PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS UTADAS HUMANAS EN CÉLULAS HUMANAS POR MEDIO DE RECOMBINACION HOMOLOGA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un proceso para la producción de muteínas de polipéptidos eucarióticos en células eucarióticas por medio de recombinación homologa. La invención adicionalmente se refiere a un proceso para la producción de células humanas que son adecuadas para la producción de proteínas humanas mutadas . Finalmente la invención se refiere a las células humanas producidas por el proceso y proteínas humanas mutadas obtenibles de ellas, así como preparaciones farmacéuticas que contienen esas muteínas. La producción de proteínas humanas recombinantes en grandes cantidades, es conocida en el campo de la biotecnología. Las proteínas obtenidas de esa manera pueden usarse como agentes terapéuticos . También se conoce la producción recombinante de proteínas humanas mutadas que difieren de las proteínas naturales correspondientes por medio de delección, adición y/o substitución de aminoácidos individuales o secciones de péptidos completas. Especialmente para las aplicaciones farmacéuticas frecuentemente es deseable el producir polipéptidos humanos en células eucarióticas ya que en contraste a los polipéptidos producidos en las células procarioticas tales como E. coli, están glicosiladas y por lo tanto difieren REF.: 32380 menos de los polipéptidos que se presentan endógenamente en el cuerpo dé tal forma que la ocurrencia de efectos laterales indeseados como por ejemplo inmunogenicidad o baja tolerancia se observa menos frecuentemente. Las proteínas humanas mutadas han sido producidas previamente por medio de expresión genética recombinante heretóloga. Para esto una construcción de ácido nucleico se introduce en la célula eucariótica deseada que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido mutado bajo el control de un promotor y un gen marcador de selección. En este proceso la construcción de ácido nucleico se integra de forma inespecífica al lugar en el genoma de la célula. En esta expresión genética recombinante heteróloga pueden presentarse frecuentemente procesos indeseables y desventajosos debido a la integración no especifica al lugar. Por ejemplo las mutaciones y en especial la delección en la codificación de secuencia de la proteína puede ocurrir durante el proceso de integración en el . Además, la integración puede realizarse integrando un lugar en el , en el cual los elementos Cis se localizan, que tienen un efecto represivo sobe la secuencia de control de expresión de la construcción de ácido nucleico y como resultado de lo cual se obtienen células con un reducido rendimiento de producción de la proteína recombinante. Una integración de la construcción de expresión en un gen importante para la célula conduce ya sea a la muerte de esta célula o a una célula recombinante con problemas funcionales que entre otras cosas pueden dar como resultado un bajo rendimiento de la proteína recombinante . La inserción también puede conducir a una reducida estabilidad de las células obtenidas así de tal forma que durante un largo período pierden su habilidad de expresar la proteína recombinante . El objeto de la presente invención es por lo tanto el proporcionar un proceso para la producción de muteínas de polipéptidos eucarióticos con una glicosilación que es tan similar como es posible a la de la proteína natural, en una célula de producción estable y en buenos rendimientos y así eliminar cuando menos parcialmente las desventajas de la técnica anterior. Este objeto se logra de acuerdo con la invención por medio de un proceso para la producción de muteínas de polipéptidos eucarióticos, en donde (i) se introduce una molécula de ácido nucleico capaz de recombinación homologa en células eucarióticas que contienen una secuencia de ácido nucleico objetivo que codifica a un polipéptido objetivo endógeno, la molécula de ácido nucleico consiste de (a) cuando menos una sección de secuencia que es homologa a las secuencias en el lugar del gen de esa secuencia de ácido nucleico objetivo, en comparación a la secuencia de ácido nucleico objetivo endógena, tiene una mutación en la región de codificación del polipéptido maduro y (b) una sección de ácido nucleico que codifica a un marcador de selección (ii) las células se cultivan bajo tales condiciones que se realiza una recombinación homologa de la molécula de ácido nucleico introducido, en donde la célula