JP2002540782A

JP2002540782A - ヒト間葉ＤＮＡｓと発現産物

Info

Publication number: JP2002540782A
Application number: JP2000609443A
Authority: JP
Inventors: デンボス，クリスチャンヴァン; ムバラビール，ガブリエル
Original assignee: オシリスセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2002-12-03
Also published as: WO2000059933A3; AU4329300A; WO2000059933A2; EP1163338A2

Abstract

(57)【要約】ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）ｃＤＮＡとそれに含まれるオープンリーディングフレームから誘導される推定上のポリヌクレオチドが開示される。同じく開示されるのは、染色体地図化と同定、ＤＮＡフィンガープリント法と疾病プロセスでの遺伝子突然変異により果される可能な役割、および前記ポリペプチドに特異的なポリクローナルおよびまたはモノクローナル抗体の生成のための試薬としての用途を含むポリヌクレオチドとポリペプチドを利用する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は１９９９年８月１３日付け合衆国暫定特許出願番号６０／１４８，８
００号および１９９９年４月１日付け同６０／１２７，４１８号の優先権を主張
し、その開示はここでその全体を引用例として組み込まれている。

【０００２】本発明をヒト遺伝子の転写産物に一致する新しく同定されたポリヌクレオチド
配列に関し、またそれに関連する完全遺伝子配列に関し、更に遺伝子発現産物お
よび前記のものの用途に関する。

【０００３】

【背景の技術】

骨形成、すなわちオステオジェネシスの主要細胞である骨芽細胞は間葉幹細胞
から形成される。数多くの哺乳類のこのような間葉幹細胞（すなわちＭＳＣｓ）
は試験管内培養条件を変えることで結合組織細胞直系に分化するように誘導する
ことができる。骨細胞への分化である骨形成は培養および移植ＭＳＣｓから代替
骨を生成する手段として報告された（ブルーダー他、包括継代培養と引き続く冷
凍保存期間の精製ヒト間葉幹細胞の成長動力学、自己再生、および骨形成能、細胞生化学ジャーナル、６４（２）：２７８−２９４（１９９７年２月）；ジェー
スワル他、試験管内精製培養拡張ヒト間葉幹細胞の骨形成分化、細胞生化学ジャーナル、６４（２）：２９５−３１２（１９９７年２月）；カディヤラ他、培養
拡張イヌ間葉肝細胞は生体内および試験管内骨軟骨形成能を持つ、細胞移植、６
（２）：１２５−１３４（１９９７年３−４月（号）））。

【０００４】ＭＳＣｓが培養で骨形成分化を受けるプロセスは骨形成形態の発達、骨芽細胞
の特質であるヒドロキシアパタイト鉱質化細胞外基質の沈着および末端分化骨細
胞の存在、並びにアルカリホスファターゼの発現により特徴付けられる（ジェー
スワル他、試験管内精製培養拡張ヒト間葉幹細胞の骨形成分化、細胞生化学ジャーナル、６４（２）：２９５−３１２（１９９７年２月）。ヒトＭＳＣｓ（以下
ｈＭＳＣｓと呼ぶ）の骨形成分化の基礎にある機構はほとんど理解されていない
。このプロセスの間に産生されるタンパク質の同定は骨芽細胞とその骨形成能を
標的とする小分子の発見と開発を容易に促進するであろう。これらの因子の同定
はこの分化の各種の段階の間にｈＭＳＣｓから構築される関係ｃＤＮＡライブラ
リーが利用可能になることで加速されるであろう。

【０００５】ヒト遺伝子の同定と配列化は近代分子生物学の主要な目標である。例えば、遺
伝子を同定しその配列を決定することにより、科学者は大量の価値あるヒト「遺
伝子産物」を作ることができた。これらのものはヒトインスリン、インターフェ
ロン、因子VIII、腫瘍壊死因子、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性
化因子、および数多くの他の化合物である。更に遺伝子配列の組織は（筋ジスト
ロフィーおよび嚢胞性線維症などのような）遺伝病の処置または治療の鍵を提供
することができる。

【０００６】

【発明の開示】

本発明に従って、間葉乾細胞（ＭＳＣｓ）がヒトから単離され培養拡張され、
それらから、新しいｃＤＮＡライブラリーがヒトＭＳＣｓから単離されたメッセ
ンジャーリボ核酸（以下ｍＲＮＡｓ）から構築された。

【０００７】精製され培養されたＭＳＣｓからｃＤＮＡライブラリーを獲得し、これらの単
離された核酸、単離された配列およびその断片をこれらの核酸とその断片を含む
配列の発現産物の決定と調製に使用することが本発明の目的である。

【０００８】このように産生されたｃＤＮＡｓ、およびその断片、同じくその発現産物を分
化間葉細胞の成長の間に発現されるゲノム内の遺伝子およびその対立遺伝子の位
置を決定するための染色体遺伝標識として使用することが本発明の更なる目的で
ある。

【０００９】更にヒト「フィンガープリント法」に使用するためにＤＮＡ配列を提供し、こ
れによりここで開示されるものと完全に、または部分的に同一として識別される
遺伝子の配列に基づき異なった個体を識別できるＤＮＡ配列を提供することが本
発明のもう一つの目的である。

【００１０】更にまたここで開示されるように、ポリペプチドをコーディングする遺伝子に
一致するポリヌクレオチド配列を提供し、これによりそのような配列が動物、と
りわけ哺乳類、またもっとも特にヒトにおいて類似の染色体位置に見出される物
と比較することができ、ここでそのような動物が骨成長、またはそのような他の
疾病、もしくはそのような遺伝子に影響する疾病に苦しんでおり、かくしてその
ような疾病に導く前記遺伝子での突然変異を検出することが本発明のもう一つの
目的である。

【００１１】更にまた本発明に基づく遺伝子の急速クローニングのためにペプチド、または
ポリペプチドもしくはタンパク質を発現できる本発明に基づく核酸、またはＤＮ
Ａｓ、あるいは遺伝子、もしくはヌクレオチド配列の１個またはそれ以上の複製
を含む遺伝子操作細胞、またはベクターを提供することが本発明の目的である。

