag atcagcagga acagctgctc 5220
cagcctctcc agcctgctct ccacctcggt caggtgggcc ctggtcaggg ggctcctctt 5280
ggtcttgggg ctgtatctgc actcccagtt gttcttcagg cacttggcgc acttgggctt 5340
ctccttgctg cacttcagct tcttcagcct gcagatgtcg caagcctgct cgatgctgct 5400
cagcagcttc atggtggcca attgcccccc cccccccccg catgccccgg aggcggcggg 5460
aggcgggggg cgggtccggg ccacgatgcg cttcctgccc gcgccagccg cccccgaccc 5520
cggcgtccgg gcccggatca gcctcgccgc gcagtccggg ggcggggcgg gggcggctcc 5580
gctgcggaca cgccctcact ccccgccccg gccccgcccg cccccggaac ccccgcctgc 5640
ccctggccgc cctgggccac gccccgccgt ccgcgggtcc cgccgcccgc gccctccagg 5700
acccgcccgc ggccccaggg tccctccccg tagccgccgc cgccgtcgct cgctctcctc 5760
gctctttcct cccacttggc cgcttggcct gcctcgctcg cgcctgtttt ctcttttccg 5820
ccctctcccc caccccgcct ctccctctct ctgtgtctct cggtctctgc gcctctccgc 5880
ctctgtcccc accccaaact ccgcgcgtgt ggcgcttctc cgggttctgc ctctgcttct 5940
ccttctccct ccgactccgc ttcgctctcc agtccctggc agccccgccc ccggcccttt 6000
ctagtctcct tctctctcct gctccgtttt tccgtccctg acgctcgctc cctctctccg 6060
tggctccctc tgcctccccc tcggaccctc cgtccctctc tcggtccctc tgagctcccc 6120
tttccttctc cctctgcctt cccgaaccct gtgtctcccc tccacactca gcctccctcc 6180
accacctttc tcaggcactg tccaggcctt cgctcctcga gtggtaatac aatggccggt 6240
tcccatggac ctgcatcgtg gtgtaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact 6300
aggtgtattt atctaagcga tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta 6360
ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc 6420
catcaaaaca aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca 6480
ggtgccagaa catttctcta tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct 6540
ccaattgcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc 6600
cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga 6660
gcggagagtc cccggggacc tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct 6720
catcttcctg tacgcccctg caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa 6780
catgctcttt tttttttttt ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt 6840
acaacaaatg tttgttcctg acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact 6900
tcttgtcctc tactttggaa aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tggatgcaat 6960
gaagcggggg ctctgctgtg tgctgctgct gtgtggagca gtgttcgttt cgcccagcca 7020
ggaaatccat gcccgattca gaaggggcgc aagaagctac caagtgatct gccgggatga 7080
aaaaacgcag atgatatacc agcaacatca gtcatggctg cgccctgtgc tcagaagcaa 7140
ccgggtggag tattgctggt gcaacagtgg cagggcacag tgccacagcg tccctgtcaa 7200
aagttgcagc gagccaaggt gtttcaacgg gggcacctgt cagcaggccc tgtacttctc 7260
agatttcgtg tgccagtgcc ccgaaggatt tgctgggaag tgctgtgaaa tagataccag 7320
ggccacctgt tacgaggacc agggcatcag ctacaggggc acctggagca cagcggagag 7380
tggcgctgag tgtaccaact ggaacagcag cgcgttggcc cagaagccct acagcgggcg 7440
gaggccagat gccatcagac tcggcctggg gaaccacaac tactgccgga acccagatcg 7500
agactcaaag ccctggtgct acgtctttaa ggcggggaag tacagctcag agttctgctc 7560
cacccctgcc tgctctgagg gaaacagtga ctgctacttt gggaatgggt cagcctaccg 7620
tggcacgcac agcctcaccg agtcgggtgc ctcctgcctc ccgtggaaca gcatgatcct 7680
gataggcaat gtttacacag cacagaaccc cagtgcccag gcactgggcc tgggcaaaca 7740
taattactgc cggaatcctg atggggatgc caagccctgg tgccacgtcc tgaagaaccg 7800
caggctgacg tgggagtatt gcgatgtgcc cagctgctcc acctgtggcc tgagacagta 7860
cagccagcct cagtttcgca tcaaaggcgg cctgttcgcc gacatcgcct cccacccctg 7920
gcaggctgcc atctttgcca agcacaggag gtcgcccgga gagcggttcc tgtgcggggg 7980
catactcatc agctcctgct ggattctctc tgccgcccac tgcttccagg agaggtttcc 8040
gccccaccac ctgacggtga tcttgggcag aacataccgg gtggtccctg gcgaggagga 8100
gcagaaattt gaagtcgaaa aatacattgt ccataaggag ttcgatgatg acacttacga 8160
caatgacatt gcgctgctgc aactgaaatc ggattcgtcc cgctgtgccc aggagagcag 8220
cgtggtcaga accgtgtgcc ttcccccggc ggacctccag ctgccggact ggacggagtg 8280
tgagctgtcc ggctacggca agcatgaggc cctgtctcct ttctattcgg agcggctgaa 8340
ggaggctcat gtcagactgt acccatccag ccgctgcaca tcacaacatt tacttaacag 8400
aacagtcacc gacaacatgc tgtgtgctgg agacactcgg agcggcggcc cccaggcaaa 8460
cttgcacgac gcctgccagg gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga acgatggccg 8520
catgactttg gtgggcatca tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg atgtgcccgg 8580
cgtgtacacc aaggttacca actacctaga ctggattcgt gacaacatgc gaccgtgaat 8640
cgattgcgca aagctttcgc gataggcgag accaatgggt gtgtacgtag cggccgcgtc 8700
gacgatagct tgatgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg 8760
aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt 8820
ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc 8880
aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag 8940
tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc 9000
agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt 9060
tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg 9120
tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct 9180
tccctgtcct tctgatttta aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata 9240
ggctacctgg ccatgcccaa ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct 9300
catgcgttgg gtccactcag tagatgcctg ttgaattctg atttaaatcg gtccgcgtac 9360
ggcgtggtag gtccgaacga atccatggat taccctgtta tccctactca aggacatcat 9420
ccctttagtg agggttaatt cacgcagtgg gtacggaact aaaggcagca cacatcgtgt 9480
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctacgtctc tcccccgcag 9540
taagggctag attaactcgt ctcgtgaata tccggaactc cctttagtga gggttaattg 9600
cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctt aatcatggtc 9660
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctaccggaa acgcttcctt catgtgagca 9720
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 9780
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 9840
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 9900
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 9960
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 10020
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 10080
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 10140
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 10200
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 10260
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 10320
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 10380
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgatctat 10440
gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcatacgagt aaacttggtc tgacaccgct 10500
gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 10560
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 10620
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 10680
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 10740
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagcgccg 10800
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaac tgttgccggg 10860
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcggag cgttgttgcc attgctacag 10920
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 10980
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 11040
cgatggttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 11100
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtattcaa 11160
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 11220
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattggg aagcgttctt 11280
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccacac 11340
gagcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 11400
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 11460
tacgcttcct ttttcaatag tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc gggagcgaat 11520
acatatttga atgtatttag aaaaa 11545
<210> 12
<211> 10207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic NxcI cardomyocyte promoter hypoxia inducible gene
switch expressing EPO
<400> 12
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160
atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220
tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340
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tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
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ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
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cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccccag tatgatgcct tctctaaatt taccagaaag 3060
aaaggacctg ggatgcttgt cctttaagtg tctctaaaca tggtttgcat agctggatct 3120
cagcttatct gtgcctttcg gctttcgctt ccatacatgg atctgttccc aacagtaact 3180
ccaagctgtc gaaaagaagc tatctggcag ctctctgctt catccaacac atggatgata 3240
aaaatacaca tatagcgatt cttccctcga gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc 3300
tcttccaaaa atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg 3360
ctacaaacta cgaacgatca ttctagatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa 3420
aaacctccca catctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaaatg ttttattaac 3480
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 3540
taagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 3600
catgtctaat cgattcacag gttggtgggg ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg 3660
ctcatgtcgg ccacgtccca aatctcctcc aggaaggggg gcagcttcct gttcttcagc 3720
ttcaggctga tacacatatt gctgttctgc attcccaggg tcctcagctc gctcaggatg 3780
ctcaggatct tgccgtagat cacgctgctc ctggcgctgc cgctcagctg gttcaggatg 3840
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agggccatgc tgtacataca tctgcagaag tgcaggaggt cctcgatcac ctcggccatg 4020
ccagccttcc tgtagttgtc cctggtgtaa gcctggttgt tggcgaacag gatgctgtcg 4080
ctggcggcgt cgtacctcct ggccaccctc agcatcatca cctcgctgct gcaagccttc 4140
agcagggtga tctggtcggg ctggctgatc ttggcgaatc cgggcaggcc cttggcgaac 4200
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ctggggaaga tcagcaggaa cagctgctcc agcctctcca gcctgctctc cacctcggtc 4920
aggtgggccc tggtcagggg gctcctcttg gtcttggggc tgtatctgca ctcccagttg 4980
ttcttcaggc acttggcgca cttgggcttc tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg 5040
cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc 5100
ccccccccgc atgcacagga agatgagctc acacaccagc taaggcaccc attatatacc 5160
ctctaggtct tcgcggacgt gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc 5220
ccgcacgcac tcagcgtcgc tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt 5280
gtcacgtcgc ggacgtgcgg gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc 5340
acgcactcag cgtcgctctg gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca 5400
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actcagcgtc gctctggggc cccacgtccg gccctgacgt gcggcttcgt ttgtcacgtc 5520
gcggacgtgc gggaacccac gtgggggctc cgtcacgtac tccgagtccc gcacgcactc 5580
agcgtcgctc tggggcccca cgtccggccc tgacgtgcgg cttcgtttgt cacgtcgcgg 5640
acgtgcggga acccacgtgg gggctccgtc acgtactccg agtcccgcac gcactcagcg 5700
tcgctctggg gccccacgtc cggccctgac gtgcggcttc gtttgtcacg tcgcggacgt 5760
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tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt gtcacgtcgc ggacgtgcgg 5880
gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc acgcactcag cgtcgctctg 5940
gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca cgtcctcgag tggtaataca 6000
atggccggtt cccatggacc tgcatcgtgg tgtaactata acggtcctaa ggtagcgacc 6060
gcggagacta ggtgtattta tctaagcgat cgcttaatta aggccggccg ccgcaataaa 6120
atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatccat agtactaaca 6180
tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 6240
gcaagtccag gtgccagaac atttctctat ccataatgca ggggtaccgg gtgatgacgg 6300
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taatcttaac atgctctttt tttttttttt tgctaatccc ttttgtgtgc tgatgttagg 6600
atgacattta caacaaatgt ttgttcctga caggaaaaac cttgctgggt accttcgttg 6660
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atacctgttg gaggccaagg aagccgagaa tatcacgacg ggctgtgctg aacactgctc 6900
cttgaatgag aatatcactg tcccagacac caaagttaat ttctatgcct ggaagcggat 6960
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ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct 7500
ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct 7560
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aaattgttat ccgctaccgg aaacgcttcc ttcatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 8400
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ggtaatgaaa tggcatacga gtaaacttgg tctgacaccg ctgcatgaga ttatcaaaaa 9180
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tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 9360
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ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagcgc cgagcgcaga agtggtcctg 9480
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cgccagttaa tagtttgcgg agcgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 9600
cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 9660
cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatggtt gtcagaagta 9720
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agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 9900
atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg ggaagcgttc ttcggggcga aaactctcaa 9960
ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac acgagcaccc aactgatctt 10020
cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 10080
caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catacgcttc ctttttcaat 10140
agtattgaag catttatcag ggttattgtc tcgggagcga atacatattt gaatgtattt 10200
agaaaaa 10207
<210> 13
<211> 16979
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic ubiquitous+ hPlexin D1 + hypoxia inducible gene switch
construct expressing relaxin and HGF
<400> 13
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
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cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360
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gcggctgact gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg 1380
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gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat tgttgttaaa tcacacaaaa aaccaacaca 1800
cagatgtaat gaaaataaag atattttatt atcgattcag ctgtcgctgg ggctctccag 1860
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gctgaagctg gcgatcagca gctcgttcca tccggccctc agcaggatca cctggtcgtc 2340
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ggttccgccg gggccctcca cgccctggtc gcttttctgc tccacggcga gttcggcctc 2520
cagaatcctg tccacgggca tctccatatg gccgccgtac tcgtcgatgc ccagggcgtc 2580
ggtgaacatc tgctcgaact cgaagtcggc catgtccagg gcgccgtagg gggcgctgtc 2640
gtggggggtg aagccggggc cggggctgtc gccgtcgccc agcatgtcca ggtcgaagtc 2700
gtccagggcg tcggcgtggg ccatggccac gtcctcgccg tccaggtgca gctcgtcgcc 2760
caggctcacg tcggtggggg gggccacctt ccttttcttc ttggggccca tggtggccaa 2820
ttgccccccc ccccccccgc atgccgtcta acaaaaaagc caaaaacggc cagaatttag 2880
cggacaattt actagtctaa cactgaaaat tacatattga cccaaatgat tacatttcaa 2940
aaggtgccta aaaaacttca caaaacacac tcgccaaccc cgagcgcacg tacccagccc 3000
agcagcccgc tactcaccaa gtgacgatca cagcgatcca caaacaagaa ccgcgaccca 3060
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cgttcaccgc cccacggaga tccctccgca gaatcgccga gaagggacta cttttcctcg 3180
cctgttccgc tctctggaaa gaaaaccagt gccctagagt cacccaagtc ccgtcctaaa 3240
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ctgagcgtcc gggcggaagg atcaggacgc tcgctgcgcc cttcgtctga cgtggcagcg 3360
ctcgccgtga ggaggggggc gcccgcggga ggcgccaaaa cccggcgcgg aggccctcga 3420
gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc tcttccaaaa atttaggtga cactataggg 3480
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acataaaatg aatgcaaatg ttttattaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 3660
ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat taagcatttt tttcactgca ttctagttgt 3720
ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctaat cgattcacag gttggtgggg 3780
ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg ctcatgtcgg ccacgtccca aatctcctcc 3840
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tgcctcaggg tcaggggcat gtcggtctcc acgctggcca gcctgtcggt cacggcgtcc 4920
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tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc 5220
agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc ccccccccgc atgccccgga ggcggcggga 5280
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ggcgtccggg cccggatcag cctcgccgcg cagtccgggg gcggggcggg ggcggctccg 5400
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cccgcccgcg gccccagggt ccctccccgt agccgccgcc gccgtcgctc gctctcctcg 5580
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cctctccccc accccgcctc tccctctctc tgtgtctctc ggtctctgcg cctctccgcc 5700
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tatgtacagt actgctgtat ataaaaccag tggttatatg tacagtacgt cgactgctgt 8520
atataaaacc agtggttata tgtacagtac tgctgtatat aaaaccagtg gttatatgta 8580
cagtaccccg gggacctaga gggtatataa tgggtgcctt agctggtgtg tgacctcatc 8640
ttcctgtacg cccctgcagg ggcgcgccac gcgtcgaaga aggtgagtaa tcttaacatg 8700
ctcttttttt ttttttttgc taatcccttt tgtgtgctga tgttaggatg acatttacaa 8760
caaatgtttg ttcctgacag gaaaaacctt gctgggtacc ttcgttgccg gacacttctt 8820
gtcctctact ttggaaaaaa ggaattgaga gccgctagcg ccaccatgtg ggtgaccaaa 8880
ctcctgccag ccctgctgct ccagcacgtc ctcctgcatc tcctcctgct ccccatcgcc 8940
atcccctatg cagagggaca aaggaaaaga agaaatacaa ttcatgagtt caaaaaatca 9000
gcaaagacta ccctaatcaa aatagatcca gcactgaaga taaaaaccaa aaaagtgaat 9060
accgccgacc aatgtgctaa tagatgtact aggaacaaag gacttccatt cacttgcaag 9120
gcttttgttt ttgataaagc aagaaaacaa tgcctctggt tccccttcaa tagcatgtca 9180
agtggagtga aaaaagaatt tggccatgaa tttgacctct atgaaaacaa agactacatt 9240
agaaactgca tcattggtaa aggacgcagc tacaagggaa cagtatctat cactaagagt 9300
ggcatcaaat gtcagccctg gagttccatg ataccacacg aacacagctt tttgccttcg 9360
agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcccagagg cgaagaaggg 9420
ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 9480
tgttcagaag ttgagtgcat gacctgtaat ggggagagtt atcgaggtct catggatcat 9540
acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc 9600
ttgcctgaaa gataccccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc 9660
cagccgaggc cctggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta ttgcgcaatc 9720
aagacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgagtgc 9780
atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa tggcatcccc 9840
tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag 9900
tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt 9960
tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg 10020
tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa 10080
acaagaagcg gactaacctg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaggactt acatcgtcat 10140
atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat 10200
gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga ttattgccct 10260
atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca tcccgtaata 10320
tcttgtgcca aaacgaaaca gctgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata 10380
ggatggatgg ttagtttgag atacagaaac aagcatatct gcggaggatc attgataaag 10440
gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttccctagca gagacttgaa agattatgag 10500
gcttggcttg gcatccacga tgtccacggc agaggcgatg agaaatgcaa acaggttctc 10560
aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggaagcgacc tggtgctgat gaagctggcc 10620
agacccgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta tggatgcaca 10680
attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggact gattaactat 10740
gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat 10800
catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga 10860
tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga 10920
atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt 10980
tttgtccgag tagcctacta cgccaaatgg atacacaaaa ttattttaac atataaggtg 11040
ccccagtcat agatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat gggtgtgtac 11100
gtagcggccg ctcgagaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 11160
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 11220
actcatcaat gtatcttatc atgtctcgta cggcgtggta ggtccgaacg aatccatgga 11280
ttaccctgtt atccctactc atcttcgtcg gacgcgccgt taatatttga tcagccattc 11340
tctgtatgag tactaacgaa cgtgacgcgg tgttactggt aactatgact ctcttaaggt 11400
agccaaatac atcatccctt tagtgagggt taattcacgc agtgccgcgg cgtgtagaaa 11460
atacctatca gctcgaggac gtgacaaacg aagccgcacg tcagggccgg acgtggggcc 11520
ccagagcgac gctgagtgcg tgcgggactc ggagtacgtg acggagcccc cacgtgggtt 11580
cccgcacgtc cgcgacgtga caaacgaagc cgcacgtcag ggccggacgt ggggccccag 11640
agcgacgctg agtgcgtgcg ggactcggag tacgtgacgg agcccccacg tgggttcccg 11700
cacgtccgcg acgtgacaaa cgaagccgca cgtcagggcc ggacgtgggg ccccagagcg 11760
acgctgagtg cgtgcgggac tcggagtacg tgacggagcc cccacgtggg ttcccgcacg 11820
tccgcgacgt gacaaacgaa gccgcacgtc agggccggac gtggggcccc agagcgacgc 11880
tgagtgcgtg cgggactcgg agtacgtgac ggagccccca cgtgggttcc cgcacgtccg 11940
cgacgtgaca aacgaagccg cacgtcaggg ccggacgtgg ggccccagag cgacgctgag 12000
tgcgtgcggg actcggagta cgtgacggag cccccacgtg ggttcccgca cgtccgcgac 12060
gtgacaaacg aagccgcacg tcagggccgg acgtggggcc ccagagcgac gctgagtgcg 12120
tgcgggactc ggagtacgtg acggagcccc cacgtgggtt cccgcacgtc cgcgacgtga 12180
caaacgaagc cgcacgtcag ggccggacgt ggggccccag agcgacgctg agtgcgtgcg 12240
ggactcggag tacgtgacgg agcccccacg tgggttcccg cacgtccgcg aagacctaga 12300
gggtatataa tgggtgcctt agctggtgtg tgagctcatc ttcctgtgca tgcggggggg 12360
ggggggggca attggccacc atgaaagccc tcaccgctag acaacaggaa gtgtttgacc 12420
tcatcaggga ccatatctcc cagacaggaa tgccccctac cagggccgaa atcgctcaga 12480
ggctgggatt caggagccct aacgctgccg aagaacatct gaaagccctc gccaggaagg 12540
gagtgattga gattgtgtcc ggcgcttcca ggggcattag actcctgcaa gaggaggaag 12600
aaggactccc cctcgtggga agggtcgccg ctggcgaacc cctcctggct caacaacaca 12660
ttgagggaca ctatcaggtc gatcctagcc tctttaaacc caatgccgat ttcctcctga 12720
gggtgtccgg catgagcatg aaggatattg gaatcatgga cggagacctc ctggctgtgc 12780
ataagacaca ggatgtgagg aacggacagg tcgtggtcgc caggatcgac gacgaagtga 12840
cagtgaaaag actcaagaaa cagggaaaca aagtggaact gctccccgaa aactccgagt 12900
ttaagcctat cgtcgtggat ctgaggcagc aatcctttac cattgaggga ctggctgtgg 12960
gagtgattag aaatggcgat tggctcgaat ttcccgggat tagacctgag tgtgtggtcc 13020
ccgaaaccca atgcgctatg aaaagaaaag agaaaaaggc tcagaaagag aaagacaaac 13080
tgcctgtgtc caccacaacc gtcgatgatc acatgccccc tatcatgcag tgtgagcctc 13140
cccctcccga agccgctaga atccacgaag tcgtccccag gttcctctcc gataagctcc 13200
tggaaaccaa tagacaaaag aatatccctc aactcaccgc taaccaacag tttctgattg 13260
ccaggctgat ttggtatcag gatggctatg agcaaccctc cgacgaagac ctcaagagga 13320
tcacacagac atggcaacag gctgacgatg agaatgagga aagcgatacc cctttcaggc 13380
agattaccga aatgacaatc ctcaccgtcc agctcatcgt cgagtttgcc aaaggactcc 13440
ccggattcgc taagattagc caacccgatc agattaccct cctgaaagcc tgtagctccg 13500
aggtcatgat gctgagagtg gctagaaggt acgatgccgc ttccgatagc gtcctgtttg 13560
ccaataacca agcctatacc agggacaatt acaggaaggc tggcatggcc tatgtgattg 13620
aggatgtgct ccacttttgc agatgtatgt actccatggc tctcgataac attcactatg 13680
ccctcctgac agccgtcgtg attttctccg acaggcccgg actggaacag cctcaactcg 13740
tggaagaaat tcagaggtac tatctgaata ccctcagaat ttacattctg aatcagctct 13800
ccggcagcgc tagatccagc gtcatctatg gcaaaatcct ctccattctg tccgagctga 13860
gaacactggg aatgcaaaac tccaatatgt gcattagcct caagctcaag aatagaaaac 13920
tgcctccctt tctggaagaa atttgggatg tggctgacat gagccatacc caaccccctc 13980
ccattctgga aagccctacc aatctgtaaa tcgatagccg cctggctgag atggggtggg 14040
cagggcagag ctgatcaggg ccgagcagaa ccgcactctt cccaaataaa gcttcctcct 14100
tgaaacacaa atgtttctta cttacacccc atcctgattt cttttcttga gaccagagag 14160
tgggaaagct ctctcttgac ctgaggatgg atctgaaaat tatgagcccc ttgaggacag 14220
ggaatgttat tcatctttga attccgcagc atctagcacc aggtcttgta cagagcaggt 14280
gcccaataaa tggttgaatg aatatatgaa aagtagaggc agagggctgg gcacagtggc 14340
tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggtggg tggatcactt gaggtcagga 14400
gttcgagacc agcttggcca acatggctaa acctcatctc tattaaaaat acaaaaatta 14460
gctgggctgg tgcctgtaat cccagctact caggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 14520
cccaggagga ggagtttgca gtgagccgag atcgcaccat tgcactccag cctgggcgat 14580
aggagcaaaa ctccatctca aaaacaaaaa acaaaacaaa acaaaaagaa aaaagaaaag 14640
taggggcaga gatgtggggc aggagaggtg actcgggctc agctgcatgg tcctgctctg 14700
cttctttttt cttggagttt gtccgttgga tgacaatgat agtggtgaac aggtatggag 14760
ggcttactaa gtaccaggtg tctagacgag gacgctcggg cttggaccca tggcacatcg 14820
tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctacgt ctctcccccg 14880
cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa ctccctttag tgagggttaa 14940
ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag cttaatcatg 15000
gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg gaaacgcttc cttcatgtga 15060
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 15120
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 15180
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 15240
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 15300
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 15360
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 15420
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 15480
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 15540
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 15600
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 15660
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 15720
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcct 15780
aggacgaaag gaggtcgtga aatggataaa aaaatacagc gtttttcatg tacaactata 15840
ctagttgtag tgcctaaata atgcttttaa aacttaaaaa tacgtttaaa ccctcagcga 15900
aatggcatac gagtaaactt ggtctgacac cgctgcatga gattatcaaa aaggatcttc 15960
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 16020
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 16080
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 16140
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 16200
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagc gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 16260
tccgcctcca tccagtctat taactgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 16320
aatagtttgc ggagcgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 16380
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 16440
