KR102625785B1 - T-세포 수용체 및 t-세포 항원의 식별 및 특징규명을 위한 조작된 다성분 시스템 - Google Patents
T-세포 수용체 및 t-세포 항원의 식별 및 특징규명을 위한 조작된 다성분 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다성분 시스템에 관한 것이며, 여기서 제1 성분은 성분 A라고 지정된 조작된 항원-제시 세포(eAPC)이고, 제2 성분은 분석물 항원-제시 복합체(aAPX) 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 암호화하는 1종 이상의 ORF의 전달을 위한, 성분 C라고 지정된 유전자 공여자 벡터이되, 성분 A는, a. aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 결핍되어 있고, b. 각각 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위한, 성분 B 및 성분 D라고 지정된 적어도 2개의 게놈 수용자 부위를 함유하고, 그리고 성분 C는 성분 B에 매칭되되, 성분 C는, c. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는 d. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되며, 상기 게놈 수용자 부위 B 및 D는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물이다.
Description
본 발명은 조작된 항원-제시 세포(engineered antigen-presenting cell: eAPC), 조작된 게놈 수용자 부위(engineered genomic receiver site) 및 매칭 유전자 공여자 벡터(matching genetic donor vector)인 적어도 3종의 성분으로 구성된, 다성분 시스템의 작제, 조립 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 항원 및 동족(cognate) TCR 서열의 식별 및 특징규명을 위한 항원성 분자의 다양한 형태를 제시하는 안정적인 유도체 세포를 신속하고, 높은 처리율로 생성하기 위해서 사용된다.
T 림프구(T-세포)에 의한 면역 감시는 모든 턱이 있는 척추동물의 획득 면역(adaptive immunity)에서의 핵심적인 기능이다. T-세포에 의한 면역 감시는 T-세포 하위유형 전체에서 풍부한 기능적인 다양성을 통해서 달성되는데, 이것은 병원체-감염된 세포 및 신생물 세포를 제거하고, 침입한 병원체, 공생 미생물, 공생 비자가 인자, 예컨대, 식품의 분자 성분에 대한 획득 면역 반응을 조직하고, 심지어는 자신의 면역 관용을 유지시키기 위해서 제공된다. 다양한 외부 인자 및 자가 인자에 반응하기 위해서, T-세포는 이러한 외부 인자 및 자가 인자의 분자 구성요소를 특이적으로 검출할 수 있어야 한다. 따라서 T-세포는, 병원성 유기체 및 병이 걸린 자신에 대해서는 효율적인 반응을 시작하지만, 건강한 자신에 대해서는 이러한 반응을 시작하는 것을 회피하기에 충분한 특이성으로, 개체가 접하는 자가 분자 및 비-자가 분자의 큰 단면을 검출할 수 있어야 한다. 이러한 작업의 상당히 복잡한 본성은, 외부 분자 및 자가 분자 둘 모두의 실질적으로 비제한된 다양성을 고려하고, 병원성 유기체가 진화 압력 하에 존재하여 T-세포에 의한 검출을 회피한다는 것을 고려할 때 명백해진다.
T-세포 수용체(TCR)
T-세포는 T-세포 수용체(TCR)의 발현에 의해서 주로 한정된다. TCR은 T-세포 획득 면역의 표적과 상호작용하여, 이를 감지하는 책임이 있는 T-세포의 성분이다. 일반적인 용어에서, TCR은 세포 표면 상에 제시된 이종이량체 단백질 복합체로 구성된다. 2개의 TCR 쇄 각각은 2개의 세포외 도메인으로 구성되는데, 이것은 가변(V)-영역 및 불변(C)-영역이고, 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF) 도메인 둘 모두는 역평행 β-시트를 형성한다. 이들은 타입-I 막관통 도메인에 의해서 세포막에 고정되고, 이것은 짧은 세포질 꼬리에 결합한다. 다양한 분자 구성요소를 획득 및 검출하는 T-세포의 품질은 T-세포 발생 동안 생성된 TCR 쇄에서의 변화로부터 초래한다. 이러한 변화는 B-세포에서 항체 발생과 유사한 방식으로 체세포 재조합에 의해서 발생된다.
TCR 쇄 다양성
T 세포 풀(T cell pool)은 기능적으로 그리고 표현형적으로 이종인 몇몇 하위집단으로 이루어진다. 그러나, T 세포는, 그것이 표면에서 발현하는 체세포적으로 재배열된 TCR에 따라서 αβ 또는 γδ로 광범위하게 분류될 수 있다. 2개의 TCR 쇄 쌍 형태; TCR 알파(TRA) 및 TCR 베타(TRB) 쌍; 및 TRC 감마(TRG) 및 TCR 델타(TRD) 쌍이 존재한다. TRA:TRB 쌍을 발현하는 T-세포는 αβ T-세포라 지칭되는 반면, TRG:TRD 쌍을 발현하는 T-세포는 종종 γδ T-세포라 지칭된다.
αβ 형태 및 γδ 형태 둘 모두의 TCR은 다양한 리간드 또는 '항원'의 인식에 대한 책임이 있고, 각각의 T-세포는 T-세포 성숙 동안 αβ 또는 γδ 수용체 쇄를 신생(de novo)으로 생성한다. 이러한 신생 TCR 쇄 쌍은 체세포 V(D)J 재조합이라고 불리는 과정에서 수용체 서열 다양성의 생성을 통해서 인식의 다양성을 달성하고, 그 후 각각의 T-세포는 단일의 명백하게 재배열된 TCR의 카피를 발현한다. TRA 및 TRG 유전자좌, 다수의 개별 가변(V) 및 기능성(J) 유전자 분절은 재조합에 사용 가능하고, 불변(C) 유전자 분절에 병치되어, VJ 재조합이라 지칭된다. TRB 및 TRD 유전자좌에서의 재조합은 추가로 다양성(D) 유전자 분절을 포함하고, 이것은 VDJ 재조합이라 지칭된다.
각각의 재조합된 TCR은, αβ T-세포의 경우에는 α 쇄 및 β 쇄에 의해서 또는 γδ T-세포의 경우에는 γ 쇄 및 δ 쇄에 의해서 형성된 리간드-결합 부위의 구조에 의해서 결정되는, 고유한 리간드 특이성에 대한 가능성을 보유한다. TCR의 구조적 다양성은 상보성-결정 영역(CDR)이라 불리는, 각각의 쇄 상의 3개의 짧은 헤어핀 루프에 상당히 국한된다. 3개의 CDR은 수용체 쇄 쌍의 각각의 쇄로부터 기여되고, 총괄적으로 이러한 6개의 CDR 루프는 TCR 세포외 도메인의 막-윈위 단부에 위치하여 항원-결합 부위를 형성한다.
각각의 TCR 쇄에서의 서열 다양성은 두 방식으로 달성된다. 첫 번째로, 재조합을 위한 유전자 분절의 무작위 선택이 기본적인 서열 다양성을 제공한다. 예를 들어, TRB 재조합은 47 고유 V, 2 고유 D 및 13 고유 J 생식계열 유전자 분절 사이에서 일어난다. 일반적으로, V 유전자 분절은 CDR1 및 CDR2 루프 둘 모두에 기여하고, 따라서 암호화된 생식계열이다. 서열 다양성을 생성시키는 두 번째 모드는 초가변 CDR3 루프 내에서 일어나는데, 이것은 재조합 V, (D) 및 J 유전자 분절 사이의 접합부에서, 주형 뉴클레오타이드의 무작위 결실 및 비-주형 뉴클레오타이드의 첨가에 의해서 생성된다.
TCR:CD3 복합체
성숙 αβ 및 γδ TCR 쇄 쌍은 ε, γ, δ 및 ζ라 지칭되는 다수의 액세서리 CD3 소단위를 갖는 복합체로 세포 표면에 제시된다. 이러한 소단위는 αβ 또는 γδ TCR과 3종의 이량체(εγ, εδ, ζζ)로서 회합한다. 이러한 TCR:CD3 복합체는 αβ 또는 γδ TCR과 동족 항원의 결속 시에 세포 신호전달 반응의 개시를 위한 단위를 형성한다. TCR:CD3 복합체로서 회합된 CD3 액세서리는 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)라고 불리는 신호전달 모티프에 기여한다. CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 각각은 단일 ITAM에 기여하는 반면, CD3ζ 동종이량체는 3개의 ITAM을 함유한다. 따라서 TCR과 조립되는 3개의 CD3 이량체(εγ, εδ, ζζ)는 10개의 ITAM에 기여한다. 동족 항원과의 TCR 결찰 시, 탠덤 타이로신 잔기의 인산화는 Src 상동 2(Src homology 2: SH2) 도메인, 예컨대, 중요한 70kDa의 ζ-쇄-연관된 단백질(ZAP-70)을 함유하는 단백질을 위한 짝지워진 도킹(docking) 부위를 생성한다. 이러한 단백질의 모집은 T-세포 활성화 및 분화에 궁극적인 책임이 있는 TCR:CD3 신호전달 복합체의 형성을 개시한다.
αβ T-세포
αβ T-세포는 일반적으로 γδ T-세포 반대부분보다 인간에서 더 풍부하다. 대부분의 αβ T-세포는 세포 표면 상에서 HLA 복합체에 의해서 제시된 펩타이드 항원과 상호작용한다. 이들 펩타이드-HLA(pHLA)-인식 T-세포는 처음으로 기술되었고, 가장 양호하게 특징규명되어 있다. αβ T-세포의 보다 희귀한 형태가 또한 기술되어 있다. 점막-연관된 불변요소 T(Mucosal-associated invariant T: MAIT) 세포는 비교적 제한된 α 및 β 쇄 다양성을 갖는 것으로 보이며, 단백질 단편이 아닌 박테리아 대사산물을 인식한다. 불변 자연 살해 T-세포(iNK T-세포) 및 생식계열-암호화된 마이콜릴-반응성 T-세포(GEM T-세포)는 비-HLA 분자에 의해서 교차 제시되는 당지질의 인식에 제한된다. iNK T-세포는 CD1d-제시된 당지질과 상호작용하는 것으로 광범위하게 간주되는 반면, GEM T-세포는 CD1b-제시된 당지질과 상호작용한다. T-세포의 추가 형태는 CD1a 및 CD1c와 관련하여 당지질과 상호작용한다고 생각되지만, 이러한 세포는 아직 상당히 상세하게 특징규명되어 있지 않다.
종래의 αβ T-세포
대부분의 αβ T-세포의 주요 특징은 HLA 분자와 관련하여 펩타이드 항원의 인식이다. 이것은 종종 '종래의' αβ T-세포라 지칭된다. 개체 내에서, 자가-HLA 분자는 자가 단백질 및 외부 단백질로부터의 펩타이드를 T-세포에 제공하여, 악성종양 및 외부 병원체에 대항하는 획득 면역, 공생 유기체, 식품 및 자신에 대한 획득 관용에 대한 본질적인 기준을 제공한다. HLA 단백질을 암호화하는 HLA 유전자좌는 인간 게놈의 가장 유전자 조밀하고, 다형성인 영역이며, 인간에서 기술된 12,000개 초과의 대립유전자가 존재한다. HLA 유전자좌에서의 고도의 다형성은 개체들 간의 펩타이드 항원 제시의 다양성을 보장하며, 이것은 집단 수준에서 면역에 중요하다.
HLA 클래스 I 및 II
전통적인 HLA 복합체의 2가지 형태가 존재한다: HLA 클래스 I(HLAI) 및 HLA 클래스 II(HLAII). 3종의 전통적인 HLAI 유전자가 존재한다: HLA-A, HLA-B, HLA-C. 이러한 유전자는 불변 β2-마이크로글로불린(β2M) 쇄와 회합된 막-연장 α-쇄를 암호화한다. HLAI α-쇄는 면역글로불린 폴드: α1, α2 및 α3를 갖는 3개의 도메인으로 구성된다. α3 도메인은 막-근위이고, 상당히 불변성인 반면, α1 도메인 및 α2 도메인은 함께 다형성 막-윈위 항원-결합 틈(cleft)을 형성한다. 6종의 전통적인 HLAII 유전자가 존재한다: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1. 이러한 유전자는 α-쇄 및 β-쇄를 포함하는 짝지워진 DP, DQ 및 DR 이종이량체 HLA 복합체를 암호화한다. 각각의 쇄는 면역글로불린 폴드를 갖는 2개의 주요 구조 도메인을 가지며, 여기서 α2 및 β2 도메인은 HLAI α3 도메인의 것과 유사한 막-근위이고, 상당히 불변인 모듈을 포함한다. HLAII α2 도메인 및 β2 도메인은 함께 막-윈위 항원-결합 틈을 형성하며, 이것은 고도로 다형성인 영역이다.
HLAI 및 HLAII의 항원-결합 틈은 8개의 역평행 β-시트의 플랫폼 상에 2개의 역평행 α-헬릭스를 포함한다. 이러한 틈에서 펩타이드 항원은 연장된 입체배좌 내에 결합되고, 제시된다. HLAI 및 HLAII 내의 펩타이드-접촉 잔기는 대부분의 서열 다형성의 위치이며, 이것은 상이한 HLA 대립유전자에 의해서 제시된 다양한 펩타이드 레퍼토리의 분자 기준을 구성한다. 이러한 펩타이드는 항원-결합 틈과의 광범위한 접촉을 만들고, 그 결과, 각각의 HLA 대립유전자는 제시된 펩타이드에 대한 별개의 서열 제약 및 선호를 부여한다. 따라서 주어진 펩타이드는 단지 제한된 수의 HLA에만 결합할 것이고, 상반되게 각각의 대립유전자는 주어진 단백질로부터의 펩타이드 수집물의 특정 분율 만을 수용한다. 각각의 개체에 제시된 HLAI 및 HLAII 대립유전자의 세트는 HLA 일배체형이라 지칭된다. HLAI 및 HLAII 유전자의 다형성 및 유전된 대립유전자의 공우성(co-dominant) 발현은 인간 집단 전체에서 HLA 일배체형의 매우 높은 다양성을 유도하는데, 이것은 αβ TCR의 막대한 서열 다양성과 커플링되는 경우, 이러한 HLA-항원-TCR 상호작용의 분석의 표준화에 대한 상당한 장애를 제공한다.
HLAI 및 HLAII의 αβ TCR 결속
αβ TCR은 HLA 및 펩타이드 항원(변경된 자가) 둘 모두의 잔기에 의해 형성된 혼합된 pHLA 결합 계면의 부분으로서 펩타이드를 인식한다. HLAI 복합체는 거의 모든 유핵 세포의 표면 상에 제시되며, 일반적으로 내인성 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제공하는 것으로 간주된다. 따라서 T-세포는, 상호작용 세포의 pHLAI 복합체를 샘플링함으로써 HLAI-제시 세포의 내인성 세포 프로테옴에서 정보를 얻을 수 있다. HLAI의 결속은, 상호작용 T-세포에 의한 TCR 공동수용체 CD8의 발현을 요구하고, 따라서, HLAI 샘플링은 CD8+ αβ T-세포에 제한된다. 이에 반해서, HLAII 복합체의 표면 제시는 전문적인 APC에 상당히 제한되고, 일반적으로 제시 세포에 외인성인 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제공한다고 간주된다. 따라서 상호작용 T-세포는, 제시 세포가 존재하는 세포외 미세환경의 프로테옴에서 정보를 얻을 수 있다. HLAII의 결속은, 상호작용 T-세포에 의한 TCR 공동수용체 CD4의 발현을 요구하고, 따라서 HLAII 샘플링은 CD4+ αβ T-세포에 제한된다.
αβ TCR의 흉선 선택
상기에 기술된 바와 같은 αβ TCR의 역할은 pHLA 복합체의 검출이어서, TCR-제시 T-세포는 면역의 확립에서 T-세포의 역할과 밀접한 관련이 있는 반응을 증가시킬 수 있다. 개체 내에서 생성된 αβ TCR 레퍼토리는, 특이적 일배체형과 관련하여 그리고 이의 실제 발생 이전에 마주할 가능성이 있는 모든 외부 항원의 상당하고 예측하지 못한 다양성을 처리해야 한다고 고려될 것이다. 이러한 결과는, 매우 다양하고, 상당한 수의 αβ TCR이 비특이적 pHLA 복합체를 인식할 가능성을 가지면서 유사-무작위화된 방식으로 생성되고, 자가 pHLA와의 강한 상호작용을 회피하도록 단지 특이적으로 지시된다는 배경으로 달성된다. 이것은 프로세스 호출 흉선 선택에서 T-세포 성숙 동안 신중하게 조직된다.
흉선에서 T-세포 성숙의 제1 단계 동안, 충분한 친화성으로 자가-pHLA 복합체와 상호작용할 수 없는 αβ TCR을 보유한 T-세포는 생존 신호가 박탈되고, 제거된다. 이러한 단계 호출된 양성 선택은, 살아남은 T-세포가 적절한 HLA 맥락으로 제공된 외부 또는 변경된 펩타이드를 적어도 잠재적으로 인식할 수 있는 TCR 레퍼토리를 보유한다는 것을 보장한다. 그 다음, 자가-pHLA와 강하게 상호작용하고, 따라서 자가면역을 유도할 가능성을 갖는 αβ TCR은 음성 선택의 과정을 통해서 능동적으로 제거된다. 양성 선택과 음성 선택의 이러한 조합은, 주변에 존재하는 자가-pHLA에 대해서 낮은 친화성을 갖는 αβ TCR을 보유하는 T-세포 만을 생성시킨다. 이것은 자가-제한적이지만, 자가-반응성이 아닌 αβ T-세포 레퍼토리를 확립한다. HLA 일배체형에 대한 T-세포 발생의 이러한 고도로 개별화된 특성은 αβ TCR-항원-HLA 상호작용의 표준화된 분석에서의 도전을 강조한다. 더욱이, 그것은 이식 거부 및 이식편대숙주병 둘 모두, 및 하나의 개체에서 식별된 αβ TCR이 제2 개체에서 완전히 상이한 효과를 가질 수 있다는 일반적인 원리(이것은 임상 실험에서 나타나는 TCR-기반 및 T-세포 기반 치료 및 진단 전략에 대한 명백한 영향을 가짐)의 이유가 된다.
비종래의 αβ T-세포
αβ T-세포의 비-HLA-제한된, 또는 '비종래의' 형태는 매우 상이한 분자 항원 표적을 갖는다. 이러한 비종래의 αβ T-세포는 전통적인 HLA 복합체와 결속하지 않지만, 보존된 HLA-유사 단백질, 예컨대, CD1 패밀리 또는 MR1과 결속한다. CD1 패밀리는 항원 교차-제시에 관여된 4종의 형태(CD1a, b, c 및 d)를 포함한다. 이러한 세포 표면 복합체는 α-쇄 유사 HLAI를 갖는데, 이것은 β2-M과 이종이량체를 형성한다. α-쇄의 막 윈위 표면에 제공된 작은 소수성 포켓은 병원체-유래된 지질-기반 항원에 대한 결합 부위를 형성한다. 선천적 유사 NK T-세포(iNK T-세포)는 또 다른 중요한 예를 나타내는 GEM T-세포와 함께 지질/CD1 패밀리 인식의 가장 잘 이해되는 예를 형성한다. '타입 I' iNK T-세포는 CD1d와 관련하여 지질 α-GalCer과 강하게 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 iNK T-세포는 고정된 TCR α-쇄(Vα10/Jα18) 및 제한된 수의 β-쇄(제한된 vβ 사용)로 매우 제한된 TCR 다양성을 나타내고, 이것은 선천적 병원체-연관된 분자 패턴(PAMPS) 인식 수용체, 예컨대, Toll-유사 및 Nod-유사 수용체에 비유되어 왔다. 이에 반해서, '타입 II' NK T-세포는 보다 다양한 TCR 레퍼토리를 제공하고, CD1d-지질 복합체 결속의 보다 다양한 모드를 갖는 것으로 보인다. GEM T-세포는 CD1b에 의해서 제공된 마이코박테리아-유래된 당지질을 인식하지만, CD1a, b 및 c에 의한 항원 제시의 분자 상세사항뿐만 아니라 이의 T-세포 인식은 단지 이해되는 초기 단계이다.
MAIT 세포는 불변 TCR α-쇄(TRAJ33, TRAJ20 또는 TRAJ12에 결찰된 TRAV1-2)를 과량으로 발현하는데, 이것은 TCR β-쇄의 어레이와 짝을 이룰 수 있다. 펩타이드 또는 지질 대신에 MAIT TCR은 HLAI-유사 분자, MR1에 의해서 제공된 병원체-유래된 엽산(folate)- 및 리보플라빈-기반 대사산물에 결합할 수 있다. MAIT TCR 상에서 관찰되는 TCR에서의 제한적이지만 상당한 다양성은 보존된 MR1과 관련하여 다양하지만 관련된 대사산물의 인식을 가능하게 하는 것으로 보인다.
비-전통적인 HLA-제한된 αβ T-세포 TCR이 성숙 동안 흉선에서 선택되는 방법은 양호하게 이해되어 있지 않다. 그러나, 상기에 제시된 음성 선택 및 양성 선택의 기본적인 과정이 여전히 적용되고, 일부 증거는 이것이 흉선 내에서의 특화된 틈새(niche)에서 일어난다는 것을 시사한다.
γδ T-세포
αβ TCR 발생 및 pHLA 결속의 상세한 기전적 이해에 비해서, 항원 표적 및 이의 γδ T-세포 반대부분의 내용에 대해서는 비교적 적게 공지되어 있다. 이것은 부분적으로는 순환하는 T-세포 구획에서의 이의 비교적 낮은 풍부도로 인한 것이다. 그러나, γδ T-세포는 엄격히 HLA 제한되지 않는다고 광범위하게 간주되며, 항체와 다르지 않게 표면 항원을 더 자유롭게 인식하는 것으로 보인다. 추가로, 보다 최근에, γδ T-세포는 외부 항원과 면역계의 주요 상호작용부위인, 상피 조직의 존재하는 T-세포 구획에 우세하게 존재할 수 있다는 것이 인식되었다. 또한, γδ T-세포 종양 면역감시 및 이상조절된-자가의 다른 형태의 감시에 대한 다양한 기전이 문헌에 출현하기 시작하고 있다. 선천적-유사 및 획득 γδ T-세포 둘 모두의 특이적 항원 표적은, 저조하게 정의되어 있지만, PAMP의 조직 분포 및 신속한 인식은 외부 항원에 대한 반응 초기에서 뿐만 아니라 획득 면역계가 여전히 성숙하고 있는 삶의 초기 둘 모두에 γδ T-세포에 대한 근본적인 역할을 시사한다.
γδ T-세포의 다양한 기능은 상이한 Vγ Vδ 유전자 분절 사용을 기반으로 하는 것으로 보이며, 상당한 불변 TCR을 갖는 γδ T-세포가 감염 동안 매우 초기에 PAMP의 선천적-유사 인식을 매개한다는 2개의 주요 카테고리로 광범위하게 이해될 수 있다. PAMP을 넘어서서, 이러한 유형의 γδ T-세포는 세포 스트레스, 감염 및 잠재적인 신생물 발달의 매우 초기 특징을 제공할 수 있는 인항원을 비롯한, 자가-분자를 인식한다고 추가로 여겨진다. PAMP의 인식 및 이러한 소위 위험 연관된 분자 패턴(danger associated molecular patterns: DAMPS)뿐만 아니라 다수의 조직-제한된 선천적-유사 γδ T-세포는, 이러한 세포가 이전 활성화, 귀소 및 클론성 확장에 대한 필요성 없이 항원 시험감염에 신속하게 반응하기에 적합하다는 것을 강하게 시사한다.
γδ T-세포의 제2 형태는 본래 보다 획득성이라고 간주되며, 상당히 다양한 γδ TCR 레퍼토리 및 림프 조직 주변을 순환하고, 림프 조직에 직접 접근하는 능력을 갖는다. 공통 인간 병원체, 예컨대, CMV에 대한 이러한 항원-특이적 γδ T-세포가 기술되어 있고, 그것은 기억 반응을 형성하는 것으로 보인다. 그러나, γδ T-세포는 활성화 후 단지 비교적 제한된 클론성 증식을 나타낸다는 것이 관찰되어 있고, 말초 순환 또는 조직에서 TCR 다양성 및 γδ T-세포의 특이적 반응의 정도에 대한 데이터는 거의 입수 가능하지 않다. 추가로, γδ TCR은 pHLA 복합체와 상호작용하지 않고, 따라서 이와 관련하여 펩타이드 항원과 결속하지 않는 것으로 일반적으로 간주되지만, γδ T-세포의 단지 소수의 항원 표적이 특징규명되어 있고, 기본적인 분자 프레임워크는 단지 저조하게 이해된다.
인간에서 말초 γδ T-세포의 낮은 빈도 및 조직-존재 T-세포의 연구 어려움으로 인해서, T-세포의 이러한 중요하고 다양한 유형이 획득 면역 반응에 어떻게 참여하는지에 대한 지식은 제한적이다. 이러한 최근 연구 분야는 희귀한 γδ T-세포를 포획 및 특징규명하고, 이의 TCR 쌍을 단리하고, 이의 동족 항원을 식별하는 매우 신뢰할 만한 기술을 필요로 한다.
항원 및 항원-제시 세포
T-세포 및 TCR과 관련하여, 항원은 TCR에 의해서 결속되어, T-세포 내에서 변환될 신호를 생성할 수 있는 임의의 분자로서 정의될 수 있다. 가장 잘 특징규명된 T-세포 항원은 HLAI 및 HLAII 복합체에서 제시되고, 종래의 αβ T-세포에 의해서 결속되는 펩타이드이다. 그러나, 최근에, 비-종래의 αβ T-세포 및 γδ T-세포가 지질, 지질펩타이드, 당펩타이드, 당지질 및 다양한 대사산물 및 이화산물(catabolite)을 비롯한, 항원으로서 광범위한 생물분자를 결속할 수 있다는 것이 명백해졌다. 또한, γδ T-세포가 완전히 폴딩된 단백질을 항체-유사 방식으로 직접 결속할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, HLA-제시된 펩타이드에 대해 상당히 제한될 T-세포 항원의 관점은 지난 이십년에 걸쳐서 대부분의 임의의 생물분자를 포함하도록 확장되었다. 이러한 개념을 염두하여, 그것은 항원-제시 세포(APC)로 간주될 수 있는 것을 정의하는 것에 관련된다.
상기 섹션에 정의된 바와 같이, HLAI 및 HLAII는 세포 유형에 걸쳐서 이질적인 발현 프로파일을 갖는다. 거의 모든 유핵 세포는 세포 표면 상에 HLAI 복합체를 제시하고, 따라서 T-세포 샘플링을 위한 펩타이드 항원을 제시하기에 유능하다고 널리 허용된다. 이에 반해서, HLAII는 제한된 발현 프로파일을 갖고, 적어도 정상 상태에서의 조건은 수지상 세포(DC), 대식세포 및 B-세포를 비롯한, 항원 제시에서 전문가 역할을 갖는 세포의 표면 상에서만 발현된다. 이러한 전문가 세포 유형을 종종 전문적인 APC라 지칭한다. 이러한 내용의 목적을 위해서, 용어 APC는 αβ 또는 γδ T-세포에 의한 샘플링을 위해서 항원을 제시할 수 있는 임의의 유핵 세포를 기술하는 데 사용된다. 이러한 항원은 특이적 항원-제시 복합체, 예컨대, HLA 및 HLA-유사 분자에서 '카고(cargo)'로서 제시된 것에 제한되지 않고, αβ 또는 γδ TCR-보유 세포에 결속할 수 있는 임의의 세포-표면 제시된 모이어티를 또한 포함할 수 있다.
TCR의 치료 용도
일차 T-세포의 입양 전달이 1990년대 초기에 임상 실험에서 먼저 시도되었고, 생체외 면역손상된 환자에서 바이러스 면역을 부여하기 위해서 바이러스 항원에 대해서 분극화된 생체외 확장된 T-세포에서 시작되었다. 특이적 암 항원에 대해서 생체외에서 확장된 일차 T-세포를 사용한 유사한 접근은 곧 악성종양의 치료에 시도되었다. 현재 도전으로 남아있는 이러한 초기 접근법에서의 하나의 제한은, 치료 제품에서 조성을 정밀하게 최적화할 필요성과 충돌하는, T-세포의 특성 및 다양성의 이해 부족이다. 현재, 생체외에서 확장된 일차 T-세포의 사용은, 바이러스 항원에 대해서 특이성을 갖는 일차 T-세포를 사용하는 소수의 계획을 제외하고는, 약제학적 분야에서 상당히 포기되었다.
최근, 일차 인간 세포에 유전 물질을 신뢰할 수 있게 도입하는 능력이 다양한 실험적인 유전적으로 변형된 T-세포 치료제에서 인지되었다. 이러한 치료 세포 생성물은, T-세포 반응의 능력을 견고하게 하고, 질환-연관된 항원 표적, 예를 들어, 악성 세포에 의해서 고유하게 발현되는 항원에 대해서 T-특이성을 재지향시키는 것을 목표로 한다. 이것은, 실제 TCR 쇄 쌍이 아니라 키메라 항원 수용체(CAR)의 수령자 T-세포의 전달에 상당히 좌우된다. CAR은 CD3-TCR 기능을 모방하는 합성 키메라 수용체를 생산하기 위해서, 신호 수용체 요소, 예컨대, CD3 복합체의 ζ-쇄에 그래프팅된 표적화 모이어티(가장 자주는 악성 세포의 표면 발현된 단백질을 표적화 하는 단일-쇄 항체 요소)를 나타낸다. 이러한 소위 CAR T-세포(CAR-T) 산물은 지금까지 임상 시험에서 혼합된 성공을 거뒀지만, 그럼에도 불구하고 이러한 가능성은 내재하는 고유한 분자 표적을 갖는 종양, 예컨대, B-세포 악성종양을 능가하는 것으로 해석되기에 용이하지 않다. 대안적으로, 전장 TCR 쇄 쌍 ORF의 T-세포 내로의 전달이 관심 대상이다. 이러한 TCR-조작된 T-세포 치료제는 현재 제조 공정의 문제점, CAR-T 산물과 유사하게, 검증된 항원 표적 및 표적화 작제물의 부족에 의해서 제한된다. 지금까지, 악성 세포 상의 HLAI에 의해서 제시된 펩타이드 항원의 인식을 위해서 αβ TCR을 사용하는 것에 초점이 맞춰져 있었고, 이러한 접근법의 기본적인 문제점은 악성 세포에 특이적인 항원에 대한 필요성이다.
TCR-pHLA 상호작용은 비교적 낮은-친화성을 갖기 때문에, 네이티브 TCR은 TCR-조작된 T-세포 치료제를 위한 최선이 아닌 것으로 간주되어 왔다. 몇몇 접근법은 단일-쇄 항체 친화성 성숙과 상당히 유사한 방식으로, 생체내에서 친화성-성숙 TCR을 고안하였다. 이러한 TCR 친화성 성숙 접근법은 일반적으로 또한 단일-쇄 포맷을 활용하는데, 여기서 하나의 쇄의 V-영역이 또 다른 쇄의 V-영역에 융합되어 단일 폴리펩타이드 작제물을 제조한다. 이어서 이러한 단일 폴리펩타이드가, 항체 조작 작업 흐름으로부터 개작되고, 표적 결합을 기준으로 몇몇 라운드의 선택을 통과한 파지- 또는 효모- 디스플레이 시스템에 사용될 수 있다. 2개의 내재하는 제한이, 기능성 TCR 쇄 쌍을 산출하는 것과 관련하여 이러한 단일-쇄 TCR 접근법에 존재한다. 먼저, 선택은 표적에 대한 결합 친화성을 기초로 한다. 그러나, TCR 친화성은 TCR 신호전달 산출물의 강도 또는 역량과 항상 상관관계가 있는 것은 아니라는 것이 양호하게 문헌화되어 있다. 두 번째로, 친화성을 기초로 하는 단일-쇄 작제물의 선택은 전장 수용체로서 재구성된 후 항상 동등한 친화성으로 번역되는 것은 아니다.
치료 관점에서, 친화성-성숙된 TCR 쌍에서의 추가적이고 결정적인 제한이 존재한다. 즉, 이의 서열이 변경되었음을 고려하면, 정의에 의해서 생성된 작제물은 흉선 선택에 더 이상 지배를 받지 않는데, 여기서 자가-항원에 강하게 반응하는 TCR은 레퍼토리로부터 결실된다. 따라서, 이러한 변형된 TCR은, 현재 방법을 사용하여 시험관내에서 제외시키기에 매우 어려운 자가-반응성인 내재하는 위험을 보유한다. 동일한 이유로 인해서, 치료 응용을 위한 임의의 선택된 또는 조작된 TCR은 개별화될 필요가 있다. TCR이 개체 전체에 적용되는 인공적으로 조작된 TCR 또는 네이티브 TCR인 경우, 교차 반응성은 잠재적으로 파국적인 자가면역을 회피하기 위해서, 각각의 특정 개체의 HLA 일배체형 및 제시된 펩타이드 레퍼토리를 기초로 제외되어야 한다. 이는, 흉선 선택이 주어진 개체의 것에만 특이적인 모든 사용 가능한 HLA 분자의 배경 상에서 수행된다는 사실로 인한 것이다. 이러한 교차 반응의 가능성은 불명확하다. 그러나, 동일한 종의 다른 개체의 pHLA 복합체를 외부물질로서 인식하는 TCR 레퍼토리의 능력은 획득 면역의 기본적인 특성이고, 이식 거부 및 이식편대숙주병을 뒷받침한다. 암-특이적 흑색종 연관된 항원(MAGE)에 대항하여 성숙된 TCR 쇄 쌍을 사용한 최근 임상 시험은 흉선 선택을 우회하는 잠재적인 문제를 강조하였다. 성숙된 TCR을 보유하는 자가유래 T-세포를 2명의 암 환자에게 다시 주입하였을 때, 이 환자는 치명적인 심장 질환이 신속하게 발달하였다. 후속 연구는, MAGE-특이적인 성숙된 TCR이 심장 단백질 티틴(titin)으로부터의 HLAI-제시된 펩타이드와 교차 작용성이었다고 결정하였다. 이는, 교차 작용성이 TCR의 치료 용도에서 구별되는 가능성이라는 것을 강하게 시사한다.
치료 목적을 위해서 TCR을 활용하는 별개의 방안은, 항체 치료 물질과 상당히 동일한 방식으로 친화성 시약으로서 이를 사용하는 것이다. 단일-쇄 TCR 분자를, 접합된 약물 물질의 특이적 HLA-항원 발현 세포 집단에 대한 전달에 대해서 시험하였다. 이러한 접근법은 일반적으로 CAR-T 또는 TCR 조작된 T-세포 치료제보다 안전한 것으로 간주되었는데, 그 이유는 약물 물질의 투여가 단순히 중단될 수 있기 때문이다. 그러나, 예측하기 어려운 교차 반응성 및 오프 타깃 효과에 대한 가능성이 이러한 설정에서 잠재적인 제한으로 존재한다.
임상 진단에서의 TCR 레퍼토리 검출
관련된 양상에서, 임상 진단 목적을 위해서 특이적 TCR 서열의 풍부도의 검출을 사용하는 것이 흥미로워지고 있다. 특히 딥(deep)-서열결정의 발달로 인해서, 특이적 맥락에서 개체 내에서의 완전 TCR 다양성을 광범위하게 그리고 매칭된 αβ 쌍에 대해서 이해하는 것이 가능하다. 이는, 환자에서 질환-연관된 항원에 대한 확립된 면역 반응에 대한 대용 판독물로서, 확장된 T-세포 클론의 풍부도를 단순히 검출함으로써, 특정 병태 및 질환 상태를 진단하기 위한 수단을 잠재적으로 나타낸다. 그러나, 이러한 포괄적인 접근법은 확립된 임상 시점에서 현재 매우 강한 면역 반응으로 제한되며, 서열결정을 통해서 식별된 임의의 특정 TCR의 특이적 항원 표적을 식별하는 데 있어서 근본적인 어려움을 겪는다.
T-세포 항원의 치료 및 진단 용도
획득 면역 반응을 사용한 근본적인 영향력은, TCR-항원 상호작용의 정교한 특이성이 각각의 병원체, 암 세포 또는 자가면역 질환과 특이적으로 연관된 항원의 상세한 지식을 필요로 한다는 점에서, 중추적인 기술적 도전으로 번역된다. 추가로, 각각의 항원은 특이적 항원 제시 복합체, 또는 이의 대립유전자에 의해서 제시될 수 있어서, 항원 발견이 각각의 관련된 HLA 유전자 및 대립유전자에 대해서 수행되었다. 강한 획득 면역 반응과 연관되고, 일반적으로 보존된 에피토프 반응 체계를 나타내는 몇몇 감염성 질환, 예컨대, HIV, 인플루엔자 및 CMV의 경우, 대부분의 중요한 에피토프는 일부 공통 HLA과 관련하여 맵핑되었다. 유사하게, 암, 알레르기 및 자가면역 분야는 연관된 T-세포 항원을 맵핑하기 위한 증가되고 조직적인 노력이 인지되었다. 그러나, 이것은 도전적인 절차이며, 상이한 임상 맥락과 연관된 T-세포 항원을 체계적으로 기술하기 위한 노력은 효율적이고, 강력하고, 신속하고 규모 확장 가능한 프로토콜의 부재에 의해서 방해된다.
구체적으로, 암 세포는 도전적이고 중요한 양상을 나타내는데, 그 이유는 악성 세포의 표면 상에 제시된 펩타이드 대부분이 자가 항원 또는 자가 항원과 매우 유사하기 때문이다. 따라서, 흉선 선택은 이러한 펩타이드를 강하게 인식할 수 있는 결실된 TCR을 가질 것이며, 동시에 종양은 면역 인식을 회피하도록 발달되었다. 이는, 확립된 종양에 대한 강력한 면역 반응은 비교적 희귀하고, 표적을 예측 또는 발견하기가 어렵다는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 반응은 존재하고, 중요하게는 더 양호한 결과와 일반적으로 연관된다. 이러한 반응의 표적, 종양-연관된-항원(TAA)은 대부분의 경우 자가로부터 구별되는 특징을 가질 것이고, 암 발달 동안 과발현되는 단백질로부터 유래되며, 그렇지 않았으면 이것은 이러한 발달 단계에서 세포 유형으로부터 존재하지 않았거나 유전자 돌연변이 또는 번역후 변형, 예컨대, 인산화를 통해 특이적으로 변경되었을 것이다.