【００１２】

【発明の説明】

本発明の一つの見地は核酸と単離ＤＮＡ配列と分子、およびその断片（並びに
対応する単離ＲＮＡ配列とその断片）に向けられ、前記のものに相補の配列を含
み、配列識別番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，
２３，２５および２７または２８で同定されるＤＮＡ配列に類似の配列を示し、
あるいはそれらのＤＮＡ配列にハイブリッド形成できる前記核酸、ＤＮＡ配列と
分子、およびその断片に向けられる。本発明は更に少なくとも１５塩基、望まし
くは少なくとも３０塩基、より望ましくは少なくとも５０塩基、もっとも望まし
くは８０塩基を含むこのような配列に向けられ、また配列識別番号２，４，６，
８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６および２９のポリ
ペプチドをコード化するＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列に少なくとも６０％、望ま
しくは少なくとも８０％、もっとも望ましくは少なくとも９５％、とりわけ９８
％同一であるこれらの配列に向けられ、その断片または部分を含み、それが天然
源から誘導される場合にはその対立遺伝子を含むような配列に向けられる。

【００１３】本発明に従って、配列を引用するときに「パーセント同一性」または「パーセ
ント同一である」という用語は、比較されるべき配列（「比較配列」）と説明ま
たは請求される配列（「引用配列」）とのアラインメントの後に配列が説明また
は請求される配列と比較されることを意味する。パーセント同一性は下記の式に
基づき決定される。

【００１４】パーセント同一性＝１００〔１−（Ｃ／Ｒ）〕ここでＣは引用配列と比較配列の間のアラインメントの長さ全体にわたり引用
配列と比較配列の間の差の数であり、ここで（ｉ）比較配列に対応するアライン
された塩基またはアミノ酸を持たない引用配列内の各塩基またはアミノ酸、およ
び（ii）引用配列内の各ギャップ部および（iii）比較配列内のアラインされた
塩基またはアミノ酸と異なる引用配列内の各アラインされた塩基またはアミノ酸
が差異を構成する。またＲは引用配列内に創られ同じく塩基またはアミノ酸とし
て計数されるいずれかのギャップ部と共に比較配列とのアラインメントの長さに
わたり引用配列での塩基とアミノ酸の数である。

【００１５】もしも前に計算されたように特定の最小パーセント同一性とほぼ同じかもしく
はそれより大きいアラインメントが比較配列と引用配列の間に存在するとすれば
、ここで計算されたパーセント同一性が特定のパーセント同一性以下であるアラ
インメントが存在するとしても、比較配列は引用配列に対して特定の最小パーセ
ント同一性を持つことになる。

【００１６】その上更に本発明の見地は少なくともヒト遺伝子、とりわけ発現されたヒト遺
伝子のコーディング領域またはそのようなコーディング領域での同じポリペプチ
ドをコード化するＤＮＡ配列を含む単離されたＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列ある
いは分子に向けられ、この日と遺伝子は配列識別番号１，３，５，７，９，１１
，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５および２７または２８で示された
配列、あるいはそれらに少なくとも６０％、望ましくは少なくとも８０％、また
もっとも望ましくは９５％、とりわけ９８％同一であり、１００％同一性のもの
も含む配列に相同であるかそれに寄与するＤＮＡ配列を含み、同じく前記コーデ
ィング領域によりコード化されるポリペプチドに対して類似の機能をもつポリペ
プチドをコード化する断片または部分を含む。かくして単離されたＤＮＡ（また
はＲＮＡ）配列は発現された遺伝子（またはここで示されたその断片または部分
）のコーディング領域のみを含み、あるいは更に発現されたヒト遺伝子の非コー
ディングＤＮＡ（またはＲＮＡ）の全体または部分を含む。

【００１７】一般に配列識別番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２
１，２３，２５および２７または２８の配列（あるいはそれに少なくとも６０％
、望ましくは少なくとも８０％、またもっとも望ましくは少なくとも９５％同一
または相同である配列）に相同またはそれに寄与する配列はヒト遺伝子のコーデ
ィング領域からのものである。

【００１８】本発明は更にこのようなＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を含むベクターまたはプ
ラスミド、並びにＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の用途に関する。

【００１９】配列識別番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２
３，２５および２８で示された配列は異なったヒト組織から誘導されて実際のＤ
ＮＡとＲＮＡ配列でハイブリッド形成可能である。これらの配列はｃＤＮＡクロ
ーンを表す。

【００２０】図１（配列識別番号２７）で示される配列は異なったヒト組織から誘導されて
実際のＤＮＡとＲＮＡ配列でハイブリッド形成可能である。数多くのｃＤＮＡク
ローンが生成された。図１（配列識別番号２７）のヌクレオチド配列自身は研究
される各種組織での各位置を示した。各種ヒト組織でのこの配列の分布は図３と
図４で示される。これらクローンのいくつかは追加の３’未翻訳領域を持ち、そ
の存在はｍＲＮＡ種が回収される前に細胞に留まる範囲と一般に関連がある。キ
ングマン、遺伝子工学、ブラックウェル（出版）１９８８、３１３ページ参照。
３’未翻訳領域は更にｍＲＮＡが翻訳され、かくしてタンパク質の発現を調節で
きる機構を構成する頻度を調節する（Ｎ．Ｋ．グレーおよびＭ．ウィッケンズ、
動物における翻訳開始の制御、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．（細胞生長生物学アニュアルレビュー）、１４：３９９−４５８（１９８８））
。

【００２１】本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態にあり、このＤ
ＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖また
は一本鎖であり、一本鎖の場合はコーディング鎖または非コーディング（アンチ
センス）鎖である。成熟ポリペプチドをコード化するコーディング配列はここで
開示されるポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）
として存在するコーディング配列と同一であるかもしくは異なるコーディング配
列であり、このコーディング配列は遺伝暗号の冗長または縮重の結果、配列識別
番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５お
よび２８のポリヌクレオチド配列として同一成熟ポリペプチドをコード化する。

【００２２】推定上のタンパク質配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，
１８，２０，２２，２４，２６および２９としてここに開示されるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは必ずしもそれのみに限定されないが、成熟ポリ
ペプチドのコーディング領域；リーダー配列または分泌配列、プロタンパク質と
膜アンカーなどの成熟ポリペプチドのコーディング配列および追加コーディング
配列；イントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の非コーディング
配列５′およびまたは３′などのような成熟ポリペプチドのコーディング配列（
および選択肢として追加のコーディング配列）更に非コーディング配列を含む。