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatgg ttgtcagaag taagttggcc 16500
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 16560
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtat tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 16620
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 16680
actttaaaag tgctcatcat tgggaagcgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 16740
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc acacgagcac ccaactgatc ttcagcatct 16800
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 16860
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatacgct tcctttttca atagtattga 16920
agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa 16979
<210> 14
<211> 13188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic cardiomycyte + hypoxia inducible + hPlexin DI inducible
gene switch constant encoding IGF-1
<400> 14
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160
atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220
tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340
tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccccag tatgatgcct tctctaaatt taccagaaag 3060
aaaggacctg ggatgcttgt cctttaagtg tctctaaaca tggtttgcat agctggatct 3120
cagcttatct gtgcctttcg gctttcgctt ccatacatgg atctgttccc aacagtaact 3180
ccaagctgtc gaaaagaagc tatctggcag ctctctgctt catccaacac atggatgata 3240
aaaatacaca tatagcgatt cttccctcga gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc 3300
tcttccaaaa atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg 3360
ctacaaacta cgaacgatca ttctagatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa 3420
aaacctccca catctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaaatg ttttattaac 3480
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 3540
taagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 3600
catgtctaat cgattcacag gttggtgggg ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg 3660
ctcatgtcgg ccacgtccca aatctcctcc aggaaggggg gcagcttcct gttcttcagc 3720
ttcaggctga tacacatatt gctgttctgc attcccaggg tcctcagctc gctcaggatg 3780
ctcaggatct tgccgtagat cacgctgctc ctggcgctgc cgctcagctg gttcaggatg 3840
tagatcctca gggtgttcag gtagtacctc tggatctcct ccaccagctg gggctgctcc 3900
aggccgggcc tgtcgctgaa gatcaccacg gcggtcagca gggcgtagtg gatgttgtcc 3960
agggccatgc tgtacataca tctgcagaag tgcaggaggt cctcgatcac ctcggccatg 4020
ccagccttcc tgtagttgtc cctggtgtaa gcctggttgt tggcgaacag gatgctgtcg 4080
ctggcggcgt cgtacctcct ggccaccctc agcatcatca cctcgctgct gcaagccttc 4140
agcagggtga tctggtcggg ctggctgatc ttggcgaatc cgggcaggcc cttggcgaac 4200
tccacgatca gctgcacggt caggatggtc atctcggtga tctgcctgaa gggggtgtcg 4260
ctctcctcgt tctcgtcgtc ggcctgctgc caggtctggg tgatcctttt caggtcctcg 4320
tcgctgggct gctcgtagcc gtcctgatac cagatcagcc tggcgatcag gaactgctgg 4380
ttggcggtca gctgggggat gttcttctgc ctgttggtca ccagcagctt gtcgctcagg 4440
aacctgggca cgacctcgtg aatcctggcg gcctcggggg gggggggctc gcactgcatg 4500
atggggggca tgtggtcatc gacggtggtg gtgctcacgg gcagcttgtc cttctccttc 4560
tgggccttct tctccttcct tttcatggcg cactgggtct cgggcaccac gcactcgggc 4620
ctgatcccgg gaaactcggg gctcacggtc agctgcctct ggcccttgtt gctgctctcc 4680
tcgctgctgc tggtggcgct gatcctgtgc tgcctcaggg tcaggggcat gtcggtctcc 4740
acgctggcca gcctgtcggt cacggcgtcc ttgttcacgt tgtcctgcac gaacaggccg 4800
gtcagcaggg ccttgatgtc ttgcaggctg tccatcttca ggatcatgtc caggtcctcc 4860
ctggggaaga tcagcaggaa cagctgctcc agcctctcca gcctgctctc cacctcggtc 4920
aggtgggccc tggtcagggg gctcctcttg gtcttggggc tgtatctgca ctcccagttg 4980
ttcttcaggc acttggcgca cttgggcttc tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg 5040
cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc 5100
ccccccccgc atgcacagga agatgagctc acacaccagc taaggcaccc attatatacc 5160
ctctaggtct tcgcggacgt gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc 5220
ccgcacgcac tcagcgtcgc tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt 5280
gtcacgtcgc ggacgtgcgg gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc 5340
acgcactcag cgtcgctctg gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca 5400
cgtcgcggac gtgcgggaac ccacgtgggg gctccgtcac gtactccgag tcccgcacgc 5460
actcagcgtc gctctggggc cccacgtccg gccctgacgt gcggcttcgt ttgtcacgtc 5520
gcggacgtgc gggaacccac gtgggggctc cgtcacgtac tccgagtccc gcacgcactc 5580
agcgtcgctc tggggcccca cgtccggccc tgacgtgcgg cttcgtttgt cacgtcgcgg 5640
acgtgcggga acccacgtgg gggctccgtc acgtactccg agtcccgcac gcactcagcg 5700
tcgctctggg gccccacgtc cggccctgac gtgcggcttc gtttgtcacg tcgcggacgt 5760
gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc ccgcacgcac tcagcgtcgc 5820
tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt gtcacgtcgc ggacgtgcgg 5880
gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc acgcactcag cgtcgctctg 5940
gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca cgtcctcgag tggtaataca 6000
atggccggtt cccatggacc tgcatcgtgg tgtaactata acggtcctaa ggtagcgacc 6060
gcggagacta ggtgtattta tctaagcgat cgcttaatta aggccggccg ccgcaataaa 6120
atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatccat agtactaaca 6180
tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 6240
gcaagtccag gtgccagaac atttctctat ccataatgca ggggtaccgg gtgatgacgg 6300
tgaaaacctc caattgcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt 6360
actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 6420
gtcctccgag cggagagtcc ccggggacct agagggtata taatgggtgc cttagctggt 6480
gtgtgacctc atcttcctgt acgcccctgc aggggcgcgc cacgcgtcga agaaggtgag 6540
taatcttaac atgctctttt tttttttttt tgctaatccc ttttgtgtgc tgatgttagg 6600
atgacattta caacaaatgt ttgttcctga caggaaaaac cttgctgggt accttcgttg 6660
ccggacactt cttgtcctct actttggaaa aaaggaattg agagccgcta gcgccaccat 6720
gggaaaaatc agcagcctgc ccacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa 6780
ggtgaagatg cacaccatgt cctcctcgca tctgttctac ctggcgctgt gcctgctgac 6840
cttcaccagc tctgccacgg ctggaccgga gaccctctgc ggggccgagc tggtggatgc 6900
cctgcaattc gtgtgtggag acaggggctt ctacttcaac aagcccacag ggtatggctc 6960
cagcagtcgg agagcccccc agacaggcat cgtggatgag tgctgcttca gaagctgtga 7020
tctaaggagg ctggagatgt attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt 7080
ccgtgcccag cgccacaccg acatgcccaa gacccagaag tatcagcccc catctaccaa 7140
caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagatcga 7200
ttgcgcaaag ctttcgcgat aggcgagacc aatgggtgtg tacgtagcgg ccgcgtcgac 7260
gatagcttga tgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 7320
ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 7380
actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag 7440
ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg 7500
cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc 7560
ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt 7620
ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga 7680
tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc 7740
ctgtccttct gattttaaaa taactatacc agcaggagga cgtccagaca cagcataggc 7800
tacctggcca tgcccaaccg gtgggacatt tgagttgctt gcttggcact gtcctctcat 7860
gcgttgggtc cactcagtag atgcctgttg aattctgatt taaatcggtc cgcgtacggc 7920
gtggtaggtc cgaacgaatc catggattac cctgttatcc ctactcaagg acatcatccc 7980
tttagtgagg gttaattcac gcagtgccgc ggcgtgtaga aaatacctat cagctcgagg 8040
agcgaaggcc tggacagtgc ctgagaaagg tggtggaggg aggctgagtg tggaggggag 8100
acacagggtt cgggaaggca gagggagaag gaaaggggag ctcagaggga ccgagagagg 8160
gacggagggt ccgaggggga ggcagaggga gccacggaga gagggagcga gcgtcaggga 8220
cggaaaaacg gagcaggaga gagaaggaga ctagaaaggg ccgggggcgg ggctgccagg 8280
gactggagag cgaagcggag tcggagggag aaggagaagc agaggcagaa cccggagaag 8340
cgccacacgc gcggagtttg gggtggggac agaggcggag aggcgcagag accgagagac 8400
acagagagag ggagaggcgg ggtgggggag agggcggaaa agagaaaaca ggcgcgagcg 8460
aggcaggcca agcggccaag tgggaggaaa gagcgaggag agcgagcgac ggcggcggcg 8520
gctacgggga gggaccctgg ggccgcgggc gggtcctgga gggcgcgggc ggcgggaccc 8580
gcggacggcg gggcgtggcc cagggcggcc aggggcaggc gggggttccg ggggcgggcg 8640
gggccggggc ggggagtgag ggcgtgtccg cagcggagcc gcccccgccc cgcccccgga 8700
ctgcgcggcg aggctgatcc gggcccggac gccggggtcg ggggcggctg gcgcgggcag 8760
gaagcgcatc gtggcccgga cccgcccccc gcctcccgcc gcctccgggg catgcggggg 8820
gggggggggg caattggcca ccatgaagct cctgtccagc attgagcaag cctgtgacat 8880
ttgcaggctg aaaaagctca agtgtagcaa agagaaaccc aaatgcgcta agtgtctgaa 8940
aaacaactgg gaatgcagat actcccccaa aaccaaaaga tcccccctca ccagggccca 9000
tctgacagag gtcgagtcca gactcgaaag gctggaacag ctctttctcc tgattttccc 9060
tagagaagac ctcgacatga tcctcaagat ggactccctg caagacatta aggctctgct 9120
caccggactg tttgtgcaag acaatgtgaa taaggatgcc gtcaccgata gactcgcctc 9180
cgtggaaacc gatatgcctc tgacactgag gcagcataga attagcgcta cctccagctc 9240
cgaggaaagc tccaacaaag gccaaagaca actgacagtg tcccccgagt tccccgggat 9300
tagacctgag tgtgtggtcc ccgaaaccca atgcgctatg aaaagaaaag agaaaaaggc 9360
tcagaaagag aaagacaaac tgcctgtgtc caccacaacc gtcgatgatc acatgccccc 9420
tatcatgcag tgtgagcctc cccctcccga agccgctaga atccacgaag tcgtccccag 9480
gttcctctcc gataagctcc tggaaaccaa tagacaaaag aatatccctc aactcaccgc 9540
taaccaacag tttctgattg ccaggctgat ttggtatcag gatggctatg agcaaccctc 9600
cgacgaagac ctcaagagga tcacacagac atggcaacag gctgacgatg agaatgagga 9660
aagcgatacc cctttcaggc agattaccga aatgacaatc ctcaccgtcc agctcatcgt 9720
cgagtttgcc aaaggactcc ccggattcgc taagattagc caacccgatc agattaccct 9780
cctgaaagcc tgtagctccg aggtcatgat gctgagagtg gctagaaggt acgatgccgc 9840
ttccgatagc gtcctgtttg ccaataacca agcctatacc agggacaatt acaggaaggc 9900
tggcatggcc tatgtgattg aggatgtgct ccacttttgc agatgtatgt actccatggc 9960
tctcgataac attcactatg ccctcctgac agccgtcgtg attttctccg acaggcccgg 10020
actggaacag cctcaactcg tggaagaaat tcagaggtac tatctgaata ccctcagaat 10080
ttacattctg aatcagctct ccggcagcgc tagatccagc gtcatctatg gcaaaatcct 10140
ctccattctg tccgagctga gaacactggg aatgcaaaac tccaatatgt gcattagcct 10200
caagctcaag aatagaaaac tgcctccctt tctggaagaa atttgggatg tggctgacat 10260
gagccatacc caaccccctc ccattctgga aagccctacc aatctgtaaa tcgatagccg 10320
cctggctgag atggggtggg cagggcagag ctgatcaggg ccgagcagaa ccgcactctt 10380
cccaaataaa gcttcctcct tgaaacacaa atgtttctta cttacacccc atcctgattt 10440
cttttcttga gaccagagag tgggaaagct ctctcttgac ctgaggatgg atctgaaaat 10500
tatgagcccc ttgaggacag ggaatgttat tcatctttga attccgcagc atctagcacc 10560
aggtcttgta cagagcaggt gcccaataaa tggttgaatg aatatatgaa aagtagaggc 10620
agagggctgg gcacagtggc tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggtggg 10680
tggatcactt gaggtcagga gttcgagacc agcttggcca acatggctaa acctcatctc 10740
tattaaaaat acaaaaatta gctgggctgg tgcctgtaat cccagctact caggaggctg 10800
aggcaggaga atcacttgaa cccaggagga ggagtttgca gtgagccgag atcgcaccat 10860
tgcactccag cctgggcgat aggagcaaaa ctccatctca aaaacaaaaa acaaaacaaa 10920
acaaaaagaa aaaagaaaag taggggcaga gatgtggggc aggagaggtg actcgggctc 10980
agctgcatgg tcctgctctg cttctttttt cttggagttt gtccgttgga tgacaatgat 11040
agtggtgaac aggtatggag ggcttactaa gtaccaggtg tctagacgag gacgctcggg 11100
cttggaccca tggcacatcg tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 11160
tccgctacgt ctctcccccg cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa 11220
ctccctttag tgagggttaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 11280
gtcgtgccag cttaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg 11340
gaaacgcttc cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 11400
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 11460
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 11520
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 11580
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 11640
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 11700
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 11760
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 11820
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 11880
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 11940
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 12000
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 12060
aagggatttt ggtcatgatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcatacg 12120
agtaaacttg gtctgacacc gctgcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 12180
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 12240
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 12300
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 12360
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 12420
aaaccagcca gccggaagcg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 12480
ccagtctatt aactgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 12540
gagcgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 12600
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 12660
agcggttagc tccttcggtc ctccgatggt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 12720
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 12780
ttctgtgact ggtgagtatt caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 12840
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 12900
gctcatcatt gggaagcgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 12960
atccagttcg atgtaaccca cacgagcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 13020
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 13080
gacacggaaa tgttgaatac tcatacgctt cctttttcaa tagtattgaa gcatttatca 13140
gggttattgt ctcgggagcg aatacatatt tgaatgtatt tagaaaaa 13188
<210> 15
<211> 13314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic constitutive + TNF + inducible promoter gene switch
encoding etanercept
<400> 15
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160
atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220
tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340
tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060
gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca 3120
aaaggtgcct aaaaaacttc acaaaacaca ctcgccaacc ccgagcgcac gtacccagcc 3180
cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc 3240
aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg 3300
gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc 3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa 3420
aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt 3480
cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc 3540
gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg 3600
agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg 3660
gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata 3720
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga 3780
aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260
ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa 4320
gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta 4380
agcctggttg ttggcgaaca ggatgctgtc gctggcggcg tcgtacctcc tggccaccct 4440
cagcatcatc acctcgctgc tgcaagcctt cagcagggtg atctggtcgg gctggctgat 4500
cttggcgaat ccgggcaggc ccttggcgaa ctccacgatc agctgcacgg tcaggatggt 4560
catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg 4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata 4680
ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg 4740
cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt 4860
ggtgctcacg ggcagcttgt ccttctcctt ctgggccttc ttctccttcc ttttcatggc 4920
gcactgggtc tcgggcacca cgcactcggg cctgatcccg ggaaactcgg ggctcacggt 4980
cagctgcctc tggcccttgt tgctgctctc ctcgctgctg ctggtggcgc tgatcctgtg 5040
ctgcctcagg gtcaggggca tgtcggtctc cacgctggcc agcctgtcgg tcacggcgtc 5100
cttgttcacg ttgtcctgca cgaacaggcc ggtcagcagg gccttgatgt cttgcaggct 5160
gtccatcttc aggatcatgt ccaggtcctc cctggggaag atcagcagga acagctgctc 5220
cagcctctcc agcctgctct ccacctcggt caggtgggcc ctggtcaggg ggctcctctt 5280
ggtcttgggg ctgtatctgc actcccagtt gttcttcagg cacttggcgc acttgggctt 5340
ctccttgctg cacttcagct tcttcagcct gcagatgtcg caagcctgct cgatgctgct 5400
cagcagcttc atggtggcca attgcccccc cccccccccg catgcctgtc tgacgggcaa 5460
tgctcctctg agagttgtta cagttcagac atggtaatga ctggttttat acagctttgc 5520
ccctcccaca tggcattttt ttttctccct ctgtcttttg atctgtgtcc tttgagtgat 5580
tcaacatttt actcaggaag acatcattag aatagaaata cttgtttgta aaggcatggt 5640
ttaagaaatt ttgggggagg atgaggtcac tctgaaactt aagaatttgt caatatcctc 5700
gagtggtaat acaatggccg gttcccatgg acctgcatcg tggtgtaact ataacggtcc 5760
taaggtagcg accgcggaga ctaggtgtat ttatctaagc gatcgcttaa ttaaggccgg 5820
ccgccgcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 5880
catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 5940
ggctgtcccc agtgcaagtc caggtgccag aacatttctc tatccataat gcaggggtac 6000
cgggtgatga cggtgaaaac ctccaattgc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc 6060
ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc 6120
cgagcggagt actgtcctcc gagcggagag tccccgggga cctagagggt atataatggg 6180
tgccttagct ggtgtgtgac ctcatcttcc tgtacgcccc tgcaggggcg cgccacgcgt 6240
cgaagaaggt gagtaatctt aacatgctct tttttttttt ttttgctaat cccttttgtg 6300
tgctgatgtt aggatgacat ttacaacaaa tgtttgttcc tgacaggaaa aaccttgctg 6360
ggtaccttcg ttgccggaca cttcttgtcc tctactttgg aaaaaaggaa ttgagagccg 6420
ctagcgccac catgctgccc gcccaggtcg ccttcacccc ctacgccccc gagcccggca 6480
gcacctgtag actgagagag tattacgacc agaccgccca gatgtgctgc tccaagtgca 6540
gccccggcca gcacgccaag gtgttctgca ccaagaccag cgacaccgtc tgcgacagct 6600
gcgaggacag cacctacacc cagctgtgga actgggtgcc cgagtgcctg agctgcggca 6660
gcagatgtag cagcgaccag gtggagaccc aggcttgcac cagagagcag aacagaatct 6720
gcacctgtag acccggctgg tactgcgccc tgagcaagca ggagggctgc cgcctgtgcg 6780
cccccctgag aaagtgcaga cccggcttcg gcgtggccag acccggcacc gagaccagcg 6840
acgttgtgtg caagccctgt gcccccggca ccttcagcaa caccaccagc agcaccgaca 6900
tctgccgccc ccaccagatt tgcaacgtgg tggccatccc cggcaacgcc agcatggacg 6960
ccgtgtgtac cagcaccagc cccacccgca gcatggcccc cggcgctgtc cacctccccc 7020
agcccgtgag caccagaagc cagcacaccc agcccacccc cgagcccagc accgccccca 7080
gcaccagctt cctgctgcct atgggaccca gcccccccgc cgagggcagc accggcgacg 7140
agcccaagag ctgcgacaag acccacacct gtcccccctg ccccgccccc gagctgctgg 7200
gcggccccag cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atctccagaa 7260
cccccgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga ggacccccag gtgaagttca 7320
actggtacgt ggacggcgtg caagtgcata acgccaagac caagcccaga gagcagcagt 7380
acaacagcac ctacagagtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccagaac tggctggacg 7440
gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca aggccctgcc cgcccccatc gagaaaacca 7500
tcagcaaggc caagggccag cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cccagcagag 7560
aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc taccccagcg 7620
acatcgccgt ggagtgggag agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc 7680
ccgtgctgga cagcgacggc agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca 7740
gatggcagca gggcaacgtg ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact 7800
acacccagaa gtccctgagc ctgagccccg gcaagtgaat cgattgcgca aagctttcgc 7860
gataggcgag accaatgggt gtgtacgtag cggccgcgtc gacgatagct tgatgggtgg 7920
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 7980
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 8040
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt 8100
agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact 8160
gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga 8220
ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc 8280
accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct 8340
cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tctgatttta 8400
aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgg ccatgcccaa 8460
ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg gtccactcag 8520
tagatgcctg ttgaattctg atttaaatcg gtccgcgtac ggcgtggtag gtccgaacga 8580
atccatggat taccctgtta tccctactca aggacatcat ccctttagtg agggttaatt 8640
cacgcagtgc cgcggcgtgt agaaaatacc tatcagctcg agcacggggc tcccactctc 8700
aactccgcag cctcagcccc ctcaatgctg aggagcagag ctggtctcct gccctgacag 8760
ctgccaggca catcttgttc cctcaggttg cacaactggg ataaatgacc cgggatgaag 8820
aaaccactgg catccaggaa cttgtcttag accgttttgt aggggaaatg acctgcaggg 8880
actttcccca gggaccacat ccagcttttc ttcgctccca agaaaccagc agggagcatg 8940
cggggggggg ggggggcaat tggccaccat gaagctcctg tccagcattg agcaagcctg 9000
tgacatttgc aggctgaaaa agctcaagtg tagcaaagag aaacccaaat gcgctaagtg 9060
tctgaaaaac aactgggaat gcagatactc ccccaaaacc aaaagatccc ccctcaccag 9120
ggcccatctg acagaggtcg agtccagact cgaaaggctg gaacagctct ttctcctgat 9180
tttccctaga gaagacctcg acatgatcct caagatggac tccctgcaag acattaaggc 9240
tctgctcacc ggactgtttg tgcaagacaa tgtgaataag gatgccgtca ccgatagact 9300
cgcctccgtg gaaaccgata tgcctctgac actgaggcag catagaatta gcgctacctc 9360
cagctccgag gaaagctcca acaaaggcca aagacaactg acagtgtccc ccgagttccc 9420
cgggattaga cctgagtgtg tggtccccga aacccaatgc gctatgaaaa gaaaagagaa 9480
aaaggctcag aaagagaaag acaaactgcc tgtgtccacc acaaccgtcg atgatcacat 9540
gccccctatc atgcagtgtg agcctccccc tcccgaagcc gctagaatcc acgaagtcgt 9600
ccccaggttc ctctccgata agctcctgga aaccaataga caaaagaata tccctcaact 9660
caccgctaac caacagtttc tgattgccag gctgatttgg tatcaggatg gctatgagca 9720
accctccgac gaagacctca agaggatcac acagacatgg caacaggctg acgatgagaa 9780
tgaggaaagc gatacccctt tcaggcagat taccgaaatg acaatcctca ccgtccagct 9840
catcgtcgag tttgccaaag gactccccgg attcgctaag attagccaac ccgatcagat 9900
taccctcctg aaagcctgta gctccgaggt catgatgctg agagtggcta gaaggtacga 9960
tgccgcttcc gatagcgtcc tgtttgccaa taaccaagcc tataccaggg acaattacag 10020
gaaggctggc atggcctatg tgattgagga tgtgctccac ttttgcagat gtatgtactc 10080
catggctctc gataacattc actatgccct cctgacagcc gtcgtgattt tctccgacag 10140
gcccggactg gaacagcctc aactcgtgga agaaattcag aggtactatc tgaataccct 10200
cagaatttac attctgaatc agctctccgg cagcgctaga tccagcgtca tctatggcaa 10260
aatcctctcc attctgtccg agctgagaac actgggaatg caaaactcca atatgtgcat 10320
tagcctcaag ctcaagaata gaaaactgcc tccctttctg gaagaaattt gggatgtggc 10380
tgacatgagc catacccaac cccctcccat tctggaaagc cctaccaatc tgtaaatcga 10440
tagccgcctg gctgagatgg ggtgggcagg gcagagctga tcagggccga gcagaaccgc 10500
actcttccca aataaagctt cctccttgaa acacaaatgt ttcttactta caccccatcc 10560
tgatttcttt tcttgagacc agagagtggg aaagctctct cttgacctga ggatggatct 10620
gaaaattatg agccccttga ggacagggaa tgttattcat ctttgaattc cgcagcatct 10680
agcaccaggt cttgtacaga gcaggtgccc aataaatggt tgaatgaata tatgaaaagt 10740
agaggcagag ggctgggcac agtggctcac gcctgtaatc ctagcacttt gggaggctga 10800
ggtgggtgga tcacttgagg tcaggagttc gagaccagct tggccaacat ggctaaacct 10860
catctctatt aaaaatacaa aaattagctg ggctggtgcc tgtaatccca gctactcagg 10920
aggctgaggc aggagaatca cttgaaccca ggaggaggag tttgcagtga gccgagatcg 10980
caccattgca ctccagcctg ggcgatagga gcaaaactcc atctcaaaaa caaaaaacaa 11040
aacaaaacaa aaagaaaaaa gaaaagtagg ggcagagatg tggggcagga gaggtgactc 11100
gggctcagct gcatggtcct gctctgcttc ttttttcttg gagtttgtcc gttggatgac 11160
aatgatagtg gtgaacaggt atggagggct tactaagtac caggtgtcta gacgaggacg 11220
ctcgggcttg gacccatggc acatcgtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 11280
ttgttatccg ctacgtctct cccccgcagt aagggctaga ttaactcgtc tcgtgaatat 11340
ccggaactcc ctttagtgag ggttaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 11400
aaacctgtcg tgccagctta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 11460
ctaccggaaa cgcttccttc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 11520
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 11580
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 11640
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 11700
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 11760
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 11820
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 11880
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 11940
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 12000
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 12060
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 12120
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 12180
cacgttaagg gattttggtc atgatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg 12240
catacgagta aacttggtct gacaccgctg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 12300
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 12360
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 12420
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 12480
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 12540
agcaataaac cagccagccg gaagcgccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 12600
ctccatccag tctattaact gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 12660
tttgcggagc gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 12720
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 12780
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatggttgtc agaagtaagt tggccgcagt 12840
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 12900
atgcttttct gtgactggtg agtattcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 12960
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 13020
aaaagtgctc atcattggga agcgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 13080
gttgagatcc agttcgatgt aacccacacg agcacccaac tgatcttcag catcttttac 13140
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 13200
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat acgcttcctt tttcaatagt attgaagcat 13260
ttatcagggt tattgtctcg ggagcgaata catatttgaa tgtatttaga aaaa 13314
<210> 16
<211> 11013
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic TNF inducible promoter gene switch construct expressing
etanercept
<400> 16
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180
cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360
tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420
gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc 480
agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag 540
cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc 600
tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt 660
tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct 720
ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg 780
tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg 840
tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata 900
gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg 960
cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca 1020
gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt 1080
tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac 1140
agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac 1200
agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg 1260
gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact 1320
gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag 1380
ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg 1440
tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1500
tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1560
taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1620
tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1680
acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1740
acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1800
gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1860
aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta 1920
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1980
attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 2040
atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt 2100
ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagcttc ctgttcttca 2160
gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga 2220
tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga 2280
tgtagatcct cagggtgttc aggtagtacc tctggatctc ctccaccagc tggggctgct 2340
ccaggccggg cctgtcgctg aagatcacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt 2400
ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca 2460
tgccagcctt cctgtagttg tccctggtgt aagcctggtt gttggcgaac aggatgctgt 2520
cgctggcggc gtcgtacctc ctggccaccc tcagcatcat cacctcgctg ctgcaagcct 2580
tcagcagggt gatctggtcg ggctggctga tcttggcgaa tccgggcagg cccttggcga 2640
actccacgat cagctgcacg gtcaggatgg tcatctcggt gatctgcctg aagggggtgt 2700
cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760
cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820
ggttggcggt cagctggggg atgttcttct gcctgttggt caccagcagc ttgtcgctca 2880
ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940
tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000
tctgggcctt cttctccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060
gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120
cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180
ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240
cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300
ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360
tcaggtgggc cctggtcagg gggctcctct tggtcttggg gctgtatctg cactcccagt 3420
tgttcttcag gcacttggcg cacttgggct tctccttgct gcacttcagc ttcttcagcc 3480
tgcagatgtc gcaagcctgc tcgatgctgc tcagcagctt catggtggca gatctggtcg 3540
cgggaggctg ctggttttcc actacccgaa aaaaatccag cgtctaagca gctgcaagga 3600
gagcctttca gagaagcggg tcctggcagc ggcggggaag tgtccccaaa tgggcagaat 3660
agcctccccg cgtcgggaga gtcgcgtcct tgctcgggtg ttgtaagttc cagtgcaaag 3720
tgcccgcccg ctgctatggg caaagtttcg tggatgcggc tagggttgcg caccgctggc 3780
tgggggatca gcgggagggc tgggccagag gcgaagcccc ctattcgctc cggatctccc 3840
ttcccaggac gcccgcagcg cagctctgct cgccgggctc ctccacccta gcccgccgcc 3900
cgctcgctcc ctctgcctct cgctggaatt actacagcga gttgccggct cagctgtcgc 3960
tggggctctc cagcatctcc atcaggaagg tgtcgatggg cacgtcgccg atcagcctga 4020
agaagaacag gtgctccagg cacttcaggc cgatgctcct caggctgggc agcctcagca 4080
gcagcttggc gaatctgccg ggctcgtcgg ggtgggtggt cctggtgtac tcctccaggg 4140
cggcgtacac cttctccctc agcagctcca cctcctgggc gcttttcagg cccctcacct 4200
cggggttgaa caggatgatg gccctcaggc agcccagctc ggtcttgtcc atcctcatgt 4260
ccctcatctt gctcaccagc tcggtcagca ccctgtcgaa gatggcgccc actccggcgc 4320
tgtgggcgct gttcctatgg acgtgcaggc cggtggccag caggatgccg tccctcacgt 4380
cgatgctcct gtggctgaag ctggcgatca gcagctcgtt ccatccggcc ctcagcagga 4440
tcacctggtc gtccaggggc aggctgctga agtggggaat cctcttggcc cactccacca 4500
gggtgaacag ctgcttgtcg gcggcctggc agatgttggt cacggggtcg ttggggctgc 4560
tgccgctgcc gccggttccg ccggggccct ccacgccctg gtcgcttttc tgctccacgg 4620
cgagttcggc ctccagaatc ctgtccacgg gcatctccat atggccgccg tactcgtcga 4680
tgcccagggc gtcggtgaac atctgctcga actcgaagtc ggccatgtcc agggcgccgt 4740
agggggcgct gtcgtggggg gtgaagccgg ggccggggct gtcgccgtcg cccagcatgt 4800
ccaggtcgaa gtcgtccagg gcgtcggcgt gggccatggc cacgtcctcg ccgtccaggt 4860
gcagctcgtc gcccaggctc acgtcggtgg ggggggccac cttccttttc ttcttggggc 4920
ccatggtggc caattgcccc cccccccccc cgcatgcagc tcctgaagcc agtgaggccc 4980
gatgcagata ccgcggagtg aaatagaaag tctgtgcttt ataaagggtc ttgttgcaga 5040
ggcggaggga aatcccttca aggggaaacc cagggcagag ccagggaaaa aagtttaaca 5100
gacacccagc caagttccac tattaacccc ttcagttgct ctcactgctg aagctcctct 5160
ctctgtcctg gcaaaagaag acacttccaa gactataaaa tacaggcttt tcctcatctt 5220
cgactccaaa aggctatctt tactggaaag ataaaggaca atgctgattg cagaatgaag 5280
ctttctgaat ccaatgtggg ttaagggggt ggggagagaa aaaatggaga cagagtagta 5340
aattctactc tggtttttga actggataaa taacgactat gccatgtgaa ttgattttct 5400
ccatcaagga aatatgtttg caattctaaa agagattaat ttttttctct tacaagagaa 5460
aggaaaaagt tatttctttt gatgagtcat tttttaaaaa agggacacca taacttctta 5520
gttttatatt tattcataaa aatagttctt ttagcaacaa acatcaactt tttgaaacta 5580
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gagtaggcga gaccaatggg tgcgccatgg gctcttccaa aaatttaggt gacactatag 5820
ggcaccgctc gcacctgcgc acaggcataa gccaaatgga actacgagac ctgcatcgtg 5880
gtgtaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga 5940
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 6000
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 6060
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta 6120
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc 6180
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 6240
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 6300
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 6360
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 6420
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg 6480
acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa 6540
aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tgctgcccgc ccaggtcgcc ttcaccccct 6600
acgcccccga gcccggcagc acctgtagac tgagagagta ttacgaccag accgcccaga 6660
tgtgctgctc caagtgcagc cccggccagc acgccaaggt gttctgcacc aagaccagcg 6720
acaccgtctg cgacagctgc gaggacagca cctacaccca gctgtggaac tgggtgcccg 6780
agtgcctgag ctgcggcagc agatgtagca gcgaccaggt ggagacccag gcttgcacca 6840
gagagcagaa cagaatctgc acctgtagac ccggctggta ctgcgccctg agcaagcagg 6900
agggctgccg cctgtgcgcc cccctgagaa agtgcagacc cggcttcggc gtggccagac 6960
ccggcaccga gaccagcgac gttgtgtgca agccctgtgc ccccggcacc ttcagcaaca 7020
ccaccagcag caccgacatc tgccgccccc accagatttg caacgtggtg gccatccccg 7080
gcaacgccag catggacgcc gtgtgtacca gcaccagccc cacccgcagc atggcccccg 7140
gcgctgtcca cctcccccag cccgtgagca ccagaagcca gcacacccag cccacccccg 7200
agcccagcac cgcccccagc accagcttcc tgctgcctat gggacccagc ccccccgccg 7260
agggcagcac cggcgacgag cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc 7320
ccgcccccga gctgctgggc ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca 7380
ccctgatgat ctccagaacc cccgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg 7440
acccccaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgca agtgcataac gccaagacca 7500
agcccagaga gcagcagtac aacagcacct acagagtggt gagcgtgctg accgtgctgc 7560
accagaactg gctggacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg 7620
cccccatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca 7680
ccctgccccc cagcagagag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga 7740
agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca 7800
actacaagac cacccccccc gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc 7860
tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg 7920
aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aagtgaatcg 7980
attgcgcaaa gctttcgcga taggcgagac caatgggtgt gtacgtagcg gccgcgtcga 8040
cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa 8100
gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct 8160
gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa 8220
gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg 8280
gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag 8340
cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt 8400
tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg 8460
atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc 8520
cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg acgtccagac acagcatagg 8580
ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct tgcttggcac tgtcctctca 8640
tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaattctgat ttaaatcggt ccgcgtacgg 8700
cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatc cctactcaag gacatcatcc 8760
ctttagtgag ggttaattca cgcagtgggt acggaactaa aggcagcaca catcgtgtaa 8820
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tacgtctctc ccccgcagta 8880
agggctagat taactcgtct cgtgaatatc cggaactccc tttagtgagg gttaattgcg 8940
ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagcttaa tcatggtcat 9000
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc taccggaaac gcttccttca tgtgagcaaa 9060
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 9120
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9180
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9240
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 9300
tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 9360
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 9420
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 9480
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 9540
cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 9600
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 9660
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 9720
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcctaggac 9780
gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt 9840
tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt aaaaataatc tatgtcgggt gcggagaaag 9900
aggtaatgaa atggcaaatc aatgtcctca gcgaaatggc atacgagtaa acttggtctg 9960
acaccgctgc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 10020
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 10080
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 10140
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 10200
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 10260
aagcgccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaactg 10320
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcggagcg ttgttgccat 10380
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 10440
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 10500
cggtcctccg atggttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 10560
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 10620
gtattcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 10680
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattgggaa 10740
gcgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 10800
acccacacga gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 10860
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 10920
aatactcata cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcgg 10980
gagcgaatac atatttgaat gtatttagaa aaa 11013
<210> 17
<211> 15706
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic dual promoter inflammation + hypoxia inducible gene
switch construct encoding etanercept and EPO
<400> 17
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180
cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360
tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420
gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga tttagaagaa ctcgtcaaga 480
aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggggcggcga taccgtaaag gacgaggaag 540
cggtcagccc attcgccgcc aagttcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 600
tgatagcggt cggccacacc cagccgtcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 660
tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccgtgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 720
ggcatcctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcctcg 780
tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 840
tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcatgta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 900
gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 960
cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcacg 1020
gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctggagt 1080
tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 1140
agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 1200
agcctctcca cccaagcggc cggagaacca gcgtgcaatc catcttgttc aatggccgat 1260
cccatggtgg ccaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat 1320
gcggctgact gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg 1380
catgcggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1440
tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1500
taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1560
tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1620
acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1680
acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1740
gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat tgttgttaaa tcacacaaaa aaccaacaca 1800
cagatgtaat gaaaataaag atattttatt atcgattcag ctgtcgctgg ggctctccag 1860
catctccatc aggaaggtgt cgatgggcac gtcgccgatc agcctgaaga agaacaggtg 1920
ctccaggcac ttcaggccga tgctcctcag gctgggcagc ctcagcagca gcttggcgaa 1980
tctgccgggc tcgtcggggt gggtggtcct ggtgtactcc tccagggcgg cgtacacctt 2040
ctccctcagc agctccacct cctgggcgct tttcaggccc ctcacctcgg ggttgaacag 2100
gatgatggcc ctcaggcagc ccagctcggt cttgtccatc ctcatgtccc tcatcttgct 2160
caccagctcg gtcagcaccc tgtcgaagat ggcgcccact ccggcgctgt gggcgctgtt 2220
cctatggacg tgcaggccgg tggccagcag gatgccgtcc ctcacgtcga tgctcctgtg 2280
gctgaagctg gcgatcagca gctcgttcca tccggccctc agcaggatca cctggtcgtc 2340
caggggcagg ctgctgaagt ggggaatcct cttggcccac tccaccaggg tgaacagctg 2400
cttgtcggcg gcctggcaga tgttggtcac ggggtcgttg gggctgctgc cgctgccgcc 2460
ggttccgccg gggccctcca cgccctggtc gcttttctgc tccacggcga gttcggcctc 2520
cagaatcctg tccacgggca tctccatatg gccgccgtac tcgtcgatgc ccagggcgtc 2580
ggtgaacatc tgctcgaact cgaagtcggc catgtccagg gcgccgtagg gggcgctgtc 2640
gtggggggtg aagccggggc cggggctgtc gccgtcgccc agcatgtcca ggtcgaagtc 2700
gtccagggcg tcggcgtggg ccatggccac gtcctcgccg tccaggtgca gctcgtcgcc 2760
caggctcacg tcggtggggg gggccacctt ccttttcttc ttggggccca tggtggccaa 2820
ttgccccccc ccccccccgc atgccgtcta acaaaaaagc caaaaacggc cagaatttag 2880
cggacaattt actagtctaa cactgaaaat tacatattga cccaaatgat tacatttcaa 2940
aaggtgccta aaaaacttca caaaacacac tcgccaaccc cgagcgcacg tacccagccc 3000
agcagcccgc tactcaccaa gtgacgatca cagcgatcca caaacaagaa ccgcgaccca 3060
aatcccggct gcgacggaac tagctgtgcc acacccggcg cgtccttata taatcatcgg 3120
cgttcaccgc cccacggaga tccctccgca gaatcgccga gaagggacta cttttcctcg 3180
cctgttccgc tctctggaaa gaaaaccagt gccctagagt cacccaagtc ccgtcctaaa 3240
atgtccttct gctgatactg gggttctaag gccgagtctt atgagcagcg ggccgctgtc 3300
ctgagcgtcc gggcggaagg atcaggacgc tcgctgcgcc cttcgtctga cgtggcagcg 3360
ctcgccgtga ggaggggggc gcccgcggga ggcgccaaaa cccggcgcgg aggccctcga 3420
gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc tcttccaaaa atttaggtga cactataggg 3480
caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg ctacaaacta cgaacgatca ttctagatac 3540
cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca catctccccc tgaacctgaa 3600
acataaaatg aatgcaaatg ttttattaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 3660
ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat taagcatttt tttcactgca ttctagttgt 3720
ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctaat cgattcacag gttggtgggg 3780
ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg ctcatgtcgg ccacgtccca aatctcctcc 3840
aggaaggggg gcagcttcct gttcttcagc ttcaggctga tacacatatt gctgttctgc 3900
attcccaggg tcctcagctc gctcaggatg ctcaggatct tgccgtagat cacgctgctc 3960
ctggcgctgc cgctcagctg gttcaggatg tagatcctca gggtgttcag gtagtacctc 4020
tggatctcct ccaccagctg gggctgctcc aggccgggcc tgtcgctgaa gatcaccacg 4080
gcggtcagca gggcgtagtg gatgttgtcc agggccatgc tgtacataca tctgcagaag 4140
tgcaggaggt cctcgatcac ctcggccatg ccagccttcc tgtagttgtc cctggtgtaa 4200
gcctggttgt tggcgaacag gatgctgtcg ctggcggcgt cgtacctcct ggccaccctc 4260
agcatcatca cctcgctgct gcaagccttc agcagggtga tctggtcggg ctggctgatc 4320
ttggcgaatc cgggcaggcc cttggcgaac tccacgatca gctgcacggt caggatggtc 4380
atctcggtga tctgcctgaa gggggtgtcg ctctcctcgt tctcgtcgtc ggcctgctgc 4440
caggtctggg tgatcctttt caggtcctcg tcgctgggct gctcgtagcc gtcctgatac 4500
cagatcagcc tggcgatcag gaactgctgg ttggcggtca gctgggggat gttcttctgc 4560
ctgttggtca ccagcagctt gtcgctcagg aacctgggca cgacctcgtg aatcctggcg 4620
gcctcggggg gggggggctc gcactgcatg atggggggca tgtggtcatc gacggtggtg 4680
gtgctcacgg gcagcttgtc cttctccttc tgggccttct tctccttcct tttcatggcg 4740
cactgggtct cgggcaccac gcactcgggc ctgatcccgg gaaactcggg gctcacggtc 4800
agctgcctct ggcccttgtt gctgctctcc tcgctgctgc tggtggcgct gatcctgtgc 4860
tgcctcaggg tcaggggcat gtcggtctcc acgctggcca gcctgtcggt cacggcgtcc 4920
ttgttcacgt tgtcctgcac gaacaggccg gtcagcaggg ccttgatgtc ttgcaggctg 4980
tccatcttca ggatcatgtc caggtcctcc ctggggaaga tcagcaggaa cagctgctcc 5040
agcctctcca gcctgctctc cacctcggtc aggtgggccc tggtcagggg gctcctcttg 5100
gtcttggggc tgtatctgca ctcccagttg ttcttcaggc acttggcgca cttgggcttc 5160
tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc 5220
agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc ccccccccgc atgctccctg ctggtttctt 5280
gggagcgaag aaaagctgga tgtggtccct ggggaaagtc cctgcaggtc atttccccta 5340
caaaacggtc taagacaagt tcctggatgc cagtggtttc ttcatcccgg gtcatttatc 5400
ccagttgtgc aacctgaggg aacaagatgt gcctggcagc tgtcagggca ggagaccagc 5460
tctgctcctc agcattgagg gggctgaggc tgcggagttg agagtgggag ccccgtgctc 5520
gagtggtaat acaatggccg gttcccatgg acctgcatcg tggtgatcta tgtcgggtgc 5580
ggagaaagag gtaatgaaat ggcagaaatg gcaccaccta aggtagcgac cgcggagact 5640
aggtgtattt atctaagcga tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta 5700
ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc 5760
catcaaaaca aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca 5820
ggtgccagaa catttctcta tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct 5880
ccaattgcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc 5940
cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga 6000
gcggagagtc cccggggacc tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct 6060
catcttcctg tacgcccctg caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa 6120
catgctcttt tttttttttt ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt 6180
acaacaaatg tttgttcctg acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact 6240
tcttgtcctc tactttggaa aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tgctgcccgc 6300
ccaggtcgcc ttcaccccct acgcccccga gcccggcagc acctgtagac tgagagagta 6360
ttacgaccag accgcccaga tgtgctgctc caagtgcagc cccggccagc acgccaaggt 6420
gttctgcacc aagaccagcg acaccgtctg cgacagctgc gaggacagca cctacaccca 6480
gctgtggaac tgggtgcccg agtgcctgag ctgcggcagc agatgtagca gcgaccaggt 6540
ggagacccag gcttgcacca gagagcagaa cagaatctgc acctgtagac ccggctggta 6600
ctgcgccctg agcaagcagg agggctgccg cctgtgcgcc cccctgagaa agtgcagacc 6660
cggcttcggc gtggccagac ccggcaccga gaccagcgac gttgtgtgca agccctgtgc 6720
ccccggcacc ttcagcaaca ccaccagcag caccgacatc tgccgccccc accagatttg 6780
caacgtggtg gccatccccg gcaacgccag catggacgcc gtgtgtacca gcaccagccc 6840
cacccgcagc atggcccccg gcgctgtcca cctcccccag cccgtgagca ccagaagcca 6900
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gggacccagc ccccccgccg agggcagcac cggcgacgag cccaagagct gcgacaagac 7020
ccacacctgt cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc ggccccagcg tgttcctgtt 7080
cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat ctccagaacc cccgaggtga catgcgtggt 7140
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gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 7500
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cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt 7620
cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgagcct 7680
gagccccggc aagtgaatcg attgcgcaaa gctttcgcga taggcgagac caatgggtgt 7740
gtacgtagcg gccgcgtcga cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag 7800
tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 7860
taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg 7920
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aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc 8100
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ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg 8220
cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg 8280
acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct 8340
tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaattctgat 8400
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tggtcctcca gggttgccgt tccttaacta taacggtcct aaggtagcga ccgcggagac 8520
taggtgtatt tatctaagcg atcgcttaat taaggccggc cgccgcaata aaatatcttt 8580
attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcc atagtactaa catacgctct 8640
ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtcc 8700
aggtgccaga acatttctct atccataatg caggggtacc gggtgatgac ggtgaaaacc 8760
tccaattgtg ctgtatataa aaccagtggt tatatgtaca gtactgctgt atataaaacc 8820
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acgcgtcgaa gaaggtgagt aatcttaaca tgctcttttt tttttttttt gctaatccct 9060
tttgtgtgct gatgttagga tgacatttac aacaaatgtt tgttcctgac aggaaaaacc 9120
ttgctgggta ccttcgttgc cggacacttc ttgtcctcta ctttggaaaa aaggaattga 9180
gagccgctag cgccaccatg ggcgtccacg aatgccctgc ctggctgtgg ctgctcctgt 9240
ccctgctgtc tctccccctc ggcctccccg tcctgggagc ccctcccagg ctgatttgcg 9300
atagcagggt gctggagaga tacctgttgg aagccaagga agccgagaat atcacaaccg 9360
gatgcgccga gcactgctcc ctgaatgaga atatcacagt gcctgacaca aaggtcaact 9420
tttacgcttg gaaaagaatg gaggtcggcc aacaggctgt ggaagtgtgg cagggactgg 9480
ctctgctgtc cgaagccgtc ctgaggggcc aagccctcct ggtcaactcc agccaaccct 9540
gggagcctct gcaactgcat gtggataagg ctgtgtccgg cctcagatcc ctgacaaccc 9600
tcctgagagc cctgggcgct cagaaagagg ctatctcccc ccctgacgct gcctccgccg 9660
ctcccctcag aacaatcaca gccgatacct ttagaaaact gtttagagtc tactccaact 9720
ttctgagggg caaactgaaa ctgtataccg gagaggcttg caggaccgga gacaggtaaa 9780
tcgattgcgc aaagctttcg cgataggcga gaccaatggg tgtgtacgta gcggccgctc 9840
gagaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 9900
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 9960
tcttatcatg tctcgtacgg cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatc 10020
cctactcatc ttcgtcggac gcgccgttaa tatttgatca gccattctct gtatgagtac 10080
taacgaacgt gacgcggtgt tactggtaac tatgactctc ttaaggtagc caaatacatc 10140
atccctttag tgagggttaa ttcacgcagt gccgcggcgt gtagaaaata cctatcagct 10200
cgaggacgtg acaaacgaag ccgcacgtca gggccggacg tggggcccca gagcgacgct 10260
gagtgcgtgc gggactcgga gtacgtgacg gagcccccac gtgggttccc gcacgtccgc 10320
gacgtgacaa acgaagccgc acgtcagggc cggacgtggg gccccagagc gacgctgagt 10380
gcgtgcggga ctcggagtac gtgacggagc ccccacgtgg gttcccgcac gtccgcgacg 10440
tgacaaacga agccgcacgt cagggccgga cgtggggccc cagagcgacg ctgagtgcgt 10500
gcgggactcg gagtacgtga cggagccccc acgtgggttc ccgcacgtcc gcgacgtgac 10560
aaacgaagcc gcacgtcagg gccggacgtg gggccccaga gcgacgctga gtgcgtgcgg 10620
gactcggagt acgtgacgga gcccccacgt gggttcccgc acgtccgcga cgtgacaaac 10680
gaagccgcac gtcagggccg gacgtggggc cccagagcga cgctgagtgc gtgcgggact 10740
cggagtacgt gacggagccc ccacgtgggt tcccgcacgt ccgcgacgtg acaaacgaag 10800
ccgcacgtca gggccggacg tggggcccca gagcgacgct gagtgcgtgc gggactcgga 10860
gtacgtgacg gagcccccac gtgggttccc gcacgtccgc gacgtgacaa acgaagccgc 10920
acgtcagggc cggacgtggg gccccagagc gacgctgagt gcgtgcggga ctcggagtac 10980
gtgacggagc ccccacgtgg gttcccgcac gtccgcgaag acctagaggg tatataatgg 11040
gtgccttagc tggtgtgtga gctcatcttc ctgtgcatgc gggggggggg gggggcaatt 11100
ggccaccatg aaagccctca ccgctagaca acaggaagtg tttgacctca tcagggacca 11160
tatctcccag acaggaatgc cccctaccag ggccgaaatc gctcagaggc tgggattcag 11220
gagccctaac gctgccgaag aacatctgaa agccctcgcc aggaagggag tgattgagat 11280
tgtgtccggc gcttccaggg gcattagact cctgcaagag gaggaagaag gactccccct 11340
cgtgggaagg gtcgccgctg gcgaacccct cctggctcaa caacacattg agggacacta 11400
tcaggtcgat cctagcctct ttaaacccaa tgccgatttc ctcctgaggg tgtccggcat 11460
gagcatgaag gatattggaa tcatggacgg agacctcctg gctgtgcata agacacagga 11520
tgtgaggaac ggacaggtcg tggtcgccag gatcgacgac gaagtgacag tgaaaagact 11580
caagaaacag ggaaacaaag tggaactgct ccccgaaaac tccgagttta agcctatcgt 11640
cgtggatctg aggcagcaat cctttaccat tgagggactg gctgtgggag tgattagaaa 11700
tggcgattgg ctcgaatttc ccgggattag acctgagtgt gtggtccccg aaacccaatg 11760
cgctatgaaa agaaaagaga aaaaggctca gaaagagaaa gacaaactgc ctgtgtccac 11820
cacaaccgtc gatgatcaca tgccccctat catgcagtgt gagcctcccc ctcccgaagc 11880
cgctagaatc cacgaagtcg tccccaggtt cctctccgat aagctcctgg aaaccaatag 11940
acaaaagaat atccctcaac tcaccgctaa ccaacagttt ctgattgcca ggctgatttg 12000
gtatcaggat ggctatgagc aaccctccga cgaagacctc aagaggatca cacagacatg 12060
gcaacaggct gacgatgaga atgaggaaag cgatacccct ttcaggcaga ttaccgaaat 12120
gacaatcctc accgtccagc tcatcgtcga gtttgccaaa ggactccccg gattcgctaa 12180
gattagccaa cccgatcaga ttaccctcct gaaagcctgt agctccgagg tcatgatgct 12240
gagagtggct agaaggtacg atgccgcttc cgatagcgtc ctgtttgcca ataaccaagc 12300
ctataccagg gacaattaca ggaaggctgg catggcctat gtgattgagg atgtgctcca 12360
cttttgcaga tgtatgtact ccatggctct cgataacatt cactatgccc tcctgacagc 12420
cgtcgtgatt ttctccgaca ggcccggact ggaacagcct caactcgtgg aagaaattca 12480
gaggtactat ctgaataccc tcagaattta cattctgaat cagctctccg gcagcgctag 12540
atccagcgtc atctatggca aaatcctctc cattctgtcc gagctgagaa cactgggaat 12600
gcaaaactcc aatatgtgca ttagcctcaa gctcaagaat agaaaactgc ctccctttct 12660
ggaagaaatt tgggatgtgg ctgacatgag ccatacccaa ccccctccca ttctggaaag 12720
ccctaccaat ctgtaaatcg atagccgcct ggctgagatg gggtgggcag ggcagagctg 12780
atcagggccg agcagaaccg cactcttccc aaataaagct tcctccttga aacacaaatg 12840
tttcttactt acaccccatc ctgatttctt ttcttgagac cagagagtgg gaaagctctc 12900
