WO2000043528A1

WO2000043528A1 - Promoteur de megsine

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Publication number: WO2000043528A1
Application number: PCT/JP2000/000350
Authority: WO
Inventors: Toshio Miyata
Original assignee: Kurokawa, Kiyoshi
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2000-07-27
Also published as: NO20013625D0; AU3078200A; NO20013625L; EP1146123A4; CA2358928A1; KR20010103752A; CN1343255A; US6790617B1; AU769710B2; EP1146123A1

Description

'。口モーター

技術分野

本発明は、賢細胞で発現する遺伝子のプロモーターに関する。本発明のプロモ一夕一は、遺伝子治療などの分野に応用が可能である。背景技術

体内の 60兆個もの様々な細胞が、本質的に同一のゲノム DNAを有している。正常な生理学的機能のために、これらの遺伝子の発現は、細胞系統、および細胞が受容するシグナルにより厳密に制御されている。従って、個々の細胞型で特異的に発現している遺伝子を解明することは極めて重要である。

メサンギゥム（mesangium)は、腎糸球体の毛細管係蹄の小葉中心部に位置し、各小葉を結びつける芯となる組織である。メサンギゥムは糸球体基底膜に覆われており、毛細管腔とは内皮細胞によって隔てられている細胞（メサンギゥム細胞： mesangial eel 1 )と 3層からなる糸球体基底膜の中の内透明層と連続している無形物質（メサンギゥム基質： mesangial matrix) から構成されている。

メサンギゥム細胞は、腎糸球体の構造および機能の維持に中心的な役割を果たしていることが知られており、また、糸球体腎炎や糸球体硬化症などの糸球体疾患の発症における主要な要因であると考えられている。そして、メサンギゥム細胞は、各種腎炎において障害の標的となっている。例えば、メサンギゥム細胞の増殖や細胞外メサンギゥム基質の蓄積は、末期腎不全の 2大原因である慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症のような種々の糸球体障害を有する患者に糸球体硬化症をもたらす最初の過程とされている [D. Schlondorff， Kidney Int. , 49, 1583-1 585 ( 1996 ) ; R. B. Sterzel et al . , Glomerular mesangial cells . Immunologic Renal Diseases, pp595- 626(1997)]。従って、メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子を見いだし、その発現の調節機構を明らかにすることは、メサンギゥム細胞の生物学的性質の解明、メサンギゥム細胞に関連する疾患の原因の究明、ひいては、メサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効である。ところで、本発明者は、大規模 DNA配列決定およびデ一夕ベース解析により、メサンギゥム細胞で特に強く発現する遺伝子として、 MEGSINと命名した遺伝子を単離し、その全塩基配列を決定した。そして、 MEGSINの全長 cDNAクローンがコードする 380個のアミノ酸からなる新規タンパク質（ヒト MEGSIN)の配列を決定した。さらに、 Swiss Protデータベースを用いて FASTAプログラムによるアミノ酸ホモ口ジー検索を行ったところ、ヒト MEGSINが、 SERPIN (セリンプロテアーゼインヒビ夕一）スーパ一フアミリー [R.Carrell et al.， Trends Biochem. Sci. , 10, 20 (1985); R. Carrel 1 et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52, 527 (1987); E.K.O.Kruithof et al., Blood, 86, 4007 (1995); J.Potempa et al., J.Biol.Chem., 269, 15957 (1994); E.Remold-0' Donnell, FEBS Lett., 315, 1 05(1993)] に属するタンパク質であることを見出した [T.Miyata et al., J.Cli n. Invest., 120, 828-836 (1998)]。

ヒト MEGSINは、ヒト繊維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、ケラチノサイトでは発現が弱く、メサンギゥム細胞で特に強く発現している（即ち、ヒト MEGSIN遺伝子の発現はメサンギゥム細胞に特異性を有する）。また、 IgA腎症患者や糖尿病性賢症患者と健常人とで腎臓組織中の MEGSINの発現量を比較すると、 IgA腎症患者や糖尿病性腎症患者において MEGSINが有意に発現量が多い [D.Suzuki et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10， 2606- 2613(1999)]。また、ラットを用いたメサンギゥム増殖性糸球体腎炎モデルにおいて、発現量の上昇が認められた。

このように、 MEGSIN遺伝子の発現は、腎疾患に深く関与している可能性があることから、 MEGSIN遺伝子の発現制御機構の実態を明ら.かにし、ヒト MEGSINの生体内における機能の解明やその変異によって引き起こされる遺伝性疾患などへの診断、治療に有用なプロモ一夕一の提供、あるいは腎メサンギゥム細胞に特異的に発現するプロモーターを提供することが望まれていた。

