CN1343255A

CN1343255A - Megsin启动子

Info

Publication number: CN1343255A
Application number: CN00804657A
Authority: CN
Inventors: 宫田敏男
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2002-04-03
Also published as: EP1146123A1; CA2358928A1; EP1146123A4; NO20013625L; AU3078200A; NO20013625D0; KR20010103752A; WO2000043528A1; AU769710B2; US6790617B1

Abstract

本发明分离了一种基因组DNA区,其含有MEGSIN基因上游区约1.5kb的一部分,本发明还测定了它的碱基序列。在该基因组DNA区中,鉴定了能正调节转录的两个调节序列。此外,通过定点诱变在位于3’侧,上述两个调节序列之间的启动子区中导入了碱基取代,并因此成功鉴定了对启动子活性具有重要作用的碱基序列。

Description

MEGSIN启动子

技术领域

本发明涉及一种表达于肾细胞中的基因的启动子。本发明的启动子可应用于诸如基因治疗领域。

背景技术

人体中六万亿的各种细胞具有基本相同的基因组DNA。就正常生理功能而言，这些基因的表达受到细胞系以及细胞所接受的信号的严格控制。因此，阐明具体每种细胞中表达的基因将非常重要。

肾小球膜位于肾小球毛细管襻的小叶的中心，它是连接各小叶的一种核心组织。肾小球膜由肾小球基底膜覆盖，它包括肾小球膜细胞和无定形物质(肾小球膜基质)，所述肾小球膜细胞与毛细管腔被内皮细胞隔开，所述无定形物质与3层肾小球基底膜中的内透明层相连。

已知肾小球膜细胞在维持肾小球的结构和功能方面起关键作用，有观点认为它是肾小球疾病如肾小球肾炎和肾小球硬化症发病的主要原因。肾小球膜细胞是各类肾炎的发病目标。例如，有观点认为肾小球膜细胞的增生和肾小球膜细胞外基质的累积是各种肾小球疾病(如慢性肾小球肾炎和糖尿病性肾炎)患者发生肾小球硬化症的第一步，也是肾衰晚期的主要病因[D.Schlondorff，Kidney Int.，49，1583-1585(1996]；R.B.Sterzel等，肾小球膜细胞。免疫性肾病，595-626页(1997)]。因此，对特异性表达于肾小球膜细胞的基因的鉴定以及对其表达的调节机制的阐明均有助于理解肾小球膜细胞的生物学特征和与肾小球膜细胞相关疾病的病因，并因此有助于与肾小球膜细胞相关的疾病的治疗或诊断。

通过测定大批量DNA序列以及通过数据分析，本发明人分离了在肾小球膜细胞中特异性强表达的名为MEGSIN的基因。本发明人还测定了该基因的全部碱基序列，并推导了新蛋白质(人MEGSIN)的氨基酸序列，其由MEGSIN的全长cDNA编码，含380个氨基酸。此外，利用SwissProt数据库以FASTA程序进行的氨基酸序列同源性检索表明，人的MEGSIN属于SERPIN(丝氨酸蛋白酶抑制剂)超家族[R.Carrell等，Trends Biochem.Sci.，10，20(1985]；R.Carrell等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，52，527(1987)；E.K.O.Kruithof等，血液，86，4007(1995)；J.Potempa等，生物化学杂志，269，15957(1994)；E.Remold-O′Donnell，FEBS Lett.，315，105(1993)][T.Miyata等，临床研究杂志，120，828-836(1998)]。

人的MEGSIN在人成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、和角化细胞中弱表达，但在肾小球膜细胞中强表达(这表明人的MEGSIN特异性表达于肾小球膜细胞)。当在IgA肾病患者或糖尿病性肾病患者与健康人之间进行比较时，肾组织中MEGSIN的表达在IgA肾病患者或糖尿病性肾病患者中显著增多[D.Suzuki等，J.Am.Soc.Nephrol.10，2606-2613(1999)]。此外，表达水平的增加也可在肾小球膜增生性大鼠模型中观察到。

