KR20010086587A - 유전자 요법에 의한 염증성 세포의 자기-조절된 고사 - Google Patents

유전자 요법에 의한 염증성 세포의 자기-조절된 고사 Download PDF

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바톤랜달더블유.
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데이비드 이. 프랭크하우저
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Abstract

본 발명은 키메라 핵산 및 활성화된 염증성 세포, 또는 염증부위에 있는 세포로 키메라 핵산을 도입하여, 그들 세포에서 고사를 치료적으로 유도하는 것에 관한 것이다. 기능적 카피의 TNFα 프로모터에 결합되는 적어도 하나의 TNFα 프로모터 인핸서를 갖고 3'UTR에 추가로 결합되는, 적어도 한 카피의 고사-유도 유전자에 추가로 결합되는 키메라 핵산. 고사-유도 유전자는 그랜자임 B이다. 본 발명은 또한 자기-조절된 고사 키메라 핵산을 제조하고 이용하는 방법 및 그들을 함유하는 염증성 질환을 치료하기위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

유전자 요법에 의한 염증성 세포의 자기-조절된 고사{Self-regulated apoptosis of inflammatory cells by gene therapy}
많은 염증성 상태에서, IL-1β, IL-10, GM-CGF 및 TNFα와 같은 사이토카인이 덩어리 응집 및 염증성 세포의 축적 결과 과도하게 생산된다(Brennan F.M 등, British Medical Bulletim 1995, 51/2, 368-384). 염증조직에서 사이토카인의 상향조절 및/또는 이상조절은 만성 염증성 질환 악화의 직·간접적인 원인이 될 수 있다. 예를들어, 류마티스성 관절염(RA)에서 가장 두드러진 병변은 염증의 국소부위(즉, 활액분비 관절)에서 나타난다. 따라서, RA 환자의 활액분비 관절에서 생산된 사이토카인은 질환과정에서 중요한 역할을 하는것 같다. 그들 사이토카인중, IL-1β 및 TNFα가 RA에 특징적인 파괴적인 연골파괴 및 골침식의 원인이 되는 것으로 믿어진다(Dayer J.M. 등, J. Exp. Med., 1985, 162, 1208-1215; Gowen M. 등, Nature, 1983, 306, 378-380). 활액분비 관절에서 과량의 IL-1β 및 TNFα의 존재는 설치류에서 콜라겐-유도된 관절염의 진전을 가속화시키는 것으로 나타났다(Brennan F.M. 등, Clin. Expt. Immunol., 1994, 97/1, 1-3).
고사는 배발생 및 조직항상성 유지를 위한 기본적인 생리과정이다(Raff, M.C. Nature, 1992, 356, 397; Vaux, D.L. 등, Cell, 1994, 76, 777). 이 결정적인 자연과정에서의 불일치는 다양한 종양, 신경변성 및 자가면역 질환의 특징이다(Thompson, C.B., Science, 1995, 267, 1456). 신호전달 캐스캐이드를 포함하는, 생화학적 속성은 다소 복잡하고 완전히 이해되지않고 있다. 특이적인 수용체, 예를들어 몇몇 신호성분을 포함하는 TNFR1 또는 Fas 유발 진화상 보존된 수행 기구의 활성화를 포함하는 다양한 자극은 세포사멸을 유발하도록 조정된다(Ashkenazi, A. 및 Dixit, V.M., Science, 1998, 181, 1305).
그랜자임(Granzyme) B는 세포독성 T 림프구 및 자연 킬러 세포의 세포질 입자에서 주로 발견되는, 세린 프로테아제이다. 그랜자임 B는 세포독성 세포 매개된 살해에 의해(Huesel J.W. 등, Cell, 76, 977-987, 1994; Shi, L. 등, J. Exp. Med. 176, 1521-1529, 1992), 부분적으로 몇몇 캐스파제의 절단 및 활성화에 촉매작용을 함으로써(Salvesen, G.S. 및 Dixit, V.M., Cell, 91, 443-446, 1997) 또한 캐스파제 비의존적 경로에 의해(Andrade, F 등, Immunity 8, 451-460, 1998) 표적세포에서 고사성 변화를 유도하는데 중요한 역할을 한다. 구조적으로, 그랜자임 B는 활성 그랜자임 B 폴리펩타이드로부터 불활성화 디-펩타이드(Gly-Glu)에 의해 분리된 리더 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드로서 생성된다. 캐스파제와 같이, 그랜자임 B는 절단을 위해 아스파르트산에서 특이적으로 기질을 인지한다.
TNFα는 활성화에 반응하여 단핵세포, 마크로파지 및 림프구에 의해 주로 합성되는, 사이토카인이다. 그의 발현을 지배하는 표준적인 요소는 기부 또는 말단부 프로모터 부위에 위치한다(Pauli, U. Critical Rev. in Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344에서 검토됨). TNFα 프로모터 활성에 중대한 역할을 하는 것으로 기재된 부위를 이하 요약한다:
a) TNFα-반응성 요소는 염기쌍 -100 내지 -125사이에 위치하는 것으로 나타났다. 부위 -108 내지 -101 bp는 PMA-반응성 요소를 함유하는 AP-1 서열과 유사한, 회문, TGAGCTCA를 함유한다. 다중 카피의 -125 내지 -85 bp는 리포터 유전자 발현이 7 내지 11 배 유도되게 한다(Leitman, D 등, J. Biol. Chem, 266, 9343, 1991).
b) PMA-반응성 요소는 -101 내지 -286 염기쌍사이에 존재하는 것으로 나타났다(Hensel, G 등, Lymphokine Res. 8, 347, 1989).
c) 항-CD3 항체-유도된(또한 Ca-이오노포어-유도된) 반응성 요소는 -118 내지 -80 염기쌍사이에 있는 것으로 나타났다. 이 부위의 KappaB3(GGGTTTCTCC) 서열은 Ca-이오노포어에 의한 TNFα 프로모터의 CsA-감수성 활성화를 위해 매우 중요하다. 이들 요소는 그들 자신의 프로모터의 컨텍스트에서 최적의 기능을 하는 것으로 제안되어 있다(Goldfield 등, J. Exp. Med. 178, 1356, 1993).
d) U937 세포에서, PMA 반응성 요소는 -95 내지 -36 bp사이에 위치하고 cAMP-반응성 요소(CRE)는 -107 내지 -99 bp 위치에 맵핑된다. 이 부위는 PMA에 반응하지 않는다(Economou, J.S. 등, J. Exp. Med. 170, 321, 1989).
e) 모든 세 개의 카파B 위치[즉, 카파B1(-587 내지 -577), 카파B2(-210 내지 -202) 및 카파B3(-98 내지 -87)]는, 비록 이들 위치의 결실이 바이러스 유도성에 영향을 미치지는 않으나, 바이러스-유도성 단백질과 결합하였다(Goldfield, A 등, PNAS, 87, 9769, 1990). 더욱이, 카파B 위치의 결실 돌연변이는 그들이 인간 TNFα 유전자의 PMA 자극에 대한 일차 표적이 아님을 보여준다(Goldfield, A 등, J. Exp. Med. 174, 73, 1991).
f) 쥐 시스템에서, TNFα 프로모터 작제물(construct) -1059, -695 및 -655 bp는 강한 LPS 유도성이다. 이 LPS-유도성은 -451 bp 작제물 및 추가로 -301과 -241 bp사이에서 크게 감소되었다. TNFα 프로모터의 -1059 bp 단편은 마크로파지에서 발현되지 않았고 LPS 자극후 강하게 발현되었다. 활성화의 가장 큰 감소는 쥐 TNFα 프로모터에서 카파B 요소를 함유하는, -695 내지 -655 bp에서였다(Shakhov, A.N. 등, J. Exp. Med., 1990, 171, 35; Drouet, C 등, J. Immunol., 1991, 147, 1694).
TNFα 유전자의 3' 비번역 부위(3'UTR)에 있는 요소는 전사후 조절에 중요한 것으로 알려져있다. 3'UTR의 영향분석이 상동적 프로모터와 결합하여, LPS 유도성이 매우 강한, 쥐 시스템에서 이루어졌다. 쥐 TNFα 프로모터 시스템을 이용하여, 3'UTR이 세 개의 비-마크로파지 세포주, 즉 HeLa, NIH3T3 및 L929에서 CAT 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다. 서열 TTATTTAT는 3'UTR에서 몇차례 반복되었고 조절에 관여하는 것으로 제안되었다(Han, J. 등, J. Immunology, 1991, 146, 1843-1848; Crawford, F.K. 등, J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390).