一方、ヒト MEGSINが属する SERPINスーパ一ファミリ一は、一次構造上相互に高い相同性を有することから、進化上共通の祖先タンパク質から分岐したと考えられている。すなわち、アミノ酸配列上の変異アミノ酸数 [K.Suzuki et al., Tan pakushitsu Kakusan Koso, 34, 949-962 (1989)] や染色体遺伝子構造に基づいて作製された進化系統樹 [J.J.Bao et al., Biochem., 26, 7755 (1987)] の解析の結果、 SERPINスーパーフアミリーは、種々の高等脊椎動物とともに 500万年以上にわたって進化してきたことが示されている。しかしながら、 MEGSIN遺伝子は、糸球体メサンギゥム細胞に特異的に発現するという点で極めて特徴的である。また最近、イオンチャンネルや輸送に係わる遺伝子が、腎臓に特異的に発現することが報告されている [S.J.Lolait et al., Nature, 357, 336-339 (1992); Y.Kanai et al., J.Clin. Invest. , 93, 397-404 (1994); S.Uchida et al., J.B iol.Chem., 268, 3821-3824 (1993); S.Adachi et al., J.Biol.Chem., 269, 17 677-17683(1994); K.Fushimi et al., Nature, 361, 549-552 (1993); G.Gamba et al., J.Biol.Chem., 269, 17713-17722 (1994)]。

しかしながら、これらの遺伝子は、尿細管上皮細胞に局在しており、糸球体メサンギゥム細胞では発現していない。従って、 MEGSIN遺伝子のプロモーターおよび転写因子を解明することにより、細胞型依存的な遺伝子発現機構に関する重要な情報を得ることができる。さらにこのようにして得られた情報は、分子遺伝学や遺伝子導入における標的細胞にも応用することができる。発明の開示

本発明は、 MEGSIN遺伝子のプロモー夕一およびその利用を提供することを課題とする。

本発明者らは MEGSIN遺伝子の発現調節機構を解明するために、 MEGSIN遺伝子より上流（ 5，側）約 1. 5kbを含むゲノム DNAの塩基配列を決定した。 S1ヌクレア一ゼプロテクションアツセィの結果、 MEGSIN mRNA の転写開始点は 4種類存在していることが判明した。転写開始点の上流には、 API結合部位、 cMyb結合部位、および Oct- 1を含む転写制御部位となり得る保存された転写制御配列が存在することが判明した。これらの転写制御配列を含む領域をさまざまに欠失させた MAの 3' 側にルシフヱラーゼ遺伝子を連結したベクターを作製し、細胞にトランスフエク卜してルシフェラ一ゼ活性による転写制御領域の決定を行ったところ、転写を正に制御する 2つの制御配列を同定した。それらのうち 3'側に位置するプロモー夕一領域について、部位特異的変異導入法により塩基置換を行い、その転写制御活性につき詳細な解析を行った。その結果、本発明者らは、転写制御に重要な役割を担う DNAの塩基配列を特定することに成功した。

従って、本発明は、 MEGSIN遺伝子のプロモーターおよびその利用に関し、より具体的には、

( 1 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列またはその一部を含み、プロモーター活性を有する DNA、

( 2 ) ( 1 ) に記載の DNAを含むベクタ一、

( 3 ) ( 1 ) に記載の DNAの下流に異種遺伝子が発現可能な状態で結合している、 ( 2 ) に記載のベクター、

( 4 ) ( 3 ) に記載のベクターが導入された細胞、

( 5 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる MAまたはその一部に結合する夕ンパク質のスクリ一ニング方法であって、

( a ) 被検試料を配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部に接触させる工程、および

( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部に結合する活性を有するタンパク質を選択する工程、を含む方法、

( 6 ) ( 5 ) に記載の方法によって単離されうるタンパク質、 ( 7 ) 転写因子である、（6 ) に記載のタンパク質、

に関する。

なお、本明細書において、「プロモーター」とは転写開始部位の近傍に存在し、遺伝子の発現を制御する DNA領域を指す。また、「プロモー夕一活性」とは、その下流に存在する遺伝子の発現を制御するプロモーターの活性を指す。

本発明は、 MEGSIN遺伝子のプロモーターを提供する。実施例 3に示すように、 M EGSIN遺伝子の 5'上流域において、- 128位より下流の塩基の欠失や置換の多くがそのプロモータ一活性の著しい低下を示した。従って、本発明のプロモー夕一は、 - 128位より下流の MEGSIN遺伝子の 5'上流域（配列番号： 1 )の少なくとも一部を含む。

本発明のプロモーターとしては、 -128位より下流の領域（配列番号： 1 ) の少なくとも一部を含み、かつ、プロモーター活性を有する限り、配列番号： 1に示す塩基配列において塩基が置換された配列を有していてもよい。しかしながら、図 7に示すように、 -128位より下流の領域における、 ml変異（-128位および- 127 位の塩基の置換）、 m2変異（-120位、 -118位、および- 117位の塩基の置換）、 m3 変異（-116位および- 115位の塩基の置換）、 m4変異（-113位および- 112位の塩基の置換）、 m5変異（-106位および- 105位の塩基の置換）、 m6変異（-100位および - 98位の塩基の置換）、および m7変異（-94位および- 93位の塩基の置換）はそのプ口モーター活性の低下を招いた。

従って、本発明のプロモーターとしては、高いプロモーター活性を必要とする場合、これらの塩基が置換されていることは好ましくない。

本発明のプロモ一夕一は、例えば、ゲノム DNAライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。即ち、既に判明している MEGSIN cDNAまたはその一部をプローブとしてヒトゃ他の動物のゲノム DNAライブラリ一をハイプリダイゼ —シヨンスクリーニングすることにより、また、 MEGSIN cMA配列または MEGS IN ゲノム DNA配列の情報を基に作成したプライマーを利用してヒトゃ他の動物のゲノム DNAライブラリ一を錶型にポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) を行うことにより単離することができる。.