contiene una secuencia de ácido nucleico objetivo mutada después de la recombinación homologa que puede expresar una muteína del polipéptido objetivo, (iii) se seleccionaron las células en las cuales se ha realizado la recombinación homologa y (iv) la muteína se aisla de las células y/o de la nata de las células . Las proteínas eucarióticas mutadas y en particular las proteínas humanas mutadas pueden producirse en una célula homologa por medio del proceso de acuerdo con la invención. Sorprendentemente este permite que se obtenga una proteína mutada con altos rendimientos con un modelo de glicosilación muy similar al de la proteína natural. Una ventaja el proceso de acuerdo con la invención es que una proteína puede mutarse en una célula eucariótica y esta muteína se sintetiza por esta célula igual que la proteína de la célula que se presente endógenamente. Otra desventaja del proceso de acuerdo con la invención es que las propiedades de las células resultantes que producen la proteína mutada no se alteran de manera desventajosa debido a la integración del gen inespecífica al lugar. Así el genoma de la célula no se cambia en manera alguna aparte de la localización del gen de la proteína que se va a expresar y por lo tanto pueden excluirse los efectos adversos asociados . La proteína mutada humana producida por el proceso de acuerdo con la invención difiere de la proteína natural correspondiente por medio de delección, adición y/o substitución de los aminoácidos individuales o secciones enteras de péptidos . Preferentemente se producen muteínas que tienen mutaciones en la terminal N y/o en la terminal C por ejemplo como delecciones, inserciones, substituciones y/o fusiones con otras proteínas por ejemplo humanas. Las muteínas de acuerdo con la invención son preferentemente polipéptidos que no se presentan naturalmente y difieren de las variaciones alélicas del polipéptido que se va a mutar, que se presenta naturalmente en otras células de partida por cuando menos un aminoácido . Las muteínas que no se presentan naturalmente, de manera particularmente preferible difieren por delecciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos individuales o secciones de péptidos, de las variaciones alélicas naturales. La célula usada en el proceso de acuerdo con la invención es una célula eucariótica arbitraria que tiene cuando menos una copia endógena del gen objetivo que se va a mutar. La célula preferentemente es una célula humana, particularmente se prefiere una célula humana inmortalizada tal como una célula HeLa, una célula Namlwa o una célula HT1080. Sorprendentemente se encontró que cuando se usan células de partida que contienen un número mayor de cromosomas en las cuales el gen objetivo se encuentra, pueden producirse células por medio de recombinación homologa que produce un rendimiento mayor de proteínas humanas mutadas en comparación con las células que solo contienen dos copias del gen objetivo. Ejemplos de esas células de partida son familias celulares tumorales con reacomodos genéticos tales como HeLaS3 (Puck et al., J.Exp.Med. 103(1996), 273-284) y Naal a (Nadkarni et al., Cáncer 23 (1969), 64-79) que contiene un numero mayor de copias del cromosoma 7. Una activación endógena del gen del gen objetivo mutado puede realizarse para mejorar la expresión del péptido mutado . Para esto pueden introducirse secuencias adicionales en el, lo que influye positivamente el rendimiento de expresión, en las cual por ejemplo la secuencia de control de expresión endógena de la secuencia de ácido nucleico objetivo se reemplaza cuando menos parcialmente por una secuencia de control de expresión heteróloga. Esta secuencia de control de expresión heteróloga puede contener un promotor y/o amplificador heterólogo, la secuencia de control de expresión heteróloga preferentemente contiene un promotor viral, en particular un promotor CMV. El reemplazo del promotor endógeno no solo permite que aumente la expresión sino que permite la síntesis de la muteína cuando se usa un promotor adecuado. El promotor heterólogo puede ser un promotor regulable o constructivo. Además, este puede utilizarse para inactivar elementos Cis que tienen un efecto represivo sobre el promotor endógeno. Esto también puede conducir a un mayor rendimiento . La molécula de ácido nucleico introducida en la célula de partida comprende cuando menos una sección de secuencia que permite una integración por medio de la recombinación homologa en el lugar