KR20010103752A - 멕신 프로모터 - Google Patents

Abstract

MEGSIN 유전자의 상류 약 1.5 kb를 포함하는 게놈 DNA 영역을 단리하여, 그 염기서열을 결정했다. 또한, 상기 게놈 DNA 영역에 있어서, 전사를 정으로 제어하는 2개의 제어서열을 동정했다. 더욱이, 이들 2개의 제어서열 중 3'측에 위치하는 프로모터영역에 대해서, 부위 특이적 변이도입법에 의해 염기치환을 행하고, 그 프로모터활성에 중요한 역할을 담당하는 염기서열을 특정하는 것에 성공했다.

Description

멕신 프로모터{Megsin promoter}

체내의 60조개의 여러 가지 다양한 세포가, 본질적으로 동일한 게놈 DNA를 가지고 있다. 정상적인 생리학적 기능을 위해, 이들 유전자의 발현은 세포계통 및 세포가 수용하는 시그날에 의해 엄밀하게 제어되고 있다. 따라서, 개개의 세포형에서 특이적으로 발현하고 있는 유전자를 해명하는 것은 지극히 중요하다.

메산기움(mesangium)은, 신장사구체의 모세관계제(capillary loop)의 소엽중심부에 위치하여, 각 소엽을 연결하고 있는 중심이 되는 조직이다. 메산기움은 사구체 기저막에 덮여 있고, 모세관강(毛細管腔)과는 내피세포에 의해 격리되어 있는 세포(메산기움세포: mesangial cell)와 3층으로 된 사구체 기저막 중의 내투명층과 연속해 있는 무형물질(메산기움기질: mesangial matrix)로 구성되어 있다.

메산기움세포는, 신장사구체의 구조 및 기능유지에 중심적인 역할을 하고 있는 것이 알려져 있고, 또한, 사구체 신장염이나 사구체 경화증 등의 사구체 질환의 발증에 있어서의 주요한 요인인 것으로 생각되고 있다. 그리고, 메산기움세포는, 각종 신장염에 있어서 장애의 표적이 되고 있다. 예를 들면, 메산기움세포의 증식이나 세포외 메산기움기질의 축적은, 말기 신부전의 2대 원인인 만성 사구체 신장염 및 당뇨병성 신장병증(nephropathy)과 같은 여러 사구체 장애를 갖는 환자에게 사구체 경화증을 초래하는 최초의 과정으로 되어 있다[D.Schlondorff, Kindney Int., 49, 1583-1585(1996); R.B.Sterzel et al., Glomerular mesangial cells. Immunologic Renal Diseases, pp595-626(1997)]. 따라서, 메산기움세포에서 특이적으로 발현하고 있는 유전자를 발견하여, 그 발현의 조절기구를 명확하게 하는 것은, 메산기움세포의 생물학적 성질의 해명, 메산기움세포에 관련된 질환의 원인구명, 더 나아가서는 메산기움세포에 관련된 질병의 치료, 진단 등에 유효하다.

따라서, 본 발명자는 대규모 DNA 서열결정 및 데이터 베이스 해석에 의해, 메산기움세포에서 특히 강하게 발현하는 유전자로서, MEGSIN이라 명명한 유전자를 단리하여, 그 전체 염기서열을 결정했다. 그리고, MEGSIN의 전장 cDNA 클론이 코드하는 380개의 아미노산으로 된 신규 단백질(인간 MEGSIN)의 서열을 결정했다. 또한, Swiss Prot 데이터 베이스를 사용하여 FASTA 프로그램에 의한 아미노산 상동성 검색을 행한 바, 인간 MEGSIN이, SERPIN(세린프로테아제 인히비터)슈퍼 패밀리[R.Carrell et al., Trends Biochem.Sci., 10, 20(1985);R.Carrell et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52, 527(1987); E.K.O.Kruithof et al., Blood, 86, 4007(1995);J.Potempa et al., J.Biol.Chem, 269, 15957(1994); E.Remold-O'Donnell, FEBS Lett., 315, 105(1993)]에 속하는 단백질인 것을 발견했다[T.Miyata et al., J.Clin.Invest., 120, 828-836(1998)].

인간 MEGSIN은, 인간 섬유아세포, 평활근세포, 내피세포, 케라티노사이트에서는 발현이 약하고, 메산기움세포에서 특히 강하게 발현하고 있다(즉, 인간 MEGSIN 유전자의 발현은 메산기움세포에 특이성을 갖는다). 또한, IgA 신장병증환자 및 당뇨병성 신장병증환자와 정상인에서 신장조직중의 MEGSIN의 발현량을 비교하면, IgA 신장병증환자나 당뇨병성 신장병증환자에 있어서 MEGSIN이 유의하게 발현량이 많다[D.Suzuki et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2606-2613(1999)]. 또한, 래트를 사용한 메산기움 증식성 사구체 신장염 모델에 있어서, 발현량의 상승이 인정되었다.

이와 같이, MEGSIN 유전자의 발현은, 신장질환에 깊이 관여하고 있을 가능성이 있는 것으로부터, MEGSIN 유전자의 발현 제어기구의 실태를 명확하게 하여, 인간 MEGSIN의 생체내에 있어서의 기능의 해명이나 그의 변이에 의해 일어나는 유전성 질환 등으로의 진단, 치료에 유용한 프로모터의 제공, 또는 신장 메산기움세포에 특이적으로 발현하는 프로모터를 제공하는 것이 요망되고 있었다.