tcttgacctg aggatggatc tgaaaattat gagccccttg aggacaggga atgttattca 12960
tctttgaatt ccgcagcatc tagcaccagg tcttgtacag agcaggtgcc caataaatgg 13020
ttgaatgaat atatgaaaag tagaggcaga gggctgggca cagtggctca cgcctgtaat 13080
cctagcactt tgggaggctg aggtgggtgg atcacttgag gtcaggagtt cgagaccagc 13140
ttggccaaca tggctaaacc tcatctctat taaaaataca aaaattagct gggctggtgc 13200
ctgtaatccc agctactcag gaggctgagg caggagaatc acttgaaccc aggaggagga 13260
gtttgcagtg agccgagatc gcaccattgc actccagcct gggcgatagg agcaaaactc 13320
catctcaaaa acaaaaaaca aaacaaaaca aaaagaaaaa agaaaagtag gggcagagat 13380
gtggggcagg agaggtgact cgggctcagc tgcatggtcc tgctctgctt cttttttctt 13440
ggagtttgtc cgttggatga caatgatagt ggtgaacagg tatggagggc ttactaagta 13500
ccaggtgtct agacgaggac gctcgggctt ggacccatgg cacatcgtgt aatcatggtc 13560
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctacgtctc tcccccgcag taagggctag 13620
attaactcgt ctcgtgaata tccggaactc cctttagtga gggttaattg cgttgcgctc 13680
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctt aatcatggtc atagctgttt 13740
cctgtgtgaa attgttatcc gctaccggaa acgcttcctt catgtgagca aaaggccagc 13800
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 13860
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 13920
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 13980
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 14040
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 14100
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 14160
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 14220
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 14280
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 14340
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 14400
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 14460
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcctagg acgaaaggag 14520
gtcgtgaaat ggataaaaaa atacagcgtt tttcatgtac aactatacta gttgtagtgc 14580
ctaaataatg cttttaaaac ttaaaaatac gtttaaaccc tcagcgaaat ggcatacgag 14640
taaacttggt ctgacaccgc tgcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 14700
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 14760
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 14820
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 14880
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 14940
accagccagc cggaagcgcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 15000
agtctattaa ctgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgga 15060
gcgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 15120
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 15180
cggttagctc cttcggtcct ccgatggttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 15240
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 15300
ctgtgactgg tgagtattca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 15360
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 15420
tcatcattgg gaagcgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 15480
ccagttcgat gtaacccaca cgagcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 15540
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 15600
cacggaaatg ttgaatactc atacgcttcc tttttcaata gtattgaagc atttatcagg 15660
gttattgtct cgggagcgaa tacatatttg aatgtattta gaaaaa 15706
<210> 18
<211> 17505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic dual promoter gene switch construct encoding human
Factor VIII:C
<400> 18
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160
atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220
tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340
tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060
gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca 3120
aaaggtgcct aaaaaacttc acaaaacaca ctcgccaacc ccgagcgcac gtacccagcc 3180
cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc 3240
aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg 3300
gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc 3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa 3420
aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt 3480
cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc 3540
gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg 3600
agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg 3660
gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata 3720
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga 3780
aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260
ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa 4320
gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta 4380
agcctggttg ttggcgaaca ggatgctgtc gctggcggcg tcgtacctcc tggccaccct 4440
cagcatcatc acctcgctgc tgcaagcctt cagcagggtg atctggtcgg gctggctgat 4500
cttggcgaat ccgggcaggc ccttggcgaa ctccacgatc agctgcacgg tcaggatggt 4560
catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg 4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata 4680
ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg 4740
cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt 4860
ggtgctcacg ggcagcttgt ccttctcctt ctgggccttc ttctccttcc ttttcatggc 4920
gcactgggtc tcgggcacca cgcactcggg cctgatcccg ggaaactcgg ggctcacggt 4980
cagctgcctc tggcccttgt tgctgctctc ctcgctgctg ctggtggcgc tgatcctgtg 5040
ctgcctcagg gtcaggggca tgtcggtctc cacgctggcc agcctgtcgg tcacggcgtc 5100
cttgttcacg ttgtcctgca cgaacaggcc ggtcagcagg gccttgatgt cttgcaggct 5160
gtccatcttc aggatcatgt ccaggtcctc cctggggaag atcagcagga acagctgctc 5220
cagcctctcc agcctgctct ccacctcggt caggtgggcc ctggtcaggg ggctcctctt 5280
ggtcttgggg ctgtatctgc actcccagtt gttcttcagg cacttggcgc acttgggctt 5340
ctccttgctg cacttcagct tcttcagcct gcagatgtcg caagcctgct cgatgctgct 5400
cagcagcttc atggtggcca attgcccccc cccccccccg catgccacta agatctgcat 5460
tttgacctag tttaaaagta aaacataagc gtgtcacctc aggatcattg tatttcttgc 5520
ttttacacct aatattcttc aaaattagca actattcctt caaaatgcct taaatacgtt 5580
aatattccgc aagcctcccc tcaattttac aaggctaagt cacttaatac gaaattcgtc 5640
attcaaggtt tcaacgtcaa cagcggaaaa tccagagcgc tctcttacca agcgtccaca 5700
gctttcccca ctaactgttc cggatattca aactcccccg accgaactcc aatctgcctc 5760
aaacctaagc acggtgttag gcaaactgaa aacaaaacca aacccacaag actcgcgaaa 5820
taaaaatccc attgaaacac aagaaggggc acctttctca cactgggatt ccaaagtaaa 5880
ggcttccaga aaccacacaa actacctctt ttccgccttc cccgcgaagt aaactcgaca 5940
gaatcgccga tcggttaggc gtccgttagt ttccgtcaac ccgcgcgcgc caaccgccct 6000
cgcccccctc aggtcaacaa ggcccactgt cccggaaagg cccagcgccg cgtcacctcg 6060
ccctcccctc ccccacgccc tcccctcagc ggcccaccca accccaagaa gcctccacct 6120
tgacctcacc cattcccccc tctcacaccc ccccaaggtc gttacggctg cgggccagta 6180
cctgttagcg gataccagga tcctgccaat caccaaccac gtccacccac agggacacaa 6240
acaagctcac ccaacaaagc caaccgcccc taaatgctcc gggctggcgg aggcaaattt 6300
atgcaacgag tgttgcgtca cttatcaccc ctcacgtaga cgccgtctcc gtgcgccgct 6360
gaaagtagtt cgccgcgccc aacctcccga gaggcagttt aggcttttca actgagcccc 6420
aaattcctca tagccgtaag aaaggctcct aaaaaattat ttcccttctc ctctatgcgc 6480
ttctcttcct tctttaggaa aatataagaa aattatcagg cggatgaatt tgagttgaag 6540
aaaccttcct cgaaagctct ggaaacttcc ttgcagcgcc ggcactgatt ggttaggcct 6600
gcgaaggcga ggtcggcgct gattggtggg ggacgcggtg gctctgttgt tgctgggctc 6660
cacctggggt ggcttagcgc cgaggttgct aagtaactga gcgcgcgtcg ccgcacaggt 6720
ctttcctttt ttttcttgag acggatttcg ctcttgtttc ccaggctgga gtgcaatggc 6780
gcgatctcgg ctcatcgcaa cctccgcctc ccgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 6840
tcccaagtag ctgggattac agctcgagtg gtaatacaat ggccggttcc catggacctg 6900
catcgtggtg taactataac ggtcctaagg tagcgaccgc ggagactagg tgtatttatc 6960
taagcgatcg cttaattaag gccggccgcc gcaataaaat atctttattt tcattacatc 7020
tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatccatag tactaacata cgctctccat caaaacaaaa 7080
cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtccaggt gccagaacat 7140
ttctctatcc ataatgcagg ggtaccgggt gatgacggtg aaaacctcca attgcggagt 7200
actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 7260
gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagagtcccc 7320
ggggacctag agggtatata atgggtgcct tagctggtgt gtgacctcat cttcctgtac 7380
gcccctgcag gggcgcgcca cgcgtcgaag aaggtgagta atcttaacat gctctttttt 7440
tttttttttg ctaatccctt ttgtgtgctg atgttaggat gacatttaca acaaatgttt 7500
gttcctgaca ggaaaaacct tgctgggtac cttcgttgcc ggacacttct tgtcctctac 7560
tttggaaaaa aggaattgag agccgctagc gccaccatgg ctaccaggag atattacctc 7620
ggcgctgtgg aactgtcctg ggattacatg cagtccgacc tcggcgaact gcctgtggat 7680
gccaggttcc ctcccagggt gcctaagtcc ttccctttca atacctccgt ggtctacaaa 7740
aagacactgt ttgtggaatt tacagaccat ctgtttaaca ttgccaaacc caggccccct 7800
tggatgggcc tcctgggacc cacaatccaa gccgaagtgt atgacacagt ggtcatcaca 7860
ctgaaaaaca tggcctccca ccccgttagc ctgcacgctg tcggcgtcag ctattggaaa 7920
gcctccgagg gagccgaata cgatgaccaa acctcccaga gggagaaaga ggatgacaaa 7980
gtgtttcccg gaggctccca cacatacgtc tggcaagtgc tcaaggaaaa cggacctatg 8040
gcctccgacc ctctgtgtct gacatactcc tacctgagcc atgtggatct ggtcaaggat 8100
ctgaatagcg gactgattgg cgctctgctc gtgtgtagag aaggctccct ggctaaggaa 8160
aagacacaga cactgcataa gtttatcctc ctgtttgccg tttttgatga gggaaagtcc 8220
tggcatagcg aaaccaaaaa ctccctgatg caggatagag atgccgccag tgctagagct 8280
tggcctaaga tgcacaccgt caatggctat gtgaatagat ccctgcctgg cctcatcgga 8340
tgccatagaa aaagcgtcta ctggcacgtc atcggaatgg gaaccacacc cgaagtgcat 8400
agcattttcc ttgaaggaca cacattcctc gtgaggaacc atagacaagc ctccctggaa 8460
atctccccca ttacctttct gacagcccaa accctcctga tggacctcgg ccaattcctc 8520
ctgttttgcc atatctccag ccatcagcat gacggaatgg aagcctatgt gaaagtggat 8580
agctgtcccg aggagcccca gctcagaatg aagaataacg aagaagccga ggactacgat 8640
gacgatctga cagactccga gatggatgtc gtgaggttcg atgacgataa ctccccctcc 8700
ttcattcaga ttagatccgt ggctaagaaa caccctaaga catgggtcca ctatatcgct 8760
gccgaggaag aagattggga ctatgcccct ctggtcctgg ctcccgatga caggagctat 8820
aagtcccagt atctgaataa cggaccccag agaatcggca ggaagtataa gaaagtgagg 8880
ttcatggcct ataccgatga gacattcaaa accagggagg ctatccaaca cgaaagcgga 8940
atcctcggcc ctctgctcta cggagaggtc ggcgataccc tcctgattat ctttaagaat 9000
caggccagta ggccctataa catttaccct cacggaatca cagatgtgag acctctgtat 9060
agcaggagac tccccaaagg cgtcaagcat ctgaaagact ttcccattct gcctggcgaa 9120
atctttaagt ataagtggac cgtcaccgtc gaggatggcc ctaccaaaag cgatcccagg 9180
tgcctcacca ggtactatag ctccttcgtc aacatggaga gggacctcgc ctccggcctc 9240
atcggacccc tcctgatttg ctataaggaa agcgtcgatc aaagaggaaa ccaaatcatg 9300
agcgataaga ggaacgtcat cttgttctcc gtgtttgacg aaaacaggag ctggtacttg 9360
accgaaaaca ttcagaggtt cctccccaat cccgctggcg tccagcttga ggaccctgag 9420
tttcaagcct ccaacattat gcacagcatt aacggatacg ttttcgatag cctccagctg 9480
tccgtctgcc tccacgaggt cgcttactgg tacattctgt ccatcggagc ccaaaccgat 9540
ttcctgagcg tcttttttag cggatacaca ttcaaacaca aaatggtcta cgaggataca 9600
ctgacactgt ttccctttag cggagagaca gtgtttatga gcatggagaa ccctggcctc 9660
tggattctgg gatgccataa ctccgacttt agaaatagag gaatgacagc cctcctgaaa 9720
gtgtccagct gtgacaaaaa cacaggcgat tactatgagg atagctatga ggacatttcc 9780
gcctatctgc tgtcaaaaaa caatgccatt gagcctagat ccttctccca gaatagcagg 9840
caccctagca caagacaaaa gcaattcaat gccacaacca ttcccgaaaa cgacatcgaa 9900
aagacagacc cttggtttgc ccatagaaca cccatgccca aaatccaaaa cgtcagctcc 9960
agcgatctgc tcatgctcct gaggcagtcc cccacacccc acggcctgag cctgtccgat 10020
ctgcaagagg ctaagtatga gacattctcc gacgatccct cccccggagc cattgactcc 10080
aacaatagcc tgagcgaaat gacacacttt agaccccagc tgcaccatag cggagacatg 10140
gtgtttaccc ctgagtccgg cctccagctc agactcaacg aaaagctcgg cacaaccgct 10200
gccacagagc tgaagaaact ggatttcaaa gtgtccagca caagcaataa cctcatctcc 10260
accattccct ccgacaatct ggctgccgga accgataaca caagctccct gggaccccct 10320
tccatgcccg tccactatga ctcccagctc gacacaaccc tttttggaaa gaaaagctcc 10380
cccctcaccg aaagcggagg ccctctgtcc ctgtccgagg aaaacaatga cagcaagctg 10440
ctggagagcg gactgatgaa ctcccaggaa agctcctggg gaaagaatgt gtccagcaca 10500
gagtccggca ggctgtttaa gggaaagaga gcccacggcc ctgccctcct gacaaaggat 10560
aacgctctgt ttaaggtcag cattagcctc ctgaaaacca ataagacaag caataactcc 10620
gccacaaaca gaaagaccca cattgacgga ccctccctgc tcatcgaaaa ctccccctcc 10680
gtgtggcaga atatcctcga atccgacaca gagtttaaga aagtgacacc cctcatccat 10740
gacaggatgc tcatggataa gaatgccaca gccctcagac tcaaccacat gagcaacaaa 10800
accacaagca gcaagaacat ggagatggtc cagcaaaaga aagagggacc cattccccct 10860
gacgctcaga atcccgatat gtccttcttt aagatgctgt ttctgcctga gtccgccagg 10920
tggattcaga ggacccacgg caaaaactcc ctgaatagcg gacagggacc ctcccccaaa 10980
cagctcgtgt ccctgggacc cgaaaagtcc gtggaaggcc aaaactttct gtccgagaaa 11040
aacaaagtgg tcgtgggaaa gggagagttt accaaggacg ttggcctgaa ggaaatggtg 11100
tttcctagct ccagaaatct gtttctgaca aacctcgaca atctgcatga gaataacaca 11160
cacaatcagg aaaagaaaat ccaagaggaa atcgaaaaga aagagacact gattcaggaa 11220
aacgtcgtgc tcccccaaat ccataccgtc accggaacca aaaactttat gaaaaacctt 11280
ttcctcctgt ccaccaggca gaatgtggaa ggctcctacg atggcgctta cgctcccgtc 11340
ctgcaagact ttagatccct gaatgactcc accaatagaa caaagaaaca cacagcccat 11400
ttctccaaga aaggcgagga ggaaaacctg gaaggactgg gaaaccaaac caaacagatt 11460
gtggaaaagt atgcctgtac cacaagaatt agccctaaca caagccaaca gaatttcgtc 11520
acccaaagat ccaagagagc cctgaagcaa ttcaggctgc ctctggaaga aacagagctg 11580
gagaaaagaa ttatcgtgga tgatacctcc acccaatggt ccaagaatat gaaacacctc 11640
acccctagca cactgacaca gattgactat aacgaaaagg aaaagggagc cattacccaa 11700
agccctctgt ccgactgtct gacaagatcc cactccatcc ctcaggctaa caggagccct 11760
ctgcctatcg ctaaggtcag ctccttccct agcattagac ctatctatct gacaagagtc 11820
ctgtttcagg ataactccag ccatctgcct gccgcctctt atagaaaaaa ggatagcgga 11880
gtgcaagagt ccagccattt cctccaggga gccaaaaaga ataacctgag cctcgccatt 11940
ctgacactgg aaatgacagg cgatcagagg gaggtcggct ccctgggaac ctccgccaca 12000
aactccgtga catacaaaaa ggtcgagaat accgtcctgc ctaagcctga cctccccaaa 12060
acctccggca aagtggaact gctccccaaa gtgcatatct atcagaaaga cctctttcct 12120
accgaaacct ccaacggaag ccccggccac ctggatctgg tcgagggaag cctcctgcaa 12180
ggcacagagg gagccattaa gtggaacgaa gccaatagac ctggcaaagt gcctttcctc 12240
agagtcgcca cagagtccag cgctaagaca cccagcaagc tgctggaccc cctcgcctgg 12300
gacaatcact atggcacaca gattcccaaa gaggaatgga aaagccaaga gaaaagccct 12360
gagaaaaccg ctttcaaaaa gaaagacaca atcctgagcc tcaacgcttg cgaaagcaat 12420
cacgctatcg ctgccattaa cgaaggccaa aacaaacccg aaatcgaagt gacatgggcc 12480
aagcagggca ggaccgaaag actctgctcc cagaatcccc ctgtgctcaa gaggcaccaa 12540
agagaaatca caagaacaac cctccagtcc gaccaagagg aaatcgacta cgatgacaca 12600
atctccgtgg aaatgaaaaa ggaggacttt gacatttacg atgaggatga gaatcagtcc 12660
cccaggagct ttcagaaaaa gacaagacat tactttatcg ctgccgtcga gaggctgtgg 12720
gactatggca tgagcagcag ccctcacgtc ctgaggaaca gagcccagag cggaagcgtc 12780
ccccaattca aaaaggtcgt gtttcaggag ttcacagacg gcagcttcac ccaacccctc 12840
tacaggggcg aactgaatga gcatctggga ctgctcggcc cttacattag agccgaggtg 12900
gaggataaca ttatggtcac ctttagaaat caggccagca ggccctatag cttttactcc 12960
agcctcatct cctacgagga agatcagagg cagggagccg aacccaggaa gaatttcgtc 13020
aagcctaacg aaaccaaaac ctatttctgg aaggtccagc atcacatggc ccctaccaaa 13080
gacgaatttg attgcaaagc ctgggcctat ttctccgacg ttgacctgga gaaagacgtg 13140
cattccggcc tcatcggacc cctcctggtc tgccatacca ataccctcaa ccctgcccac 13200
ggcagacagg tgaccgtcca ggagtttgct ctgtttttca caatctttga cgaaaccaaa 13260
agctggtact ttaccgaaaa catggagagg aactgtagag ccccctgtaa cattcagatg 13320
gaggacccca cattcaaaga gaattacagg ttccatgcca ttaacggata cattatggat 13380
accctccccg gactggtcat ggctcaggat cagaggatca ggtggtatct gctgtctatg 13440
ggctccaacg aaaacattca ctccatccat ttctccggcc atgtgtttac cgtcagaaaa 13500
aaggaggagt ataagatggc cctctacaat ctgtatcccg gagtgtttga gacagtggaa 13560
atgctcccct ccaaggctgg catttggagg gtggaatgcc tcatcggaga gcatctgcac 13620
gccggaatgt ccaccctgtt tctcgtgtat agcaataagt gtcagacacc cctcggcatg 13680
gcctccggcc atatcaggga ctttcagatt accgccagcg gacagtatgg ccaatgggct 13740
cccaaactgg ctagactcca ctatagcgga agcattaacg cttggtccac caaagagcct 13800
ttctcctgga ttaaggtgga cctcctggct cccatgatta tccacggaat caaaacccaa 13860
ggcgctagac aaaagtttag ctccctgtat atctcccagt ttatcattat gtatagcctc 13920
gacggaaaga aatggcaaac ctatagagga aactccaccg gaaccctcat ggtgttcttt 13980
ggcaatgtgg atagctccgg cattaagcat aacattttca atccccctat cattgccagg 14040
tacattagac tccaccctac ccattactcc atcaggagca cactgaggat ggaactgatg 14100
ggctgtgacc tcaactcctg ctccatgccc ctcggcatgg aaagcaaagc cattagcgat 14160
gcccaaatca cagcctccag ctatttcaca aatatgttcg ctacctggag ccctagcaaa 14220
gccaggctgc atctgcaagg caggagcaat gcctggagac ctcaggtcaa caatcccaaa 14280
gagtggctgc aagtggattt ccaaaagaca atgaaagtga caggcgtcac cacacaggga 14340
gtgaaaagcc tcctgacaag catgtacgtc aaggagttcc tcatctccag ctcccaggat 14400
ggccatcagt ggaccctgtt ctttcagaat ggcaaagtga aagtgtttca gggaaaccaa 14460
gactccttca cacccgtcgt gaatagcctc gaccctcccc tcctgacaag atacctgaga 14520
atccaccccc aaagctgggt gcatcagatt gccctcagaa tggaggtcct gggatgcgaa 14580
gcccaagacc tctactaaat cgattgcgca aagctttcgc gataggcgag accaatgggt 14640
gtgtacgtag cggccgcgtc gacgatagct tgatgggtgg catccctgtg acccctcccc 14700
agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa 14760
attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg 14820
ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg 14880
ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt 14940
tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag 15000
gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt 15060
ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca 15120
ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tctgatttta aaataactat accagcagga 15180
ggacgtccag acacagcata ggctacctgg ccatgcccaa ccggtgggac atttgagttg 15240
cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg gtccactcag tagatgcctg ttgaattctg 15300
atttaaatcg gtccgcgtac ggcgtggtag gtccgaacga atccatggat taccctgtta 15360
tccctactca aggacatcat ccctttagtg agggttaatt cacgcagtgg gtacggaact 15420
aaaggcagca cacatcgtgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 15480
gctacgtctc tcccccgcag taagggctag attaactcgt ctcgtgaata tccggaactc 15540
cctttagtga gggttaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 15600
gtgccagctt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctaccggaa 15660
acgcttcctt catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 15720
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 15780
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 15840
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 15900
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 15960
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 16020
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 16080
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 16140
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agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 16260
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 16320
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 16380
ggattttggt catgatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcatacgagt 16440
aaacttggtc tgacaccgct gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 16500
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 16560
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 16620
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 16680
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 16740
ccagccagcc ggaagcgccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 16800
gtctattaac tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcggag 16860
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 16920
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 16980
ggttagctcc ttcggtcctc cgatggttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 17040
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 17100
tgtgactggt gagtattcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 17160
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 17220
catcattggg aagcgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 17280
cagttcgatg taacccacac gagcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 17340
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 17400
acggaaatgt tgaatactca tacgcttcct ttttcaatag tattgaagca tttatcaggg 17460
ttattgtctc gggagcgaat acatatttga atgtatttag aaaaa 17505
<210> 19
<211> 16379
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic single promoter gene switch construct encoding human
factor VIII:C
<400> 19
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180
cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360
tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420
gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc 480
agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag 540
cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc 600
tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt 660
tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct 720
ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg 780
tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg 840
tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata 900
gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg 960
cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca 1020
gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt 1080
tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac 1140
agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac 1200
agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg 1260
gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact 1320
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tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1500
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taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1620
tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1680
acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1740
acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1800
gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1860
aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta 1920
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1980
attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 2040
atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt 2100
ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagcttc ctgttcttca 2160
gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga 2220
tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga 2280
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ccaggccggg cctgtcgctg aagatcacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt 2400
ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca 2460
tgccagcctt cctgtagttg tccctggtgt aagcctggtt gttggcgaac aggatgctgt 2520
cgctggcggc gtcgtacctc ctggccaccc tcagcatcat cacctcgctg ctgcaagcct 2580
tcagcagggt gatctggtcg ggctggctga tcttggcgaa tccgggcagg cccttggcga 2640
actccacgat cagctgcacg gtcaggatgg tcatctcggt gatctgcctg aagggggtgt 2700
cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760
cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820
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ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940
tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000
tctgggcctt cttctccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060
gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120
cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180
ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240
cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300
ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360
tcaggtgggc cctggtcagg gggctcctct tggtcttggg gctgtatctg cactcccagt 3420
tgttcttcag gcacttggcg cacttgggct tctccttgct gcacttcagc ttcttcagcc 3480
tgcagatgtc gcaagcctgc tcgatgctgc tcagcagctt catggtggca gatctggtcg 3540
cgggaggctg ctggttttcc actacccgaa aaaaatccag cgtctaagca gctgcaagga 3600
gagcctttca gagaagcggg tcctggcagc ggcggggaag tgtccccaaa tgggcagaat 3660
agcctccccg cgtcgggaga gtcgcgtcct tgctcgggtg ttgtaagttc cagtgcaaag 3720
tgcccgcccg ctgctatggg caaagtttcg tggatgcggc tagggttgcg caccgctggc 3780
tgggggatca gcgggagggc tgggccagag gcgaagcccc ctattcgctc cggatctccc 3840
ttcccaggac gcccgcagcg cagctctgct cgccgggctc ctccacccta gcccgccgcc 3900
cgctcgctcc ctctgcctct cgctggaatt actacagcga gttgccggct cagctgtcgc 3960
tggggctctc cagcatctcc atcaggaagg tgtcgatggg cacgtcgccg atcagcctga 4020
agaagaacag gtgctccagg cacttcaggc cgatgctcct caggctgggc agcctcagca 4080
gcagcttggc gaatctgccg ggctcgtcgg ggtgggtggt cctggtgtac tcctccaggg 4140
cggcgtacac cttctccctc agcagctcca cctcctgggc gcttttcagg cccctcacct 4200
cggggttgaa caggatgatg gccctcaggc agcccagctc ggtcttgtcc atcctcatgt 4260
ccctcatctt gctcaccagc tcggtcagca ccctgtcgaa gatggcgccc actccggcgc 4320
tgtgggcgct gttcctatgg acgtgcaggc cggtggccag caggatgccg tccctcacgt 4380
cgatgctcct gtggctgaag ctggcgatca gcagctcgtt ccatccggcc ctcagcagga 4440
tcacctggtc gtccaggggc aggctgctga agtggggaat cctcttggcc cactccacca 4500
gggtgaacag ctgcttgtcg gcggcctggc agatgttggt cacggggtcg ttggggctgc 4560
tgccgctgcc gccggttccg ccggggccct ccacgccctg gtcgcttttc tgctccacgg 4620
cgagttcggc ctccagaatc ctgtccacgg gcatctccat atggccgccg tactcgtcga 4680
tgcccagggc gtcggtgaac atctgctcga actcgaagtc ggccatgtcc agggcgccgt 4740
agggggcgct gtcgtggggg gtgaagccgg ggccggggct gtcgccgtcg cccagcatgt 4800
ccaggtcgaa gtcgtccagg gcgtcggcgt gggccatggc cacgtcctcg ccgtccaggt 4860
gcagctcgtc gcccaggctc acgtcggtgg ggggggccac cttccttttc ttcttggggc 4920
ccatggtggc caattgcccc cccccccccc cgcatgccgt ctaacaaaaa agccaaaaac 4980
ggccagaatt tagcggacaa tttactagtc taacactgaa aattacatat tgacccaaat 5040
gattacattt caaaaggtgc ctaaaaaact tcacaaaaca cactcgccaa ccccgagcgc 5100
acgtacccag cccagcagcc cgctactcac caagtgacga tcacagcgat ccacaaacaa 5160
gaaccgcgac ccaaatcccg gctgcgacgg aactagctgt gccacacccg gcgcgtcctt 5220
atataatcat cggcgttcac cgccccacgg agatccctcc gcagaatcgc cgagaaggga 5280
ctacttttcc tcgcctgttc cgctctctgg aaagaaaacc agtgccctag agtcacccaa 5340
gtcccgtcct aaaatgtcct tctgctgata ctggggttct aaggccgagt cttatgagca 5400
gcgggccgct gtcctgagcg tccgggcgga aggatcagga cgctcgctgc gcccttcgtc 5460
tgacgtggca gcgctcgccg tgaggagggg ggcgcccgcg ggaggcgcca aaacccggcg 5520
cggaggccct cgagtaggcg agaccaatgg gtgcgccatg ggctcttcca aaaatttagg 5580
tgacactata gggcaccgct cgcacctgcg cacaggcata agccaaatgg aactacgaga 5640
cctgcatcgt ggtgtaacta taacggtcct aaggtagcga ccgcggagac taggtgtatt 5700