다양한 세포, 예를들어 활성화된 마크로파지, 활성화된 T 세포, 마크로파지양 활막세포(synoviocytes) 및 섬유아세포양 활막세포, 및 형질전환된 마크로파지양 활막세포(판노사이트(pannocyte)라고도 함)가 염증성 관절에 존재한다. 판누스(pannus)라 불리는, 침투성 구조는 활막세포 및 판노사이트의 과형성 성질로부터 유래한다. 판누스는 세포의 과도한 증식 및/또는 이들 세포에서 고사 감소로부터 기인할 수 있다. 이들 세포에서 증식 지수는 비교적 낮은 것으로 나타났다. 따라서, 활막세포에서 과형성은 활막 내막의 고사 이상에 기인할 수 있다. 최종단계 고사에 있는 세포의 빈도가 활막에서는 낮다. 고사에 대한 내성을 일으키는 p53 돌연변이 이상이 RA 활액분비 섬유아세포에서 보고된다. 또한, TNFα 및 IL-1β와 같은 과량의 전(pro)-염증성 사이토카인이 마크로파지계, 마크로파지양 활막세포, 활성화된 T-세포 및 가능하게는 섬유아세포양 활막세포를 포함하는, 연골-판누스 접합부의 다양한 세포 타입에 의해 활막조직에서 생산된다(Chu C.Q. 등, Arthritis & Rheumatism, 1991, 34, 1125-1132; Deleuran B.W. 등, Arthritis & Rheumatism, 1992, 35, 1170-1178). 이것은 활막세포 증식의 원인이 되는, 염증성 세포의 침윤 및 더많은 전-염증성 사이토카인의 생산을 지속시킨다. 상기한 염증성 효과이외에, TNFα는 다양한 전-염증성 사건에 편재하는 결정적인 역할을 한다.
TNFα는 단핵세포에서 IL-1β 활성을 유도한다. 실제로, 항-TNFα 중화 항체는 총 IL-1β 생성을 감소시키는 것으로 나타났다(Portillo 등, Immunol., 1989, 66, 170-175; Brennan F.M. 등, British Medical Bulletin 1995, 51/2, 368-384). 따라서, 염증성 사이토카인 TNFα의 효과를 차단하는 부가적인 잇점은 동등하게 파괴적인 전-염증성 매개체, IL-1β 생성의 감소이다. 더욱이, TNFα는 다른 염증-관련 유전자의 전사 활성제인 것으로 잘 알려져있다. 예를들어, TNFα의 존재는 활막염증 및 과형성, 및 궁극적으로 연골 및 뼈의 파괴 강화를 일으키게되는, 활성화된 T 세포 및 호중구의 보강을 지속시키는(Allen J.B., J. Exp. Med., 1990, 171, 231), 다른 사이토카인(GM-CSF와 같은) 및 HLA 클래스 Ⅱ 항원 및 부착분자를 포함하는, 세포표면 수용체의 생산을 촉진한다(Alvaro-Garcia J.M. 등, J. Exp. Med. 1989, 146, 865-875).
염증성 질환에 대한 통상적인 요법은 전형적으로 증상적 염증에 대한 것이다. 그러한 요법은 질병 진전을 크게 지연시키지 않으면서 단지 일시적인 경감만을 제공한다. 반대로, TNFα 및 염증 과정에서 유도된 다른 인자를 표적으로 하는 요법이 더 유망할 것같다. 예를들어, 콜라겐-유도된 관절염 동물모델에서, 항-TNFα 항체 및 가용성 TNFα 수용체-IgG 키메라는 발부종, 관절접촉 및 연골 및 뼈파괴를 효과적으로 감소시켰다(Williams R.O 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 9784-9788). 인간화 항-TNFα 항체 및 TNFα 수용체-IgG 키메라 분자를 사용한 인간시험이 극적인 결과를 낳았다(Elliot M.J., Arthritis and Rheumatism, 1993, 36, 1681-1690; Elliot M.J. 등, Lancet, 343, 1105-1110). 비록 이들 TNFα 길항제로의 치료를 잘 견디는 것처럼 보이더라도, 그것은 또한 재조합 단백질에 대한 항체 생산을 일으킨다. 따라서, 이들 치료법은 장기간 치료에 적당하지 않을 수 있고 진정한 질병완화를 이루지는 못한다.
WO 97/07828은 결손 고사-조절 유전자, 더 구체적으로 p53의 결과인 세포 축적 또는 만성 염증성 질환을 가진 환자를 유전자 요법에 의해 치료하는 방법을 개시하고 있다. 고사-조절성 유전자 발현을 조종하는 프로모터에 연결된 야생형 유전자로의 치료가 결손을 회복시킨다.
질병의 진전을 실제로 변형시키기 위하여, TNFα는 TNFα-특이적 치료법을 이용하여 계속적으로 표적화되어야만 한다. 그러한 연속적인 치료 프로토콜은 이들 생물학적 시약으로 수행될 수 없으며 장기간동안 투여되기 어렵다.
대체 치료사양에서, 염증 활막이 외과적(Herold N. 및 Schroder H.A., Acta Orthop. Scand., 1995, 66, 252-254; Ogilvie-Harris D.J. 및 Weisleder L., Arthroscopy, 1995, 11, 91-95), 화학적(Cruz-Esteban C. 및 Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801) 또는 방사선-유도된 활막절제술(Cruz-Esteban C. 및 Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol., 1995, 9, 787-801)을 이용하여 제거될 수 있다. 최소한의 양호한 결과가 관절경 수술에 뒤따른다. 비-외과적 활막절제술은 오스뮴산, 질소 머스타드 및 티오테파와 같은 알킬화제, 메쏘트렉세이트와 같은 다양한 화학시약을 이용하여 수행된다. 불행히도, 비-외과적 활막절제술(화학적 및 방사선-유도된 것을 포함)은 과정이 복잡하고, 단지 짧은 기간의 경감만을 제공하며, 단지 활막과형성의 불균일한 감소만을 나타낸다. 더욱이, 대부분의 비-외과적 대체물은 잠재적 기형유발물질이다. 게다가, 선천적 염증반응이 화학적 또는 외과적 개재로부터 발생되는 조직손상과 공존한다. 결국, 이들 접근법은 입원 및 회복의 비용과 불편을 포함하는, 통상적인 약물학적 요법과 침입적 외과과정에 공통적으로 관련된 위험 및 부작용을 겪는다.
따라서, 일박적으로 특히 RA에서 염증성 질환을 치료하기위한 효과적인 치료적 접근에 대한 요구가 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 TNFα 생산세포의 신규한 고사 유도된 파괴에 관한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서 본 발명의 목적은 차례로 3'UTR 핵산 서열에 추가로 결합되는 그랜자임 B 단백질 또는 그의 보존적 치환체(conservative substitutions) 또는 대립형질 변이체(allelic variants)를 암호화하는 핵산 서열에 추가로 결합되는, TNFα 프로모터에 결합된 적어도 하나의 TNFα 프로모터 인핸서(enhancer) 부위(핵산 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체)를 갖는 독특한 키메라 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 TNFp-AIG 등 키메라 핵산 작제물, 그의 제조방법, 그의 이용방법, 및 그를 함유하는 제제를 제공하는 것이다.
여기에 기재된 키메라 핵산 분자를 갖는 약제학적 유효량의 조성물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하여 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이 추가의 목적이다.
또한 TNFp-AIG 키메라 핵산으로 형질감염된 세포에서 고사를 유도하는 방법, 집단에서 TNFα 비-생산 체세포 변이체를 인 비트로에서 선별하는 방법, TNFα 비-생산 집단 발생의 원인이 되는 우성/부(負)(negative) 유전자를 확인하는 방법 및 TNFα 생산 조절을 담당하는 산물을 확인하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.
이들 및 다른 목적은 하기 본 발명의 상세한 개시에 기초하여 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
본 발명은 분자생물학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 염증성 세포에서 고사(apoptosis)(예정된 세포사멸 또는 비괴사성 세포사멸)를 유도하는 유전자를 그들 세포로 도입하여 이들 세포에서 고사를 유도하는 것에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 핵산의 도식도이다. 고사 유도 유전자(AIG)는 그랜자임 B이다.
도 2는 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 핵산을 이용하는 유전자 요법의 결과를 나타내는 도식도이다.
도 3은 리포터 시스템으로서 루시페라제 유전자(Luc) 발현을 이용하는 TNFα 프로모터의 유도성 시스 요소의 확인에 사용되는 결실 작제물의 요약이다.
도 4(a)는 일시적으로 형질감염된 Jurkat 세포에서 TNFα 프로모터의 결실 작제물에 의해 조종된 루시페라제 유전자의 발현을 측정하기 위해 수행된 대표적 실험결과를 나타낸다. 히스토그램은 활성화제 PMA에 의한 유도성의 척도로서 자극 지수를 나타낸다.
도 4(b)는 일시적으로 형질감염된 THP-1 세포에서 TNFα 프로모터의 결실 작제물에 의해 조종된 루시페라제 유전자의 발현을 측정하기 위하여 수행된 대표적 실험결과를 나타낸다. 히스토그램은 활성화제 LPS에 의한 유도성의 척도로서 자극 지수를 나타낸다.
도 5는 TNFα 프로모터 및 그랜자임 B의 선별된 본래의 요소를 이용하여 TNFpGB를 제조하는 흐름도이다.