如上所述，很有可能MEGSIN基因的表达与肾病密切相关。因此，需要揭示MEGSIN基因表达之调节机制的真实情况，以便明确人的MEGSIN的体内功能，并提供可用于诊断和治疗诸如由MEGSIN突变所致的遗传性疾病的有效启动子或在肾小球膜细胞中特异性表达的启动子。

另一方面，由于人MEGSIN所属SERPIN超家族的成员之间在一级结构上高度相似，因而它们被认为由共同的祖先蛋白质衍生而来。即，根据对基于所述序列中突变的氨基酸数目[K.铃木等，蛋白质·核酸·酶，34，949-962(1989)]，以及对染色体基因结构的分析而构建的系统发生树的分析[J.J.Bao等，Biochem.，26，7755(1987)]，SERPIN超家族已在各种高等脊椎动物中进化了不少于五百万年。MEGSIN基因的最显著特征是，它特异性表达于肾小球中的肾小球膜细胞中。

最近有报道称，离子通道的基因和与转运有关的基因均特异性表达于肾脏[S.J.Lolait等，自然，357，336-339(1992]；Y.Kanai等，临床研究杂志，93，397-404(1994)；S.Uchida等，生物化学杂志，268，3821-3824(1993)；S.Adachi等，生物化学杂志，269，17677-17683(1994)；K.Fushimi等，自然，361，549-552(1993)；G.Gamba等，生物化学杂志，269，17713-17722(1994)]。

但是，这些基因均位于肾小管的上皮细胞中，均未在肾小球膜细胞中表达。因此，对MEGSIN基因的启动子和转录因子的鉴定可以为特定类型细胞中基因表达的机制提供重要的信息。这一信息还可以应用于在分子遗传学和基因转移中靶向细胞。

发明内容

本发明的一个目的是提供MEGSIN基因启动子及其应用。

本发明人测定了约1.5kb长的包含MEGSIN基因序列上游(5’端)的基因组DNA的碱基序列，以揭示MEGSIN基因表达的调控机制。S1核酸酶保护作用的分析结果表明，在MEGSIN mRNA中存在4个转录起始位点。此外还表明，转录起始位点上游存在保守型转录调节序列，其包括AP1结合位点、cMyb结合位点、以及Oct-1等转录调节位点。构建载体，使其中该转录调节序列的各种区域缺失，并在3’中导入萤光素酶基因。用所述载体转染细胞，通过检测细胞的萤光素酶活性而测定转录调节区。结果鉴定了两个能正调控转录的调节序列。对位于3’末端的一个启动子的转录调节活性，通过以位点特异性诱变法导入碱基置换而进行详细分析。结果，本发明人成功测定了在转录调节中起重要作用的DNA碱基序列。

因此，本发明涉及MEGSIN基因启动子及其应用，更具体地，本发明涉及：

(1)一种具有启动子活性的DNA，其具有SEQ ID NO：1所示碱基序列或其部分；

(2)一种含(1)所述DNA的载体；

(3)如(2)所述的载体，其中已将一外源基因连接在(1)所述DNA的下游并使其能表达；

(4)用(3)所述载体转化的细胞；

(5)一种筛选与DNA结合的蛋白质的方法，所述DNA含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分，该方法包括以下步骤：

(a)使待测样品与所述含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分的DNA接触，和

(b)筛选能结合所述含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分之DNA的蛋白质；

(6)可通过(5)的方法分离的蛋白质；和

(7)如(6)所述的蛋白质，其中该蛋白质为转录因子。

本文中，“启动子”指存在于转录起始位点附近且控制基因表达的DNA区。此外，“启动子活性”指启动子控制其下游基因表达的活性。

本发明提供了MEGSIN基因的启动子。如实施例3所述，使MEGSIN基因5’上游区中-128位下游的碱基缺失或被取代，常显示启动子活性的显著降低。因此本发明的启动子包括MEGSIN基因5’上游区(SEQ ID NO：1)中-128位下游的至少一部分。