【００２３】図２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列識別番号２９）は必
ずしもそれのみに限定されないが、成熟ポリペプチドのコーディング配列；リー
ダーまたは分泌配列、プロタンパク質と膜アンカーなどの成熟ポリペプチドのコ
ーディング配列および追加コーディング配列；イントロンまたは成熟ポリペプチ
ドのコーディング配列の非コーディング配列５′およびまたは３′などのような
成熟ポリペプチドのコーディング配列（および選択肢として追加のコーディング
配列）更に、非コーディング配列を含む。

【００２４】本発明で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコー
ディング領域のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコーディング配列およ
びまたは非コーディング領域を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００２５】本発明は更に配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，
２０，２２，２４，２６および２９のアミノ酸配列を持つポリペプチドの断片、
類似体および誘導体をコード化する前記のポリヌクレオチドの変異体に関する。
ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然発生対立遺伝子変異体また
はポリヌクレオチドの非天然発生変異体である。

【００２６】かくして本発明に基づく核酸、またはポリヌクレオチドは配列識別番号１，３
，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７および
２８で示されるコーディング配列の自然発生対立遺伝子変異体であるコーディン
グ配列を持つ。従来技術で公知のように、対立遺伝子変異体はコード化ポリペプ
チドの機能を事実上変更したい１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失
または追加をもつポリヌクレオチド配列の代替的形態である。

【００２７】本発明は更にポリヌクレオチドを含み、ここで成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現を分泌を助け、例えば細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御する分泌配列としてまたポリペプチドの細胞膜への付
着を促進する膜貫通アンカーとして機能するリーダー配列などのようなポリヌク
レオチド配列に同じリーディングフレーム内で融合する。リーダー配列を持つポ
リペプチドはプレタンパク質であり、成熟ポリペプチドを形成するために宿主細
胞で切断されるリーダー配列を持つであろう。ポリヌクレオチドは更に成熟タン
パク質プラス追加５′アミノ酸残基であるプロタンパク質をコード化するであろ
う。プロ配列を持つ成熟タンパク質はプロタンパク質であり、しばしばタンパク
質の不活性形態である。一度プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残
存する。

【００２８】かくして例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質を、プロ配列を
持つタンパク質を、膜貫通アンカーを持つタンパク質をあるいはプロ配列、プロ
配列（リーダー配列）と膜貫通アンカーを持つポリペプチドをコード化する。

【００２９】本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドの精製を可能にする標
識配列にコーディング配列をフレーム内で融合させる。標識配列は細菌宿主の場
合に標識に融合する成熟ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジン標識であり、あるいは例えば哺乳類宿主の場合に
は標識配列は赤血球凝集素（ＨＡ）標識であり、例えばＣＯＳ−７細胞が使用さ
れる。ＨＡ標識はインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピト
ープに一致する（Ｉ．ウイルソン、他、細胞、３７：７６７（１９８４））。

【００３０】本発明の全長ポリヌクレオチドの断片は全長ｃＤＮＡを単離しまた遺伝子に対
し高い配列類似性または類似の生物活性を持つ他のｃＤＮＡを単離するためのｃ
ＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成プローブとして使用される。この型のプ
ローブは望ましくは少なくとも１５塩基、少なくとも３０塩基、更には５０塩基
もしくはそれ以上の塩基を持つ。プローブはまた全長転写物に一致するｃＤＮＡ
クローンおよびゲノムクローンまたは調節領域、プロモーター領域、エキソン、
およびイントロンを含む完全遺伝子を含むクローンを同定するために使用される
。選別の例はオリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を
使用して遺伝子のコーディング領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配
列に相補性の配列を持つ標識オリゴヌクレオチドは、プローブがライブラリーの
どの部材にハイブリッド形成するのかを決定するためにヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーを選別するために使用される。

【００３１】本発明に基づく一つのポリヌクレオチドは、配列識別番号１，３，５，７，９
，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７および２８のポリヌ
クレオチドにハイブリッド形成し、それに対し前記のとおり同一性を持ち、また
活性を保持しあるいは保持しない少なくとも１５塩基、望ましくは少なくとも３
０塩基、またより望ましくは５０塩基を持つ。このようなポリヌクレオチドはポ
リヌクレオチドのプローブとして、または例えばポリヌクレオチドの回収または
診断プローブもしくはＰＣＲプライマーとしての配列識別番号２，４，６，８，
１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６および２９のポリペプ
チドの遺伝子コーディングのプローブとして使用することができる。

【００３２】本発明に基づくポリヌクレオチドは更に配列識別番号１，３，５，７，９，１
１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７および２８のヌクレオチ
ド配列のいずれかを含み、その断片のいずれかおよびすべてを含み、またそのヌ
クレオチド混合物がそのようなポリヌクレオチドまたはその断片のいずれかの数
で構成され、少なくとも１０個、多分少なくとも３０個のそのような配列または
その断片を持つ混合物を含む遺伝子配列にある程度までハイブリッド形成可能な
ポリヌクレオチドの混合物の形態で生じる。

【００３３】コーディング領域がごく僅かなヒトゲノムの部分を含むために、染色体の転写
領域とコーディング領域の同定と地図化は著しく興味深いものがある。染色体の
コーディング領域と転写領域を同定し標識する試薬に対応する必要性が存在する
。更にこのようなヒト配列は染色体の地図化、ヒト同定、組織の型と起源の同定
、法廷上の同定、染色体に対する疾病関連遺伝子（すなわち突然変異、欠失、ま
たは、誤った遺伝子発現のいずれかを通じてのヒト遺伝疾病と関連する遺伝子）
の位置付けにとっては価値がある。

【００３４】本発明の各種の見地は個体の配列、対応する部分および完全ｃＤＮＡｓ、ゲノ
ムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス鎖、ＰＣＲプライマー、コーディング領域お
よび構築物のそれぞれを含む。発現ベクターおよびポリペプチド発現産物もまた
、このような発現産物に対する抗体とりわけモノクローナル抗体とともに本発明
の範囲内にある。

【００３５】ここで使用されまた特に記載される場合を除き、すべての用語は以下の定義に
よる。

【００３６】本発明に基づき「遺伝子」または「シストロン」という用語はポリペプチド鎖
を産生することに係るＤＮＡのセグメント（すなわちＤＮＡセグメント）を意味
する。それはコーディング領域に前後する領域（５′および３′未翻訳領域すな
わちＵＴＲｓ、またリーダーおよびトレーラー配列、領域またはゼグメントと呼
ばれる領域）並びに個別のコーディングセグメント（エキソン）管の介在配列（
イントロン）を含み、このイントロン領域は最終翻訳可能ｍＲＮＡ産物を形成す
るために転写後ＲＮＡの処理の間に典型的には除去される。もち論その性質から
、ｃＤＮＡはイントロン配列を含まない。