도 6(a 및 b)은 키메라 TNFp-그랜자임 B(TNFpGB)의 발현을 보기위하여 수행된 대표적 실험결과의 요약을 제공한다. TNFpGB 작제물의 다양한 클론의 발현은 일시적-형질감염된 Jurkat 세포(도 6a)에서 발현된다. 그랜자임 B의 발현은 항 그랜자임 B 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석에 의해 측정되었다. 형질감염된 세포에서 그랜자임 B를 나타내는 밴드를 화살표로 표시하였다. TNFpGB 키메라 핵산의 발현에 의한 고사 유도는 Jurkat 세포에서 일시적 형질감염에 의해 측정되었다(도 6b). 고사는 세포 사멸 ELISA에 의해 평가되었다. 양 실험에서, 희박한 점들을 갖는 히스토그램은 세포가 나타낸 키메라 핵산으로 형질감염되고 형질감염된 세포가 PMA로 자극되지 않은, 비-자극된 대조군을 나타낸다. 조밀한 히스토그램은 대조 형질감염체(-1005Luc3'UTR로 형질감염됨) 또는 그랜자임 B를 발현하는 키메라 핵산에서, PMA로의 자극후 고사 유도를 나타낸다.
도 7(a 및 b)은 차례로, AIG의 발현을 조종하는 TNFα 프로모터의 유도성 시스 요소의 다중 카피를 포함하는, 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 핵산의 도식도이다(도 7a). TNFα 유전자의 3' 비번역 부위(TNF3'UTR)의 하부, AIG의 발현을 조종하는, TNFα 프로모터의 유도성 시스 요소의 다중 카피를 포함하는, TNFpAIG 키메라 핵산의 도식도(도 7b). TNFα 유전자의 3'UTR은 TNFα의 유도성 발현 조절에 관련되어있다(Han, J. 등, J. Immunology, 1991, 146, 1843-1843, Crawford, E.K., 등, J. Biol. Chem., 1997, 272, 21120-21137, 및 도 9).
도 8(a 및 b)은 TNFα 슈퍼-프로모터-그랜자임 B 키메라 작제물을 제조하는 계획의 흐름도이다.
도 9는 루시페라제 리포터 유전자의 유도성 발현에 대한 TNF3'UTR의 조절효과를 나타내는 두 실험 결과의 요약을 나타낸다. 일시적 형질감염은 섬유아세포주에서 수행되었다. 점으로된 히스토그램은 TNF3'UTR 부재하에서 TNFpLuc의 유도성을 나타내고 조밀한 히스토그램은 TNF3'UTR 존재하에서 TNFpLuc 유도성을 나타낸다. 유사한 결과가 Jurkat 세포에서 얻어진다.
도 10은 TNFα-생산 세포 집단내에서의 TNFα 비-생산 체세포 변이체 선별과 TNFα 생산 저해를 담당하는 우성 부 억제 유전자 확인의 도식도이다.
도 11(a)는 TNFα 프로모터의 확인된 인핸서 부위(ER) ER1(서열번호 4), ER2(서열번호 5), ER3(서열번호 11) 및 ER4(서열번호 12) 및 본래의 -120 TNFα 프로모터의 상부에 상기 ER의 두 카피 삽입의 도식도이다.
도 11(b)는 5' 말단에 두 카피의 인핸서 부위 ER1, ER2, ER3 및 ER4가 결합된, 본래의 -120 TNFα 프로모터에 의해 조종되는 루시페라제 유전자의 발현을 측정하기 위하여 수행된 실험결과를 나타낸다. 루시페라제 유전자의 발현을 조종하는 작제물은 일시적으로 형질감염된 Jurkat 세포에서였다. 히스토그램은 활성화제 PMA에 의한 유도성의 척도로서 자극 지수를 나타낸다. Jurkat 세포는 PMA로의 자극후 TNFα를 생산한다.
도 11(c)는 두 카피의 인핸서 부위 ER1, ER2, ER3 및 ER4가 5'말단에 결합된, 본래의 -120 TNFα 프로모터에 의해 조종되는 루시페라제 유전자의 발현을 측정하기 위하여 수행되는 실험결과를 나타낸다. 루시페라제 유전자의 발현을 조종하는 작제물은 일시적으로 형질감염된 THP-1 세포에서였다. 히스토그램은 활성화제 LPS에 의한 유도성의 척도로서 자극 지수를 나타낸다. THP-1 세포는 LPS로의자극후 TNFα를 생산한다.
도 12는 프로모터 단편 서열은 소문자 알파벳으로 표시되고, 링커 단편 서열은 대문자 이탤릭 알파벳으로 표시되며, 그랜자임 B 단편 서열은 대문자 알파벳으로 표시되고, TNFα3'UTR 단편 서열은 소문자 밑줄친 알파벳으로 표시된, 키메라 핵산 -706TNFpGB3'UTR 서열의 묘사도이다.
도 13은 프로모터 단편 서열은 소문자 알파벳으로 표시되고, 링커 단편 서열은 대문자 이탤릭 알파벳으로 표시되며, 그랜자임 B 단편 서열은 대문자 알파벳으로 표시되고, TNFα3'UTR 단편 서열은 소문자 밑줄친 알파벳으로 표시된, 키메라 핵산 -1005TNFpGB3'UTR 서열의 묘사도이다.
여기에 기재된 발명은 치료용 조성물에 사용하기 위한 신규한 키메라 핵산 분자 및 그러한 조성물의 이용방법을 제공하여 당해 분야에서의 단점을 극복한다. 조성물은 이들 세포의 파괴를 유발하는 TNFα 생산세포에서 고사를 선별적으로 유도하는 것에 관한 것이다.
여기서 사용된, 약자 3'UTR은 3' 비번역 부위를 의미한다.
약자 "AIG"는 고사 유도 유전자를 나타낸다. AIG는 그랜자임 B를 포함한다.
약자 "CsA"는 사이클로스포린 A, 면역억제 성질을 갖는 생물학적 활성 곰팡이 대사물을 나타낸다.
약자 "DN"은 기타 유전자 또는 유전자 산물의 발현 또는 기능에 대해 부정적 영향을 미치는 우성/부 유전자 산물을 나타낸다.
약자 "ER"은 인핸서 부위를 나타내고, ER1은 서열번호 4, ER2는 서열번호 5, ER3는 서열번호 11, 및 ER4는 서열번호 12를 나타낸다.
약자 "GB"는 그랜자임 B를 나타낸다.
약자 "PMA"는 포볼 미리스테이트 아세테이트를 나타낸다.
약자 "RA"는 류마티스성 관절염을 나타낸다.
약자 "TNFα"는 종양괴사인자 알파를 나타낸다.
용어 "TNF 프로모터", "TNFα 프로모터" 및 "TNFp"는 여기서 교체되어 사용된다. 달리 언급되지 않으면, 이들 용어는 자연적으로, 타고나거나, 실험실에서 유전적으로 조작된, 하나 이상의 상부 인핸서 요소에 결합된 본래의 TNFα 최소 프로모터 서열에 대응하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
아미노산 "치환"은 일대일 아미노산 교체를 갖는 것으로 정의된다. 치환된 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 가질때 그들의 성질은 보존된다. 보존적 교체의 예는 루이신의 이소루이신 또는 발린으로의, 아스파테이트의 글루타메이트로의, 또는 트레오닌의 세린으로의 치환이다.
"보존적 변이체"는 폴리펩타이드에서 아미노산의 치환을 나타낸다.
"대립형질 변이체"는 동일 유전자의 대체 형태를 일으키는 보존적 또는 비-보존적 치환에 기인하는 핵산 또는 단백질 수준에서의 변이를 나타낸다.
"리포터" 분자는 핵산 또는 아미노산 서열을 표지하는데 사용되는 화학부위이다. 그들은 방사성뉴클라이드, 효소, 형광, 화학발광, 또는 발색제를 포함하지만, 제한되는 것은 아니다. 리포터 분자는 특정 핵산 또는 아미노산 서열과 관련되고, 그의 존재를 확립하고, 그의 정량을 가능하게할 수 있다.
"리포터 유전자"는 이종 프로모터의 활성을 측정하는데 사용될 수 있는, 루시페라제와 같은 기능적 단백질을 암호화하는 핵산 및 그 단편이다.
폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 유전자의 전사를 개시하거나 폴리펩타이드의 기능적 서브유닛을 암호화하기에 충분한 유전물질로서 사용될 수 있는, 더 소수의 뉴클레오타이드를 갖는 모든 또는 어느 부분의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 특정 염증성 질환에서 염증성 세포의 고사가 치료학적으로 유익하다는 증거에 기초하였다. 본 발명은 특히 유전자 요법에 의한 자기-조절된 고사에 관한 것이다. 넓게 말하면, 본 발명의 실시에 있어서, 염증성 세포에서 또는 염증부위의 세포에서 활성화된 유전자 또는 유전자의 결합인, 최소 프로모터의 적어도 하나의 기능적 카피에 결합된 적어도 하나의 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 핵산은 적어도 한 카피의 고사-유도 유전자(AIG)에 결합되어, AIG의 발현이 프로모터에 의해 조종되고, 따라서 염증성 세포를 표적화한다. 염증에서 활성화된 유도성 유전자의 프로모터는 TNFα 프로모터의 핵산서열 및 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 키메라 핵산은 직접, 가까운 부위, 또는 먼 부위의 결합, 및 그의 결합으로 인핸서, 프로모터, AIG 요소를 포함한다. 상기하고 이하 더 상세히 논의되는 바와 같이, 일부 예에서, 인핸서, 프로모터, 및/또는 AIG의 다중 카피가 최대한의 효과를 위해 사용되었다.
여기에 기재된 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 단지 설명 목적만을 위하여최소 TNFα 프로모터의 적어도 하나의 기능적 카피에 결합되고 추가로 AIG의 적어도 한 카피에 결합된 적어도 하나의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 핵산을 강조하면서, 이하 상세히 기재된다. 뒤따르는 실시예 또한 이들 타입의 작제물을 사용하지만, 여기에 기재된 기본 작제물은 감염부위에서 세포를 표적화하는데 사용될 수 있는 유사한 기능을 나타내는, 상기 열거한 타입과 같은 염증에서 활성화된 유도성 유전자를 포함하는 다른 프로모터를 이용하여 본 발명의 산물, 공정, 방법 및 조성물을 사용하는 다른 예들을 제공하도록 변형될 수 있음은 당업자들에 의해 예상될 것이다.
고사-유도 유전자(여기서 가끔 AIG로 언급됨)는 TNFα 프로모터(TNFp) 또는 염증에서 활성화된 기타 유도성 유전자에 의해 조종되었다. 일례에서, 고사는 TNFα를 생산할 수 있는 그들 세포에서 선별적으로 유도되었다. TNFp-AIG 또는 기타 키메라 핵산은 통상적인 유전자 요법 기술을 이용하여 인 비보에서 통상적으로 도입될 수 있다. 유리하게, 키메라 핵산이 TNFp-AIG인 예에서, 그것은 염증성 사이토카인, TNFα를 생산하는 그들 세포에서만 발현되었다. 또한, TNFp-AIG 키메라 핵산은 TNFα 프로모터 요소를 함유하므로, 그것은 또한 유도성, TNFp-선별적 전사인자를 격리시킨다. 그러한 격리는 TNFα의 내생적 생산을 감소시킨다. 본 발명은 특히 TNFp-AIG 및 유사 유전자 작제물, 키메라 핵산을 함유하는 세포, 키메라 핵산으로 형질감염된 세포에서 고사 유도방법, 키메라 핵산을 함유하는 약제학적 조성물, TNFα 생산 세포 집단내에서 TNFα 비-생산 체세포 변이체의 인 비트로 선별방법 등, TNFα 생산 저해를 담당하는 우성 부/우성 억제 유전자의 확인방법 및키메라 핵산을 이용하는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 예시적인 TNFp-AIG 키메라 핵산의 하기 논의를 명확히 하기위하여, 하기 서열이 설명된다:
서열번호 1은 공개된(Takashiba S. 등, Gene, 1993, 131, 307-308) 전장, 참조 인간 TNFα 프로모터 서열에 대응하는 핵산 서열이다. 여기에 사용된 뉴클레오타이드 번호는 이 서열의 번호를 나타낸다.
서열번호 2는 본 발명에서 사용된 유전자의 본래의 TNFα 프로모터 서열이다(전사 개시부위, TSS로부터 -1077 뉴클레오타이드). 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열에서 약간의 차이가 있다. TNFα 프로모터의 뉴클레오타이드 서열에서의 그러한 차이는 보고된 바 있다(Takashiba S. 등, Gene, 1993, 131, 307-308).
서열번호 3은 적어도 하나의 인핸서 요소(k3 부위)를 포함하는, 본래의 최소 TNFα 프로모터 서열(뉴클레오타이드 -120 내지 -TSS)이다; Pauli, U., Crit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344; Rhoades K.L. 등, J. Biol. Chem., 1992, 267, 22102-22107; 및 Takashiba S. 등, Gene, 131, 307-108).
서열번호 4는 뉴클레오타이드 -1005 내지 -905를 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 부위 1(ER1)이다.
서열번호 5는 뉴클레오타이드 -706 내지 -517을 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 부위 2(ER2)이다.
서열번호 6은 -120pGL3 작제물에서 -120 최소 TNFα 프로모터의 상부에서 유전적으로 조작된 부가적인 다중 클로닝 부위(MCS)이다.
서열번호 7은 TNFα 유전자의 3' 비번역된 부위(3'UTR)이다(Nedwin, G.E. 등, Nucleic Acid Research, 1985, 13, 6361-6373).
서열번호 8은 전장 그랜자임 B이다.
서열번호 9는 리더 펩타이드 및 불활성화 디-펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는, 절단된 그랜자임 B이다.
서열번호 10은 불활성화 디-펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 없지만, 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 함유하는, 전장 그랜자임 B이다.
서열번호 11은 뉴클레오타이드 -234 내지 -120을 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 부위 3(ER3)이다.
서열번호 12는 뉴클레오타이드 -234 내지 -65를 포함하는 TNFα 프로모터의 인핸서 부위 4(ER4)이다.
서열번호 13은 키메라 핵산 -706TNFpGB3'UTR이다.
서열번호 14는 키메라 핵산 -1005TNFpGB3'UTR이다.
본 발명에 따른 키메라 핵산 작제물을 제조하기위한 TNFα 프로모터 요소는 TNFα 프로모터에 의해 조종되는 치료 유전자의 발현을 유도할 수 있는 요소들로부터 선별되었다. 이들 프로모터 요소는 여기서 TNFα 프로모터의 "유도성 시스 요소", "시스-유도성 요소" 또는 "인핸서 요소"로 나타내어진다.
인핸서 요소는 최소 프로모터 서열에 물리적으로 결합되거나, 특유의 제한위치를 갖거나 갖지않을 수 있는 링커 서열에 의해 최소 프로모터로부터 분리될 수 있다. 따라서, 이상 요약한 바와 같이, 인핸서 요소는 직접적으로, 먼 부위에, 가까운 부위에, 또는 그의 어느 결합으로 본 발명의 키메라 핵산에 결합될 수 있다. 이들은 전형적으로 프로모터의 상부에서 제작된다. 예가 되는 TNFα 인핸서 요소를 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 11 및 서열번호 12에 나타내었고; 기능적 단편 또는 변이체 및 그의 결합을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 일부 바람직한 유전자 작제물은 인핸서 요소의 다중 카피, 즉, 2 이상의 카피를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예는 약 2 내지 25, 더 좁게는 2 내지 10, 더욱더 좁게는 2 내지 5 카피를 갖는다.
용어 "TNF 프로모터", "TNFα 프로모터" 및"TNFp"는 여기서 교체되어 사용된다. 달리 언급하지않는 한, 이들 용어는 하나 이상의 상부 인핸서 요소(자연적으로 존재하거나, 즉 타고나거나, 실험실에서 유전적으로 조작된)에 결합된 본래의 TNFα 최소 프로모터 서열에 대응하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 예들은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3, 및 기능적 단편, 변이체, 및 이들중 어느것의 혼합물을 포함하지만, 제한되는 것은 아니다. 이들 TNFα 서열의 많은 기능적 단편 및 변이체 및 여기에 기재된 다른 것들은 그들 본래의 또한 유전적으로 조작된 대응물에 대해 적어도 약 80%, 일부 경우 90% 이상의 서열상동성을 갖지만, 이들은 당업자에게 알려져 있고 여기에 인용된 참고문헌에서 정의된다.
본 발명은 TNFα 프로모터(TNFp)에 의해 조종되는 고사-유도 유전자(AIG)를 포함하는 키메라 핵산을 포유세포로 도입하는 단계를 포함하는 신규한 치료방법을 제공한다. 예가 되는 본 발명의 키메라 핵산은 서열번호 13 및 14에 기재되어 있다; 이들의 기능적 단편 또는 변이체도 사용될 수 있다. 이론에 구속되는 것을 원치않으면서, TNFp에 의해 제어된 결과, AIG는 염증성 사이토카인, TNFα를 생산하는 그들 세포에서만 발현되었다. 따라서, TNFα를 발현하는 모든 세포가 자기-파괴적인 반면, TNFα를 발현하지않는 세포는 영향을 받지 않는다. 유리하게도, 이 방법은 활성화된 마크로파지, 활성화된 T-세포, 마크로파지-양, 섬유아세포-양 활막세포 및 RA 관절에 존재하는 근원세포와 같은, 모든 TNFα-생산 세포를 표적화할 수 있다. 실제로, 표적화된 TNFα-생산 세포는 그 본래의, 비변형된 형태에서 고사 유전자를 정상적으로 운반 또는 발현하거나 하지않는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 핵산 및 방법을 이용하여, TNFα의 세포 출처는 고도로 선별적인 방법으로 파괴될 수 있다.