한편, 인간 MEGSIN이 속하는 SERPIN 슈퍼 패밀리는, 1차구조상 상호 높은 상동성을 갖는 것으로부터, 진화상 공통의 선조 단백질로부터 분기한(derived) 것으로 생각되고 있다. 즉, 아미노산서열상의 변이 아미노산수[K.Suzuki et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso, 34, 949-962(1989)]나 염색체 유전자구조를 토대로 제작된 진화계통수[J.J.Bao et al., Biochem., 26, 7755(1987)]의 해석결과, SERPIN 슈퍼 패밀리는, 여러 고등 척추동물과 함께 500만년 이상에 걸쳐 진화해 온 것이 나타내어져 있다. 그러나, MEGSIN 유전자는, 사구체 메산기움세포에 특이적으로 발현한다고 하는 점에서 지극히 특징적이다.

또한 최근, 이온채널이나 수송에 관련된 유전자가, 신장에 특이적으로 발현하는 것이 보고되어 있다[S.J.Lolait et al., Nature, 357, 336-339(1992); Y.Kanai et al., J.Clin.Invest., 93, 397-404(1994);S.Uchida et al., J.Biol.Chem., 268, 3821-3824(1993);S.Adachi et al., J.Biol.Chem., 269, 17677-17683(1994);K.Fushimi et al., Nature, 361, 549-552(1993);G.Gamba et al., J.Biol.Chem., 269, 17713-17722(1994)].

그러나, 이들 유전자는, 뇨세관 상피세포에 국재하고 있어, 사구체 메산기움세포에서는 발현하지 않는다. 따라서, MEGSIN 유전자의 프로모터 및 전사인자를 해명함으로써, 세포형 의존적인 유전자 발현기구에 관한 중요한 정보를 얻을 수 있다. 더욱이 이와 같이 하여 얻어진 정보는, 분자 유전학이나 유전자도입에 있어서의 표적 세포에도 응용할 수 있다.

발명의 개시

본 발명은 MEGSIN 유전자의 프로모터 및 그의 이용을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자 등은 MEGSIN 유전자의 발현 조절기구를 해명하기 위해, MEGSIN 유전자 보다 상류(5'측) 약 1.5 kb를 포함하는 게놈 DNA의 염기서열을 결정했다. S1 뉴클레아제 프로텍션 분석결과, MEGSIN mRNA의 전사개시점은 4종류 존재하고 있는 것이 판명되었다. 전사개시점의 상류에는, AP1 결합부위, cMyb 결합부위 및 Oct-1을 포함하는 전사 제어부위로 될 수 있는 보존된 전사 제어서열이 존재하는 것이판명되었다. 이들의 전사 제어서열을 포함하는 영역을 여러 가지로 다양하게 결실시킨 DNA의 3'측에 루시페라아제 유전자를 연결한 벡터를 제작하고, 세포에 트랜스펙션하여 루시페라아제 활성에 의한 전사 제어영역의 결정을 행한 바, 전사를 정(正)으로 제어하는 2개의 제어서열을 동정했다. 그들 중 3'측에 위치하는 프로모터영역에 대해서, 부위특이적 변이도입법에 의해 염기치환을 행하고, 그 전사 제어활성에 대해 상세한 해석을 행했다. 그 결과, 본 발명자 등은, 전사제어에 중요한 역할을 담당하는 DNA의 염기서열을 특정하는 것에 성공했다.

따라서, 본 발명은, MEGSIN 유전자의 프로모터 및 그의 이용에 관한 것이고, 보다 구체적으로는,

(1) 서열번호: 1의 염기서열 또는 그의 일부를 포함하고, 프로모터 활성을 갖는 DNA,

(2) (1)의 DNA를 포함하는 벡터,

(3) (2)에 있어서, (1)의 DNA의 하류에 이종 유전자가 발현 가능한 상태에서 결합하고 있는 벡터,

(4) (3)의 벡터가 도입된 세포,

(5) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 결합하는 단백질의 스크리닝방법으로서,

(a) 검사대상 시료를 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 접촉시키는 공정 및

(b) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 결합하는 활성을 갖는 단백질을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(6) (5)의 방법에 의해 단리될 수 있는 단백질,

(7) (6)에 있어서, 전사인자인 단백질,

에 관한 것이다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「프로모터」란 전사 개시부위의 근방에 존재하여, 유전자의 발현을 제어하는 DNA 영역을 가리킨다. 또한, 「프로모터 활성」이란, 그의 하류에 존재하는 유전자의 발현을 제어하는 프로모터의 활성을 가리킨다.

본 발명은, MEGSIN 유전자의 프로모터를 제공한다. 실시예 3에 나타내는 바와 같이, MEGSIN 유전자의 5'상류역에 있어서, -128번 위치 보다 하류의 염기의 결실이나 치환의 대부분이 그 프로모터 활성의 현저한 저하를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 프로모터는, -128번 위치 보다 하류의 MEGSIN 유전자의 5'상류역(서열번호: 1)의 적어도 일부를 포함한다.

본 발명의 프로모터로서는, -128번 위치 보다 하류의 영역(서열번호: 1)의 적어도 일부를 포함하고, 또한 프로모터 활성을 갖는 한, 서열번호: 1에 나타내는 염기서열에 있어서 염기가 치환된 서열을 가지고 있더라도 좋다. 그러나, 도7에 나타내는 바와 같이, -128번 위치 보다 하류의 영역에 있어서의, m1 변이(-128번 위치 및 -127번 위치 염기의 치환), m2 변이(-120번 위치, -118번 위치 및 -117번 위치 염기의 치환), m3 변이(-116번 위치 및 -115번 위치 염기의 치환), m4 변이(-113번 위치 및 -112번 위치 염기의 치환), m5 변이(-106번 위치 및 -105번 위치 염기의 치환), m6 변이(-100번 위치 및 -98번 위치 염기의 치환) 및 m7 변이(-94번위치 및 -93번 위치 염기의 치환)는 그의 프로모터 활성의 저하를 초래했다.