【００３７】本発明に従って、「ＤＮＡセグメント」という用語は異なった断片の形態でま
たはより大きなＤＮＡ構築物の成分としてＤＮＡポリマーを意味し、それは少な
くとも一度事実上純粋な形態で、すなわち、不動する内因性ベクターを用いる方
法によりセグメントとその成分ヌクレオチド配列を同定、操作および回収可能に
する量または濃度で単離された。このようなセグメントは典型的に真核遺伝子に
存在する内部未翻訳配列（イントロン）により邪魔されることのないオープンリ
ーディングフレームの形態で提供される。未翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーデ
ィンフレームからの下流に存在し、ここでは同じものはコーディング領域の操作
または発現に干渉することはない。

【００３８】本発明に基づき開示された核酸およびポリペプチド発現産物並びにこのような
核酸を含む発現ベクターは、「富化形態」にある。ここで使用されるように、「
富化」という用語は物質の濃度（例えば）その天然の濃度よりも少なくとも約２
倍、５倍、１０倍、１００倍または１０００倍であり、望ましくは重量で０．０
１％、望ましくは少なくとも重量で約０．１％であることを意味する。重量で約
０．５％、１％、５％、１０％および２０％の富化調製物も同じく検討される。
本発明を含む配列、構築物、ベクター、クローン、および他の物質は有利に富化
または単離形態にすることができる。例えは、ここに記載された差動ディスプレ
ー技術を経由して、リボソーム遺伝子と「ハウスキーピング」遺伝子に一致する
クローンおよびヒトｃＤＮＡ挿入片無しのクローンの除去は、望ましいクローン
で「富化」されるライブラリーに帰着する。

【００３９】本発明に基づき開示されるＤＮＡとＲＮＡ配列、およびポリペプチドは一般に
単離形態にある。「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えばも
しそれが自然発生のものであれば自然環境）から移動されることを意味する。例
えば生きた動物に存在する自然発生ポリヌクレオチドまたはＤＮＡが単離されず
、自然システムでの共存物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリペ
プチドまたはＤＮＡが単離される。このようなＤＮＡはベクターの一部であり得
るし、およびまたはこのようなポリヌクレオチドは組成物の一部であることもで
き、また更にこのようなベクターまたはポリヌクレオチドはその自然環境の部分
でないように単離することができる。

【００４０】本発明に基づき開示されるＤＮＡとＲＮＡ配列およびポリペプチドは「精製さ
れた」形でも存在する。「精製された」という用語は必ずしも完全な純度を必要
としない。むしろそれは相対的な定義として意図され、これらの用語が当業者に
より理解されるように高度に精製された調製物または部分的にのみ精製された調
製物を含むことができる。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個体クローンは
電気泳動同質性に対し従来の方法で精製された。ｃＤＮＡクローンは部分的に精
製された自然発生物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を経由して得られる。ｍ
ＲＮＡのｃＤＮＡへの転換により、精製個体ｃＤＮＡクローンをクローン選択に
より合成ライブラリーから単離することができる。かくしてＲＮＡからｃＤＮＡ
ライブラリーを創り、続いてこのライブラリーから個体クローンを単離すること
により生のメッセージの約１０⁶倍の精製に帰着する。出発物質または天然物質
の少なくとも１桁の大きさ望ましくは２桁または３桁、およびより望ましくは４
桁または５桁の大きさが時に考慮される。更に望ましくは０．０１％、または少
なくとも０．０１％または０．１％およびなお望ましくは重量で１％あるいはそ
れ以上の純度を持つ請求項のポリヌクレオチドが特に考慮される。

【００４１】「コーディング領域」という用語は、その天然ゲノム環境でその遺伝子の発現
産物を自然にまたは正常にコードするヒト遺伝子の部分、すなわち遺伝子の自然
発現産物を生体内でコーディングする領域を意味する。コーディング領域は正常
、突然変異、または変更された遺伝子からのものであることができ、あるいはＤ
ＮＡ合成の当業者に公知である方法を用いて実験室で完全に合成されるＤＮＡ配
列、または遺伝子からのものであることさえ可能である。

【００４２】本発明に基づき、「ヌクレオチド配列」という用語はデオキシリボヌクレオチ
ドのヘテロポリマーを引用する。一般に本発明により提供されるタンパク質をコ
ード化するＤＮＡセグメントは、微生物またはウイルスオペロンから誘導される
調節要素を含む組換え転写ユニットで発現され得る合成遺伝子を提供するために
、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌ
クレオチドから組立てられる。

【００４３】「発現産物」という用語は、遺伝子の天然転写産物、および遺伝子コード縮重
から生成する等価物をコーディングしまたはかくして同じアミノ酸をコーディン
グするいずれかの核酸配列であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【００４４】コーディング配列を引用する時の「断片」という用語は、その発現産物が完全
コーディング領域の発現産物と同じ機能または活性を基本的に保持する完全ヒト
コーディング領域以下のもの含むＤＮＡの部分を意味する。

【００４５】ここで使用されるようにポリペプチドの一部を引用する時に「部分」、「セグ
メント」、および「断片」という用語は、その配列がより大きな配列のサブセッ
トを形成する例えばアミノ酸残基などのような残基の連続する配列を引用する。
例えば、もしポリペプチドがいずれかの普通のエンドペプチダーゼ、例えばトリ
プシンまたはキモトリプシンで処置されたなら、このような処置から生じるオリ
ゴペプチドは出発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片を表すことになる
であろう。同様にポリヌクレオチドの部分、セグメントまたは断片はこのような
ポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼでの処置から生じたこれらの産物を含む
であろう。

【００４６】「プライマー」という用語はＤＮＡの一本鎖で対にされ、ＤＮＡポリメラーゼ
がデオキシリボヌクレオチド鎖の合成を開始する遊離３′ＯＨ末端を提供する短
い核酸配列を意味する。

【００４７】「プロモーター」という用語は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼの
結合を伴うＤＮＡの領域を意味する。

【００４８】「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、何らの停止コド
ン無しでアミノ酸の一連の三文字暗号を意味し、また（潜在的に）タンパク質に
翻訳可能な配列である。