본 발명의 TNFp-AIG 키메라 핵산을 사용하는 또다른 장점은 TNFp가 내생적 TNFp에 의해 요구되는 전사인자를 격리시켜, 내생적인 TNFα 생산을 감소시키는 것이었다. 일례에서, TNFp는 치료학적으로 표적화된 세포에서 막대한 과량으로 존재하였다. 이것은 형질감염된 유전자의 다중 카피를 세포로 도입함으로써 성취될 수 있다. 대안으로, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 핵산은 TNFα 프로모터의 유도성 시스 요소의 다중 카피를 함유할 수 있다. 이상 언급한 바와 같이, TNFp의 "유도성 인핸서 요소"의 다중 카피는 본 발명의 TNFp-AIG 키메라 핵산의 일부 예에서 존재한다. TNFp 작제물의 유도성 시스 요소의 다중 카피를 포함함으로써, TNFα를 생산하기 위하여 형질감염된 세포에 의해 요구되는 전사인자는 외래로부터 도입된 서열에 의해 격리되었다. 이 바람직한 키메라 TNFp-AIG 작제물은 TNFp에 결합된 단일의 인핸서 요소만을 함유하는 본 발명의 키메라 핵산에 비하여 TNFp-특이적 전사인자에 대해 경쟁함에 있어 증가된 효과를 특징으로 하였다. 이 방법으로 제작된 "유도성 슈퍼 프로모터"는 (1) TNFα 특이적 유도성 전사인자에 대해 더 효과적으로 경쟁하고 (2) 다중 인핸서 요소에 의해 강화된 양식으로 고사 유도 유전자의 발현을 조종할 수 있었다.
류마티스성 관절염 환자에서, 활막절제술, 즉 활막조직의 제거는 임상적으로 유익한 것으로 나타났다. 통상적이고도 외과적인 활막절제술과 달리, 여기에 기재된 세포-표적화된 치료방법은 TNFα를 생산하는 세포만을 표적으로 한다. 따라서, 유리하게도, TNFp-AIG 키메라 유전자의 도입과 발현 및 잇따른 고사 유도는 염증성 반응을 유도하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 비교적 선별적이고 최소한의 조직손상 및 염증감소에 이르게 한다.
여기에 기재된 산물 및 방법은 기타 염증성 질환의 치료에도 유용하다. 그러한 염증성 질환은 다발성 경화증, 길레인-바르(Guillain-Barre) 증후군, 크론(Crohn's)병, 궤양성 결장염, 건선, 이식편 대 숙주 질환, 홍반성 루푸스, 인슐린-의존성 당뇨병, 건선성 관절염, 유육종증, 과민성 폐렴, 유착성 척추염 및 관련 척추관절증, 라이터(Reiter's) 증후군 및 전신성 경화증을 포함하지만, 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 핵산을 갖는 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 환자에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 고사는 본 발명의 적어도 하나의 키메라 핵산을 세포로 도입함으로써 환자의 염증성 세포 또는 염증부위의 세포에서 유도되었다. 이것은 전형적으로 본 발명의 적어도 하나의 키메라 핵산 및 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제조하고, 그 조성물을 당업자에게 알려진 표준방법을 이용하여 환자에게 투여하여 달성된다. 약제학적 조성물은 국부, 정맥내, 복강내, 및 유사방법을 이용하여 염증부위로 직접 전달될 수 있다. 추가의 방법은 이하 논의된다.
치료학적 적용이외에, 본 발명에 따른 키메라 핵산은 다양한 유용한 스크리닝 및 선별방법에 사용될 수 있다. 하나의 그러한 방법에서, TNFα 생산 세포집단내에서 TNFα 비-생산 체세포 변이체는 TNFα 생산 세포집단으로 TNFp-AIG 키메라 핵산을 도입하여 인 비트로에서 선별될 수 있다. TNFα를 생산하는 세포는 고사를 겪는다. TNFα를 생산하지않는 세포는 살아남는다. 생존 표현형을 갖는 그들 세포 변이체의 선별은 TNFα 비-생산 세포를 확인하는 쉬운 방법이었다. 그러한 선별방법은 TNFα 프로모터의 활성을 조절하기 위하여 트랜스로 작용하여, TNFα 생산을 감소시키는 유전자의 발현을 결정하는데 사용될 수 있다. 그러한 유전자는 다른 시스템에서 우성 부(DN)/우성 억제 유전자로서 특징지워졌다(Behrends S. 등, J. Biol. Chem. 1995, 270, 21109-21113; Zhang S. 등, J. Biol. Chem., 1995, 270, 23934-23936; Watowich S.S. 등, Mol. Cell Biol., 1994, 14/6, 3535-3549).
추가의 인 비트로 방법에서, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 핵산은 TNFα 비-생산 세포집단의 생성을 담당하는 우성 부 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다. 본 방법에 따르면, 본 발명에 따른 TNFp-AIG 키메라 핵산은 TNFα를 생산하는 세포로 도입되었다. 우성 부 유전자의 존재를 막으면서, 그들 세포는 활성화시 고사를 겪어야만 한다. 따라서, 살아남은 변이체는 TNFα 생산을 하향-조절할 수 있는 우성 부 유전자를 갖는 것으로 유추될 수 있다. 우성 부 유전자는 cDNA 라이브러리를 제조하고 세포주를 형질감염시켜 쉽게 확인될 수 있다(예를들어, Jurkat 및 THP-1). 이들 세포는 유도성 TNFp-AIG 키메라 핵산 또는 TNFp-루시페라제 유전자의 안정한 형질감염체이다. TNFp-AIG 형질감염된 세포는 인 비트로 활성화후 생존 표현형에 대해 선별될 것이다; 생존 표현형은 DN 유전자 영향의 지표였다. TNFp-루시페라제 유전자로 형질감염된 세포에서, 루시페라제 활성의 감소는 DN 유전자 영향의 지표일 것이다. 이 프로토콜을 이용하여 확인된 우성 부 유전자는 그 자체로 미래의 치료제로 사용될 수 있다. 그러한 유전자는 TNFα 생산을 감소시키기 위한 유전자 요법의 후보일 것이다.
유전자 전이에 사용된 방법들은 두 넓은 카테고리로 분류되었다:
1. 직접 접근법: 치료 유전자의 담체로서 적당한 벡터를 이용하는 활막세포와 같은 표적 세포로의 치료 유전자의 인 시튜 형질도입. 치료 유전자를 함유하는 벡터는 환부(예를들어, 관절염에 걸린 관절)로 직접 주사되었다.
2. 간접 접근법: 활막세포와 같은 표적세포로의 치료 유전자의 엑스-비보 형질감염. 이 접근법에서, 활막을 관절로부터 제거하고, 활막세포를 분리하여 인 비트로에서 배양하였다. 인 비트로 배양된 세포를 치료 유전자로 형질감염시키고, 유전적으로 변형된 활막세포를 활막으로 재이식하였다.
인 비보 전이를 위해, 몇몇 벡터를 유전자 전달에서의 그들의 효능에 대해 평가하였다(Nita 등, Arthritis & Rheumatism, 1996, 39/5, 820-828).
유전자 요법에 사용되는 벡터중에서, 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가가장 잘 개발되어있다. 그들은 숙주 게놈에 유전물질을 삽입하고 안정한 형질감염체를 생산할 수 있었다. 이들 벡터는 그러나, 비-분열 세포를 감염시킬 수 없었고, 그들은 숙주 게놈으로 삽입되기때문에, 삽입 돌연변이의 가능성이 배제될 수 없다. 그에 비해, 아데노바이러스로부터 유래된 벡터는 분열 및 비-분열 세포를 감염시키고 DNA를 에피좀적으로(episomally) 전달한다. 아데노바이러스에 기초한 벡터의 단점은 이들 벡터가 감염된 세포에서 바이러스 단백질을 계속 생산하여 그들을 잠재적으로 항원적으로 만드는 것이다. 바이러스에 기초한 벡터의 제3 타입은 역시 분열 및 비-분열 세포를 모두 감염시킬 수 있는 허피스 심플렉스 바이러스(HSV)로부터 유래되었다.
비-바이러스 벡터 시스템중에서, 양이온성 리포좀 및 노출된 플라스미드 DNA가 평가되었다. 리포좀은 비록 근육 및 피부와 같은 특정 타입의 세포가 노출된 플라스미드 DNA를 획득하고, 보유하며 발현하더라도, 개발의 가장 진보적인 단계에 있다.
입자-매개된 유전자-전달 시스템 또한 가능하고(Rakhmilevich 등, PNAS, 1996, 93, 6291) 유망한 접근법이다.