tatctaagcg atcgcttaat taaggccggc cgccgcaata aaatatcttt attttcatta 5760
catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcc atagtactaa catacgctct ccatcaaaac 5820
aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtcc aggtgccaga 5880
acatttctct atccataatg caggggtacc gggtgatgac ggtgaaaacc tccaattgcg 5940
gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag 6000
tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagagt 6060
ccccggggac ctagagggta tataatgggt gccttagctg gtgtgtgacc tcatcttcct 6120
gtacgcccct gcaggggcgc gccacgcgtc gaagaaggtg agtaatctta acatgctctt 6180
tttttttttt tttgctaatc ccttttgtgt gctgatgtta ggatgacatt tacaacaaat 6240
gtttgttcct gacaggaaaa accttgctgg gtaccttcgt tgccggacac ttcttgtcct 6300
ctactttgga aaaaaggaat tgagagccgc tagcgccacc atggctacca ggagatatta 6360
cctcggcgct gtggaactgt cctgggatta catgcagtcc gacctcggcg aactgcctgt 6420
ggatgccagg ttccctccca gggtgcctaa gtccttccct ttcaatacct ccgtggtcta 6480
caaaaagaca ctgtttgtgg aatttacaga ccatctgttt aacattgcca aacccaggcc 6540
cccttggatg ggcctcctgg gacccacaat ccaagccgaa gtgtatgaca cagtggtcat 6600
cacactgaaa aacatggcct cccaccccgt tagcctgcac gctgtcggcg tcagctattg 6660
gaaagcctcc gagggagccg aatacgatga ccaaacctcc cagagggaga aagaggatga 6720
caaagtgttt cccggaggct cccacacata cgtctggcaa gtgctcaagg aaaacggacc 6780
tatggcctcc gaccctctgt gtctgacata ctcctacctg agccatgtgg atctggtcaa 6840
ggatctgaat agcggactga ttggcgctct gctcgtgtgt agagaaggct ccctggctaa 6900
ggaaaagaca cagacactgc ataagtttat cctcctgttt gccgtttttg atgagggaaa 6960
gtcctggcat agcgaaacca aaaactccct gatgcaggat agagatgccg ccagtgctag 7020
agcttggcct aagatgcaca ccgtcaatgg ctatgtgaat agatccctgc ctggcctcat 7080
cggatgccat agaaaaagcg tctactggca cgtcatcgga atgggaacca cacccgaagt 7140
gcatagcatt ttccttgaag gacacacatt cctcgtgagg aaccatagac aagcctccct 7200
ggaaatctcc cccattacct ttctgacagc ccaaaccctc ctgatggacc tcggccaatt 7260
cctcctgttt tgccatatct ccagccatca gcatgacgga atggaagcct atgtgaaagt 7320
ggatagctgt cccgaggagc cccagctcag aatgaagaat aacgaagaag ccgaggacta 7380
cgatgacgat ctgacagact ccgagatgga tgtcgtgagg ttcgatgacg ataactcccc 7440
ctccttcatt cagattagat ccgtggctaa gaaacaccct aagacatggg tccactatat 7500
cgctgccgag gaagaagatt gggactatgc ccctctggtc ctggctcccg atgacaggag 7560
ctataagtcc cagtatctga ataacggacc ccagagaatc ggcaggaagt ataagaaagt 7620
gaggttcatg gcctataccg atgagacatt caaaaccagg gaggctatcc aacacgaaag 7680
cggaatcctc ggccctctgc tctacggaga ggtcggcgat accctcctga ttatctttaa 7740
gaatcaggcc agtaggccct ataacattta ccctcacgga atcacagatg tgagacctct 7800
gtatagcagg agactcccca aaggcgtcaa gcatctgaaa gactttccca ttctgcctgg 7860
cgaaatcttt aagtataagt ggaccgtcac cgtcgaggat ggccctacca aaagcgatcc 7920
caggtgcctc accaggtact atagctcctt cgtcaacatg gagagggacc tcgcctccgg 7980
cctcatcgga cccctcctga tttgctataa ggaaagcgtc gatcaaagag gaaaccaaat 8040
catgagcgat aagaggaacg tcatcttgtt ctccgtgttt gacgaaaaca ggagctggta 8100
cttgaccgaa aacattcaga ggttcctccc caatcccgct ggcgtccagc ttgaggaccc 8160
tgagtttcaa gcctccaaca ttatgcacag cattaacgga tacgttttcg atagcctcca 8220
gctgtccgtc tgcctccacg aggtcgctta ctggtacatt ctgtccatcg gagcccaaac 8280
cgatttcctg agcgtctttt ttagcggata cacattcaaa cacaaaatgg tctacgagga 8340
tacactgaca ctgtttccct ttagcggaga gacagtgttt atgagcatgg agaaccctgg 8400
cctctggatt ctgggatgcc ataactccga ctttagaaat agaggaatga cagccctcct 8460
gaaagtgtcc agctgtgaca aaaacacagg cgattactat gaggatagct atgaggacat 8520
ttccgcctat ctgctgtcaa aaaacaatgc cattgagcct agatccttct cccagaatag 8580
caggcaccct agcacaagac aaaagcaatt caatgccaca accattcccg aaaacgacat 8640
cgaaaagaca gacccttggt ttgcccatag aacacccatg cccaaaatcc aaaacgtcag 8700
ctccagcgat ctgctcatgc tcctgaggca gtcccccaca ccccacggcc tgagcctgtc 8760
cgatctgcaa gaggctaagt atgagacatt ctccgacgat ccctcccccg gagccattga 8820
ctccaacaat agcctgagcg aaatgacaca ctttagaccc cagctgcacc atagcggaga 8880
catggtgttt acccctgagt ccggcctcca gctcagactc aacgaaaagc tcggcacaac 8940
cgctgccaca gagctgaaga aactggattt caaagtgtcc agcacaagca ataacctcat 9000
ctccaccatt ccctccgaca atctggctgc cggaaccgat aacacaagct ccctgggacc 9060
cccttccatg cccgtccact atgactccca gctcgacaca accctttttg gaaagaaaag 9120
ctcccccctc accgaaagcg gaggccctct gtccctgtcc gaggaaaaca atgacagcaa 9180
gctgctggag agcggactga tgaactccca ggaaagctcc tggggaaaga atgtgtccag 9240
cacagagtcc ggcaggctgt ttaagggaaa gagagcccac ggccctgccc tcctgacaaa 9300
ggataacgct ctgtttaagg tcagcattag cctcctgaaa accaataaga caagcaataa 9360
ctccgccaca aacagaaaga cccacattga cggaccctcc ctgctcatcg aaaactcccc 9420
ctccgtgtgg cagaatatcc tcgaatccga cacagagttt aagaaagtga cacccctcat 9480
ccatgacagg atgctcatgg ataagaatgc cacagccctc agactcaacc acatgagcaa 9540
caaaaccaca agcagcaaga acatggagat ggtccagcaa aagaaagagg gacccattcc 9600
ccctgacgct cagaatcccg atatgtcctt ctttaagatg ctgtttctgc ctgagtccgc 9660
caggtggatt cagaggaccc acggcaaaaa ctccctgaat agcggacagg gaccctcccc 9720
caaacagctc gtgtccctgg gacccgaaaa gtccgtggaa ggccaaaact ttctgtccga 9780
gaaaaacaaa gtggtcgtgg gaaagggaga gtttaccaag gacgttggcc tgaaggaaat 9840
ggtgtttcct agctccagaa atctgtttct gacaaacctc gacaatctgc atgagaataa 9900
cacacacaat caggaaaaga aaatccaaga ggaaatcgaa aagaaagaga cactgattca 9960
ggaaaacgtc gtgctccccc aaatccatac cgtcaccgga accaaaaact ttatgaaaaa 10020
ccttttcctc ctgtccacca ggcagaatgt ggaaggctcc tacgatggcg cttacgctcc 10080
cgtcctgcaa gactttagat ccctgaatga ctccaccaat agaacaaaga aacacacagc 10140
ccatttctcc aagaaaggcg aggaggaaaa cctggaagga ctgggaaacc aaaccaaaca 10200
gattgtggaa aagtatgcct gtaccacaag aattagccct aacacaagcc aacagaattt 10260
cgtcacccaa agatccaaga gagccctgaa gcaattcagg ctgcctctgg aagaaacaga 10320
gctggagaaa agaattatcg tggatgatac ctccacccaa tggtccaaga atatgaaaca 10380
cctcacccct agcacactga cacagattga ctataacgaa aaggaaaagg gagccattac 10440
ccaaagccct ctgtccgact gtctgacaag atcccactcc atccctcagg ctaacaggag 10500
ccctctgcct atcgctaagg tcagctcctt ccctagcatt agacctatct atctgacaag 10560
agtcctgttt caggataact ccagccatct gcctgccgcc tcttatagaa aaaaggatag 10620
cggagtgcaa gagtccagcc atttcctcca gggagccaaa aagaataacc tgagcctcgc 10680
cattctgaca ctggaaatga caggcgatca gagggaggtc ggctccctgg gaacctccgc 10740
cacaaactcc gtgacataca aaaaggtcga gaataccgtc ctgcctaagc ctgacctccc 10800
caaaacctcc ggcaaagtgg aactgctccc caaagtgcat atctatcaga aagacctctt 10860
tcctaccgaa acctccaacg gaagccccgg ccacctggat ctggtcgagg gaagcctcct 10920
gcaaggcaca gagggagcca ttaagtggaa cgaagccaat agacctggca aagtgccttt 10980
cctcagagtc gccacagagt ccagcgctaa gacacccagc aagctgctgg accccctcgc 11040
ctgggacaat cactatggca cacagattcc caaagaggaa tggaaaagcc aagagaaaag 11100
ccctgagaaa accgctttca aaaagaaaga cacaatcctg agcctcaacg cttgcgaaag 11160
caatcacgct atcgctgcca ttaacgaagg ccaaaacaaa cccgaaatcg aagtgacatg 11220
ggccaagcag ggcaggaccg aaagactctg ctcccagaat ccccctgtgc tcaagaggca 11280
ccaaagagaa atcacaagaa caaccctcca gtccgaccaa gaggaaatcg actacgatga 11340
cacaatctcc gtggaaatga aaaaggagga ctttgacatt tacgatgagg atgagaatca 11400
gtcccccagg agctttcaga aaaagacaag acattacttt atcgctgccg tcgagaggct 11460
gtgggactat ggcatgagca gcagccctca cgtcctgagg aacagagccc agagcggaag 11520
cgtcccccaa ttcaaaaagg tcgtgtttca ggagttcaca gacggcagct tcacccaacc 11580
cctctacagg ggcgaactga atgagcatct gggactgctc ggcccttaca ttagagccga 11640
ggtggaggat aacattatgg tcacctttag aaatcaggcc agcaggccct atagctttta 11700
ctccagcctc atctcctacg aggaagatca gaggcaggga gccgaaccca ggaagaattt 11760
cgtcaagcct aacgaaacca aaacctattt ctggaaggtc cagcatcaca tggcccctac 11820
caaagacgaa tttgattgca aagcctgggc ctatttctcc gacgttgacc tggagaaaga 11880
cgtgcattcc ggcctcatcg gacccctcct ggtctgccat accaataccc tcaaccctgc 11940
ccacggcaga caggtgaccg tccaggagtt tgctctgttt ttcacaatct ttgacgaaac 12000
caaaagctgg tactttaccg aaaacatgga gaggaactgt agagccccct gtaacattca 12060
gatggaggac cccacattca aagagaatta caggttccat gccattaacg gatacattat 12120
ggataccctc cccggactgg tcatggctca ggatcagagg atcaggtggt atctgctgtc 12180
tatgggctcc aacgaaaaca ttcactccat ccatttctcc ggccatgtgt ttaccgtcag 12240
aaaaaaggag gagtataaga tggccctcta caatctgtat cccggagtgt ttgagacagt 12300
ggaaatgctc ccctccaagg ctggcatttg gagggtggaa tgcctcatcg gagagcatct 12360
gcacgccgga atgtccaccc tgtttctcgt gtatagcaat aagtgtcaga cacccctcgg 12420
catggcctcc ggccatatca gggactttca gattaccgcc agcggacagt atggccaatg 12480
ggctcccaaa ctggctagac tccactatag cggaagcatt aacgcttggt ccaccaaaga 12540
gcctttctcc tggattaagg tggacctcct ggctcccatg attatccacg gaatcaaaac 12600
ccaaggcgct agacaaaagt ttagctccct gtatatctcc cagtttatca ttatgtatag 12660
cctcgacgga aagaaatggc aaacctatag aggaaactcc accggaaccc tcatggtgtt 12720
ctttggcaat gtggatagct ccggcattaa gcataacatt ttcaatcccc ctatcattgc 12780
caggtacatt agactccacc ctacccatta ctccatcagg agcacactga ggatggaact 12840
gatgggctgt gacctcaact cctgctccat gcccctcggc atggaaagca aagccattag 12900
cgatgcccaa atcacagcct ccagctattt cacaaatatg ttcgctacct ggagccctag 12960
caaagccagg ctgcatctgc aaggcaggag caatgcctgg agacctcagg tcaacaatcc 13020
caaagagtgg ctgcaagtgg atttccaaaa gacaatgaaa gtgacaggcg tcaccacaca 13080
gggagtgaaa agcctcctga caagcatgta cgtcaaggag ttcctcatct ccagctccca 13140
ggatggccat cagtggaccc tgttctttca gaatggcaaa gtgaaagtgt ttcagggaaa 13200
ccaagactcc ttcacacccg tcgtgaatag cctcgaccct cccctcctga caagatacct 13260
gagaatccac ccccaaagct gggtgcatca gattgccctc agaatggagg tcctgggatg 13320
cgaagcccaa gacctctact aaatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat 13380
gggtgtgtac gtagcggccg cgtcgacgat agcttgatgg gtggcatccc tgtgacccct 13440
ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa 13500
taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga 13560
ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct 13620
attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct 13680
gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga 13740
ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc 13800
tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat 13860
tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttaaaataa ctataccagc 13920
aggaggacgt ccagacacag cataggctac ctggccatgc ccaaccggtg ggacatttga 13980
gttgcttgct tggcactgtc ctctcatgcg ttgggtccac tcagtagatg cctgttgaat 14040
tctgatttaa atcggtccgc gtacggcgtg gtaggtccga acgaatccat ggattaccct 14100
gttatcccta ctcaaggaca tcatcccttt agtgagggtt aattcacgca gtgggtacgg 14160
aactaaaggc agcacacatc gtgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 14220
atccgctacg tctctccccc gcagtaaggg ctagattaac tcgtctcgtg aatatccgga 14280
actcccttta gtgagggtta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 14340
tgtcgtgcca gcttaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctacc 14400
ggaaacgctt ccttcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 14460
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 14520
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 14580
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 14640
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 14700
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 14760
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 14820
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 14880
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 14940
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 15000
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 15060
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 15120
taagggattt tggtcatgcc taggacgaaa ggaggtcgtg aaatggataa aaaaatacag 15180
cgtttttcat gtacaactat actagttgta gtgcctaaat aatgctttta aaacttaaaa 15240
ataatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg caaatcaatg tcctcagcga 15300
aatggcatac gagtaaactt ggtctgacac cgctgcatga gattatcaaa aaggatcttc 15360
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 15420
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 15480
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 15540
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 15600
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagc gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 15660
tccgcctcca tccagtctat taactgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 15720
aatagtttgc ggagcgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 15780
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 15840
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatgg ttgtcagaag taagttggcc 15900
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 15960
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtat tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 16020
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 16080
actttaaaag tgctcatcat tgggaagcgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 16140
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc acacgagcac ccaactgatc ttcagcatct 16200
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 16260
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatacgct tcctttttca atagtattga 16320
agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa 16379
<210> 20
<211> 158
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(158)
<223> Human Insulin like growth factor (IGF-1)
<400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145 150 155
<210> 21
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(288)
<223> Human basic fibroblast growth factor (bFGF)
<400> 21
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile
20 25 30
Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg
35 40 45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg
50 55 60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala
130 135 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys
145 150 155 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile
165 170 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His
180 185 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
195 200 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu
210 215 220
Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu
225 230 235 240
Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp
245 250 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
275 280 285
<210> 22
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(193)
<223> Human erythropoietin
<400> 22
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 23
<211> 134
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(134)
<223> Human BNP
<400> 23
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn
35 40 45
His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu
50 55 60
Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg
65 70 75 80
Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr
85 90 95
Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys
100 105 110
Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys
115 120 125
Lys Val Leu Arg Arg His
130
<210> 24
<211> 562
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(562)
<223> Human tPA
<400> 24
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
20 25 30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
35 40 45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
50 55 60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65 70 75 80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
100 105 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
115 120 125
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser
130 135 140
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
165 170 175
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
180 185 190
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
195 200 205
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
210 215 220
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225 230 235 240
Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
245 250 255
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
260 265 270
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
275 280 285
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
290 295 300
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305 310 315 320
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro
325 330 335
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
340 345 350
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
355 360 365
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
370 375 380
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
405 410 415
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
435 440 445
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
450 455 460
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465 470 475 480
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
485 490 495
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
500 505 510
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
515 520 525
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
530 535 540
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545 550 555 560
Arg Pro
<210> 25
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(185)
<223> Human relaxin
<400> 25
Met Pro Arg Leu Phe Phe Phe His Leu Leu Gly Val Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln
50 55 60
Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp
65 70 75 80
Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln
85 90 95
Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu
100 105 110
Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu
115 120 125
Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser
130 135 140
Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Arg Lys Lys
145 150 155 160
Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys
165 170 175
Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
180 185
<210> 26
<211> 728
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(728)
<223> Human hepatocyte growth factor (HGF)
<400> 26
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
Claims (142)
- (a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자 복합체(LDTFC)를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와 작동가능하게 연결된 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 발현하도록 도입되는 것인 단계; 및
(b) 리간드를 상기 피검자에게 투여하여 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자의 질병, 장애 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방하는 방법.
- (a) 피검자에게 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 발현하도록 도입되는 것인 단계; 및
(b) 리간드를 피검자에게 투여하여 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 피검자에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 구성적인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에서 활성화되어 상기 질병, 장애, 또는 이상과 관련된 상태하에서 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 발현하도록 하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 이상이 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드에 반응성인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드는 상기 질병, 장애, 또는 이상을 치료, 완화, 또는 예방하기에 충분한 수준에서 발현되고 전파되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 엑디손 수용체(EcR)-기반의 유전자 스위치인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 리간드는 EcR 결합 도메인에 결합하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 리간드는 디아실하이드라진인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 리간드는 RG-115819, RG-115932, 및 RG-115830로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 리간드는 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 제1 치료학적 스위치 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 치료학적 스위치의 조절하의 제2 치료학적 스위치 프로모터를 포함하고, 여기서 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질이 상호 작용하여 리간드-의존성 전사 인자 복합체로 기능하는 단백질 복합체를 형성하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 상기 제2 치료학적 프로모터는 상이한 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 상기 제2 치료학적 스위치 프로모터는 동일한 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 서열은 이종이합체 파트너 및 전이활성 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제2 전사 인자 서열은 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 하나 또는 그 이상의 변형된 세포로 상기 피검자에게 도입하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 상기 피검자로부터 분리된 세포로 도입하여 변형된 동종 세포를 생산함으로써 제조되고, 이후 상기 피검자에게 재-도입되는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 삽입된 변형된 비-동종(MNA) 세포인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 MNA 세포는 상기 피검자에게 동종이계인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 MNA 세포는 상기 피검자에게 이종성인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 MNA 세포는 비사멸 세포 및 말단 분화를 할 수 있는 원시 세포(primary cell)로 이루어진 군에서 선택된 세포 타입인 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 MNA 세포는 C2C12 마우스 근아세포, HEK293 인간 태아 신장 세포, ARPE-19 세포, hMSC 세포, 췌장 섬 세포, MDCK 세포, CHO 세포, 성상세포 유래 세포, 올리고덴드로사이트 유래 세포, 및 근아세포 유래 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 췌장 섬 세포는 돼지 섬 세포인 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 췌장 섬 세포는 해부용 시체로부터 유래된 인간 섬 세포인 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 피검자에게 도입된 경우 피검자의 면역 시스템으로부터 보호되도록 처리된 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전파하지만, 상기 변형된 세포가 피검자의 면역 시스템의 세포와 직접 접촉하는 것을 방지하도록 배리어 시스템 내에 포함된 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 등각 피막된 변형된 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 등각 피막은 중합체를 포함하는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 및 하이드록시에틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(HEMA- MMA)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 캡슐화된 변형된 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 변형된 세포는 매크로캡슐화 장치 안에 포함된 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 하나 또는 그 이상의 합성 막을 포함하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 둘 또는 그 이상의 합성 막을 포함하며, 상기 합성 막은 상기 매크로캡슐화 장치를 통한 대량 수송을 조절하기 위한 상이한 기공 크기를 포함하고 있는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 반-투과성 중합체 외부 막 및 세포를 지지하는 내부 골격을 포함하는 것인 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 약 6 mm 길이 및 약 1 mm 직경인 것인 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 외부 막은 약 15 nm의 기공을 포함하는 것인 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 내부 골격은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 사(yarn)를 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치의 내부 공간은 적어도 1개 내지 약 105 개의 변형된 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 고분자성 막 이중층을 포함하고, 상기 이중층은 보다 내부 밀착성의 기공 0.45 μM PFTE 면역배리어 층 위에 적층된 5μm PTFE 막의 외부층을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 상기 고분자성 막 이중층의 외부에 부직포 폴리 메쉬층을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 PES 중공 섬유 장치를 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 봉합 클립을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 이식 및 회수될 수 있는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 변형된 세포는 마이크로캡슐화된 세포인 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 변형된 세포는 생물학적으로 적합한 캡슐화 물질에 현탁시킨 다음, 비드-유사 구조체를 형성하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 하이드로겔을 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 셀룰로오즈, 및 알기네이트로 이루어진 군에서 선택된 중합체인 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 중합체는 상호작용하여 물리적 선택투과성 막 배리어를 형성하기 위한 폴리음이온성 알기네이트 및 폴리-양이온성 중합체를 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 각각 적어도 하나 내지 약 103 개의 변형된 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 폴리(L-락티드) 산 (PLLA) 알기네이트 미소구체를 포함하는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 폴리-L-오르니틴(PLO) 알기네이트 피막을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 알기네이트 기반 초고점도(UHV)-생물 중합체를 포함하는 것인 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 알기네이트 기반 UHV-중합체는 생물분해성인 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 대략 구형이고 약 500μm 직경인 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 상기 변형된 세포를 보호할 수 있는 보호세포, 여기서 상기 보호세포는 세르톨리 세포 및 적혈구로 이루어진 군에서 선택된 세포인 보호세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 보호성의 마이크로-환경을 생성할 수 있는 외부 피막을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 보호성의 마이크로-환경은 소염인 것인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 보호성의 마이크로-환경은 전-혈관형성인 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 변형된 세포는 활성화시 상기 변형된 세포의 파괴를 유도할 수 있는 조절된 자살 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 자살 유전자는 배리어 시스템으로부터 벗어나거나 또는 종양원성 전환인 경우에 활성화되는 것인 방법.
- (a) 세포에 (1) 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 여기서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함함, 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 인자-조절된 프로모터와의 작동성 연결을 통해 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 도입하여 변형 세포를 생산하는 단계; 및
(b) 리간드를 상기 변형된 세포에 투여하여 상기 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 변형된 세포에서 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 구성적인 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에서 활성되어 상기 질병, 장애, 또는 이상과 관련된 상태하에서 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 발현하도록 하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 방법은 시험관내(in vitro)에서 수행되는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 방법은 피검자로부터 분리한 세포인 생체외(ex vivo)에서 수행되는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 방법은 생체내(in vivo)에서 수행되는 것인 방법.
- 유전자 스위치를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물로서, 상기 유전자 스위치는 치료학적 스위치 프로모터와의 작동성 연결을 통해 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열을 포함하는 것인 핵산 조성물.
- 제68항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 구성적인 것인 핵산 조성물.
- 제68항에 있어서, 상기 치료학적 스위치 프로모터는 질병, 장애, 또는 이상과 관련된 상태하에서 활성되어 상기 질병, 장애 또는 이상과 관련된 상태하에서 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 발현하도록 하는 핵산 조성물.
- 제68항에 있어서, 상기 리간드-의존성 전사 인자 복합체에 의해서 활성화된 프로모터와의 작동성 연결을 통해 질병, 장애, 또는 이상과 관련된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것인 핵산 조성물.
- 제71항에 있어서, 상기 질병, 장애, 또는 이상과 관련된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 질병, 장애, 또는 이상을 치료, 완화 또는 예방할 수 있는 치료학적 폴리펩티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 조성물.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치인 것인 핵산 조성물.
- 제73항에 있어서, 상기 리간드는 EcR 리간드 결합 도메인에 결합하는 것인 핵산 조성물.
- 제74항에 있어서, 상기 리간드는 디아실하이드라진인 것인 핵산 조성물.
- 제75항에 있어서, 상기 리간드는 RG-115819, RG-115932, 및 RG-115830로 이루어진 군에서 선택된 것인 핵산 조성물.
- 제74항에 있어서, 상기 리간드는 아미도케톤 또는 옥사디아졸린인 것인 핵산 조성물.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 스위치는 제1 치료학적 스위치 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 치료학적 스위치의 조절하의 제2 치료학적 스위치 프로모터를 포함하고, 여기서 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질이 상호 작용하여 리간드-의존성 전사 인자 복합체로 기능하는 단백질 복합체를 형성하는 것인 핵산 조성물.
- 제78항에 있어서, 상기 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 상기 제2 치료학적 프로모터는 상이한 것인 핵산 조성물.
- 제78항에 있어서, 상기 제1 치료학적 스위치 프로모터 및 상기 제2 치료학적 스위치 프로모터는 동일한 것인 핵산 조성물.
- 제78항에 있어서, 상기 제1 전사 인자 서열은 이종이합체 파트너 및 전이활성 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 핵산 조성물.