【００４９】「エキソン」という用語は成熟ＲＮＡ産物で代表される非連続性遺伝子のいず
れかのセグメントを意味する。

【００５０】ここで使用されるように、ＤＮＡ配列への引用は一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡ
の両方を含む。かくして前後関係が他のものを指示するものでない限り、この特
異的配列はこのような配列の一本鎖ＤＮＡ、その補体を持つこのような配列の二
重構造（二本鎖ＤＮＡ）およびこのような配列の補体を引用する。

【００５１】本発明に基づき、ｈＭＳＣｓからのｃＤＮＡの同定のためのアプローチは培養
でのヒト間葉幹細胞成長の間の遺伝子発現を含んでいた。細胞は収穫されその全
ＲＮＡ容量は回収された。次いで各種のプライマーの組合せを用いて逆転写酵素
とポリメラーゼ連鎖反応手続（ＲＴ−ＰＣＲ）が対応するｃＤＮＡｓを産生し増
幅するために使用され、そのｃＤＮＡｓは次いで精製されクローンされる調節Ｄ
ＮＡ配列を発見するためにスクリーンされた。これらのクローンは次いで配列化
されコンセンサス配列を決定するために使用された（コンセンサス配列は貢献す
る配列が残基位置によりアラインされた後に配列内の各ヌクレオチド位置にある
もっとも普通に発生する塩基に基づく配列である）。生成する配列は次いで例え
ばブラストプログラムおよびジェンバンクデータベースを用いて新規性と既知の
配列との相同性のためにコンピュータデータベース検索を受けた。

【００５２】ＲＴ−ＰＣＲ手順を用いて、対象となる細胞からのｍＲＮＡ（例えば本発明に
基づき使用されるｈＭＳＣｓなど）が細胞の発現遺伝子に一致する一連のもしく
はファミリーのｃＤＮＡを準備するために使用される。このｃＤＮＡ調製物は次
いで遺伝子を発現しない細胞のｍＲＮＡと完全にハイブリッド形成され、２個の
細胞サンプルに共通するｃＤＮＡ調製物からのすべての配列除去を来たす。他の
ｍＲＮＡとハイブリッド形成するすべてのｃＤＮＡ配列とそのまま残る配列とは
次いで遺伝子を発現する細胞（例えば、健康なヒトからの細胞または遺伝子を発
現するものとして知られる組織からの細胞）でそれらが事実上望ましいコーディ
ング領域にあるかどうかを確認するためにｍＲＮＡでハイブリッド形成される。
これら後者のクローンが対象となる細胞のｍＲＮＡ集団に特異的な配列を含むた
めに、それらは続いて増幅され、ＰＣＲの更なるラウンドと分子生物学の一般手
法を用いて増幅され特徴付けることができる。

【００５３】前記に従って、ｃＤＮＡライブラリーが生成され、それは配列識別番号１，３
，５，７，９，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７および２８の
配列と一致する。これらのｃＤＮＡｓに基づくプローブは、各種組織の細胞内に
これらの配列を局在化する従来の技術で公知のノーザンブロッティング分析を使
用して関連する転写物を同定するのに使用することができる。例えば、図２のポ
リペプチド（配列識別番号２９）をコードする遺伝子のもっとも重い分布は図３
と図４で示されるように心臓組織にあった。

【００５４】本発明に従って、ｃＤＮＡは製造業者（カリフォルニア、ラホーラ、ストラー
タジーン）からの指示に従って、準備されるエチジウムアガロース平板上に標準
のサンプル０．５μｌアリコートをスポットすることで定量された。平板は室温
で１５分保温され、ＤＮＡは紫外透照により視覚化された。それぞれのｃＤＮＡ
は次いでサンプルのスポット強度を標準のものと比較することで定量化された（
後者は１キロベースのはしごの適切な希釈により成る（ライフテクノロジーから
のもの））。

【００５５】各増幅ライブラリーのアリコートは除去され任意に選択されたコロニーからの
プラスミドは制限ヌクレアーゼ分析で分析された。本発明に従って、プラスミド
ＤＮＡはＥｃｏＲＩをＸｈｏｌヌクレアーゼ（ニューイングランド・バイオラブ
）の両方で消化され、生成制限断片は１．５％アガロースゲル電気泳動で分離さ
れた。ｃＤＮＡ挿入片は１キロベース対以下から大きいものは４キロベース対以
上のサイズわたった（１キロベース対＝二本鎖ＤＮＡの１，０００ヌクレオチド
塩基対）。

【００５６】ここで同定されたＤＮＡ配列のそれぞれ（および対応する完全遺伝子配列）は
ポリヌクレオチド試薬として数多くの方法で使用することができる。この配列は
とりわけ細胞型同じく遺伝子連鎖分析（多形性）で特異的ｍＲＮＡの存在を確か
める診断プローブとして使用できる。更に配列は遺伝子病に関連する遺伝子領域
の位置付けのためのプローブとして使用できる。

【００５７】本発明のヌクレオチドおよび遺伝子配列は更に染色体同定のために価値がある
。各配列は個体ヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化しまたその位置でハ
イブリッド形成することができる。更に染色体上の特定の部位を同定する必要性
が現在ある。本発明に基づく特異的染色体に対するポリヌクレオチドの地図化は
これらの配列を疾病と関連する遺伝子に相関させるための重要な第１ステップと
なる。

【００５８】要約すると、配列はここで開示される配列からＰＣＲプライマー（望ましくは
１５−３０塩基対）を準備することにより染色体上に地図化することができる。
これら配列のコンピュータ分析は、さもなければ増幅プロセスを複雑にしかねな
い対応するゲノムＤＮＡで１個以上のエキソンに広げないプライマーを急速に選
択するのに使用される。これらのプライマーは次いで個体ヒト染色体を含有する
体細胞雑種のＰＣＲスクリーニングの使用される。ここで開示される配列または
部分配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらの雑種細胞のみが増幅された断片を
産出するであろう。

【００５９】体細胞雑種のＰＣＲ地図化は特定配列を特定染色体に割当てるための加速手順
である。従来技術で公知にように、単一のサーマルサイクラーを用いて１日当り
３個以上のクローンを割り当てることができる。同じオリゴヌクレオチドプライ
マーで本発明を使用して、類似の方法で大きなゲノムクローンの特異的染色体ま
たはプールからの断片のパネルで部分局在化を達成することができる。配列、あ
るいは配列の部分の同様に使用できるその染色体に対する他の地図化戦略はｉｎ
ｓｉｔｕ（原位置）ハイブリッド形成、標識フロー分類染色体のプレスクリー
ニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー構築のためのハイブリット形成
による予備選別を含む。