하기 "인 비보" 유전자 전달 프로토콜은 본 발명의 키메라 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다:
(1) Nita 등, Arthritis and Rheumatism, 1996, 39, 820-823
토기의 인 비보 실험:
각각의 벡터를 하나의 무릎 관절로 관절내 주사하였다. 바이러스 벡터로,0.5 ㎖ 평형염 용액에 현탁된 108내지 109입자를 무릎마다 주사하였다. 1 ㎖ 평형염 용액내의 리포좀-DNA 복합체(20 ㎍의 DNA/㎖과 복합된 200 nmoles의 DC-Chol)를 무릎마다 주사하였다.
(2) 분자 의학에서의 방법: Gene Therapy Protocols, Paul Robbins, ed., 1997, Barr 등, 제205-212면
간세포로의 아데노바이러스-기초한 벡터 전달: 100 g 동물에 랫트 간세포 1×1011PFU.
개(12-17 ㎏)에서, 문정맥을 숙주 DNA의 이배체 카피당 1 아데노바이러스 게놈 카피를 제공하는 약 1.5×1011PFU/kg로 관류시켰다.
토끼(2-4 ㎏)에서, 1.5×1013바이러스 입자(약 1.5×1011PFU)는 100% 간세포 형질도입을 제공한다; 4×1012바이러스 입자는 50-75% 형질도입을 제공한다.
Yang N-S 등, 281-296
금입자-매개된 유전자 전달: 포유류 피부조직의 형질감염-0.1, 0.5, 1.0 및 2.5 ㎍의 DNA/㎎ 입자는 트랜스유전자 발현 수준과 선형적 관계를 제공한다.
Nabel 등, 297-305
인간에서 리포좀-매개된 유전자 전달:
프로토콜 1: 15 nmol DC-Chol/Dope 리포좀을 1 ㎍ DNA 0.7 ㎖에 배합하였다. 위 혼합물 0.2 ㎖을 환자의 흑색종 소결절로 주사하였다. 카테테르 전달을 위해,0.6 ㎖의 용액을 동맥으로 전달하였다,
프로토콜 2: 15 nmol DMRIE/Dope 리포좀을 5 ㎍ DNA 1.0 ㎖과 배합하였다.
직접적인 종양내 주사를 위해, DNA 농도는 4.5 nM DMRIE/Dope와 배합된 3 ㎍ 내지 450 nM DMRIE/Dope와 배합된 300 ㎍ 범위이다.
(3) Roessler 등, 369-374
활막세포로의 유전자 전달:
치료유전자/관절을 함유하는 용량 범위, 109-1012아데노바이러스 입자가 사용되었다. 그러나, 어느 특정 실험 시리즈를 위한 최적 용량은 실험적으로 결정될 필요가 있고 사용되는 재조합 아데노바이러스 게놈 백본과 발현되는 트랜스유전자의 성질에 의존하였다.
간접 접근법을 위해, 양이온성 지질 또는 양이온성 폴리머-기초한 형질감염 및 전기천공법을 포함한, 다양한 방법이 잘 확립되었다.
위에서 언급된 기술들중 어느 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자의 특정 필요에 부합하기 위하여 변화될 수 있다. 그러한 변형은 통상의 기술자가 갖는 기술 범위내에 있으며 과도한 실험을 요구하지 않는다. 이들 자명한 변화는 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 하기 실시예를 기재한다. 이들 실시예는 본 발명의 일부 바람직한 예를 설명하기 위한 것이고 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1
TNFp-그랜자임 B 작제물의 생산
TNF 프로모터의 인핸서 시스 요소에 의해 조종되는 키메라 그랜자임 B를 제작하기 위하여, 단일 또는 다중 카피의 동일 부위 또는 다양한 부위에서, 리포터 유전자의 최적의 유도성 발현을 담당하는 관심있는 부위를 확인하였다.
키메라 핵산을 제작하기 위한 TNFα 프로모터 요소의 선별
TNFα 프로모터 부위를 TNFα 프로모터의 다양한 결실 작제물을 포함하는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다(도 3). 다양한 다른 세포 시스템에서 다른 연구자에 의해 확인된 부위를 참조로 사용하였다(Rhoades 등, J. Biol. Chem. 1992, 267, 22102-22107; Leitman 등, Mol. Cell Biol., 1992, 12, 1352-1356; Pauli U., Crit. Reviews Eukaryotic Gene Expression, 1994, 4, 323-344). 그후 PCR-증폭된 유전자를 상업적으로 입수가능한 무-프로모터 벡터에서, 루시페라제와 같은, 리포터 유전자의 상부에 클론하였다. 이들 작제물을 Jurkat(T 림프아구), U973(골수단핵세포), THP-1(단핵세포), 섬유아세포에서와 같은 다양한 세포주에서와 인 비트로 배양된 인간 활막세포에서 그들의 구조성 및 유도성 발현에 대해 시험하였다. 리포터 유전자의 유도성 발현을 담당하는 부위의 확인은 두 TNFα-생산 세포주, 즉 Jurkat(PMA로 자극후) 및 THP-1(LPS로 자극후)을 이용하여 얻어지는 결과에 일차적으로 기초하였다(도 4a 및 b). 이들 세포를 잘 확립된 방법 및 상업적으로 입수가능한 시약, 예를들어 DEAE 덱스트란 및 슈퍼펙트를 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 그후 리포터 유전자의 유도성 발현을 담당하는 TNFα 프로모터의 시스-요소를 TNFp-그랜자임 B 키메라 핵산을 제작하는데 사용하였다.
TNFp-그랜자임 B 키메라 핵산의 제작
IL-2 함유 배지에서 유지시킨 PHA/항-CD3-활성화된 인간 말초혈액 림프구로부터 얻은, 그랜자임 코딩 부위를 올리고-dT-프라임된 cDNA를 주형으로 사용하여 증폭시켰다. 코돈 1-7 및 21-27에 대응하는 센스 프라이머를 전장(서열번호 8) 또는 절단된(서열번호 9) 형태의 그랜자임 B를 증폭시키는데 사용하였다. 사용된 안티-센스 프라이머는 두 증폭에서 동일하여 정지 코돈, 즉 잔기 248까지에 대응하는 산물을 얻었다. 디-펩타이드 결실된 그랜자임 B 작제물(서열번호 10)을 전장 그랜자임 B(서열번호 8)을 주형으로 사용하여 제조하였다. 15 뉴클레오타이드의, 코돈 19 및 20에 대응하는 6 개의 뉴클레오타이드(불활성화 디-펩타이드)를 포함하지는 않지만, 그의 어느 쪽에 접하는, 돌연변이유발성 센스 및 안티센스 상보적 프라이머를 결실을 만들어내는데 사용하였다. 상기 작제물을 퀵체인지 돌연변이유발 키트(Stratagene)을 이용하여 제조하였다. TNFα 프로모터의 결실 작제물 -706 및 -1005에서 루시페라제 유전자를 교체하여 디-펩타이드-결실된 그랜자임 B를 암호화하는 핵산 단편을 TNFα 프로모터의 하부에 서브클론하였다(도 5). TNFα 유전자의 전체 3' 비번역 부위(서열번호 7)을 PCR-증폭시키고 TNFα 프로모터의 -706 및 -1005 결실 단편에 의해 조종된 디-펩타이드 결실된 그랜자임 B를 암호화하는 핵산 단편의 하부에 삽입하였다. 키메라 핵산의 전체 서열은 서열번호 13 및 14에 있다.
TNFα 슈퍼 프로모터-그랜자임 B 키메라 핵산의 제작
상기한 리포터 유전자의 유도성 발현을 담당하는 요소를 함유하는, TNFα 프로모터의, 두 개의 넓은 바람직한 부위, 즉 ER1(-1005 내지 -905)(서열번호 4), ER2(-706 내지 -517)(서열번호 5)를 PCR 증폭시키고 최소의 본래 프로모터(-120 내지 TSS, 서열번호 3)의 상부에 단일 카피 또는 다중 카피로 결찰시켰다. TNFα 프로모터의 두 부위 ER3(-234 내지 -120)(서열번호 11) 및 ER4(-234 내지 -65)(서열번호 12)도 하기 전략을 이용하여 키메라 작제물에 사용되는 인핸서 부위로 확인되었다. 슈퍼 프로모터는 유도성 프로모터 요소를 함유하는 상기한 부위의 다중(2-10) 카셋트를 함유한다(도 7). 이것은 각각의 프라이머의 5' 말단에 삽입된 제한위치로 합성된 프라이머를 이용하여 관심있는 부위를 PCR 증폭시킴으로써 성취되었다. 이들 독특한 제한위치는 관심있는 증폭된 유전자 산물에 접한다. 바람직하게는, 본래의 TNFα 프로모터에 대해 기재된(도 5) 원래의 작제물에서 루시페라제 리포터 유전자를 교체하여, PCR 증폭된 AIG를 TNFα 슈퍼 프로모터의 하부에 클로닝하였다.