입수 가능한 경우, 이러한 에피토프의 지식은 기본적인 발견, 진단 목적을 위해서 그리고 예를 들어 백신 효능의 시험으로서 연관된 T-세포 반응에서 정보를 얻는 것을 가능하게 한다. 중요하게는, 이것은 또한 알레르기 및 자가면역에서, 그리고 중요하게는, 특이적 면역요법에 대한 유용한 표적에 대한 지점에서 그리고 악성 세포에 대해서 T-세포 관용 유도(tolerization)를 위한 고도로 특이적인 표적을 제공한다. 악성종양은 세포 면역요법의 가능성으로서 특히 가치있는 표적을 나타내고, T-세포 조작에서의 진전은 암의 유형에 대한 특이적 마커가 입수 가능해지는 몇몇 경우를 넘어선 검증된 표적 TAA의 결핍에 의해서 둔화된다.
세포 요법의 가능성 및 검증된 표적의 결핍에 비추어, 특히 암을 치료하려는 노력에서, TCR-기반 면역요법의 가장 시급한 장애 중 하나는 유망한 TCR 항원의 식별이다.
TCR 및 T-세포 항원 분석의 기술적 양상
총괄적으로, TCR-기반 요법의 발달은 여전히 초기 단계이며, 성공은 제한적이었다. 진단 접근법은 엄청난 가능성을 갖지만, 환자 질환 상태 또는 치료에 대한 반응을 평가하는 것을 목표로 하는 제어된 임상 연구에 거의 적용되지 않는다. 네이티브 TCR 쇄 쌍의 믿을 수 있는 포획 및 높은 처리량 및 세포-세포 소통의 기능적 맥락에서의 TCR-항원 상호작용의 체계적인 분석을 위한 부족하게 개발된 기술은 TCR-기반 요법 및 진단법의 발달에 대한 주요 장애였다.
딥 서열결정 접근법은 건강한 상태 및 질환 상태에서 T-세포 수용체 다양성의 개선된 이해로 이어졌다. 그러나, 이러한 접근법은 일반적으로 주로 TCR β-쇄의 CDR3 영역을 연장하는 짧은 스트레치에 초점을 맞추고 있다. 대부분의 연구는 TCR α-쇄의 기여를 무시하였으며, 몇몇이 짝지워진 αβ 쇄뿐만 아니라 흥미로울 것으로 결정된 TCR의 항원 특이성을 분석하려고 하였다. 단일 세포 캡슐화 및 유전자 바코딩을 사용한 최근 작업 흐름은 네이티브 TCR αβ 또는 γδ 쇄 쌍의 짝지움 및 전장 서열의 분석을 가능하게 하였지만, 이러한 작업 흐름은 실험적인 것으로 남아있다.
단리된 TCR 쇄 쌍은 항원 특이성의 관점에서 생물물리학 또는 기능성 모드로 분석될 수 있다. 생물물리학 분석은 TCR뿐만 아니라 분석물 항원 둘 모두의 재조합 생산을 가용성 형태로 필요로 한다. HLA-제한된 TCR의 경우에, 따라서 이것은 모든 개별 TCR뿐만 아니라 동족 pHLA 복합체의 생성을 요구한다. 이것은 기술적으로 매우 도전적이고, 느리고 매우 낮은-처리량이다. 추가로, 이러한 분석은 상호작용 친화성을 단지 제공할 것인데, 이것은 기능성 특징과 예측 가능한 방식으로 양호하게 관련되지 않는다.
최근까지, 세포 맥락에서 단리된 TCR 서열의 상세한 기능성 분석은 분석물 TCR 쇄 쌍을 일차 T-세포 또는 불멸 T-세포주 내로 형질주입하는 실험적 프로토콜, 및 세포 활성화의 전통적인 유세포 분석에 의한 세포 반응의 검출 또는 항원 시험감염 시 형질주입된 세포로부터의 분비된 인자의 검출로 제한되었다. 구오(Guo) 등에 의한 최근 간행물에서, 단일-세포로부터의 짝지워진 TCR 쇄의 신속한 클로닝, 발현 및 기능성 특징규명이 보고되었다(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054). 이러한 연구에서, 분석물 인간 αβ TCR 쌍은 αβ TCR 발현이 결핍되고, TCR 자극 시 활성화되는 Nur77 프로모터에 연결된 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 시스템을 함유한 리포터 세포주에서 발현되었다. 이러한 시스템은 리포터 세포주 게놈 내에서의 표준화된 TCR 통합의 결핍으로 인해서 비효율적이며, APC 요소에 의한 세포-결합된 항원 시험감염을 위한 체계적인 방식을 제공하지 않는다.
공지된 T-세포 항원에 대한 TCR의 식별을 위한 작업 흐름과 유사하게, 건강한 상태 및 질환 상태에서 신규 T-세포 항원의 신생 발견은 매우 도전적이다. 대부분의 접근법은 본래 생물물리학적이며, 면역화 프로토콜로 또는 상기에 다룬 바와 같은 동족 TCR의 식별을 통해서 시험될 수 있는 후보물질 항원을 생산하는 것을 목적으로 한다. T-세포 항원 발견 분야에는 표준화가 거의 또는 전혀 존재하지 않으며, 이 분야는 학문적 연구로 상당히 제한된다.
치료 및 진단 용도 둘 모두에서 TCR 및 이의 동족에서의 축적된 관심 및 상당한 수의 네이티브 TCR αβ 및 γδ 쇄 쌍을 포획하는 수단의 출현으로, TCR-항원 상호작용의 체계적인 분석을 위한 신뢰할 만한 높은-처리량 및 표준화된 기술이 부족하다. 중요하게는, TCR 및 항원 둘 모두가 생존 가능한 세포에 의해서 제시되는 세포-세포 소통의 본래 맥락에서 TCR 쇄 쌍의 기능성 분석에 대한 표준화된 시스템이 부족하다. 더욱이, 후보물질 항원의 큰 라이브러리를 분석물 TCR-보유 세포 또는 시약에 제공하기 위한 체계적인 수단이 부족하다.
T-세포 항원의 치료 용도
T-세포 생물학의 신속하게 확장되는 지식으로, 치료 제형에서 T-세포 항원을 사용하는 것으로 관심이 확장되었다. 대부분 이것은 일부 유형 면역화 전략의 형태를 갖는다. 가장 우세하게, 차세대 서열결정 접근법의 사용은 종양 세포에서 상당한 수의 그러한 돌연변이된 서열을 식별할 수 있다. 이러한 서열은 암 세포에 고유한 잠재적인 T-세포 항원을 나타낼 수 있고, 따라서 서열결정된 종양에 대한 개인화된 치료 백신을 위한 면역원을 나타낼 수 있다. 그러나, 관찰 가능한 다수의 유전자 돌연변이로 인해서, 환자 HLA 레퍼토리에 의해서 제시되는 이의 능력에 대해서 잠재적인 T-세포 항원을 분석하는 것도 그리고 이러한 항원이 면역원성인지의 여부를 분석하는 것도 높은-처리량 방식으로 가능하지 않다. 현재, 돌연변이 펩타이드 결합의 예측은 매우 적은 수의 HLA 대립유전자에 대해서 컴퓨터에 의해서 수행된다. 이러한 예측 모델은 주어진 펩타이드 서열이 HLA에 결합할 것인지의 여부를 대략적으로 알려주며, 일반적으로 결합된 항원의 잠재적인 면역원성을 예측하지 않는다. 더욱이, 이러한 컴퓨터 모델은 분석될 HLA 대립유전자에 비해서 정규 '앵커링' 잔기를 제시하지 않는 항원에 대해서는 신뢰할 만하지 않다.
예를 들어, 알레르기 및 자가면역 증후군을 위한 관용 요법 및 병원체에 대한 예방적 백신화를 비롯한, 다른 면역화 접근법은 T-세포 항원의 상세한 지식을 요구하였다. 예방적 백신의 후자 예에서, 놀랍게도 몇몇 HLA 대립유전자를 제외한 모두에서 일반적인 병원체로부터의 T-세포 항원에 대한 지식이 부족하다. 일반 및 응급 병원체를 위한 효과적인 백신을 개발하기 위해서 이러한 지식을 확장하는 체계적인 접근법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 상기에 언급된 요구를 다룬다. 특히, 본 발명은 조작된 항원-제시 세포(eAPC), 조작된 게놈 수용자 부위 및 매칭 유전자 공여자 벡터인 적어도 3종의 성분으로 구성된, 다성분 시스템의 작제, 조립 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 항원 및 동족 TCR 서열의 식별 및 특징규명을 위한 항원성 분자의 다양한 형태를 제시하는 안정적인 유도체 세포를 신속하고, 높은 처리율로 생성하기 위해서 사용된다. 구체적으로, eAPC는, APC를, 인간 백혈구 항원(HLA) 분자, HLA-유사 분자 및 항원-제시 분자 및 항원성 분자의 별개의 형태의 세포 표면 제시에 대해서 널(null)로 만드는 게놈 편집에 의해서 조작된다. 또한, 다성분 시스템의 부분으로서의 eAPC는 항원-제시 분자 암호화 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 삽입, 및 선택적으로 유전적으로 암호화된 분석물 항원의 삽입을 위한 게놈 수용자 부위를 함유한다. 시스템은 분석물 항원 분자- 및/또는 항원-제시 복합체 암호화 ORF를 신속하게 전달하기 위해서 APC의 게놈 수용자 부위를 표적으로 하도록 설계된 유전자 공여자 벡터를 추가로 포함한다. 다성분 시스템은 임상 면역진단제에서 분석 시스템으로서 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 면역치료제 및 면역진단제의 생산을 위한 T-세포 항원 및 동족 TCR을 식별 및 특징규명하기 위한, 다성분 시스템의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다양한 분석물 eAPC 형태의 조립을 위한 고도로 표준화된 시스템을 체계화된 방식으로 가능하게 한다. 이러한 표준화 및 체계화는 항원-제시 복합체 및 항원성 분자 ORF와 매칭된 공여자 벡터 / 게놈 수용자 부위 서브시스템의 고도로 한정되고 제어 가능한 게놈 통합을 통해서 달성된다. 이러한 제어 가능하고 예측 가능한 시스템은 eAPC 집단을 생성시키는 공정에 상당한 효율성을 제공하여, 이러한 공정에 대한 사이클 수 및 비용을 감소시킨다. 이전 시스템은 지정되지 않은 게놈 통합 및/또는 바이러스 접근법을 사용하는 무작위 통합에 의존하였다. 더욱이, 시스템의 설계는 통합된 ORF의 제어 가능한 카피수, 통상적으로 단일 카피를 부분적으로 보장하는 것인데, 이것은 통합된 ORF 산물의 달성 가능한 발현 수준 보다 엄격한 제어를 허용한다. 보다 중요하게는, 벡터 풀로부터의 ORF의 단일-카피 통합의 능력은 소위 '샷건 통합'을 허용하는데, 여기서 공여자 벡터와 통합된 각각의 세포는 ORF의 다양한 집단을 잠재적으로 암호화하는, 벡터의 라이브러리로부터 단일 ORF를 단지 수용할 수 있다. 이것은, 공여자 벡터 내에 암호화된 ORF 라이브러리의, 클론성 eAPC 하위-집단당 단일의 목적하는 분석물 ORF를 발현하는, 본질적으로는 박테리오파지 또는 효모 디스플레이 시스템과 유사한 세포-기반 어레이 시스템을 나타내는 eAPC 라이브러리로의 전환을 가능하게 한다. 이러한 어레이 시스템은, eAPC에 의해서 제시되는 경우 이의 TCR 또는 다른 친화성 시약 반응성을 기초로 서열의 라이브러리 내의 미지의 분석물 항원 서열의 식별, 및 이어서 담체 eAPC로부터의 미지의 '반응성' 서열의 회수를 가능하게 할 수 있다. 더욱이, 샷건 통합은 표적 세포 내에서 각각의 분석물 항원의 효율적인 생산을 허용한다. 대형 풀의 분석물 항원 서열의 일시적인 형질주입(이것은 임의의 주어진 분석물 항원을 위해서 사용 가능한 극미한 수준의 전사물을 초래함)과 비교할 때, 샷건 통합에 의해서 생성된 eAPC 라이브러리 내의 각각의 세포는 eAPC에 의해서 표면 제시를 위한 단일 분석물을 견고하게 발현할 것이어서, 다양한 수단에 의한 상기 분석물 항원의 식별을 가능하게 한다.
본 발명은 조작된 다성분 시스템의 제공에 관한 것이며, 이의 성분은 1종 이상의 분석물 eAPC를 제조하는 데 사용된다. 이어서 이러한 분석물 eAPC는 1종 이상의 분석물 TCR(총괄적으로 eAPC:TCR 시스템, eAPC:T)과 조합되어 하나 이상의 산출물을 수득하며, 여기서 분석물 TCR은 가용성 시약 또는 고정된 시약으로서 제공될 수 있거나 세포의 표면 상에 제시되거나 또는 비-세포 기반 입자(NCBP)에 의해서 제시될 수 있다. eAPC는 후보물질 분석물 항원을 분석물 TCR에 제시한다.
다성분 시스템의 최소 형태는 게놈 수용자 부위인 성분 B로서 제2 성분을 함유하는, 성분 A라고 지정된 eAPC로서 제1 구성성분을 포함하고, 제3 성분은 성분 C라고 지정된 유전자 공여자 벡터이다(도 1).
eAPC는 시스템의 모든 다른 성분이 관련된 다성분 시스템의 기본 성분을 나타낸다. 따라서, eAPC는 네이티브이거나 또는 조작되고, eAPC를 분석물 eAPC 집단을 생성시키기 위해서 사용하고, 이의 용도에 적합하게 만드는 특정 특징부를 함유한다.
본 발명에서 eAPC, 성분 A는,
i. 항원-제시 복합체(aAPX) 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)의 적어도 1종의 패밀리의 내인성 표면 발현이 결핍되어 있고,
ii. 성분 B라고 지정된 적어도 하나의 게놈 수용자 부위를 함유하며,
여기서 i)은 aAPX 및/또는 aAM의 상기 발현이 결핍된 자연 발생 세포 집단의 선택에 의해서 수득될 수 있거나, 또는 이러한 발현이 결핍되도록 조작될 수 있고, ii) 이것은 합성적이고, 이것은 유도된 또는 비유도된 게놈 통합에 의해서 도입될 수 있다.
자연 발생 세포 집단으로부터의 목적하는 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 eAPC 세포 후보물질의 선택은 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해서 달성될 수 있다. 이는, 표적 세포를, eAPC로부터 결핍되는 것이 바람직한 aAPX 및/또는 aAM에 대해서 특이적인 친화성 시약으로 표적 세포를 염색하고, 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 직접 달성될 수 있다.
aAPX 및/또는 aAM 발현을 결핍시키기 위한 세포의 조작은 비표적화 수단 및 표적화 수단에 의해서 달성될 수 있다. 세포의 비표적화 돌연변이발생은, 세포에 화학적, 방사선학적 또는 다른 돌연변이원을 제공하고, 이어서 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다. 게놈 유전자좌의 표적화된 돌연변이는,
i. 아연-핑거 뉴클레아제,
ii. CRISPR/Cas9 매개된 표적화,
iii. 합성 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)
를 통한 부위 지향된 돌연변이 발생을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 상이한 수단을 통해서 달성될 수 있고, 여기서 상기 부위-지향된 뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 부위-특이적 DNA-수선 오류 돌연변이발생을 유도하고, 그 후 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 돌연변이된 세포가 수득된다.
성분 A인 eAPC는 추가적인 T-세포 공자극 수용체를 선택적으로 포함할 수 있는데, 여기서 이러한 특징부는 분석물 TCR-제시 세포(분석물 TC)에 대한 분석물 eAPC의 소통의 견고하거나 다양한 형태를 허용하며, 여기서 조정 가능한 소통은 특이적 분석물 TCR 및/또는 분석물 항원의 식별 또는 특징규명과 관련된다. 본 발명에서, 분석물 TC에 대한 CD28 결찰의 상이한 형태는 CD80, CD86 및/또는 추가의 B7 패밀리 단백질 중 하나 이상의 포함에 의해서 촉진될 수 있다.
성분 A인 eAPC는 분석물 TC와의 eAPC 결속 및 면역학적 시냅스의 형성을 촉진시키기 위해서, 또는 각각 조합된 eAPC:T 시스템 내에서의 강한 결합 및 유해한 세포 클러스터링의 형성을 방지하기 위해서, 도입된 세포 표면 접착 분자 성분, 또는 내인성 세포 표면 접착 분자의 절제를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 ORF로서 성분 A에 도입되거나, A로부터 유전적으로 절제될 수 있는 이러한 접착 분자는 접착 단백질의 인테그린 패밀리로부터 선택될 수 있다.
eAPC는 네이티브 가공 및 적재 머시너리에 의해서, aAPX:aAM이라고 지정된, aAPX 내에 항원을 카고로서 가공 및 적재하는 능력을 선택적으로 보유할 수 있다. 네이티브 가공 및 적재 머시너리에 의해서 항원을 카고로서 aAPX 내에서 가공 및 적재하는 능력을 보유하는 eAPC는 또한 eAPC 또는 그것이 함유된 배양계에 고유한 카고 분자(CM)를 가공 및 적재할 것이며, 여기서 CM이 적재된 aAPX는 aAPX:CM 복합체로서 지정된다(도 17).
최소 다성분 시스템의 제2 성분은 유전자 공여자 벡터인 성분 C이며, 이것은 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 사용된다(도 1).
성분 C는 eAPC인 성분 A의 게놈 내에 함유된 성분 B의 게놈 수용자 부위와 커플링된 유전자 공여자 벡터이다. 성분 C는, 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된, aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF를 게놈 수용자 부위, B에 통합시키도록 설계되며, 여기서 통합은 표적 eAPC에 의한 aAPX 및/또는 aAM의 발현을 초래한다.
본 발명에서, 짝지워진 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플로서 기술된다.
다성분 시스템의 확장된 형태에서, 성분 A eAPC는 성분 D라고 지정된 제2 게놈 수용자 부위를 추가로 함유할 수 있는데, 이것은 시스템에 또한 첨가되는, 성분 E라고 지정된 제2 게놈 공여자 벡터에 커플링된다(도 2). 다성분 시스템은 1종 이상의 추가적인 통합 커플을 추가로 포함할 수 있다.
eAPC 및 하나 또는 2개의 통합 커플 중 하나를 포함하는, 다성분 시스템이 하기 유도체 eAPC 형태의 제조를 위해서 사용되며:
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
여기서 각각의 유전자 공여자 벡터는, i)이 적어도 1종의 aAPX를 발현하고, ii)이 적어도 1종의 aAM을 발현하고, iii)이 적어도 1종의 aAPX 및 적어도 1종의 aAM을 발현하도록, 상기 ORF를 커플링된 게놈 수용자 부위에 통합하기 위한, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF를 함유할 수 있다(도 3).
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 다성분 시스템의 통합 커플 서브시스템으로서 작동한다. 유전자 공여자 벡터는 먼저 표적 ORF와 조합되어야 하며, 기본 공여자 벡터는 이제 이러한 표적 ORF를 암호화한다. 이어서, 이러한 조립된 프라이밍된 공여자 벡터는 표적 eAPC에 도입되어 게놈 수용자 부위에 대한 표적 ORF(들)를 교환함으로써, 표적 ORF를 표적 세포의 커플링된 수용자 부위에 통합한다(도 4).
유전자 공여자 벡터 성분 C 및/또는 E를 포함하는 다성분 시스템은 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF와 조합되어 성분 C' 및/또는 E'를 수득할 수 있고, 여기서 조합은 유전자 공여자 벡터의 적절한 암호화 프레임(correct coding frame)(들) 내로의 그리고 적절한 배향(들)으로의 유전 물질의 결찰로서 정의된다.
1종 이상의 ORF의 유전자 공여자 벡터 C 및/또는 E 내로의 조합은,
i. 다수의 ORF를 암호화하는 C' 및/또는 E' 벡터의 개별 라이브러리를 수득하기 위한 단일 개별 반응
ii. 다수의 ORF를 암호화하는 C' 및/또는 E' 벡터의 풀링된 라이브러리를 수득하기 위한 단일 반응
으로서 고유한 ORF의 라이브러리를 사용하여 수 회 수행될 수 있으며, 여기서 개별 라이브러리는 고유한 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 고유한 ORF를 갖는 eAPC의 개별 라이브러리를 수득하도록 성분 A와 수 회 조합될 수 있거나, 또는 풀링된 라이브러리는 고유한 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 고유한 ORF를 각각 갖는 eAPC의 풀링된 라이브러리를 수득하도록 단일 사례로서 성분 A와 조합될 수 있다.
1종 이상의 ORF의 예측 가능한 카피 수의, 게놈 수용자 부위 내로의 효율적인 통합은, 분석물 eAPC 집단이 신속하게 제조 및 특징규명될 수 있는 표준화된 eAPC의 작동에 상당히 이롭다. 따라서, 게놈 수용자 부위(들) 및 커플링된 공여자 벡터(들)는 eAPC의 기능에 중요하다. 추가로, 성분 B 및 D가 서로 격리되어, 공여자 벡터 성분 C가 성분 B에서 통합할 수 없거나, 그 역인, eAPC를 갖는 것이 상당히 바람직하다. 또한, 성분 B 및/또는 B는, 단일의 정의된 aAPX- 및/또는 aAM-함유 작제물의 도입이 단지 단일 분석물의 정확한 통합 및 전달의 높은 가능성으로, 신속하고, 반복 가능한, eAPC의 제조 방법에서 처리될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
게놈 수용자 부위는 하기로부터 선택될 수 있고:
i. 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물,
ii. 부위 지향된 상동 재조합을 위해 설계된 합성 작제물,
iii. 부위 지향된 상동 재조합을 위한 네이티브 게놈 부위,
여기서 i)이 바람직하다. RMCE 방법은, 개별 리콤비나제 효소에 특이적인 선택된 이종특이적 부위를 사용할 수 있어서, 각각의 성분 B 및 D는 격리된 특이성을 보유한다.
게놈 수용자 부위인 성분 B 및/또는 성분 D는 하기 유전 요소 중 적어도 하나를 포함한다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소,
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터(insulator),
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
xiv. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
xv. 코작 공통서열.
바람직한 게놈 수용자 부위는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 배열을 포함할 것이다. 제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
식 중,
A)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
B)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C)는 요소 xv) 코작 공통서열이고,
D)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커이고,
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 v) 진핵생물 종결인자이다.
제2 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마커를 암호화하는 2종의 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]- 3'이고,
식 중,
A)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
B)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C)는 요소 xv) 코작 공통서열이고,
D)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 1이고,
E)는 요소 v) 진핵생물 양방향성 전사 종결인자이고,
F)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 2이고,
G)는 요소 xv) 코작 공통서열이고,
H)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
I)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고;
추가로, 이러한 제2 배열에서 요소 F, G 및 I는 안티센스 방향으로 암호화된다.
성분 C 및/또는 E는 하기 유전 요소 중 적어도 하나를 포함한다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소,
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터,
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
xiv. 바이러스 자가-절단 f 요소,
xv. 코작 공통서열,
xvi. 통합의 선택 마커,
xvii. 항생제 내성 카세트,
xviii. 박테리아 복제 기점,
xix. 효모 복제 기점,
xx. 클로닝 부위.
유전자 공여자 벡터의 바람직한 실시형태에서, 성분 C 및/또는 성분 E는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 가능한 배열을 포함할 것이다.
제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF를 전달하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' - [A] [B] [C] [D] [E] - 3'이고,
식 중,
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF의 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
E)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 다수의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
제2 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 2종의 ORF를 전달하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' - [A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
식 중,
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는, 진핵생물 종결인자를 갖는, 2종 이상의 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 xv) 코작 공통서열(안티센스 방향)이고,
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 각각의 ORF 내에서 다수의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
다성분 시스템을 사용한 분석물 eAPC의 제조
상기에 기술된 다성분 시스템을 다양한 방식으로 사용하여, 작동 시에 조합된 eAPC:T 시스템 내에서 분석물 TCR에 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM 및 aAPX:CM을 제시하기 위해서 제공되는, 분석물 eAPC의 별개의 형태, 또는 이의 라이브러리를 제조할 수 있다(도 27 참고).
단일 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAPX에 대한 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-p를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면 상에 제시된다(도 5).
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAPX에 대한 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-p를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면에 존재한다. 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 6).
단일 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAM에 대한 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-a를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 세포 표면에 존재하거나 또는 세포 내에 유지된다(도 7).
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAM에 대한 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-a를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 세포 표면에 존재하거나 또는 세포내에 유지된다. 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 8).
단일 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 2종의 ORF(하나는 aAPX를 암호화하고, 나머지는 aAM을 암호화함)와 조합된 성분 C'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다(도 9).
2종의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 2종의 ORF(하나는 aAPX를 암호화하고, 나머지는 aAM을 암호화함)와 조합된 성분 C'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다. 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 10).
2종의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAPX 또는 aAM을 암호화하는 하나의 ORF와 각각 조합된 성분 C' 및 E를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 B 또는 D에 통합되어, B' 및 D'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다(도 11).
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 먼저 aAPX를 암호화하는 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면에 존재한다(eAPC-p 중간체). 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 E'가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터는 aAM을 암호화하는 ORF와 조합되어 이러한 aAM이 부위 E에 통합되어, E'를 생성한다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 이것은 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 12).
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 먼저 aAM을 암호화하는 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPM이 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM(eAPC-a 중간체)을 발현한다. 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 E'가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터는 aAPX를 암호화하는 ORF와 조합되어 이러한 aAPX가 부위 E에 통합되어, E'를 생성한다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면 상에 존재한다. 제1 단계에서 통합된 aAM은 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 13).
eAPC로부터 분석물 eAPC-p, eAPC-a 및 eAPC-pa 집단을 제조하는 상기에 언급된 예에서, 다성분 시스템을 사용하여 정의된 방식으로 공지된 aAPX 및 aAM 후보물질을 제공하여 정의된 aAPX 및/또는 aAM을 발현하는 분석물 eAPC의 개별 집단을 제조한다. 이러한 공정은 수 회 반복되어 eAPC-p, eAPC-a 및 eAPC-pa의 라이브러리를 제조하여 시스템의 작동 시에 조합된 eAPC:T 시스템을 제공할 수 있다. 대안적인 접근법은 유전자 공여자 벡터와 조합된 후보물질 aAPX 및/또는 aAM ORF의 풀링된 라이브러리를 취하고, 이것을 단일 반응으로 통합하여 다수의 aAPX, aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는 분석물 eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 수득하는 것이다. 벡터의 풀을 eAPC-p, -a, 및/또는 -pa의 풀로 전환시키는 공정은 샷건 통합이라 지칭될 것이다. 이것은, 고정된 aAPX에 대한 고정된 후보물질 aAM의 큰 라이브러리 또는 그 역을 분석하는 경우 특히 유용하다.
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 먼저 aAPX를 암호화하는 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 세포 표면 상에서 제공된 aAPX를 발현한다(eAPC-p 중간체). 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 다수의 E'의 라이브러리가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터의 라이브러리는 aAM을 암호화하는 단일 ORF와 각각 조합된 벡터의 풀을 포함하여 각각의 aAM이 부위 E에 통합되어, 단일 세포 내에 E'를 생성한다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였다. 제2 단계에서 통합된 aAM은 제1 단계에서 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 14).
2개의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, 먼저 aAM을 암호화하는 ORF와 조합된 성분 C'를 제공하여, 이러한 aAPM이 부위 B에 통합되어, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM인 eAPC-a 중간체를 발현한다. 제2 통합 커플 D/E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 다수의 E'의 라이브러리가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터의 라이브러리는 aAPX를 암호화하는 단일 ORF와 각각 조합된 벡터의 풀을 포함하여 각각의 aAPX가 부위 E에 통합되어, 단일 세포 내에 E'를 생성한다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAPX ORF를 통합하였다. 제1 단계에서 통합된 aAM은 제2 단계에서 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 15).
2종의 통합 커플을 포함하는 다성분 시스템을 사용하여, aAPX의 라이브러리 또는 aAM의 라이브러리를 암호화하는 ORF의 라이브러리와 각각 조합된 성분 C' 및 E를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 B 또는 D에 통합되어, B' 및 D'를 생성하도록 함으로써, 성분 A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAPX ORF 및 단일 부작위 aAM ORF를 통합하였다. 풀링된 라이브러리에서 각각의 세포 내에서, 통합된 aAM은 동일한 세포 내에 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 풀링된 라이브러리는 제공된 aAPX 및 aAM의 세트로부터의 aAPX:aAM의 모든 가능한 조합을 함유할 것이다(도 16).
eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 제공하는 상기에 언급된 샷건 통합 방법에서, 시스템의 견고성은 게놈 수용자 부위의 단일 카피에 관련된다. 이는 단지 단일 분석물이 통합 커플을 통해서 각 세포에 도입될 수 있음을 보장하기 위한 것이다. 이러한 단일-카피 게놈 수용자 부위는 eAPC의 선택적인 양상인데, 그 이유는 동일한 게놈 수용자 부위의 다수의 카피가, 제공된 벡터의 라이브러리로부터의 다수의 '대립유전자'가 제조된 eAPC에서 수득될 수 있는 통합 단계를 제공하기에 이로울 수 있기 때문이다.
본 발명에서, aAPX는 하기 중 하나로부터 선택될 수 있다:
i. HLA 클래스 I의 1종 이상의 구성원,
ii. HLA 클래스 II의 1종 이상의 구성원,
iii. 1종 이상의 비-HLA 항원-제시 복합체.
본 발명에서, aAPX는 하기 중 하나로부터 선택될 수 있다:
i. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
ii. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
iii. 분석물 항원으로서 제공된 펩타이드,
iv. 분석물 항원으로서 제공된 대사산물,
v. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
vi. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
vii. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 펩타이드,
viii. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 폴리펩타이드,
ix. 성분 A 대사체를 변경시킴으로써 유래된 대사산물.
분석물 eAPC와 분석물 TC의 접촉
본 발명은 조작된 다성분 시스템을 제공하는 것에 관한 것이다. 성분 A 및 1종 이상의 성분 C' 및/또는 1종 이상의 성분 E'를 사용하여 1종 이상의 분석물 eAPC 집단을 제조한다. 이어서, 이러한 분석물 eAPC는 1종 이상의 분석물 TCR과 조합되어 eAPC:TCR 분석 시스템(eAPC:T)을 컴파일링하여 1종 이상의 산출물을 수득하는데(도 27), 여기서 eAPC는 분석물 항원을 제공하고, 여기서 분석물 TCR은 하기에 의해서 표현될 수 있고:
i. TCR 분자 및/또는
ii. 분석물 항원에 대해서 친화성을 갖는 분자,
여기서 분석물 TCR은 하기와 같이 표현되는 eAPC:T 시스템 내에서 상이한 모드로 eAPC에 제시될 수 있고:
i. 분석물 TCR 제시 세포(TC) 및/또는
ii. 가용성 또는 고정된 친화성 시약 및/또는
iii. 비-세포 기반 입자(NCBP),
여기서 i) 분석물 TCR 제시 세포(TC)는 분석물 TCR을 eAPC에 제시할 수 있는 임의의 TC로 간주되며; ii) 친화성 시약은 eAPC:T 시스템에서 eAPC의 세포 표면에서 프로브 TCR 결합 및/또는 자극에 대한 분석물로서 제조된 임의의 시약인 것으로 간주된다. 이러한 시약은 종종 eAPC를 염색하는 데 사용되는 분석물 TCR 다량체 시약(예를 들어, TCR '사량체')을 나타낼 것이다. 이와 관련하여 친화성 시약은 또한 항체 또는 유사한 엔티티를 나타낼 수 있고; iii) 비-세포 기반 입자(NCBP)는, 그 입자가 분석물 TCR 또는 eAPC:T 시스템 내에서 eAPC의 표면에서 분석물 항원 결속에 대해서 평가될 다른 엔티티를 나타내기 때문에, 친화성 시약과 유사한 방식으로 작용한다. 그러나, NCBP는 제시된 분석물 TCR 또는 다른 결합 엔티티의, 직접 또는 대리로, 식별인자로서 작용할 유전자 또는 다른 정보를 추가로 보유할 수 있는 더 큰 엔티티로서 간주된다. NCBP의 전형적인 예는 파지-디스플레이 시나리오의 박테리오파지일 것인데, 여기서 파지는 항체 단편 항원 결합(FAB)을 디스플레이할 수 있다. 양성으로 표지된 eAPC는 파지를 따라서 회수되고, 서열결정되어 eAPC의 표면에서 분석물 항원에 대해 특이적인 FAB를 식별할 수 있다.
추가로, 분석물 TCR의 세포 제시는 총괄적으로 분석물 TC라 지칭되는, 하기 중 임의의 것의 형태일 수 있다:
i. 일차 T-세포,
ii. 재조합 T-세포,
iii. 조작된 TCR 제시 세포,
iv. 분석물 항원에 대해서 친화성을 갖는 분자를 제시하는 조작된 세포.
분석 eAPC:T 시스템은 분석물 eAPC 집단 중 1종 이상 및 더 많은 분석물 TCR의 선택으로 구성된다(도 27). 분석물 eAPC 집단은 상기에 기술된 다성분 시스템을 사용하여 제조된다(도 3 내지 16). eAPC:T 시스템은 분석물 eAPC와 분석물 TCR 간의 물리적 접촉을 허용하는 포맷으로 제공되는데, 여기서 이러한 접촉은 분석물 eAPC에 의해 제시되는 1종 이상의 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 복합체 형성을 허용한다.
분석물 항원은, 분석물 TCR이 eAPC:T 시스템에서 추정상으로 결속될 수 있는 임의의 엔티티를 나타내고, 하기에 의해서 표현될 수 있고;
i. aAPX(분석물 항원-제시 복합체) 및/또는
ii. aAM(분석물 항원성 분자) 및/또는
iii. aAPX:aAM(분석물 항원성 분자를 제시하는 분석물 항원-제시 복합체) 및/또는
iv. CM(비-분석물 카고 분자) 및/또는
v. aAPX:CM(카고 분자를 제시하는 분석물 항원-제시 복합체),
여기서 aAPX는 aAM을 제시할 수 있는 복합체를 나타내고; aAM은 TCR에 의해서 또는 aAPX에 적재되는 경우 직접 인식되는 임의의 분자이고; aAPX:aAM은 적재된 aAM을 갖는 aAPX이고; CM은 aAPX에 적재될 수 있지만 분석물이 아니어서, 그 자체가 분석물 항원 제시 세포(APC) 또는 검정 시스템으로부터 유래될 수 있는 카고 분자이고; aAPX:CM은 적재된 CM을 갖는 aAPX이다.
본 발명에서, eAPC:T 시스템은 하기로 구성되고:
i. 단일 분석물 eAPC의 입력물; 또는
ii. 분석물 eAPC의 풀링된 라이브러리의 입력물,
하기 중 하나와 조합된다:
iii. 단일 분석물 TC의 입력물; 또는
iv. 단일 분석물 친화성 시약의 입력물; 또는
v. 단일 분석물 NCBP의 입력물; 또는
vi. 분석물 TC의 풀링된 라이브러리의 입력물; 또는
vii. 분석물 친화성 시약의 풀링된 라이브러리의 입력물; 또는
viii. 분석물 NCBP의 풀링된 라이브러리의 입력물.
완충계 중에서의 접촉
분석물 eAPC와 분석물 TC 간의 접촉은 관대한 세포 배양계 또는 완충 배지 중에서 수행되는데, 여기서 상기 계는 분석물 eAPC 및 분석물 TC 세포 둘 모두 또는 분석물 친화성 시약, 또는 분석물 NCBP의 기능에 관대한 배지를 포함한다.
가용성 분석물 TCR, 고정된 분석물 TCR 및/또는 분석물 NCBP와, 분석물 eAPC 간의 접촉은 관대한 완충계에서 수행될 수 있는데, 여기서 상기 계는 분석물 TCR 및 분석물 eAPC 세포 둘 모두의 기능에 관대한 완충 배지를 포함한다.
eAPC의 친화성 시약 또는 NCBP로의 표지
다성분 시스템으로부터 수득된 분석물 eAPC를 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원의 특징규명을 위해서 사용할 수 있다. 이러한 특징규명은, 분석물 eAPC가, 고정된 또는 가용성 친화성 시약 또는 NCBP와, eAPC를 표지하도록 하는 방식으로 접촉되는 방식으로 수행될 수 있다(도 24).
eAPC의 표지는 유세포 분석법, 현미경관찰법, 분석법 또는 발광법과 같은 방법을 통해서 또는 대안적으로 분석물 항원의 식별을 위해서 고정된 친화성 시약 또는 NCBP를 사용하여 포획하는 것에 의해서, 표지를 직접적으로 관찰함으로써 검출되는 것으로 간주될 수 있다.
신호 반응 정의
다성분 시스템으로부터 제조된 분석물 eAPC는 분석물 TCR에 대한 분석물 eAPC의 신호 반응의 특징규명을 위해서 사용되며, 여기서 이러한 신호 반응은 2진법적 또는 등급화될 수 있고, 포함되는 경우, eAPC(도 21) 및/또는 분석물 TC(도 20)에 내재하는 것으로 고유한 것으로서 측정될 수 있다. 이러한 신호는 방법, 예컨대, 유세포 분석법, 현미경관찰법, 분석법 또는 발광법 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 통해서 검출될 수 있다.
일반적인 방법 - eAPC의 선택
1종 이상의 분석물 eAPC를 수득하기 위하여, 조합된 eAPC:T 시스템으로부터, 입력 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 방법(여기서 발현된 분석물 항원은 1종 이상의 분석물 TCR에 결합함)은,
i. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 TCR과 조합하여 분석물 항원과 분석물 TCR을 접촉시켜서, 하기 단계 중 적어도 하나의 측정하는 단계를 초래하는 단계:
ii. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
iii. 표지된 분석물 TCR로부터 신호를 측정하는 단계 및/또는
iv. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 eAPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
v. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 TC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계; 및
vi. 단계 ii, iii, iv 및/또는 v를 기초로 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하며,
여기서 i, iv 및 vi 또는 i, v 및 vi은 바람직한 배열을 포함한다.
일반적인 방법 - 분석물 TCR의 선택
1종 이상의 분석물 TCR을 수득하기 위하여 입력 분석물 TCR 또는 분석물 TCR의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 TCR을 선택하는 방법(여기서 발현된 분석물 항원은 1종 이상의 분석물 TCR에 결합함)은,
i. 1종 이상의 분석물 APC를 1종 이상의 분석물 TCR과 조합하여, 분석물 APC에 의해서 제시된 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 접촉을 초래하는 단계; 및
ii. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
iii. 표지된 분석물 TCR로부터 신호를 측정하는 단계 및/또는
iv. 존재하는 경우, 분석물 TCR과 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 TC에서 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
v. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCR과 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된 분석물 APC에 의한, 신호 반응을 측정하는 단계; 및
vi. 단계 ii, iii, iv 및/또는 v로부터 1종 이상의 분석물 APC를 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하며,
여기서 i, iv 및 v는 바람직한 배열을 포함한다.