따라서, 본 발명의 프로모터로서는, 높은 프로모터 활성을 필요로 하는 경우, 이들 염기가 치환되어 있는 것은 바람직하지 않다.

본 발명의 프로모터는, 예를 들면, 게놈 DNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리할 수 있다. 즉, 이미 판명되어 있는 MEGSIN cDNA 또는 그의 일부를 프로브로서 인간이나 그 밖의 동물의 게놈 DNA 라이브러리를 하이브리다이제이션 스크리닝함으로써, 또한, MEGSIN cDNA 서열 또는 MEGSIN 게놈 DNA 서열의 정보를 토대로 작성한 프라이머를 이용하여 인간이나 그 밖의 동물의 게놈 DNA 라이브러리를 주형으로 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행함으로써 단리할 수 있다.

또한, 본 발명의 프로모터는, 예를 들면 포스포아미다이드법(phosphoamidide method)[Mattencci, M.D. & Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc. 103, 3185(1981)], 포스파이트 ·트리에스테르법[Hunkapiller, M. et al., Nature 310, 105(1984)] 등의 핵산의 화학합성을 사용하는 일반적인 방법에 따라 제조할 수도 있다.

DNA 단편중에 존재하는 MEGSIN 유전자의 프로모터영역 및 엔핸서영역(인트론 또는 3'비번역영역에 존재하는 유전자의 발현을 증강하는 DNA 영역을 포함한다)은, 예를 들면, 특개평6-181767호 공보나 문헌(The Journal of Immunology(1995) 155, 2477-2486, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995) 92, 3561-3565)과 동일한 방법으로 취득하는 것이 가능하다.

일반적으로는, 발광반응이나 정색반응(color reaction) 등에 의해 정량을 용이하게 행할 수 있는 단백질을 코드하는 유전자(리포터 유전자)를 프로모터 후보영역의 하류에 발현 가능한 상태에서 결합하고, 이를 숙주세포에 도입하여 정색반응이나 발광을 검출함으로써, 프로모터 활성의 유무나 프로모터 활성의 강약을 판정할 수 있다.

구체적으로는, 프로모터영역은 이것에 제한되지 않지만, 아래의 방법에 의해 취득할 수 있다.

1) 상기와 같이 게놈 DNA 또는 게놈 라이브러리로부터 전사 제어영역을 포함하는 DNA를 클로닝한다.

2) 제한효소 소화하여 MEGSIN 유전자의 번역개시 코돈을 포함하는 그 상류부분의 프로모터영역을 포함하는 DNA(2~5 kbp)를 얻어, 염기서열을 결정한다. 메산기움세포 등으로부터 제작한 poly(A)⁺RNA를 주형으로 하고, MEGSIN 유전자의 5'말단측 cDNA 서열로부터 선택한 프라이머 DNA를 사용한 프라이머 신장법에 의해, 전사개시점(+1)을 결정한다. 염기서열로부터 전사인자 결합서열을 검색하여, 프로모터 활성을 가질 가능성이 있는 개소를 예상한다.

3) 2)에서 얻은 DNA로부터 MEGSIN 유전자의 코드영역을 제외한 DNA 단편을 플라스미드상에 서브클로닝하고, 이 2~5 kbp DNA 단편의 하류에, 리포터 유전자(예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 전위효소(CAT)유전자, 또는 루시페라아제 유전자 등)를 연결한 리포터 플라스미드를 구축한다. 마찬가지로, 프로모터영역의 가능성이 있는 각 개소를 포함하는 형태로, 제한효소 소화에 의해, 또는 PCR 등에 의해,5'말단측 및 3'말단측을 순차적으로 깎은 MEGSIN 유전자 상류부분의 여러 부위에 해당하는 DNA 단편을 작성하고, 이들 하류에, 리포터 유전자를 연결한 리포터 플라스미드를 구축한다. 또한, 부위특이적 변이도입법에 의해 적절히, 1개 또는 복수 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행하여 변이를 도입한 DNA 단편을 작성하고, 이들 하류에 리포터 유전자를 연결한 리포터 플라스미드를 구축한다.

4) 3)에서 제작한 리포터 플라스미드로 형질전환한 동물세포의 리포터 활성(예를 들면, CAT 활성 또는 루시페라아제 활성 등)을 측정함으로써, MEGSIN 유전자 상류부분에 존재하는 프로모터영역을 동정한다.

또한, 3'비코드영역이나 인트론 중에 있어서의 엔핸서영역은, 예를 들면, MEGSIN cDNA 등을 프로브로 한 게놈 라이브러리의 스크리닝에 의해, 먼저 MEGSIN의 게놈 유전자를 클로닝하고, 이어서, 상류 프로모터에 관한 방법과 동일한 실험을 행함으로써 동정할 수 있다.

본 발명의 프로모터는, 그 하류에 결합한 유전자를 신장(메산기움세포)에서 높은 비율로 발현시키는 활성을 갖는다. 이 때문에 본 발명의 프로모터는, 예를 들면, 신장에서 목적으로 하는 유전자의 발현을 임의로 제어할 수 있는 벡터의 개발에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로모터를 활성화 하는 전사인자를 갖는 그 밖의 세포(장기)에 있어서도 동일한 효과를 기대할 수 있다. 이와 같은 신장 특이적으로 활성화 하는 프로모터는, 예를 들면, 신장질환의 유전자치료를 위한 벡터제작에 사용할 수 있다.