本发明的启动子可包含SEQ ID NO：1的碱基序列(其中一个或多个核苷酸已被取代)，只要它包括-128位(SEQ ID NO：1)下游区的至少一部分且只要它具有启动子活性。然而，如图7所示，-128位下游区中的下述突变可导致启动子活性下降：m1突变(位于-128位和-127位的碱基被取代)，m2突变(位于-120，-118，和-117位的碱基被取代)，m3突变(位于-116位和-115位的碱基被取代)，m4突变(位于-113位和-112位的碱基被取代)，m5突变(位于-106位和-105位的碱基被取代)，m6突变(位于-100位和-98位的碱基被取代)，以及m7突变(位于-94位和-93位的碱基被取代)。

因此，当要求较高启动子活性时，不优选这些碱基的取代。

本发明的启动子可用诸如基因组DNA文库筛选法进行分离。即，可用已知MEGSIN cDNA或其部分作为探针通过与人或其它动物的基因组DNA文库杂交来筛选所述启动子，或利用根据MEGSIN cDNA或MEGSIN基因组DNA而设计的引物以及用人或其它动物的基因组DNA文库为模板通过聚合酶链式反应(PCR)来筛选所述启动子。

本发明的启动子也可通过常规方法利用核酸的化学合成产生，如膦酰胺法[Mattencci，M.D.&Caruthers，M.H.，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103，3185(1981)]和亚磷酸三酯法[Hunkapiller，M.等，自然310，105(1984)]。

所述DNA片段中MEGSIN基因的启动子区和增强子区(位于内含子和3’非编码区并包括能增加该基因表达的DNA区)可通过如未审查的日本专利申请1994年181767或文献[免疫学杂志(1995)155，2477-2486，美国国家科学院学报(1995)92，3561-3565]中所述的方法获得。

通常，启动子活性的存在或强度可通过将某蛋白质的编码基因(报道基因)以能表达的方式连接在待测启动子的下游来判定，其中所述蛋白质可通过如颜色反应或发光反应，或通过用它转染宿主细胞，或通过检测所述颜色反应或发光反应来定量测定。

具体地，启动子区可通过如下方法获得，但不限于此。

1)克隆包含上述基因组DNA或基因组文库的转录调节区的DNA。

2)用限制性酶消化MEGSIN基因，以获得含有MEGSIN基因转录起始密码子并在其上游含有启动子区(2-5 kbp)的DNA。转录起始位点(+1)通过用肾小球膜细胞的poly(A)⁺RNA为模板，用选自MEGSIN基因5’位点之cDNA序列的DNA为引物，经引物延伸法测定。通过出所述碱基序列寻找转录因子结合序列而预测可能包含启动子活性的位点。

3)将2)所获DNA中除MEGSIN基因编码区以外的DNA片段亚克隆至质粒中，然后将报道基因(如氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或萤光素酶基因等)连接至该2-5 kbp DNA片段的下游，以构建一个报道质粒。类似地，对应于MEGSIN基因上游各位点的DNA片段(其中5’和3’端的各个位点已被逐一除去)通过限制性酶消化或PCR等方法制备，以便包括可能的启动子区。将报道基因连接至这些DNA片段的下游以构建报道质粒。制备一种DNA片段，该片段中一个或多个碱基已通过位点特异性诱变被适当取代、缺失、添加、和/或插入。构建一个报道质粒，其中报道基因连接在所述DNA片段下游。

4)位于MEGSIN基因上游区的启动子区可通过测定，用3)所构建之报道质粒所转化的动物细胞的报道蛋白活性(例如CAT活性或萤光素酶活性等)来鉴定。

位于3’非编码区或内含子中的增强子区可通过，例如，以MEGSINcDNA为探针筛选基因组文库，克隆MEGSIN的基因组DNA，并实施如上述启动子的例子所述的方法来鉴定。

本发明的启动子具有在肾脏(肾小球膜细胞)中高表达其下游基因的活性。因此，本发明的启动子可用于，例如，开发能控制目标基因在肾脏中的表达的载体。还可预计，本发明的启动子可在能活化本发明启动子的其它细胞(或器官)中发挥同样的效应。这类在肾脏中被特异性活化的启动子可用于，例如，构建肾脏疾病基因治疗所用的载体。