신호 반응에 대한 일반적인 방법
보고된 신호 반응을 기초로 조합된 eAPC:T 시스템으로부터 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC 및/또는 친화성 시약 및/또는 NCBP를 선택하는 방법은 하기를 포함한다:
i. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
ii. eAPC가 이러한 반응 회로를 함유하는 경우 및/또는 분석물 TC가 동등한 합성 리포터 회로를 함유하는 경우, 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
APC 및/또는 분석물 TC에 내재하는 유도된 네이티브 또는 합성 신호 반응은 하기 중 하나 이상에서의 증가 또는 감소를 검출함으로써 측정되며:
i. 분비된 생물분자,
ii. 분비된 화학물질,
iii. 세포내 생물분자,
iv. 세포내 화학물질,
v. 표면 발현된 생물분자,
vi. 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 세포독성 작용,
vii. 신호 반응이 분석물 APC에 의해서 유도되고, i 내지 v 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 파라크린(paracrine) 작용,
viii. 분석물 TC의 증식,
ix. 분석물 TC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스,
여기서 상기 검출된 신호 반응은, 조합된 eAPC:T 시스템 및/또는 평행한 조립된 조합된 시스템의 조립 이전에 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC에 내재하는 비-유도된 신호 반응 상태와 비교되고, 여기서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC는 사용 시에 조합된 eAPC:T 시스템 내에서 신호 반응을 유도하지 않는 것으로 공지된 대조군 분석물 항원 및/또는 분석물 TCR 종 및/또는 가용성 분석물 항원을 제시할 수 있다.
표지 및/또는 신호 반응에 의한 선택 방법
상기 친화성 시약 또는 NCBP에 의한 eAPC의 측정 가능한 표지를 기초로 조합된 eAPC:T 시스템으로부터 분석물 eAPC 및/또는 분석물 친화성 시약 및/또는 분석물 NCBP를 선택하는 방법은,
i. 친화성 시약 또는 NCBP에 의한 eAPC의 표지를 결정하는 단계를 포함하며, 또한
ii. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
iii. eAPC가 이러한 반응 회로를 함유하는 경우 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계를 포함할 수 있고,
여기서 eAPC의 표지를 검출함으로써 eAPC 및/또는 친화성 시약 및/또는 NCBP를 선택하는 것은 친화성 시약 및/또는 NCBP 상의 검출 가능한 표지를 비롯하여, 친화성 시약 및/또는 NCBP에 의한 eAPC의 표면 표지를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 검출 가능한 표지는 형광, 발광, 분광법, 화학, 방사선화학 또는 친화성 모이어티일 수 있다. 따라서, eAPC의 이러한 선택은 FACS, MACS 또는 동등한 고-처리량 스크리닝 및 선택 방법에 따라 수행될 수 있다.
요약
조합된 eAPC:T 시스템에서, 1종 이상의 분석물 eAPC 또는 1종 이상의 분석물 TC에서 신호 반응을 측정하는 것, 또는 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 매개될 수 있는 eAPC의 표지(도 27 단계 iv)는, 일차 시스템 산출물(도 27 단계 v)의 선택에 중요한데, 여기서 일차 시스템 산출물은 단일 세포 또는 세포의 풀, 및/또는 단일 친화성 시약 또는 친화성 시약의 풀 및/또는 단일 NCBP 또는 NCBP의 풀이다. 여기서 세포 또는 시약의 선택은, 접촉된 분석물 eAPC 또는 분석물 TC 세포 중 하나 및/또는 둘 모두에서 또는 친화성 시약 또는 NCBP로의 eAPC의 측정 가능한 표지를 통해서, 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재 하에서 일어날 수 있다.
eAPC:T 시스템으로부터의 일차 시스템 산출물의 수득
본 발명은 조작된 다성분 시스템을 제공하는 것에 관한 것이다. 성분 A 및 1종 이상의 성분 C' 및/또는 1종 이상의 성분 E'를 사용하여 1종 이상의 분석물 eAPC 집단을 제조한다. 이어서, 이러한 분석물 eAPC를 eAPC:T 시스템을 통해서 1종 이상의 분석물 TCR과 조합하여 1종 이상의 산출물을 수득한다. 분석물 TCR은 가용성 시약 또는 고정된 시약으로서 제공되거나 세포의 표면 상에 제시되거나 또는 비-세포 기반 입자(NCBP)에 의해서 제시된다. 분석물 TCR의 세포 제시는 총괄적으로 분석물 TC라 지칭되는, 하기 중 임의의 것의 형태일 수 있다:
i. 일차 T-세포,
ii. 재조합 T-세포,
iii. 조작된 TCR 제시 세포,
iv. 분석물 항원에 대해서 친화성을 갖는 분자를 제시하는 조작된 세포.
시스템은 분석물 eAPC 집단 중 1종 이상 및 더 많은 분석물 TCR의 선택으로 구성된다(도 27). 분석물 eAPC 집단은 상기에 기술된 다성분 시스템을 사용하여 제조된다(도 3 내지 16). eAPC:T 시스템은 분석물 eAPC와 분석물 TCR 간의 물리적 접촉을 허용하는 포맷으로 제공되는데, 여기서 이러한 접촉은 분석물 eAPC에 의해 제시되는 1종 이상의 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 복합체 형성을 허용하며, 여기서 분석물 항원은 하기 중 임의의 것이고:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM,
여기서 분석물 TCR은 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과의 잠재적인 결속을 위해서, 분석물 TC에 의해서 제시된 바와 같이, 또는 가용성 또는 고정된 분석물 친화성 시약 중 어느 하나에 의해서 제시된 바와 같이, 또는 분석물 NCBP에 의해서 제시된 바와 같이 제공되어, 복합체 형성은 이러한 복합체의 안정화로 이어질 수 있고, 여기서 eAPC의 표지로 이어지며 그리고/또는 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC 내에서의 신호전달의 유도가 보고 및 측정될 수 있다.
eAPC를 보고하고/하거나 표지하는 유도된 신호 반응의 모드는 상기에 기술되어 있고, 이것은 eAPC:T 시스템으로서 컴파일된 다성분 시스템의 일차 산출물을 수득하는 데 있어서 측정될 필요가 있는 이러한 보고된 반응 및/또는 표지이다.
eAPC:T 시스템으로부터의 일차 산출물은 선택된 세포 집단 및/또는 선택된 친화성 시약 또는 선택된 NCBP이며, 여기서 선택은 하기를 기초로 수행되고:
i. 친화성 시약 또는 NCBP에 의한 eAPC의 측정 가능한 표지 및/또는
ii. eAPC에서의 검출된 신호 반응 및/또는
iii. eAPC에서의 검출된 신호 반응의 결핍 및/또는
iv. 분석물 TC에서의 검출된 신호 반응 및/또는
v. 분석물 TC에서의 검출된 신호 반응의 결핍;
여기서 일차 산출물은 단일 세포, 또는 세포의 풀 및/또는 1종 이상의 eAPC-연관된 친화성 시약 또는 NCBP로서 표현될 수 있다.
조합된 eAPC:T 시스템으로부터의 분석물 친화성 시약, NCBP 또는 분석물 TC 및/또는 분석물 eAPC의 선택은 접촉한 세포에서의 반응을 기초로 수행될 수 있다. 즉, 분석물 TC는 접촉한 분석물 eAPC에서, 보고된 반응, 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있다. 이에 반해서, 분석물 eAPC는 접촉한 분석물 TCR에서, 보고된 반응 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있거나, 또는 분석물 TC가 분석물 친화성 시약 또는 NCBP인 경우에, 분석물 친화성 시약 또는 NCBP는 eAPC 반응으로부터 선택될 수 있다.
시스템으로부터의 일차 eAPC 및/또는 분석물 TC 산출물은 선택된 세포이며, 여기서 선택은 분석물 TC 또는 eAPC 중 어느 하나에서 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 수행되며, 이러한 세포는 1종 이상의 eAPC 및/또는 1종 이상의 분석물 TC를 포함할 수 있고, 여기서 선택된 세포는 단일 세포, 동일한 아이덴티티의 세포의 풀, 상이한 아이덴티티의 세포의 풀을 포함할 수 있다(도 27 단계 v).
일차 분석물 친화성 시약 또는 시스템으로부터의 NCBP 산출물은 연관된 친화성 시약 또는 NCBP를 사용하거나 사용하지 않고 선택된 세포이고, 여기서 선택은 분석물 eAPC에 의한 표지 또는 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 수행되며, 여기서 선택된 친화성 시약 또는 NCBP는 단일 친화성 시약 또는 NCBP, 친화성 시약 또는 동일한 아이덴티티의 NCBP의 풀, 친화성 시약 또는 상이한 아이덴티티의 NCBP의 풀을 포함할 수 있다(도 27 단계 v).
2상 조성물로부터의 산출물
조합된 eAPC:T 시스템에서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC에서의 보고된 신호를 사용하여 분석물 세포 집단을 선택하여 일차 산출물을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 분석물 eAPC의 일차 산출물이 예에서 달성될 수 있는데, 여기서 조합된 eAPC:T 시스템은, 2상 시스템으로부터의 분석물 TCR로 표지된 목적하는 분석물 eAPC 집단을 선택함으로써 1종 이상의 분석물 eAPC와 분석물 TCR의 2상 조성물을 갖는다(예를 들어, 도 24).
분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP의 일차 산출물이 예에서 달성될 수 있는데, 여기서 조합된 eAPC:T 시스템은, 2상 시스템으로부터의 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP로 표지된 목적하는 분석물 eAPC 집단을 선택함으로써 1종 이상의 분석물 eAPC와 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP의 2상 조성물을 갖는다(예를 들어, 도 24).
eAPC 및/또는 분석물 TC 유형의 일차 산출물은, 조합된 eAPC:T 시스템이 고정된 분석물 eAPC 및 풀링된 라이브러리 분석물 TC 특성을 갖는 예(예를 들어, 도 22), 또는 조합된 eAPC:T 시스템이 조합된 배양계로부터 목적하는 분석물 APC 및/또는 분석물 TC 집단을 선택함으로써 고정된 분석물 TC 및 분석물 eAPC 특성의 풀링된 라이브러리를 갖는 예(예를 들어, 도 23)로부터 달성될 수 있다.
분석물 eAPC의 일차 산출물은, 조합된 eAPC:T 시스템이 고정된 분석물 TCR 및 풀링된 라이브러리 분석물 eAPC 특성을 갖는 예(예를 들어, 도 24), 또는 조합된 eAPC:T 시스템이 조합된 배양계로부터 목적하는 분석물 eAPC 집단을 선택함으로써 고정된 eAPC 및 가용성 분석물 친화성 시약 또는 NCBP 특성의 풀링된 라이브러리를 갖는 예로부터 달성될 수 있다.
분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP의 일차 산출물은, 조합된 eAPC:T 시스템이 고정된 가용성 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP 및 풀링된 라이브러리 분석물 eAPC 특성을 갖는 예(예를 들어, 도 24), 또는 조합된 eAPC:T 시스템이 조합된 배양계로부터 목적하는 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP 집단을 선택함으로써 고정된 eAPC 및 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP 특성의 풀링된 라이브러리를 갖는 예로부터 달성될 수 있다.
산출물의 수득 모드
일차 산출물이 수득될 수 있는 몇몇 별개의 모드가 존재하는데, 여기서 각각의 모드는 세포 분류 단계를 수반한다. 분류는 형광-활성화 세포 분류(FACS) 및/또는 자성-활성화 세포 분류(MACS) 및/또는 별개의 친화성-활성 세포 분류 방법을 통해서 달성될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 분석물 TC 세포, 및/또는 eAPC-연관된 친화성 시약 또는 NCBP는 단일 세포를 수득하기 위한 단일 세포 분류에 의해서 그리고/또는 세포의 풀을 수득하기 위한 풀에 대한 세포 분류에 의해서 수득될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 분석물 TC 세포는 단일 세포를 수득하기 위한 단일 세포 분류 및 선택적으로 후속으로 선택된 eAPC 또는 분석물 TC 세포의 단클론성 풀을 수득하기 위한 단일 세포의 과성장에 의해서 수득될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 분석물 TC 세포는 또한 세포의 풀을 수득하기 위한 풀에 대한 세포 분류 및 선택적으로 후속으로 선택된 eAPC 및/또는 TC 세포의 풀을 수득하기 위한 세포의 풀의 과성장에 의해서 수득될 수 있다.
eAPC:T 시스템으로부터의 최종 시스템 산출물 수득
일차 산출물을 수득하는 상기에 기술된 방법 이후에, 여기서 일차 산출물은 측정된 신호 반응 또는 안정적인 복합체 형성을 기초로 선택된, 선택된 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC 및/또는 분석물 NCBP여서, eAPC:T 시스템으로부터의 최종 산출물은 선택된 eAPC 및/또는 분석물 TC 및/또는 NCBP 일차 산출물의 추가 가공을 통해 수득될 수 있다(도 27, 단계 vi).
다성분 시스템으로부터의 최종 산출물은, 분석물 APC 또는 분석물 TC 또는 분석물 친화성 시약 또는 분석물 NCBP에 의해서 제시되고, 조합된 eAPC:T 시스템으로부터 이의 선택에 의해서 다성분 시스템으로부터 일차 산출물로서 수득된, 하기의 아이덴티티이다:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM 및/또는
vi. TCR.
eAPC:T 시스템 내에서, 분석물 eAPC 및 분석물 TC에 의해서 제시된 분석물 분자가 유전적으로 암호화된 경우가 종종 존재한다. NCBP가 예를 들어 박테리오파지인 경우, 분석물 NCBP가 유전적으로 암호화된 아이덴티티를 갖는 경우가 또한 존재할 수 있다. 따라서, 분석물 eAPC 또는 분석물 TC 또는 분석물 NCBP에 의해서 제시된 분석물 분자를 식별하기 위해서, 제조된 분석물 eAPC, TC 및 NCBP의 유전자 서열결정이 수행될 수 있다.
선택된 일차 산출물은, 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 세포의 게놈 또는 전사체를 위해서 수득되어 하기의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM 및/또는
vi. 분석물 TCR,
여기서 수득된 아이덴티티는 eAPC:T 시스템으로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
유전 성분을 보유하는 NCBP는 유전자 서열이 분류된 NCBP의 게놈 또는 전사체를 위해서 수득되어 분석물 TCR의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고, 여기서 수득된 아이덴티티는 eAPC:T 시스템으로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
eAPC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 TC 세포의 성분 B' 및/또는 성분 D'를 위해서 수득되어 분석물 항원의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고, 여기서 분석물 항원의 수득된 아이덴티티는 eAPC:T 시스템으로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
분석물 TC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 TC 세포의 게놈 또는 전사체를 위해서 수득되어 분석물 TCR의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고, 여기서 TCR의 수득된 아이덴티티는 eAPC:T 시스템으로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
유전자 서열결정은 특별하게 가공하거나 가공하지 않고, 다양한 모드에 의해서 그리고 유전 물질 공급원의 배열로부터 달성될 수 있다. 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행될 수 있다:
i. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
ii. 성분 B' 및/또는 D' RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
iii. 성분 B' 및/또는 D'의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
서열결정 단계는 다성분 시스템으로부터 일차 산출물로서 수득된, eAPC 또는 TC, NCBp, 또는 이의 풀에 대해서 파괴적일 수 있다.
eAPC:T 시스템으로부터 일차 산출물을 수득하는 것이 바람직한 경우(여기서 서열결정 단계는 일차 산출물 eAPC에 대해서 파괴적임), 다성분 시스템의 최종 산출물로서 수득된 서열 정보를 사용하여 분석물 eAPC와 동등한 산출물 eAPC를 제조할 수 있다.
유전적으로 암호화된 분석물 분자의 상기에 기술된 시나리오에서, eAPC:T 시스템의 최종 산출물은 성분 B' 및/또는 D'로부터, 그리고/또는 세포 게놈 및/또는 전사체로부터 서열 정보를 수득함으로써 수득될 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서 항원 정보는 유전적으로 암호화되지 않을 것이다. 번역후 변형된 항원, 비-유전학적 수단을 통해서 조합된 eAPC:T 시스템에 제공된 항원, eAPC 프로테옴 또는 대사산물의 유도된 또는 변형된 상태로부터 출현한 항원, eAPC:T 시스템에 내재하는 CM은 유전자 서열결정 수단을 통해서 타당하게 식별될 수 없다.
비-유전학적 수단에 의해서 eAPC:T 시스템에 제공될 수 있는 aAM의 중요한 경우에서, APC가 제공된 aAM을 aAPX:aAM 복합체로서 제시할 수 있는 2가지의 별개의 모드가 존재한다. 제1 시나리오에서, aAM은 aAPX에 직접 결합될 수 있는 형태로 제공되고, 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체를 형성한다(도 18). 이러한 aAM의 예는 HLA 복합체에 대한 펩타이드 항원일 것이다. 제2 시나리오에서, aAM은 분석물 eAPC에 의해서 취해질 수 있는 형태로 제공되고, 그것이 카고로서 aAPX 내에 적재되어 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체를 형성하도록 가공된다(도 19).
aAM 카고 또는 CM 카고를 선택 및 식별하는 방법(여기서 카고는 다성분 시스템의 일차 산출물로서 선택 및 수득된 eAPC의 aAPX에 적재된, 대사산물 및/또는 펩타이드임)은,
i. aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 또는 카고 aM 또는 카고 CM을 단리하는 단계, 및
ii. 적재된 카고를 식별하는 단계를 포함하고,
여기서 식별된 적재된 카고(CM 또는 aAM)는 다성분 시스템의 최종 산출물을 나타낸다.
일반적으로 카고 분자가 선택된 APC로부터 식별될 수 있는 2가지 모드가 존재한다. 첫 번째로, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM로부터의 카고의 강제 방출은 후속 식별을 위해서 사용 가능한 aAM 또는 CM의 단리를 초래한다(도 25). 이의 예는 eAPC를 산 세척하여 HLA 복합체로부터 펩타이드 aAM을 해방시키는 것이다. 두 번째로, 예를 들어, 복합체의 해방 및 면역친화성 단리 방법에 의한, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM의 포획은, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 복합체의 단리를 초래하여, aAM 또는 CM이 식별될 수 있다(도 26).
단리된 aAM 및/또는 CM을 직접, 또는 단리된 aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 복합체로부터 식별하는 방법은,
i. 질량 분석법 분석
ii. 펩타이드 서열결정 분석을 포함할 수 있고,
여기서 함유된 aAM 및/또는 CM 아이덴티티는 다성분 시스템으로부터의 최종 산출물이다.
eAPC:T 시스템을 사용한 분석물 항원에 대한 분석물 TCR의 친화성 결정
일차 산출물(여기서 일차 산출물은 측정된 신호 반응을 기초로 선택된, 선택된 분석물 eAPC 세포임)을 수득하는 상기에 기술된 방법 이후에, eAPC 일차 산출물을 친화성 분석에 적용하여 동족 분석물 TCR에 대한 분석물 항원의 친화성을 결정할 수 있는데, 여기서 분석물 항원은,
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM
중 임의의 것이며, 여기서 분석물 TCR은 가용성 친화성 시약으로 제공되거나 또는 분석물 TC 또는 분석물 NCBP에 의해서 제시되어, 분석물 항원의 친화성은 하기 방법에 따라서 결정된다:
i. 선택된 분석물 eAPC를 다양한 농도에서 분석물 TCR로 표지하는 단계
ii. 단계 a의 염색된 분석물 eAPC 상에서 FACS 분석을 수행하는 단계
iii. 분석물 eAPC의 형광 표지의 강도를 분석물 TCR의 다양한 농도에 걸쳐서 결정하는 단계
iv. 분석물 TCR에 대한 분석물 항원의 친화성을 계산하는 단계.
본 발명에서, 분석물 항원의 친화성은 또한 이미 기술되어 있는 방법에 의해서 결정될 수 있되, 여기서는 표지된 참조군이 또한 포함되어, 참조군 형광 강도에 대한 분석물 항원 형광 강도의 비를 사용하여 친화성이 계산될 수 있으며, 여기서 표지된 참조군은 하기로부터 선택된다:
i. 분석물 항원 중 하나에 대한 친화성 시약으로 표지된 분석물 eAPC
ii. 표지된 참조군 분석물 항원을 제시하는 세포 또는 입자.
본 발명은 하기 비제한적인 도면에서 추가로 설명된다.
도 1 - 단일 통합 커플 다성분 시스템의 성분의 설명.
3종의 성분을 포함하는 MCS의 예. 제1 성분 A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC A는 1종의 추가 성분 B를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 1종의 추가적인 성분 C는 부위 B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다. 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 2 - 이중 통합 커플 다성분 시스템의 성분의 설명.
5종의 성분을 포함하는 MCS의 예. 제1 성분 A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC A는 2종의 추가 성분 B 및 D를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 2종의 추가적인 성분 C 및 E는 각각 부위 B 및 D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 짝지워진 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 3 - 상이한 분석물 항원 제시 eAPC의 제조
MCS는 eAPC에서 시작하고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 생성시킨다. aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라 지칭되고, ORF(들)를 암호화하는 aAPX를 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 i). aAM 단독을 발현하는 eAPC는 eAPC-a라 지칭되고, 여기서 aAM은 세포 표면에서 발현될 수 있고, TCR 결속을 위해서 사용 가능하거나, 또는 카고로서 aAPX 내에 aAPX:aAM 복합체로서 가공 및 적재될 필요가 있다. eAPC A는 ORF(들)를 암호화하는 aAM을 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). aAPX에서 aAM을 카고로서 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라 지칭된다. eAPC-pa는 aAM 및 aAPX 암호화 ORF를 eAPC에 동시에 도입하는 것(단계 iii); aAM 암호화 ORF(들)를 eAPC-p에 도입하는 것(단계 iv); aAPX 암호화 ORF(들)를 eAPC-a에 도입하는 것(단계 v) 중 어느 하나에 의해서 생산될 수 있다.
도 4 - 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위 통합 커플의 작동
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플을 형성하는데, 여기서 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 1종 이상의 ORF가 이의 커플링된 게놈 수용자 부위에 특이적으로 통합될 수 있다. 통합 커플의 작동에서의 단계 1은 1종 이상의 표적 ORF를 공여자 벡터에 도입하는 것이다. 초기 공여자 벡터는 X라 지정되고, 표적 ORF(들)의 도입에 의해서, 프라이밍된 공여자 벡터 X'로 변형된다. 단계 2는 프라이밍된 공여자 벡터 X'와, 게놈 수용자 부위 Y를 보유한 세포의 조합을 수반한다. 프라이밍된 공여자 벡터에 의해서 암호화된 ORF의 수용자 부위로의 도입은 통합된 부위 Y'를 보유한 세포의 생성을 초래한다.
도 5 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-p의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다.
도 6 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-p의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않는다.
도 7 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-a의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다.
도 8 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-a의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다.
도 9 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다.
A eAPC는 공여자 벡터 C'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다.
도 10 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다. A eAPC는 공여자 벡터 C'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다.
도 11 - 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAM을 암호화한다. A eAPC는 동시에 공여자 벡터 C' 및 E'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 동시에, E'의 ORF는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환되어 부위 D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다.
도 12 - eAPC-p를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAM을 암호화한다. 단계 1에서, A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않는다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-p는 E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E'를 가져서 부위 D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 발현된 aAPX의 카고로서 세포 표면 상에서 aAM의 발현, 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 13 - eAPC-a를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAM을 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAPX를 암호화한다. 단계 1에서, A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAM의 발현 및 eAPC-a의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-a는 E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E'를 가져서 부위 D'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 카고로서 aAM을 갖는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 14 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 제조
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 E' i 내지 iii의 풀이 D에 커플링된다. 공여자 벡터 E' i 내지 iii 각각은 단일 aAM 유전자를 암호화한다. eAPC-p는 동시에 공여자 벡터 E' i, E' ii, E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAM 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAM 유전자 중 하나를 aAPX:aAM으로서 제시하는 B'의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 15 - eAPC-a로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 제조
eAPC-a는 aAM를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 E' i 내지 iii의 풀이 D에 커플링된다. 공여자 벡터 E' i 내지 iii 각각은 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC-a는 동시에 공여자 벡터 E' i, E' ii, E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAPX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 B'에 암호화된 aAM과, 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAPX 유전자 중 어느 하나의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 16 - aAM 및 aAPX 유전자의 조합 짝지움을 함유하는 eAPC로부터의 풀링된 eAPC-pa 라이브러리의 샷건 제조
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 커플링된다. 공여자 벡터 C' i 및 C' ii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화하고, 공여자 벡터 E' i 및 E' ii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC A는 공여자 벡터 C' i, C' ii, E' i 및 E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C' i 또는 C' ii를 가져서 각각 aAM에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 B' i 및 B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E i 또는 E ii를 추가로 가져서 각각 APX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 E' i 및 E' ii를 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 유전자 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 aAPX:aAM 쌍을 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 17 - 내재하는 카고 CM을 발현하는 eAPC-p로부터의 eAPC-p:CM의 생성
게놈 재조합 부위로부터의 aAM의 발현의 부재 하에서, eAPC-p 상의 aAPX 분자는 내재하는 카고 분자 CM을 aAPX:CM 복합체로서 표면 상에 제시할 수 있다.
도 18 - eAPC-p로부터의 eAPC-p + aAM의 생성 및 가용성의 제시 가능한 항원 aAM의 첨가
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'를 함유한다. 가용성의 직접 제시 가능한 항원 aAM은 eAPC-p와 조합된다. 이는 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체의 형성을 초래하고 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 19 - eAPC-p 및 가용성 aAM으로부터의 eAPC-p + aAM의 생성
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'를 함유한다. 가용성 항원 aAM은 eAPC-p와 조합되고, 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현, 세포내의 aAM의 존재, 및 따라서 세포 표면 상에서의 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재 및 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 20 - 가능한 분석물 TC 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 TCRsp를 발현한다. 분석물 TC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 분석물 TC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 TC 제시된 TCRsp를 자극하기 위한 eAPC aAPX:aAM 복합체의 실패를 나타내는 신호 강도가 없는, 분석물 TC의 휴지 상태이다. 3개의 양성 상태는 증가하는 신호 강도를 나타내고, *, ** 및 ***은 각각 낮은, 중간 또는 강한 신호를 나타내고, 또한 세포의 더 어두운 음영에 의해서 표현된다. 이것은, eAPC-pa에 의해서 제시된 분석물 aAPX:aAM을 향해서 분석물 TC 집단에 의해서 발현된 분석물 TCRsp의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 21 - 가능한 eAPC-pa 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 TCRsp를 발현한다. 분석물 TC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eAPC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 eAPC에 의해 제시된 aAPX:aAM 복합체를 자극하기 위한 TCRsp 쇄 쌍의 실패를 나타내는 분석물 eAPC의 휴지 상태이다. 3종의 양성 상태는 접촉된 aAPX:aAM으로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 3개의 양성 상태는 증가하는 신호 강도를 나타내고, *, ** 및 ***은 각각 낮은, 중간 또는 강한 신호를 나타내고, 또한 세포의 더 어두운 음영에 의해서 표현된다. 이것은 분석물 TC에 의해 제시된 분석물 TCRsp에 대한 분석물 aAPX:aAM의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 22 - 개별 분석물 TCRsp를 발현하는 분석물 TC의 라이브러리로부터 분석물 aAPX:aAM과 반응성인 TCR 쇄 쌍을 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 조합된 작동
분석물 TC 풀은 표면에서 다양한 TCRsp를 발현한다. 분석물 eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 본 예에서, 단지 분석물 TC i로부터 발현된 TCRsp만 분석물 eAPC-pa에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적이어서, 분석물 TC 풀 및 분석물 eAPC-pa 집단이 접촉되는 경우, 단지 분석물 TC의 세포 코호트만 TCRsp i 결속물을 발현한다.
도 23 - 개별 분석물 aAPX:aAM 복합체를 발현하는 분석물 eAPC-pa의 라이브러리로부터 분석물 TC와 반응성인 aAM을 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 조합된 작동
분석물 eAPC는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 정의된 TCRsp를 발현한다. 본 예에서, 단지 복합체 aAPX:aAM i만 분석물 TC에 의해서 제시된 TCRsp에 대해서 특이적이어서, 분석물 eAPC 풀 및 분석물 TC 집단이 접촉되는 경우, aAM i를 발현하는 세포 코호트 만이 별개의 신호 *를 발현한다.
도 24 - 특이적 분석물 TCR과 반응성인 aAPX:aAM 복합체를 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa 풀은 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM i-iii을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 eAPC-pa 풀의 하위집단에 의해서 발현된 별개의 aAPX:aAM 복합체에 대해서 특이적인 제시된 가용성, 고정된 또는 NCBP의 형태의 분석물 TCR이 분석물 eAPC-pa 풀과 접촉된다. 본 예에서, 분석물 TCR로부터 형성되어, aAM i를 보유하는 분석물 eAPC-pa 풀의 세포 코호트 만이 분석물 TCR에 반응한다(어두운 회색).
도 25 - aAM의 강제 방출을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAM은 인큐베이션을 통해서 aAM aAPX:aAM 표면 복합체로부터 방출되고, 방출된 aAM은 식별을 위해서 사용 가능하다.
도 26 - aAPX:aAM 복합체의 포획을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAPX:aAM 표면 복합체는 적재된 aAM의 식별을 위해서 포획된다.
도 27 - 조합된 eAPC:T 시스템의 조립을 위해서 분석물 eAPC를 제조하기 위한 다성분 시스템의 작동
조작된 다성분 세포 시스템(MCS)이 작동하는 전체 시스템은 조합된 eAPC:T 시스템의 조립으로, 제시된 분석물 조작된 항원-제시 세포(eAPC)를 다양한 분석물 TCR과 접촉시키는 것을 포함한다. 그것은 일차 산출물이 유래된 조합된 eAPC:T 시스템으로부터, 그리고 최종 산출물이 유래된 이러한 일차 산출물로부터 유래된다. 전체 시스템의 작동은 2 단계, 즉 제조 단계 및 분석 단계를 포함한다. 단계 1의 일 양상에서, 다성분 시스템을 사용하여 분석물 eAPC를 제조하고, 이러한 분석물 집단은 eAPC-p, eAPC-a 및/또는 eAPC-pa를 포함할 수 있다. 이러한 분석물 eAPC는 항원성 모이어티; 분석물 항원-제시 복합체(aAPX); 분석물 항원성 분자(aAM); 적재된 aAM 카고를 갖는 aAPX(aAPX:aAM); 카고 분자(CM); CM이 적재된 aAPX(aAPX:CM)의 다양한 형태를 제시하고; 여기서 분석물 항원은 분석물 TCR에 대한 친화성 또는 신호 유도에 대해서 시험될 것을 나타낸다(단계 i). 단계 1의 또 다른 양상에서, 세포(분석물 TC), 비-세포 기반 입자, 가용성 시약, 분석물 TCR 쇄 쌍을 제시하는 고정된 시약, 또는 분석물 항원에 대해서 특이성을 갖는 다른 친화성 시약이 제조되며, 총괄적으로 분석물 TCR이라고 지칭된다(단계 ii). 전체 시스템의 단계 2는 단계 1에서 제조된 분석물 eAPC 집단과 분석물 TCR의 접촉이며, 이것은 조합된 eAPC:T 시스템의 조립을 초래한다(단계 iii). 접촉된 분석물 eAPC는 잠재적으로 분석물 TCR에 결합하는데, 여기서 이러한 결합은 안정적인 복합체 형성을 초래한다. 안정적인 복합체의 형성은 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC 엔티티에서 신호 반응을 유도할 수 있고/있거나, 안정적인 복합체는 직접 선택될 수 있다. 조합된 eAPC:T 시스템 내에서, 분석물 eAPC, 또는 분석물 TC의 산출물은 이의 신호 상태를 변경할 수 있어서(* 및 더 어두운 음영으로 나타냄) 이러한 응답한 종이 식별될 수 있다(단계 iv). 변경된 상태는 또한 eAPC의 직접적인 선택의 형태로 존재하여 분석물 TCR과 안정적인 복합체를 형성할 수 있다. eAPC:T 시스템 내에서 변경된 신호 상태를 기초로, 특이적 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC는 서로와 반응을 유도하는 능력에 대해서 선택되거나, 또는 이러한 반응을 유도의 실패를 기초로 선택되고/되거나 안정적인 복합체 자체의 직접적인 선택으로 선택될 수 있다. 이의 반응성 또는 안정적인 복합체를 기초로 한 선택은 조합된 eAPC:T 시스템의 일차 산출물을 산출한다(단계 v). 단계 v로부터 분석물 세포, 또는 분석물 TCR을 수득함으로써, 제시된 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM, CM, aAPX:CM 및/또는 TCR 및/또는 분석물 항원에 대해서 특이성을 갖는 다른 친화성 시약이 시스템 작동의 최종 산출물로서 식별될 수 있다(단계 vi).
도 28 - HEK239 세포주에서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌의 표적화된 돌연변이발생을 갖는 세포의 선택
a) HEK293 대조군 세포(점선 히스토그램)와 비교한 Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드 및 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 18시간 후 2개의 독립적인 세포 집단의 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). GFP 하위세트 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포가 다클론성 집단으로서 분류되었다. b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 세포 표면 HLA-ABC 신호(회색 히스토그램). 낮은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 29 - HLA-ABC 널 단클론의 표현형 분석: 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. 모든 3종의 단클론 주는, 각각의 주 결핍된 HLA-ABC 표면 발현을 입증하는 표지되지 않은 대조군과 매칭되는 형광 신호를 나타내었다.
도 30 - 표적화된 HLA 대립유전자에서 게놈 결실을 입증하는 표면 HLA-ABC 발현이 결핍된 단클론의 선택의 유전학적 특징규명. 특이적 HLA 대립유전자의 gRNA 게놈 표적 부위를 연장시킨 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 이의 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 야생형 HLA-A 앰플리콘의 예측된 크기는 1067bp이고, HLA-B 앰플리콘은 717bp이고, HLA-C 앰플리콘은 1221bp이다.
도 31 - 합성 성분 D이 존재하거나 또는 존재하지 않는 합성 성분 B의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 표적으로 하는 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 유전 요소를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. b) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 둘 모두 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 및 D를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. c) BFP는 유지되었지만, D1 분류된 다클론성 집단에서 어떠한 검출 가능한 RFP 신호도 관찰되지 않았다. 사분면 Q3에서 높은 BFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 단클론을 함유하는 eAPC를 확립하였다. d) BFP는 유지되었고, D2 분류된 다클론성 집단에서 RFP 신호가 관찰되었다. 사분면 Q2에서 높은 BFP 및 RFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 및 합성 성분 D를 함유하는 eAPC 단클론을 확립하였다.
도 32 - eAPC 단클론의 표현형 분석
a 및 b) 유지된 BFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B의 통합을 시사한다. c) 유지된 BFP 및 RFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B 및 합성 성분 D 둘 모두의 통합을 시사한다.
도 33 - AAVS1 유전자좌에서 성분 B 또는 성분 B 및 D의 통합을 위한 단클론의 선택의 유전학적 특징규명.
a) 성분 B 및/또는 D 내에 프라이밍된 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시키고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 380bp인데, 이는 성분 B 및/또는 D의 안정적인 통합을 나타낸다. b) 상동 아암에 의해서 암호화된 영역 및 성분 B 및/또는 D에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍되는 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 660bp인데, 이는 AAVS1 부위에서 일어난 성분 B 및/또는 D의 통합을 나타낸다.
도 34 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-A*24:02(좌측 패널) 또는 성분 C'HLA-B*-07:02(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단 ACL-303 또는 ACL-305로 분류되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 높은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주로부터 검출된 신호(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 35 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합체 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF를 발현하고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 36 - 게놈이 성분 C'에 통합되고, 그 통합이 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 일어나서, 성분 B'를 생성시킨 것을 예증하는 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) PCR 앰플리콘은 HLA 삽입부의 존재를 확인하고, 810bp의 밴드는 적절한 CMV 프로모터 앰플리콘을 나타내었고, 380bp는 SV40pA 종결인자로부터 생성된 앰플리콘이다. b) PCR 앰플리콘은 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대한 원위에 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍된 프라이머 및 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머의 두 세트를 사용하여 생성되었다. 양성 앰플리콘 1kb 및 1.1kb의 예측된 크기는 성분 B'의 생성을 나타낸다.
도 37 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01(좌측 패널) 또는 성분 C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다.
b) 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 알렉사 647 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 알렉사 647 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)로부터 검출된 신호가 대조군으로서 제공되었다.
도 38 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 II 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-341 및 ACL-350 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01을 발현하였고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 39 - 분석물 HLA 클래스 I 단백질의 RMCE 통합에 의해서 생성된 eAPC-p 단클론
a) eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 BFP 형광을 손실하였다(회색 히스토그램). 이의 모 eAPC 세포주 ACL-385(흑색 선 히스토그램) 및 BFP 음성 ARH 야생형 세포주(점선 히스토그램)는 대조군으로서 제공되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색되는 경우 eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 HLA-A*02:01 발현을 얻었다(회색 히스토그램). 이의 모 ACL-385 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)는 각각 음성 및 양성 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지 대조군으로서 제공되었다.
이러한 결과는, ACL-421 및 ACL-422 세포주 둘 모두에서 BFP ORF와 HLA-A*02:01 ORF 사이에 일어난 성공적인 RMCE를 나타내었다.
도 40 - 단클론의 선택의 유전학적 특징규명은 RMCE에 의한 HLA-A*02:01 통합을 확인하였음
630bp의 앰플리콘은 단클론 ACL-421 및 422에서 HLA-A2의 존재를 나타내었지만, 대조군 주, ACL-128에서는 존재하지 않았다.
도 41 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-pa 단클론 및 aAM의 표현형 분석
a) eAPC-p 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 나타내었고, 따라서 eAPC-p 세포주였음을 예증하였다.
b) eAPC-pa 단클론 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 형광에 대해서 평가하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-391 및 ACL-395 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 분석물 aAM 선택 마커를 발현하고, 따라서 각각 또한 HLA-LA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 발현하는 세포주에서 aAM 발현을 암시한다는 것을 예증하였다. 따라서 ACL-391 및 ACL-395는 eAPC-pa 주였다.
도 43 - 성분 C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p.