본 발명의 프로모터를 신장 특이적인 유전자의 발현에 이용하는 경우에는,본 발명의 프로모터의 하류에 신장에 있어서 발현시키고 싶은 목적으로 하는 유전자를 발현 가능한 상태에서 결합하고, 이를 표적 세포에 도입한다. 여기에서 「발현 가능한 상태에서 결합한다」라는 것은, 유전자의 전사가 가능해지도록, 본 발명의 프로모터와 상기 유전자가 결합하고 있는 것을 가리킨다.

표적 세포에 도입하는 경우, 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터에 의해 제어되는 유전자는, 적당한 벡터에 도입되어 있더라도 좋다. 또한, 본 발명의 프로모터는, 단독으로 사용하더라도, 엔핸서, 사이렌서(silencer) 등의 전사 제어서열을 조합시켜 사용하더라도 좋다.

유전자치료를 목적으로 하는 경우, 사용되는 벡터로서는, 예를 들면, 레트로 바이러스(retrovirus), 단순성 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus), 에프스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 소 파필로마 바이러스(bovine papillomavirus), 아데노 바이러스(adenovirus), 아데노 수반 바이러스(adeno associated virus), 신드비스 바이러스(sindbis virus), 폭스 바이러스(poxvirus) 등에 유래하는 벡터를 들 수 있다. 또한, 온도 감수성 리포솜, 혈중 안정성 리포솜, 카티오닉 리포솜(cationic liposome), pH 감수성 리포솜 및 바이러스의 엔밸럽 단백질을 함입한 재구성 리포솜 등의 리포솜제제, HVJ(센다이 바이러스)-리포솜[T. Nakagawa et al., Drug Delivery System, 11, 411 (1996)], VSV(수포성 구내염 바이러스)-리포솜(특원평9-357506호) 등의 바이러스의 막융합능을 부여한 막융합 리포솜제제 등을 사용할 수도 있다.

이들 벡터를 도입하는 대상이 되는 세포로서는, 예를 들면, 메산기움세포,뇨세관 세포, 마크로파지, 림프구, 내피세포, 종양세포 등을 들 수 있다.

또한, 상술한 것 외에, 본 발명의 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터, 상기 벡터의 세포로의 도입 등의 일반적인 유전자조작은, 예를 들면, 「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. )에 기재된 일반적인 방법에 의해 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 프로모터의 변이는, 중독(重篤) 유전질환을 일으키는 것으로 생각되어지는 것으로부터, 상기 프로모터는, 유전자 진단으로의 응용도 기대할 수 있다. 이 유전자 진단은, 예를 들면 단쇄고차(單鎖高次)구조 다형분석, DNA 핑거프린트법, PCR법을 사용한 다이렉트 시퀀스, 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 변이해석법 등의 수법을 사용하여 유전자의 변이를 검출함으로써 달성된다.

또 한편, 인간 MEGSIN은 SERPIN 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질인 것으로부터, 인간 MEGSIN의 이상증은, 혈액응고능의 항진에 의한 혈전색전증(血栓塞栓症) 또는 선용능(線溶能)의 항진에 의한 출혈증을 초래할 우려도 있다(스즈키 등, 단백질 ·핵산 ·효소, 34권, 949-962(1989)). 이것은, 본 발명의 프로모터의 전사활성에 영향을 주는 약제가 이들 질환의 발증이나 억제에 작용할 가능성이 있는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명의 프로모터는, 이들 질환에 관련된 약제의 스크리닝에 이용할 수 있는 가능성이 생각된다.

또한, MEGSIN 발현량이 IgA 신장병증환자나 당뇨병성 신장병증환자에 있어서 항진하고 있는 것으로부터, 신장질환의 발증에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 프로모터의 활성을 제어하는 약제를 상기 환자에게 투여함으로써, IgA 신장병증이나 당뇨병성 신장병증의 발증이나 진전을 억제하는 것도 가능하다고 생각된다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 프로모터에 결합하는 단밸질의 스크리닝방법에 관한 것이다. 본 발명의 프로모터에 결합하는 단백질로서는, 예를 들면, 전사인자를 들 수 있다. 「전사인자」란, 본 발명의 프로모터에 결합하여, 상기 프로모터 하류의 유전자의 발현을 정(正) 또는 부(負)로 조절하는 단백질을 가리킨다.

본 발명의 스크리닝방법은, (a) 검사대상 시료를 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 접촉시키는 공정 및 (b) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부와 결합하는 단백질을 선택하는 공정을 포함한다.

본 발명의 스크리닝은, 당업자에게 공지의 방법(「신세포공학실험 프로토콜(슈쥰샤)」, 「바이오 매뉴얼시리즈5 전사인자 연구법(요도샤)」,「DNA & Cell Biology, 13, 731-742(1994)」참조), 예를 들면, 친화성 컬럼(affinity column)을 사용한 방법, 사우스 웨스턴법(south western method), 풋 프린팅법(foot printing method), 겔 시프트법(gel shift method), 원-하이브리드법(one-hybrid method) 등에 의해 행할 수 있다.

친화성 컬럼법을 사용하는 경우는, 상술한 벙법으로 얻은, 본 발명의 프로모터를 세파로오스(sepharose) 또는 라텍스 비드(latex bead)에 고정화 한 컬럼에 핵추출액을 걸어 컬럼을 세척 후, 컬럼에 고정화 한 서열과 동일한 서열을 갖는 DNA를 사용하여, 결합한 전사인자를 용출한다.

또한, 사우스 웨스턴법을 사용하는 경우는, 예를 들면 본 발명의 프로모터에 결합하는 전사인자가 발현하고 있는 것으로 예상되는 세포(예를 들면 메산기움세포 등)유래의 mRNA로부터 cDNA를 조제한다. 그 후, 대장균의 발현벡터, 예를 들면 λgt11에 상기 cDNA를 함입한 cDNA 라이브러리를 제작하여, β-갈락토시다아제와의 융합단백질을 합성시키고, 니트로셀룰로오스막에 상기 융합단백질을 흡착시켜, 방사성 동위원소로 표지된 본 발명의 프로모터를 프로브로 하여, 결합활성을 갖는 융합단백질을 합성하는 파지를 선택한다.