当本发明的启动子用于基因的肾脏特异性表达时，将所需在肾脏表达的基因以可以表达的方式连接在所述启动子的下游，并导入靶细胞。“以可以表达的方式连接”指基因与本发明的启动子连接后可以被表达。

将本发明的启动子及受其控制的基因导入靶细胞后，它们可整合至任何适当的载体。本发明的启动子可以单独使用或与转录调节序列如增强子和沉默子一起使用。

来自逆转录病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺伴随病毒、新培斯病毒、及痘病毒的载体可用于基因治疗。也可使用脂质体制剂如热敏感性脂质体、血液稳定性脂质体、阳离子脂质体、pH依赖性脂质体、含有病毒包膜蛋白的重排型脂质体等；具有病毒之膜融合能力的膜融合脂质体制剂如HVJ(仙台病毒)-脂质体[T. Nakagawa等，药物运送系统，11，411(1996)]，VSV(水泡性口炎病毒)-脂质体(日本专利申请1997年357506号)等。

已含有导入的载体的靶细胞可以是肾小球膜细胞、肾小管细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、以及肿瘤细胞。

为了制备本发明的启动子和含有该启动子的重组载体，并用该载体转染细胞，除了上述方法，还可按“分子克隆-实验室手册”(冷泉港实验室，纽约)所述的标准方法进行。

由于本发明的启动子中发生突变可导致严重的遗传疾病，故可将该启动子应用于基因诊断。这种基因诊断可通过对突变的检测或分析实现，对突变的检测可用诸如单链构象多形性法、DNA指纹作图法、和PCR法直接进行，对突变的分析可使用基因特异性寡核苷酸探针进行。

由于人的MEGSIN属于SERPIN超家族，故人MEGSIN的紊乱可通过促进血液凝固的能力而导致血栓栓塞，还可通过促进纤维蛋白溶解而导致出血性疾病[铃木等，蛋白质·核酸·酶，34，949-962(1989)]。这提示，能影响本发明启动子的转录活性的药物可以作用于这些疾病的发生或抑制。因此，本发明的启动子可用于筛选针对这些疾病的药物。

由于在IgA肾病患者和糖尿病肾病患者中MEGSIN的表达水平受到促进，故有人认为这种促进与肾脏疾病的发生有关。因此，可通过给与这些患者能控制本发明启动子活性的药物而抑制IgA肾病和糖尿病性肾病的发生或进展。

本发明涉及筛选能结合本发明启动子的蛋白质的方法。能结合本发明启动子的蛋白质可以是，例如，转录因子。“转录因子”指能结合本发明的启动子并正调节或负调节该启动子下游基因的表达的蛋白质。

本发明的筛选方法包括以下步骤：(a)使待检样品与含有SEQ ID NO：1所示碱基序列或其部分的DNA接触，和(b)筛选能与含有SEQ ID NO：1所示碱基序列或其部分的DNA的蛋白质。

本发明的筛选方法可通过本领域技术人员已知的方法进行[参见最新细胞工程实验方案，秀润社；Biomanual series 5转录因子研究方法，羊土社；以及DNA和Cell生物学，13，731-742(1994)]，例如，利用了亲和柱的方法，Southwestern法，指纹作图法，凝胶移位(shift)法，和一步杂合子(one-hybrid)法。

亲和柱法可如下实施：将用上述方式获得的本发明启动子固定在Sepharose或乳胶珠上以制备层析柱，将核提取物上样至该柱，洗柱，用含有与固定于柱中的DNA相同序列的DNA洗脱所结合的转录因子。

在Southwestern法中，可从来自细胞(如肾小球膜细胞)的mRNA构建cDNA，所述细胞中，结合至本发明启动子的转录因子将被表达。然后，将该cDNA整合至大肠杆菌表达载体，如λgtll，以构建cDNA文库，并合成与β-半乳糖苷酶的融合蛋白。将该融合蛋白吸附至硝酸纤维素膜上，用本发明启动子的放射性标记的DNA片段作为探针筛选能合成显示结合活性之融合蛋白的噬菌体。