del gen objetivo y es adecuado para introducir la mutación en la región de codificación del polipéptido objetivo maduro. La molécula de ácido nucleico preferentemente contiene dos secuencias flanqueantes que son homologas a las regiones de la localización del gen objetivo. Las secuencias flanqueantes preferentemente tienen una longitud cada una de cuando menos 150 bp y contiene regiones de las secuencias de la localización del gen objetivo que codifica a los polipéptidos objetivos maduros que están modificadas en comparación a la secuencia nativa. Además la molécula de ácido nucleico contiene un gen de marcador de selección. Esto puede ser cualquier gen marcador de selección adecuado para células eucarióticas que conduce a un fenotipo seleccionable en la expresión, por ejemplo resistencia a antibióticos, auxotropia, expresión de una proteína superficial, etc. El gen de la fosfotransferasa de neomicina es un gen marcador de selección particularmente preferida. Además la molécula de ácido nucleico puede contener opcionalmente un gen marcador de selección negativo, por ejemplo un gen de quinasa de timidina HSV cuya expresión destruye las células en la presencia de un agente selectivo. Si se desea la amplificación del gen objetivo modificado en la célula, la molécula de ácido nucleico contiene un gen de amplificación. Ejemplos de genes de amplificación adecuados son reductasa de dihidrofolato, deaminasa de adenosina, descarboxilasa de ornitina, etc. El gen de reductasa de dihidrofolato es un gen de amplificación particularmente preferido. Cuando el gen de amplificación esta presente, la secuencia de ácido nucleico objetivo mutado puede amplificarse después de la recombinación homologa con el fin de aumentar el numero de copias en la célula. El proceso de acuerdo con la invención permite la mutación de todos los genes endógenos presentes en el genoma de la célula usada. La secuencia de ácido nucleico objetivo es preferentemente una secuencia de activador de plasminógeno de tejido (tPA) , de eritropoyetina, de insulina, de factor de necrosis tumoral, de interleucina o de receptor de interleucina. La muteína obtenida por el proceso de acuerdo con la invención es de manera particularmente preferida, un polipéptido cuyas propiedades biológicas difieren de aquellas de la proteína natural correspondiente, tal como un polipéptido derivado de t-PA que comprende los dominios K2 y P de t-PA (EP-0 382 174) . Las técnicas conocidas pueden usarse para aislar la muteína. La muteína preferentemente se aisla de la nata de células cultivadas en suspensión. Las células que pueden ser cultivadas en suspensión son especialmente ventajosas para una producción a gran escala. Esto simplifica considerablemente la transferencia de células cultivadas que es necesaria durante el curso del proceso de producción. Esto conduce a un ahorro considerable del tiempo de producción y los recursos de producción y así reduce significantemente los costos . La muteína de manera particularmente preferida se aisla de la nata de células cultivadas en un medio libre de suero. La muteína puede aislarse de manera mas simple y barata de células cultivadas en un medio libre de suero, en comparación a las células cultivadas con suero ya que son necesarias menos etapas de purificación. Otro objeto de la presente invención es un polipéptido humano mutado de una célula humana obtenible por medio del proceso descrito antes que se distingue por medio de la glicolización humana y la ausencia de polipéptidos que son extraños a la especie. La ausencia de polipéptidos que son extraños a la especie, significa menos del 3% en peso de impurezas de polipéptidos ajenos a la especie, preferentemente menos de 1% en peso y mas preferentemente menos de 0.1% en peso en relación a la cantidad de la proteína deseada. Otro objeto de la invención es un proceso para la producción de una célula humana que exprese una muteína de un polipéptido objetivo humano , caracterizado porque (i) una molécula de ácido nucleico se introduce en células humanas que contienen una secuencia de ácido nucleico objetivo que codifica a un polipéptido objetivo endógeno, la molécula de ácido nucleico consiste de (a) cuando menos una sección de secuencia que es homologa a las secuencias en la localización en el gen de la secuencia de ácido nucleico objetivo, y comparado con la secuencia de ácido nucleico objetivo endógena, tiene una mutación en la región de codificación del polipéptido objetivo maduro, (b) opcionalmente una secuencia de control de expresión heteróloga para la secuencia de ácido nucleico objetivo y (c) una sección de ácido nucleico que codifica a un marcador de selección, (ii) las células se cultivas bajo condiciones tales que se realiza una recombinación de la molécula de ácido nucleico introducido, en donde la célula contiene una secuencia de ácido nucleico objetivo mutada después de la recombinación homologa que es capaz de expresar una muteína del polipéptido objetivo, (iii) se seleccionan las células en las cuales se ha realizado una recombinación homologa, y (iv) se aislan las células así seleccionadas. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico adicionalmente contiene un gen de amplificación y la secuencia de ácido nucleico objetivo mutada es amplificada después de la recombinación homologa. Otro objetivo de la invención es una célula humana obtenible por medio de un proceso como el descrito antes que contiene cuando menos un gen endógeno que codifica a un polipéptido humano mutado. La célula de acuerdo con la invención puede cultivarse bajo condiciones de cultivo adecuadas y es preferentemente una célula que crece en suspensión y de forma particularmente preferida una célula que cree en un medio libre de suero. Otro objeto de la invención es el uso de una célula humana producida por un proceso como el descrito antes para la producción de una muteína de un polipéptido humano. Otro objeto de la invención es una preparación farmacéutica que esta caracterizada porque contiene una muteína como se describe antes como substancia activa opcionalmente junto con otras substancias activas y/o portadores farmacéuticos comunes, substancias auxiliares o aditivos . Ejetpplo Construcción de un mutante t-PA que contiene los dominios K2 y P: a) Construcción del vector El vector de determinación de objetivo esta compuesto por los siguientes elementos (enlistados en la secuencia 5 '-3'):
A: un fragmento BglII de 6 kb que contiene aproximadamente 3.5 kb de la región 5' corriente arriba del gen t-PA
(Friezner et al. 1986, JBC 261 (15) : 6972) B: una secuencia de activación de aproximadamente 5.2 genes
(como un fragmento Agel) que contiene el gen de la fosfotransferasa de neomicina (NEO) bajo el control del promotor RSV y el último punto de poliadenilación de SV40 como el terminador, un gen que codifica a un mutante de arinina de la reductasa de dihidrofolarto de murina (DHFR) (Simonsen et. al., Proc. Nati. Acad. Sci, US 80 (1983) 2495) bajo el control del promotor anterior SV40 y el punto de poliadenilación SV40 anterior como el terminador (Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okamaya et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280 y Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989) y el promotor de citomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41, (1995) , pag. 21) . C: un fragmento de aproximadamente 20 pb aislado del cADN de t-PA que corresponde a las posiciones nucleótidas l- 199 y que contiene la región codificadora de la secuencia de señal y los tres primeros aminoácidos del t-PA maduro (Pennica et al., 1983, Natre 301:204). D : un fragmento EcoRI de aproximadamente 1.5 kn que contiene una gran parte del intron G del gen tPA
(Friezner et al. op. cit. Ny et al. 1984, PNAS 812:5355)
Esos elementos se aislaron de los materiales de partida apropiados y se ensamblaron por medio de PCR y cebadores de fusión PCR adecuados . Subsecuentemente los elementos fusionados se ligaron en pBR322 y se introdujeron en E. coli. Alternativamente los fragmentos pueden recortarse de materiales de partida respectivos y ser ligados por medio de enlazantes.
b) Familia celular humana Se uso HeLa como la familia celular para realizar la activación genética endógena en la cual se mostró que la transcripción del gen t-PA puede ser inducida por la adición de miristato acetato de forbol (Waller y Schleuning 1985, J. Bioo. Chem. 260: 6354) . Después de la introducción del vector de determinación de objetivo por medio de electroporación, las células que contenían el vector se seleccionaron por medio de la adición de G418. Las células que como resultado de la recombinación homologa, secretaron un polipéptido con los dominios K2 y P de t-PA se identificaron al examinar la nata de las células con un examen ELISA (tPA total Inmunoligado, American Diagnostics) que puede detectar la expresión del polipéptido deseado. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.