また、本発明のプロモータ一は、例えばホスホアミダイド法 [Mattencci, M.D. & Caruthers， M. H. J. Am. Chem. Soc . 103， 3185( 1981 )]、ホスファイト - 卜リエステル法 [Hunkapil ler, M. et al . , Nature 310, 105 ( 1984)] 等の核酸の化学合成を用いる常法に従って製造することもできる。

DNA断片中に存在する MEGSIN遺伝子のプロモーター領域およびェンハンサ一領域（ィントロンまたは 3'非翻訳領域に存在する遺伝子の発現を増強する DNA領域を含む）は、例えば、特開平 6- 181767号公報や文献 (The Journal of Immunology ( 1995 ) 155, 2477-2486, Pro Natl . Acad. Sci . USA ( 1995 ) 92, 3561-3565) と同様の方法で取得することが可能である。

一般的には、発光反応や呈色反応などにより定量が容易に行えるタンパク質をコードする遺伝子（レポ一夕一遺伝子）をプロモーター候補領域の下流に発現可能な状態で結合し、これを宿主細胞に導入して呈色反応や発光を検出することにより、プロモー夕一活性の有無やプロモーター活性の強弱を判定することができる。

具体的には、プロモーター領域は、これに制限されないが、以下の方法によつて取得することができる。

1 ) 上記のようにゲノム DNAまたはゲノムライブラリーより転写制御領域を含む D NAをクロ一ニングする。

2 ) 制限酵素消化して MEGSIN遺伝子の翻訳開始コドンを含むその上流部分のプロモ一夕一領域を含む DNA (2〜5 kbp) を得て、塩基配列を決定する。メサンギゥム細胞等から調製した poly(A)+ RNAを銪型とし、 MEGSIN遺伝子の 5'末端側 cDNA配列より選択したブラィマー DNAを用いたプライマー伸長法により、転写開始点（ + 1 ) を決定する。塩基配列から転写因子結合配列を検索し、プロモー夕一活性を有する可能性がある箇所を予想する。 3 ) 2 ) で得た DNAから MEGSIN遺伝子のコード領域を除いた DNA断片をプラスミド上にサブクローニングし、この 2〜5 kbp DNA断片の下流に、レポ一夕一遺伝子（例えば、クロラムフエニコ一ルァセチル転位酵素（C A T ) 遺伝子、あるいはルシフェラ一ゼ遺伝子など）を連結したレポータープラスミドを構築する。同様に、プロモーター領域の可能性がある各箇所を含むような形で、制限酵素消化により、あるいは P C R等により、 5，末端側及び 3'末端側を順次削つた MEGSIN遺伝子上流部分の様々な部位に該当する DNA断片を作成し、これらの下流に、レポーター遺伝子を連結したレポ一夕一プラスミドを構築する。また、部位特異的変異導入法により適宜、 1つまたは複数の塩基の置換、欠失、付加および/または挿入を行い変異を導入した DNA断片を作成し、これらの下流にレポーター遺伝子を連結したレポ—夕一プラスミドを構築する。

4 ) 3 ) で作製したレポータープラスミドで形質転換した動物細胞のレポ一夕一活性（例えば、 C A T活性あるいはルシフェラ一ゼ活性等）を測定することにより、 MEGSIN遺伝子上流部分に存在するプロモーター領域を同定する。

また、 3，非コード領域やイントロン中におけるェンハンサ一領域は、例えば、 MEGSIN cDNA等をプローブとしたゲノムライブラリーのスクリ一ニングにより、まず MEGSINのゲノム遺伝子をクロ一ニングし、次いで、上述のプロモーターに関する方法と同様の実験を行うことにより同定することができる。

本発明のプロモ一夕一は、その下流に結合した遺伝子を腎臓（メサンギゥム細胞）で高率に発現させる活性を有する。このため本発明のプロモー夕一は、例えば、腎臓で所望の遺伝子の発現を任意に制御できるベクターの開発に利用できる。また、本発明のプロモ一夕一を活性化する転写因子を有する他の細胞（臓器）においても同様の効果が期待できる。このような腎臓特異的に活性化するプロモー夕一は、例えば、腎臓疾患の遺伝子治療のためのベクター作製に用いることができる。

本発明のプロモーターを腎臓特異的な遺伝子の発現に利用する場合には、本発明のプロモーターの下流に腎臓において発現させたい所望の遺伝子を発現可能な状態で結合し、これを標的細胞に導入する。ここで「発現可能な状態で結合する」とは、遺伝子の転写が可能となるように、本発明のプロモー夕一と該遺伝子とが結合していることを指す。

標的細胞に導入する場合、本発明のプロモー夕一および該プロモ一夕一により制御される遺伝子は、適当なベクタ一に導入されていてもよい。また、本発明のプロモー夕一は、単独で用いても、ェンハンサー、サイレンサー等の転写制御配列を組み合わせて用いてもよい。