- 제78항에 있어서, 상기 제2 전사 인자 서열은 DNA 결합 도메인 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 핵산 조성물.
- 제71항에 있어서, 유도성 프로모터와 작동가능하게 연결된 치사 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것인 핵산 조성물.
- 제71항의 핵산 조성물을 포함하는 벡터.
- 제84항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인 벡터.
- 제84항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 벡터.
- 제71항의 어느 하나의 핵산 조성물을 포함하는 키트.
- 제84항의 벡터를 포함하는 키트.
- 제71항의 어느 하나의 핵산 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 변형된 세포를 생산하는 방법.
- 제84항의 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 변형된 세포를 생산하는 방법.
- 제71항의 어느 하나의 핵산 조성물을 포함하는 변형된 세포.
- 제84항의 벡터를 포함하는 변형된 세포.
- 제91항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 필요로 하는 피검자로부터 분리된 세포에서 유래된 변형된 동종 세포이며, 상기 피검자에게 재-도입되기에 적합한 것인 변형된 세포.
- 제91항에 있어서, 상기 변형된 세포는 비사멸 세포 및 말단 분화를 할 수 있는 원시 세포(primary cell)로 이루어진 군에서 선택된 세포 타입 유래인 변형된 세포.
- 제94항에 있어서, 상기 변형된 세포는 C2C12 마우스 근아세포, HEK293 인간 태아 신장 세포, ARPE-19 세포, hMSC 세포, 췌장 섬 세포, MDCK 세포, CHO 세포, 성상세포 유래 세포, 올리고덴드로사이트 유래 세포, 및 근아세포 유래 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포 타입 유래인 변형된 세포.
- 제95항에 있어서, 상기 췌장 섬 세포는 돼지 섬 세포인 것인 변형된 세포.
- 제95항에 있어서, 상기 췌장 섬 세포는 해부용 시체로부터 유래된 인간 섬 세포인 것인 변형된 세포.
- 제91항에 있어서, 활성화시 상기 변형된 세포의 파괴를 유도할 수 있는 조절된 자살 유전자를 추가로 포함하는 것인 변형된 세포.
- 제98항에 있어서, 상기 자살 유전자는 배리어 시스템으로부터 벗어나거나 또는 종양원성 전환인 경우에 활성화되는 것인 변형된 세포.
- 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에서 열거된 하나 또는 그 이상의 변형된 세포를 포함하는 생물반응기 장치.
- 제100항에 있어서, 상기 변형된 세포는 피검자에게 도입된 경우 상기 피검자의 면역 시스템으로부터 보호되도록 처리된 것인 생물반응기 장치.
- 제100항에 있어서, 상기 변형된 세포는 상기 치료학적 단백질 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전파하지만, 상기 변형된 세포가 피검자의 면역 시스템의 세포와 직접 접촉하는 것을 방지하도록 배리어 시스템 내에 포함된 것인 생물반응기 장치.
- 제102항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 등각 피막된 변형된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제103항에 있어서, 상기 등각 피막은 중합체를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제104항에 있어서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 및 하이드록시에틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(HEMA- MMA)로 이루어진 군에서 선택된 것인 생물반응기 장치.
- 제102항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 캡슐화된 변형된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제106항에 있어서, 상기 변형된 세포는 매크로캡슐화 장치 안에 포함된 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 하나 또는 그 이상의 합성 막을 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제108항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 둘 또는 그 이상의 합성 막을 포함하며, 상기 합성 막은 상기 매크로캡슐화 장치를 통한 대량 수송을 조절하기 위한 상이한 기공 크기를 포함하고 있는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 반-투과성 중합체 외부 막 및 세포를 지지하는 내부 골격을 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제110항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 약 6 mm 길이 및 약 1 mm 직경인 것인 생물반응기 장치.
- 제110항에 있어서, 상기 외부 막은 약 15 nm의 기공을 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제110항에 있어서, 상기 내부 골격은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 사(yarn)를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치의 내부 공간은 적어도 1개 내지 약 105 개의 변형된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 고분자성 막 이중층을 포함하고, 상기 이중층은 보다 내부 밀착성의 기공 0.45 μM PFTE 면역배리어 층 위에 적층된 5μm PTFE 막의 외부층을 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제115항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 상기 고분자성 막 이중층의 외부에 부직포 폴리 메쉬층을 추가로 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 PES 중공 섬유 장치를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 봉합 클립을 추가로 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제107항에 있어서, 상기 매크로캡슐화 장치는 이식 및 회수될 수 있는 것인 생물반응기 장치.
- 제106항에 있어서, 상기 변형된 세포는 마이크로캡슐화된 세포인 생물반응기 장치.
- 제120항에 있어서, 상기 변형된 세포는 생물학적으로 적합한 캡슐화 물질에 현탁시킨 다음, 비드-유사 구조체를 형성하는 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 하이드로겔을 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 셀룰로오즈, 및 알기네이트로 이루어진 군에서 선택된 중합체인 것인 생물반응기 장치.
- 제123항에 있어서, 상기 중합체는 상호작용하여 물리적 선택투과성 막 배리어를 형성하기 위한 폴리음이온성 알기네이트 및 폴리-양이온성 중합체를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 각각 적어도 하나 내지 약 103 개의 변형된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 폴리(L-락티드) 산 (PLLA) 알기네이트 미소구체를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 폴리-L-오르니틴(PLO) 알기네이트 피막을 추가로 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제123항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 알기네이트 기반 초고점도(UHV)-생물 중합체를 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제128항에 있어서, 상기 알기네이트 기반 UHV-중합체는 생물분해성인 것인 생물반응기 장치.
- 제121항에 있어서, 상기 비드-유사 구조체는 대략 구형이고 약 500μm 직경인 것인 생물반응기 장치.
- 제102항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 상기 변형된 세포를 보호할 수 있는 상기 캡슐안에 세르톨리 세포 및 적혈구로 이루어진 군에서 선택된 세포인 보호세포를 추가로 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제102항에 있어서, 상기 배리어 시스템은 보호성의 마이크로-환경을 생성할 수 있는 외부 피막을 추가로 포함하는 것인 생물반응기 장치.
- 제132항에 있어서, 상기 보호성의 마이크로-환경은 소염인 것인 생물반응기 장치.
- 제132항에 있어서, 상기 보호성의 마이크로-환경은 전-혈관형성인 것인 생물반응기 장치.
- 질병, 장애, 또는 이상을 치료하기 위한 제68항 내지 제83항 중 어느 한 항의 핵산 조성물의 용도.
- 질병, 장애, 또는 이상을 치료하기 위한 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
- 질병, 장애, 또는 이상을 치료하기 위한 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항의 변형된 세포의 용도.
- 질병, 장애, 또는 이상을 치료하기 위한 제100항 내지 제134항 중 어느 한 항의 생물반응기 장치의 용도.
- 과증식성 질병, 질환 또는 이상, 심혈관 질병, 장애 또는 이상, 신경 질병, 장애 또는 이상, 자가면역 질병, 장애 또는 이상, 골 질병, 장애 또는 이상, 위장 질병, 장애 또는 이상, 혈액 질병, 장애 또는 이상, 대사 질병, 장애 또는 이상, 염증 질병, 장애 또는 이상 및 감염 질병, 장애 또는 이상으로 이루어진 군에서 선택된 질병, 장애, 또는 이상의 치료용 의약의 제조에 있어서, 제68항 내지 제83항 중 어느 한 항의 핵산의 용도.
- 과증식성 질병, 질환 또는 이상, 심혈관 질병, 장애 또는 이상, 신경 질병, 장애 또는 이상, 자가면역 질병, 장애 또는 이상, 골 질병, 장애 또는 이상, 위장 질병, 장애 또는 이상, 혈액 질병, 장애 또는 이상, 대사 질병, 장애 또는 이상, 염증 질병, 장애 또는 이상 및 감염 질병, 장애 또는 이상으로 이루어진 군에서 선택된 질병, 장애, 또는 이상의 치료용 의약의 제조에 있어서, 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
- 과증식성 질병, 질환 또는 이상, 심혈관 질병, 장애 또는 이상, 신경 질병, 장애 또는 이상, 자가면역 질병, 장애 또는 이상, 골 질병, 장애 또는 이상, 위장 질병, 장애 또는 이상, 혈액 질병, 장애 또는 이상, 대사 질병, 장애 또는 이상, 염증 질병, 장애 또는 이상 및 감염 질병, 장애 또는 이상으로 이루어진 군에서 선택된 질병, 장애, 또는 이상의 치료용 의약의 제조에 있어서, 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항의 변형된 세포의 용도.
- 과증식성 질병, 질환 또는 이상, 심혈관 질병, 장애 또는 이상, 신경 질병, 장애 또는 이상, 자가면역 질병, 장애 또는 이상, 골 질병, 장애 또는 이상, 위장 질병, 장애 또는 이상, 혈액 질병, 장애 또는 이상, 대사 질병, 장애 또는 이상, 염증 질병, 장애 또는 이상 및 감염 질병, 장애 또는 이상으로 이루어진 군에서 선택된 질병, 장애, 또는 이상의 치료용 의약의 제조에 있어서, 제100항 내지 제134항 중 어느 한 항의 생물반응기 장치의 용도.
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HUE024479T2 (en) * | 2007-10-08 | 2016-01-28 | Intrexon Corp | Genetically altered dendritic cells and uses for cancer treatment |
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AU2010226313B2 (en) | 2009-03-20 | 2014-10-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins |
WO2010138180A2 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-02 | The University Of Vermont And State Agriculture College | Compositions and methods for cardiac tissue repair |
EP2461819A4 (en) | 2009-07-28 | 2013-07-31 | Sangamo Biosciences Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING TRI-NUCLEOTIDE REPEAT DISORDERS |
US8586526B2 (en) | 2010-05-17 | 2013-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | DNA-binding proteins and uses thereof |
MX362513B (es) * | 2010-03-23 | 2019-01-22 | Intrexon Corp | Vectores que expresan de manera condicional proteinas terapeuticas, celulas hospedadoras que comprenden vectores, y usos de los mismos. |
EP2596011B1 (en) | 2010-07-21 | 2018-10-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of a hla locus |
US9149427B2 (en) * | 2010-12-02 | 2015-10-06 | Neurotech Usa, Inc. | Cell lines that secrete anti-angiogenic antibody-scaffolds and soluble receptors and uses thereof |
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TWI586640B (zh) * | 2011-09-08 | 2017-06-11 | 英翠克頌公司 | 結晶狀二醯基肼及其用途 |
AU2013225950B2 (en) | 2012-02-29 | 2018-02-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating huntington's disease |
JP2015527889A (ja) * | 2012-07-25 | 2015-09-24 | ザ ブロード インスティテュート, インコーポレイテッド | 誘導可能なdna結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用 |
EP3763810A3 (en) | 2012-10-10 | 2021-07-14 | Sangamo Therapeutics, Inc. | T cell modifying compounds and uses thereof |
US9265458B2 (en) | 2012-12-04 | 2016-02-23 | Sync-Think, Inc. | Application of smooth pursuit cognitive testing paradigms to clinical drug development |
US9380976B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-07-05 | Sync-Think, Inc. | Optical neuroinformatics |
KR102431079B1 (ko) | 2013-11-11 | 2022-08-11 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
FR3014316B1 (fr) * | 2013-12-10 | 2017-01-20 | Defymed | Organe bioartificiel |
CN106459894B (zh) | 2014-03-18 | 2020-02-18 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物 |
EP3209306B1 (en) | 2014-10-20 | 2024-04-24 | Neuralstem, Inc. | Stable neural stem cells comprising an exogenous polynucleotide coding for a growth factor and methods of use thereof |
US11897921B2 (en) * | 2014-12-09 | 2024-02-13 | New York University | Propeptide fusion comprising a mutated clostridium botulinum neurotoxin and a VHH domain |
AU2016334401A1 (en) | 2015-10-10 | 2018-04-26 | Intrexon Corporation | Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12 |
CA3004742A1 (en) * | 2015-11-11 | 2017-05-18 | Intrexon Corporation | Compositions and methods for expression of multiple biologically active polypeptides from a single vector for treatment of cardiac conditions and other pathologies |
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EP3390437A4 (en) | 2015-12-18 | 2019-10-16 | Sangamo Therapeutics, Inc. | TARGETED DISORDER OF MHC CELL RECEPTOR |
EP3235516B1 (en) | 2016-04-22 | 2019-06-26 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin | Regulatable adeno-associated virus (aav) vector |
CA3025667A1 (en) | 2016-06-08 | 2017-12-14 | Intrexon Corporation | Cd33 specific chimeric antigen receptors |
UY37343A (es) | 2016-07-25 | 2018-02-28 | Intrexon Corp | Control del fenotipo en plantas |
KR20220145913A (ko) | 2016-08-24 | 2022-10-31 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 가공된 표적 특이적 뉴클레아제 |
WO2018132494A1 (en) | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Intrexon Corporation | Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems |
US11820728B2 (en) | 2017-04-28 | 2023-11-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
EP3619322A4 (en) | 2017-05-03 | 2021-06-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFICATION OF A TRANSMEMBRANARY CONDUCTANCE REGULATORY GENE IN MUCOVISCIDOSIS (CFTR) |
CN110997920A (zh) | 2017-06-07 | 2020-04-10 | 英特拉克森公司 | 新型细胞标签的表达 |
US11512287B2 (en) | 2017-06-16 | 2022-11-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors |
EP3762010A4 (en) | 2018-03-06 | 2022-04-06 | Precigen, Inc. | HEPATITIS B VACCINES AND USES THEREOF |
CN112313246A (zh) | 2018-04-18 | 2021-02-02 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于调节亨廷顿蛋白(htt)的锌指蛋白组合物 |
US11690921B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-07-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery of target specific nucleases |
JP7413629B2 (ja) * | 2018-07-17 | 2024-01-16 | ヘリックスミス カンパニー, リミテッド | Igf-1異型体を発現させるdnaコンストラクトを用いた神経病症の治療 |
JP2022500052A (ja) | 2018-09-18 | 2022-01-04 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | プログラム細胞死1(pd1)特異的ヌクレアーゼ |
CN110946988B (zh) * | 2018-09-26 | 2022-11-29 | 臻崴生物科技有限公司 | 短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途 |
UY38389A (es) | 2018-09-27 | 2020-04-30 | Sigilon Therapeutics Inc | Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados |
AU2020205717A1 (en) | 2019-01-11 | 2021-08-12 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
WO2020206056A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Greenvenus Llc | Peptides and methods of plant protection |
MX2019015589A (es) * | 2019-12-19 | 2021-06-21 | Centro De Investig Y Asistencia En Tecnologia Y Diseno Del Estado De Jalisco A C | Molécula sintética de adn con potenciador autorregulado por hipoxia y/o inflamación para uso como agente terapéutico de enfermedades inflamatorias y degeneración tisular. |
AU2021219707A1 (en) * | 2020-02-11 | 2022-08-25 | William Marsh Rice University | Methods for improved delivery of therapeutic agents |
CN111704705B (zh) * | 2020-06-24 | 2021-06-08 | 河南大学 | 一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡 |
CN116096702A (zh) | 2020-07-16 | 2023-05-09 | 爱康泰生治疗公司 | 用于脂质纳米颗粒的阳离子脂质 |
WO2022046760A2 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
WO2024081309A1 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | Sigilon Therapeutics, Inc. | Engineered cells and implantable elements for treatment of disease |
WO2024081310A1 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | Sigilon Therapeutics, Inc. | Engineered cells and implantable elements for treatment of disease |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050191659A1 (en) * | 1998-05-05 | 2005-09-01 | Richard Voellmy | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
US20060020146A1 (en) * | 2003-02-28 | 2006-01-26 | Hormann Robert E | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US20070087346A1 (en) * | 2003-10-24 | 2007-04-19 | Gennaro Ciliberto | Orthogonal gene switches |
Family Cites Families (448)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3989816A (en) | 1975-06-19 | 1976-11-02 | Nelson Research & Development Company | Vehicle composition containing 1-substituted azacycloheptan-2-ones |
US4409331A (en) | 1979-03-28 | 1983-10-11 | Damon Corporation | Preparation of substances with encapsulated cells |
US4352883A (en) | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
US4444762A (en) * | 1980-04-04 | 1984-04-24 | Nelson Research & Development Company | Vehicle composition containing 1-substituted azacyclopentan-2-ones |
CA1196862A (en) | 1983-06-01 | 1985-11-19 | Anthony M.F. Sun | Microencapsulation of living tissue and cells |
US4806355A (en) * | 1983-06-06 | 1989-02-21 | Connaught Laboratories Limited | Microencapsulation of living tissue and cells |
US4689293A (en) | 1983-06-06 | 1987-08-25 | Connaught Laboratories Limited | Microencapsulation of living tissue and cells |
US4680174A (en) | 1984-05-24 | 1987-07-14 | Damon Biotech, Inc. | Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US5117057A (en) | 1985-10-21 | 1992-05-26 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines |
US4985461A (en) * | 1985-10-21 | 1991-01-15 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines |
FR2593630B1 (fr) | 1986-01-27 | 1988-03-18 | Maurice Francois | Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran |
US5225443A (en) | 1986-05-01 | 1993-07-06 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines |
US5892019A (en) | 1987-07-15 | 1999-04-06 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of a single-gene-encoded immunoglobulin |
US5082779A (en) * | 1987-08-06 | 1992-01-21 | Edison Animal Biotechnology Center/Ohio University | Method of directing transgenic expression in animals using a prolactin promoter |
US5786216A (en) | 1987-11-17 | 1998-07-28 | Cytotherapeutics, Inc. | Inner-supported, biocompatible cell capsules |
US5773286A (en) | 1987-11-17 | 1998-06-30 | Cytotherapeutics, Inc. | Inner supported biocompatible cell capsules |
US4981784A (en) * | 1987-12-02 | 1991-01-01 | The Salk Institute For Biological Studies | Retinoic acid receptor method |
JP3040121B2 (ja) | 1988-01-12 | 2000-05-08 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 |
US5266488A (en) | 1988-04-06 | 1993-11-30 | The Regents Of The University Of California | Troponin T gene promoter and derivatives thereof |
US5340739A (en) | 1988-07-13 | 1994-08-23 | Brigham & Women's Hospital | Hematopoietic cell specific transcriptional regulatory elements of serglycin and uses thereof |
US5853985A (en) | 1988-08-30 | 1998-12-29 | Bayer Aktiegsesellschaft | Promoter of the gene for the human precursor of the alzheimer's disease and its use |
US5151508A (en) | 1988-08-30 | 1992-09-29 | Molecular Therapetuics, Inc. | Promoter region for DNA sequences which encode the precursor of the human A4 amyloid protein |
AU4128089A (en) | 1988-09-15 | 1990-03-22 | Rorer International (Overseas) Inc. | Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5693622A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
US5773215A (en) | 1989-10-24 | 1998-06-30 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor marker protein for cancer risk assessment |
AU7174791A (en) | 1990-01-26 | 1991-08-21 | Baylor College Of Medicine | Mutated promoter region from chicken skeletal alpha-actin gene |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
CA2043775A1 (en) | 1990-06-14 | 1991-12-15 | Dat P. Le | Dibenzoylakylcyanohydrazines |
US5529914A (en) | 1990-10-15 | 1996-06-25 | The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System | Gels for encapsulation of biological materials |
US5288846A (en) * | 1990-10-19 | 1994-02-22 | The General Hospital Corporation | Cell specific gene regulators |
US5831141A (en) | 1991-01-11 | 1998-11-03 | United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Expression of a heterologous polypeptide in mammary tissue of transgenic non-human mammals using a long whey acidic protein promoter |
IL100643A (en) | 1991-01-25 | 1996-10-31 | Nippon Kayaku Kk | History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient |
US7192584B2 (en) | 1991-03-18 | 2007-03-20 | Centocor, Inc. | Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies |
US5800829A (en) | 1991-04-25 | 1998-09-01 | Brown University Research Foundation | Methods for coextruding immunoisolatory implantable vehicles with a biocompatible jacket and a biocompatible matrix core |
CA2109085C (en) | 1991-04-25 | 2003-03-11 | Keith E. Dionne | Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products |
US5352595A (en) | 1991-09-03 | 1994-10-04 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Myod regulatory region |
US5837747A (en) | 1991-10-29 | 1998-11-17 | Vivorx, Inc. | Crosslinkable polysaccharides, polycations and lipids useful for encapsulation and drug release |
US5545423A (en) | 1991-11-25 | 1996-08-13 | Vivorx, Inc. | Cytoprotective, biocompatible, retrievable macrocapsule containment systems for biologically active materials |
ATE225852T1 (de) | 1992-01-23 | 2002-10-15 | Res Corp Technologies Inc | Menschlicher epidermaler gen-promotor |
US5753502A (en) | 1993-08-05 | 1998-05-19 | Icos Corporation | Neuron-specific ICAM-4 promoter |
US5556954A (en) | 1992-02-13 | 1996-09-17 | Beth Israel Hospital Boston Association | Hematopoietic stem cell specific gene expression |
US6013836A (en) | 1992-02-28 | 2000-01-11 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines |
US5573934A (en) | 1992-04-20 | 1996-11-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Gels for encapsulation of biological materials |
US5530028A (en) | 1992-11-23 | 1996-06-25 | Rohm And Haas Company | Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines |
US5334640A (en) | 1992-04-08 | 1994-08-02 | Clover Consolidated, Ltd. | Ionically covalently crosslinked and crosslinkable biocompatible encapsulation compositions and methods |
US5286495A (en) | 1992-05-11 | 1994-02-15 | University Of Florida | Process for microencapsulating cells |
DE4228458A1 (de) | 1992-08-27 | 1994-06-01 | Beiersdorf Ag | Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
AU5325694A (en) * | 1992-11-25 | 1994-06-22 | Brigham And Women's Hospital | Epstein barr virus induced genes |
CA2154265C (en) * | 1993-01-21 | 2011-01-04 | Spencer B. Farr | Methods and diagnostic kits utilizing mammalian stress promoters to determine toxicity of a compound |
US5627023A (en) | 1993-03-29 | 1997-05-06 | Duke University | Suppressor of HIV replication and transcription |
DK0746582T3 (da) * | 1993-04-27 | 2000-08-21 | Cytotherapeutics Inc | Membran dannet af en acrylonitril-baseret polymer |
US5698413A (en) * | 1993-05-05 | 1997-12-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of evaluating chemotherapeutic agents in vivo |
US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
AU688776B2 (en) | 1993-06-23 | 1998-03-19 | Brown University Research Foundation | Method and apparatus for sealing implantable, membrane encapsulation devices |
US5908623A (en) | 1993-08-12 | 1999-06-01 | Cytotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules |
DE69430824T2 (de) | 1993-08-12 | 2003-01-23 | Neurotech Sa | Biokompatible immunoisolatorische Kapseln, die genetisch veränderte Zellen enthalten |
WO1995013375A1 (en) | 1993-11-10 | 1995-05-18 | The Johns Hopkins University | Tumor suppressor waf1 |
US5858350A (en) | 1993-12-01 | 1999-01-12 | Marine Polymer Technologies | Methods and compositions for poly-β-1→4-N-acetylglucosamine cell therapy system |
FR2714830B1 (fr) | 1994-01-10 | 1996-03-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
ATE275194T1 (de) * | 1994-01-13 | 2004-09-15 | Rogosin Inst | Makroeingekapselte sekretorische zellen |
USRE39542E1 (en) | 1994-01-13 | 2007-04-03 | The Rogosin Institute | Preparation of agarose coated, solid agarose-collagen beads containing secretory cells |
FR2715847B1 (fr) | 1994-02-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
US5661032A (en) | 1994-03-18 | 1997-08-26 | Mcgill University | Tα1 α-tubulin promoter and expression vectors |
US5651980A (en) | 1994-04-15 | 1997-07-29 | Biohybrid Technologies, Inc. | Methods of use of uncoated gel particles |
US5550050A (en) | 1994-04-15 | 1996-08-27 | Cytotherapeutics, Inc. | Method for implanting encapsulated cells in a host |
US5518885A (en) | 1994-04-19 | 1996-05-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | ERBB2 promoter binding protein in neoplastic disease |
US5959094A (en) | 1994-05-11 | 1999-09-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | p75 TNF receptor promoters |
US6150137A (en) * | 1994-05-27 | 2000-11-21 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Immunosuppressant target proteins |
US5668012A (en) | 1994-07-05 | 1997-09-16 | The Blood Center Research Foundation, Inc. | Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 promoters and uses thereof |
US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
DE19524720A1 (de) | 1995-07-12 | 1997-01-16 | Hoechst Ag | Zellspezifische Gentherapie mit Hilfe eines neuen Promotors für den "Tissue Inhibitor of Metalloproteinasn-3" |
AU701568B2 (en) * | 1994-09-22 | 1999-02-04 | Licentia Ltd | Promoter for the receptor tyrosine kinase, tie |
US6306454B1 (en) | 1994-10-17 | 2001-10-23 | Baxter International Inc. | Method for producing improved medical devices and devices so produced |
US5919652A (en) | 1994-11-09 | 1999-07-06 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof |
US5643726A (en) | 1994-11-10 | 1997-07-01 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating transcription from the amyloid β-protein precursor (APP) promoter |
FR2727679B1 (fr) | 1994-12-05 | 1997-01-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
US6177242B1 (en) * | 1994-12-14 | 2001-01-23 | Institut Pasteur | Genomic DNA fragments containing regulatory and coding sequences for the β2-subunit of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor and transgenic animals made using these fragments or mutated fragments |
US6281015B1 (en) | 1994-12-16 | 2001-08-28 | Children's Medical Center Corp. | Localized delivery of factors enhancing survival of transplanted cells |
US5834306A (en) * | 1994-12-23 | 1998-11-10 | Sri International | Tissue specific hypoxia regulated therapeutic constructs |
US5824794A (en) | 1994-12-23 | 1998-10-20 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Human stromelysin-1 promoter |
US5888764A (en) * | 1995-01-20 | 1999-03-30 | Uab Research Foundation | Human fas gene promoter region |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
US7037647B1 (en) | 1995-02-24 | 2006-05-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Prostate-specific membrane antigen and uses thereof |
AU703124B2 (en) | 1995-03-03 | 1999-03-18 | Syngenta Participations Ag | Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand |
US5916790A (en) * | 1995-03-03 | 1999-06-29 | Metabolex, Inc. | Encapsulation compositions, and methods |
US6126936A (en) | 1995-03-10 | 2000-10-03 | Biohybrid Technologies Llc | Microcapsules and composite microreactors for immunoisolation of cells |
US5866323A (en) | 1995-04-07 | 1999-02-02 | Case Western Reserve University | Cancer diagnosis prognosis and therapy based on mutation of receptors for transforming growth factor β and homologous growth controlling factors |
ATE256184T1 (de) | 1995-04-24 | 2003-12-15 | Medical Res Council | Promotor des utrophingens |
CZ372297A3 (cs) | 1995-05-26 | 1998-03-18 | Zeneca Limited | Přepínání genové exprese využívající receptoru pro ekdyson |
US5744304A (en) * | 1995-05-30 | 1998-04-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inflammation-induced expression of a recombinant gene |
US7033746B2 (en) | 1995-06-06 | 2006-04-25 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | NES-1 polypeptides, DNA, and related molecules and methods |
US5837234A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Cytotherapeutics, Inc. | Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane |
US6187757B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-02-13 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of biological events using novel compounds |