HLA-A*02:01(V4.H.5) 또는 HLA-A*24:02(V4.H.6) 중 어느 하나로부터 선택된, aAPX를 암호화하는 하나의 성분 C' 플라스미드와 함께, Tyr-리콤비나제, Flp(V4.1.8)의 발현을 암호화하는 플라스미드를 사용하여 세포주 ACL-402의 전기천공법에 의해서 RMCE를 통해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 10일 후, 성분 B 선택 마커에 의해서 암호화된, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 형광 단백질 신호, RFP가 감소된 개별 세포를 분류하였다. 생성된 단클론성 eAPC-p 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 두 예를 제공한다: a) 개별 과성장된 단클론 주(ACL-900 및 ACL-963)를 RFP의 손실, BFP의 존재 및 HLA-ABC(aAPX)의 이득에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 좌측 플롯은 BFP 대 RFP를 나타내고, 모 세포는 BFP 및 RFP(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 모두를 갖는 반면, ACL-900(Q3, 중간 플롯, 99.7%) 및 ACL-963(Q3, 하단 플롯, 99.9%) 둘 모두는 RFP 신호가 결핍되었는데, 이는 성분 B/C' 간의 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. 우측 플롯은 BFP 대 HLA-ABC(aAPX)를 나타내는데, 여기서 ACL-900(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 및 ACL-963(Q2, 하단 플롯, 99.2%) 둘 모두는 HLA-ABC(aAPX)에 대한 강한 신호를 나타내며, 이는 B/C' 통합을 더 뒷받침한다. ACL-900 및 ACL-963 둘 모두는 강한 BFP 신호를 갖는데, 이는 성분 D가 개방적이고, 성분 B/C' 통합 커플로부터 격리되어 있음을 나타낸다. b) ACL-900 및 ACL-963, 및 a)에 제공되지 않은 제3 eAPC-p, ACL-907을 더 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 B'의 인접 및 내부를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 8.B.3, 15.H.2)를 사용하여 PCR을 수행하여, 성공적인 통합 커플 사례 만을 선택적으로 증폭시켰다. 변형되지 않은 모체 주, ACL-3에 대한 비교를 수행하였는데, 여기서 성분 B는 결핍되어 있다. 성분 B'에 대해서 특이적인 앰플리콘 산물을 모든 3종의 eAPC-p 단클론에 대해서 생산하였지만, 어떠한 산물도 ACL-3 반응에서 검출되지 않았는데, 이는 성분 B와 성분 C' 사이에 특이적 통합 커플 사례가 발생하였음을 확인해 준다.
도 44 - 성분 D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(ACL-905)로부터 작제하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다. eAPC-p(ACL-900, 실시예 8)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 전기천공법 10일 후에, 개별 eAPC-pa를 선택하고, 성분 D에 의해서 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 단일 세포 분류하였다(단클론). 생성된 단클론성 eAPC-pa 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 3개의 예를 제공한다. 또한, 생성된 단클론을 또한 유전적으로 특징규명하여 통합 커플 사례를 확인하였다. a) eAPC-pa에 대한 단클론, ACL-1219, ACL-1227 및 ACL-1233을 분석하였고, BFP 신호의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. BFP 대 SSC의 플롯을 BFP- 게이트로 나타낸다. 모체 eAPC-p에 비해서 BFP- 사례의 수의 증가가 관찰되며, 이는 성분 D/E' 간에 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. BFP- 게이트로부터의 단일 세포는 선택, 분류 및 과성장되었다. b) ACL-1219, ACL-1227, ACL-1233의 선택된 단클론을 유세포 분석법에 의해서 분석하여 BFP의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지를 확인하였다. BFP 대 HLA-ABC의 플롯을 제공하며, 여기서 모든 3종의 단클론은 모체 eAPC-p(가장 우측 플롯)에 비해서 BFP 신호가 손실된 것이 관찰될 수 있는데, 이는 성공적인 통합 커플 사례를 나타낸다. c) 단클론이 aAM ORF에 대한 적절한 단편 크기를 함유하였다는 것을 예증하기 위해서, AM ORF를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 10.D.1, 15.H.4)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였고, 대표적인 아가로스 젤을 나타낸다. 각각의 aAM ORF를 나타내는 2종의 클론으로부터의 결과를 나타낸다. 레인 1: 2_log DNA 마커, 레인 2-3: pp28 ORF(예측된 크기 0.8kb), 레인 4: 2_log DNA 마커, 레인 5-6: pp52 ORF(예측된 크기 1.5kb), 레인 7: 2_log DNA 마커, 레인 8-9: pp65 ORF(예측된 크기 1.9kb), 레인 10: 2_log DNA 마커. 분석된 모든 단클론은 대표적인 aAM에 대해서 예측된 앰플리콘 크기를 가졌는데, 이는 통합 커플이 일어났음을 추가로 나타낸다.
도 45 - 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 항원의 샷건 통합
모체 eAPC-p 내로의 단일 단계 통합에 의해서 총괄적으로 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 암호화하는 프라이밍된 성분 E 벡터(성분 E')의 풀로부터 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 생성시켰는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 생성된 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 발현한다. eAPC-p(ACL-905, aAPX: HLA-A*02:01)를 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나에 대한 ORF를 암호화하는 개별 벡터(V9.E.6, V9.E.7 및 V9.E.8)로 구성되고, 1:1:1로 혼합된 풀링된 벡터 라이브러리와 조합함으로써 전기천공법에 의해서 eAPC-pa의 라이브러리를 생성시켰다. 생성된 eAPC-pa 집단을 모체 eAPC-p 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. a) 전기천공법 10일 후에 추정 eAPC-pa 세포(형질주입체)를 유세포 분석법에 의해서, 모체 주(ACL-905)와 비교하여 분석 및 선택하였다. 플롯은 BFP- 집단에 대해서 게이팅된, 디스플레이 BFP 대 SSC를 나타내고, 여기서 BFP- 세포의 증가는 모체 주와 비교하여 BFP- 게이트에서 관찰된다. 벌크 세포를 BFP- 게이트를 기초로 형질주입체로부터 분류하였고, ACL-1050이라 지칭하였다. b) 과성장 후, ACL-1050 세포를 BFP의 손실에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 나타낸 플롯은 BFP 대 SSC이고, 여기서 ACL-1050은 약 4% BFP-인 모체 주에 비해서 96.4% BFP-가 풍부하였다. 그 다음, 단일 세포를 ACL-1050의 BFP- 오염물로부터 분류하였다. c) 다클론 ACL-1050이 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65 암호화 세포의 혼합물로 구성되었다는 것을 입증하기 위해서, 12종의 단클론을 무작위로 선택하고, 과성장시키고, 이를 유전적 특징규명을 위해서 사용하였다. 세포를 aAM ORF(성분 D')에 표적화된 프라이머(표 5, 10.D.1, 15.H.4)를 사용하여 PCR에 의해서 특징규명하여, 통합된 aAM을 증폭 및 검출하였다. PCR에 의해서 스크리닝된 모든 12종의 단클론은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 또는 pp65(1.9kb) 중 하나에 대해서 예측된 크기를 갖는 검출 가능한 앰플리콘을 갖는다. 또한, 모든 3종의 aAM을 12종의 단클론에 대해서 나타내었다. 비교 시에, aAM에서 공지된 3종의 개별 단클론으로부터의 앰플리콘을 대조군과 동시에 증폭시켰고; 모든 3종의 대조군은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)의 적절한 크기의 앰플리콘을 생성시켰다. 따라서, 풀이 eAPC-pa로 구성되고, 여기서 각각의 세포는 3종의 벡터의 본래 풀의 단일 무작위로 선택된 aAM 형태를 갖는다는 것이 확인된다.
도 46 - 일차 CD8 세포의 eAPC-pa 유도된 항원-특이적 과성장
7종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD8+ T 세포, 및 3종의 상이한 eAPC 세포주, ACL-191(eAPC-p, aAPX: HLA-A*02:01), ACL-390(eAPC-pa, aAPX:aM: HLA-A*02:01, HCMVpp65) 또는 ACL-128 (eAPC, HLA-I 널, 즉, aAPX 없음)을 사용하여 컴파일하였다. 추가로, eAPC:T 시스템은 ACL-191 또는 ACL-128로 구성되며, 여기서 가능한 경우 외인성으로 제공된 aAM(가용성 NLVPMVATV 펩타이드로서)을 사용하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 공배양 9일 후, 세포를 CMV-A.0201-NLVP 사량체(aAPX:aAM)로의 특이적 염색에 대해서 분석하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출하였다. a) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) aAM이 없는 ACL-191(펄싱되지 않음), 2) aAM으로 펄싱된 ACL-191, 3) 펄싱되지 않은 ACL-128, 또는 4) aAM으로 펄싱된 ACL-128을 포함하는 4종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 4시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로 HCMVpp65 단백질로부터 유래된 NLVPMVATV 펩타이드(aAM)를 갖는, aAM을 갖는 시스템을 제공하였다. CD8 대 CMV-A.0201-NLVP의 유세포 분석법 플롯을 도시하며, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1), 2), 3), 4)에 대한 데이터를 나타낸다. CD8+CMV-A.0201-NLVP+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(27%)이 플롯 2(aAM으로 펄싱된 ACL-191)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAPX 또는 aAM 또는 둘 모두가 결핍된 나머지 eAPC:T 시스템 모두, 플롯 1, 3, 4는 0.02 내지 0.12%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 특이적 분석물 TC는, 외인성 aAM이 제공되는 경우 eAPC-p 세포에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 의해서 항원 의존적 특성으로 과성장될 수 있다. b) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) ACL-128(eAPC), 2) ACL-191(eAPC-p) 또는 3) ACL-390(eAPC-pa)으로 구성된 3종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였고, 여기서 어떠한 외인성 aAM도 제공되지 않는다. ACL-390은 통합된 aAM ORF, HCMVpp65를 갖는다. CD8 대 CMV-A.0201-NLVP의 유세포 분석법 플롯을 도시하며, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1), 2), 3)에 대한 데이터를 나타낸다. CD8+CMV-A.0201-NLVP+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(4.89%)이 플롯 3(내인성 aAM을 갖는 ACL-390)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAM 또는 aAPX 및 aAM 중 어느 하나가 결핍된 나머지 eAPC:T 시스템, 플롯 1 및 2는 0.02 내지 0.12%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 이러한 데이터는, eAPC-pa가 네이티브 세포 머시너리에 의해서 aAM 내에서 내인성 aAM ORF를 가공할 수 있고, aAPX와 복합체를 이룬 aAM을 제시할 수 있어서, 그것은 분석물 TC의 항원 특이적 과성장을 자극할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
도 47 - 일차 CD4 세포의 eAPC-p 및 외인성 aAM 유도된 항원-특이적 과성장
2종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD4+ T 세포, 및 1종의 eAPC-p 세포주, ACL-341(aAPX:HLA-DRB1*01:01)를 사용하여 컴파일하였다. 추가로, 외인성으로 적용 가능한 경우 aAM(PKYVKQNTLKLAT 펩타이드로서, 서열번호 1)을 또한 시스템에 제공하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 공배양 9일 후, 세포를 INFL-DRB1*01:01-PKYV 사량체(aAPX:aAM, 서열번호 2)로의 특이적 염색에 대해서 분석하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출하였다. 분석물 TC(CD4+ T-세포), 및 1) aAM을 갖지 않는 ACL-341(펄싱되지 않음), 2)물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 2시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로, PKYVKQNTLKLAT 펩타이드(aAM, 서열번호 1)로 펄싱된 ACL-341으로 구성된 2종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. CD4 대 INFL-DRB1*01:01-PKYV의 유세포 분석법 플롯을 나타내고, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1) 및 2)에 대한 데이터를 나타낸다. CD4+/INFL-DRB1*01:01-PKYV+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(12%)이 플롯 2(aAM으로 펄싱됨 ACL-341)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAM이 결핍된 대조군 eAPC:T 시스템, 플롯 1은 0.06%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 특이적 분석물 TC CD4+ 세포는, 외인성 aAM이 제공되는 경우 eAPC-p 세포에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 의해서 항원 의존적 특성으로 과성장될 수 있다.
도 48 - 일차 CD8 세포와 공배양된 eAPC-pa 세포의 항원-특이적 세포독성
7종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD8+ T 세포, 및 3종의 상이한 eAPC 세포주, ACL-191(eAPC-p, aAPX: HLA-A*02:01), ACL-390(eAPC-pa, aAPX:aM: HLA-A*02:01, HCMVpp65) 또는 ACL-128 (eAPC, HLA-I 널, 즉, aAPX 없음)을 사용하여 컴파일하였다. 추가로, ACL-191 또는 ACL-128로 구성된 eAPC:T 시스템은, 사용 가능한 경우, 외인성으로 제공된 aAM(NLVPMVATV 펩타이드로서, 서열번호 3)을 사용하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 아넥신V 및 PI로 염색하여 유세포 분석법에 의해서 죽은 세포를 검출함으로써 공배양물에서 세포를 eAPC-p 또는 -pa에 대한 세포독성 작용에 대해서 분석하였다. a) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) 펄싱되지 않은 ACL-128, 2) aAM으로 펄싱된 ACL-128, 3) aAM을 갖지 않은 ACL-191(펄싱되지 않음), 4) aAM으로 펄싱된 ACL-191로 구성된 4종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 2시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로 HCMVpp65 단백질로부터 유래된 NLVPMVATV 펩타이드(aAM)를 갖는, aAM을 갖는 시스템을 제공하였다. 또한, 시스템을 1:0, 1:1 및 1:8의 eAPC:CD8의 비율로 컴파일하였다. 유세포 분석법(CD80+아넥신+PI+)에 의해서 검출된 바와 같은 죽은 eAPC 세포 백분율의 막대 그래프를 도시한다. eAPC-p 세포의 명백한 사멸은 1:1 또는 1:8(eAPC:CD8)의 비의 eAPC 및 CD8+ 세포 둘 모두로 구성된 시스템 4(ACL-191 +펩타이드)에서만 관찰된다. 상기 사멸의 어떠한 유의한 증가도 배경에 존재하지 않고, aAPX, aAM 또는 둘 모두가 결핍된 시스템 1, 2 및 3에서 관찰되지 않는다. 따라서, 외인성 aAM으로 펄싱된 eAPC-p를 사용하여 일차 CD8+ T-세포(분석물 TC)에서 항원 특이적 세포독성 작용을 자극할 수 있다. b) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) ACL-128(eAPC), 2) ACL-191(eAPC-p) 또는 3) ACL-390(eAPC-pa)으로 구성된 3종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였고, 여기서 어떠한 외인성 aAM도 제공되지 않는다. ACL-390은 통합된 aAM ORF, HCMVpp65를 갖는다. 유세포 분석법(CD80+아넥신+PI+)에 의해서 검출된 바와 같은 죽은 eAPC 세포 백분율의 막대 그래프를 도시한다. eAPC-p 세포의 명백한 사멸은 1:1 또는 1:8(eAPC:CD8)의 비의 eAPC 및 CD8+ 세포 둘 모두로 구성된 시스템 3(ACL-390)에서만 관찰된다. 상기 사멸의 어떠한 유의한 증가도 배경에 존재하지 않고, aAM 또는 aAPX:aAM 중 어느 하나가 결핍된 시스템 1 및 2에서 관찰되지 않는다. 따라서, 이러한 데이터는, eAPC-pa가 네이티브 세포 머시너리에 의해서 aAM 내에서 내인성 aAM ORF를 가공할 수 있고, aAPX와 복합체를 이룬 aAM을 제시할 수 있어서, 그것은 일차 CD8+ T-세포(분석물 TC)에 의한 항원 특이적 세포독성 작용을 자극할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
도 49 - 질량 분석법을 통한 eAPC-pa 세포로부터의 분석물 항원 분자 식별
질량-분석법 결과를 하기 절차로부터 유래된 펩타이드 분획에 대해서 제공한다. 2종의 eAPC-p 주, ACL-900(aAPX: HLA-A*02:01) 및 ACL-963(aAPX: HLA-A*24:02)를 공지된 항원성 펩타이드로 펄싱하였고, 여기서 각각의 eAPC-p의 경우, 펩타이드로서 하기 aAM 중 하나로 이루어진 4종의 개별 펄스를 수행하였다: NLVPMVATV(APD-2, 서열번호 3), NLGPMAAGV(APD-21, 서열번호 4), 또는 VYALPLKML(APD-11, 서열번호 5), 또는 펩타이드 없음. APD-2는 HLA-A*02:01와, APD-11은 HLA-A*24:02와 복합체를 이룬다고 공지되어 있고, APD-21은 APD-2의 삼중 돌연변이체(V3G, T8G, V6A)인데, 여기서 이러한 돌연변이는 HLA-A*02:01과 복합체를 이루는 펩타이드에 대한 능력을 파괴한다. 펄싱된 세포를 수거 및 용해시켰다. 투명한 용해물을 니켈 아가로스 수지와 혼합하고, HLA를 6x-His 포획을 사용하여 풀 다운(pull down)시켰다. 결합된 분획을 10% 아세트산 중에 용리시키고, 3kD 칼럼 상에서 한외여과시켰다. 펩타이드 분획을 액체 추출에 적용하고, 유기상을 제거하고, 고체상 추출에 적용하였다. 용리된 펩타이드 분획 w를 질량 분석법에 적용하였다. 펩타이드 NLVPMVATV(서열번호 3), VYALPLKML(서열번호 5) 및 NLGPMVAGV(서열번호 4)는 이의 대표적인 펄싱된 실험(ID 2, 3, 11)으로 성공적으로 식별되었고, 임의의 다른 샘플에서는 식별되지 않았다. HLA-비매칭된 펩타이드 NLVPMVATV(ID 12, HLA-A*24:02, 서열번호 3) 및 VYALPLKML(ID 13, HLA-A*02:01, 서열번호 5) 및 삼중 돌연변이체 NLGPAAGV(서열번호 4)는 식별되지 않았다. 따라서, eAPC-p 세포의 aAPX:aAM 복합체의 포획 및 농축을 사용하여 항원 제시 복합체에서 분석물 항원 분자의 HLA-제한된 제시를 식별, 확인 및/또는 결정할 수 있다.
도 1 - 단일 통합 커플 다성분 시스템의 성분의 설명.
3종의 성분을 포함하는 MCS의 예. 제1 성분 A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC A는 1종의 추가 성분 B를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 1종의 추가적인 성분 C는 부위 B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다. 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 2 - 이중 통합 커플 다성분 시스템의 성분의 설명.
5종의 성분을 포함하는 MCS의 예. 제1 성분 A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC A는 2종의 추가 성분 B 및 D를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 2종의 추가적인 성분 C 및 E는 각각 부위 B 및 D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 짝지워진 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 3 - 상이한 분석물 항원 제시 eAPC의 제조
MCS는 eAPC에서 시작하고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 생성시킨다. aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라 지칭되고, ORF(들)를 암호화하는 aAPX를 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 i). aAM 단독을 발현하는 eAPC는 eAPC-a라 지칭되고, 여기서 aAM은 세포 표면에서 발현될 수 있고, TCR 결속을 위해서 사용 가능하거나, 또는 카고로서 aAPX 내에 aAPX:aAM 복합체로서 가공 및 적재될 필요가 있다. eAPC A는 ORF(들)를 암호화하는 aAM을 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). aAPX에서 aAM을 카고로서 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라 지칭된다. eAPC-pa는 aAM 및 aAPX 암호화 ORF를 eAPC에 동시에 도입하는 것(단계 iii); aAM 암호화 ORF(들)를 eAPC-p에 도입하는 것(단계 iv); aAPX 암호화 ORF(들)를 eAPC-a에 도입하는 것(단계 v) 중 어느 하나에 의해서 생산될 수 있다.
도 4 - 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위 통합 커플의 작동
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플을 형성하는데, 여기서 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 1종 이상의 ORF가 이의 커플링된 게놈 수용자 부위에 특이적으로 통합될 수 있다. 통합 커플의 작동에서의 단계 1은 1종 이상의 표적 ORF를 공여자 벡터에 도입하는 것이다. 초기 공여자 벡터는 X라 지정되고, 표적 ORF(들)의 도입에 의해서, 프라이밍된 공여자 벡터 X'로 변형된다. 단계 2는 프라이밍된 공여자 벡터 X'와, 게놈 수용자 부위 Y를 보유한 세포의 조합을 수반한다. 프라이밍된 공여자 벡터에 의해서 암호화된 ORF의 수용자 부위로의 도입은 통합된 부위 Y'를 보유한 세포의 생성을 초래한다.
도 5 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-p의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다.
도 6 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-p의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않는다.
도 7 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-a의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다.
도 8 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-a의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 C'의 ORF를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다.
도 9 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 게놈 수용자 부위 B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다.
A eAPC는 공여자 벡터 C'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다.
도 10 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 C'는 B에 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다. A eAPC는 공여자 벡터 C'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다.
도 11 - 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAM을 암호화한다. A eAPC는 동시에 공여자 벡터 C' 및 E'와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 동시에, E'의 ORF는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환되어 부위 D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다.
도 12 - eAPC-p를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAM을 암호화한다. 단계 1에서, A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않는다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-p는 E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E'를 가져서 부위 D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 발현된 aAPX의 카고로서 세포 표면 상에서 aAM의 발현, 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 13 - eAPC-a를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 제조의 예
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 C'는 aAM을 암호화하고, 공여자 벡터 E'는 aAPX를 암호화한다. 단계 1에서, A eAPC는 C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C'를 가져서 부위 B'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAM의 발현 및 eAPC-a의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-a는 E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E'를 가져서 부위 D'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 카고로서 aAM을 갖는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 14 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 제조
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 E' i 내지 iii의 풀이 D에 커플링된다. 공여자 벡터 E' i 내지 iii 각각은 단일 aAM 유전자를 암호화한다. eAPC-p는 동시에 공여자 벡터 E' i, E' ii, E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAM 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAM 유전자 중 하나를 aAPX:aAM으로서 제시하는 B'의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 15 - eAPC-a로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 제조
eAPC-a는 aAM를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 E' i 내지 iii의 풀이 D에 커플링된다. 공여자 벡터 E' i 내지 iii 각각은 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC-a는 동시에 공여자 벡터 E' i, E' ii, E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAPX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 B'에 암호화된 aAM과, 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAPX 유전자 중 어느 하나의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 16 - aAM 및 aAPX 유전자의 조합 짝지움을 함유하는 eAPC로부터의 풀링된 eAPC-pa 라이브러리의 샷건 제조
eAPC A는 별개의 게놈 수용자 부위 B 및 D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 C' 및 E'는 각각 B 및 D에 커플링된다. 공여자 벡터 C' i 및 C' ii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화하고, 공여자 벡터 E' i 및 E' ii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC A는 공여자 벡터 C' i, C' ii, E' i 및 E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 C' i 또는 C' ii를 가져서 각각 aAM에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 B' i 및 B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 E i 또는 E ii를 추가로 가져서 각각 APX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 E' i 및 E' ii를 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 유전자 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 aAPX:aAM 쌍을 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 17 - 내재하는 카고 CM을 발현하는 eAPC-p로부터의 eAPC-p:CM의 생성
게놈 재조합 부위로부터의 aAM의 발현의 부재 하에서, eAPC-p 상의 aAPX 분자는 내재하는 카고 분자 CM을 aAPX:CM 복합체로서 표면 상에 제시할 수 있다.
도 18 - eAPC-p로부터의 eAPC-p + aAM의 생성 및 가용성의 제시 가능한 항원 aAM의 첨가
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'를 함유한다. 가용성의 직접 제시 가능한 항원 aAM은 eAPC-p와 조합된다. 이는 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체의 형성을 초래하고 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 19 - eAPC-p 및 가용성 aAM으로부터의 eAPC-p + aAM의 생성
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'를 함유한다. 가용성 항원 aAM은 eAPC-p와 조합되고, 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현, 세포내의 aAM의 존재, 및 따라서 세포 표면 상에서의 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재 및 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 20 - 가능한 분석물 TC 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 TCRsp를 발현한다. 분석물 TC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 분석물 TC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 TC 제시된 TCRsp를 자극하기 위한 eAPC aAPX:aAM 복합체의 실패를 나타내는 신호 강도가 없는, 분석물 TC의 휴지 상태이다. 3개의 양성 상태는 증가하는 신호 강도를 나타내고, *, ** 및 ***은 각각 낮은, 중간 또는 강한 신호를 나타내고, 또한 세포의 더 어두운 음영에 의해서 표현된다. 이것은, eAPC-pa에 의해서 제시된 분석물 aAPX:aAM을 향해서 분석물 TC 집단에 의해서 발현된 분석물 TCRsp의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 21 - 가능한 eAPC-pa 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 TCRsp를 발현한다. 분석물 TC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eAPC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 eAPC에 의해 제시된 aAPX:aAM 복합체를 자극하기 위한 TCRsp 쇄 쌍의 실패를 나타내는 분석물 eAPC의 휴지 상태이다. 3종의 양성 상태는 접촉된 aAPX:aAM으로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 3개의 양성 상태는 증가하는 신호 강도를 나타내고, *, ** 및 ***은 각각 낮은, 중간 또는 강한 신호를 나타내고, 또한 세포의 더 어두운 음영에 의해서 표현된다. 이것은 분석물 TC에 의해 제시된 분석물 TCRsp에 대한 분석물 aAPX:aAM의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 22 - 개별 분석물 TCRsp를 발현하는 분석물 TC의 라이브러리로부터 분석물 aAPX:aAM과 반응성인 TCR 쇄 쌍을 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 조합된 작동
분석물 TC 풀은 표면에서 다양한 TCRsp를 발현한다. 분석물 eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 본 예에서, 단지 분석물 TC i로부터 발현된 TCRsp만 분석물 eAPC-pa에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적이어서, 분석물 TC 풀 및 분석물 eAPC-pa 집단이 접촉되는 경우, 단지 분석물 TC의 세포 코호트만 TCRsp i 결속물을 발현한다.
도 23 - 개별 분석물 aAPX:aAM 복합체를 발현하는 분석물 eAPC-pa의 라이브러리로부터 분석물 TC와 반응성인 aAM을 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 조합된 작동
분석물 eAPC는 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 TC는 표면에서 정의된 TCRsp를 발현한다. 본 예에서, 단지 복합체 aAPX:aAM i만 분석물 TC에 의해서 제시된 TCRsp에 대해서 특이적이어서, 분석물 eAPC 풀 및 분석물 TC 집단이 접촉되는 경우, aAM i를 발현하는 세포 코호트 만이 별개의 신호 *를 발현한다.
도 24 - 특이적 분석물 TCR과 반응성인 aAPX:aAM 복합체를 식별하기 위한 조합된 eAPC:T 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa 풀은 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM i-iii을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 C' 및 E'를 함유한다. 분석물 eAPC-pa 풀의 하위집단에 의해서 발현된 별개의 aAPX:aAM 복합체에 대해서 특이적인 제시된 가용성, 고정된 또는 NCBP의 형태의 분석물 TCR이 분석물 eAPC-pa 풀과 접촉된다. 본 예에서, 분석물 TCR로부터 형성되어, aAM i를 보유하는 분석물 eAPC-pa 풀의 세포 코호트 만이 분석물 TCR에 반응한다(어두운 회색).
도 25 - aAM의 강제 방출을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAM은 인큐베이션을 통해서 aAM aAPX:aAM 표면 복합체로부터 방출되고, 방출된 aAM은 식별을 위해서 사용 가능하다.
도 26 - aAPX:aAM 복합체의 포획을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAPX:aAM 표면 복합체는 적재된 aAM의 식별을 위해서 포획된다.
도 27 - 조합된 eAPC:T 시스템의 조립을 위해서 분석물 eAPC를 제조하기 위한 다성분 시스템의 작동
조작된 다성분 세포 시스템(MCS)이 작동하는 전체 시스템은 조합된 eAPC:T 시스템의 조립으로, 제시된 분석물 조작된 항원-제시 세포(eAPC)를 다양한 분석물 TCR과 접촉시키는 것을 포함한다. 그것은 일차 산출물이 유래된 조합된 eAPC:T 시스템으로부터, 그리고 최종 산출물이 유래된 이러한 일차 산출물로부터 유래된다. 전체 시스템의 작동은 2 단계, 즉 제조 단계 및 분석 단계를 포함한다. 단계 1의 일 양상에서, 다성분 시스템을 사용하여 분석물 eAPC를 제조하고, 이러한 분석물 집단은 eAPC-p, eAPC-a 및/또는 eAPC-pa를 포함할 수 있다. 이러한 분석물 eAPC는 항원성 모이어티; 분석물 항원-제시 복합체(aAPX); 분석물 항원성 분자(aAM); 적재된 aAM 카고를 갖는 aAPX(aAPX:aAM); 카고 분자(CM); CM이 적재된 aAPX(aAPX:CM)의 다양한 형태를 제시하고; 여기서 분석물 항원은 분석물 TCR에 대한 친화성 또는 신호 유도에 대해서 시험될 것을 나타낸다(단계 i). 단계 1의 또 다른 양상에서, 세포(분석물 TC), 비-세포 기반 입자, 가용성 시약, 분석물 TCR 쇄 쌍을 제시하는 고정된 시약, 또는 분석물 항원에 대해서 특이성을 갖는 다른 친화성 시약이 제조되며, 총괄적으로 분석물 TCR이라고 지칭된다(단계 ii). 전체 시스템의 단계 2는 단계 1에서 제조된 분석물 eAPC 집단과 분석물 TCR의 접촉이며, 이것은 조합된 eAPC:T 시스템의 조립을 초래한다(단계 iii). 접촉된 분석물 eAPC는 잠재적으로 분석물 TCR에 결합하는데, 여기서 이러한 결합은 안정적인 복합체 형성을 초래한다. 안정적인 복합체의 형성은 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC 엔티티에서 신호 반응을 유도할 수 있고/있거나, 안정적인 복합체는 직접 선택될 수 있다. 조합된 eAPC:T 시스템 내에서, 분석물 eAPC, 또는 분석물 TC의 산출물은 이의 신호 상태를 변경할 수 있어서(* 및 더 어두운 음영으로 나타냄) 이러한 응답한 종이 식별될 수 있다(단계 iv). 변경된 상태는 또한 eAPC의 직접적인 선택의 형태로 존재하여 분석물 TCR과 안정적인 복합체를 형성할 수 있다. eAPC:T 시스템 내에서 변경된 신호 상태를 기초로, 특이적 분석물 eAPC 및/또는 분석물 TC는 서로와 반응을 유도하는 능력에 대해서 선택되거나, 또는 이러한 반응을 유도의 실패를 기초로 선택되고/되거나 안정적인 복합체 자체의 직접적인 선택으로 선택될 수 있다. 이의 반응성 또는 안정적인 복합체를 기초로 한 선택은 조합된 eAPC:T 시스템의 일차 산출물을 산출한다(단계 v). 단계 v로부터 분석물 세포, 또는 분석물 TCR을 수득함으로써, 제시된 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM, CM, aAPX:CM 및/또는 TCR 및/또는 분석물 항원에 대해서 특이성을 갖는 다른 친화성 시약이 시스템 작동의 최종 산출물로서 식별될 수 있다(단계 vi).
도 28 - HEK239 세포주에서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌의 표적화된 돌연변이발생을 갖는 세포의 선택
a) HEK293 대조군 세포(점선 히스토그램)와 비교한 Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드 및 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 18시간 후 2개의 독립적인 세포 집단의 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). GFP 하위세트 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포가 다클론성 집단으로서 분류되었다. b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 세포 표면 HLA-ABC 신호(회색 히스토그램). 낮은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 29 - HLA-ABC 널 단클론의 표현형 분석: 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. 모든 3종의 단클론 주는, 각각의 주 결핍된 HLA-ABC 표면 발현을 입증하는 표지되지 않은 대조군과 매칭되는 형광 신호를 나타내었다.
도 30 - 표적화된 HLA 대립유전자에서 게놈 결실을 입증하는 표면 HLA-ABC 발현이 결핍된 단클론의 선택의 유전학적 특징규명. 특이적 HLA 대립유전자의 gRNA 게놈 표적 부위를 연장시킨 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 이의 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 야생형 HLA-A 앰플리콘의 예측된 크기는 1067bp이고, HLA-B 앰플리콘은 717bp이고, HLA-C 앰플리콘은 1221bp이다.
도 31 - 합성 성분 D이 존재하거나 또는 존재하지 않는 합성 성분 B의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 표적으로 하는 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 유전 요소를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. b) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 둘 모두 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 및 D를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. c) BFP는 유지되었지만, D1 분류된 다클론성 집단에서 어떠한 검출 가능한 RFP 신호도 관찰되지 않았다. 사분면 Q3에서 높은 BFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 단클론을 함유하는 eAPC를 확립하였다. d) BFP는 유지되었고, D2 분류된 다클론성 집단에서 RFP 신호가 관찰되었다. 사분면 Q2에서 높은 BFP 및 RFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 및 합성 성분 D를 함유하는 eAPC 단클론을 확립하였다.
도 32 - eAPC 단클론의 표현형 분석
a 및 b) 유지된 BFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B의 통합을 시사한다. c) 유지된 BFP 및 RFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B 및 합성 성분 D 둘 모두의 통합을 시사한다.
도 33 - AAVS1 유전자좌에서 성분 B 또는 성분 B 및 D의 통합을 위한 단클론의 선택의 유전학적 특징규명.
a) 성분 B 및/또는 D 내에 프라이밍된 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시키고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 380bp인데, 이는 성분 B 및/또는 D의 안정적인 통합을 나타낸다. b) 상동 아암에 의해서 암호화된 영역 및 성분 B 및/또는 D에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍되는 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 660bp인데, 이는 AAVS1 부위에서 일어난 성분 B 및/또는 D의 통합을 나타낸다.
도 34 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-A*24:02(좌측 패널) 또는 성분 C'HLA-B*-07:02(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단 ACL-303 또는 ACL-305로 분류되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 높은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주로부터 검출된 신호(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 35 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합체 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF를 발현하고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 36 - 게놈이 성분 C'에 통합되고, 그 통합이 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 일어나서, 성분 B'를 생성시킨 것을 예증하는 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) PCR 앰플리콘은 HLA 삽입부의 존재를 확인하고, 810bp의 밴드는 적절한 CMV 프로모터 앰플리콘을 나타내었고, 380bp는 SV40pA 종결인자로부터 생성된 앰플리콘이다. b) PCR 앰플리콘은 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대한 원위에 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍된 프라이머 및 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머의 두 세트를 사용하여 생성되었다. 양성 앰플리콘 1kb 및 1.1kb의 예측된 크기는 성분 B'의 생성을 나타낸다.
도 37 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01(좌측 패널) 또는 성분 C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다.
b) 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 알렉사 647 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 알렉사 647 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)로부터 검출된 신호가 대조군으로서 제공되었다.
도 38 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 II 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-341 및 ACL-350 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01을 발현하였고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 39 - 분석물 HLA 클래스 I 단백질의 RMCE 통합에 의해서 생성된 eAPC-p 단클론
a) eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 BFP 형광을 손실하였다(회색 히스토그램). 이의 모 eAPC 세포주 ACL-385(흑색 선 히스토그램) 및 BFP 음성 ARH 야생형 세포주(점선 히스토그램)는 대조군으로서 제공되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색되는 경우 eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 HLA-A*02:01 발현을 얻었다(회색 히스토그램). 이의 모 ACL-385 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)는 각각 음성 및 양성 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지 대조군으로서 제공되었다.
이러한 결과는, ACL-421 및 ACL-422 세포주 둘 모두에서 BFP ORF와 HLA-A*02:01 ORF 사이에 일어난 성공적인 RMCE를 나타내었다.
도 40 - 단클론의 선택의 유전학적 특징규명은 RMCE에 의한 HLA-A*02:01 통합을 확인하였음
630bp의 앰플리콘은 단클론 ACL-421 및 422에서 HLA-A2의 존재를 나타내었지만, 대조군 주, ACL-128에서는 존재하지 않았다.
도 41 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-pa 단클론 및 aAM의 표현형 분석
a) eAPC-p 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 나타내었고, 따라서 eAPC-p 세포주였음을 예증하였다.
b) eAPC-pa 단클론 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 형광에 대해서 평가하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-391 및 ACL-395 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 분석물 aAM 선택 마커를 발현하고, 따라서 각각 또한 HLA-LA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 발현하는 세포주에서 aAM 발현을 암시한다는 것을 예증하였다. 따라서 ACL-391 및 ACL-395는 eAPC-pa 주였다.
도 43 - 성분 C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p.
HLA-A*02:01(V4.H.5) 또는 HLA-A*24:02(V4.H.6) 중 어느 하나로부터 선택된, aAPX를 암호화하는 하나의 성분 C' 플라스미드와 함께, Tyr-리콤비나제, Flp(V4.1.8)의 발현을 암호화하는 플라스미드를 사용하여 세포주 ACL-402의 전기천공법에 의해서 RMCE를 통해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 10일 후, 성분 B 선택 마커에 의해서 암호화된, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 형광 단백질 신호, RFP가 감소된 개별 세포를 분류하였다. 생성된 단클론성 eAPC-p 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 두 예를 제공한다: a) 개별 과성장된 단클론 주(ACL-900 및 ACL-963)를 RFP의 손실, BFP의 존재 및 HLA-ABC(aAPX)의 이득에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 좌측 플롯은 BFP 대 RFP를 나타내고, 모 세포는 BFP 및 RFP(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 모두를 갖는 반면, ACL-900(Q3, 중간 플롯, 99.7%) 및 ACL-963(Q3, 하단 플롯, 99.9%) 둘 모두는 RFP 신호가 결핍되었는데, 이는 성분 B/C' 간의 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. 우측 플롯은 BFP 대 HLA-ABC(aAPX)를 나타내는데, 여기서 ACL-900(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 및 ACL-963(Q2, 하단 플롯, 99.2%) 둘 모두는 HLA-ABC(aAPX)에 대한 강한 신호를 나타내며, 이는 B/C' 통합을 더 뒷받침한다. ACL-900 및 ACL-963 둘 모두는 강한 BFP 신호를 갖는데, 이는 성분 D가 개방적이고, 성분 B/C' 통합 커플로부터 격리되어 있음을 나타낸다. b) ACL-900 및 ACL-963, 및 a)에 제공되지 않은 제3 eAPC-p, ACL-907을 더 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 B'의 인접 및 내부를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 8.B.3, 15.H.2)를 사용하여 PCR을 수행하여, 성공적인 통합 커플 사례 만을 선택적으로 증폭시켰다. 변형되지 않은 모체 주, ACL-3에 대한 비교를 수행하였는데, 여기서 성분 B는 결핍되어 있다. 성분 B'에 대해서 특이적인 앰플리콘 산물을 모든 3종의 eAPC-p 단클론에 대해서 생산하였지만, 어떠한 산물도 ACL-3 반응에서 검출되지 않았는데, 이는 성분 B와 성분 C' 사이에 특이적 통합 커플 사례가 발생하였음을 확인해 준다.