遺伝子治療を目的とする場合、用いられるベクターとしては、例えば、レトロウィルス、単純性へルぺスウィルス、サイトメガロウィルス、ェプス夕イン一バ —ウィルス、ゥシパピローマウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、シンドビスウィルス、ボックスウィルスなどに由来するべク夕一が挙げられる。また、温度感受性リボソーム、血中安定性リポソ一ム、カチォニックリポソ一ム、 pH感受性リボソームおよびウィルスのエンベロープ夕ンパク質を組み込んだ再構成リボソームなどのリボソーム製剤、 HVJ (センダイウィルス） -リボソーム [T. Nakagawa et al . , Drug Del ivery System, 11， 411 ( 1996) ]、 VSV (水疱性口内炎ウィルス） -リボソーム（特願平 9- 357506号）などのウィルスの膜融合能を付与した膜融合リボソーム製剤などを用いることもできる。

これらのベクターを導入する対象となる細胞としては、例えば、メサンギゥム細胞、尿細管細胞、マクロファージ、リンパ球、内皮細胞、腫瘍細胞などが挙げられる。

なお、上述した他、本発明のプロモーター、該プロモーターを含有する組換えベクタ一、該ベクターの細胞への導入などの一般的な遺伝子操作は、例えば、「M olecular Cloning - A Laboratory Manualj (Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. ) に記載の常法に従って行うことができる。

また、本発明のプロモー夕一の変異は、重篤な遺伝疾患を引き起こすと考えられることから、該プロモーターは、遺伝子診断への応用も期待できる。この遺伝子診断は、例えば単鎖高次構造多型分析、 DNAフィンガープリント法、 PCR法を用いたダイレクトシークェンス、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ一ブを用いた変異解析法などの手法を用いて遺伝子の変異を検出することにより達成されるまた一方、ヒト MEGSINは SERPINスーパ一フアミリーに属するタンパク質であることから、ヒト MEGSINの異常症は、血液凝固能の亢進による血栓塞栓症または線溶能の亢進による出血症をきたすおそれもある（鈴木ら、蛋白質 '核酸 '酵素， 34卷， 949-962 ( 1989) ) 。このことは、本発明のプロモ一夕一の転写活性に影響を与える薬剤がこれら疾患の発症や抑制に作用する可能性があることを示唆する従って、本発明のプロモ一夕一は、これら疾患に関連する薬剤のスクリーニングに利用できる可能性が考えられる。

また、 MEGSIN発現量が IgA腎症患者や糖尿病性腎症患者において亢進していることから、腎疾患の発症に関与していると考えられる。よって本発明のプロモー夕一の活性を制御する薬剤を該患者に投与することにより、 IgA腎症ゃ糖尿病性腎症の発症や進展を抑制することも可能であると考えられる。

また、本発明は、本発明のプロモー夕一に結合するタンパク質のスクリ一ニング方法に関する。本発明のプロモー夕一に結合するタンパク質としては、例えば、転写因子を挙げることができる。「転写因子」とは、本発明のプロモー夕一に結合して、該プロモー夕一の下流の遺伝子の発現を正または負に調節するタンパク質を指す。

本発明のスクリーニング方法は、（a ) 被検試料を配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部に接触させる工程、および（b )配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部と結合するタンパク質を選択するェ程、を含む。

本発明のスクリーニングは、当業者に公知の方法（「新細胞工学実験プロトコ —ル（秀潤社）」、「バイオマニュアルシリーズ 5転写因子研究法（羊土社）」、「MA & Cell Biology, 13, 731-742 ( 1994)」参照）、例えば、ァフィ二ティ一カラムを用いた方法、サウスウエスタン法、フットプリンティング法、ゲルシフト法、 one- hybrid法などをにより行うことができる。

ァフィ二ティーカラム法を用いる場合は、前述の方法で得た、本発明のプロモ一夕一をセファロ一ス或いはラテックスビーズに固定化したカラムに、核抽出液をかけ、カラムを洗浄後、カラムに固定化した配列と同様の配列を有する DNAを用い、結合した転写因子を溶出する。

また、サウスウエスタン法を用いる場合は、例えば本発明のプロモーターに結合する転写因子が発現していると予想される細胞（例えばメサンギゥム細胞など）由来の mRNAから cDNAを調製する。その後、大腸菌の発現べクタ一、例えばえ gtll に該 cDNAを組み込んだ cDNAラィブラリーを作製し、 ?—ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を合成させ、ニトロセルロース膜に該融合蛋白質を吸着させて、放射性同位元素で標識された本発明のプロモーターをプローブにし、結合活性をもつ融合蛋白質を合成するファ一ジを選択する。

フットプリント法を用いる場合は、放射性同位元素で標識したプロモーターをプローブとし、これを細胞核抽出液と反応後、 DNase I で消化し、電気泳動することによって夕ンパク質結合 DNA配列を決定することができる。