【００６０】中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光ｉｎｓｉｔｕ（原位置）
ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ法）は１ステップで正確な染色体位置を提供する
のに使用することができる。この方法は５００または６００塩基ほどの短いｃＤ
ＮＡで使用できる。しかし２０００塩基対以上の大きいクローンは単純な検出に
対し充分なシグナル強度でユニークな染色体位置に結合するより高い尤度を持つ
。ＦＩＳＨ法は配列がそれから誘導されたクローンの使用を必要とし、それが長
ければ長いほどいい。例えば２０００塩基対は良く、４０００塩基対はより良く
、しかし４０００以上はたぶん時間の妥当な割合でいい結果を得るためには必要
ではない。この技法の報告については、ヴァーマ他、ヒト染色体：基本技術のマニュアル、ペルガモン・プレス、ニューヨーク（１９８８）を参照されたい。

【００６１】染色体地図化のための試薬は（単一染色体またはその染色体上の単一部位を標
識するために）個別に、または（多数の部位およびまたは多数の染色体を標識す
るために）試薬のパネルとして使用することができる。遺伝子の非コーディング
領域に対応する試薬は事実上地図化目的のためには望ましい。コーディング配列
は遺伝子ファミリー内により多く保持され、かくして染色体地図化の間に交差ハ
イブリッド形成の機会を増加させる。

【００６２】一度配列が正確な染色体位置に地図化されると、染色体上の配列の物理的位置
は遺伝地図データで相関させることができる。（このようなデータは、例えばＶ
．マッキューシック、ヒトにおけるメンデルの遺伝的性質、で見出される（ジョ
ンズ・ホプキンズ・ユニバーシティ、ウエルチ・メディカル・ライブラリーを通
じてオンラインで利用可能））。同じ染色体領域に地図作製される遺伝子と疾病
の間の関係は次いで連鎖分析（物理的に密接な遺伝子の同時遺伝）を通じて同定
される。

【００６３】次いで影響を受けおよび影響を受けない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列に
差が存在するかどうかを決定する必要がある。もしも突然変異が影響を受けた個
体のいくらかまたはすべてで観察されるがその正常な個体では観察されないなら
ば、突然変異は疾病の原因となる病原体となるであろう。

【００６４】物理的地図化と遺伝子地図化の手法での現在の解決法により、疾病と関連する
染色体領域に正確に局在化するｃＤＮＡは５０種乃至５００種の潜在的病原性病
遺伝子のどれか一つと見ることができる（これは１メガベース地図化解決と、２
０キロベースあたり１個の遺伝子を仮定する）。

【００６５】影響を受けおよび受けなかった個体の比較は染色体スプレッドから可視であり
あるいはｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な欠失またはトランスロ
ケーションなどの染色体内の構造的変質を一般に最初に見ることを伴う。最終的
には、各個体からの遺伝子の完全な配列化が突然変異の存在を確認し、また突然
変異を多形成から区別することが必要とされる。

【００６６】前記に加えて、広範囲に記載された本発明の配列は、そのいずれの方法もポリ
ヌクレオチド配列のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく三重鎖形成またはアン
チセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御するために使用するこ
とができる。これらの方法での使用に適したポリヌクレオチドは通常２０個乃至
４０個の塩基の長さであり、転写に伴う遺伝子の領域に相補であるように設計さ
れている（三重鎖−リー他、核酸研究、６：３０７３（１９７９）；クーニー他
、サイエンス、２４１：４５６（１９９８）；またダーバン他、サイエンス、２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）し、あるいはまたｍＲＮＡそれ自体
に相補であるように設計されている（アンチセンス−岡野Ｊ．神経化学、５６：
５６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンス阻害薬としてのオリゴデオキシ
ヌクレオチド、ＣＲＣプレス、ボカレイトン、フロリダ、（１９９８））。三重
鎖形式は最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の停止に帰着し、一方アンチセンスＲ
ＮＡハイブリッド形成はｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を遮断する。いず
れの方法もモデルシステムで有効でることが示された。本発明の配列に含まれる
情報はアンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチドの設計に必要である。アン
チセンスＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成またはＲＮＡｓｅＨ
活性に導き従って雑種細胞に含まれる分子の破壊に導く。

【００６７】本発明はまた遺伝子治療に有用な用具であり遺伝子欠損を修正するために正常
な遺伝子を生体に挿入する前提条件として問題となる疾病関連遺伝子の単離を必
要とする。本発明に基づくｃＤＮＡプローブの高い特異性が高い精度でこのよう
な遺伝子の位置を標的にすることを保証する。

【００６８】広範囲に定義されその部分配列と断片を含む本発明の配列は更に微小生物サン
プルからの個体の同定に有用である。例えば合衆国陸軍はその兵員の同定のため
に制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を検討している。この手法では、個体ゲノ
ムＤＮＡは１個またはそれ以上の制限酵素で消化され、兵員を同定するためのユ
ニーク帯を産出するためにサザンブロットでプローブされる。この方法は失った
り、切り換えたりあるいは盗まれたりして確信ある同定を難しくしがちな「認識
票」での現在の制約に悩むことはない。本発明の配列はＲＦＬＰの追加のＤＮＡ
標識として有用である。

【００６９】しかしＲＦＬＰはパターンベースの技法であり、それは配列化されるべき個体
のＤＮＡ配列を必要とはしない。本発明の配列の部分は個体ゲノムの選択部分で
事実上塩基単位ＤＮＡ配列を決定する代替的手法を提供するために使用すること
ができる。更にこれらの配列はこのような選択されたＤＮＡを増幅し単離するＰ
ＣＲプライマーを調製するために使用することができる。例えば本発明の配列の
一部を取り出し配列の５'および３'末端または配列の断片から２個のＰＣＲプラ
イマーを調製することができる。これらは配列に対応する個体ＤＮＡを増幅する
ために使用される。増幅ＤＮＡは配列される。

【００７０】このようにして作られた個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が
対立遺伝子の差の故でこのようなＤＮＡ配列のユニークセットを持つので、ユニ
ークな個別的同定を提供することができる。本発明の配列は個体からまた組織か
らのこのような同定配列を得るための特定の利益に使用することができる。対立
遺伝子変質はこれら配列のコーディング領域である程度起こり、また非コーディ
ング領域ではより大きな度合で生じる。個体ヒトの間での対立遺伝子変質は各５
００塩基毎に約１個の頻度で生じる。本発明の部分を含む断片または完全コーデ
ィング配列のそれぞれは、ある程度まで個体からのＤＮＡが同定目的と比較でき
ることに対する標準として使用することができる。より大きな数の多型性が非コ
ーディング領域で生じるために、より少ない数の配列が分化した個体にとって必
要である。