在指纹作图法中，可利用放射性标记的启动子作为探针，将其与核提取物混合，用DNaseI消化，然后电泳，从而测定与蛋白质结合的DNA序列。

在凝胶移位法中，用所述启动子区中的序列构建探针，并进行放射性标记。然后将该探针与核提取物混合，经电泳测定与该探针结合之核蛋白的存在或缺乏。

在一步杂合子法中，将含有MEGSIN启动子序列至少3个拷贝之串联重复序列的序列连接至所述报道基因的上游，然后整合至酵母基因组以构建报道菌株。将上述cDNA与GAL4(与酵母DNA结合的转录活化因子)活化区(GAL4 AD)的编码区相连，构建编码该融合蛋白的活化区(AD)文库，将其导入上述报道菌株。通过AD与DNA结合蛋白形成杂合蛋白并结合于MEGSIN启动子序列上可活化转录。该效应可通过报道基因的表达检测。

附图说明

图1显示人MEGSIN基因与PAI-2基因的外显子和内含子边缘区的比较。大写字母为外显子，小写字母为内含子。

图2显示人MEGSIN基因第一个外显子(5’-UTR)的序列以及上游1431bp的序列。由5’RACE获得的克隆子的5’端用“*”表示。

图3是一张照片，显示用于测定人MEGSIN基因之转录起始位点的S1核酸酶分析的结果。

图4显示用于萤光素酶分析的载体的结构。

启动子，无；增强子，无；SV40晚期polyA信号，1772-1993；萤光素酶基因(luc+)，88-1737；上游polyA信号，4658-4811；多重克隆位点，1-58；β-内酰胺酶基因(Amp^r)，3940-3083；复制起点f1，4073-4527；来自ColE1的质粒的复制起点，2313。

图5显示使用各种细胞获得的人MEGSIN基因之转录调节区的萤光素酶分析结果。启动子相对活性用β-半乳糖苷酶标准化，如图示。

图6显示人MEGSIN基因之缺失型转录调节区的萤光素酶分析结果。启动子的相对活性用β-半乳糖苷酶标准化(所述区未缺失时的值为100)，如图示。(A)显示人表皮样肿瘤细胞系A431的结果，(B)显示人肾小球膜细胞的结果。

图7显示人MEGSIN基因之转录调节区导入位点特异性突变后的萤光素酶分析结果。下图显示所导入的突变，上图显示所述启动子已用β-半乳糖苷酶标准化(所述区未缺失时的值为100)的相对活性。下图中还显示了Oct-1、c-Myb、及AP-1的结合位点。

图8显示了用人MEGSIN基因之转录调节区(从-129至-89)进行的凝胶移位分析的结果。上图为探针的DNA序列，下图为结果。

图9是一张照片，其显示利用来自人的各种原代细胞提取物进行的人MEGSIN基因之转录调节区(从-129至-89)凝胶移位分析的结果。其中使用了图8所示的探针A和探针B。

实施本发明的最佳模式

本发明用以下实施例详细举例说明，但应理解其不限于此。

实施例1：人肾小球膜细胞的原代培养

在含有10％胎牛血清(GIBCO)、100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、及200μg/mL L-谷氨酰胺的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)上培养人肾小球膜细胞(Clontech)。

实施例2：人MEGSIN基因之转录调节区的分离

人MEGSIN基因的上游区用基因组步行(Genome Walker)试剂盒(Clontech)分离。然后，以基因组步行试剂盒的人类基因组文库为模板，用根据MEGSIN cDNA序列[Miyata，T.等，临床研究，120，828-836(1998)]设计的MEGSIN特异性引物(5’-CGTCGACGGACACGTCTCACGTCC GACG-3’/SEQ ID NO：4)、试剂盒所附的衔接子引物、以及PCR缓冲液，经嵌套式聚合酶链式反应来扩增人MEGSIN基因的上游区。用同样的方法分离外显子和内含子之间的边缘区基因组DNA。

此外，通过用TFSEARCH程序(Yutaka Akiyama：京都大学)分析TFMATRIX转录因子结合位点数据库(E.Wingender，R.Knueppel，P.Dietze，和H.Karas：GBF-Braunschweig)来搜寻转录因子的高度保守型结合位点序列。