ゲルシフト法を用いる場合は、まずプロモーター領域内の任意の配列からプローブを作製し、放射性同位元素で標識する。次に、この標識プローブと細胞核抽出液を反応させ、電気泳動を行い、プローブに結合する核タンパク質の有無を確認することができる。

one-hybrid法を用いる場合は、例えば、まず、 MEGSINプロモーター配列を少なくとも 3コピー、タンデムに並べた配列をレポ一夕一遺伝子の上流に挿入し、酵母ゲノム内に組込むことにより、レポ一夕一株を作成する。次に、上記の cDNAと GA L4 (酵母の DNA結合性転写活性化因子）の活性化ドメイン（GAL4 AD) のコード領域とを連結させ、これらの融合タンパク質をコードするような活性化ドメイン（A D)ライブラリーを作製し、これを前述のレポ一夕一株に導入する。 ADと DNA結合夕ンパク質とのハイプリッドタンパク質が MEGSINプロモー夕一配列へ結合することにより、転写が活性化されて、その効果を、レポ一夕一遺伝子の発現を通じて検出することができる。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト MEGSIN遺伝子と PAI- 2遺伝子の、ェキソン—イントロン境界領域の比較を示す図である。大文字はェキソン、小文字はイントロンを表す。

図 2は、ヒト MEGSIN遺伝子の第 1ェキソン（5，- UTR) およびその上流 1431bpの配列を示す図である。 5' -RACEにより得られたクローンの 5'端を「*」で示した。図 3は、ヒト MEGSIN遺伝子の転写開始部位を決定するための S1ヌクレア—ゼァッセィの結果を表す写真である。

図 4は、ルシフェラ一ゼアツセィに用いられたベクタ一の構造を示した図である。

プロモ一夕一：なし、ェンハンサー：なし、 SV40後期ポリ（A) シグナル： 1772- 1993、ルシフェラーゼ遺伝子（luc+) : 88- 1737、上流のポリ（A)シグナル： 4658- 4 811、マルチプルクローニング部位： 1-58、 ? -ラク夕マ一ゼ遺伝子（Amp^r) ： 3940-3083、 fl複製開始点： 4073- 4527、 ColEl-由来のプラスミド複製開始点： 2313 図 5は、種々の細胞を用いて、ヒト MEGSIN遺伝子転写制御領域によるルシフエラーゼアツセィを行った結果を表す図である。 5 -ガラクトシダ一ゼ活性で標準化したプロモ一夕一の相対活性を示す。

図 6は、欠失させたヒト MEGSIN遺伝子転写制御領域によるルシフヱラ一ゼアツセィの結果を表す図である。/? -ガラクトシダーゼ活性で標準化したプロモー夕一の相対活性（欠失させていない場合を 100とした値）を示す。（A) はヒト類表皮癌細胞株 A431における結果を、（B) はヒトメサンギゥム細胞における結果を示す。図 7は、部位特異的変異を導入したヒト MEGSIN遺伝子転写制御領域によるルシ巷え用紙（規則 26) フェラーゼアツセィの結果を表す図である。下段は導入した変異を、上段は/? - ガラクトシダ一ゼ活性で標準化したプロモー夕一の相対活性（欠失させていない場合を 100とした値）を示す。また、下段に Oct- 1、 c- Myb、および AP- 1の結合部位も示した。

差替え用紙（規則 26) 図 8は、ヒト MEGS IN遺伝子転写制御領域（-129〜- 89) を用いたゲルシフトアツセィの結果を示す図である。上段に用いたプローブ DNA配列、下段にその結果を示す。

図 9は、種々のヒトプライマリー細胞抽出物を用いた、ヒト MEGSIN遺伝子転写制御領域（-129〜- 89) の DNAのゲルシフトアツセィの結果を示す写真である。図 8に示したプローブ Aおよびプローブ Bを用いた。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。

[実施例 1 ] ヒトメサンギゥム細胞の初代培養

ヒトメサンギゥム細胞（Clontech社）は、 10%ゥシ胎児血清（GIBC0社）、 100 IU/mLのぺニシリン、 100 ;z g/mLのストレプトマイシンおよび 200 μ g/mLの L-グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) で培養した。

[実施例 2 ] ヒト MEGSIN遺伝子の転写制御領域の単離

ヒト MEGSIN遺伝子の上流領域は、 Genome Walker Kits (Clontech社）を用いて単離した。即ち、 Genome Walker Kitsのヒトゲノムライブラリーを踌型として、 M EGSINの cDNA配列 [Miyata, T. et al. , J. Clin. Invest. , 120, 828-836 (1998) ] からデザィンされた MEGSIN特異的プライマー（5' -CGTCGACGGACACGTCTCACGTCCGAC G - 3' Z配列番号： 4 ) およびキットに添付されているアダプタープライマ一と PC Rバッファーを用いたネスティドポリメラーゼ連鎖反応（nested Polymerase Cha in Reaction) により、ヒト MEGSIN遺伝子の上流領域を増幅した。また、同様にしてェキソン一イントロン境界領域のゲノム DNAも単離した。

さらに、 TFSEARCHプログラム（Yutaka Akiyama：京都大学）を用いた TFMATRIX 転写因子結合部位データベース（E. Wingender、 R. Knueppel、 P. Dietzeおよび H. K aras : GBF- Braunschweig) の解析により、高度に保存されている転写因子結合部位配列を検索した。

ゲノム DNA配列の解析の結果、ヒト MEGSIN遺伝子は 8つのェキソンと 7つのイントロンを有し、約 20kbにわたつてコードされていることが判明した。また、ェクソン—ィントロン境界部位（スプライス部位）は、 GT- AG則に従っていた。その構造を表 1に示す。表の配列中、大文字はェキソン、小文字はイントロンを表す。