TNFα 슈퍼 프로모터 및 독특한 제한위치를 나타내는(이들 제한위치는 TNFα 프로모터 및 그랜자임의 선별된 요소에는 존재하지않았다) 링커 서열을 제작하기위한 계획을 이하에서 개략적으로 설명하고 도 8에 나타내었다:
계획 1:
단계 1: TNFα 최소 프로모터(-120 내지 TSS)의 pGL3 기본(무-프로모터) 루시페라제 벡터(프로메가)로의 삽입
키메라 핵산 TNFp-AIG를 작제하기 위해 사용되는 pGL3 기본 벡터의 요소는 하기와 같다.
＿KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SmaⅠ.XhoⅠ.BglⅡ.HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
최소 프로모터를 XhoⅠ 및 BglⅡ.HindⅢ 위치를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켜, XhoⅠ는 증폭된 산물의 5' 말단에 BglⅡ.HindⅢ 위치는 3'말단에 있었다. 이 단편을 이들 동일한 제한위치를 이용하여 pGL3 기본 벡터의 폴리링커로 삽입하였다. 이 작제물을 "작제물 A1"으로 나타내며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠSmaⅠXhoⅠ.(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 2: 인핸서 단편(ER1, ER2, ER3 또는 ER4)을 몇몇 제한위치를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 결과 단편은 하기와 같이 5'말단에서 제한위치 KpnⅠ.AatⅡ.BssHⅡ 및 3'말단에서 NsiⅠ.SpeⅠ.MluⅠ을 가질 것이다:
5'KpnⅠ.AatⅡ.BssHⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).NsiⅠ.SpeⅠ.MluⅠ3'. 이 단편을 KpnⅠ 및 MluⅠ 제한위치를 이용하여 단계 1에서 생성된 "작제물 A1"으로 삽입하였다. 이 작제물을 "작제물 B1"이라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.AatⅡ.BssHⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).NsiⅠ.SpeⅠ.MluⅠ.NheⅠ.
SmaⅠ.XhoⅠ(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 3: TNFα 인핸서 단편(ER1, ER2, ER3 또는 ER4)을 제한위치 AatⅡ 및 BssHⅡ를 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켜 하기와 같은 PCR 산물을 생성시켰다:
5'AatⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).BssHⅡ3'. 이 단편을 동일한 제한위치를 이용하여 "작제물 B1"으로 클로닝하였다. 이 작제물을 "작제물 C1"이라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.AatⅡ.(ER1 또는 ER2).BssHⅡ(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).NsiⅠ.SpeⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SmaⅠ.XhoⅠ(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 4:
TNFα 인핸서 단편(ER1, ER2, ER3 또는 ER4)를 제한위치 NsiⅠ 및 SpeⅠ을 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켜 하기와 같은 PCR 산물을 생성시켰다:
5'NsiⅠ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).SpeⅠ3'. 이 단편을 동일한 제한위치를 이용하여 "작제물 C1"으로 클로닝하였다. 이 작제물을 "작제물 D1"이라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.AatⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).BssHⅡ(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).NsiⅠ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).SpeⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SmaⅠ.XhoⅠ(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 5:
그랜자임 B 코딩 부위를 BglⅡ 및 XbaⅠ 제한위치를 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켜 하기와 같은 단편을 생성시켰다: 5'EcoRⅠ.BglⅡ.[그랜자임 B].XbaⅠ3'. 이 단편을 BglⅡ 및 XbaⅠ를 이용하여 "작제물 D1"으로 삽입하였다. 결과 작제물을 "작제물 E1"이라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.AatⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).BssHⅡ(ER1, ER2, ER3 또는ER4).NsiⅠ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).SpeⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SmaⅠ.XhoⅠ(-120 내지 TSS BglⅡ).[그랜자임 B].EcoRⅠXbaⅠ＿
대안으로 계획 2가 따랐다:
계획 2:
단계 1: 계획 1에서와 같이 하기와 같은 "작제물 A1"을 생성하였다:
KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SmaⅠ.XhoⅠ.(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ
단계 2: 부가적인 다중 클로닝 위치(서열번호 6)의 삽입
＿NheⅠ.SacⅡ.EcorⅤ.AflⅡ.AatⅡ.AvrⅡ.SpeⅠ.PvuⅡ.XhoⅠ＿를 제공하는 두 개의 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'인산화된)를 상업적 출처를 이용하여 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한후 "작제물 A1"의 NheⅠ 및 XhoⅠ 위치로 클로닝하였다. 결과 작제물을 "작제물 B2"라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SacⅡ.EcorⅤ.AflⅡ.AatⅡ.AvrⅡ.SpeⅠ.PvuⅡ.
XhoⅠ(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 3:
TNFα 인핸서 단편(ER1, ER2, ER3 또는 ER4)을 5'말단에 제한위치 SpeⅠ.PvuⅡ 및 3'말단에 XhoⅠ을 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켜 하기와 같은 PCR 산물을 생성시켰다: 5'SpeⅠ.PvuⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).XhoⅠ3'. 이 단편을 SpeⅠ 및 XhoⅠ 제한위치를 이용하여 "작제물 B2"로 클로닝하였다. 이 작제물을 "작제물 C2"라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SacⅡ.EcorⅤ.AflⅡ.AatⅡ.AvrⅡ.SpeⅠ.PvuⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).XhoⅠ.(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
단계 4: TNFα 인핸서 단편(ER1, ER2, ER3 또는 ER4)을 5'말단에 제한위치 AvrⅡ.SpeⅠ 및 3'말단에 PvuⅡ를 함유하는 프라이머를 이용하여 증폭시켜 하기와 같은 PCR 산물을 생성시켰다: 5'AvrⅡ.SpeⅠ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).PvuⅡ3'. 이 단편을 AvrⅡ 및 PvuⅡ 제한위치를 이용하여 "작제물 C2"로 클로닝하였다. 이 작제물을 "작제물 D2"라 하며 하기와 같았다:
＿KpnⅠ.SacⅠ.MluⅠ.NheⅠ.SacⅡ.EcorⅤ.AflⅡ.AatⅡ.AvrⅡ.SpeⅠ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).PvuⅡ.(ER1, ER2, ER3 또는 ER4).XhoⅠ.(-120 내지 TSS BglⅡ).HindⅢ.[루시페라제].XbaⅠ＿
따라서, 이 전략을 이용하여, 적어도 일곱 카피의 인핸서 부위(ER1, ER2, ER3 또는 ER4 개개 또는 결합)를, 한번에 하나씩, 선택된 인핸서 부위의 PCR 증폭에서 이전 것의 상부에 하나 이상의 제한위치를 사용하여 첨가할 수 있다. 일단 원하는 카피수의 인핸서 부위를 첨가하면, AIG를 계획 1 단계 5에 기재된 슈퍼 프로모터의 하부에 삽입하였다.
키메라 TNFp-그랜자임 B 유전자의 유도성 발현을 위에서 언급한 세포주의 일시적 형질감염에 의해 시험하였다. 형질감염된 세포의 고사를 검출하고, 상업적으로 입수가능한 항체를 이용하는 웨스턴 블랏에서 AIG 발현된 단백질을 측정하고 상업적으로 입수가능하고, 잘 입증된 특이적 합성 테트라펩타이드 기질을 이용하여프로테아제 활성을 측정함으로써 TNFp-그랜자임 B 핵산의 발현을 측정하였다.
리포터 유전자의 TNFp-조종된 발현의 조절
TNFα 유전자의 3' 비번역 부위는 TNFα 생합성 조절에 중요한 역할을 한다. 그것은 정상, 비활성화 상태에서 TNFα 유전자의 번역 발현에 관여하였다. 중요하게, 이들 요소는 TNFα-생산 세포가 외부 자극에 의해 활성화되었을때 억제해제가 일어나게 한다(Han, J. 등, J. Immunology, 1991, 146, 1843-1848; Crawford, F.K. 등, J. Biol. Chem., 1996, 271, 22383-22390).
전체 3' 비번역 부위(서열번호 13)가 TNFα 프로모터의 결실 단편, 즉 -120, -706 및 -1005에 의해 조종되는 루시페라제 유전자의 하부에 삽입된 유전적 작제물을 제조하였다. 이들 작제물의 일시적 발현결과를 도 9에 요약한다. 이 전략을 이용하여, 3'UTR 또한 그랜자임 B TNFpGB 키메라 작제물의 하부에 삽입하였다(도 6(a), 6(b), 12 및 13).
실시예 2
시험 프로토콜
인 비트로 방법:
루시페라제 분석: 루시페라제 활성을 상업적으로 입수가능한 시약(프로메가)을 이용하여 결정하였다.
그랜자임 B 유전자 발현:
a) 형질감염된 세포용균물의 웨스턴 블랏을 항-그랜자임 B 항체를 이용하여 전개시켰다.
b) 형질감염된 세포의 고사: 핵을 프로피디움 요오다이드(Krishan, A., J. Cell Biol., 66, 1994, 188-193) 및 상업적으로 입수가능한 세포 사멸 ELISA 키트(베링거 만하임)로 염색하여 그랜자임 B로 인한 형질감염된 세포의 고사를 결정하였다.