对基因组DNA序列分析的结果显示，人MEGSIN基因有8个外显子和7个内含子，它由约20 kb的DNA编码。外显子-内含子边缘区(剪接位点)遵循GT-AG规则。结构如表1所示。表1中大写字母的序列表示外显子，小写字母表示内含子。表1编号外显子(bp) 内含子(kbp) 供体序列受体序列1 346 6.0 CTAGCgtgag tctagGCTGC2 186 0.5 ATAAGgtcag tacagTTGCT3 51 0.9 GTCAGgtaaa aacagTCAGG4 117 3.3 ATAAGgtaag tatagGACTA5 118 3.0 ACATGgtgag aaaagGCAAA6 143 3.0 CCAAGgtatg ttcagTGCTC7 147 3.5 CTGAAgtaag tacagATTGA8 1141

图1显示人MEGSIN基因与纤溶酶原活化因子2型抑制剂(PAI-2)基因的外显子-内含子边缘区的碱基序列比较，其中PAI-2[Ye，R.D.，生物化学杂志，264，5495-5502(1989)]与MEGSIN一样属于Serpin超家族。由于这两个序列均高度保守，故表明它们在系统发育中的关系十分密切。

人MEGSIN基因启动子的碱基序列(从-1431至-1)如图2及SEQ ID NO：2所示。5’非翻译区(5’-UTR)(从1至181)的碱基序列如图2及SEQ ID NO：3所示。

实施例3：荧光原位杂交(FISH)

培养人外周血淋巴细胞，用植物血凝素(PHA)刺激，然后取中期相淋巴细胞的染色体用标准方法制备载玻片样品。来自F581克隆的DNA经缺口翻译法标记地高辛配基-dUTP，用它作探针进行FISH。将标记的探针与50％甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，以及含有2x SSC的缓冲液混合，然后与上述载玻片样品杂交。将发生杂交的载玻片样品与荧光素标记的抗地高辛配基抗体(Boehringer Mannheim)一起保温。用4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI)进行复染以检测特异性杂交信号。将载玻片样品与荧光素标记的抗地高辛配基抗体(Boehringer Mannheim)以及德克萨斯红(texas red)标记的亲和素(Boehringer Mannheim)一起保温，然后通过DAPI复染来实施探针检测。结果发现，人MEGSIN基因位于染色体18q21.3。

实施例4：通过S1核酸酶保护试验鉴定转录起始位点

人MEGSIN mRNA的5′末端，利用实施例1中从人的肾小球膜细胞提取的poly(A)⁺RNA，通过S1核酸酶保护试验测定[Berk，A.J.等，美国国家科学院学报，75，1979(1978)]。

标记的探针用多重引物(multiprime)法制备。使对应于+161至+191bp的完全覆盖所述起始位点的寡核苷酸引物(5′-ttccctgtac atgcacttag gaaggtgatg a-3′/SEQ ID NO：5)与变性的MEGSIN启动子退火。然后，将所述引物与Klenow酶在含有[³²P]-dCTP的缓冲液中37℃保温15分钟。所得产物用Sephadex G-50柱(Pharmacia)纯化，然后作为放射性标记的探针使用。使该探针与来自培养的肾小球膜细胞的0.2g mRNA用S1试验试剂盒(Ambion)于55℃杂交16小时。向该DNA-RNA杂合体中加入500g含S1核酸酶的S1缓冲液，于37℃保温30分钟。终产物进行电泳并通过放射自显影分析(图3)。

结果发现，人MEGSIN基因的第一外显子为346bp，但另有三个转录起始位点。此外，以人的肾小球膜细胞总RNA为样品，用5′-RACE试剂金(宝酒造)按说明书测定了转录起始位点(图2)。

对碱基序列的分析表明，保守的启动子区，包括AP-1结合位点、cMyb结合位点、及可以作为转录调节位点的Oct-1均位于MEGSIN基因的上游区。未发现TATA盒[分子细胞生物学，1，281(1981)]或CAAT盒[科学，236，1237(1987)]的共有序列。