表 1

No. ェキソン（bp ) イントロン（kbp) ドナ一配列ァクセプ夕一配列

1 346 6. 0 CTAGCgtgag tctagGCTGC 2 186 0.5 ATAAGgtcag tacagTTGCT 3 51 0. 9 GTCAGgtaaa aacagTCAGG 4 117 3. 3 ATAAGgtaag tatagGACTA 5 118 3. 0 ACATGgtgag aaaagGCAAA 6 143 3.0 CCAAGgtatg ttcagTGCTC 7 147 3.5 CTGAAgtaag tacagATTGA 8 1141 ヒト MEGSIN遺伝子のェキソン—ィントロン境界領域の塩基配列と、 MEGSINと同じ Serpinスーパーフアミリーに属するプラスミノ一ゲンァクチべ一夕一ィンヒビ夕一 type2 (PAI-2) [Ye，R. D . , J. Biol . Chem.， 264, 5495-5502 ( 1989 )] 遺伝子のそれとの比較を図 1に示す。両者の配列は高度に保存されており、系統的に近い関係にあることが判明した。

決定したヒト MEGSIN遺伝子のプロモー夕一領域（-1431〜- 1 )の塩基配列を図 2 および配列番号： 2に、 5'非翻訳領域（5' - UTR) ( 1〜； 181 ) の塩基配列を図 2および配列番号： 3に示す。 [実施例 3 ] 蛍光 in situハイプリダイゼ一ション（FISH)

フィトへマグルチニン（PHA)で刺激したヒト末梢血培養リンパ球から分裂中期群の染色体標本スライドを常法により作製した。 FISH用のプロ一ブは、 F581クロ ―ン由来の DNAを二ックトランスレーション法によりジゴキシゲニン- dUTPで標識したものを使用した。前記スライド標本に、標識化プロ一ブを 50%のホルムアミド、 10%のデキストラン硫酸および 2 X SSCを含むバッファ一と混合し、ィプリダイズした。ハイブリダィズされたスライド標本をフルォレセイン標識抗ジゴキシゲ二ン抗体（Boehringer Mannheim社）とともにインキュベーションし、 4，，6，- Diami dine- 2，- phenylindole dihydrochloride (DAPI ) を用いた対比染色を行うことにより特異的なハイブリダイゼ一シヨンシグナルを検出した。二色染色によるプロ —ブの検出は、標本スライドをフルォレセイン標識抗ジゴキシゲニン抗体（Boeh ringer Mannheim社）およびテキサスレッド標識アビジン（Boehringer Mannheim 社）とともにィンキュベ一トし、 DAPIを用いた対比染色により行った。その結果、ヒト MEGSIN遺伝子は、染色体 18q21.3に存在していた。

[実施例 4 ] S1ヌクレアーゼプロテクションアツセィによる転写開始点の同定

MEGSIN mRNAの 5'末端は、実施例 1で調製したヒトメサンギゥム細胞から抽出した poly(A)+ RNAを用いて、 S1ヌクレア一ゼプロテクションアツセィ法 [Berk,A. J. et al .， Proc . Natl . Acad. Sci . USA. , 75, 1979 ( 1978)] により決定した。

まず、マルチプライム法により、標識 DNAプローブを調製した。即ち、開始点の前後を充分にカバ一するような、 bp +161〜+191に対応するオリゴヌクレオチドプライマ一（5， - ttccctgtac atgcacttag gaaggtgatg a- 3，/配列番号： 5 ) を変性した MEGSINプロモーターにァニールさせた。次にプライマ一を [ ^{3 2} P]- dCTPを含有するバッファ一中でクレノウ酵素とともに 37°Cで 15分間ィンキュベートした後、反応生成物を Sephadex G- 50カラム（Pharmacia製）を用いて精製し、アイソトープ標識プロ一ブとして使用した。次に Si-Assay kit (Ambion社）を用い、標識プローブを 55°C16時間の条件で、培養メサンギゥム細胞から調製した 0.2 gの mRNAとハイブリダィズさせた。 DNA- RNAハイプリッドに S1ヌクレア一ゼを含有する 500/zg の SIバッファ一を加え、 37°Cで 30分間ィンキュベ一シヨンした。最終生成物を電気泳動し、オートラジオグラフィ一により分析した（図 3 )。

その結果、ヒト MEGSIN遺伝子の第 1ェキソンは 346bpであることが判明した。しかしながら、他にも 3つの転写開始点が存在することが明らかとなった。さらに、ヒトメサンギゥム細胞の全 RNAを試料とし、 5' - RACEキット（宝酒造製）を用い、製品に添付の説明書に従い操作し、転写開始点を決定した（図 2 ) 。

塩基配列の解析の結果、 AP- 1結合部位、 cMyb結合部位、および Oct- 1を含む、転写制御部位となり得る保存されたプロモーター配列が MEGSIN遺伝子の上流領域に見出された。また、 TATAボックス [Mol . Cell . Biol . , 1， 281 ( 1981 )]や CMTボックス [Science, 236, 1237 ( 1987)] のコンセンサス配列は見出されなかった。