도 44 - 성분 D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(ACL-905)로부터 작제하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다. eAPC-p(ACL-900, 실시예 8)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 전기천공법 10일 후에, 개별 eAPC-pa를 선택하고, 성분 D에 의해서 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 단일 세포 분류하였다(단클론). 생성된 단클론성 eAPC-pa 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 3개의 예를 제공한다. 또한, 생성된 단클론을 또한 유전적으로 특징규명하여 통합 커플 사례를 확인하였다. a) eAPC-pa에 대한 단클론, ACL-1219, ACL-1227 및 ACL-1233을 분석하였고, BFP 신호의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. BFP 대 SSC의 플롯을 BFP- 게이트로 나타낸다. 모체 eAPC-p에 비해서 BFP- 사례의 수의 증가가 관찰되며, 이는 성분 D/E' 간에 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. BFP- 게이트로부터의 단일 세포는 선택, 분류 및 과성장되었다. b) ACL-1219, ACL-1227, ACL-1233의 선택된 단클론을 유세포 분석법에 의해서 분석하여 BFP의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지를 확인하였다. BFP 대 HLA-ABC의 플롯을 제공하며, 여기서 모든 3종의 단클론은 모체 eAPC-p(가장 우측 플롯)에 비해서 BFP 신호가 손실된 것이 관찰될 수 있는데, 이는 성공적인 통합 커플 사례를 나타낸다. c) 단클론이 aAM ORF에 대한 적절한 단편 크기를 함유하였다는 것을 예증하기 위해서, AM ORF를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 10.D.1, 15.H.4)를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였고, 대표적인 아가로스 젤을 나타낸다. 각각의 aAM ORF를 나타내는 2종의 클론으로부터의 결과를 나타낸다. 레인 1: 2_log DNA 마커, 레인 2-3: pp28 ORF(예측된 크기 0.8kb), 레인 4: 2_log DNA 마커, 레인 5-6: pp52 ORF(예측된 크기 1.5kb), 레인 7: 2_log DNA 마커, 레인 8-9: pp65 ORF(예측된 크기 1.9kb), 레인 10: 2_log DNA 마커. 분석된 모든 단클론은 대표적인 aAM에 대해서 예측된 앰플리콘 크기를 가졌는데, 이는 통합 커플이 일어났음을 추가로 나타낸다.
도 45 - 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 항원의 샷건 통합
모체 eAPC-p 내로의 단일 단계 통합에 의해서 총괄적으로 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 암호화하는 프라이밍된 성분 E 벡터(성분 E')의 풀로부터 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 생성시켰는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 생성된 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 발현한다. eAPC-p(ACL-905, aAPX: HLA-A*02:01)를 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나에 대한 ORF를 암호화하는 개별 벡터(V9.E.6, V9.E.7 및 V9.E.8)로 구성되고, 1:1:1로 혼합된 풀링된 벡터 라이브러리와 조합함으로써 전기천공법에 의해서 eAPC-pa의 라이브러리를 생성시켰다. 생성된 eAPC-pa 집단을 모체 eAPC-p 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. a) 전기천공법 10일 후에 추정 eAPC-pa 세포(형질주입체)를 유세포 분석법에 의해서, 모체 주(ACL-905)와 비교하여 분석 및 선택하였다. 플롯은 BFP- 집단에 대해서 게이팅된, 디스플레이 BFP 대 SSC를 나타내고, 여기서 BFP- 세포의 증가는 모체 주와 비교하여 BFP- 게이트에서 관찰된다. 벌크 세포를 BFP- 게이트를 기초로 형질주입체로부터 분류하였고, ACL-1050이라 지칭하였다. b) 과성장 후, ACL-1050 세포를 BFP의 손실에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 나타낸 플롯은 BFP 대 SSC이고, 여기서 ACL-1050은 약 4% BFP-인 모체 주에 비해서 96.4% BFP-가 풍부하였다. 그 다음, 단일 세포를 ACL-1050의 BFP- 오염물로부터 분류하였다. c) 다클론 ACL-1050이 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65 암호화 세포의 혼합물로 구성되었다는 것을 입증하기 위해서, 12종의 단클론을 무작위로 선택하고, 과성장시키고, 이를 유전적 특징규명을 위해서 사용하였다. 세포를 aAM ORF(성분 D')에 표적화된 프라이머(표 5, 10.D.1, 15.H.4)를 사용하여 PCR에 의해서 특징규명하여, 통합된 aAM을 증폭 및 검출하였다. PCR에 의해서 스크리닝된 모든 12종의 단클론은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 또는 pp65(1.9kb) 중 하나에 대해서 예측된 크기를 갖는 검출 가능한 앰플리콘을 갖는다. 또한, 모든 3종의 aAM을 12종의 단클론에 대해서 나타내었다. 비교 시에, aAM에서 공지된 3종의 개별 단클론으로부터의 앰플리콘을 대조군과 동시에 증폭시켰고; 모든 3종의 대조군은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)의 적절한 크기의 앰플리콘을 생성시켰다. 따라서, 풀이 eAPC-pa로 구성되고, 여기서 각각의 세포는 3종의 벡터의 본래 풀의 단일 무작위로 선택된 aAM 형태를 갖는다는 것이 확인된다.
도 46 - 일차 CD8 세포의 eAPC-pa 유도된 항원-특이적 과성장
7종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD8+ T 세포, 및 3종의 상이한 eAPC 세포주, ACL-191(eAPC-p, aAPX: HLA-A*02:01), ACL-390(eAPC-pa, aAPX:aM: HLA-A*02:01, HCMVpp65) 또는 ACL-128 (eAPC, HLA-I 널, 즉, aAPX 없음)을 사용하여 컴파일하였다. 추가로, eAPC:T 시스템은 ACL-191 또는 ACL-128로 구성되며, 여기서 가능한 경우 외인성으로 제공된 aAM(가용성 NLVPMVATV 펩타이드로서)을 사용하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 공배양 9일 후, 세포를 CMV-A.0201-NLVP 사량체(aAPX:aAM)로의 특이적 염색에 대해서 분석하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출하였다. a) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) aAM이 없는 ACL-191(펄싱되지 않음), 2) aAM으로 펄싱된 ACL-191, 3) 펄싱되지 않은 ACL-128, 또는 4) aAM으로 펄싱된 ACL-128을 포함하는 4종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 4시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로 HCMVpp65 단백질로부터 유래된 NLVPMVATV 펩타이드(aAM)를 갖는, aAM을 갖는 시스템을 제공하였다. CD8 대 CMV-A.0201-NLVP의 유세포 분석법 플롯을 도시하며, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1), 2), 3), 4)에 대한 데이터를 나타낸다. CD8+CMV-A.0201-NLVP+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(27%)이 플롯 2(aAM으로 펄싱된 ACL-191)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAPX 또는 aAM 또는 둘 모두가 결핍된 나머지 eAPC:T 시스템 모두, 플롯 1, 3, 4는 0.02 내지 0.12%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 특이적 분석물 TC는, 외인성 aAM이 제공되는 경우 eAPC-p 세포에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 의해서 항원 의존적 특성으로 과성장될 수 있다. b) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) ACL-128(eAPC), 2) ACL-191(eAPC-p) 또는 3) ACL-390(eAPC-pa)으로 구성된 3종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였고, 여기서 어떠한 외인성 aAM도 제공되지 않는다. ACL-390은 통합된 aAM ORF, HCMVpp65를 갖는다. CD8 대 CMV-A.0201-NLVP의 유세포 분석법 플롯을 도시하며, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1), 2), 3)에 대한 데이터를 나타낸다. CD8+CMV-A.0201-NLVP+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(4.89%)이 플롯 3(내인성 aAM을 갖는 ACL-390)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAM 또는 aAPX 및 aAM 중 어느 하나가 결핍된 나머지 eAPC:T 시스템, 플롯 1 및 2는 0.02 내지 0.12%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 이러한 데이터는, eAPC-pa가 네이티브 세포 머시너리에 의해서 aAM 내에서 내인성 aAM ORF를 가공할 수 있고, aAPX와 복합체를 이룬 aAM을 제시할 수 있어서, 그것은 분석물 TC의 항원 특이적 과성장을 자극할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
도 47 - 일차 CD4 세포의 eAPC-p 및 외인성 aAM 유도된 항원-특이적 과성장
2종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD4+ T 세포, 및 1종의 eAPC-p 세포주, ACL-341(aAPX:HLA-DRB1*01:01)를 사용하여 컴파일하였다. 추가로, 외인성으로 적용 가능한 경우 aAM(PKYVKQNTLKLAT 펩타이드로서, 서열번호 1)을 또한 시스템에 제공하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 공배양 9일 후, 세포를 INFL-DRB1*01:01-PKYV 사량체(aAPX:aAM, 서열번호 2)로의 특이적 염색에 대해서 분석하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출하였다. 분석물 TC(CD4+ T-세포), 및 1) aAM을 갖지 않는 ACL-341(펄싱되지 않음), 2)물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 2시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로, PKYVKQNTLKLAT 펩타이드(aAM, 서열번호 1)로 펄싱된 ACL-341으로 구성된 2종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. CD4 대 INFL-DRB1*01:01-PKYV의 유세포 분석법 플롯을 나타내고, 여기서 플롯은 eAPC:T 시스템(좌측에서 우측으로) 1) 및 2)에 대한 데이터를 나타낸다. CD4+/INFL-DRB1*01:01-PKYV+ 세포(게이팅됨)의 명백한 집단(12%)이 플롯 2(aAM으로 펄싱됨 ACL-341)에서 관찰되며, 이에 반해서 aAM이 결핍된 대조군 eAPC:T 시스템, 플롯 1은 0.06%의 양성 세포를 갖는다. 따라서, 특이적 분석물 TC CD4+ 세포는, 외인성 aAM이 제공되는 경우 eAPC-p 세포에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 의해서 항원 의존적 특성으로 과성장될 수 있다.
도 48 - 일차 CD8 세포와 공배양된 eAPC-pa 세포의 항원-특이적 세포독성
7종의 상이한 eAPC:T 시스템을 분석물 TC로서 일차 CD8+ T 세포, 및 3종의 상이한 eAPC 세포주, ACL-191(eAPC-p, aAPX: HLA-A*02:01), ACL-390(eAPC-pa, aAPX:aM: HLA-A*02:01, HCMVpp65) 또는 ACL-128 (eAPC, HLA-I 널, 즉, aAPX 없음)을 사용하여 컴파일하였다. 추가로, ACL-191 또는 ACL-128로 구성된 eAPC:T 시스템은, 사용 가능한 경우, 외인성으로 제공된 aAM(NLVPMVATV 펩타이드로서, 서열번호 3)을 사용하였다. 시스템을 하기에 기술된 바와 같이 컴파일하였고, 아넥신V 및 PI로 염색하여 유세포 분석법에 의해서 죽은 세포를 검출함으로써 공배양물에서 세포를 eAPC-p 또는 -pa에 대한 세포독성 작용에 대해서 분석하였다. a) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) 펄싱되지 않은 ACL-128, 2) aAM으로 펄싱된 ACL-128, 3) aAM을 갖지 않은 ACL-191(펄싱되지 않음), 4) aAM으로 펄싱된 ACL-191로 구성된 4종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 2시간 동안 1μM의 펩타이드 농도로 HCMVpp65 단백질로부터 유래된 NLVPMVATV 펩타이드(aAM)를 갖는, aAM을 갖는 시스템을 제공하였다. 또한, 시스템을 1:0, 1:1 및 1:8의 eAPC:CD8의 비율로 컴파일하였다. 유세포 분석법(CD80+아넥신+PI+)에 의해서 검출된 바와 같은 죽은 eAPC 세포 백분율의 막대 그래프를 도시한다. eAPC-p 세포의 명백한 사멸은 1:1 또는 1:8(eAPC:CD8)의 비의 eAPC 및 CD8+ 세포 둘 모두로 구성된 시스템 4(ACL-191 +펩타이드)에서만 관찰된다. 상기 사멸의 어떠한 유의한 증가도 배경에 존재하지 않고, aAPX, aAM 또는 둘 모두가 결핍된 시스템 1, 2 및 3에서 관찰되지 않는다. 따라서, 외인성 aAM으로 펄싱된 eAPC-p를 사용하여 일차 CD8+ T-세포(분석물 TC)에서 항원 특이적 세포독성 작용을 자극할 수 있다. b) 분석물 TC(CD8+ T-세포), 및 1) ACL-128(eAPC), 2) ACL-191(eAPC-p) 또는 3) ACL-390(eAPC-pa)으로 구성된 3종의 eAPC:T 시스템을 컴파일하였고, 여기서 어떠한 외인성 aAM도 제공되지 않는다. ACL-390은 통합된 aAM ORF, HCMVpp65를 갖는다. 유세포 분석법(CD80+아넥신+PI+)에 의해서 검출된 바와 같은 죽은 eAPC 세포 백분율의 막대 그래프를 도시한다. eAPC-p 세포의 명백한 사멸은 1:1 또는 1:8(eAPC:CD8)의 비의 eAPC 및 CD8+ 세포 둘 모두로 구성된 시스템 3(ACL-390)에서만 관찰된다. 상기 사멸의 어떠한 유의한 증가도 배경에 존재하지 않고, aAM 또는 aAPX:aAM 중 어느 하나가 결핍된 시스템 1 및 2에서 관찰되지 않는다. 따라서, 이러한 데이터는, eAPC-pa가 네이티브 세포 머시너리에 의해서 aAM 내에서 내인성 aAM ORF를 가공할 수 있고, aAPX와 복합체를 이룬 aAM을 제시할 수 있어서, 그것은 일차 CD8+ T-세포(분석물 TC)에 의한 항원 특이적 세포독성 작용을 자극할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
도 49 - 질량 분석법을 통한 eAPC-pa 세포로부터의 분석물 항원 분자 식별
질량-분석법 결과를 하기 절차로부터 유래된 펩타이드 분획에 대해서 제공한다. 2종의 eAPC-p 주, ACL-900(aAPX: HLA-A*02:01) 및 ACL-963(aAPX: HLA-A*24:02)를 공지된 항원성 펩타이드로 펄싱하였고, 여기서 각각의 eAPC-p의 경우, 펩타이드로서 하기 aAM 중 하나로 이루어진 4종의 개별 펄스를 수행하였다: NLVPMVATV(APD-2, 서열번호 3), NLGPMAAGV(APD-21, 서열번호 4), 또는 VYALPLKML(APD-11, 서열번호 5), 또는 펩타이드 없음. APD-2는 HLA-A*02:01와, APD-11은 HLA-A*24:02와 복합체를 이룬다고 공지되어 있고, APD-21은 APD-2의 삼중 돌연변이체(V3G, T8G, V6A)인데, 여기서 이러한 돌연변이는 HLA-A*02:01과 복합체를 이루는 펩타이드에 대한 능력을 파괴한다. 펄싱된 세포를 수거 및 용해시켰다. 투명한 용해물을 니켈 아가로스 수지와 혼합하고, HLA를 6x-His 포획을 사용하여 풀 다운(pull down)시켰다. 결합된 분획을 10% 아세트산 중에 용리시키고, 3kD 칼럼 상에서 한외여과시켰다. 펩타이드 분획을 액체 추출에 적용하고, 유기상을 제거하고, 고체상 추출에 적용하였다. 용리된 펩타이드 분획 w를 질량 분석법에 적용하였다. 펩타이드 NLVPMVATV(서열번호 3), VYALPLKML(서열번호 5) 및 NLGPMVAGV(서열번호 4)는 이의 대표적인 펄싱된 실험(ID 2, 3, 11)으로 성공적으로 식별되었고, 임의의 다른 샘플에서는 식별되지 않았다. HLA-비매칭된 펩타이드 NLVPMVATV(ID 12, HLA-A*24:02, 서열번호 3) 및 VYALPLKML(ID 13, HLA-A*02:01, 서열번호 5) 및 삼중 돌연변이체 NLGPAAGV(서열번호 4)는 식별되지 않았다. 따라서, eAPC-p 세포의 aAPX:aAM 복합체의 포획 및 농축을 사용하여 항원 제시 복합체에서 분석물 항원 분자의 HLA-제한된 제시를 식별, 확인 및/또는 결정할 수 있다.
물질 및 방법
ARH-77 세포의 전기천공법
반응에 따라, 4×106개 세포를 하기 설정 스퀘어 웨이브(Square Wave) 285V, 펄스 길이 12.5㎳ 및 1s 간격의 2회 펄스로, Gene Pulser XcellTM(바이오래드(Bio-Rad))을 사용하여 글루타맥스(Glutamax)-I(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 500ul RPMI 1640에서 전기천공하였다. Cas9 플라스미드 V1.A.8에 대해서 사용된 DNA 농도는 10ug/㎖였고, 통합 부위를 표적화하는 gRNA에 대해서는 7.5ug/㎖였다(HLA 내인성 유전자좌에서 통합을 위해서 V2.I.10 및 V2.J.1 및 AAVS1 부위를 표적화하기 위해서 V2.J.6)(표 3).
통합 벡터를 7.5ug/ul의 농도에서 전기천공하였다. HLA 유전자좌에서 HDR 통합을 위해서, HLA 클래스 I V1.C.6 및 V1.C.9 플라스미드를 사용하였다. AAVS1 유전자좌에서 HDR 통합을 위해서, HLA 클래스 I V1.F.8 및 V1.F.10 및 HLA 클래스 II V1.I.5 및 V1.I.7. pp65 ORF의 변이체를 미리 생성된 HLA 단일대립유전자주 내에 통합시켰다. GFP 마커와 연결된 pp65의 형태를 함유하는 플라스미드 V1.G.9 및 V1.H.1을 이러한 목적을 위해서 사용하였다. 하나의 RMCE 부위를 갖는 ARH-77 HLA-널 주를 생성시키기 위해서, 마커 측면에 배치된 이종특이적 리콤비나제 부위를 갖는 플라스미드, RFP의 경우 V4.B.2 및 BFP의 경우 V4.B.3을 사용하였다. 동일한 플라스미드를 공동 전기천공하여 2개의 RMCE 부위를 함유하는 안정적인 주를 생성시켰다. RMCE를 사용하여 단일대립유전자 HLA 주를 또한 생성시켰는데, 여기서 벡터 V4.D.2를 하나의 RMCE 부위를 함유하는 세포 내에 전기천공하였다. 전기천공법 후, 분석 전에, 세포를 글루타맥스-I + 10% FBS를 함유한 배양 배지 RPMI 1640(37℃, 5% CO2) 중에서 2일 동안 인큐베이션시켰다.
HEK293 세포의 형질주입
형질주입 1일 전에, 세포를 1.2 내지 1.4×106개 세포/60㎜ 접시의 밀도로 90% DMEM + 2mML-글루타민 + 10% HI-FBS(라이프 테크놀로지스) 중에 시딩하였다. 다음 날, 65% 컨플루언시를 갖는 세포를 6의 N/P 비에서 5ug DNA 및 jetPEI ®(폴리플러스(Polyplus) 형질주입 시약, 라이프 테크놀로지스)의 총량으로 형질주입시켰다. 배지를 형질주입 이전에 대체하였다. DNA 및 jetPEI ®의 스톡 용액을 각각 멸균 1M NaCl 및 150mM NaCl 중에 희석시켰다. 각각의 용액의 최종 부피는 총 믹스 부피의 50%에 동일하였다. 이어서, PEI 용액을 희석된 DNA에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로 DNA/PEI 혼합물을 세포막이 파괴되지 않도록 주의하면서 60-㎜ 접시에 첨가하였다.
GFP 발현 분석 이전에 세포를 48시간 동안 (37℃, 5% CO2, 95% 상대 습도)에서 인큐베이션시켰다. HLA 클래스 I 유전자의 결실을 위해서, 세포를 Cas9_GFP(V1.A.8), HLA-A, B 및 C(각각 V2.A.1, V2.A.7 및 V2.B.3)를 암호화하는 DNA 벡터 및 빈 벡터(V1.C.2) 0.42ug으로 형질주입하였다. AAVS1 유전자좌에서 RMCE 부위의 통합을 위해서, 세포를 0.5ug의 V1.A.8; 0.625ug의 gRNA V2.J.6 및 RMCE 부위에 의해서 측면에 배치된 2개의 마커를 암호화하는 플라스미드(RFP의 경우 V4.B.2 및 BFP의 경우 V4.B.3) 0.75ug로 형질주입하고, 빈 벡터 V1.C.2를 사용하여 5ug의 DNA를 완결하였다.
다클론성 GFP-발현 세포의 분류
Cas9-P2A-GFP(V1.A.8) 또는 GFP 선택 마커(V1.A.4)를 암호화하는 플라스미드로 전기천공되거나 형질주입된 세포를 FACSJAzzTM 세포 분류기(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여, 일시적인 GFP 발현에 대해서 분류하였다. HEK 293 세포를 TrypLETM Express Trypsin(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 수거하고, 세포 분류 전에, DPBS 1X(라이프 테크놀로지스)의 적합한 부피로 20% HI-FBS 및 Anti-Anti 100X(라이프 테크놀로지스)를 함유하는 DMEM 1X 배지 중에 재현탁시켰다. ARH-77 세포를 세척하고, 분류 이전에 20% HI-FBS 및 Anti-Anti 100X(라이프 테크놀로지스)와 함께 글루타맥스-I을 함유하는 RPMI 1640 중의 적절한 부피의 DPBS 중에 재현탁시켰다.
관심대상 성분의 안정적인 발현을 갖는 다클론성 및 단클론성 세포의 분류
통합된 단백질 또는 마커를 구성적으로 발현하는 세포의 집단을 수득하기 위해서, 세포를 제1 GFP+ 선택 7 내지 15일 후에 분류하였다. 표면 단백질을 발현하는 것으로 예상되는 세포에 대해서, 분류 이전에 항체 염색을 수행하였다. HLA 클래스 I 유전자의 경우, PE-CyTM5 마우스 항-인간 HLA-ABC 항체(비디 바이오사이언시스)를 사용하였다. HLA-DR 및 HLA-DP의 염색을 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647 마우스 항-인간 HLA-DR, DP, DQ(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 수행하였다. HEK 293 유래된 세포주의 경우, 세포를 TrypLETM Express Trypsin(써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 수거하고, 세포 분류 전에, DPBS 1X(라이프 테크놀로지스)의 적합한 부피로 20% HI-FBS 및 Anti-Anti 100X(라이프 테크놀로지스)를 함유하는 DMEM 1X 배지 중에서 세척하였다. ARH-77 유래된 세포주를 분류 이전에 20% HI-FBS 및 Anti-Anti 100X(라이프 테크놀로지스)와 함께 글루타맥스-I을 함유하는 RPMI 1640 중의 적절한 부피의 DPBS 중에서 세척하였다.
HLA 넉아웃 또는 통합의 경우, 세포의 선택을 각각 HLA 발현의 손실 또는 이득을 기초로 수행하였다. 통합된 RMCE 부위를 갖는 세포를 BFP 및 RFP 마커의 발현을 기초로 분류하였고, 통합된 pp65 돌연변이체를 갖는 HLA 단클론을 GFP 발현에 대해서 분류하였다(표 4). 관심대상 유전자를 발현하는 세포의 단클론성 분류를 200ul의 성장 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 1 내지 2개의 플레이트를 샘플당 분류하였다. 남아있는 세포의 다클론성 분류를, 직 후에, FACS 튜브에서, 이측 분류 설정을 사용하여 세포 분류기 인플럭스(Influx)TM(비디 바이오사이언시스)에서 수행하였다.
단클론성 집단의 표현형 스크리닝
과성장된 단클론 집단의 20,000개 세포의 샘플을 분석을 위해서 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 세포를 250ul의 DPBS 1X(라이프 테크놀로지스) 중에 재현탁시키고, LRSFortessaTM(비디 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. BFP 및 RFP 발현을 각각 BV421의 경우 PMT 및 PE-텍사스 레드(Texas Red) 형광단을 사용하여 검출하였다. 표면 발현을 갖는 단백질의 경우, 세포를 먼저 PE-CyTM5 마우스 항-인간 HLA-ABC 항체(비디 바이오사이언시스) 또는 알렉사 플루오르® 647 마우스 항-인간 HLA-DR, DP, DQ(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 염색하였다. 100ul의 염색 완충액(DPBS +2% FBS) 중에 희석된 제안된 항체 부피를 사용하여 염색 용액을 제조하였다. 세포를 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시키고, 이어서 분석 전에 500ul의 완충액으로 2회 세척하였다. 선택된 단클론을 정상 성장 배지 중에서 유지시켰다. HEK239 세포는 DMEM+ 2mML-글루타민+10% HI-FBS(라이프 테크놀로지스) 중에서 성장하고, ARH-7 세포는 글루타맥스-I + 10% HI-FBS를 함유하는 RPMI 1640 중에서 성장한다. 세포의 컨플루언스를, 이것이 10 내지 12×106에 도달할 때까지, 매일 모니터링하였다. DNA를 QIAamp DNA 미니키트(퀴아젠)를 사용하여 5×106개 세포로부터 추출하였다. 남아있는 세포를 추가로 확장시키고, 70% 성장 배지 + 20% HI-FBS + 10% DMSO 중에서 3×106개 세포/㎖의 밀도로 저온보존하였다.
적절한 게놈 위치 내의 통합의 확인
목적하는 표현형 특징을 갖는 단클론을 분자 수준에서 스크리닝 및 평가하고, 이것을 Q5® 핫 스타트 하이-피델리티(Hot Start High-Fidelity) DNA 중합효소(NBE)를 사용하여, 20ul 반응으로, 제조사에 의해서 제안된 성분 및 부피를 사용하여 PCR에 의해서 수행하였다. HLA I ORF가 HLA 유전자좌에 통합되었는지의 여부를 결정하기 위해서, 프라이머 9.C.4 및 9.D.6을 사용하였고; 적절한 우측 상동 아암 재조합은 1kb 앰플리콘에 의해서 제시되었다(표 5). AAVS1 유전자좌에서의 HLA 통합의 경우, 프라이머의 4개 세트를 사용하였다: 적절한 좌측 상동 아암 재조합을 평가하기 위한 9.C.3 및 9.C.8(1.1 kb), 우측 상동 아암 재조합을 평가하기 위한 9.C.4 및 9.D. 1(660 bp), 내부 작제물의 CMV 프로모터를 증폭시키기 위한 1.C.5 및 9.C.5(810bp), 및 내부 작제물의 SV40pA 종결인자에 대한 앰플리콘을 수득하기 위한 1.C.2 및 9.C.10(380bp). HEK293 및 ARH-77 HLA-널 주에서 RMCE 부위 통합의 평가를 프라이머 세트 2 및 4를 사용하여 수행하였다. HEK293 세포에서 HLA 클래스 I 결실을 확인하기 위해서, 특이적 HLA 프라이머를 하기와 같이 사용하였다: HLA-A를 표적화하는 4.A.3 및 4.A.4, HLA-B를 위한 4.A.7 및 4.B.1 및 HLA-C를 위한 4.B.5 및 8.A.1. 먼저, 모든 성분(Q5® 반응 완충액, dNTP, 핫-스타트 Q5® DNA 중합효소, 프라이머 Fwd 및 Rev, 100ng의 DNA 주형 및 H20)을 사용하여 PCR 마스터 믹스를 제조하였다. PCR 반응을 C1000 TouchTM 써멀 사이클러(Thermal Cycler)(바이오래드)를 사용하여 수행하였다. PCR 산물을 1XTAE 완충액 중의 1% 아가로스 젤 상에서, 파워팩 베이직(PowerPac Basic)(바이오래드)을 사용하여 이동시키고, 시버세이프(sybersafe)의 10,000배 희석물로 염색하고, 퓨전(Fusion) SL(빌버 루멧(Vilber Lourmat))로 분석하였다.
유전자 카피 수의 식별
선택된 단클론의 DNA를, 관심대상 유전자를 표적으로 하는 특이적 프라이머 및 통합된 유전자의 단편을 인식하고, 상동 아암에 연장된 프로브를 사용함으로써 분석하였다. HLA 유전자좌 내에서의 HLA 클래스 I 통합의 경우, 프라이머 4.I.9 및 9.C.4를 사용하여 관심대상 유전자를 증폭시켰고, 8.B.2를, FAM과 접합된, 프로브로서 사용하였다. AAVS1 유전자좌에 통합된 작제물의 경우, 프라이머 9.D.6 및 9.D.7, 및 또한 FAM과 접합된 프로브 9.J.2를 또한 사용하였다. 모든 경우에, HEX와 접합된 형광 프로브 10.B.6과 함께 프라이머 10.A.9 및 10.A.10을 사용하여, 참조군 유전자(TRAC)를 동시에 스크리닝하여 카피 수를 결정하였다. 통합 카피 수는, ARH-77 세포가 2배체이고, HEK293 세포가 참조군 유전자(TRAC)에 대해 3배체인 것으로 간주되었다. 드롭렛 디지털(Droplet Digital) PCR 이전에, DNA를 MfeI(NEB)로 소화시켜 탠덤 통합을 분리하였다. 반응 설정 및 사이클링 조건은, QX200TM 드롭렛 리더(Droplet Reader) 및 드롭렛 제너레이터(Droplet Generator) 및 C1000 TouchTM 딥-웰 써멀 사이클러(deep-well Thermal cycler)(바이오래드)를 사용하여, ddPCRTM 프로브용 슈퍼믹스(Supermix for Probes)(dUTP 없음)(바이오래드)에 대한 프로토콜을 따랐다. 데이터를 QuantaSoftTM 소프트웨어를 사용하여 획득하여, Ch1을 사용하여 HEX에 대한 FAM 및 Ch2를 검출하였다.
eAPC 세포주에서 HLA-A*02:01 서열의 Flp-매개된 통합
eAPC 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HLA-A*02:01을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HLA-A*02:01 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다.
각각의 통합 벡터와 Flp-벡터 간의 비는 1:3이었다. 2일 후 GFP 분류를 위한 게이트를 설정하기 위해서 GFP-벡터 만으로 전기천공된 세포 및 비-전기천공된 세포를 각각 대조군으로 사용하였다. 다음 날(전기천공법 2일 후), 세포를 분석하고, GFP 발현을 기초로 분류하였다. 세포를 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
전기천공법 3일 후, 전기천공된 세포를 풍부하게 하기 위해서 GFP-발현을 기초로 한 분류를 수행하였다. 전기천공법 7 내지 8일 후, 세포를 수거하고, HLA-ABC 발현에 대해서 표면 염색하였다. BFP+ve RFP-ve HLA+ve 세포는 단클론성에 대해서 분류된 단일 세포였다.
세포를 유전형결정하기 위해서, 100ng의 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하여 통합이 예측된 통합 부위에서 일어났는지의 여부를 확인하였다. 통합 카세트를 표적화하는 순방향 프라이머(Pan_HLA_GT_F1(삽입부 서열번호)) 및 통합 부위 외부 만을 표적화하는 역방향 프라이머(SV40pA_GT_R1 삽입부 서열번호)를 사용하였고, PCR 산물을 1% 아가로스 젤 상에서 이동시켰다.
eAPC-p 세포주에서 HCMV ORF 서열의 Flp-매개된 통합
eAPC-p 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HCMV pp28, pp52 또는 pp65 aAM-ORF을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HCMV-ORF 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다.
각각의 통합 벡터와 Flp-벡터 간의 비는 1:3이었다. 2일 후 GFP 분류를 위한 게이트를 설정하기 위해서 GFP-벡터 만으로 전기천공된 세포 및 전기천공되지 않은 세포를 각각 대조군으로 사용하였다. 다음 날(전기천공법 2일 후), 세포를 분석하고, GFP 발현을 기초로 분류하였다. 세포를 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
eAPC-p 세포주에서 3개의 HCMV ORF 서열의 Flp-매개된 샷건 통합
eAPC-p 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HCMV pp28, pp52 또는 pp65 aAM-ORF을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HCMV-ORF 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다. 샷건 통합을 위해서, HCMV-ORF를 함유하는 벡터를 1:1:1의 비로 풀링시키고, 혼합물을 eAPC-p 세포 내에 전기천공하였다. 생성된 eAPC-pa 세포는 다클론성이었다. 개별 단클론 세포를 분류하고, 유전적으로 특징규명하여, 다클론이 3종의 모든 HCMV-ORF를 함유하는 세포로 구성되었음을 예증하였다.
성분 D 내의 HCMV ORF의 RMCE-통합을 평가하기 위한 PCR 반응
프라이머를 사용하여 링커(순방향 프라이머 10.D.1(삽입부 서열번호) 및 EF1aplha 프로모터(역방향 프라이머 15.H.4))에 어닐링된 HCMV ORF의 통합을 평가하였다. 예측된 크기는 pp28의 경우 0.8kb, pp52의 경우 1.5kb, pp65의 경우 1.9kb였다.
PCR 산물을 1XTAE 완충액 중의 1% 아가로스 젤 상에서, 파워팩 베이직(바이오래드)을 사용하여 수행하고, 시버세이프의 10,000배 희석물로 염색하고, 퓨전 SL(빌버 루멧)로 분석하였다.
항원-특이적 CD8+ 세포의 과성장
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 피콜 플라크 플러스(Ficoll Paque Plus)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여, CMV-A.0201-NLVP에 대해서 특이적인 CD8+ T 세포를 갖는 것으로 공지된 건강한 혈액 공여자로부터 단리하였다. 세포를 CD 마커에 대해서 표면 항체로 염색하였다. 특이적 T-세포 집단을 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하고, 펠릿화하고, 200 000개 세포/㎖로 OSG 배지 + 10% HS 중에 재현탁시켰다.
펩타이드 다량체로 펄싱한 eAPC
HLA-A*02:01 eAPC를 1μM 펩타이드(NLVPMVATV(서열번호 3)로 또는 완전 OSG 배지 + 10% HS) 중에서 4시간 동안 펄싱하였다. 세포를 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 3회 세척하고, 100 000개 세포/㎖로 OSG 배지 + 10% 인간 혈청(HS) 중에 재현탁시켰다.
항원-특이적 CD8+와 eAPC의 공배양
CD8+ 세포를 96웰 폴리스테렌(wp) 둥근 바닥 플레이트에서 1:1 비로, 즉, 100㎕ 배양 부피로 웰당 총 10000개 세포 중의 각각의 세포 유형의 5000개 세포로, eAPC와 공배양하였다. 배양 9일에 재자극을 수행하여, 150㎕의 배양물을 유지시키고, 웰당 50㎕의 부피에서 5000개의 새로 펄싱된 eAPC 세포로 재자극하였다.
병행 실험에서 CD8+ T 세포를, 96wp 둥근 바닥에서 pp65를 안정적으로 발현하는 eAPC-pa 세포주와 1:1 비로 공배양하고, 100㎕ 배양 부피에서 웰당 각각의 세포 유형은 5,000개 세포 => 10,000개 세포였다. 펄싱되지 않은 HLA 널 및 eAPC-pa 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 어떠한 재자극도 수행하지 않았다.
표현형결정(phenotyping)
표현형결정을 14일에 수행하였다. 20개 웰의 5개 반복물 및 풀을 조건당 표현형결정하였다. 세포를 별도로 100x 희석된 DCM(Zombie NIR)으로 염색하고, 그 다음 50x 희석된 다량체(표 4)로 10분 동안 염색하고, 그 후 표면 마커(표 4)를 30 내지 60분 동안 샘플당 25㎕로 첨가하였다. 세포를 염색 완충액(PBS+2% FBS) 중에 재현탁시키고, LSR포테사(LSRFortessa) 상에서 데이터를 획득하고, FlowJo에서 분석하였다.
항원-특이적 CD4+ 세포의 과성장
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 피콜 플라크 플러스(지이 헬쓰케어)를 사용하여, INFL-DRB1*01:01-PKYV에 대해서 특이적인 CD4+ T 세포를 갖는 것으로 공지된 건강한 혈액 공여자로부터 단리하였다. 세포를 CD 마커에 대해서 표면 항체로 염색하였다. 특이적 T-세포 집단을 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하고, 펠릿화하고, 100000 또는 400000개 세포/㎖로 OSG 배지 + 10% HS 중에 재현탁시켰다.
펩타이드 다량체로 펄싱한 eAPC
HLA DRB1*01:01 eAPC를 1μM 펩타이드(PKYVKQNTLKLAT(서열번호 1)로 또는 완전 OSG 배지 + 10% HS) 중에서 2시간 동안 펄싱하였다. 세포를 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 3회 세척하고, 5000개 세포/㎖로 OSG 배지 + 10% 인간 혈청(HS) 중에 재현탁시켰다.
항원-특이적 CD4+와 eAPC의 공배양
CD4+ 세포를 eAPC와 96wp 둥근 바닥에서, 즉 250 eAPC 및 5.000 대 20.000 CD4+ 세포를 100㎕ 배양 부피에서 공배양하였다. 배양물을 OSG+10% HS에서 유지시켰다. 일부 배양물에 1일에 100U/㎖ IL-2를 첨가하였다. IL-2 첨가가 없는 배양물을 배지에 첨가하였다. 14일 동안 확장된 배양물에는 7일에 IL-2의 추가 용량을 첨가하였다.
표현형결정
표현형결정을 14일에 수행하였다. 20개 웰의 5개 반복물 및 풀을 조건에 따라서 표현형결정하였다. 세포를 별도로 100x 희석된 DCM(Zombie NIR)으로 염색하고, 그 다음 50x 희석된 다량체(표 4)로 10분 동안 염색하고, 그 후 표면 마커(표 4)를 30 내지 60분 동안 샘플당 25㎕로 첨가하였다. 세포를 염색 완충액(Stain 완충액)(PBS+2% FBS) 중에 재현탁시키고, LSR포테사 상에서 데이터를 획득하고, FlowJo에서 분석하였다.
세포독성 검정
eAPC의 펩타이드 펄싱
2×106개 세포를 1μM NLVPMVATV(서열번호 3) 펩타이드로, 2㎖ 완전 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배지 중에서 밤새 펄싱하고, 수거하고, PBS로 3x 세척하고, 완전 RPMI 중에서 재현탁시켰다.
항원-특이적 CD8+ T 세포의 제조
항원-특이적 CD8+ T 세포는 건강한 공여자로부터의 PBMC로부터 유래되었다. 세포를 CD 마커에 대해서 표면 항체로 염색하였다. 특이적 T-세포 집단을 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하고, 계수하고, 액체 질소 중에 저장하였다. 실험 1일 전에 세포를 해동시키고, 완전 OSG 배지 중에서 밤새 유지시켰다. 세포를 계수하고, 완전 OSG 배지 중에 재현탁시켰다.
eAPC 및 항원 특이적 CD8+ 세포의 공배양
펩타이드 펄싱된 eAPC 및 펄싱되지 않은 eAPC를 세포독성 CD8+ T 세포와 공배양하였다. 10,000개의 eAPC를 96-웰 플레이트에 웰당 시딩하였다(50㎕ 완전 RPMI). eAPC를 CD8+ T 세포와 증가하는 비율로 공배양하였다. 시험된 비는 100ul의 총 부피의, eAPC 단독 1:0(eAPC:CD8+), 1:1(eAPC:CD8+), 1:8(eAPC:CD8+)이었다. 세포를 4 내지 5시간 동안 공배양하였다.