US5888765A (en) * | 1995-06-23 | 1999-03-30 | President And Fellows Of Harvard College | Endothelial-cell specific promoter |
US6306649B1 (en) | 1995-06-27 | 2001-10-23 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Heterologous transcription factors |
GB2302874B (en) | 1995-06-29 | 1999-11-10 | Orion Yhtymae Oy | Novel proteins |
AU6854696A (en) | 1995-09-22 | 1997-04-09 | Gore Hybrid Technologies, Inc. | Improved cell encapsulation device |
GB9519490D0 (en) | 1995-09-25 | 1995-11-29 | Melvin William T | Use of a cytochrome P450 enzyme in tumour cells as a marker and target |
US5866329A (en) * | 1995-09-27 | 1999-02-02 | Demetriou; Achilles A. | Method and probe for detection of gene associated with liver neoplastic disease |
WO1997017369A2 (en) | 1995-11-09 | 1997-05-15 | Trustees Of Boston University | Dna comprising a neuron-specific transcriptional promoter and its use in a gene therapy vector |
US5837534A (en) | 1995-11-14 | 1998-11-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Smooth muscle 22α promoter, gene transfer vectors containing the same, and method of use of the same to target gene expression in arterial smooth muscle cells |
US5698389A (en) | 1995-11-16 | 1997-12-16 | Tularik, Inc. | Transcriptional promoter of the murine obesity gene |
US6482927B1 (en) | 1995-11-27 | 2002-11-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric proteins comprising the extracellular domain of murine Ob receptor |
CA2191903A1 (en) | 1995-12-20 | 1997-06-21 | Jun Ikeda | Stress proteins |
US6323329B1 (en) | 1995-12-21 | 2001-11-27 | Jorn Bullerdiek | Nucleic acid sequences of genes encoding high mobility group proteins |
HU228630B1 (en) | 1996-02-09 | 2013-04-29 | Abbott Biotech Ltd | Use of human anti bodies that bind human tnf-alpha and process for inhibiting of human tnf-alpha activity |
US5681706A (en) | 1996-03-01 | 1997-10-28 | Health Research Inc. | Mammalian anoxia-responsive regulatory element |
CA2248541A1 (en) | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Dnavec Research Inc. | Mouse tec tyrosine kinase promoter |
US6468766B1 (en) | 1996-03-15 | 2002-10-22 | President And Fellows Of Harvard College | Aortic carboxypeptidase-like polypeptide |
WO1997034914A1 (en) | 1996-03-22 | 1997-09-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for the diagnosis and treatment of chediak-higashi syndrome |
US5763591A (en) | 1996-03-25 | 1998-06-09 | Cedars-Sinai Medical Center | Polynucleic acid sequences that are functionally associated with the development of autoimmune disease |
US6224912B1 (en) | 1996-04-03 | 2001-05-01 | The Rogo Institute | Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment |
IL126418A0 (en) * | 1996-04-05 | 1999-05-09 | Salk Inst For Biological Studi | Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes and pharmaceutical compositions for modulating the same |
US6723531B2 (en) | 1996-04-05 | 2004-04-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Method for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
US6696557B1 (en) | 1996-04-19 | 2004-02-24 | Genentech, Inc. | AL-2 neurotrophic factor nucleic acid |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
WO1998000563A1 (fr) | 1996-06-28 | 1998-01-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de detection d'une activite telomerase |
US6720472B2 (en) | 1996-07-12 | 2004-04-13 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | HMGI proteins in cancer and obesity |
US5744310A (en) * | 1996-07-29 | 1998-04-28 | The Burnham Institute | Bax promoter sequence and screening assays for indentifying agents that regulate bax gene expression |
US20010011128A1 (en) | 1996-09-25 | 2001-08-02 | Gerald Batist | Hex II tumor-specific promoter and uses thereof |
US6777203B1 (en) | 1997-11-19 | 2004-08-17 | Geron Corporation | Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences |
US20040086494A1 (en) * | 1996-10-07 | 2004-05-06 | John Constance Mary | Immune privileged cells for delivery of proteins and peptides |
US5773290A (en) | 1996-10-07 | 1998-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mammary gland-specific promoters |
US6673911B1 (en) * | 1996-11-19 | 2004-01-06 | Chiron Corporation | Human polyhomeotic 2 (hph2) acts as an oncogene |
US5772993A (en) | 1997-01-21 | 1998-06-30 | The University Of Virginia Patent Foundation | Osteocalcin promoter-based toxic gene therapy for the treatment of calcified tumors and tissues |
US6794131B1 (en) | 1998-01-27 | 2004-09-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Lage-1 tumor associated nucleic acids |
US7138511B1 (en) | 1997-01-28 | 2006-11-21 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders |
US6482795B1 (en) | 1997-01-30 | 2002-11-19 | Myriad Genetics, Inc. | Tumor suppressor designated TS10q23.3 |
WO1998033912A1 (en) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Human Genome Sciences, Inc. | MYELIN OLIGODENDROCYTE GLYCOPROTEIN-LIKE PROTEIN (MOGp) AND METHODS OF USE |
US20030192065A1 (en) | 1998-02-06 | 2003-10-09 | Matthew D. Linnik | Human nerve growth factor exon 1 and exon 3 promoters |
DE19704301C1 (de) | 1997-02-06 | 1998-03-26 | Hoechst Ag | Der Promotor des humanen Endoglingens und seine Verwendung für die Gentherapie |
WO1998037194A1 (en) | 1997-02-19 | 1998-08-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Ell2, a member of an ell family of rna polymerase ii elongation factors |
US5965790A (en) | 1997-03-06 | 1999-10-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | SR-BI regulatory sequences and therapeutic methods of use |
US6472520B2 (en) | 1997-03-21 | 2002-10-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rat PEG-3 promoter |
US20020142417A1 (en) | 1997-04-02 | 2002-10-03 | Beverly Paigen | Antioxidant protein 2, gene and methods of use therefor |
US6410312B1 (en) | 1997-12-19 | 2002-06-25 | Chiron Corporation | huBUB3 gene involved in human cancers |
US6548736B1 (en) * | 1997-06-13 | 2003-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | 7B2 knockout transgenic animals as models of endocrine disease |
EP0893493A3 (de) * | 1997-07-21 | 2002-12-04 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen |
US6287558B1 (en) | 1997-08-01 | 2001-09-11 | Biohybrio Technologies Llc | Devices containing cells or tissue and an agent that inhibits damage by a host cell molecule |
US6040168A (en) | 1997-08-06 | 2000-03-21 | The Rockefeller University | DNA encoding the human synapsin III gene and uses thereof |
US6015709A (en) * | 1997-08-26 | 2000-01-18 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Transcriptional activators, and compositions and uses related thereto |
CA2300376A1 (en) | 1997-08-26 | 1999-03-04 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Fusion proteins comprising a dimerization, trimerization or tetramerization domain and an additional heterologous transcription activation, transcription repression, dna binding or ligand binding domain |
US20020048792A1 (en) | 1997-08-26 | 2002-04-25 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Methods and materials for regulated production of proteins |
US6479653B1 (en) | 1997-08-26 | 2002-11-12 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Compositions and method for regulation of transcription |
US6255473B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-07-03 | Duke University | Presenilin-1 gene promoter |
US20040103448A1 (en) * | 1997-09-05 | 2004-05-27 | Anders Bjorklund | Methods for inducing in vivo proliferation and migration of transplanted progenitor cells in the brain |
AU760274B2 (en) | 1997-09-19 | 2003-05-08 | Genaera Corporation | Asthma associated factors as targets for treating atopic allergies including asthma and related disorders |
US6087164A (en) | 1997-10-03 | 2000-07-11 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
AU1085099A (en) | 1997-10-16 | 1999-05-03 | Children's Medical Center Corporation | Thymosin beta15 promoter and use thereof |
US6383746B1 (en) | 1997-10-23 | 2002-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Functional promoter for CCR5 |
JP2001521740A (ja) * | 1997-11-03 | 2001-11-13 | ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・アリゾナ | 遺伝子治療用の高温誘導性発現ベクター及びその使用方法 |
US20020111325A1 (en) | 1997-11-03 | 2002-08-15 | Human Genome Sciences, Inc. | VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth |
US6509190B2 (en) * | 1997-11-12 | 2003-01-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA regulatory element for the expression of transgenes in neurons of the mouse forebrain |
US6368612B1 (en) | 1997-12-12 | 2002-04-09 | Biohybrid Technologies Llc | Devices for cloaking transplanted cells |
US6930175B1 (en) | 1997-12-12 | 2005-08-16 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Gene family with transformation modulating activity |
US7063960B2 (en) | 1997-12-12 | 2006-06-20 | The Rockefeller University | Protein belonging to the TNF superfamily involved in signal transduction, nucleic acids encoding same, and methods of use thereof |
US6335156B1 (en) | 1997-12-18 | 2002-01-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | 14-3-3σ arrests the cell cycle |
US6432668B1 (en) | 1997-12-30 | 2002-08-13 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding human cyclin-dependent kinase (hPFTAIRE) |
US6015376A (en) * | 1998-01-13 | 2000-01-18 | University Of Kentucky Research Foundation | DNA sequence corresponding to the minimal essential promoter of the human sodium-iodide symporter (hNIS) |
US6780610B1 (en) | 1998-01-16 | 2004-08-24 | Setagon, Inc. | Identification of a smooth muscle cell (SMC) specific smooth muscle heavy chain (SM-MHC) promoter/enhancer |
GB9801902D0 (en) | 1998-01-29 | 1998-03-25 | Cancer Res Campaign Tech | A gene promoter |
US6617171B2 (en) * | 1998-02-27 | 2003-09-09 | The General Hospital Corporation | Methods for diagnosing and treating autoimmune disease |
KR20010086587A (ko) * | 1998-02-27 | 2001-09-13 | 데이비드 이. 프랭크하우저 | 유전자 요법에 의한 염증성 세포의 자기-조절된 고사 |
US6207812B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-03-27 | Rhode Island Hospital | Chondrosarcoma associated genes |
US6866842B1 (en) * | 1998-05-01 | 2005-03-15 | University Of Pittsburgh | Muscle-derived cells (MDCs) for treating muscle-or bone-related injury or dysfunction |
US6342596B1 (en) * | 1998-05-05 | 2002-01-29 | Hsf Pharmaceuticals S.A. | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
WO1999056748A1 (en) * | 1998-05-05 | 1999-11-11 | Sepracor Inc. | Desmethylpantoprazole compositions and methods |
US6333318B1 (en) | 1998-05-14 | 2001-12-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
US20020023277A1 (en) * | 1998-05-22 | 2002-02-21 | Heidi Stuhlmann | Vascular endothelial zinc finger 1 gene and protein and uses thereof |
US6303372B1 (en) | 1998-06-12 | 2001-10-16 | Chiron Corporation | cDNA molecule encoding human CIF130 |
US6258603B1 (en) | 1998-06-17 | 2001-07-10 | Rohm And Haas Company | Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US6262249B1 (en) | 1998-06-23 | 2001-07-17 | Chiron Corporation | Pancreatic cancer genes |
US6610509B1 (en) | 1998-07-24 | 2003-08-26 | Barnes-Jewish Hospital | Methods of targeted expression by the CD-RAP gene promoter |
WO2000006087A2 (en) | 1998-07-29 | 2000-02-10 | Tularik Inc. | Uncoupling protein-2(hcp2): compositions and methods of use |
US6818018B1 (en) | 1998-08-14 | 2004-11-16 | Incept Llc | In situ polymerizable hydrogels |
JP4768916B2 (ja) | 1998-09-15 | 2011-09-07 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | サイトカイン発現が遺伝的に増強された抗原提示細胞のインサイチュ注入 |
CA2245903A1 (en) | 1998-09-28 | 2000-03-28 | Mcgill University | Use of pex in the treatment of metabolic bone diseases |
US6387656B1 (en) | 1998-09-29 | 2002-05-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Gene encoding MNR2 and uses thereof |
DE19849044A1 (de) * | 1998-10-23 | 2000-04-27 | Univ Ludwigs Albert | Das Gen PRV-1 und dessen Verwendung |
WO2000032630A2 (en) * | 1998-12-04 | 2000-06-08 | G.D. Searle & Co. | Nucleic acids and polypeptides derived from activated eosinophil cells and use thereof |
US6174679B1 (en) * | 1998-12-10 | 2001-01-16 | Chiron Corporation | CIF150/hTAFII150 is necessary for cell cycle progression |
WO2000036147A1 (en) | 1998-12-12 | 2000-06-22 | Samyang Genex Corporation | Cancer diagnosis method using cell growth inhibiting and cell differentiation specific syg972 gene and genomic dna and promoter thereof |
PT1141331E (pt) | 1998-12-16 | 2008-12-22 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Quinase dependente de ciclina humana (hpnqalre) |
US6682736B1 (en) * | 1998-12-23 | 2004-01-27 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to CTLA-4 |
EA006972B1 (ru) | 1998-12-23 | 2006-06-30 | Пфайзер Инк. | Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения |
US6395482B1 (en) | 1999-01-13 | 2002-05-28 | The Rockfeller University | Method of determining susceptibility to schizophrenia |
US7148016B1 (en) | 1999-01-14 | 2006-12-12 | Ca*Tx Inc. | Immunoassays to detect diseases or disease susceptibility traits |
US7094533B1 (en) | 1999-01-21 | 2006-08-22 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Therapeutic and diagnostic applications of prostatic acid phosphatase in prostate cancer |
CN1343255A (zh) | 1999-01-25 | 2002-04-03 | 宫田敏男 | Megsin启动子 |
JP2002535997A (ja) | 1999-02-02 | 2002-10-29 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 細胞の老化および細胞の最終分化の際に向上した発現を示す遺伝子、およびその使用 |
US6267985B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-07-31 | Lipocine Inc. | Clear oil-containing pharmaceutical compositions |
US6495161B1 (en) | 1999-03-09 | 2002-12-17 | Vivorx, Inc. | Cytoprotective biocompatible containment systems for biologically active materials and methods of making same |
EP1048736A1 (en) | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | DNA-construct for the tissue specific expression of a blood coagulation factor |
US6365385B1 (en) | 1999-03-22 | 2002-04-02 | Duke University | Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells |
US6303355B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-10-16 | Duke University | Method of culturing, cryopreserving and encapsulating pancreatic islet cells |
AU2248500A (en) | 1999-03-31 | 2000-10-05 | Aquatic Mechanical Services Pty Ltd | Alloy water treatment |
US7227013B1 (en) | 1999-03-31 | 2007-06-05 | Metamorphix, Inc. | Growth differentiation factor-9 regulatory sequences and uses therefor |
US6897062B1 (en) * | 1999-04-09 | 2005-05-24 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | DNA encoding the prostate-specific membrane antigen-like gene and uses thereof |
ATE525390T1 (de) | 1999-04-27 | 2011-10-15 | Univ Pennsylvania | Verwendung von resistin spezifischen antikörpern in der behandlung von diabetes |
US6277970B1 (en) | 1999-05-11 | 2001-08-21 | The Regents Of The University Of California | PRP-like gene |
US6558665B1 (en) | 1999-05-18 | 2003-05-06 | Arch Development Corporation | Encapsulating particles with coatings that conform to size and shape of the particles |
US6541244B1 (en) | 1999-06-07 | 2003-04-01 | Cedars-Sinai Medical Center | Suppressor of cytokine signaling (SOCS)-3 promoter and methods for its use in genetic therapy in humans |
US6284882B1 (en) | 1999-06-10 | 2001-09-04 | Abbott Laboratories | Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof |
EP1183392A1 (en) | 1999-06-15 | 2002-03-06 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Diagnosis, prognosis and treatment of cancer related to the barx2 gene |
US7049132B1 (en) | 1999-06-28 | 2006-05-23 | University Of Southern California | Stress-responsive induction of a therapeutic agent and methods of use |
CA2377438A1 (en) | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Gene encoding promoter domain of tumor suppressor gene p51 and use thereof |
AU5886700A (en) | 1999-06-30 | 2001-01-31 | Chiron Corporation | Human chromosome 15 and 16 bardet-biedl syndrome polynucleotides and polypeptides and methods of use |
US7276595B2 (en) | 1999-07-14 | 2007-10-02 | Hong Kong University Of Science & Technology Inc. | DNA sequence encoding a retinoic acid regulated protein |
US6320038B1 (en) | 1999-08-03 | 2001-11-20 | Pertti Aarre Juhani Panula | Promoter for neuropeptide FF and use thereof for therapy and diagnostics |
US6416956B1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-07-09 | George Washington University | Transcription factor, BP1 |
US7605238B2 (en) | 1999-08-24 | 2009-10-20 | Medarex, Inc. | Human CTLA-4 antibodies and their uses |
WO2001016324A2 (en) | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions of a novel serine protease inhibitor |
EP1083231A1 (en) | 1999-09-09 | 2001-03-14 | Introgene B.V. | Smooth muscle cell promoter and uses thereof |
US20020042062A1 (en) | 1999-09-24 | 2002-04-11 | Mark Stearns | Prostate cancer-related compositions, methods, and kits based on DNA macroarray proteomics platforms |
US7790861B2 (en) | 1999-09-24 | 2010-09-07 | Philadelphia Health And Education Corporation | Prostate cancer-related compositions, methods, and kits based on DNA macroarray proteomics platforms |
DE19947668A1 (de) | 1999-10-04 | 2001-04-19 | Univ Eberhard Karls | Tumorspezifischer Vektor für die Gentherapie |
DE19949179A1 (de) * | 1999-10-12 | 2001-05-03 | Univ Bremen | Nukleinsäuresequenzen von Hyperplasien und Tumoren der Schilddrüse |
WO2001029068A2 (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | A eag gene encoding for a potassium channel |
US6716824B1 (en) | 1999-10-22 | 2004-04-06 | F. Charles Brunicardi | Treatment of pancreatic adenocarcinoma by cytotoxic gene therapy |
US20040091928A1 (en) | 1999-10-27 | 2004-05-13 | Pharmacia & Upjohn Company | G protein-coupled receptors expressed in brain |
US20030078224A1 (en) | 1999-10-29 | 2003-04-24 | Chung Leland W.K. | Gene expression directed by a super-PSA promoter |
US20030031670A1 (en) | 1999-11-08 | 2003-02-13 | Jack R. Wands | Diagnosis and treatment of malignant neoplasms |
US6881834B1 (en) | 2000-01-03 | 2005-04-19 | Guthrie Foundation For Education And Research | Myeloid cell promoter and constructs containing same |
US6569684B2 (en) * | 2000-01-06 | 2003-05-27 | University Of Central Florida | Method of identifying and treating invasive carcinomas |
US6743903B1 (en) | 2000-01-18 | 2004-06-01 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids for the diagnosis and treatment of giant cell arteritis |
AU2001227526A1 (en) | 2000-01-18 | 2001-07-31 | Pharmacia Corporation | Osteoarthritis tissue derived nucleic acids, polypeptides, vectors, and cells |
US20020042057A1 (en) * | 2000-02-03 | 2002-04-11 | Ralph Knoell | MLP-gene, nucleic acids, polypeptides and use thereof |
US6800604B2 (en) | 2000-02-11 | 2004-10-05 | Genentech, Inc. | Polypeptides that inhibit human serum-induced cleavage of hepatocyte growth factor |
DE10008330A1 (de) * | 2000-02-23 | 2001-09-06 | Switch Biotech Ag | Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren der Genfamilie NM23 zur Diagnose oder Behandlung von Haut- und Darmerkrankungen sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen. |
CA2399259A1 (en) | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Metriogene Biosciences Inc. | Endometriosis-related markers and uses thereof |
EP1259609A2 (en) | 2000-02-28 | 2002-11-27 | Decode Genetics EHF. | Human schizophrenia gene |
AU2001241839A1 (en) | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Decode Genetics Ehf | Human schizophrenia gene |
CA2401775A1 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Abbot F. Clark | Diagnostics and therapeutics for glaucoma |
US6841362B1 (en) * | 2000-02-29 | 2005-01-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Melanoma differentiation associated gene-7 promoter and uses thereof |
AU4347701A (en) | 2000-03-01 | 2001-09-12 | Corixa Corp | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
JP2004500097A (ja) | 2000-03-02 | 2004-01-08 | エムエル ラボラトリーズ ピーエルシー | Tcf応答性エレメント |
FR2806418B1 (fr) * | 2000-03-14 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Promoteurs hybrides inductibles par l'inflammation, vecteurs les contenant et utilisations |
US20030157072A1 (en) | 2000-03-16 | 2003-08-21 | Roger Bouillon | Nusap, a novel gene encoding a tissue-specific nuclear protein, useful as a diagnostic tool and therapeutic agent |
MXPA02009157A (es) | 2000-03-22 | 2004-04-05 | Rohm & Haas | Nuevo sistema de expresion genetica inducible a base del receptor de ecdisona. |
US20040033600A1 (en) | 2001-03-21 | 2004-02-19 | Palli Subba Reddy | Ecdysone receptor-based inducible gene expression system |
US7514239B2 (en) * | 2000-03-28 | 2009-04-07 | Amgen Inc. | Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof |
DE60135315D1 (de) | 2000-04-04 | 2008-09-25 | Univ Rochester | In brust- und blasenkrebs differentiell exprimiertes gen und durch dieses kodierte polypeptide |
AU4675901A (en) | 2000-04-13 | 2001-10-30 | 1149336 Ontario Inc. | Glp-2 receptor gene promoter and uses thereof |
CA2405680C (en) * | 2000-04-20 | 2018-02-13 | St. Vincent's Hospital Sydney Limited | Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitory cytokine -1 (mic-1) |
US20020009455A1 (en) * | 2000-04-27 | 2002-01-24 | Ted Lau | DNA encoding a novel PROST 03 polypeptide |
US7071323B2 (en) | 2000-05-02 | 2006-07-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Promoter sequences for corticotropin releasing-factor receptor CRF2α and method of identifying agents that alter the activity of the promoter sequences |
DE10024171A1 (de) | 2000-05-17 | 2001-12-20 | Basf Lynx Bioscience Ag | Neuronale Serin-Threonin-Protein-Kinase |
WO2001094420A1 (en) | 2000-06-05 | 2001-12-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Identification and use of human bone marrow-derived endothelial progenitor cells to improve myocardial function after ischemic injury |
AU2001268232A1 (en) | 2000-06-09 | 2001-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions, methods, and kits relating to resistin-like molecules |
US6337008B1 (en) | 2000-06-12 | 2002-01-08 | Alcan International Limited | Electrolysis cells |
DE60126088D1 (de) * | 2000-06-19 | 2007-03-08 | Vereniging Het Nl Kanker I | Wechselwirkung zwischen tbx2 und dem arf-promoter in zellzyklus-regulator-assays |
US20030180302A1 (en) | 2000-06-20 | 2003-09-25 | Eckhard Wolf | Use of polypeptides or nucleic acids for the diagnosis or treatment of skin disorders and wound healing and for the identification of pharmacologically active substances |
GB0015371D0 (en) | 2000-06-23 | 2000-08-16 | Novartis Res Found | Tumour-cell specific gene expression and its use in cancer therapy |
US6723553B2 (en) | 2000-06-27 | 2004-04-20 | Biovitrum Ab | Promoter sequences |
FR2811678B1 (fr) | 2000-07-12 | 2002-09-27 | Inst Nat Sante Rech Med | Promoteur specifique du myocarde |
EP1302539A4 (en) | 2000-07-21 | 2004-10-27 | Chiba Prefecture | TUMOR-SPECIFIC PROMOTORS |
DE60123431D1 (de) | 2000-07-25 | 2006-11-09 | Sir Mortimer B Davis Jewish Ge | Ho-1 suppressor als diagnostischer und prognostischer test für demenz-krankheiten |
US20050181374A1 (en) | 2004-01-05 | 2005-08-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Kruppel-like factor 6 ( KLF6), a tumor suppressor protein, and diagnostics, therapeutics, and screening based on this protein |
WO2002012285A2 (en) | 2000-08-10 | 2002-02-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | The tumor suppressor car-1 |
US7195910B2 (en) * | 2000-08-30 | 2007-03-27 | Thomas Jefferson University | Human tyrosine hydroxylase promoter and uses thereof |
AUPQ980600A0 (en) | 2000-09-01 | 2000-09-21 | Bionomics Limited | Tumour suppressor gene |
AU2001295457B2 (en) * | 2000-09-11 | 2006-11-16 | Merck Patent Gmbh | Use of CARP inhibitors for the treatment of heart diseases |
US6630304B1 (en) | 2000-09-14 | 2003-10-07 | Decode Genetics Ehf. | Human osteoporosis gene |
US8105825B2 (en) | 2000-10-03 | 2012-01-31 | Intrexon Corporation | Multiple inducible gene regulation system |
US20030017573A1 (en) * | 2000-10-04 | 2003-01-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Polymerase kappa compositions and methods thereof |
AU2002213143A1 (en) | 2000-10-12 | 2002-04-22 | Institute Of Materials Research And Engineering | Non-disruptive three-dimensional culture and harvest system for anchorage-dependent cells |
US6630325B1 (en) | 2000-10-19 | 2003-10-07 | Maine Medical Center Research Institute | Compositions, methods and kits relating to remodel |
JP2004517634A (ja) | 2000-10-27 | 2004-06-17 | ベイラー カレッジ オブ メディシン | 神経変性疾患の同定と治療のための方法及び組成物 |
AU2002232407A1 (en) | 2000-10-30 | 2002-05-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods, compositions and therapeutic applications relating to fortilin (= translationally controlled tumor protein, tctp) and modulators thereof |
US20020151018A1 (en) | 2000-10-31 | 2002-10-17 | Prouty Stephen M. | Stearoyl-CoA desaturase gene promoter |
US6670138B2 (en) | 2000-11-01 | 2003-12-30 | Agy Therapeutics, Inc. | Method of diagnosing ischemic stroke via UCP-2 detection |