풋 프린트법을 사용하는 경우는, 방사성 동위원소로 표지한 프로모터를 프로브로 하여, 이를 세포핵 추출액과 반응 후, DNase I로 소화하고 전기영동함으로써 단백질 결합 DNA 서열을 결정할 수 있다.

겔 시프트법을 사용하는 경우는, 먼저 프로모터영역 내의 임의의 서열로부터 프로브를 제작하여, 방사성 동위원소로 표지한다. 다음에, 이 표지 프로브와 세포핵 추출액을 반응시키고 전기영동을 행하여, 프로브에 결합하는 핵단백질의 유무를 확인할 수 있다.

원-하이브리드법을 사용하는 경우는, 예를 들면, 먼저 MEGSIN 프로모터 서열을 적어도 3카피, 탄뎀(tandem)하게 늘어선 서열을 리포터 유전자의 상류에 삽입하고, 효모 게놈내에 함입함으로써, 리포터주를 작성한다. 다음에, 상기의 cDNA와 GAL4(효모의 DNA 결합성 전사활성화 인자)의 활성화 도메인(GAL4 AD)의 코드영역을 연결시키고, 이들 융합단백질을 코드하는 활성화 도메인(AD)라이브러리를 제작하여, 이를 상술의 리포터주에 도입한다. AD와 DNA 결합 단백질과의 하이브리드 단백질이 MEGSIN 프로모터 서열로 결합함으로써, 전사가 활성화되어 그 효과를 리포터 유전자의 발현을 통해 검출할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도1은, 인간 MEGSIN 유전자와 PAI-2 유전자의, 엑손-인트론 경계영역의 비교를 나타내는 도이다. 대문자는 엑손, 소문자는 인트론을 나타낸다.

도2는, 인간 MEGSIN 유전자의 제1엑손(5'-UTR) 및 그의 상류 1431 bp의 서열을 나타내는 도이다. 5'-RACE에 의해 얻어진 클론의 5'단을 「*」로 나타냈다.

도3은, 인간 MEGSIN 유전자의 전사 개시부위를 결정하기 위한 S1 뉴클레아제 분석결과를 나타내는 사진이다.

도4는, 루시페라아제 분석에 사용된 벡터의 구조를 나타낸 도이다.

프로모터: 없음, 엔핸서: 없음, SV40 후기 폴리(A)시그날: 1772-1993, 루시페라아제 유전자(luc+): 88-1737, 상류의 폴리(A)시그날: 4658-4811, 멀티플 클로닝부위: 1-58, β-락타마제(lactamase) 유전자(Amp^r): 3940-3083, f1 복제개시점: 4073-4527, ColEl-유래의 플라스미드 복제개시점: 2313

도5는, 여러 세포를 사용하여, 인간 MEGSIN 유전자 전사제어영역에 의한 루시페라아제 분석을 행한 결과를 나타내는 도이다. β-갈락토시다아제 활성으로 표준화한 프로모터의 상대활성을 나타낸다.

도6은, 결실시킨 인간 MEGSIN 유전자 전사제어영역에 의한 루시페라아제 분석결과를 나타내는 도이다. β-갈락토시다아제 활성으로 표준화 한 프로모터의 상대활성(결실시키지 않은 경우를 100으로 한 값)을 나타낸다. (A)는 인간류 표피 암세포주 A431에 있어서의 결과를, (B)는 인간 메산기움세포에 있어서의 결과를 니티낸다.

도7은, 부위특이적 변이를 도입한 인간 MEGSIN 유전자 전사제어영역에 의한 루시페라아제 분석결과를 나타내는 도이다. 하단은 도입한 변이를, 상단은 β-갈락토시다아제 활성으로 표준화 한 프로모터의 상대활성(결실시키지 않은 경우를 100으로 한 값)을 나타낸다. 또한, 하단에 Oct-1, c-Myb 및 AP-1의 결합부위도 나타냈다.

도8은, 인간 MEGSIN 유전자 전사제어영역(-129∼-89)을 사용한 겔 시프트 분석결과를 나타내는 도이다. 상단에 사용한 프로브 DNA 서열, 하단에 그 결과를 나타낸다.

도9는, 여러 가지 인간 프라이머리 세포추출물을 사용한, 인간 MEGSIN 유전자 전사제어영역(-129∼-89)의 DNA의 겔 시프트 분석결과를 나타내는 사진이다. 도8에 나타낸 프로브A 및 프로브B를 사용했다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인간 메산기움세포의 초대배양

인간 메산기움세포(Clontech사)는, 10% 소태아혈청(GIBCO사), 100 IU/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신 및 200 ㎍/mL의 L-글루타민을 함유하는 달벡크개변 이글배지(DMEM)에서 배양했다.

[실시예 2] 인간 MEGSIN 유전자의 전사제어영역의 단리

인간 MEGSIN 유전자의 상류영역은, Genome Walker Kits(Clontech사)를 사용하여 단리했다. 즉, Genome Walker Kits의 인간 게놈라이브러리를 주형으로서, MEGSIN의 cDNA 서열[Miyata,T. et al., J.Clin.Invest., 120, 828-836 (1998)]로부터 디자인된 MEGSIN 특이적 프라이머(5'-CGTCGACGGACACGTCTCACGTCCGACG-3'/서열번호: 4) 및 키트에 첨부되어 있는 어댑터 프라이머(adapter primer)와 PCR 버퍼를 사용한 네스티드 폴리머라제 연쇄반응(nested Polymerase Chain Reaction)에 의해, 인간 MEGSIN 유전자의 상류영역을 증폭했다. 또한, 동일하게 하여 엑손-인트론 경계영역의 게놈 DNA도 단리했다.