【００７１】もし本発明に基づく配列からの試薬のパネルが個体に対するユニークＩＤデー
タベースを生成するために使用される場合には、これらの同じ試薬は後でその個
体からの組織を同定するのに使用できる。生きていても死んでいてもその個体の
明白な同定を極めて小さな認識サンプルから行うことができる。

【００７２】ＤＮＡベースの同定技術のも一つの使用法は法生物学においてである。ＰＣＲ
技術は非常に小さな生物サンプルから取られたＤＮＡ配列を増幅するのに使用で
きる。一つの先行後術において、遺伝子配列は大きな数の対立遺伝子変質、例え
ばＤＱαクラスII ＨＬＡ遺伝子を含むものとして知られる特異的遺伝子座で増
幅される（Ｈ．エルリッヒ、ＰＣＲ技術、フリーマン・アンド・カンパニー（１
９９２））。ゲノムのこの特異的領域が一度増幅されると、ＤＱαクラスII Ｈ
ＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロット上の同定セットの
帯を産生するために、それは１個またはそれ以上の制限酵素で消化される。本発
明に基づいて、本発明に基づく新規な遺伝子シグナルが身体の多くの異なった組
織で見出されるということが図３と図４で示された結果から明らかである。

【００７３】本発明の配列はヒトゲノムにある追加の遺伝子座を特異的に標的とするポリヌ
クレオチド試薬を提供するために使用することができ、またＤＮＡベースの法的
同定の信頼度を高めることができる。非コーディング領域を標的とするこれらの
配列はとりわけ適切である。前に記載の通り、実際の塩基配列情報は制限酵素生
成断片により形成されるパターンに対して正確な選択肢として同定のために使用
できる。このような配列情報を獲得するための試薬は本発明の範囲内にある。こ
のような試薬は完全配列、遺伝子の部分または対応するコーディング領域、もし
くは少なくとも１５塩基対、望ましくは少なくとも１８塩基対の断片を含むこと
ができる。

【００７４】特別な組織の源を同定できる試薬の必要性も存在する。例えばこのような必要
性は、起源の不明な組織を提出された時の法廷で生じる。適切な試薬は例えば本
発明の配列から調製された特別な組織に特異的なＤＮＡプローブまたはプライマ
ーを含むことができる。このような試薬のパネルは種によりおよびまたは器官の
型により組織を同定することができる。同じようなやり方で、これらの試薬は不
純物のために組織培養をスクリーンするために使用できる。

【００７５】いくつか異なる遺伝子と完全に符合する配列は染色体にハイブリッド形成する
ことで検出できる。もし多くの染色体遺伝子座が観察されるならば、配列（また
は閉鎖変異体）は、１個以上の遺伝子にある。この問題は染色体位置または全長
ｃＤＮＡあるいは遺伝子のプローブとしてｃＤＮＡのみの３′未翻訳部分を使用
することにより回避される。３′未翻訳領域は遺伝子ファミリー内ではユニーク
であるように見えるが、それはｍＲＮＡがこの領域のコーディング機能を保存す
るために進化の圧力が存在しないためである。

【００７６】本発明に基づき開示されるｃＤＮＡライブラリーは理想的に方向性クローニン
グを用いているため、ｃＤＮＡの５′末端（多分コーディング配列を含むもの）
または３′末端（多分非コーディング配列であるように見えるもの）のいずれか
を選択的に獲得できるからである。

【００７７】ここで提供される配列情報を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドは
既知の方法を用いて天然資源から誘導されまたは合成することができる。本発明
の範囲内に位置する配列は前記の特異的配列に限定されないが、更にそのヒト対
立遺伝子および種の変質を含む。対立遺伝子変質は同じ種の一つの配列をも一つ
の個体の配列と比較することにより日常的に決まった形で決定することができる
。更にまたコドンの変動性に適応するために、本発明はここで開示された特異的
配列がするのと同じアミノ酸配列をコーディングする配列を含む。換言すれば、
コーディング領域で一つのコドンが同じアミノ酸をコード化するも一つのものに
置換されることが特に熟慮される（コーディング領域は日常的な配列分析を通じ
て決定することができる）。

【００７８】ｃＤＮＡライブラリーでは、提示されるｍＲＮＡの多くの種が存在する。各ｃ
ＤＮＡクローンはそれ自身の正当な理由において興味深いものであるが、更なる
試験が行われる前にライブラリーから単離されねばならない。いずれか特異的な
ｃＤＮＡを配列するために、それはあらゆる他の配列から除去され分離され（す
なわち単離され精製され）ねばならない。これは当業者にとって公知である多く
の方法により達成することができる。これらの手順は通常対象となるｃＤＮＡを
含む細菌コロニーの同定とその細菌の更なる増幅を伴う。一度ｃＤＮＡが混合コ
ロニーライブラリーから分離されると、それはヌクレオチド配列化などのような
更なる手順の鋳型として使用することができる。

【００７９】本発明はまた前に広範囲に記載されたように１個またはそれ以上の配列を含む
組換え構築物を含む。この構築物はプラスミドまたはウイルスベクターなどのよ
うなベクターを含み、その中心に本発明の配列が前進または逆配向で挿入された
。本実施例の望ましい見地において、構築物は更に調節配列より成り、例えば操
作可能に配列に連鎖されるプロモーターを含む。多数の適切なベクターとプロモ
ーターは当業者にとっては公知であり、また商業的に利用可能である。下記のベ
クターは例として提供される。細菌性：ｐＢｓ，ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，Ｐｓ
ｉＸ１７４，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ，ｐＢｓＫＳ，ｐＮＨ８ａ，ｐＮ
Ｈ１６ａ，ｐＮＨ１８ａ，ｐＮＨ４６ａ（ストラーダジーン）；ｐＴｒｃ９９Ａ
，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（ファルマ
シア）。原核系：ｐＷＬｎｅｏ，ｐＳＶ２ｃａｔ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１，ｐＳ
Ｇ（ストラーダジーン）；ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（ファル
マシア）。