[実施例 5 ] MEGSIN転写制御領域の機能検定

転写制御領域の検定のため、 MEGSIN遺伝子の上流領域（Kpnl- Dral断片； -115 4〜+59)またはその欠失変異 DNAとルシフェラ一ゼ遺伝子を連結させたベクターを作製した。さまざまな欠失変異 DNAは、アツセィに用いる領域を覆うようなプライマ一対を設計し、ポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) により調製した。具体的には、ァンチセンスプライマ一としてプライマー 13 (5' -aggctgtccaaaggtgcagcctgcactct g - 3，/配列番号： 1 8 ) を用い、センスプライマ一としてプライマ一 1 (5， - ggtac cttctaattccaatagctttttac- 3， /配列番号： 6 ) 、プライマー 2 (5' -ccagttacttgg ataaatgttggctgtact - 3， /sii列番号： 7 ) 、プライマ一 3 (5' -ctcaggcagaaggaccag gcttgcagtcat— 3， /酉己列番号： 8 ) 、フフイマ一4 (5 -acatacagctcaacctcatgatgc tacggc— 3, /酉己列番号： 9 ) 、プライマー 5 ( 5' -cctcatgatgctacggccagaaactgaaat - 3' /配列番号： 1 0 ) 、プライマ一 6 (5' -ccaagtttcagctcctatctgaagctgctc-3' / 配列番号： 1 1 ) 、プライマー 7 (5，- ggtccagatgaaaatctgagattggagaat- 3，/配歹 ij 番号： 1 2 )、プライマ一 8 (5， -atgtcttgacccaggctgacagatactgtt-3' /配列番号： 1 3 )、プライマ一9 (5' -cctcctgaaatctgattcacatacaaactg-3' /西己列番号： 1 4 )、プライマ——10 (5，一 aatgaactacataacaaccaccttagtcag_3， /酉己歹 ij番号： 1 5 )、プライマ一 11 (5，一 tacataacaaccaccttagtcagatactac— 3， /酉己列番号： 1 6 )、またはプライマー 12 (5，一 tactactttgaaacctggttcaaaacctaa— 3， /酉己列番号： 1 7 ) を用レ、ヽそれそれ MEGSIN遺伝子の- 1079〜+59、 - 1040〜+59、 - 1000〜+59、 - 940〜+59、 -92 7~+59、 - 669〜+59、 - 497〜+59、 - 258〜十 59、 -158〜十 59、 -128〜十 59、 -121〜十 59 または- 97〜+59を含む欠失変異 DNAを作製した。ルシフェラ一ゼ発現ベクター（P icca Gene Basic Vector 2：東洋インキ製）（図 4 )のマルチクローニング部位を K pnlおよび Hindi I Iで切断し、上記の PCR産物をライゲ一シヨンさせて、ベクタ一へ組み込んだ。ベクタ一は、 LiopfectAmine (Gibco- BRL社）を用いて、添付の説明書に従い細胞へ導入した。

まず、欠失させない MEGSIN遺伝子の上流領域（- 1154〜+59) を使ったベクターを種々の細胞へ導入し、転写活性の細胞種による特異性を検討した（図 5 ) 。ベクタ一を 37°C 5時間の条件でトランスフエクシヨンした（Derijard，B. et al .， Cel l, 76, 1025-1037 ( 1994) ) 。 37°Cで 2日間培養した後、培養液を取り除き、細胞を PBSで 3回洗浄し、細胞溶解（cell lysis) バッファーで溶解させライセ一トを得た。細胞のライセ一トは遠心し細胞残渣を沈殿させて除いた。蛍光の発光量は、 Lumat LB9507ルミノメーター（EG&G Berthold社）を用いて直接測定した。出力光の測定値を、波長 570nmにおける吸光度により算出したそれそれの 5 -ガラクトシダーゼ活性 [Herbomel，P. et al .， Cell , 39, 653-662 ( 1984)]で割ることにより、相対ルシフヱラーゼ活性を求めた。

細胞としては、実施例 1に記載の培養ヒトメサンギゥム細胞（Clontech社）、ヒト真皮線維芽細胞（HDF：宝酒造）、およびヒト腎皮質上皮細胞（HRCE :宝酒造）を使用した。その結果、ルシフェラーゼ活性は、培養ヒトメサンギゥム細胞において特異的に観察された（図 5 ) 。このことから、用いた転写制御領域はメサンギゥム細胞に対し特異性を有することが判明した。

次にさまざまな欠失変異 DNAについても前記と同様に操作して、ベクタ一へ組み込み、ヒト類表皮癌細胞株 A431または実施例 1の培養ヒトメサンギゥム細胞（C1 ontech社）にトランスフエクシヨンし、ルシフェラ一ゼ活性を測定した。その結果を図 6に示す。グラフは、欠失させない MEGSIN遺伝子の上流領域における活性を 100%とした相対値で示した。

- 1154bpから- 941bpまでを欠失させると、転写活性は約 60%に減少したことから、この領域に転写を正に制御する配列が存在することが示された。さらに- 159bpまで欠失させても、転写活性はほとんど低下しなかった。しかし、 - 158bpから- 121 bpまでを欠失させると、転写活性は全長の場合にくらべ 5% に減少した。特に、 - 128bpから - 121bpまでの間に転写活性が急激に低下することから、 -128〜- 121の領域が転写を正に制御するのに重要であると考えられる。