또한, TFSEARCH 프로그램(Yutaka Akiyama : 교토대학)을 사용한 TFMATRIX 전사인자 결합부위 데이터 베이스(E.Wingender, R.Knueppel, P.Dietze 및 H.Karas : GBF-Braunschweig)의 해석에 의해, 고도로 보존되어 있는 전사인자 결합부위서열을 검색했다.

게놈 DNA 서열의 해석 결과, 인간 MEGSIN 유전자는 8개의 엑손과 7개의 인트론을 갖고, 약 20 kb에 걸쳐 코드되어 있는 것이 판명되었다. 또한, 엑손-인트론 경계부위(스프라이스 부위)는, GT-AG칙을 따르고 있었다. 그 구조를 표1에 나타낸다. 표의 서열중, 대문자는 엑손, 소문자는 인트론을 나타낸다.

표1

인간 MEGSIN 유전자의 엑손-인트론 경계영역의 염기서열과, MEGSIN과 동일한 Serpin 슈퍼 패밀리에 속하는 플라스미노겐 엑티베이터 인히비터 type2(PAI-2) [Ye,R.D.,J.Biol.Chem., 264, 5495-5502(1989)]유전자의 그것과의 비교를 도1에 나타낸다. 양자의 서열은 고도로 보존되어 있어, 계통적으로 가까운 관계에 있는 것이 판명되었다.

결정한 인간 MEGSIN 유전자의 프로모터영역(-1431∼-1)의 염기서열을 도2 및 서열번호: 2에, 5'비번역영역(5'-UTR)(1∼181)의 염기서열을 도2 및 서열번호: 3에 나타낸다.

[실시예 3] 형광 in situ 하이브리다이제이션(FISH)

피토헤마글루티닌(PHA)으로 자극한 인간 말초혈 배양 림프구로부터 분열 중기군의 염색체 표본 슬라이드를 일반적인 방법에 의해 제작했다. FISH용 프로브는, F581 클론 유래의 DNA를 닉 트랜슬레이션법(nick traslation method)에 의해 디곡시게닌(digoxigenin)-dUTP로 표지한 것을 사용했다. 상기 슬라이드 표본에, 표지화 프로브를 50%의 포름아미드, 10%의 덱스트란황산 및 2×SSC를 포함하는 버퍼와 혼합하여, 하이브리다이즈했다. 하이브리다이즈된 슬라이드 표본을 플루오레세인(fluorescein) 표지 항디곡시게닌항체(Boehringer Mannheim사)와 함께 인큐베이션하여, 4',6'-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride(DAPI)를 사용한 대비염색을 행함으로써 특이적인 하이브리다이제이션 시그날을 검출했다. 2색염색에 의한 프로브의 검출은, 표본 슬라이드를 플루오레세인 표지 항디곡시게닌항체 (Boehringer Mannheim사) 및 텍사스 레드 표지 아비딘(Boehringer Mannheim사)과 함께 인큐베이트하여, DAPI를 사용한 대비염색에 의해 행했다. 그 결과, 인간 MEGSIN 유전자는, 염색체 18q21.3에 존재하고 있었다.

[실시예 4] S1 뉴클레아제 프로텍션 분석에 의한 전사개시점의 동정

MEGSIN mRNA의 5'말단은, 실시예 1에서 조제한 인간 메산기움세포로부터 추출한 poly(A)⁺RNA를 사용하여, S1 뉴클레아제 프로텍션 분석법[Berk,A.J.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 75, 1979 (1978)]에 의해 결정했다.

먼저, 멀티프라임법에 의해, 표지 DNA 프로브를 조제했다. 즉, 개시점의 전후를 충분히 커버하는, bp +161∼+191에 대응하는 올리고뉴클레오티드프라이머(5'-ttccctgtac atgcacttag gaaggtgatg a-3'/서열번호: 5)를 변성한 MEGSIN 프로모터에어닐링시켰다. 다음에 프라이머를 [³²P]-dCTP를 함유하는 버퍼속에서 클레노우(klenow)효소와 함께 37℃에서 15분간 인큐베이트한 후, 반응생성물을 Sephadex G-50 컬럼(Pharmacia제)을 사용하여 정제하여, 동위원소(isotope) 표지 프로브로서 사용했다. 다음에 S1-Assay kit(Ambion사)를 사용하여, 표지 프로브를 55℃ 16시간의 조건으로, 배양 메산기움세포로부터 조제한 0.2 ㎍의 mRNA와 하이브리다이즈시켰다. DNA-RNA 하이브리드에 S1 뉴클레아제를 함유하는 500 ㎍의 S1 버퍼를 가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션했다. 최종 생성물을 전기영동하여, 오토 라디오그래피에 의해 분석했다(도3).

그 결과, 인간 MEGSIN 유전자의 제1엑손은 346 bp인 것이 판명되었다. 그러나, 그 밖에도 3개의 전사개시점이 존재하는 것이 명백해졌다. 또한, 인간 메산기움세포의 전RNA를 시료로 하여, 5'-RACE 키트(다까라주조제)를 사용하고, 제품에 첨부하는 설명서에 따라 조작하여, 전사개시점을 결정했다(도2).

염기서열의 해석결과, AP-1 결합부위, cMyb 결합부위 및 Oct-1을 포함하는, 전사제어부위로 될 수 있는 보존된 프로모터 서열이 MEGSIN 유전자의 상류영역에 발견되었다. 또한, TATA 박스[Mol.Cell.Biol., 1, 281(1981)]나 CAAT 박스 [Science, 236, 1237 (1987)]의 콘센서스서열은 발견되지 않았다.