염색
세포를 웰로부터 마이크로튜브(하나의 웰 -> 하나의 마이크로튜브)로 옮기고, 400㎕의 RPMI를 튜브당 첨가하였다. 세포를 3분 동안 400g에서 원심분리하고, 상청액을 흡입시키고, 세포 펠릿을 25㎕ 염색 믹스 또는 RPMI(염색되지 않은 대조군)(염색 믹스: 아넥신V BV711 + CD80 APC + CD8 APC-H7) 중에 재현탁시키고, 20분 동안 RT에서 450rpm으로 인큐베이션시켰다. 튜브당 400㎕의 RPMI를 첨가함으로써 염색을 중단시키고, 그 다음 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 염색을 표 4에 기술한다. 세포 펠릿을 1㎍/㎖의 프로피듐 아이오다이드를 함유하는 150㎕ RPMI(염색된 샘플) 또는 150㎕의 RPMI(염색되지 않은 샘플) 중에 재현탁시키고, 포테사 획득을 위해서 샘플을 96-웰 플레이트로 옮겼다.
금속 친화성 크로마토그래피
펄싱 실험을 위해서 사용된 펩타이드를 젠스크립트 바이오테크(Genscript Biotech)로부터 구입하였다.
APD-2: NLVPMVATV(서열번호 3) pp65는 야생형 펩타이드이고, HLA-A*02:01에 대한 결합에 제한되고, APD-21: NLGPMAAGV(서열번호 4) pp65는 ADP-2 NLVPMVATV(서열번호 3) pp65의 V3G,T8G, V6A 삼중 돌연변이체 펩타이드이고, APD-11: VYALPLKML(서열번호 5)은 HLA-A*24:02에 대한 결합에 제한된 야생형 펩타이드이다.
세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험일에, 세포를 수거하고, 따뜻한 PBS 1x 중에서 2회 세척하고, 2×106개 세포/㎖로 재시딩하고, 1μM 펩타이드로 2시간 동안 펄싱하였다. 펄싱된 세포를 수거하고, 얼음 냉각된 PBS로 2회 세척하고, 얼음 냉각된 용해 완충액(150mM 염화나트륨(NaCl), 50mM 트리스 pH 8, 1% 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 5mM 이미다졸, 0,2mM 아이오도아세트아마이드 및 1x 할트(Halt) 프로테아제 저해제 칵테일(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 중에 용해시키고, 보텍싱하고, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
투명해진 용해물을 HisPurTM 니켈-니트릴로아세트산(Ni-NTA) 수지(써모 사이언티픽)와 혼합하고, 2시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 용해물 미결합 분획을 제거한 후, 수지를 고염 완충액(250mM NaCl, 50mM 트리스 pH 8, 25mM 이미다졸)으로 2회 세척하고, 저염 완충액(50mM NaCl, 50mM 트리스 pH 8)으로 2회 세척하였다. 세척된 비드를 저염 세척 완충액 중에서 수거하고, 스핀 칼럼(써모 사이언티픽)으로 옮겼다. 결합된 분획을 10% 아세트산 중에 용리시키고, 3kD 나노셉 오메가(Nanosep Omega) 칼럼(폴(Pall)) 상에서 한외여과시켰다. 수-포화된 에틸-아세테이트와 1:1로 혼합하고, 광범위하게 보텍싱하고, 유기상을 제거함으로써 펩타이드 분획을 액체 추출에 적용하였다. 2층 엠포어 스타이렌 다이바이닐벤젠-역상 설포네이트(SDB-RPS) 매트릭스 47㎜ 디스크(3M)와 조립된 스테이지 팁 상에서 후속 고체상 추출을 수행하였다. SDB-RPS 막을 아세토나이트릴로 활성화시키고, 샘플 적재 이전에 SDB 세척 완충액(0.2% TFA, 밀리-큐(milli-Q), pH <2)으로 평형화시켰다. 이어서, SDB 막을 2회 세척한 후, 용리 완충액(80% 아세토나이트릴(ACN), 1% NH3, 밀리-큐, pH>10) 중에서의 흡수된 펩타이드 분획의 용리시켰다. 샘플을 HPLC-유리 바이알로 옮기고, 진공 건조시키고, -20℃에서 저장한 후, LC-MS/MS 분석하였다.
질량 분석법
펩타이드를 10ul 용매 A(3% ACN, 0.1% 폼산(FA), MQ) 중에 재현탁시킨 후, LC-MS/MS 분석하였다. 각각의 샘플 바이알로부터 8㎕를 주입함으로써 각각의 샘플을 디오넥스 나노(Dionex nano)-UHPLC 시스템(써모 피셔 사이언티픽)에 연결된 Q 이그잭트(Exactive) HF(써모 피셔(Thermo Fisher), 독일 소재) 상에서 분석하였다. UHPLC에 50℃까지 가열된 트랩 칼럼(아클레임 펩맵(Acclaim PepMap) 100, 75㎛ x 2㎝, 나노바이퍼(nanoviper), C18, 3㎛, 100Å; 써모 피셔 사이언티픽) 및 분석 칼럼(펩맵 RSLC C18, 2㎛, 100Å, 50㎛ x 50㎝; 써모 피셔 사이언티픽)을 장착하였다. nLC 분리를 위한 이동-상 완충액은 용매 A 및 용매 B(95% ACN, 0.1% FA, MQ)로 이루어졌다. 펩타이드를 30분 구배 동안 용리시키고, 질량 분광광도계에 직접 분사하였다. 유량을 400nL/분으로 설정하였고, LC 구배는 다음과 같았다: 5분 이내에서 2-5%의 용매 B, 30분 이내에서 5-40% 용매 B, 5분 이내에서 40-47% 용매 B, 5분 이내에서 47-100% 용매 B 및 8분 동안 100% B 및 5분 동안 2% 용매 B. 1.8kV의 인가 전압으로 나노 스프레이를 달성하였다.
질량 분석계를 데이터-의존적 획득(DDA) 모드(상위 10개의 가장 강한 피크)로 프로그래밍하였고, 400에서 1600 m/z의 푸리에 변환 연구 스캔(200 m/z에서 해상도 60,000), AGC 표적 1e6, 최대 주입 시간 250㎳를 수행하도록 구성하였다. HCD 단편화 및 동적 배제를 위해서 1.2 m/z의 사중극자 단리 윈도우를 사용하여 30s에서 MS2 스캔을 전하 상태 1-7의 10개의 가장 풍부한 MS1 이온 상에서 획득하였다.
데이터 분석
일반적인 LC-MS/MS 오염물의 목록이 보충된, 실험에서 사용된 펩타이드를 포함하는 펩타이드 파스타-파일(fasta-file)에 대해서 맥시퀀트(MaxQuant)(버전 1.5.6.5)를 사용하여 원시 MS 파일을 탐색하였다. 소화 특이성을 비특이적으로 설정하고, 펩타이드 가변 변형을 산화(M)를 허용하도록 설정하고, 제1 탐색 허용을 20ppm으로 설정하고, FDR을 1%로 설정하였다.
실시예
실시예 1: 표적화된 돌연변이발생에 의한 APX 유전자 패밀리의 결실
여기서는 항원-제시 복합체(APX) 암호화 유전자의 패밀리의 표적화된 돌연변이발생이 어떻게 달성되어 조작된 항원-제시 세포(eAPC)의 제1 특질을 생성하였는지를 기술한다. 상기 특질은 APX 패밀리의 적어도 하나의 구성원의 표면 발현의 결핍이다.
본 실시예에서, 표적화된 APX는 HEK293 세포주에서 주요 HLA 클래스 I 패밀리의 3개의 구성원, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하였다. HEK293 세포는 HLA-ABC의 내인성 표면 발현을 나타내는 인간 배아 신장 세포로부터 유래되었다. 세포유전학적 분석은, 세포주가 근사 3배체 핵형을 갖고, 따라서 HEK293 세포는 각각의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 3종의 대립유전자를 암호화하였음을 예증하였다.
조작된 CRISPR/Cas9 시스템(여기서 Cas9 뉴클레아제 활성도는 합성 가이드 RNA(gRNA)에 의해서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌에 표적화되었음)을 사용하여 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 표적화된 돌연변이발생을 수행하였다. 4 내지 5개의 고유한 gRNA를 각각의 HLA 유전자 유전자좌에 대해서 보존된 뉴클레오타이드 서열을 표적화하도록 설계하고, 표적화된 부위를 유전자 암호 서열의 시작부를 향해서 편향시켰는데, 이는 널 대립유전자를 생성시킬 가능성이 크기 때문이었다. 표적화된 유전자좌에서 돌연변이를 유도하는 gRNA 효율을 결정하고, 가장 효율적인 gRNA를 선택하여 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 널(HLA-ABC널) HEK293 세포주를 생성시켰다.
Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드와 함께, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드를 본 방법에 기술된 바와 같이 HEK293 세포 내에 형질주입하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 28a). GFP 분류된 세포를 5일 초과 동안 추가로 확장시켜 유전자 편집 사례가 발생하기에 충분한 시간을 허용하였고, 장해 돌연변이의 경우, 잔류하는 내인성 HLAI 단백질의 발현의 손실에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 pan-HLA-ABC 항체로 염색하여, 이의 표면 상에서 감소된 발현된 HLA-ABC를 갖는 세포를 식별하였다(도 28b). pan-HLA-ABC 항체 염색의 부재는, 각각의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자가 돌연변이되었음을 의미하였다. 개별 HLA-ABC 음성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집물을 나타내었다.
HLA-ABC널 단클론을 HLA-ABC의 표면 발현의 결핍에 의해서 확인하였다. 이는, 단클론의 하위세트가 HLA-ABC의 표면 발현이 결핍되었음을 예증하였고, 이의 3종의 예시적인 단클론, ACL-414, ACL-415 및 ACL-416을 도 29에 도시한다. 세포주가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 모든 대립유전자에서 근본적인 유전자 돌연변이를 보유하였는지를 결정함으로써 HLAI 표면 발현이 결핍된 단클론의 추가의 유전학적 특징규명을 수행하였다(도 30). 앰플리콘 크기 변화를 검출하기 위해서, gRNA 게놈 표적 부위에 연장된 프라이머를 사용한 PCR에 의해서 유전학적 특징규명을 수행하였고/거나 이를 서열결정을 위한 주형으로서 사용하였다. 도 30은 제조된 세포주(예를 들어, ACL-414)의 앰플리콘 크기에 비해서 더 짧은 PCR 앰플리콘에 의해서 검출된 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 대립유전자에서 유전자 결실을 함유한 HLA-ABC널 단클론의 선택을 나타낸다.
결론적으로, ACL-414, ACL-415 및 ACL-416을 비롯한, 유전적으로 변형된 HEK293 세포주는, HLA-ABC의 표면 발현이 결핍되었고, 따라서 조작된 항원-제시 세포(eAPC)의 제1 특질을 보유하였음이 입증되었다.
실시예 2: 성분 B를 함유한 eAPC의 생성
여기서는 성분 B가 HLA-ABC널 단클론 주 ACL-414에 어떻게 안정적으로 통합되어 eAPC의 제2 특질을 생성시켰는지를 기술한다. 상기 제2 특질은 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 적어도 하나의 게놈 수용자 부위를 함유하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해서 설계된 합성 작제물이었다.
본 실시예에서, 게놈 통합 부위, 성분 B는 선택된 유전 요소로 구성되었다. 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3가 존재하며, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화한 ORF 측면에 배치되었다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F3 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 이종특이적 리콤비나제 부위 상에 비-암호 시스-조절 요소를 배치하는 것의 이점은, 그것이 매칭된 유전자 공여자 벡터, 성분 C에서 요구되지 않기 때문이다. 따라서, 유전자 공여자 벡터의 세포 전달 이후에, 암호화된 ORF의 어떠한 일시적인 발현도 관찰되지 않을 것이다. 이것은 성공적인 RMCE의 선택을 보다 신뢰 가능하게 만드는데, 그 이유는 유전자 공여자 벡터로부터의 ORF의 세포 발현이 성분 B 내로의 적절한 통합 이후에만 대부분 일어나기 때문에, 그것이 이제 적절한 시스-조절인자 요소를 함유하기 때문이다(실시예 6 참고).
성분 B의 게놈 안전 보유 유전자좌, AAVS1 내로의 안정적인 게놈 통합을 촉진시키기 위해서, 플라스미드를 작제하였고, 여기서, 성분 B의 DNA 요소는 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암 측면에 배치되었다. 각각의 아암은 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성되었다.
상동 유도 재조합(homology directed recombination: HDR)의 과정을 통해서 게놈 안전 보유 유전자좌, AAVS1에서 성분 B의 안정적인 통합을 달성하였다. ACL-414 세포주를 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드, Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 유전 요소를 암호화한 플라스미드로 형질주입하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 31a). GFP 분류된 세포를 7일 초과 동안 추가로 확장시켜, HDR이 발생하고, 선택 마커, BFP의 일시적인 발현이 손실되기에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 FACS 기계 상에서 분석하고, 개별 BFP 양성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집물을 나타내었다(도 31c).
개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 발현을 기초로 그리고 성분 B의 목적하는 AAVS1 게놈 위치 내로의 단일 통합을 위해서 eAPC로서 선택하였다. 세포주 ACL-469 및 ACL-470은 유지된 BFP 발현을 갖는 단클론을 나타내었다(도 32a 및 b). 유전학적 특징규명을 단클론 ACL-469 및 ACL-470으로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 B를 통합하였고, 성분 B는 AAVS1 부위 내에 통합되었음을 입증하였다(도 33). 성분 B에 대해서 특이적인 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 게놈 통합의 확인을 결정하였다(도 33a). 성분 B가 AAVS1 부위 내에 통합되었는지의 확인은, 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열에 대해서 설계된 프라이머 및 성분 B에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 고유한 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 결정하였다(도 33b). 디지털 드롭 PCR에 의해서 성분 B의 카피-수를 결정하였고, 여기서 성분 B 및 참조군 유전자 DNA 분자의 수를 측정하고, 비를 계산하였다(표 1). 단클론 ACL-469 및 ACL-470은 1 성분 B 분자 대 3 참조군 유전자 분자의 비를 함유하였다. 제조된 HEK293 세포주가 근사 3배체 핵형이라는 것을 고려할 때, 이는, ACL-469 및 ACL-470 세포주에서 성분 B의 단일 통합을 입증하였다.
결론적으로, 유전적으로 변형된 ACL-469 및 ACL-470 세포주는 HLA-ABC널 이었고, RMCE를 위해서 설계된 합성 게놈 수용자 부위의 단일 카피를 함유하였고, 따라서 단일 합성 통합 수용자 부위를 갖는 eAPC의 생성을 입증하였다.
실시예 3: 성분 B 및 성분 D를 함유하는 eAPC의 생성
여기서는 성분 B 및 성분 C가 HLA-ABC널 단클론 주 ACL-414에 어떻게 안정적으로 통합되어 eAPC의 제2 특질을 생성시켰는지를 기술한다. 상기 제2 특질은 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 2개의 게놈 수용자 부위를 함유하는데, 여기서 게놈 수용자 부위는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해서 설계된 합성 작제물이었다.
본 실시예는, 제2 게놈 수용자 부위, 성분 D의 첨가를 제외하고는, 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방법 및 성분을 사용한다. 성분 D 유전 요소는 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성되었는데, 이것은 성분 B와 상이하였다. 이러한 부위는 선택 마커, 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화한 ORF를 측면에 배치하였다. F14 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 실시예 2에서와 같이, 성분 D 유전 요소를 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 및 우측 상동 아암 측면에 배치하였다.
성분 B 및 성분 D를, 성분 D 요소를 암호화한 플라스미드를 형질주입 믹스에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기술된 바와 같이 AAVS1 내에 통합하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 31a). GFP 분류된 세포를 7일을 초과 동안 추가로 확장시키고, 그 후, 세포를 FACS 기계 상에서 분석하고, 개별 BFP 및 RFP 양성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집물을 나타내었다(도 31b).
개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 및 RFP 발현을 기초로 그리고 성분 B 및 성분 D의 상이한 AAVS1 대립유전자 내로의 단일 통합을 위해서 eAPC로서 선택하였다. 세포주 ACL-472가 유지된 BFP 및 RFP 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 32c). 실시예 2에 기술된 바와 같이, 유전학적 특징규명을 단클론 ACL-472로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 B 및 성분 D를 통합하였고, 두 성분 모두가 AAVS1 부위 내에 통합되었음을 입증하였다(도 33). 디지털 드롭 PCR에 의해서 두 성분 B 및 D의 카피-수를 결정하였고, 여기서 성분 B alc D및 참조군 유전자 DNA 분자의 수를 측정하고, 비를 계산하였다. 단클론 ACL-472는 2 성분 B와 D 분자 대 3 참조군 유전자 분자의 비를 함유하였다(표 2). 제조된 HEK293 세포주가 근사 3배체 핵형이라는 것을 고려할 때, 이는, 성분 B 및 성분 D의 ACL-472 세포주 내로의 단일 통합을 입증하였다.
결론적으로, 유전적으로 변형된 ACL-472 세포주는 HLA-ABC널이었고, RMCE에 대해서 설계된 합성 게놈 수용자 부위 성분 B 및 성분 D의 단일 카피를 함유하였고, 따라서 2개의 고유한 합성 통합 수용자 부위를 갖는 eAPC의 생성을 입증하였다.
실시예 4: 성분 C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 B는 네이티브 게놈 부위이고, 유전자 공여자 벡터, 성분 C'는 하나의 분석물 항원-제시 복합체(aAPX)를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, eAPC는 APX의 2개의 패밀리, 주요 HLA 클래스 I 패밀리 및 HLA 클래스 II가 돌연변이된, ACL-128이라고 지정된, 유전적으로 변형된 ARH-77 세포주였다. 제조된 세포주, ARH-77은 강한 HLA-A,B,C 및 HLA-DR,DP,DQ 세포 표면 발현을 나타낸 형질세포 백혈병으로부터 유래된 B 림프아구이다. 세포유전학 분석은, 제조된 ARH-77 세포주가 근사 2배체 핵형을 갖지만, 또한 HLA 유전자좌를 암호화하는 영역인 염색체 6p21 결실을 나타내었다는 것을 입증하였다. ARH-77 유전자좌의 DNA 서열결정은, ARH-77이 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 및 HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA 및 HLA-DPB 유전자 패밀리의 단일 대립유전자 만을 암호화하였다는 것을 확인해주었다.
HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 세포주 ACL-128을 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 및 HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA 및 HLA-DPB 유전자 패밀리를 표적으로 하는 gRNA를 사용하여 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 CRISPR/cas9 표적화된 돌연변이발생에 의해서 생성시켰다. pan-항-HLA-ABC 또는 pan-항-HLA-DR,DP,DQ로의 표면 표지는, ACL-128이 APX 패밀리 둘 모두의 표면 발현이 결핍되어 있음을 확인해주었다(각각 도 34b 및 35 및 도 37b).
본 실시예에서, 게놈 수용자 부위, 성분 B는 네이티브 AAVS1 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 C를, 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 및 우측 상동 아*을 암호화하는 성분 C에 의해서, 성분 B에 매칭시켰다. AAVS1 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAPX를 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 C'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 C'는 하나의 aAPX인 HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02를 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이들은 각각 성분 C'HLA -A*24:02 및 성분 C'HLA-B*-07:02라 지칭되었다.
eAPC-p를 작제하기 위한 과정은 성분 C'의 성분 B 내로의 HDR 유도된 통합을 통해서 성분 B'를 생성시키는 것이었다. 세포주 ACL-128을 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드, Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드 및 성분 C'를 암호화한 플라스미드로 전기천공하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 전기천공 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 34a). GFP 분류된 세포를 7일 초과 동안 추가로 확장시켜 HDR이 발생하고, aAPX의 일시적인 발현이 손실되기에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 pan-HLA-ABC 항체로 염색하여, 이의 표면 상에서 분석물 HLA의 발현을 얻은 세포를 식별하였다(도 34b). pan-HLA-ABC 항체 염색의 존재는, 성분 C'에 암호화된 분석물 HLA ORF가 게놈 내에 통합되었음을 암시하였다. 개별 HLA-ABC 양성 염색된 세포를 분류 및 확장시켜 eAPC-p 단클론의 수집물을 나타내었다.
개별 단클론 주를 이의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 기초로 그리고 성분 B'를 생성시키는, 게놈 수용자 부위 내로의 분석물 ORF의 통합을 기초로 eAPC-p로서 선택하였다. 세포주 ACL-321 및 ACL-331는 각각 HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02의 분석물 HLA 표면 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 35). 유전학적 특징규명을 선택된 단클론 ACL-321, ACL-327, ACL-331 및 ACL-332로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 C'를 통합하였고, 그 통합은 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 발생하여, 성분 B'를 생성하였음을 입증하였다(도 36). 성분 C'에 대해서 특이적인 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 게놈 통합의 확인을 결정하였다(도 36a). 성분 B'의 존재를, 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머 및 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열에 대해서 설계된 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 확인하였다(도 36b).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 B' 내에, 각각 aAPX HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-321 및 ACL-331 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 5: 성분 C'가 짝지워진 HLAI ORF를 암호화한 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 B는 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 C'는 2개의 aAPX 쇄를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예는 eAPC, ACL-128, 및 성분 B를 사용하였고, 이들 둘 모두는 실시예 4에 정의되어 있다. 그러나 성분 C'는 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소에 의해서 HLA-DRB1*01:01 대립유전자에 연결된 HLA-DRA*01:01 대립유전자, 또는 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소에 의해서 HLA-DPB1*04:01 대립유전자에 연결된 HLA-DPA1*01:03 대립유전자를 암호화한 단일 ORF를 포함하였고, 이는 각각 성분 C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 및 성분 C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01라 지칭되었다. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소는, 전사되는 경우 합성된 펩타이드의 자가-절단을 초래하고, 각각의 HLA 쇄를 한정하는 2개의 폴리펩타이드를 생산하는 펩타이드 서열을 암호화하였다.
표면 상에서 분석물 HLA의 발현을 얻은 세포의 식별을 pan-항-HLA-DR,DP,DQ 항체로의 세포 표면 표지에 의해서 평가한 것을 제외하고는, APC-p를 작제하는 과정은 실시예 4에 기술되어 있다(도 37). pan-항-HLA-DR,DP,DQ 항체 염색의 존재는, 성분 C'에 암호화된 분석물 HLA ORF가 게놈 내에 통합되었음을 암시하였다. 개별 HLA-DR,DP,DQ 양성 염색된 세포를 분류 및 확장시켜 eAPC-p 단클론의 수집물을 나타내었다.
개별 단클론 주를 실시예 4에 기술된 바와 같이, 이의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 기초로 그리고 성분 B'를 생성시키는, 게놈 수용자 부위 내로의 분석물 ORF의 통합을 기초로 eAPC-p로서 선택하였다. 세포주 ACL-341 및 ACL-350는 HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 38).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 B' 내에, 각각 aAPX HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-341 및 ACL-350 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 II 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 6: 성분 B가 합성 작제물인 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 B는 RMCE에 대해서 설계된 합성 작제물이었고, 유전자 공여자 벡터, 성분 C'는 하나의 aAPX 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, 게놈 통합 부위, 성분 B는 선택된 유전 요소로 구성되었다. 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3가 존재하며, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화한 ORF 측면에 배치되었다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F3 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 성분 B의 유전 요소를 실시예 2에 기술된 바와 같이 동일한 플라스미드로 전기천공법에 의해서 세포주 ACL-128에 통합하였다. 개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 발현을 기초로 선택하였고, 이것은 실시예 2에 기술된 바와 같이 목적하는 AAVS1 게놈 위치 내로의 성분 B의 단일 통합을 함유하는 것으로 유전적으로 특징규명되었다(도 39a). 생성된 eAPC 세포주, ACL-385는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널이었고, RMCE에 대해서 설계된, 합성 게놈 수용자 부위, 성분 B의 단일 카피를 함유하였다.
유전자 공여자 벡터, 성분 C는 성분 B에 매칭되었는데, 그 이유는 성분 C가 동일한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3을 암호화하였기 때문이다. 관심대상 aAPX ORF는 시작 코돈 직전에 코작 서열을 추가로 암호화하고, 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위 사이에 클로닝되어, 성분 C'를 생성하였다. 본 실시예에서, 성분 C'는 하나의 aAPX인 HLA-A*02:01을 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이는 성분 C'FRT:HLA-A*02:01:F3이라고 지정되었다.
RMCE를 통해서, 성분 C'FRT:HLA-A*02:01:F3과 함께, Tyr-리콤비나제, Flp를 암호화한 플라스미드를 사용한 세포주 ACL-385의 전기천공법에 의해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 4 내지 10일 후, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 성분 B 선택 마커에 의해서 암호화된, 형광 단백질 마커, BFP에 대해서 음성/감소된 개별 세포를 분류하였다. 개별 과성장된 단클론 주를 이의 유지된 HLAI 대립유전자 발현 및 BFP 형광의 손실(예측된 RMCE가 발생하였음을 나타냄)을 기초로 선택하였다. 이러한 단클론을 식별하기 위해서, 표현형결정 시험 및 유전자 시험 둘 모두를 수행하였다. 먼저, 모든 단클론 세포주를 세포 표면 HLA-ABC 발현 및 BFP 형광의 결핍에 대해서 스크리닝하였다(도 39). 게놈 DNA를 그러한 세포주, 예를 들어, ACL-421 및 ACL-422로부터 추출하고, 성분 B'를 생성한 성분 C'의 성분 B 내로의 통합을 성분 B'에 특이적인 PCR 산물의 검출에 의해서 확인하였다(도 40).
결론적으로, 합성 게놈 수용자 부위, 성분 B' 내에, 각각 aAPX HLA-A*02:01 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-421 및 ACL-422 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 7: 2개의 통합 커플을 사용하여 2 단계로 작제된 eAPC-pa
여기서는 eAPC-pa가 2 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술한다. 단계 1, 게놈 수용자 부위, 성분 B는 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 C'는 하나의 aAPX를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다. 단계 2, 게놈 수용자 부위, 성분 D는 제2 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 E'는 하나의 분석물 항원 분자(aAM)를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, 단계 1을 수행하였는데, 여기서 eAPC는 ACL-128이었고, 게놈 수용자 부위인 성분 B는 HLA-A널이라고 지정된, 돌연변이된 HLA-A 대립유전자 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 C를, 각각 HLA-A널 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 HLA-A널 좌측 및 우측 상동 아암을 암호화하는 성분 C에 의해서, 성분 B에 매칭시켰다. HLA-A널 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAPX를 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 C'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 C'는 하나의 aAPX인 HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01을 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이들은 각각 성분 C' HLA-A*02:01 및 성분 C'HLA-B*-35:01라 지칭된다.
성분 B 내로의 성분 C'의 통합, 및 단클론 eAPC-p 세포주의 선택은, HLA-A널 게놈 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 사용하여 성분 C'의 성분 B 내로의 HDR 통합을 촉진시킨 것을 제외하고는, 실시예 4에 기술된 바와 같았다. 단클론 eAPC-p ACL-191 및 ACL-286은 각각 세포 표면 상에서 HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01을 발현하였다(도 41a).
본 실시예에서, 단계 2를 수행하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 D는 네이티브 AAVS1 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 E를, 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암을 암호화한 성분 E에 의해서, 성분 B에 매칭시켰다. AAVS1 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAM을 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 E'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 E'는 hCMV-pp65를 암호화한, aAM ORF에 연결된, 선택 마커, GFP를 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이를 성분 E'GFP:2A:pp63이라 지칭한다. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소는, 전사되는 경우 합성된 펩타이드의 자가-절단을 초래하고, 2개의 폴리펩타이드, GFP 및 세포내 hCMV-pp65 단백질을 생산하는 펩타이드 서열을 암호화하였다.
성분 E'의 성분 D 내로의 통합은 실시예 4에 기술되어 있다. 개별 단클론 주, ACL-391 및 ACL-395를 이의 유지된 선택 마커 GFP 발현을 기초로 eAPC-pa로서 선택하였다(도 41b).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 B' 내에 각각 aAPX HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01 ORF의 카피를 함유하고, 게놈 수용자 부위 성분 D' 내에 aAM ORF pp65를 함유한 유전적으로 변형된 ACL-391 및 ACL-395 세포주를 생성시켰다. 이러한 유전적 변형은 상기 aAM을 또한 발현한 세포의 세포 표면 상에 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원인 상기 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-pa 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 8: 성분 C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p
여기서 단일 통합 커플을 통해서, 1 단계로 eAPC를 eAPC-p로 전환시켜 분석물 항원-제시 복합체(aAPX)를 암호화하는 단일 HLAI ORF를 통합하는 것을 기술하며, 여기서 eAPC는 RMCE 기반 게놈 통합을 위해서 설계된 2개의 합성 게놈 수용자 부위 성분 B 및 성분 D를 함유한다. 생성된 eAPC-p는 HLAI ORF(성분 B')에 의해서 점유된 하나의 게놈 수용자 부위를 갖는 반면, 나머지 성분 D는 추가적인 통합 커플 사례를 위해서 사용 가능하다(도 6).
본 실시예는 성분 B 및 D를 함유하는 실시예 3에서 생성된 eAPC(ACL-402)를 사용하였으며, 여기서 성분 B는 선택 마커, 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화하는 ORF 측면에 배치된 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15를 포함한다. F14 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다. 성분 D는 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화하는 ORF 측면에 배치된, 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3으로 구성된다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다.
본 실시예는 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성된 성분 C 유전자 공여자 벡터를 사용하며, 따라서 성분 B에 매칭된다. 2개의 독립적인 성분 C'를 성분 C로부터 생성시켰는데, 여기서 하나의 벡터(V4.H.5)는 코작 서열, 시작 코돈 및 F14/F15 부위 사이의 HLA-A*02:01을 암호화하는 aAPX ORF로 구성되고, 여기서 제2 벡터(V4.H.6)는 코작 서열, 시작 코돈 및 F14/F15 부위 사이의 HLA-A*24:02를 암호화하는 aAPX ORF를 포함한다.
eAPC(ACL-402)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V4.H.5 또는 V4.H.6의 각각의 성분 C'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 배양하였고, 그 때 세포를 세포의 표면 상에서의 통합의 선택 마커, RFP의 손실, 및 HLAI의 이득을 기초로 선택 및 분류하였다. 그 다음, 개별 과성장된 단클론 주를 HLAI 표면 발현의 이득 및 RFP 형광의 손실(이것은 성분 B에서 B'로의 예측된 전환이 발생하였음을 나타냄)을 기초로 특징규명, 확인 및 선택하였다. 선택된 eAPC-p 단클론 ACL-900(V4.H.5, HLA-A*02:01) 및 ACL-963(V4.H.6, HLA-A*24:02)은 모체 ACL-402 세포주에 비해서 RFP에 대해서 음성이며, HLAI 표면 발현을 유지한다(도 43a). 추가로, 단클론은 BFP 통합의 선택 마커의 발현을 유지하는데, 이는 성분 D가 비커플링되어 성분 B 통합 커플 사례로부터 분리되어 유지됨을 나타낸다. eAPC-p 단클론을 추가로 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 세포로부터 추출하고, 성분 B'를 생성시키는, 성분 B'에 대해서 특이적인 PCR 산물의 검출에 의해서 성분 C'와 성분 B 간의 통합 커플의 확인을 수행하였다(도 43b, 표 5는 유전형결정에 사용된 프라이머를 열거함). 게놈 수용자 부위에 인접한 영역(프라이머 ID 8.B.3), 통합 커플 사례 내의 영역(프라이머 ID 15.H.2)을 표적으로하도록 프라이머를 설계하였다. 특이적 통합의 경우에서만 증폭을 수행하였지만, 어떠한 산물도 대조군(ACL-3) 또는 오프-타깃 재조합으로부터 생성되지 않았다.
요약하면, 본 실시예는 다성분 시스템을 사용한, eAPC에서 eAPC-p로의 전환의 구체적인 두 실시예를 설명하는데, 여기서 2종의 상이한 aAPX가 개별적으로 전달되고(성분 C'), RMCE 게놈 통합 방법에 의해서 단일 게놈 수용자 부위 내에 통합되며(성분 B), 그 다음 2개의 개별 eAPC-p를 포함하는 제한된 라이브러리를 생성시킨다. 추가로, 제2 게놈 수용자 부위(성분 D)는 격리되고, 성분 B/성분 C' 통합 커플에 의해서 영향을 받지 않았음을 입증하였다.
실시예 9: 성분 D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
본 실시예는 다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(실시예 8에 기술됨)로부터 어떻게 작제하는지를 설명하는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다.
본 실시예에서, 사용된 모체 eAPC-p 주는 ACL-900이었는데, 이것은 성분 B' (실시예 8에 기술됨)에서 통합된 단일 aAPX(HLA-A*02:01)를 발현한다. eAPC-p 성분 D는 개방되어 유지되고, 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3으로 구성되는데, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화하는 ORF 측면에 배치된다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다. 유전자 공여자 벡터, 성분 E를 본 실시예에서 사용하였는데, 이것은 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성되고, 따라서 성분 D에 매칭된다. 본 실시예에서, 성분 E를 또한 각각 C-말단 c-myc 태그를 암호화하는, HCMVpp28(V9.E.6), HCMVpp52(V9.E.7), 또는 HCMVpp65(V9.E.8)로부터 선택된 관심대상의 하나의 aAM ORF로 추가로 프라이밍하였다. 추가로, 각각의 성분 E'는 aAM ORF의 5'에 바로 옆의 시작 코돈 및 코작 서열로 구성된다. 따라서, 3개의 벡터로 구성된, 성분 E'의 작은 개별 라이브러리를 생성하였다.
eAPC-p(ACL-900, 실시예 8)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 인큐베이션시켜 통합 커플이 발생하는 것을 허용하였고, 그 때 개별 eAPC-pa를 성분 D에 의해 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 선택 및 단일 세포 분류(단클론)하였다(도 44a). 그 다음, 개별 과성장된 단클론 eAPC-pa, ACL-1219(pp28), ACL-1227(pp52) 및 ACL-1233(pp65)을, BFP 발현의 손실 및 HLAI(성분 B'에서의 aAPX)의 유지된 표면 발현(이것은 D에서 D'로의 예측된 전환이 발생하였음을 나타냄)을 기초로 특징규명, 확인 및 선택하였다(도 44b). 추가로, aAPX의 유지된 표면 발현은, 성분 B'가 성분 D와 성분 E' 간의 통합 커플 사례로부터 영향을 받지 않고 격리되어 있음을 나타내었다. 선택된 eAPC-pa 단클론을 추가로 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 D'에 대해 특이적인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 앰플리콘 산물의 검출에 의해서 성분 D'를 생성시키는, 성분 E'와 성분 D 간의 통합 커플의 확인을 수행하였다. 도 44c에서, 각각 3개의 eAPC-pa를 나타내는 2개의 단클론을 나타내는데, 여기서 aAM ORF pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)에 대해서 예측된 크기의 앰플리콘 산물이 관찰되며, 이는 예측된 통합 사례가 발생하였음을 추가로 보여준다.
요약하면, 본 실시예는 다성분 시스템을 사용한 eAPC-p에서 eAPC-pa로의 전환의 구체적인 3개의 실시예를 설명하는데, 여기서 3종의 상이한 aAM이 개별적으로 전달되고(성분 E'), RMCE 게놈 통합 방법에 의해서 단일 게놈 수용자 부위(성분 D) 내에 통합되며, 그 다음 3종의 상이한 aAM ORF를 보유한 3개의 개별 eAPC-pa의 작은 라이브러리를 생성시킨다. 추가로, 이는, 적재된 제2 게놈 수용자 부위(성분 B')가 격리되어 있고, 성분 D/성분 E' 통합 커플에 의해서 영향을 받지 않았음을 입증하였다.
실시예 10: 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 분석물 항원 분자 ORF의 샷건 통합
여기서는 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 총괄적으로 암호화하는 프라이밍된 성분 E 벡터(성분 E')의 풀이 어떻게 단일 단계로 모체 eAPC-p(실시예 8에 기술됨) 내에 통합되어 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키는지를 설명하는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 발현한다. 벡터의 풀로부터 단일 무작위 ORF를 각각 발현하는 eAPC-pa의 풀을 생성시키는 이러한 방법을 샷건 통합이라 지칭한다.
본 실시예에서, 사용된 모체 eAPC-p 주는 세포 표면 상에서 aAPX(HLA-A*02:01)를 발현하는 ACL-905였고(세포주의 작제는 실시예 8에 기술됨), 성분 D 및 성분 E'는 실시예 9에 기술된 바와 같았다. 본 실시예에서, 각각 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65를 암호화하는 aAM ORF로 구성된, 실시예 9의 개별 성분 E' 벡터, V9.E.6, V9.E.7, 및 V9.E.8을 함께 1:1:1 몰비로 혼합하여 벡터 풀을 생성시켰다. eAPC-p(ACL-905)를 벡터 풀 및 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8)와 전기천공법에 의해서 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 인큐베이션시키고, 그 때 세포를 풀링된 세포 집단 ACL-1050(도 45b)을 생성시키는 성분 D(도 45a)에 의해서 암호화된 통합의 선택 마커, BFP에 대한 감소된 신호를 갖는 것을 기초로 벌크 분류하였다.
eAPC-pa 풀 ACL-1050이 성분 D'에서, 각각 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나를 암호화하는 eAPC-pa의 혼합물로 구성되었는지를 확인하기 위해서, 개별 세포를 다클론성 집단으로부터 단일 세포 분류하였고, 12개를 유전 특징규명을 위해서 무작위로 선택하였다. 각각의 aAM을 연장시키는 프라이머를 사용하여 성분 D'의 증폭을 수행하였다(표 5, 도 45c). 도 45c에서, 12개의 세포에 대해서 생성된 앰플리콘을 대조군과 함께 나타내고, 여기서 모든 12개의 세포에 대해서, aAM ORF, pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb) 중 하나에 대한 예측된 크기와 일관된 단일 앰플리콘 산물이 관찰된다. 추가로, 각각의 aAM ORF는 적어도 1회 식별되는데, 이는 eAPC-pa 풀이 eAPC-pa의 혼합물로 구성됨을 나타내고, 여기서 풀 내의 각각의 eAPC-pa는 3개의 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였다.