また、 -129〜- 90領域は、転写制御因子である AP- 1 (activating protein 1)結合配列 (cttagtcaga) [Lee,W. et al .， Nature, 325, 368-372 ( 1987)、 Folett a，V. C. et al .， J.Leuk. Biol . , 63, 139-152 ( 1998)]、 c-Myb結合配列 (aacaac cacc) (配列番号： 1の 13〜22位）および Oct-1結合配列（ctacataacaac) (配列番号： 1の 7〜： 19位) [Rosenfeld,M. G. et al .， Genes Dev. , 5, 897-907 ( 1991 )] を有することから、この領域に転写制御部位が存在する可能性が示唆された。これらの領域が MEGS IN遺伝子の転写活性化に関与しているかどうかをさらに検証するために、これらの領域のさまざまな部位に変異を導入し、転写活性を及ぼす影響を調べた。即ち、特定塩基に変異を導入することによる転写調節ドメインのポテンシャノレの変ィ匕を調べるために、 Quick Change site-directed mutagenes is kit (Stratagene製) を用い、説明書に従い操作し、 -128〜- 127を ggに (m l )、 - 120〜- 117を ccccに（m 2 )、 -116〜- 115を ggに（m 3 ) 、 -113〜- 112を ggに（m 4 )、 -106〜- 105をに（m 5 )、 -100〜- 98を ggcに（m 6 )、 -94〜- 93を ggに（m 7 ) に変異させた種々の変異体を作製した。

これらの変異体の生成は、直接ダイデォキシ核酸シークェンス法により確認した。これらの変異体を前述と同様に、ベクターに組み込み、そのルシフェラ一ゼ活性を求めた。その結果、 m 3〜！ ιι 7の変異体において、ルシフェラーゼ活性は著しく低下した（図 7 ) 。図中のグラフは、欠失させない MEGSIN遺伝子の上流領域における活性を 100%とした相対値で示した。

[実施例 4 ] プロモー夕一結合タンパク質の検索

実施例 3により、 -128から下流（3'側）の領域が転写を正に制御する活性を有することが判明したため、この領域に結合するタンパク質（転写因子）を 2種類のプローブ [プローブ A (5，- GMTGAACTACATMCMCCACC- 3，/配列番号： 1 9 ； - 1 29〜- 107領域）およびプローブ B (5， -AACCACCTTAGTCAGATACTACTTT-3' /配列番号： 2 0 ； -113〜- 89領域） ]を用いたゲルシフトアツセィにより検定した。

まず、各プローブの末端を常法によりラベル化した。次に、実施例 1のメサンギゥム細胞から核抽出物を Dignamらの方法 [Dignajn, J. et al . , Nucleic Acid R es.， 11 , 1475-1489 ( 1983 )] により調製した。続いて、 10%グリセロール、 5mM の塩化マグネシウム、 ImMの EDTA、 25mMのジチオスレィトール、 50mMの塩化力リウム、 10mMの Hepes- K0H、 3〃gの poly (dl-dC) 、 7〃Lの核抽出物、およびラベル化プローブを含む反応液中、室温で 30分間の条件で DNA-蛋白結合反応を行った。反応後、電気泳動に供し、オートラジオグラフィ一で解析した。その結果、いずれのプローブにおいても DNA-蛋白複合体のバンドシフ卜が認められたことから、 2 種類の転写因子の存在が確認できた（図 8 ) 。

MEGSINのメサンギゥム細胞特異的発現がこの領域を認識する転写因子の量的影響に左右されるかどうかを検討するために、実施例 1に記載の培養ヒトメサンギゥム細胞（Clontech社）、ヒト平滑筋細胞（HSMC：宝酒造）、ヒト真皮線維芽細胞（HDF：宝酒造）およびヒト腎皮質上皮細胞（HRCE：宝酒造）を用いてゲルシフトアツセィを行い、比較した。 DNA-蛋白錯体の量は、いずれのプロ一ブにおいても培養ヒトメサンギゥム細胞で特異的に多かった（図 9 ) 。このことは、 MEGSIN のメサンギゥム細胞特異的発現がこの領域を認識する転写因子により影響を受けることを示している。産業上の利用の可能性

本発明により、メサンギゥム細胞に特異的に発現している MEGSIN遺伝子のプロモー夕一が提供された。本発明のプロモ一夕一は、メサンギゥム細胞特異的な遺伝子発現のためのプロモー夕一として利用することができ、例えば、種々の腎疾患の遺伝子治療への応用が考えられる。また、該プロモ一夕一に結合する転写因子などのタンパク質のスクリーニングに利用することも可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1に記載の塩基配列またはその一部を含み、プロモーター活性を有する DNA。

2 . 請求項 1に記載の DNAを含むベクタ一。

3 . 請求項 1に記載の DNAの下流に異種遺伝子が発現可能な状態で結合している、請求項 2に記載のベクター。

4 . 請求項 3に記載のベクターが導入された細胞。

5 . 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部に結合するタンパク質のスクリーニング方法であって、

( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその一部に結合する活性を有するタンパク質を選択する工程、を含む方法。

6 . 請求項 5に記載の方法によって単離されうるタンパク質。

7 . 転写因子である、請求項 6に記載のタンパク質。