[실시예 5] MEGSIN 전사제어영역의 기능검정

전사제어영역의 검정을 위해, MEGSIN 유전자의 상류영역(KpnI-DraI단편; -1154∼+59) 또는 그 결실변이 DNA와 루시페라아제 유전자를 연결시킨 벡터를 제작했다. 여러 결실변이 DNA는, 분석에 사용하는 영역을 덮는 프라이머대를 설계하여, 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 조제했다. 구체적으로는, 안티센스 프라이머로서 프라이머 13(5'-aggctgtccaaaggtgcagcctgcactctg-3'/서열번호: 18)을 사용하고, 센스 프라이머로서 프라이머 1(5'-ggtaccttctaattccaatagctttttac-3'/서열번호: 6), 프라이머 2(5'-ccagttacttggataaatgttggctgtact-3'/서열번호: 7), 프라이머 3(5'-ctcaggcagaaggaccaggcttgcagtcat-3'/서열번호: 8), 프라이머 4(5'-acatacagctcaacctcatgatgctacggc-3'/서열번호: 9), 프라이머 5(5'-cctcatgatgctacggccagaaactgaaat-3'/서열번호: 10), 프라이머 6(5'-ccaagtttcagctcctatctgaagctgctc-3'/서열번호: 11), 프라이머 7(5'-ggtccagatgaaaatctgagattggagaat-3'/서열번호: 12), 프라이머 8(5'-atgtcttgacccaggctgacagatactgtt-3'/서열번호: 13), 프라이머 9(5'-cctcctgaaatctgattcacatacaaactg-3'/서열번호: 14), 프라이머 10(5'-aatgaactacataacaaccaccttagtcag-3'/서열번호: 15), 프라이머 11(5'-tacataacaaccaccttagtcagatactac-3'/서열번호: 16), 또는 프라이머 12(5'-tactactttgaaacctggttcaaaacctaa-3'/서열번호: 17)를 사용하여, 각각 MEGSIN 유전자의 -1079∼+59, -1040∼+59, -1000∼+59, -940∼+59, -927∼+59, -669∼+59, -497∼+59, -258∼+59, -158∼+59, -128∼+59, -121∼+59 또는 -97∼+59를 포함하는 결실변이 DNA를 제작했다. 루시페라아제 발현벡터(Picca Gene Basic Vector 2:동양잉크제조)(도4)의 멀티클로닝 부위를 KpnI 및 HindIII로 절단하고, 상기의 PCR 산물을 라이게이션시켜, 벡터로 함입시켰다. 벡터는, 리포펙트아민(LipofectAmine)(Gibco-BRL사)을 사용하여, 첨부하는 설명서에 따라 세포로 도입했다.

우선, 결실시키지 않은 MEGSIN 유전자의 상류영역(-1154∼+59)을 사용한 벡터를 여러 세포에 도입하여, 전사활성의 세포종에 의한 특이성을 검토했다(도5). 벡터를 37℃ 5시간의 조건으로 트렌스펙션했다(Derijard,B. et al., Cell, 76, 1025-1037(1994)). 37℃에서 2일간 배양한 후, 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하고, 세포용해(cell lysis) 버퍼로 용해시켜 라이세이트(lysate)를 얻었다. 세포의 라이세이트는 원심하여 세포잔사를 침전시켜 제거했다. 형광의 발광량은, Lumat LB9507 루미노미터(luminometer)(EG&G Berthold사)를 사용하여 직접 측정했다. 출력광의 측정값을, 파장 570 ㎚에 있어서의 흡광도에 의해 산출한 각각의 β-갈락토시다아제 활성[Herbomel,P. et al., Cell, 39, 653-662(1984)]으로 나눔으로써, 상대 루시페라아제 활성을 구했다.

세포로서는, 실시예 1에 기재된 배양 인간 메산기움세포(Clontech사), 인간 진피 섬유아세포(HDF:다까라주조) 및 인간 신장피질 상피세포(HRCE:다까라주조)를 사용했다. 그 결과, 루시페라아제 활성은, 배양 인간 메산기움세포에 있어서 특이적으로 관찰되었다(도5). 이러한 것으로부터, 사용한 전사제어영역은 메산기움세포에 대해 특이성을 갖는 것이 판명되었다.

다음에 여러 결실변이 DNA에 대해서도 상기와 동일하게 조작하고, 벡터로 함입하여, 인간류 표피 암세포주 A431 또는 실시예 1의 배양 인간 메산기움세포(Clontech사)에 트렌스펙션하여, 루시페라아제 활성을 측정했다. 그결과를 도6에 나타낸다. 그래프는, 결실시키지 않은 MEGSIN 유전자의 상류영역에 있어서의 활성을 100%로 한 상대값으로 나타냈다.

-1154 bp에서 -941 bp까지를 결실시켰더니, 전사활성은 약 60%로 감소한 것으로부터, 이 영역에 전사를 정으로 제어하는 서열이 존재하는 것이 나타내어졌다. 특히 -159 bp까지 결실시키더라도, 전사활성은 거의 저하되지 않았다. 그러나, -158 bp에서 -121 bp까지를 결실시켰더니, 전사활성은 전장의 경우에 비해 5%로 감소했다. 특히, -128 bp에서 -121 bp까지의 사이에 전사활성이 급격히 저하되는 것으로부터, -128∼-121의 영역이 전사를 정으로 제어하는데 중요하다고 생각된다.