결론적으로, 본 실시예는 eAPC-p를 3종의 상이한 분석물 항원 분자(성분 E')를 암호화하는 3종의 벡터의 풀링된 라이브러리와 조합하고, RMCE 기반 샷건 통합 접근법을 사용함으로써, 단일 단계로 eAPC-p를 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리로 전환시키기 위한 다성분 시스템의 용도를 입증한다. 추가로, 본 실시예는, eAPC-pa의 생성된 풀 내의 각각의 eAPC-pa가, 성분 D와 성분 E' 간의 통합 커플 사례에 의해서 본래 벡터 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였고, 모든 3종의 aAM ORF는 생성된 풀링된 eAPC-pa 라이브러리 내에서 나타남을 입증한다.
실시예 11: 일차 CD8 세포의 eAPC-pa 유도된 항원-특이적 과성장에 대한 2종의 eAPC:T 시스템의 입증
본 실시예는 2종의 상이한 eAPC:T 시스템의 컴파일 및 사용을 기술하는데, 여기서 제1 시스템은 eAPC-p, 외인성으로 제공된 aAM(eAPC-p에 의해서 제시된 aAPX: aAM을 생성하기 위함), 및 분석물 일차 T-세포(분석물 TC)로 구성된다. 제2 시스템은 APX: aAM을 제시하는 eAPC-pa, 및 분석물 일차 T-세포(분석물 TC)로 구성된다. eAPC:T 시스템을 사용하여, 특이적 분석물 TC의 증식 및 과성장의 검출을 통해서, 분석물 항원(aAPX:aAM)에 대한 반응이 가능한 TCR을 보유하는 분석물 TC를 식별 및 선택하였다.
본 실시예에서, CD8+ T 세포 집단으로부터의 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유도된 과성장을 모니터링하였고, 여기서 aAPX는 HLA-A*02:01(HLA 클래스 I)이고, aAM은 펩타이드 NLVPMVATV이다. eAPC-p로 구성된 시스템에서 aAM은 외인성으로 제공되며, eAPC-pa로 구성된 시스템에서 aAM은 통합된 분석물 항원 ORF(HCMVpp65)로부터 네이티브로 가공된다. 사용된 세포주는 eAPC-p(ACL-191) 및 eAPC-pa(ACL- 390)이고, 이것은 각각 실시예 8 및 9에 기술되어 있다. 분석물 TC, CD8+ T 세포를 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 NLVPMVATV 펩타이드에 대해서 특이적인 CD8+ T 세포를 갖는 것으로 공지된 건강한 혈액 공여자로부터 단리하였다.
제1 eAPC:T 시스템에서, eAPC-p(ACL-191)를 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 외인성 NLVPMVATV(서열번호 3) 펩타이드로 1μM의 펩타이드 농도에서 4시간 동안 펄싱하였다. 이어서, 펄싱된 eAPC-p 세포를 분석물 TC(벌크 분류된 CD8+ T 세포)와 조합하고, 표준 조건 하에서 공배양함으로써 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 공배양 9일 후, 세포를 CMV-A.0201-NLVP 사량체(가용성 시약으로서의 aAPX:aAM)로 특이적 염색하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출함으로써 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 협동 복합체를 형성한 세포에 대해서 분석하였다. 펄싱되지 않은 ACL-191 세포(aAM 없음), 또는 펄싱된 HLA 널 ACL-128(aAPX 없음) 세포 또는 펄싱되지 않은 HLA 널 ACL-128 세포(aAPX:aAM 없음)를 포함하는 eAPC:T 시스템에 대해서 비교를 수행하였다. HLA-A*02:01-NLVP 사량체 염색에 의해서 NLVPMVATV(서열번호 3) 펩타이드에 대해서 특이적임이 확인된 분석물 TC(CD8+ T 세포)의 상당한 성장은 NLVPMVATV로 펄싱된 eAPC-p 세포를 포함하는 eAPC:T 시스템에서만 관찰된다(도 46a).
eAPC-pa(ACL-390) 세포를 분석물 TC(벌크 분류된 CD8+ T 세포)와 조합하고, 표준 조건(물질 및 방법 참고) 하에서 공배양함으로써 제2 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 제1 시스템에서와 같이, 공배양된 세포를 수거하고, CMV-A.0201-NLVP 사량체(가용성 시약으로서 aAPX:aAM)로의 특이적 염색에 의해서, 분석물 항원 및 분석물 TCR에 의해서 유도된 세포에 대해서 분석하였다. 도 46b는, pp65 ORF(aAM) 및 aAPX(HLA-A*02:01)의 안정적인 발현을 갖고, 따라서 aAPX:aAM을 제시하는 eAPC-pa(ACL-390) 세포와 공배양된 일차 CD8+ T 세포의 항원-특이적 과성장을 입증한다. pp65 ORF의 안정적인 발현이 없는 eAPC-p(ACL-191) 세포를 갖는 2종의 다른 eAPC:T 시스템 및 HLA 널 ACL-128 세포에 대해서 비교를 수행하였다. eAPC-pa에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적인 CD8+ T 세포의 과성장은 eAPC-pa(ACL-390)를 갖는 eAPC:T 시스템에서만 CMV-A.0201-NLVP 사량체 염색에 의해서 식별되었다.
요약하면, 본 실시예는, 제시된 분석물 항원(aAPX:aAM)에 의한 T-세포 자극을 가능하게 하는 분석물 TCR을 보유하는 분석물 TC의 식별 및 선택을 위해서 분석물 TC(CD8+ T-세포)를 선택적으로 과성장시킬 수 있는 컴파일된 eAPC-T 시스템에서의 eAPC-p 및 eAPC-pa 세포의 용도를 입증하였다. 추가로, 2종의 eAPC:T 시스템은 aAPX:aAM의 상이한 형태의 용도를 입증하였고, 여기서 하나의 시스템에서 aAM은 외인성으로 제공되며, 제2 시스템에서 aAM은 네이티브 세포 머시너리에 의한 가공을 통해서 eAPC-pa의 발현된 통합된 분석물 항원 ORF로부터 제공된다.
실시예 12: 일차 CD4 세포의 eAPC-pa 유도된 항원-특이적 과성장에 대한 eAPC:T 시스템의 입증
본 실시예는 eAPC:T 시스템의 컴파일 및 사용을 기술하는데, 여기서 시스템은 eAPC-p, 외인성으로 제공된 aAM(eAPC-p에 의해서 제시된 aAPX: aAM을 생성하기 위함), 및 분석물 일차 T-세포(분석물 TC)로 구성된다. eAPC:T 시스템을 사용하여, 특이적 분석물 TC의 증식 및 과성장의 검출에 의해서 분석물 항원(aAPX:aAM)에 대한 반응이 가능한 TCR을 보유하는 분석물 TC 및 분석물 TCR을 식별 및 선택하였다.
본 실시예에서, 특이적 aAPX:AM에 의해서 CD4+ T 세포 집단으로부터의 항원-특이적 CD4+ T 세포의 유도된 과성장을 모니터링하였고, 여기서 aAPX는 HLA-DRB1*01:01(HLA 클래스 II)이고, aAM은 외인성으로 제공된 펩타이드 PKYVKQNTLKLAT(서열번호 1)이다. 사용된 세포주는 실시예 8 및 9에 기술된 것과 동일한 방식으로 수행된 eAPC-p(ACL-341)였다. 분석물 TC, CD4+ T 세포를 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 PKYVKQNTLKLAT 펩타이드에 대해서 특이적인 CD4+ T 세포를 갖는 것으로 공지된 건강한 혈액 공여자로부터 단리하였다.
본 실시예에서, eAPC-p(ACL-341)를 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 외인성 PKYVKQNTLKLAT(서열번호 1) 펩타이드로 1μM의 펩타이드 농도에서 2시간 동안 펄싱하였다. 펄싱된 eAPC-p 세포를 분석물 TC(벌크 분류된 CD4+ T 세포)와 조합하고, 표준 조건 하에서 공배양함으로써 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 공배양 7일 후, 세포를 INFL-DRB1*01:01-PKYV 사량체(가용성 시약으로서의 aAPX:aAM)로 특이적 염색하여 유세포 분석법에 의해서 항원-특이적 T-세포의 과성장을 검출함으로써 제시된 aAPX:aAM에 의해서 유도된 세포에 대해서 분석하였다. 펄싱되지 않은 ACL-341 세포를 포함하는 eAPC:T 시스템(aAPX:CM)에 대해서 비교하였다. CMV-A.0201-NLVP 사량체 염색에 의해서 PKYVKQNTLKLAT(서열번호 1) 펩타이드에 대해서 특이적임이 확인된 분석물 TC(CD4+ T 세포)의 상당한 성장은 PKYVKQNTLKLAT로 펄싱된 eAPC-p 세포를 포함하는 eAPC:T 시스템에서만 관찰된다(도 47).
결론적으로, 본 실시예는, 제시된 분석물 항원과 협동 복합체(aAPX:aAM)를 형성하는 분석물 TCR을 보유하는 분석물 TC의 식별 및 선택을 위해서 분석물 TC(CD4+ T-세포)를 선택적으로 과성장시킬 수 있는 eAPC-T 시스템으로 컴파일된 HLA 클래스 II 기반의 eAPC-p의 용도를 입증하였다.
실시예 13: 공배양된 일차 CD8 세포에 의한 eAPC-pa 유도된 항원-특이적 세포독성 작용에 대한 eAPC:T의 입증
본 실시예는 2종의 상이한 eAPC:T 시스템의 컴파일 및 사용을 기술하는데, 여기서 제1 시스템은 eAPC-p, 외인성으로 제공된 aAM(eAPC-p에 의해서 제시된 aAPX: aAM을 생성하기 위함), 및 분석물 일차 T-세포(분석물 TC)로 구성된다. 제2 시스템은 APX: aAM을 제시하는 eAPC-pa, 및 분석물 일차 T-세포(분석물 TC)로 구성된다. eAPC:T 시스템을 사용하여, 분석물 TC에 의해서 eAPC-p 또는 -pa에 대한 세포독성 작용의 검출에 의한 제시된 분석물 항원(aAPX:aAM)에 대한 분석물 TC의 특이성을 확인하였다.
본 실시예에서, 분석물 TCR와 aAPX:AM 간의 협동 복합체를 형성하는 CD8+ T 세포 집단으로부터의 항원-특이적 CD8+ T 세포의 세포독성 작용이 입증되는데, 여기서 aAPX는 HLA-A*02:01(HLA 클래스 I)이고, aAM은 펩타이드 NLVPMVATV(서열번호 3)이다. eAPC-p로 구성된 시스템에서 aAM은 외인성으로 제공되며, eAPC-pa로 구성된 시스템에서 aAM은 통합된 분석물 항원 ORF(HCMVpp65)로부터 네이티브로 가공된다. 사용된 세포주는 실시예 8 및 9에 기술된 eAPC-p(ACL-191) 및 eAPC-pa(ACL- 390)이다. 분석물 TC, CD8+ T 세포를 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 NLVPMVATV 펩타이드에 대해서 특이적인 CD8+ T 세포를 갖는 것으로 공지된 건강한 혈액 공여자로부터 단리하였다.
제1 eAPC:T 시스템에서, eAPC-p(ACL-191)를 물질 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 외인성 NLVPMVATV 펩타이드로 1μM의 펩타이드 농도에서 2시간 동안 펄싱하였다 이어서, 펄싱된 eAPC-p 세포를 분석물 TC(벌크 분류된 CD8+ T 세포)와 조합하고, 표준 조건 하에서 공배양함으로써 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 공배양 후, 아넥신V 및 PI 염색 및 유세포 분석법에 의해서 eAPC-p 세포의 사멸을 평가함으로써, 세포를 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 협동 복합체에 대해서 분석하였다. 펄싱된 HLA 널 ACL-128 세포(aAPX 없음) 또는 펄싱되지 않은 HLA 널 ACL-128 세포(aAPX:aAM 없음)를 포함하는 eAPC:T 시스템에 대해서 비교를 수행하였다. NLVPMVATV로 펄싱된 eAPC-p 세포를 포함하는 eAPC:T 시스템에서만 분석물 TC(CD8+ T 세포)에 의한 상당한 세포독성 작용이 확인된다(도 48a).
eAPC-pa(ACL-390) 세포를 분석물 TC(벌크 분류된 CD8+ T 세포)와 조합하고, 표준 조건 하에서 공배양함으로써 제2 eAPC:T 시스템을 컴파일하였다. 제1 시스템에서와 같이, 공배양된 세포를 수거하고, 아넥신V 및 PI 염색 및 유세포 분석법에 의해서 eAPC-pa 세포의 사멸을 평가함으로써, 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 협동 복합체에 대해서 분석하였다. 도 48b는, pp65 ORF(aAM, 성분 D') 및 aAPX(HLA-A*02:01, 성분 B')의 안정적인 발현을 갖고, 따라서 aAPX:aAM을 제시하는 eAPC-pa(ACL-390) 세포와 공배양된 일차 CD8+ T 세포의 항원-특이적 세포독성 작용을 입증한다. pp65 ORF의 안정적인 발현이 없는 eAPC-p(ACL-191) 세포(aAM 없음)를 갖는 2종의 다른 eAPC:T 시스템 및 HLA 널 ACL-128 세포(aAPX:aAM 없음)에 대해서 비교를 수행하였다. eAPC-pa(ACL-390)를 갖는 eAPC:T 시스템에서만 eAPC-pa에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적인 CD8+ T 세포의 항원-특이적 세포독성 작용이 관찰되었다.
결론적으로, 본 실시예는 제시된 분석물 항원(aAPX:aAM)과 협동 복합체를 형성하는 분석물 TCR을 보유하는 분석물 TC의 식별 및 선택을 위해서 분석물 TC(CD8+ T-세포)에 의해서 세포독성 작용을 선택적으로 유도할 수 있는 컴파일된 eAPC-T 시스템에서의 eAPC-p 및 eAPC-pa 세포의 용도를 입증하였다. 추가로, 2종의 eAPC:T 시스템은 aAPX:aAM의 상이한 형태의 사용을 입증하였고, 여기서 하나의 시스템에서 aAM은 외인성으로 제공되며, 제2 시스템에서 aAM은 네이티브 세포 머시너리에 의한 가공을 통해서 eAPC-pa의 발현된 통합된 분석물 항원 ORF로부터 제공된다.
실시예 14: 질량 분석법을 통한 eAPC-p 내에 적재된 aAM의 식별
본 실시예는 외인성 분석물 항원 분자(aAM)와 함께 투여된 eAPC-p의 사용을 기술하며, 여기서 aAPX:aAM 복합체는 그 다음 금속 친화성 크로마토그래피에 의해서 포획되고, aAM 카고는 질량-분석법에 의해서 식별된다. 이에 의해서 aAM의 aAPX:aAM 컨택스트, 즉, 항원성 펩타이드의 HLA-제한된 제시를 식별한다.
본 실시예는 실시예 8로부터의 eAPC-p 세포주를 사용하는데, 여기서 eAPC-p는 성분 B', ACL-900(HLA-A*02:01) 및 ACL-963(HLA-A*24:02)에서 통합된 aAPX를 갖는다. aAPX ORF는 또한 금속 친화성 크로마토그래피에 의해서 포획을 위한 C-말단 6x히스티딘 태그를 암호화하였다. eAPC-p를 2시간 동안 1μM의 농도에서 펄싱된, 외인성 aAM과 조합하였는데, 여기서 펩타이드로서 하기 aAM 중 하나로 이루어진 4종의 개별 펄스를 수행하였다; NLVPMVATV(APD-2, 서열번호 3), NLGPMAAGV(APD-21, 서열번호 4), 또는 VYALPLKML(APD-11, 서열번호 5), 또는 펩타이드 없음.
펄싱 후 eAPC-p를 수거하고, 용리시키고, aAPX:aAM을 그 다음 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 금속 친화성 크로마토그래피에 의해서 포획하였다. 포획 후 펩타이드(aAM 및 CM)를 aAPX로부터 단리하고, 산 세척 및 여과하였다. 그 다음, 펩타이드 분획을 액체 추출에 적용하고, 유기상을 제거하고, 그 다음 고체상 추출하고, 펩타이드 분획의 식별을 위해서 질량 분석법에 적용하였다.
도 49는 상이한 eAPC-p / aAM 펄싱 조합물의 질량 분석법 결과를 요약한 표를 나타낸다. 결과는, 펩타이드 NLVPMVATV는 결합하여, aAPX HLA-A*02:01와 복합체를 형성하고, aAPX HLA-A*24:01과 VYALPLKML 복합체를 형성하는 반면, aAPX:aAM의 모든 다른 조합물은 어떠한 검출 가능한 aAPX:aM 복합체도 형성하지 않았음을 나타내었다는 것을 확인한다. 이러한 결과는 3종의 펩타이드의 공지된 펩타이드-HLA 결합 친화성에 따른다.
결론적으로, 본 실시예는 eAPC-p를 사용하여, aAPX:aAM의 포획 및 질량 분석법에 의한 식별을 위한 aAM의 후속 방출 및 농축에 의해서 aAPX에 대한 aAM의 선택적인 결합을 식별할 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서 이것은, eAPC-p를 사용하여 분석물 항원성 분자의 HLA-제한된 제시를 결정할 수 있음을 입증한다.
정의
한 쌍의 상보성 TCR 쇄: 번역된 단백질이 TCR 제시 세포의 표면 상에서 TCRsp를 형성할 수 있는 2개의 TCR 쇄.
친화성: 2종 이상의 분자 또는 단백질 간의 상호작용의 동적 또는 평형 파라미터.
친화성 시약: 분석물에 대해서 특이적 친화성을 갖도록 설계된 임의의 시약. HLA-항원 복합체에 대한 친화성과 관련하여 종종 사용됨.
대립유전자: 주어진 유전자의 변이체 형태.
AM: 분석물 항원성 분자. 일반적으로, 그러나 단백질은 또한 게놈 DNA 및/또는 특이적인 도입된 유전자 서열로부터 세포에 의해서 발현된 대사산물일 수 있다. AM은 세포에서 발현되고, 이어서 단편은 APX에 의해서 카고로서 세포 표면 상에 또는 그 자신 상에 제시될 수 있다. 카고로서 또는 그렇지 않든, 이어서 AM은 T-세포 수용체 보유 세포 또는 관련된 친화성 시약의 표적일 수 있다.
앰플리콘: PCR을 비롯한 다양한 방법을 사용한 인공 증폭의 공급원 및/또는 산물인 DNA 또는 RNA의 조각.
분석물: 조합된 시스템에서 식별 및/또는 측정 및/또는 문의될 관심대상 엔티티.
분석물 TC: 분석물 TCR을 표면 상에 제시하는 분석물 세포, 여기서 세포는 일차 T-세포, 재조합 T-세포 또는 조작된 TCR 제시 세포일 수 있음.
분석물 TCR: 가용성 시약, 고정된 시약의 형태로 제공되거나, NCBP에 의해서 제시되거나 또는 세포의 표면 상에 제시된 TCRsp 또는 TCR-모방 친화성 시약.
항원: 항원-제시 복합체에 의해서 종종 제시되는, T-세포 내에 형질도입될 신호를 유발하고, TCR에 의해서 결속될 수 있는 임의의 분자.
분석물 항원: 총괄적으로 분석 결정을 위한 항원을 제시하는 임의의 엔티티를 나타내는 eAPC:T 시스템.
항체: 면역계 호출된 B-세포의 전문화된 세포에 의해서 발현되고, 2개의 쇄를 함유하는 친화성 분자. B-세포는 자가 단백질에 일반적으로 결합하지 않지만 숙주를 위협할 병원체 또는 독소에 결합하여, 이를 중화시킬 수 있는 항체의 매우 크고 매우 다양한 레퍼토리를 발현한다. 자연 또는 인공 조작된 항체가 종종 친화성 시약으로서 사용된다.
APC: 항원-제시 세포. 세포의 표면 상에 AM, APX, APX를 보유하는 세포.
APX: 항원-제시 복합체. 게놈 DNA 및/또는 특이적으로 도입된 유전자 서열을 암호화하는 유전자/ORF로부터 유핵 세포에 의해서 세포 표면 상에 발현 및 제시되는 단백질. APX는 펩타이드 또는 다른 대사산물 분자인 카고를 제시한다.
C-영역: 불변 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. c-영역은, TCR의 다양성을 유도한다기 보다는, 면역계에서 그의 일반적인 기능을 정의하는 별개의 분절이다.
카고-적재 머시너리: 단백질 또는 세포에서 발견되는 다른 제시된 분자로부터 APX 상에 카고 분자를 생성시키고, 적재하는 단백질의 세포 세트.
CDR: 상보성-결정 영역. 표적 결합 기능의 대부분을 수행하는 TCR 및 항체의 항원-대면 단부 상의 짧은 서열. 각각의 항체 및 TCR은 6개의 CDR을 함유하고, 이것은 일반적으로 분자의 가장 가변적인 부분이어서, 상당한 수의 다양한 표적 분자의 검출을 가능하게 한다.
CM: 카고 분자. 항원-제시 복합체, 예를 들어, HLA I 또는 HLA II에 의해서 제시되는 펩타이드 또는 대사산물. CM은 게놈 DNA로부터 본질적으로 세포에 의해서 발현되거나, 배양 배지 내로 도입되거나, 특이적으로 도입된 유전자 서열로부터 발현될 수 있다.
카피-수: 세포의 게놈 내에 암호화된 정의된 서열의 전체 수 발생.
세포유전학: 염색체의 구조 및 기능과 관련된 유전의 연구, 즉, 세포의 핵형을 결정함.
세포독성의/세포독성: T-세포가 표적 세포를 직접 및 특이적으로 손상시키는 인자를 방출하는 경로.
D-영역: 다양성 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
DNA: 데옥시리보핵산. 유전자 및 단백질을 암호화하는 유전 물질을 형성하는 분자의 화학 명칭.
eAPC:TCR 시스템: eTPC:T, 분석물 eAPC가 분석물 TCR와 조합되어 일차 및 최종 산출물을 수득하는 시스템.
내인성: 세포 내로부터 유래된 물질.
조작된 세포: 게놈이 유전자 변형을 통해서 조작된 변형된 세포.
진핵생물 조건 조절 요소: 정의된 조건 하에서 유도 또는 억제될 수 있는, 프로모터의 활성도에 영향을 줄 수 있는 DNA 서열
진핵생물 프로모터: RNA 중합효소 결합 부위 및 반응 요소를 암호화하는 DNA 서열. 프로모터 영역의 서열은 RNA 중합효소 및 전사 인자의 결합을 제어하고, 따라서 프로모터는 관심대상 유전자가 발현될 장소 및 시기의 결정에 중요한 역할을 한다.
진핵생물 종결인자/신호 종결인자: RNA 중합효소 II와 회합되어 전사의 종결 과정을 촉발하는 단백질 인자에 의해서 인식되는 DNA 서열. 그것은 또한 폴리-A 신호를 암호화한다.
FACS/유세포 분석법: 형광-활성화 세포 분류. 개별 세포가 특이적 세포 표면 및 세포내 마커의 발현에 대해서 분석될 수 있는 분석 기술. 이 기술의 변형인 세포 분류는 마커의 정의된 세트를 보유한 세포가 추가 분석을 위해서 검색되는 것을 가능하게 한다.
APX의 패밀리: 항원 제시 복합체를 구성하는 기능적으로 관련된 단백질을 암호화하는 몇몇 유사한 유전자의 세트
형광 (단백질) 마커: 특이적 소멸 및 방출 특징을 갖고, 현미경관찰법, FACS 및 관련 기술에 의해서 검출될 수 있는 분자.
유전자 공여자 벡터: 게놈 수용자 부위로의 유전 물질의 전달을 위한 유전자 기반 벡터.
게놈 수용자 부위: 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 공여자 유전 물질의 표적화된 통합을 위한 게놈 내의 부위.
이종특이적 리콤비나제 부위: 2개의 DNA 분자의 크로스오버를 촉진시키기 위해서 리콤비나제 효소에 의해서 인식되는 DNA 서열.
HLA I: 인간 백혈구 항원 클래스 I. 모든 유핵세포에서 인간에서 발현되고, 세포 표면(여기서 그것은 T-세포 수용체에 대한 내부 단백질의, 카고 짧은 단편, 펩타이드로서 존재함)으로 외수송되는 유전자. 따라서 그것은 내재하는 단백질과 함께 잠재하는 진행 중인 감염의 단편을 제시한다. HLA I은 배양 배지에 첨가되거나, 도입된 유전 요소로부터 발현된 단백질로부터 생성되거나, 세포에 의해서 취해진 단백질로부터 생성된 카고 펩타이드로서 추가로 존재할 수 있다. HLA 클래스 I 유전자는, 상이한 개체가 제시 시에 변이로 이어지는 동일한 유전자에서의 변이를 가질 가능성이 있다는 것을 의미하는 다형성이다. HLA 클래스 II에 관련됨.
HLA II: 인간 백혈구 항원 클래스 II. 인간에서 획득 면역 반응을 조직화하고, 돕는 특이적 세포, 예를 들어 수지상 세포에서 발현되는 유전자. HLA 클래스 I에 관련됨. HLA 클래스 II 단백질은 세포 표면(여기서 이것은 T-세포 수용체에 대한 외부 단백질의, 카고 짧은 단편, 펩타이드로서 존재함)으로 외수송된다. 따라서 그것은 내재하는 단백질과 함께 잠재하는 진행 중인 감염의 단편을 제시한다. HLA II는 배양 배지에 첨가되거나, 도입된 유전 요소로부터 발현된 단백질로부터 생성되거나, 세포에 의해서 취해진 단백질로부터 생성된 카고 펩타이드로서 추가로 존재할 수 있다. HLA 클래스 II 유전자는, 상이한 개체가 제시 시에 변이로 이어지는 동일한 유전자에서의 변이를 가질 가능성이 있다는 것을 의미하는 다형성이다.
상동 아암: 보체 상동 아암에 대해서 유사한 동일한 서열을 가져서, 세포 과정, 상동 직접 수선에 의해서 2개의 DNA 분자의 교환을 촉진시키는 DNA의 스트레치.
면역 감시: 면역계가 감염, 악성종양 또는 잠재적으로 병원성인 변경을 검출하고, 이에 의해서 활성화되는 과정.
인설레이터: 유전자가 근처 유전자의 활성화 또는 억압에 의해서 영향을 받는 것을 예방하는 DNA 서열. 인설레이터는 또한 침묵화된 유전자로부터 능동적으로 전사된 유전자로의 이질염색질의 확산을 예방한다.
통합: 세포의 염색체 내에서의 DNA 서열의 물리적 결찰.
통합 커플: 짝지워진 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위.
내부 리보솜 유입 부위(IRES): 전사 시에, 캡-의존적 방식으로 번역의 개시를 허용하는 RAN 요소를 암호화하는 DNA 서열.
J-영역: 결합 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
핵형: 세포의 염색체 조성.
코작 서열: 번역의 효율적인 개시를 위해서 요구되는 짧은 서열.
주요 HLA 클래스 I: 유전자 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하는 APX의 패밀리.
매칭된: 두 성분이 상보성 성분 사이의 상호작용을 유도 및 제한하는 유전 요소를 암호화하는 경우.
메가뉴클레아제 인식 부위: 일반적으로 메가뉴클레아제라고 지칭되는, 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해서 인식되는 DNA 서열.
대사산물: 세포의 대사 경로를 통해서 생성 또는 변경되는 분자.
이동성 유전 요소: DNA와 트랜스포사제 효소의 활성도의 통합을 허용할 수 있는 DNA 서열.
단클론 세포주: 반복된 세포 복제에 의해서 단일 조상 세포로부터 생산된 세포의 정의된 군.
네이티브: 세포에 자연 발생하는 엔티티.
비-암호 유전자: 기능성 비-암호 RNA 분자로 전사되는 비 단백질 암호 DNA 서열.
ORF: 오픈 리딩 프레임. 리보솜에 의해서 단백질(폴리펩타이드)의 합성을 위해서 번역 프레임을 암호화하는 유전 물질의 스트레치.
파라크린: 이웃하는 세포에 직접 작용하는 가용성 인자를 통한 신호전달.
PCR: 특이적 표적 DNA 분자가 기하급수적으로 증폭되는 중합효소 연쇄 반응.
펩타이드: 6 내지 30개 아미노산 길이의 아미노산의 짧은 스트링.
표현형 분석: 세포의 관찰 가능한 특징의 분석.
다형성: 동일한 유전자의 상이한 대립유전자의 존재를 통해서 동일한 종의 개체에서 상이한 형태로 존재함.
폴리펩타이드: 3-차원 구조를 형성하는, 펩타이드의 스트레치로 이루어진 단백질.
일차 산출물: 최종 산출물이 유래 및/또는 결정될 수 있는 eAPC 세포, 분석물 TC 세포, NCBP 또는 다른 분석물 TCR 형태.
프라이머: 예를 들어, PCR 동안 표적 DNA 서열의 특이적 인식을 허용하는 짧은 DNA 서열.
프로모터: 유전자 발현의 제어된 개시를 위한 조절 DNA 요소.
선택 가능한 마커: 인공적인 선택 방법에 적합한 특질을 부여하는 DNA 서열
샷건 통합: 벡터의 라이브러리가 세포의 집단 내에 도입되어, 임의의 주어진 벡터 삽입부의 단지 단일 카피가 각각의 단일 세포의 게놈에 통합될 수 있는 방법. 통합 커플을 통한 주어진 세포 집단에 대한 풀링된 벡터 통합을 지칭하는 데 사용됨.
슬라이스 수용자 부위: 인트론 AM, APX CM 또는 표면 상에 TCRsp를 갖는 세포와의 상호작용을 위한 친화성 시약, 또는 TCRsp 기반 시약의 3' 단부의 DNA 서열
슬라이스 공여자 부위: 인트론의 5' 단부에서의 DNA 서열.
합성적: 인공적으로 생성되어, 세포에 도입된 엔티티.
T-세포: T 림프구. 표면 상에서 T-세포 수용체를 발현하는 백혈구. 자신의 신체와 반응하지 않지만 감염 및 악성종양을 인식하고, 동일한 종의 대부분의 구성원으로부터의 이식편을 거부하도록 면역계에 의해서 선택됨.
TCR: T-세포 수용체. 림프구 호출된 T-림프구의 하위군에 의해서 발현된 친화성 분자.
TCR-모방 친화성 시약: 자연 TCRsp의 것에 대한 의태로 분석물 항원과 상호작용 및 결합할 수 있는 단백질 또는 분자.
TCRsp: CD3과 복합체를 이룬 표면 단백질로서 발현하는 한 쌍의 상보성 TCR 쇄 또는 가용성 시약, 고정된 시약의 형태로 또는 NCBP에 의해서 제시된 단백질로서 발현되는 한 쌍의 상보성 TCR 쇄.
최종 산출물: AM, APX, APX:CM, APX:AM, TCRsp 또는 TCR-모방 친화성 시약의 형태의 분석물 항원 및 TCR 서열.
TRA: TCR 알파 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 알파 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 베타 쇄 단백질과 짝을 이뤄 알파/베타 TCRsp를 형성한다.
TRB: TCR 베타 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 베타 쇄 단백질은 전형적으로 TCR 알파 쇄 단백질과 짝을 이뤄 알파/베타 TCRsp를 형성한다.
TRD: TCR 델타 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 델타 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 감마 쇄 단백질과 짝을 이뤄 감마/델타 TCRsp를 형성한다.
TRG: TCR 감마 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 감마 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 델타 쇄 단백질과 짝을 이뤄 감마/델타 TCRsp를 형성한다.
V-영역: 가변 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
본 발명은 하기 항목에서 추가로 설명된다.
항목
1. 다성분 시스템으로서, 제1 성분은 성분 A라고 지정된 조작된 항원-제시 세포(eAPC)이고, 제2 성분은 분석물 항원-제시 복합체(aAPX) 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 암호화하는 1종 이상의 ORF의 전달을 위한, 성분 C라고 지정된 유전자 공여자 벡터인, 다성분 시스템.
2. 항목 1에 있어서, 성분 A는,
a. aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 결핍되어 있고,
b. 적어도 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위한, 성분 B라고 지정된 적어도 하나의 게놈 통합 부위를 함유하는, 다성분 시스템.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 성분 C는 성분 B에 매칭되고, 성분 C는,
a. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 및/또는
b. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되고,
a 및/또는 b는, ORF(들)가 B 게놈 수용자 부위 내에 안정적으로 통합될 수 있고, aAPX 및/또는 aAM이 발현되도록 통합의 선택 마커를 선택적으로 암호화하는, 다성분 시스템.
4. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 A라고 지정된 eAPC 및 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF의 전달을 위한 성분 C라고 지정된 유전자 공여자 벡터로 구성되고, 여기서
성분 A는,
a. aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 결핍되어 있고,
b. 적어도 하나의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위한, 성분 B라고 지정된 적어도 하나의 게놈 통합 부위를 함유하고,
성분 C는 성분 B에 매칭되고, 여기서 성분 C는,
c. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는
d. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되며,
c 및/또는 d는, ORF(들)가 B 게놈 수용자 부위 내에 안정적으로 통합될 수 있고, aAPX 및/또는 aAM이 발현되도록 통합의 선택 마커를 선택적으로 암호화하는, 다성분 시스템.
5. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 A는 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF의 통합을 위한 D라고 지정된 게놈 통합 부위인, 추가 성분을 포함하는, 다성분 시스템.
6. 항목 5에 있어서, E라고 지정된 추가 성분은 D에 매칭되는 유전 벡터이되, 성분 E는,
a. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는
b. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되며,
a 및/또는 b는, ORF(들)가 상기 D 게놈 수용자 부위 내에 안정적으로 통합될 수 있고, aAPX 및/또는 aAM이 발현되도록 통합의 선택 마커를 선택적으로 암호화하는, 다성분 시스템.
7. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추가적인 게놈 수용자 부위 및 매칭 유전자 공여자 벡터가 시스템의 추가적인 성분으로서 첨가된, 다성분 시스템.
8. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 게놈 수용자 부위 B 및/또는 D가 포함되고, 이것은
a. 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물,
b. 부위 지향된 상동 재조합을 위해 설계된 합성 작제물,
c. 부위 지향된 상동 재조합을 위한 네이티브 게놈 부위로부터 선택될 수 있는, 다성분 시스템.
9. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 A는 T-세포 공자극 수용체를 발현하는, 다성분 시스템.
10. 항목 9에 있어서, 성분 A는 T-세포 공자극 수용체 CD80 및/또는 CD83 및/또는 CD86을 발현하는, 다성분 시스템.
11. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 A는, aAPX가 세포의 표면 상에서 발현되도록, 적어도 1종 이상의 aAPX를 암호화하는 1종 이상의 ORF를 암호화하는 유전 물질과 함께 제공되는 경우, 카고 분자(CM)에 적재될 수 있고, 이것은 aAPX:CM이라고 지정되는, 다성분 시스템.
12. 항목 11에 있어서, aAPX는 네이티브 가공 및 카고-적재 머시너리를 통해서 CM에 적재될 수 있는, 다성분시스템.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, aAPX는 CM으로서 aAM에 적재될 수 있고, 이것은 aAPX:aAM이라고 지정되는, 다성분 시스템.
14. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, aAPX는 하기 중 임의의 것일 수 있는, 다성분 시스템:
a. HLA 클래스 I의 1종 이상의 구성원,
b. HLA 클래스 II의 1종 이상의 구성원,
c. 1종 이상의 비-HLA 항원-제시 복합체,
d. 또는 a, b 및/또는 c의 조합물.
15. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, aAM은 하기로부터 선택되는, 다성분 시스템:
a. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
b. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
c. 분석물 항원으로서 제공된 펩타이드,
d. 분석물 항원으로서 제공된 대사산물,
e. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
f. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
g. 상기 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 펩타이드,
h. 상기 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 폴리펩타이드,
i. 상기 성분 A 대사체를 변경시킴으로써 유래된 대사산물,
및/또는 이들의 조합물.
16. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 B 및/또는 D가 포함되고, 이것은 하기 유전 요소 중 적어도 1종을 포함하는, 다성분 시스템:
a. 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 상동 아암,
c. 진핵생물 프로모터,
d. 진핵생물 조건 조절 요소,
e. 진핵생물 종결인자,
f. 선택 마커,
g. 스플라이스 수용자 부위,
h. 스플라이스 공여자 부위,
i. 비-단백질 암호 유전자,
j. 인설레이터,
k. 이동성 유전 요소,
l. 메가뉴클레아제 인식 부위,
m. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
n. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
o. 코작 공통서열.
17. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 C 및/또는 E가 포함되고, 이것은 하기 유전 요소 중 적어도 1종을 포함하는, 다성분 시스템:
a. 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 상동 아암,
c. 진핵생물 프로모터,
d. 진핵생물 조건 조절 요소,
e. 진핵생물 종결인자,
f. 선택 마커,
g. 통합의 선택 마커,
h. 스플라이스 수용자 부위,
i. 스플라이스 공여자 부위,
j. 비-단백질 암호 유전자,
k. 인설레이터,
l. 이동성 유전 요소,
m. 메가뉴클레아제 인식 부위,
n. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
o. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
p. 항생제 내성 카세트,
q. 박테리아 복제 기점,
r. 효모 복제 기점,
s. 클로닝 부위,
t. 코작 공통서열.
18. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 B 및/또는 D가 포함되고, 이것은 단일 ORF의 RMCE 통합용이고,
a. 진핵생물 프로모터,
b. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
c. 코작 공통서열,
d. 선택 마커,
e. 진핵생물 종결인자를 포함하는, 다성분 시스템.
19. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 B 및/또는 D가 포함되고, 이것은 2종 이상의 ORF의 RMCE 통합용이고, 하기 유전 요소를 포함하는, 다성분 시스템:
a. 진핵생물 프로모터,
b. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
c. 2개 이상의 코작 공통서열,
d. 선택 마커,
e. 진핵생물 종결인자,
f. 제2 진핵생물 프로모터,
g. 제2 선택 마커,
h. 제2 진핵생물 종결인자.
20. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 C 및/또는 E가 존재하고, 이것은 단일 ORF의 RMCE 통합용이고, 하기 유전 요소를 포함하는, 다성분 시스템:
a. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 코작 공통서열,
c. 항생제 내성 카세트,
d. 박테리아 복제 기점,
e. 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합을 위한 선택 마커를 암호화하는 단일 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위.
21. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 C 및/또는 E가 존재하고, 이것은 2종 이상의 ORF의 RMCE 통합용이고, 하기로 구성되는, 다성분 시스템:
a. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 2개 이상의 코작 공통서열,
c. 항생제 내성 카세트,
d. 박테리아 또는 효모 복제 기점,
e. 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마커를 암호화하는, 진핵생물 종결인자를 갖는, 2종 이상의 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위.
22. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 성분 C 및/또는 E는 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF와 조합되어 성분 C' 및/또는 E'를 수득하는, 다성분 시스템.
23. 항목 22에 있어서, 조합은 수 회 수행되어 성분 C' 및/또는 E'의 라이브러리를 수득하는, 다성분 시스템.
24. 항목 22 또는 23에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들)를 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-p라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 eAPC-p는 세포 표면 상에서 aAPX를 발현하는, 다성분 시스템.
25. 항목 22 또는 23에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAM ORF(들)를 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-a라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 상기 eAPC-a는 상기 세포 표면 상에서 또는 세포 내에서 aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
26. 항목 22 또는 23에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들) 및/또는 1종 이상의 aAM을 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 eAPC-pa는 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
27. 항목 24에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 eAPC-p와 조합되어, 성분 C' 또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAM ORF(들)를 성분 B 또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 또는 D는 성분 B' 또는 D'가 되어 그것은 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
28. 항목 25에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 eAPC-a와 조합되어, 성분 C' 또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들)를 성분 B 또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 또는 D는 성분 B' 또는 D'가 되어 그것은 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
29. 항목 24에 정의된 바와 같은 eAPC-p의 제조 방법으로서,
a. 성분 A를, 성분 C' 및/또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAPX를 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 b 내지 d 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-p의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대한 선택,
c. 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 이득에 대한 선택,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 이득에 대한 선택.
30. 항목 29에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, 방법.
31. 항목 29 또는 30에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 29의 단계 a에서 단일 aAPX를 암호화하는, 방법.
32. 항목 31에 있어서, 방법은 수 회 수행되고, 매회 항목 29의 단계 a는 고유한 aAPX를 사용하여 수행되어서, 고유한 eAPC-p가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-p의 라이브러리를 수득하는, 방법.
33. 항목 29 또는 30에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 29의 단계 a에서 2종 이상의 고유한 aAPX의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 라이브러리는 eAPC-p의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-p는 항목 29의 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAPX를 발현하는, 방법.
34. 항목 25에 정의된 바와 같은 eAPC-a의 제조 방법으로서,
a. 성분 A를, 성분 C' 및/또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAM을 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-a의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대한 선택,
c. 1종 이상의 aAM의 발현의 이득에 대한 선택,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 이득에 대한 선택.
35. 항목 34에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, 방법.
36. 항목 34 또는 35에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 34의 단계 a에서 단일 aAPX를 암호화하는, 방법.
37. 항목 36에 있어서, 방법은 수 회 수행되고, 매회 항목 34의 단계 a는 고유한 aAM을 사용하여 수행되어서, 고유한 eAPC-a가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-a의 라이브러리를 수득하는, 방법.
38. 항목 34 또는 35에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 34의 단계 a에서 2종 이상의 고유한 aAM의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 라이브러리는 eAPC-a의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-a는 항목 34의 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAM을 발현하는, 방법.
39. 항목 28에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC-a를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 1종 이상의 aAPX ORF를 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-pa의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대한 선택
c. 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 이득에 대한 선택
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 이득에 대한 선택.
40. 항목 39에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, 방법.
41. 항목 39 또는 40에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 항목 39의 단계 a에서 단일 aAPX를 암호화하는, 방법.
42. 항목 41에 있어서, 방법은 수 회 수행되고, 매회 항목 39의 단계 a는 고유한 aAPX를 사용하여 수행되어서, 고유한 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, 방법.
43. 항목 39 또는 40에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 항목 39의 단계 a에서 2종 이상의 고유한 aAPX의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 라이브러리는 eAPC-pa의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-pa는 항목 39의 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAPX를 발현하는, 방법.
44. 항목 27에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC-p를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 상기 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 1종 이상의 aAM ORF를 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-pa의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대한 선택,
c. 1종 이상의 aAM의 발현의 이득에 대한 선택,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 이득에 대한 선택,
45. 항목 44에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, 방법.
46. 항목 44 또는 45에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 항목 44의 단계 a에서 단일 aAM을 암호화하는, 방법.
47. 항목 46에 있어서, 방법은 수 회 수행되고, 매회 항목 44의 단계 a는 고유한 aAM을 사용하여 수행되어서, 고유한 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, 방법.
48. 항목 44 또는 45에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 항목 44의 단계 a에서 2종 이상의 고유한 aAM의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 라이브러리는 eAPC-pa의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-pa는 항목 44의 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAM을 발현하는, 방법.
49. 항목 26에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAM ORF 및 1종 이상의 aAPX ORF를 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대한 선택,
c. 1종 이상의 aAM의 발현 및/또는 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 이득에 대한 선택,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 이득에 대한 선택.
50. 항목 49에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, 방법.
51. 항목 49 또는 50에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 49의 단계 a에서 단일 aAM 및 단일 aAPX를 암호화하는, 방법.
52. 항목 51에 있어서, 방법은 수 회 수행되고, 매회 항목 49의 단계 a는 고유한 aAM 및 고유한 APX 중 적어도 하나를 사용하여 수행되어서, 고유한 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, 방법.
53. 항목 49 또는 50에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 항목 49의 단계 a에서 2종 이상의 고유한 aAM 및/또는 2종 이상의 고유한 aAPX의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 라이브러리는 eAPC-pa의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-pa는 항목 49의 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAM 및 단일 aAPX를 발현하는, 방법.
54. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 다성분 시스템으로부터 수득된 분석물 eAPC로서,
a. 분석물 친화성 시약에 대한 발현된 분석물 항원의 특이성 및/또는
b. 분석물 친화성 시약에 대한 발현된 분석물 항원의 친화성 또는
c. 발현된 분석물 항원에 대한 분석물 TCR(분석물 TC)을 발현하는 1종 이상의 분석물 세포의 신호 반응의 특징규명에 사용하기 위한 분석물 eAPC이되,
분석물 항원은 aAPX:aAM 및/또는 aAM 및/또는 aAPX 및/또는 aAPX:CM으로부터 선택되고, 상기 분석물 eAPC는 eAPC-p 및/또는 eAPC-a 및/또는 eAPC-pa로부터 선택되는, 분석물 eAPC.
55. 입력 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하여, 1종 이상의 분석물 TCR에 결합하는 1종 이상의 분석물 eAPC를 수득하는 방법으로서,
a. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 TCR과 조합하여, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 분석물 TCR 간의 접촉을 초래하는 단계 및
b. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
c. 존재하는 경우, 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 eAPC의 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
d. 존재하는 경우, 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TC에 의해서 발현된 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 TC의 신호 반응을 측정하는 단계 및
e. 단계 b로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하되,
분석물 항원은 aAPX:aAM 및/또는 aAM 및/또는 aAPX 및/또는 aAPX:CM으로부터 선택되고, 여기서 분석물 eAPC는 eAPC-p 및/또는 eAPC-a 및/또는 eAPC-pa로부터 선택되고, 분석물 TCR은 가용성 시약, 고정된 시약, 비-세포 기반 입자(NCBP)에 의해서 제시된 것, 세포의 표면 상에 제시된(TC) 것 중 적어도 하나의 형태의 TCR-모방 친화성 시약 또는 한 쌍의 TCR 쇄이고, 여기서 세포는 일차 T-세포 및/또는 재조합 T-세포 및/또는 조작된 세포로부터 선택될 수 있는, 방법.
56. 항목 55에 있어서, 선택 단계 e는 풀에 대한 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 방법.
57. 항목 56에 있어서, 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 방법.
58. 항목 56에 있어서, 분류 이후에 세포의 분류된 풀을 확장시키는, 방법.
59. 항목 56 내지 58 중 어느 것에 있어서, 분류된 및/또는 확장된 세포(들)의 성분 B' 및/또는 성분 D'를 서열결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
60. 항목 59에 있어서, 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행되는, 방법:
a. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
b. 성분 B' 및/또는 성분 D' RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
c. 성분 B' 및/또는 성분 D'의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
61. 항목 59 또는 60에 있어서, 서열결정 단계는 세포에 대해서 파괴성이고, 수득된 서열결정 정보는 항목 55의 단계 e에서 선택된 분석물 eAPC를 제조하기 위해서 사용되는, 방법.
62. 항목 55, 56, 57, 58, 61 중 어느 것에 있어서, 선택된 분석물 eAPC는 친화성 분석에 적용되어 분석물 TCR에 대한 분석물 항원의 친화성을 결정하고, 방법은 하기 단계를 더 포함하는, 방법:
a. 선택된 분석물 eAPC(들)를 다양한 농도에서 분석물 TCR로 표지하는 단계,
b. 단계 a의 표지된 분석물 eAPC 상에서 FACS 분석을 수행하는 단계,
c. 분석물 eAPC의 형광 표지의 강도를 분석물 친화성 시약의 다양한 농도에 걸쳐서 결정하는 단계,
d. 분석물 TCR에 대한 분석물 항원의 친화성을 결정하는 단계.
63. 항목 62에 있어서, 단계 b 내지 c는 표지된 참조군을 사용하여 수행되고, 단계 d는 분석물 친화성 시약 형광 강도 대 참조군 형광 강도의 비를 사용하여 친화성을 계산하는, 방법.
64. 항목 63에 있어서, 표지된 참조군은 하기로부터 선택되는, 방법:
a. 분석물 항원에 대한 친화성 시약으로 표지된 분석물 eAPC
b. 표지된 참조군 분석물 항원을 제시하는 세포 또는 입자.
65. 항목 55, 56, 57, 58, 61 중 어느 것에 있어서, 선택된 분석물 eAPC는 신호 반응의 특징규명에 적용되고, 방법은 하기 단계를 더 포함하는, 방법:
a. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
b. 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
66. 항목 65에 있어서, 유도된 신호 반응은 비-유도된 신호 반응 상태에 대해서 비교된 하기 중 하나 이상의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되는, 방법:
a. 분비된 생물분자,
b. 분비된 화학물질,
c. 세포내 생물분자,
d. 세포내 화학물질,
e. 표면 발현된 생물분자,
f. 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 세포독성 작용,
g. 신호 반응이 분석물 eAPC에 의해서 유도되고, a 내지 e 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 파라크린 작용,
h. 분석물 TC의 증식,
i. 분석물 TC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스 형성.
67. 입력 분석물 TCR 또는 분석물 TCR의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 TCR을 선택하여(여기서 분석물 TCR은 1종 이상의 분석물 eAPC에 결합함), 분석물 TCR에 암호화된 TCR 쇄의 하나 이상의 쌍의 서열을 수득하고/하거나 분석물 TCR을 수득하는 방법으로서,
a. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 TCR과 조합하여, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 접촉을 초래하는 단계 및
b. 존재하는 경우, 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
c. 존재하는 경우, 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TC에 의해서 발현된 1종 이상의 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 TC의 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
d. 존재하는 경우, 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCR 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 eAPC의 신호 반응을 측정하는 단계 및
e. 단계 b, c 및/또는 d로부터 1종 이상의 분석물 TCR을 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하되,
여기서 분석물 항원은 aAPX:aAM 및/또는 aAM 및/또는 aAPX 및/또는 aAPX:CM으로부터 선택되고, 여기서 분석물 eAPC는 eAPC-p 및/또는 eAPC-a 및/또는 eAPC-pa로부터 선택되고, 분석물 TCR은 가용성 시약, 고정된 시약, 비-세포 기반 입자(NCBP)에 의해서 제시된 것, 세포의 표면 상에 제시된(TC) 것 중 적어도 하나의 형태의 TCR-모방 친화성 시약 또는 한 쌍의 TCR 쇄이고, 여기서 세포는 일차 T-세포 및/또는 재조합 T-세포 및/또는 조작된 세포로부터 선택될 수 있는, 방법.
68. 항목 67에 있어서, 선택 단계 e는 풀에 대한 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 방법.
69. 항목 68에 있어서, 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 방법.
70. 항목 68에 있어서, 분류 이후에 세포의 분류된 풀을 확장시키는, 방법.
71. 항목 67 내지 70 중 어느 것에 있어서, 분류된 및/또는 확장된 세포(들)의 분석물 TCR 쇄를 서열결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
72. 항목 71에 있어서, 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행되는, 방법:
a. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
b. 분석물 TCR 쇄 RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
c. 분석물 TCR 쇄의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
73. 항목 67, 68, 69, 70 중 어느 것에 있어서, 선택된 분석물 TC는 신호 반응의 특징규명에 적용되고, 방법은 하기 단계를 더 포함하는, 방법:
a. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
b. 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
74. 항목 73에 있어서, 유도된 신호 반응은 비-유도된 신호 반응 상태에 대해서 비교된 하기 중 하나 이상의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되는, 방법:
a. 분비된 생물분자,
b. 분비된 화학물질,
c. 세포내 생물분자,
d. 세포내 화학물질,
e. 표면 발현된 생물분자,
f. 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 세포독성 작용,
g. 신호 반응이 분석물 eAPC에 의해서 유도되고, a 내지 e 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 TC의 파라크린 작용,
h. 분석물 TC의 증식,
i. 분석물 TC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스 형성.
75. aAM 카고 또는 CM 카고를 선택 및 식별하는 방법으로서, 카고는 분석물 eAPC의 aAPX에 적재된, 대사산물 및/또는 펩타이드이고, 방법은,
a. aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 또는 카고 aM 또는 카고 CM을 단리하는 단계, 및
b. 적재된 카고를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
76. 항목 75에 있어서, 단계 b는 단리된 aAPX:aAM 또는 aAPX:CM을 하기 중 하나 이상에 적용하는 단계를 포함하는, 방법:
a. 질량 분광학 분석,
b. 펩타이드 서열결정 분석.
77. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 67 내지 74에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 한 쌍의 TCR 쇄 서열 또는 TCR 쇄 서열의 쌍의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
78. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 55 내지 66 또는 75, 76에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 항원성 분자 및/또는 상기 항원성 분자를 암호화하는 ORF를 또는 이의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
79. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 55 내지 66 또는 75, 76에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 카고로서 항원성 분자에 적재된 항원-제시 복합체 및/또는 상기 복합체를 암호화하는 ORF(들) 또는 이의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
80. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 55 내지 66에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 eAPC, 또는 eAPC의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
81. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 67 내지 74에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 CD3과 복합체를 이룬 세포의 표면 상에서 TCR을 발현하는 세포 또는 이의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
82. 하기 중 적어도 하나에 사용하기 위한, 항목 1 내지 28 중 어느 것에 따른 다성분 시스템:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
83. 하기 중 적어도 하나에 사용하기 위한 항목 67 내지 74에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 TCR-모방 친화성 시약 서열(들) 또는 TCR-모방 친화성 시약 서열의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
84. 하기 중 적어도 하나에 사용하기 위한 항목 67 내지 74에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 TCR 쌍 또는 TCR-모방 친화성 시약을 보유하는 NCBP 또는 TCR 쌍 또는 TCR-모방 친화성 시약을 보유하는 NCBP의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품.
SEQUENCE LISTING
<110> Genovie AB
<120> An Engineered Multi-component System for Identification and Characterisation of T-cell receptors and T-cell antigens
<130> WO/2018/083316
<140> PCT/EP2017/078376
<141> 2017-11-07
<150> PA 2016 70872
<151> 2016-11-07
<160> 72
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Analyte Antigenic Molecule
<400> 1
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Analyte Antigenic Molecule
<400> 2
Pro Lys Tyr Val
1
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Analyte Antigenic Molecule, APD-2
<400> 3
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr
1 5 10 15
Val
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Analyte Antigenic Molecule, APD-21
<400> 4
Asn Leu Gly Pro Met Ala Ala Gly Val
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<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Analyte Antigenic Molecule, APD-11
<400> 5
Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu
1 5
<210> 6
<211> 6071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V1.A.4 pcDNA3.1_GFP
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat ggaatccgat gagtctggcc tgcccgccat 960
ggaaatcgag tgcagaatca ccggcaccct gaacggcgtg gaatttgagc tcgtgggcgg 1020
aggcgagggc acacctgaac agggcagaat gaccaacaag atgaagtcca ccaagggggc 1080
cctgaccttc agcccctacc tgctgtctca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg 1140
cacctacccc agcggctacg agaacccttt cctgcacgcc atcaacaacg gcggctacac 1200
caacacccgg atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgtcct tcagctacag 1260
atacgaggcc ggcagagtga tcggcgactt caaagtgatg ggcaccggat tccccgagga 1320
cagcgtgatc ttcaccgaca agatcatccg gtccaacgcc accgtggaac atctgcaccc 1380
catgggcgac aacgacctgg acggcagctt caccagaacc ttctccctgc gggatggcgg 1440
ctactacagc agcgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat 1500
cctccagaac ggcggaccca tgttcgcctt cagacgggtg gaagaggacc acagcaacac 1560
cgagctgggc atcgtggaat accagcacgc cttcaagacc cccgatgccg atgccggcga 1620
ggaatgagtc gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1680
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1740
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1800
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1860
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 1920
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 1980
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 2040
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 2100
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 2160
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 2220
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 2280
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 2340
gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 2400
ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 2460
gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 2520
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 2580
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 2640
gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 2700
ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca 2760
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2820
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2880
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2940
ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 3000
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 3060
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 3120
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 3180
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 3240
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 3300
aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 3360
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 3420
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 3480
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 3540
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 3600
accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 3660
ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 3720
tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 3780
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 3840
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 3900
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 3960
cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 4020
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 4080
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 4140
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 4200
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 4260
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 4320
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 4380
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 4440
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 4500
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 4560
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4620
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 4680
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 4740
actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 4800
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt 4860
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4920
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4980
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 5040
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 5100
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 5160
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 5220
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 5280
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 5340
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 5400
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 5460
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 5520
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5580
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5640
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5700
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5760
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5820
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5880
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5940
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 6000
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 6060
cacctgacgt c 6071
<210> 7
<211> 10428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SpCas9-2A-GFP Vector V1.A.8
<400> 7
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 960
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1020
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1080
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1140
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1200
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1260
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1320
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1380
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1440
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1500
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1560
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1620
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1680
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 1740
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 1800
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 1860
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 1920
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 1980
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2040
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2100
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2160
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2220
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2280
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2340
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2400
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2460
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2520
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2580
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2640
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 2700
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 2760
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 2820
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 2880
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 2940
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3000
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3060
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3120
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3180
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3240
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3300
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3360
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3420
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3480
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3540
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cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3660
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tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 3780
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agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 3960
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taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4200
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4260
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4320
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4380
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4440
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4500
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4560
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4620
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4680
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tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 4800
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 4860
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 4920
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 4980
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5040
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5100
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5160
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaaggaa ttcggcagtg gagagggcag 5220
aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccagtga gcaagggcga 5280
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 5340
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gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 5460
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ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 5640
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 5700
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 5760
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 5820
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 5880
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 5940
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cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 6360
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 6420
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ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 6540
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 6600
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 6660
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cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc 6780
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ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct 7020
attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg 7080
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tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 7260
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cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 7380
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 7440
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 7500
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 7560
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tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 8460
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caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 10428
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMA-SV40pA vector V1.C.2
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ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
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ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 1980
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aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 2508
<210> 9
<211> 4341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-A 02:01 6xHis + Exon2/3-HA-L+R vector V1.C.6
<400> 9
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg aattcgctac cggtatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 420
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cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 2640
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 2700
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 2760
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<213> Artificial Sequence
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220
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caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 2580
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVS_Efla-intron_F14_RFPnls_F15 vector V4.B.2
<400> 24
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
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ctctcactcc tttcatttgg gcagctcccc tacccccctt acctctctag tctgtgctag 1020
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<213> Artificial Sequence
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<400> 34
ggcggttcct ctacatccgg tggatctgga tctggagaac aaaagctcat ctctgaggag 60
gaccttgggg agcagaagct aatcagtgaa gaagacctcg gagagcagaa attgattagc 120
gaggaggatc tttaaagact aggcacgaag ttcctattcc gaagttccta ttcttcaaat 180
agtataggaa cttccgctct gaccagctgc attaacatgg tcatagctgt ttccttgcgt 240
attgggcgct ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cgggtaaagc 300
ctggggtgcc taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 360
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 420
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 480
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 540
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 600
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 660
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 720
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 780
gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 840
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 900
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 960
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1020
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 1080
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 1140
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 1200
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 1260
gataccgcga gaaccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 1320
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 1380
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 1440
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 1500
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 1560
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 1620
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 1680
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 1740
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 1800
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 1860
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 1920
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 1980
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 2040
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 2100
tccccgaaaa gtgccaccta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat 2160
ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa 2220
tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt ggccgctaca gggcgctccc attcgccatt 2280
caggctgcgc aactgttggg aagggcgttt cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 2340
tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 2400
cacgacgttg taaaacgacg gccagtgagc gcgacgtaat acgactcact atagggcgaa 2460
ttggcggaag gccgtcaagg ccgcatgaat tcgctaccgg gagttggtag gtaagtatca 2520
aggttacaag acaggtttaa ggaggaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag 2580
tataggaact tcgactctca ggtaccatgg agtcgcgcgg tcgccgttgt cccgaaatga 2640
tatccgtact gggtcccatt tcggggcacg tgctgaaagc cgtgtttagt cgcggcgata 2700
cgccggtgct gccgcacgag acgcgactcc tgcagacggg tatccacgta cgcgtgagcc 2760
agccctcgct gatcttggta tcgcagtaca cgcccgactc gacgccatgc caccgcggcg 2820
acaatcagct gcaggtgcag cacacgtact ttacgggcag cgaggtggag aacgtgtcgg 2880
tcaacgtgca caaccccacg ggccgaagca tctgccccag ccaggagccc atgtcgatct 2940
atgtgtacgc gctgccgctc aagatgctga acatccccag catcaacgtg caccactacc 3000
cgtcggcggc cgagcgcaaa caccgacacc tgcccgtagc tgacgctgtg attcacgcgt 3060
cgggcaagca gatgtggcag gcgcgtctca cggtctcggg actggcctgg acgcgtcagc 3120
agaaccagtg gaaagagccc gacgtctact acacgtcagc gttcgtgttt cccaccaagg 3180
acgtggcact gcggcacgtg gtgtgcgcgc acgagctggt ttgctccatg gagaacacgc 3240
gcgcaaccaa gatgcaggtg ataggtgacc agtacgtcaa ggtgtacctg gagtccttct 3300
gcgaggacgt gccctccggc aagctcttta tgcacgtcac gctgggctct gacgtggaag 3360
aggacctgac gatgacccgc aacccgcaac ccttcatgcg cccccacgag cgcaacggct 3420
ttacggtgtt gtgtcccaaa aatatgataa tcaaaccggg caagatctcg cacatcatgc 3480
tggatgtggc ttttacctca cacgagcatt ttgggctgct gtgtcccaag agcatcccgg 3540
gcctgagcat ctcaggtaac ctgttgatga acgggcagca gatcttcctg gaggtacaag 3600
ccatacgcga gaccgtggaa ctgcgtcagt acgatcccgt ggctgcgctc ttctttttcg 3660
atatcgactt gctgctgcag cgcgggcctc agtacagcga gcaccccacc ttcaccagcc 3720
agtatcgcat ccagggcaag cttgagtacc gacacacctg ggaccggcac gacgagggtg 3780
ccgcccaggg cgacgacgac gtctggacca gcggatcgga ctccgacgaa gaactcgtaa 3840
ccaccgagcg caagacgccc cgcgtcaccg gcggcggcgc catggcgggc gcctccactt 3900
ccgcgggccg caaacgcaaa tcagcatcct cggcgacggc gtgcacgtcg ggcgttatga 3960
cacgcggccg ccttaaggcc gagtccaccg tcgcgcccga agaggacacc gacgaggatt 4020
ccgacaacga aatccacaat ccggccgtgt tcacctggcc gccctggcag gccggcatcc 4080
tggcccgcaa cctggtgccc atggtggcta cggttcaggg tcagaatctg aagtaccagg 4140
agttcttctg ggacgccaac gacatctacc gcatcttcgc cgaattggaa ggcgtatggc 4200
agcccgctgc gcaacccaaa cgtcgccgcc accggcaaga cgccttgccc gggccatgca 4260
tcgcctcgac gcccaaaaag caccga 4286
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> pMA-sv40_OE_F1 primer 1.C.2
<400> 35
cctgatcata atcaagccat atcac 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> pMA-sv40_OE_R1 primer 1.C.3
<400> 36
gtgatatggc ttgattatga tcagg 25
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-A-GT-Rg3 primer 4.A.3 1
<400> 37
tcccgttctc caggtatctg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-A-GT-Fg2 primer 4.A.4
<400> 38
gtgtcgggtt tccagagaag 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-B-GT-Fg2 primer 4.A.7
<400> 39
gggtcccagt tctaaagtcc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-B-GT-Rg2 primer 4.B.1
<400> 40
ggggattttg gcctcaactg 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-C-GT-Fg2 primer 4.B.5
<400> 41
tcttcctgaa tactcatgac g 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-A-02_GT_Rg4 primer 4.I.9
<400> 42
ggagatctac aggcgatcag 20
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-A-Exon3_HA-RE-BglII_F1 primer 6.I.9
<400> 43
ggttagatct gggaaggaga cgctgcag 28
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-C-04-GT-Rg1 primer 8.A.1
<400> 44
gatcccattt tcctcccctc 20
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CMV-pA-HLA-Ex3_Probe_F1 primer 8.B.2
<400> 45
atgtctggat ctgcggatca gcgcacg 27
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CMV-pro_GT_R1 primer 9.C.3
<400> 46
atgggctatg aactaatgac c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> sv40pA_GT_F1 primer 9.C.4
<400> 47
cattctagtt gtggtttgtc c 21
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_F1 primer 9.C.5
<400> 48
cttacctctc tagtctgtgc 20
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_F3 primer 9.C.7
<400> 49
ccattgtcac tttgcgctg 19
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_F4 primer 9.C.8
<400> 50
tcctggactt tgtctccttc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_R2 primer 9.C.10
<400> 51
agagatggct ccaggaaatg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_R3 primer 9.D.1
<400> 52
aagagaaagg gagtagaggc 20
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> AAVS1_GT_R4 primer 9.D.2
<400> 53
cccgaagagt gagtttgc 18
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HLA-A-intron4_GT_R1 primer 9.D.6
<400> 54
gctaaaggtc agagaggctc 20
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> sv40pA-GT primer 9.D.7
<400> 55
ctgcattcta gttgtggttt gtc 23
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> sv40pA-AAVS1-probe-FAM-F1 primer 9.J.2
<400> 56
tgcggatcag gattggtgac agaa 24
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC_TCRA-ex1_R1 primer 10.A.9
<400> 57
gacttgtcac tggatttaga gtctct 26
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC_TCRA-promoter_F1 primer 10.A.10
<400> 58
ctgatcctct tgtcccacag ata 23
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC_probe (HEX) primer 10.B.6
<400> 59
atccagaacc ctgaccctgc cg 22
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Pan-HLA_GT_F1 primer 8.B.3
<400> 60
aaggagggag ctactctcag 20
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> SV40pA_GT_R1 primer 15.H.2
<400> 61
cctctacaga tgtgatatgg cttg 24
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 3xMyc_OE_R1 primer 10.C.4
<400> 62
ggagaacaaa agctcatctc tgaggag 27
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CtermCysLink_OE_R1 primer 10.D.1
<400> 63
agatccagat ccaccggatg tagagcaac 29
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Ef1a_intron_GT_F2 primer 15.H.4
<400> 64
tgggtggaga ctgaagttag 20
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMVpp65_GT_F2ddPCR primer/probe 21.I.1
<400> 65
tcgacgccca aaaagcac 18
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMVpp28_GT_F1 ddPCR primer/probe 21.I.2
<400> 66
tgcctccttg ccctttg 17
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMVpp52_GT_F1 ddPCR primer/probe 21.I.3
<400> 67
cgtccctaac accaagaag 19
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Myc-Tag_GT_R1 ddPCR primer/probe 20.H.10
<400> 68
aaggtcctcc tcagagatg 19
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Linker-Myc_Probe_Fam ddPCR primer/probe 20.H.9
<400> 69
cttttgttct ccagatccag atccacc 27
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.9
<400> 70
ctgatcctct tgtcccacag ata 23
<210> 71
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe
<400> 71
gacttgtcac tggatttaga gtctct 26
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> TRAC-probe (HEX) ddPCR primer/probe
<400> 72
atccagaacc ctgaccctgc cg 22
Claims (47)
- 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 다성분 시스템(multicomponent system)으로서, 제1 성분은 성분 A라고 지정된 조작된 항원-제시 세포(engineered antigen-presenting cell: eAPC)이고, 제2 성분은 분석물 항원-제시 복합체(analyte antigen-presenting complex: aAPX) 및/또는 분석물 항원성 분자(analyte antigenic molecule: aAM)를 암호화하는 1종 이상의 ORF(open reading frame)의 전달을 위한, 성분 C 및 E라고 지정된 한 쌍의 유전자 공여자 벡터(genetic donor vector)이되, 성분 A는,
a. aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 결핍되도록 조작 및/또는 선별되고,
b. 각각 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위한, 성분 B 및 성분 D라고 지정된 적어도 2개의 게놈 수용자 부위(genomic receiver site)를 함유하고,
성분 C 및 E는 각각 성분 B 및 D에 매칭되되, 성분 C는,
c. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는
d. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되며,
상기 게놈 수용자 부위 B 및 D는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(recombinase mediated cassette exchange: RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물인, 다성분 시스템. - 제1항에 있어서, c 및/또는 d는, 상기 ORF(들)가 상기 B 게놈 수용자 부위 내에 안정적으로 통합될 수 있고, 상기 aAPX 및/또는 aAM이 발현되도록 통합의 선택 마커를 암호화하는, 다성분 시스템.
- 제1항에 있어서, E라고 지정된 추가 성분은 D에 매칭되는 유전 벡터이되, 상기 성분 E는,
a. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는
b. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되는, 다성분 시스템. - 제1항에 있어서, E라고 지정된 추가 성분은 D에 매칭되는 유전 벡터이되, 상기 성분 E는,
a. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 단일 ORF 또는
b. 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 2종 이상의 ORF를 전달하도록 설계되며,
a 및/또는 b는, 상기 ORF(들)가 상기 D 게놈 수용자 부위 내에 안정적으로 통합될 수 있고, 상기 aAPX 및/또는 aAM이 발현되도록 통합의 선택 마커를 암호화하는, 다성분 시스템. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 게놈 수용자 부위 및 매칭 유전자 공여자 벡터가 상기 시스템의 추가적인 성분으로서 첨가된, 다성분 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 aAPX는 하기 a 내지 d 중 임의의 것일 수 있는, 다성분 시스템:
a. HLA 클래스 I의 1종 이상의 구성원,
b. HLA 클래스 II의 1종 이상의 구성원,
c. 1종 이상의 비-HLA 항원-제시 복합체 또는
d. a, b 및 c의 임의의 조합물. - 제1항에 있어서, 상기 aAM은 하기 a 내지 i 및/또는 이들의 조합물로부터 선택되는, 다성분 시스템:
a. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
b. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
c. 분석물 항원으로서 제공된 펩타이드,
d. 분석물 항원으로서 제공된 대사산물,
e. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
f. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
g. 상기 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 펩타이드,
h. 상기 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 폴리펩타이드,
i. 상기 성분 A 대사체를 변경시킴으로써 유래된 대사산물. - 제1항에 있어서, 상기 성분 B 및/또는 D는 하기 유전 요소 a 내지 o 중 적어도 1종을 포함하는, 다성분 시스템:
a. 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 상동 아암,
c. 진핵생물 프로모터,
d. 진핵생물 조건 조절 요소(eukaryotic conditional regulatory element),
e. 진핵생물 종결인자,
f. 선택 마커,
g. 스플라이스 수용자 부위,
h. 스플라이스 공여자 부위,
i. 비-단백질 암호 유전자,
j. 인설레이터,
k. 이동성 유전 요소,
l. 메가뉴클레아제 인식 부위,
m. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
n. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
o. 코작 공통서열. - 제1항에 있어서, 상기 성분 B 및/또는 D는 단일 ORF의 RMCE 통합용이고, 하기 a 내지 e를 포함하는, 다성분 시스템:
a. 진핵생물 프로모터,
b. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
c. 코작 공통서열,
d. 선택 마커,
e. 진핵생물 종결인자. - 제3항 또는 제4항에 있어서, 성분 E가 존재하고, 성분 C 및/또는 E는 단일 ORF의 RMCE 통합용이고, 하기 유전 요소 a 내지 e를 포함하는, 다성분 시스템:
a. 한 쌍의 이종특이적 리콤비나제 부위,
b. 코작 공통서열,
c. 항생제 내성 카세트,
d. 박테리아 복제 기점,
e. 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합을 위한 선택 마커를 암호화하는 단일 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위. - 제3항 또는 제4항에 있어서, 성분 C 및/또는 E는 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF와 조합되어 성분 C' 및/또는 E'를 수득하는, 다성분 시스템.
- 제11항에 있어서, 상기 조합은 수 회 수행되어 성분 C' 및/또는 E'의 라이브러리를 수득하는, 다성분 시스템.
- 제11항에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들)를 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-p라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 상기 eAPC-p는 상기 세포 표면 상에서 aAPX를 발현하는, 다성분 시스템.
- 제11항에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAM ORF(들)를 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-a라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 상기 eAPC-a는 상기 세포 표면 상에서 또는 세포 내에서 aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
- 제11항에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 성분 A와 조합되어, 성분 C' 및/또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들) 및/또는 1종 이상의 aAM을 성분 B 및/또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 및/또는 D는 성분 B' 및/또는 D'가 되어 상기 eAPC-pa는 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
- 제13항에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 eAPC-p와 조합되어, 성분 C' 또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAM ORF(들)를 성분 B 또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 또는 D는 성분 B' 또는 D'가 되어 그것은 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
- 제14항에 있어서, 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 eAPC-a와 조합되어, 성분 C' 또는 E' 내에 암호화된 1종 이상의 aAPX ORF(들)를 성분 B 또는 D 내에 통합하여, eAPC-pa라고 지정된 세포를 수득하되, 성분 B 또는 D는 성분 B' 또는 D'가 되어 그것은 aAPX 및 aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는, 다성분 시스템.
- 제13항에 정의된 바와 같은 eAPC-p의 제조 방법으로서,
a. 성분 A를, 성분 C' 및/또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAPX를 암호화하는, 상기 조합하는 단계, 및 하기 b 내지 c 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-p의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대해 선별함,
c. 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 수득에 대해 선별함,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 수득에 대해 선별함. - 제18항에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, eAPC-p의 제조 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단일 aAPX를 암호화하는, eAPC-p의 제조 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 방법은 수 회 수행되되, 매회 단계 a는 별개의 aAPX를 사용하여 수행되어서, 별개의 eAPC-p가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-p의 라이브러리를 수득하는, eAPC-p의 제조 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단계 a에서 2종 이상의 별개의 aAPX의 혼합된 풀(mixed pool)을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 상기 라이브러리는 eAPC-p의 혼합된 집단을 포함하고, 각각의 eAPC-p는 단일 aAPX를 발현하는, eAPC-p의 제조 방법.
- 제14항에 정의된 바와 같은 eAPC-a의 제조 방법으로서,
a. 성분 A를, 성분 C' 및/또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 여기서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAM을 암호화하는 것인, 상기 단계, 및 하기 b 내지 c 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-a의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대해 선별함,
c. 1종 이상의 aAM의 발현의 수득에 대해 선별함,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 수득에 대해 선별함. - 제23항에 있어서, b 및 d가 포함되는, eAPC-a의 제조 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단계 a에서 단일 aAM을 암호화하는, eAPC-a의 제조 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 방법은 수 회 수행되되, 매회 단계 a는 별개의 aAM을 사용하여 수행되어서, 별개의 eAPC-a가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-a의 라이브러리를 수득하는, eAPC-a의 제조 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단계 a에서 2종 이상의 별개의 aAM의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 상기 라이브러리는 eAPC-a의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-a는 단일 aAM을 발현하는, APC-a의 제조 방법.
- 제17항에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC-a를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 여기서 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 1종 이상의 aAPX ORF를 암호화하는 것인, 상기 단계, 및 하기 b 내지 c 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-pa의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대해 선별함,
c. 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 수득에 대해 선별함,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 수득에 대해 선별함. - 제28항에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 단계 a에서 단일 aAPX를 암호화하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 방법은 수 회 수행되되, 매회 단계 a는 별개의 aAPX를 사용하여 수행되어서, 별개의 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제16항에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC-p를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 여기서 상기 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 1종 이상의 aAM ORF를 암호화하는 것인, 상기 단계, 및 하기 b 내지 c 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, eAPC-pa의 제조 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대해 선별함,
c. 1종 이상의 aAM의 발현의 수득에 대해 선별함,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 수득에 대해 선별함. - 제32항에 있어서, b 및 d가 포함되는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 단계 a에서 단일 aAM을 암호화하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 방법은 수 회 수행되되, 매회 단계 a는 별개의 aAM을 사용하여 수행되어서, 별개의 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 또는 E'는 단계 a에서 2종 이상의 별개의 aAM의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 상기 라이브러리는 eAPC-pa의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-pa는 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAM을 발현하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제15항에 정의된 바와 같은 eAPC-pa의 제조 방법으로서,
a. eAPC를, 성분 C' 또는 E' 중 적어도 1종과 조합하는 단계로서, 여기서 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 1종 이상의 aAM ORF 및 1종 이상의 aAPX ORF를 암호화하는 것인, 상기 단계, 및 하기 b 내지 d 중 적어도 하나 및 통합 인자와 조합하는 단계를 포함하는, 방법:
b. 게놈 수용자 부위 선택 마커(들)의 손실에 대해 선별함,
c. 1종 이상의 aAM의 발현 및/또는 1종 이상의 aAPX의 표면 발현의 수득에 대해 선별함,
d. 통합의 선택 마커 중 1종 이상의 수득에 대해 선별함. - 제37항에 있어서, b, c 및 d가 포함되는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단계 a에서 단일 aAM 및 단일 aAPX를 암호화하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 방법은 수 회 수행되되, 매회 단계 a는 별개의 aAM 및/또는 별개의 aAPX 중 적어도 하나를 사용하여 수행되어서, 별개의 eAPC-pa가 수득되어, 개별 및 정의된 eAPC-pa의 라이브러리를 수득하는, eAPC-pa의 제조 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 1종 이상의 성분 C' 및/또는 E'는 단계 a에서 2종 이상의 별개의 aAM 및/또는 2종 이상의 별개의 aAPX의 혼합된 풀을 암호화하여, 라이브러리를 수득하되, 상기 라이브러리는 eAPC-pa의 혼합된 집단으로 구성되고, 각각의 eAPC-pa는 단계 a에서 사용된 풀로부터 단일 aAM 및 단일 aAPX를 발현하는, eAPC-pa의 제조 방법.
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