동물 모델
IL-1β-유도된 관절염의 토끼 모델(Pettipher E. R. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, 83, 8749-8753): IL-1β를 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 관절에 주사하였다. IL-1β의 관절내 주사는 백혈구의 관절 공간내로의 용량-의존적 침투 및 관절 연골로부터의 프로테오글리칸의 유실을 유발한다.
항원-유도된 관절염: 항원(오브알부민)의 무릎 관절로의 관절내 주사는 인간에서의 류마티스성 관절염과 매우 유사한 백혈구 축적 및 연골 분해를 유도한다. 주사후 관절 부종이 14 일간 지속되었다.
Scid 마우스-인간 활막세포 모델(Houri J.M. 등, Current Opinions in Rheumatol., 1995, 7, 201-205; Sack U. 등, J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58; Geiler T. 등, Arthritis & Rheumatism, 1994, 37, 1664-1671): 이들은 RA 환자로부터 신선한 활막 조직이 정상 인간 연골을 이용하여 scid 마우스로 신장 캡슐하에, 피하로(Geiler T. 등, Arthritis & Rheumatism, 1994, 37, 1664-12671), 또는 무릎 관절로(Sack U. 등, J. Autoimmunity, 1995, 9, 51-58) 이식된 관절염에 대해 최근에 개발된 모델이었다. 이식편은 고세포 밀도의 판누스 조직 형성, 뼈 및 연골 부식, 다핵성 거대세포의 발생, 및 연골의 활액분비 섬유아세포에 의한 침식을포함하여, 관절염과 유사한 특성을 갖고 성장한다.
간접적 방법: 활막세포를 치료 유전자로 인 비트로 형질감염시키고 토끼에 재이식시켰다. 이들 토끼에서 IL-1β를 주사하여 관절염을 유도하고 활성화후 치료 유전자의 발현을 측정하였다. 키메라 핵산의 활성화-유도된 발현은 이식된 세포에서 고사를 유도한다.
직접적 방법: 키메라 핵산의 관절내 주사
노출된 플라스미드 DNA, 양이온성 리포좀-매개된 전달을 포함한, 상기한 유전자 전달 방법중 어느 것도 사용할 수 있다. 바이러스 벡터-기초한 전달용으로, 키메라 핵산을 적당한 벡터에서 클로닝하였다. 그후 이들 벡터에 존재하는 진핵세포 프로모터를 결실시켜 벡터를 변형시켰다. 그후 적절한 벡터에 삽입된 치료 유전자의 관절내 주사를 치료적·예방적 효능을 측정하기 위하여 행할 수 있다.
실시예 3
TNFα 비-생산 체세포 변이체의 선별
세포(THP-1, Jurkat)를 TNFp-AIG 키메라 핵산으로 인 비트로에서 안정하게 형질감염시켰다. TNFp-AIG 유전자를 발현하는 세포에서 고사를 유도하는, 몇 사이클의 자극후, 생존 세포를 모았다. 기능적 클로닝에 사용되는, 이들 세포로부터의 cDNA 라이브러리를 제작하였다(Legerski R 및 Peterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M. 등, Oncogene, 1995, 10, 2297-2305).
실시예 4
우성 부(DN) 유전자의 확인 및 특성분석
TNFp-AIG로 안정하게 형질감염된 THP-1 및 Jurkat 세포를 반복된 사이클의 자극에 노출시켜 TNFp-AIG의 발현을 활성화시켰다. 부조절 유전자를 발현하지않는 세포는 고사를 겪는 반면, 우성 부유전자를 발현하는 것들은 살아남는다. 이들 생존 세포에서 DN 유전자 산물은 TNFα 프로모터와 트랜스로 작용하여, 그의 활성화를 저해하여 AIG를 전사하고, 궁극적으로 생존 표현형을 나타낸다. cDNA 라이브러리를 이들 세포로부터 폴리아데닐화 mRNA를 이용하여 제작하였다. TNFp-AIG-형질감염된 THP-1 또는 Jurkat 세포를 고사로부터 구조하는 DN 유전자를 다른 유전자에 대해 기재된 기능적 클로닝에 의해 확인하였다(Legerski R. 및 Peterson C., Nature, 1992, 359, 70-73; Jaattela M. 등, Oncogene, 195, 10, 2297-2305).
상기 기재는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 실시하는 방법을 교시하기 위한 것이고, 이 기재를 읽고 당업자에게 명백해지는 그의 모든 그들 자명한 변형 및 변화를 열거하고자 하는 것은 아니었다. 그러나, 모든 그러한 변형 및 변화는 하기 청구범위에 의해 특정되는, 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 의도되었다. 청구범위는 문맥이 특별히 다르게 표시하고있지 않는한, 거기서 의도된 목적을 충족시키는데 효과적인, 어느 순서로든 청구된 성분 및 단계를 포함하는 것으로 의도된다.
여기에 인용된 논문들은 그들 전체로 참조로서 명백히 인용된다.

Claims (18)

  1. 핵산 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체를 포함하고, TNFα 프로모터에 결합된 적어도 하나의 TNFα 프로모터 인핸서(enhancer) 부위;
    차례로 3'UTR 핵산 서열에 추가로 결합된 그랜자임(Granzyme) B 단백질 또는 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 추가로 결합된 TNFα 프로모터:
    를 포함하는 키메라 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 2 내지 5 개의 TNFα 프로모터 인핸서 부위가 존재하고, 인핸서 부위중 어느 것이 서열번호 5, 서열번호 12 또는 그의 결합을 포함하는 키메라 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, TNFα 프로모터가 핵산 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택된 키메라 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 분자 서열이 서열번호 13, 서열번호 14 및 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체를 포함하는 키메라 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 3'UTR이 그래자임 B 핵산 서열의 하부에 결찰된 키메라 핵산 분자.
  6. 제1항에 따른 키메라 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 따른 약제학적 유효량의 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환의 치료방법.
  8. 제7항에 있어서, 염증성 질환이 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 길레인-바르(Guillain-Barre) 증후군, 크론(Crohn's)병, 궤양성 결장염, 건선, 이식편 대 숙주 질환, 홍반성 루푸스, 인슐린-의존성 당뇨병, 건선성 관절염, 유육종증, 과민성 폐렴, 유착성 척추염, 라이터(Reiter's) 증후군, 및 전신성 경화증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법.
  9. 제8항에 있어서, 염증성 질환이 류마티스성 관절염인 방법.
  10. (a) TNFα 프로모터의 결실 작제물을 포함하는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응에 의해 TNFα 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 증폭시키고;
    (b) 리포터 핵산 서열의 상부에 단계 (a)에서 얻은 PCR-증폭된 핵산을 클로닝하여 작제물을 제조하며;
    (c) 단계 (b)에서 얻은 작제물을 적어도 하나의 TNFα-생산 세포주에서 그들의 구조성 및 유도성 발현에 대해 시험하고;
    (d) 세포주에서 리포터의 유도성 발현을 담당하는 TNFα 프로모터를 선별하며;
    (e) 리포터의 발현을 증진시키는 TNFα 프로모터 부위를 PCR-증폭시켜 인핸서를 얻고 프로모터의 상부에 적어도 한 카피의 인핸서를 결찰시키고;
    (f) 리포터를 고사-유도 핵산 결실 작제물로 교체하여 적어도 한 카피의 고사-유도 핵산 분자를 TNFα 프로모터의 하부에 삽입하며;
    (g) TNFα-3'UTR을 PCR-증폭시키고 고사-유도 핵산 분자의 하부에 결찰시켜 키메라 핵산 분자를 얻는:
    단계를 포함하는 고사-유도 핵산이 TNFα 프로모터에 의해 조종되는, TNFα-3'UTR 핵산 서열에 추가로 결합된 적어도 한 카피의 기능적 고사-유도 핵산 분자에 결합된, 최소 TNFα 프로모터의 기능적 카피에 결합된, 적어도 하나의 TNFα 프로모터 인핸서를 포함하는 키메라 핵산 분자를 제작하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 2 이상의 카피의 인핸서가 프로모터 상부에 삽입된 방법.
  12. 제10항에 있어서, 리포터 핵산 서열이 루시페라제인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 인핸서가 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 고사-유도 핵산이 그랜자임 B 또는 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 그의 보존적 치환체 또는 대립형질 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택된 키메라 핵산 분자를 제조하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 작제물을 시험하기 위한 세포주가 T 림프아구, 골수단핵세포, 단핵세포, 섬유아세포, 배양된 인간 활막세포 및 RA에 존재하는 근원세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 방법.
  17. 제1항에 따른 키메라 핵산 분자를 포함하는 서열로 TNFα를 생산하지 않는 세포 집단을 형질감염시키고; 삽입된 서열의 발현을 자극하며; 우성 부(negative) 유전자를 갖는 살아남은 세포를 선별하는 것:을 포함하는 우성 부 유전자를 스크리닝하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 서열이 제2항에 따른 키메라 핵산 분자를 포함하는 방법.
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