또한, -129∼-90영역은, 전사제어인자인 AP-1(activating protein 1)결합서열(cttagtcaga) [Lee,W. et al., Nature, 325, 368-372 (1987), Foletta,V.C. et al., J.Leuk.Biol., 63, 139-152 (1998)], c-Myb 결합서열(aacaaccacc)(서열번호: 1의 13∼22번 위치) 및 Oct-1 결합서열(ctacataacaac)(서열번호: 1의 7∼19번 위치)[Rosenfeld,M.G. et al., Genes Dev., 5, 897-907 (1991)]을 갖는 것으로부터, 이 영역에 전사제어부위가 존재할 가능성이 시사되었다.

이들 영역이 MEGSIN 유전자의 전사활성화에 관여하고 있는지의 여부를 더 검증하기 위해, 이들 영역의 여러 부위에 변이를 도입하여, 전사활성에 미치는 영향을 조사했다. 즉, 특정 염기에 변이를 도입하는 것에 의한 전사조절 도메인의 포텐셜의 변화를 조사하기 위해서, Quick Change site-directed mutagenesis kit (Stratagene제)를 사용하여, 설명서에 따라 조작하여, -128∼-127을 gg로(m1), -120∼-117을 cccc로(m2), -116∼-115를 gg로(m3), -113∼-112를 gg로(m4), -106∼-105를 gg로(m5), -100∼-98을 ggc로(m6), -94∼-93을 gg로(m7)에 변이시킨 여러 변이체를 제작했다.

이들 변이체의 생성은, 직접 디디옥시(dideoxy) 핵산 시퀀스법에 의해 확인했다. 이들 변이체를 상술과 동일하게 벡터에 함입하여, 그 루시페라아제 활성을 구했다. 그 결과, m3∼m7의 변이체에 있어서, 루시페라아제 활성은 현저히 저하되었다(도7). 도중 그래프는, 결실시키지 않은 MEGSIN 유전자의 상류영역에 있어서의 활성을 100%로 한 상대값으로 나타냈다.

[실시예 6] 프로모터 결합단백질의 검색

실시예 3에 의해, -128부터 하류(3'측)의 영역이 전사를 정으로 제어하는 활성을 갖는 것이 판명되었기 때문에, 이 영역에 결합하는 단백질(전사인자)을 2종류의 프로브[프로브A(5'-GAATGAACTACATAACAACCACC-3'/서열번호:19;-129∼-107영역) 및 프로브B(5'-AACCACCTTAGTCAGATACTACTTT-3'/서열번호:20;-113∼-89영역)]를 사용한 겔 시프트 분석에 의해 검정했다.

먼저, 각 프로브의 말단을 일반적인 방법에 의해 라벨화 했다. 다음에, 실시예 1의 메산기움세포로부터 핵추출물을 Dignam 등의 방법[Dignam,J. et al., Nucleic Acid Res., 11, 1475-1489 (1983)]에 의해 조제했다. 계속해서, 10% 글리세롤, 5 mM의 염화마그네슘, 1 mM의 EDTA, 25 mM의 디티오스레이톨(dithiothreitol), 50 mM의 염화칼륨, 10 mM의 Hepes-KOH, 3 ㎍의 poly(dI-dC), 7 μL의 핵추출물 및 라벨화 프로브를 포함하는 반응액중, 실온에서 30분간의 조건에서 DNA-단백 결합반응을 행했다. 반응후, 전기영동에 제공하여 오토 라디오그래피로 해석했다. 그 결과, 어떠한 프로브에 있어서도 DNA-단백복합체의 벤드 시프트가 인정된 것으로부터, 2종류의 전사인자의 존재를 확인할 수 있었다(도8).

MEGSIN의 메산기움세포 특이적 발현이 이 영역을 인식하는 전사인자의 양적 영향에 좌우되는지의 여부를 검토하기 위해, 실시예 1에 기재된 배양 인간 메산기움세포(Clontech사), 인간 평활근세포(HSMC:다까라주조), 인간 진피 섬유아세포(HDF:다까라주조) 및 인간 신장피질 상피세포(HRCE:다까라주조)를 사용하여 겔 시프트 분석을 행하여 비교했다. DNA-단백착체의 양은, 어떠한 프로브에 있어서도 배양 인간 메산기움세포에서 특이적으로 많았다(도9). 이것은, MEGSIN의 메산기움세포 특이적 발현이 이 영역을 인식하는 전사인자에 의해 영향을 받는 것을 나타내고 있다.

본 발명은, 신장세포에서 발현하는 유전자의 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 프로모터는, 유전자치료 등의 분야에 응용이 가능하다.

본 발명에 의해, 메산기움세포에 특이적으로 발현하고 있는 MEGSIN 유전자의 프로모터가 제공되었다. 본 발명의 프로모터는, 메산기움세포 특이적인 유전자 발현을 위한 프로모터로서 이용할 수 있고, 예를 들면, 여러 신장질환의 유전자치료로의 응용을 생각할 수 있다. 또한, 해당 프로모터에 결합하는 전사인자 등의 단백질의 스크리닝에 이용하는 것도 가능하다.

Claims (7)

1. 서열번호: 1의 염기서열 또는 그의 일부를 포함하고, 프로모터 활성을 갖는 DNA.
2. 제1항의 DNA를 포함하는 벡터.
3. 제2항에 있어서, 제1항의 DNA의 하류에 이종 유전자가 발현 가능한 상태에서 결합하고 있는 벡터.
4. 제3항의 벡터가 도입된 세포.
5. 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 결합하는 단백질의 스크리닝방법으로서,

   (a) 검사대상 시료를 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 접촉시키는 공정 및

   (b) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA 또는 그의 일부에 결합하는 활성을 갖는 단백질을 선택하는 공정을 포함하는 방법.
6. 제5항의 방법에 의해 단리될 수 있는 단백질.
7. 제6항에 있어서, 전사인자인 단백질.