实施例5：对MEGSIN转录调节区的功能检查

为了检查转录调节区，制备下述载体，其中将MEGSIIN基因的上游区(KpnI-DraI片段：从-1154至+59)或其缺失突变体与萤光素酶基因连接。用该试验中所用的覆盖该区域的配对引物经聚合酶链式反应(PCR)制备各种缺失突变型DNA。具体为，用引物13(5′-aggctgtccaaaggtgcagcctgcactctg-3′/SEQ IDNO：18)作为反义引物、引物1(5′-ggtaccttctaattccaatagctttttac-3′/SEQ ID NO：6)，引物2(5′-ccagttacttggataaatgttggctgtact-3′/SEQ ID NO：7)，引物3(5′-ctcaggcagaaggaccaggcttgcagtcat-3′/SEQ ID NO：8)，引物4(5′-acatacagctcaacctcatgatgctacggc-3′/SEQ ID NO：9)，引物5(5′-cctcatgatgctacggccagaaactgaaat-3′/SEQ ID NO：10)，引物6(5′-ccaagtttcagctcctatctgaagctgctc-3′/SEQ ID NO：11)，引物7(5′-ggtccagatgaaaatctgagattggagaat-3′/SEQ ID NO：12)，引物8(5′-atgtcttgacccaggctgacagatactgtt-3′/SEQ ID NO：13)，引物9(5′-cctcctgaaatctgattcacatacaaactg-3′/SEQ ID NO：14)，引物10(5′-aatgaactacataacaaccaccttagtcag-3′/SEQ ID NO：15)，引物11(5′-tacataacaaccaccttagtcagatactac-3′/SEQ IDNO：16)，或12(5′-tactactttgaaacctggttcaaaacctaa-3′/SEQ ID NO：17)分别作为有义引物，构建含MEGSIN基因中-1079至+59、-1040至+59、-1000至+59、-940至+59、-927至+59、-669至+59、-497至+59、-258至+59、-158至+59、-128至+59、-121至+59、或-97至+59的区域的缺失突变型DNA。萤光素酶表达载体(Picca基因基本载体2：东洋Inki)(图4)的多重克隆位点用KpnI和HindIII消化，将上述PCR产物插入该载体。将该载体用LiopfectAmine(Gibco-BRL)按说明书导入细胞

首先，将含有不带缺失的MEGSIN基因上游区(从-1154至+59)的载体转化至各种细胞，检测转录活性在不同细胞类型中的特异性(图5)。载体于37℃转染5小时[Derijard，B.等，细胞，76，1025-1037(1994)]。于37℃培养2天后，除去培养基，细胞用PBS洗3次。用细胞裂解缓冲液裂解细胞得到裂解物。将其离心，除去细胞沉淀。用Lumat LB9507发光仪(EG&G Berthold)直接检测荧光量，将其除以(dividing)570nm波长下β-半乳糖苷酶发射光的量[Herbome，P.等，细胞，39，653-662(1984)]得到萤光素酶相对活性。

所用细胞为实施例1所述的培养的人肾小球膜细胞(Clontech)、人真皮成纤维细胞(HDF：宝酒造)、以及人的肾皮质上皮细胞(HRCE：宝酒造)。结果仅在培养的人肾小球膜细胞中发现萤光素酶活性(图5)。这表明，所用转录调节区对肾小球膜细胞有特异性。

第二，含有缺失型突变的各种DNA用上述方式处理，将它们整合至载体，再转染至人上皮样癌细胞株A431，或实施例1所述的培养的人肾小球膜细胞(Clontech)。然后测定萤光素酶活性。结果见图6。该图显示了以MEGSIN基因上游区无缺失时的值为100％时的相对值。

当-1154bp至-941bp的区缺失时，转录活性降低至约60％，因此表明正调节转录的序列位于该区中。当至-159bp的区缺失时，转录活性几乎没有降低。但缺失-158bp至-121bp的区时，转录活性比该区域完整时下降了5％当缺失-128bp至-121bp的区时，转录活性大大下降，可以认为-128bp至-121bp的区域对转录的正调节十分重要。