EP1205490A1 (en) | 2000-11-10 | 2002-05-15 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Fusion protein comprising integrase (phiC31) and a signal peptide (NLS) |
US20040003420A1 (en) | 2000-11-10 | 2004-01-01 | Ralf Kuhn | Modified recombinase |
WO2002038764A2 (en) | 2000-11-10 | 2002-05-16 | The Regents Of The University Of California | Il-17 receptor-like protein, uses thereof, and modulation of catabolic activity of il-17 cytokines on bone and cartilage |
US7067649B2 (en) | 2000-11-17 | 2006-06-27 | Vascular Biogenics Ltd. | Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same |
JP2004529614A (ja) * | 2000-11-20 | 2004-09-30 | カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 動脈平滑筋及び静脈平滑筋並びにそれらの利用 |
WO2002044331A2 (en) | 2000-11-29 | 2002-06-06 | Cangen International | Dap-kinase and hoxa9, two human genes associated with genesis, progression, and aggressiveness of non-small cell lung cancer |
US20020107219A1 (en) | 2000-12-05 | 2002-08-08 | Curiel David T. | Adenoviral vector containing cyclooxygenase-2 promoter and uses thereof |
NZ526408A (en) * | 2000-12-07 | 2005-07-29 | Centelion S | Promoter sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses in treating cardiac disorders |
US7220844B2 (en) | 2000-12-14 | 2007-05-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Liver tumor marker sequences |
KR100603683B1 (ko) | 2000-12-22 | 2006-07-20 | 가부시키가이샤 로코모젠 | 활막세포 단백질 |
WO2002053738A1 (fr) | 2000-12-28 | 2002-07-11 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouvelles proteines et adn correspondant |
WO2002054940A2 (en) | 2001-01-12 | 2002-07-18 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer |
KR100418465B1 (ko) | 2001-01-15 | 2004-02-14 | 서동상 | 인슐린 의존성 당뇨병의 유전자 치료방법 및 그 치료용 조성물 |
US20030013097A1 (en) | 2001-01-23 | 2003-01-16 | Welsh John Barnard | Genes overexpressed in prostate disorders as diagnostic and therapeutic targets |
US20020169300A1 (en) | 2001-01-30 | 2002-11-14 | Waterman Marian L. | Method of detection and treatment of colon cancer by analysis of beta-catenin-sensitive isoforms of lymphoid enhancer factor-1 |
US7413873B2 (en) | 2001-01-30 | 2008-08-19 | The Regents Of The University Of California | Method of detection and treatment of colon cancer |
EP1409536A2 (en) * | 2001-02-12 | 2004-04-21 | Curagen Corporation | Human proteins and nucleic acids encoding same |
WO2002066615A2 (en) | 2001-02-20 | 2002-08-29 | Rheogene, Inc. | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
MXPA03007492A (es) | 2001-02-20 | 2004-10-15 | Rheogene Holdings Inc | Receptores de retinoide x quimerico y su uso en un sistema de expresion de gen inducible basado en receptor de ecdisona novedoso. |
EP1373470B1 (en) | 2001-02-20 | 2013-04-24 | Intrexon Corporation | Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
EP1456346B1 (en) | 2001-02-20 | 2012-02-15 | Intrexon Corporation | Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid x receptor-based inducible gene expression system |
US20030054531A1 (en) * | 2001-03-19 | 2003-03-20 | Decode Genetics Ehf, | Human stroke gene |
CA2442134A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Celltech R & D, Inc. | Compositions and methods for diagnosing or treating psoriasis |
US20030044813A1 (en) * | 2001-03-30 | 2003-03-06 | Old Lloyd J. | Cancer-testis antigens |
ATE527375T1 (de) | 2001-04-12 | 2011-10-15 | Imp Innovations Ltd | Diagnose und behandlung von brustkrebs mit scn5a |
US7078411B2 (en) | 2001-05-16 | 2006-07-18 | Umdnj (Univ Of Medicine & Dentist. Of Nj) | Phospholipid transfer protein (PLTP) and cholestoral metabolism |
AU2002310009A1 (en) | 2001-05-21 | 2002-12-03 | University Of Iowa Research Foundation | Bmpr1a involvement in juvenile polyposis |
IL149701A0 (en) | 2001-05-23 | 2002-11-10 | Pfizer Prod Inc | Use of anti-ctla-4 antibodies |
KR20030022094A (ko) | 2001-05-24 | 2003-03-15 | (주)휴먼디엔에이테크놀로지 | 모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 |
DE10126473A1 (de) * | 2001-05-31 | 2003-09-04 | Daniel Peter | Methode zur Diagnose und Therapie des Nierenzellkarzinoms |
US6897024B2 (en) | 2001-05-31 | 2005-05-24 | Stichting Katholieke Universiteit More Particularly The University Medical Centre Nijmegen | Nucleic acid molecules comprising the promoter for PCA3, and uses thereof |
WO2002098432A1 (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods of treating cardiac disorders |
WO2002098441A2 (en) | 2001-06-07 | 2002-12-12 | Azign Bioscience A/S | Method of treating metabolic disorders using neuronatin polypeptides |
WO2002100876A1 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-19 | The General Hospital Corporation | Dock 3 tumor suppressor gene |
WO2002100884A2 (en) | 2001-06-13 | 2002-12-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Cloned mammalian polyamine oxidase |
US20040086504A1 (en) | 2001-06-21 | 2004-05-06 | Deepak Sampath | Cyr61 as a target for treatment and diagnosis of breast cancer |
EP1409734A4 (en) * | 2001-06-27 | 2005-10-19 | New England Medical Center Inc | DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER |
US6884619B2 (en) | 2001-07-17 | 2005-04-26 | Yale University | Inhibition of BEHAB cleavage and primary central nervous system (CNS) tumors |
US20050079496A1 (en) | 2001-08-17 | 2005-04-14 | Edgar Serfling | Methods for diagnosing and treating neoplasias using nf-at transcriptions factors |
KR100453853B1 (ko) | 2001-08-28 | 2004-10-20 | 삼성전자주식회사 | 저전압 불 휘발성 반도체 메모리 장치 및 그것의 독출 방법 |
US20030096781A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-05-22 | University Of Southern California | IL-8 is an autocrine growth factor and a surrogate marker for Kaposi's sarcoma |
CA2357181A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-02-28 | Procyon Biopharma Inc. | Generation of transgenic mouse models for the development of prostate cancer using regulatory regions of the psp94 gene |
US20030108920A1 (en) | 2001-09-07 | 2003-06-12 | Wei Zhang | Tumor suppressor-like proteins that bind IGFBP2 |
US7247297B2 (en) | 2001-09-14 | 2007-07-24 | The University Of Chicago | Use of DF3/MUC1 regulated expression in gene therapy |
JP3974894B2 (ja) * | 2001-09-14 | 2007-09-12 | 財団法人新産業創造研究機構 | 腫瘍特異的プロモーターおよびその用途 |
US7202024B2 (en) | 2001-09-17 | 2007-04-10 | Immunogen Inc. | bbc3 Gene promoter and methods for identifying modulators of apoptosis and bbc3 gene expression using a bbc3 gene promoter |
AU2002327945A1 (en) | 2001-09-17 | 2003-04-01 | Eirx Therapeutics Limited | Human delta-n p73 molecules and uses thereof |
US7563879B2 (en) | 2001-09-26 | 2009-07-21 | Intrexon Corporation | Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof |
US7919269B2 (en) | 2001-09-26 | 2011-04-05 | Intrexon Corporation | Whitefly ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof |
CA2460770A1 (en) | 2001-10-01 | 2003-04-10 | The General Hospital Corporation | Diagnosing, treating, and preventing cancer using cables |
GB0123664D0 (en) | 2001-10-02 | 2001-11-21 | Inst Of Cancer Res The | Histone deacetylase 9 |
WO2003033672A2 (en) | 2001-10-19 | 2003-04-24 | Riken | Nr3b nmda receptor subunit compositions and related methods |
US7781413B2 (en) | 2001-10-31 | 2010-08-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells |
CA2466138A1 (en) | 2001-11-02 | 2003-05-15 | Shen Wu Wang | B-cell lymphoma specific antigen for use in diagnosis and treatment of b-cell malignancies |
AU2002364507A1 (en) | 2001-11-21 | 2003-06-10 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Mammary-associated serum amyloid a3 promoter sequences and uses for same |
US7144985B2 (en) | 2001-12-03 | 2006-12-05 | Metabolex, Inc. | Methods and reagents for diagnosis and treatment of diabetes |
US20060275747A1 (en) | 2001-12-07 | 2006-12-07 | Hardy Stephen F | Endogenous retrovirus up-regulated in prostate cancer |
US20030211065A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-11-13 | Elon Pras | Methods and compositions for diagnosing and treating hypotrichosis simplex |
US7166713B2 (en) * | 2001-12-11 | 2007-01-23 | Texas Techn University | Variant cleavage stimulation factor and its encoding nucleic acid |
US20030134790A1 (en) | 2002-01-11 | 2003-07-17 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer |
US7432349B2 (en) | 2002-01-23 | 2008-10-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Tumor suppressor gene, p28ING5 |
US20030180728A1 (en) | 2002-03-22 | 2003-09-25 | Kovacs Karl F. | Human BCU399 gene, polypeptide, and uses |
US7053193B2 (en) | 2002-01-25 | 2006-05-30 | Origene Technologies, Inc. | Breast cancer transcription factor gene and uses |
US20030203380A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-10-30 | Decode Genetics Ehf. | Gene linked to osteoarthritis |
US20030157599A1 (en) | 2002-01-30 | 2003-08-21 | Decode Genetics Ehf | Gene for peripheral arterial occlusive disease |
WO2003065873A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-14 | Seattle Genetics, Inc. | Sga-1m, a cancer associated antigen, and uses thereof |
GB0219574D0 (en) | 2002-02-14 | 2002-10-02 | Aventis Pharma Inc | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof |
WO2003068803A2 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | A nucleic acid encoding a g-protein-coupled receptor, and uses thereof |
US20040005294A1 (en) * | 2002-02-25 | 2004-01-08 | Ho-Young Lee | IGFBP-3 in the diagnosis and treatment of cancer |
EP1340818A1 (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Epigenomics AG | Method and nucleic acids for the analysis of a colon cell proliferative disorder |
EP1487998B1 (en) | 2002-03-20 | 2007-06-06 | Novartis AG | Methods for diagnosing and treating schizophrenia |
WO2003083049A2 (en) | 2002-03-22 | 2003-10-09 | Munin Corporation | Cloning and characterization of g+c-rich promoter binding protein |
US6727322B2 (en) | 2002-04-01 | 2004-04-27 | The University Of Akron | Amphiphilic networks, implantable immunoisolatory devices, and methods of preparation |
WO2003089596A2 (en) | 2002-04-19 | 2003-10-30 | Schering Aktiengesellschaft | Novel prostate tumor-specific promoter |
CA2484965A1 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-13 | Canadian Blood Services | Encapsulated cells to elicit immune response |
AU2003234319A1 (en) | 2002-05-03 | 2003-11-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Mta1s, a steroid hormone receptor corepressor |
US20060052320A1 (en) * | 2002-05-06 | 2006-03-09 | Limin Li | Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis annexin XIII genes |
AU2003241335A1 (en) * | 2002-05-09 | 2003-11-11 | The Regents Of The University Of California | Method of analyzing ataxia-telangiectasia protein |
WO2003097804A2 (en) | 2002-05-16 | 2003-11-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Promoter sequences for urocortin ii the use thereof |
AU2003299507A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-06-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hop - a novel cardiac-restricted transcriptional factor potentially useful for cardiac regeneration and specification |
US7226978B2 (en) | 2002-05-22 | 2007-06-05 | Dexcom, Inc. | Techniques to improve polyurethane membranes for implantable glucose sensors |
AU2003243427A1 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-19 | Metabolex, Inc. | Methods of diagnosing and treating diabetes and insulin resistance |
US20070122802A1 (en) | 2002-06-04 | 2007-05-31 | Bernard Allan | Methods of diagnosing and treating diabetes and insulin resistance |
WO2003104484A1 (en) | 2002-06-10 | 2003-12-18 | Metabolex, Inc. | Methods of treating and diagnosing diabetes with cx3cr1 modulators |
US20050228016A1 (en) | 2002-06-13 | 2005-10-13 | Enrique Michelotti | Tetrahydroquinolines for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
AU2003238232A1 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-31 | Metabolex, Inc. | Compositions and methods for preventing, treating and diagnosing diabetes |
WO2004001047A1 (ja) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | 新規プロモーター |
US7375093B2 (en) * | 2002-07-05 | 2008-05-20 | Intrexon Corporation | Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
GB0216286D0 (en) * | 2002-07-15 | 2002-08-21 | Univ Leeds | Network |
US7129328B2 (en) * | 2002-07-17 | 2006-10-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Liver tumor marker sequences |
US7364727B2 (en) | 2002-07-22 | 2008-04-29 | Cell Genesys, Inc. | Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof |
KR100493887B1 (ko) | 2002-08-09 | 2005-06-08 | 한국과학기술연구원 | 내환경성 클래드 판재 및 그 제조방법 |
US20060099676A1 (en) | 2002-08-15 | 2006-05-11 | Limin Li | Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis: rapr6 genes |
AU2003265525A1 (en) | 2002-08-15 | 2004-03-19 | Functional Genetics, Inc. | Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis: rapr7 genes |
AU2003259924A1 (en) | 2002-08-20 | 2004-03-11 | Central Iowa Health System | Ovarian cancer-specific promoter |
AU2002951346A0 (en) * | 2002-09-05 | 2002-09-26 | Garvan Institute Of Medical Research | Diagnosis of ovarian cancer |
US20040049437A1 (en) | 2002-09-11 | 2004-03-11 | Govone Solutions, Lp | Method, system and computer program product for automating transaction tax calculation |
WO2004026120A2 (en) | 2002-09-23 | 2004-04-01 | The General Hospital Coporation | Methods for diagnosing and treating tumors and suppressing cd promoters |
US20080050808A1 (en) | 2002-10-09 | 2008-02-28 | Reed Thomas D | DNA modular cloning vector plasmids and methods for their use |
US7785871B2 (en) | 2002-10-09 | 2010-08-31 | Intrexon Corporation | DNA cloning vector plasmids and methods for their use |
IL152232A0 (en) | 2002-10-10 | 2003-05-29 | Yeda Res & Dev | Promoter to il-18bp, its preparation and use |
US20050266443A1 (en) | 2002-10-11 | 2005-12-01 | Thomas Jefferson University | Novel tumor suppressor gene and compositions and methods for making and using the same |
AU2003274633A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-05-04 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Erythrocyte differentiation factor, gene encoding same, and methods of use thereof |
US20040076965A1 (en) | 2002-10-16 | 2004-04-22 | Bosserhoff Anja Katrin | MIA-2 protein |
EP1565482B1 (en) | 2002-10-23 | 2014-04-30 | Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. | A34 and a33-like 3 dna, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same |
JP2006506988A (ja) | 2002-11-01 | 2006-03-02 | デコード ジェネティクス イーエッチエフ. | 染色体5q35に位置したヒトII型糖尿病遺伝子−SLIT−3 |
US20050196784A1 (en) | 2002-11-01 | 2005-09-08 | Decode Genetics Ehf. | Human Type II diabetes gene - Kv channel-interacting protein (KChIP1) located on chromosome 5 |
AU2003291433B2 (en) | 2002-11-13 | 2008-05-22 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods for cancer diagnosis and therapy |
WO2004044170A2 (en) | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Metabolex, Inc. | A pancreatic islet transcription factor and uses thereof |
US20040197770A1 (en) | 2002-11-14 | 2004-10-07 | Mount Sinai School Of Medicine | Induction of apoptosis by HIV-1 infected monocytic cells |
GB0228337D0 (en) | 2002-12-05 | 2003-01-08 | Yorkshire Cancer Res Campaign | Replication protein |
WO2004053052A2 (en) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Camargo Antonio | HUMAN RECOMBINANT ENDOOLIGOPEPTIDASE A (hEOPA) |
AU2002953341A0 (en) | 2002-12-13 | 2003-01-09 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | A novel phosphoprotein |
EP1579007B1 (de) | 2002-12-21 | 2015-05-27 | Universität Leipzig | Verfahren und mittel zur bestimmung von bestimmten zuständen bzw. veränderungen im uterusepithel und im epithel anderer organe |
WO2004064868A1 (en) * | 2003-01-22 | 2004-08-05 | Magnus Essand | Tarp promoter and uses thereof |
WO2004069194A2 (en) * | 2003-02-03 | 2004-08-19 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of the oxidoreductase ncb50r for diagnosings and treating diabetes |
US20040171108A1 (en) | 2003-02-07 | 2004-09-02 | Fisher Paul B. | Human excitatory amino acid transporter-2 gene promoter and uses thereof |
US7304161B2 (en) | 2003-02-10 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex |
WO2004072275A2 (en) | 2003-02-11 | 2004-08-26 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (fge) |
US7745689B2 (en) | 2003-02-14 | 2010-06-29 | Akari Inada | Nephropathy-associated gene |
US7304162B2 (en) | 2003-02-21 | 2007-12-04 | Intrexon Corporation | Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
KR100523028B1 (ko) * | 2003-02-27 | 2005-10-20 | 윤채옥 | 개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 |
WO2004076657A2 (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-10 | Mcgill University | Cell and enzyme compositions for modulating bile acids, cholesterol and triglycerides |
EP2006298A3 (en) | 2003-04-15 | 2009-04-22 | Xenon Pharmaceuticals Inc. | Juvenile hemochromatosis gene (HFE2A), expression products and uses thereof |
FR2853911B1 (fr) * | 2003-04-17 | 2005-07-08 | Merck Sante Sas | Gene induit par l'insuline, comme cible therapeutique dans le diabete |
US20050054826A1 (en) * | 2003-05-19 | 2005-03-10 | Rosetta Inpharmatics Llc | Human diaphanous-3 gene and methods of use therefor |
US20050069918A1 (en) * | 2003-05-29 | 2005-03-31 | Francois Claret | JAB1 as a prognostic marker and a therapeutic target for human cancer |
JP2006526986A (ja) | 2003-06-06 | 2006-11-30 | アストラゼネカ・アクチエボラーグ | 炎症性大腸炎の診断方法 |
WO2005002413A2 (en) | 2003-07-01 | 2005-01-13 | Bar Ilan University | Methods and reagents for diagnosing gliomas and treating gliomas |
US20060280725A1 (en) | 2003-07-02 | 2006-12-14 | Barrie Bode | Compositions and methods of treating and diagnosing hepatoma |
EP1646389B1 (en) | 2003-07-07 | 2008-09-10 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Pyrimidine-2,4-dione derivatives as gonadotropin-releasing hormone receptor antagonists |
US7556942B2 (en) * | 2003-07-15 | 2009-07-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tumor suppressor designated Hippo |
BRPI0413197A (pt) | 2003-08-01 | 2006-10-03 | Amgen Inc | cristal de eta wercept; método para fabricar um cristal de etanercept; composição; uso de um cristal de etanercept |
CA2535029C (en) * | 2003-08-07 | 2013-07-16 | Healor Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods for accelerating wound healing |
US9040676B2 (en) * | 2003-08-11 | 2015-05-26 | University Of South Florida | Vigilant cells |
JP4848276B2 (ja) * | 2003-08-19 | 2011-12-28 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 神経学的状態の検出および治療のための組成物および方法 |
WO2005033297A1 (en) * | 2003-09-19 | 2005-04-14 | The Rockefeller University | Compositions, methods and kits relating to reprogramming adult differentiated cells and production of embryonic stem cell-like cells |
SE526959C2 (sv) | 2003-10-02 | 2005-11-29 | Tikomed Ab | Bioartificellt implantat innefattande en semipermeabel barriär samt förfarande för reducering av risken för bildning av bindrväv vid implantatet efter implantering genom att barriären förses med en permeabel beläggning av bioaktiv metall |
US20050123538A1 (en) | 2003-10-03 | 2005-06-09 | Ronen Shemesh | Polynucleotides encoding novel ErbB-2 polypeptides and kits and methods using same |
US7482156B2 (en) | 2003-10-15 | 2009-01-27 | Cell Genesys, Inc. | Hepatocellular carcinoma specific promoter and uses thereof |
JP4411280B2 (ja) * | 2003-10-20 | 2010-02-10 | 帝人ファーマ株式会社 | 骨及び/又は関節疾患関連遺伝子 |
FR2863275B1 (fr) | 2003-12-09 | 2007-08-10 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein |
TWI398261B (zh) | 2003-12-17 | 2013-06-11 | Alcon Inc | 血清類澱粉a基因於診斷及治療青光眼及鑑定抗青光眼劑上之用途 |
WO2005066363A2 (en) | 2004-01-09 | 2005-07-21 | Medigen Biotechnology Corporation | Cancer specific gene ccndbp1 |
FR2866349B1 (fr) | 2004-02-12 | 2008-05-16 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic/pronostic d'une thrombose |
US20070053845A1 (en) * | 2004-03-02 | 2007-03-08 | Shiladitya Sengupta | Nanocell drug delivery system |
WO2005084109A2 (en) * | 2004-03-08 | 2005-09-15 | Medigen Biotechnology Corporation | Cancer specific gene mh15 |
US7582442B2 (en) * | 2004-03-16 | 2009-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2 |
US7935510B2 (en) | 2004-04-30 | 2011-05-03 | Intrexon Corporation | Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system |
WO2005116189A2 (en) | 2004-05-06 | 2005-12-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and use of inflammation-20 (inf-20) gene |
NZ551447A (en) | 2004-05-18 | 2010-08-27 | Intrexon Corp | Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids |
US7704714B2 (en) * | 2004-07-26 | 2010-04-27 | Agency For Science, Technology & Research | Encapsulation of cells in biologic compatible scaffolds by coacervation of charged polymers |
US20060070134A1 (en) * | 2004-08-12 | 2006-03-30 | Tin Tin Su | Diagnosis and treatment of fanconi's anemia |
US7332294B2 (en) * | 2004-08-17 | 2008-02-19 | University Health Network | CXCL10-based diagnosis and treatment of respiratory illnesses |
US20060067942A1 (en) * | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Salama Zoser B | Pharmaceutical agent comprising amino acids, peptides, proteins and/or fractions and fragments thereof and the use of same in the prophylaxis and treatment of immune system deficiency in humans and animals |
US7629325B2 (en) | 2004-10-11 | 2009-12-08 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Human Sef isoforms and methods of using same for cancer diagnosis and gene therapy |
US20060228776A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-10-12 | Neurologix, Inc. | PINK-1 promoter |
RU2394036C2 (ru) | 2004-12-20 | 2010-07-10 | Вайет | Аналоги рапамицина и их применение при лечении неврологических, пролиферативных и воспалительных заболеваний |
MX2007007409A (es) | 2004-12-20 | 2007-07-12 | Wyeth Corp | Derivados de rapamicina y los usos de los mismos en el tratamiento de trastornos neurologicos. |
US9034650B2 (en) | 2005-02-02 | 2015-05-19 | Intrexon Corporation | Site-specific serine recombinases and methods of their use |
US20060194235A1 (en) | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Jian-Wei Chen | HLJ1 gene expression |
US7868159B2 (en) * | 2005-06-23 | 2011-01-11 | Baylor College Of Medicine | Modulation of negative immune regulators and applications for immunotherapy |
US20070037194A1 (en) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Vanderbilt University | Allelic variation in the serotonin transporter (SERT) as an indicator of autism |
US20070036770A1 (en) * | 2005-08-12 | 2007-02-15 | Wagner Darrell O | Biologic device for regulation of gene expression and method therefor |
US7576191B2 (en) * | 2005-09-13 | 2009-08-18 | Vanderbilt University | Tumor suppressor Killin |
US9265814B2 (en) * | 2005-12-30 | 2016-02-23 | Neurotech Usa, Inc. | Micronized device for the delivery of biologically active molecules and methods of use thereof |
MX363066B (es) | 2007-05-29 | 2019-03-07 | Intrexon Corp | Ligandos quirales de diacilhidrazina para modular la expresion de genes exogenos por medio de un complejo receptor de ecdisona. |
CA2698212A1 (en) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Intrexon Corporation | Methods and compositions for diagnosing disease |
AU2008307643B9 (en) | 2007-09-28 | 2014-04-17 | Intrexon Corporation | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
HUE024479T2 (en) * | 2007-10-08 | 2016-01-28 | Intrexon Corp | Genetically altered dendritic cells and uses for cancer treatment |
MX340972B (es) | 2008-10-08 | 2016-08-02 | Intrexon Corp | Celulas manipuladas por ingenieria que expresan multiples inmunomoduladores, y uso de las mismas. |
ITUA20162720A1 (it) | 2016-04-19 | 2017-10-19 | Risco Spa | Apparecchiatura per preparare un prodotto alimentare |
-
2008
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2010
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2019
- 2019-04-22 US US16/390,434 patent/US20190343967A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050191659A1 (en) * | 1998-05-05 | 2005-09-01 | Richard Voellmy | Molecular regulatory circuits to achieve sustained activation of genes of interest by a single stress |
US20060020146A1 (en) * | 2003-02-28 | 2006-01-26 | Hormann Robert E | Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex |
US20070087346A1 (en) * | 2003-10-24 | 2007-04-19 | Gennaro Ciliberto | Orthogonal gene switches |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BioTechniques, Vol.39, pp.191-200(2005.08.)* * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2008307643B2 (en) | 2014-03-27 |
BRPI0817233A2 (pt) | 2012-11-06 |
US20160114059A1 (en) | 2016-04-28 |
US20090136465A1 (en) | 2009-05-28 |
WO2009045370A3 (en) | 2010-04-22 |
EP2205249A2 (en) | 2010-07-14 |
JP2010540534A (ja) | 2010-12-24 |
US20180126007A1 (en) | 2018-05-10 |
IL204731A0 (en) | 2010-11-30 |
NZ584848A (en) | 2012-09-28 |
EP2205249B1 (en) | 2018-11-07 |
WO2009045370A2 (en) | 2009-04-09 |
US20190343967A1 (en) | 2019-11-14 |
US9724430B2 (en) | 2017-08-08 |
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KR101666228B1 (ko) | 2016-10-13 |
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US10314926B2 (en) | 2019-06-11 |
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