由于-129至-90的区域含有AP-1(活化蛋白1)结合序列(cttagtcaga)[Lee，W.等，自然，325，368-372(1987)，Foletta，V.C.等，J.Leuk.Biol.,63，139-152(1998)]，c-Myb结合序列(aacaaccacc)(SEQ ID NO：1中13-22位)，及Oct-1结合序列(ctacataacaac)(SEQ ID NO：1中7-19位)[Rosenfeld，M.G.等，基因发展(Genes Dev.)，5,897-907(1991)]，因此提示转录调节位点存在于该区域中。

为了进一步测定该区域是否涉及MEGSIN基因的转录活化，在该区域的各个位点导入突变，测定对转录活性的影响。具体为，用速变(Quick Change)定点诱变试剂盒(Stratagene)按说明书构建各种突变体，来检测特定核苷酸发生突变后转录调节区能力的改变，所述突变体中-128至-127位已突变为gg(ml)，-120至-117位已突变为cccc(m2)，-116至-115位已突变为gg(m3)，-113至-112位已突变为gg(m4)，-106至-105位已突变为gg(m5)，-100至-98位已突变为ggc(m6)，-94至-93位已突变为gg(m7)。

这些突变体的构建可通过实施双脱氧核苷酸测序而直接证实。将这些突变体整合至载体，用上述方式获得萤光素酶活性。结果发现m3-m7的萤光素酶活大大下降(图7)。该图显示了以MEGSIN基因上游区无缺失时的值为100％时的相对值。

实施例6：寻找启动子结合蛋白

由于实施例3显示-128位(3′端)的下游区具有正调节转录的活性，故用两种探针[探针A(5′-GAATGAACTACATAACAACCACC-3′/SEQ ID NO：19；-129至-107的区)及探针B(5′-AACCACCTTAGTCAGATACTACTTT-3′/SEQID NO：20；-113至-89的区)]通过凝胶移位试验检测了与该区域结合的蛋白(转录因子)。

每种探针的末端用标准方法标记。然后，用Dignam等[Dignan，J.等，核酸研究，11，1475-1489(1983)]的方法制备实施例1之肾小球膜细胞的核提取物，然后在含10％甘油、5mM氯化镁、1mM EDTA、25mM二硫苏糖醇、50mM氯化钾、10mM Hepes-KOH、3μg poly(dI-dC)、7μL核提取物、及标记探针的反应混合液中于室温进行30分钟的DNA-蛋白结合反应。反应后，进行电泳和放射自显影。结果发现每一探针均有DNA-蛋白复合物的移动带，并鉴定出两种转录因子(图8)。

为了调查MEGSIN的肾小球膜细胞特异性表达是否受识别该区域的转录因子量的影响，用实施例1所述的培养的人肾小球膜细胞(Clontech)、人平滑肌细胞(HSMC：Takara)、人真皮成纤维细胞(HDF：Takara)、以及人的肾皮质上皮细胞(HRCE：Takara)进行凝胶移位试验以便比较。结果发现，在培养的人肾小球膜细胞中，针对所有探针的DNA-蛋白复合物的量较其它细胞的大(图9)。这表明，MEGSIN的肾小球膜细胞特异性表达受识别该区域的转录因子的影响。

产业应用性

本发明提供了MEGSIN基因的启动子，其在肾小球膜细胞中特异性表达。本发明的启动子可用于该基因在肾小球膜细胞中的特异性表达，还可用于例如，各种肾脏疾病的基因治疗。它还可用于筛选与该启动子结合的蛋白如转录因子。

Claims

1.一种DNA，其含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分并具有启动子活性。

2.一种载体，其含有权利要求1的DNA。

3.权利要求2的载体，其中已将一个外源基因以能表达的方式连接在权利要求1之DNA的下游。

4.一种细胞，其用权利要求3的载体转染。

5.一种筛选与DNA结合的蛋白的方法，所述DNA含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分，该方法包括以下步骤：

(a)使待测样品与含有SEQ ID NO：1之碱基序列或其部分的DNA接触，和

(b)筛选能与含有SEQ ID NO：1之碱基序列或其部分的DNA结合的蛋白。

6.一种蛋白，其可用权利要求5的方法分离。

7.权利要求6的蛋白，其中所述蛋白为转录因子。