【００８０】かくして本発明はこのような構築物または配列のみに限定されることなく、プ
ラスミド、ウイルス、またはいずれかの発現ベクターを含む発現媒体を含み、細
胞とリポソームを含み、本発明に基づき開示されるように核酸、ヌクレオチド配
列、ＤＮＡｓ、ＲＮＡｓ、またはその断片のいずれかを含む。更にそのような配
列がコーディング配列または非コーディング配列であるかおよびそのようなコー
ディング配列がここで開示される発現産物のすべてまたは部分をコードするかど
うかに拘らず、そのような発現産物またはその断片がここで開示される発明と同
調しある効用を示す限りにおいてこれは真実である。かくして本発明は、適切な
発現システム、例えば無細胞システムまたは試験管内発現システムにある時にヒ
トタンパク質を発現する単離されたＤＮＡ配列、または核酸を含む一方、このよ
うなシステムは適切な発現媒体またはベクターに、あるいはその部分に含まれ、
それらは細胞、プラスミド、ウイルスまたはその他の操作可能な発現ベクターで
ある。

【００８１】これらの発現システム、とりわけ発現媒体の部分である発現システムは、一般
に本発明に基づき開示された遺伝子発現産物およびタンパク質をコードする遺伝
子と生体内で通常関連するものとは異なるプロモーターを含む何らかのプロモー
ター領域を必要とする。プロモーター領域は選択標識と共にＣＡＴ（クロラムフ
ェニコール転移酵素）ベクターまたは他のベクターを用いていずれか望ましい遺
伝子から選択することができる。２個の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８とｐ
ＣＭ７である。特に指名された細菌プロモーターはｌａｃｌ，ｌａｃＺ，Ｔ３，
Ｔ７，ｇｐｔ，ラムダＰ_Rおよびｔｒｃである。真核プロモーターはＣＭＶ極初
期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの
ＬＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン−１の各プロモーターを含む。適切な
ベクターとプロモーターの選択は十分当業者の水準内にある。

【００８２】更なる実施例において、本発明は前期構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細
胞は例えば哺乳類細胞などの高次の真核細胞、または酵母細胞などの低次の真核
細胞であり得るし、あるいは宿主細胞は細菌細胞などのような原核細胞であるこ
ともできる。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ
、デキストラン仲介形質移入、または電気穿孔法で実行することができる（Ｌ．
デービス、Ｍ．ジブナー、Ｉ．バッティ、分子生物学における基本方法（１９８
６））。

【００８３】宿主細胞における構築物は組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生す
るために従来の方式で使用することができる。選択肢として、一度配列がｃＤＮ
Ａから公知であり、または純粋産物の単離で公知であるコード化ポリペプチドは
手動または自動のいずれかの従来のペプチド合成法により合成で産生することが
できる。

【００８４】かくして本発明に基づいて、一度コーディング配列が公知となり、または遺伝
子がポリペプチドをコード化してクローンにされると、分子生物学での従来の技
術はポリペプチドを獲得するために使用できる。より一般的には、本発明は前記
ポリペプチドの断片、同じくその誘導体と機能的類似体を含むここで開示された
いずれかおよびここのＤＮＡまたはＲＮＡ配列によりコードされるすべてのポリ
ペプチドを含む。

【００８５】もっとも単純な水準では、アミノ酸配列は商業的に利用できるペプチド合成装
置を用いて合成できる。これは小さなペプチドおよびより大型のポリペプチドの
断片を産生するのにとりわけ有用である。（断片は例えば天然ポリペプチドに対
する抗体を生成するのに有用である）。

【００８６】選択肢として、望ましいポリペプチドをコード化するＤＮＡは宿主生体に挿入
し発現することができる。生体は細菌、酵母、細胞系、または多細胞植物もしく
は動物である。文献は適切な宿主生体と発現技術が数多くあることを示している
。例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）がそれを発現する哺乳類の
筋組織に直接注射することを可能にする。この方法は外部応答ポリペプチドに対
する免疫応答を生成するために動物システムにポリペプチドを送達するために使
用できる。ヴォルフ他、サイエンス、２４７：１４６５（１９９０）；フェルグ
ナー、他、ネイチャー、３４９：３５１（１９９１）。選択肢として、コーディ
ング配列は適切な調節領域（すなわち構築物）と共にベクターに挿入することが
でき、それは次いで細胞を形質移入するために使用される。（細胞がより大きな
生体の部分であるまたは部分でない）細胞は次いでポリペプチドを発現する。

【００８７】本発明は更に配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，
２０，２２，２４，２６および２９から選択されるアミノ酸配列、同じくそのよ
うなポリペプチドの断片、類似体および誘導体を持つポリペプチドに関する。

【００８８】ここで開示されるポリペプチドを引用する際の「断片」、「誘導体」および「
類似体」という用語は、前記ポリペプチドと同じ生物機能または活性を基本的に
保持するポリペプチドを意味する。かくして類似体は、活性成熟ポリペプチドを
産生するためのタンパク質部分の切断により活性化できるプロタンパク質を含む
。このような断片、誘導体および類似体は天然ポリペプチドの活性が保持される
ようにここで開示されるポリペプチドに十分に類似するような性質をもつもので
なければならない。

【００８９】本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポ
リペプチドであり、望ましくは組換えポリペプチドである。

【００９０】ここで使用される「組換え」は、組換え（例えば細菌または哺乳類）発現シス
テムからタンパク質が誘導されることを意味する。「微生物性」は細菌または真
菌（例えば酵母）発現システムで作られる組換えタンパク質を引用する。産物と
して、「組換え微生物性」は天然内因性物質を基本的に欠いており関連天然グリ
コシル化を伴わないタンパク質を意味する。大抵の細菌培養、例えば大腸菌で発
現されるタンパク質はグリコシル化修飾を欠いており、酵母で発現されるタンパ
ク質は哺乳類細胞で発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを持つであ
ろう。

【００９１】配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，
２４，２６および２９のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１
個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（望ましくは
保存アミノ酸残基）で置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号（コー
ド）でコード化されまたはコード化されないもの、または（ii）1個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（iii）成熟ポリペプチドが
ポリペプチドの半減期を増加する化合物などのも一つの化合物（例えばポリヌク
レオチド）に融合されるもの、もしくは（iv）追加アミノ酸がリーダー配列また
は分泌配列、もしくは成熟ポリペプチドまたはタンパク質配列の精製に使用され
る配列、などのような成熟ポリペプチドに融合されるものである。このような断
片、誘導体および類似体はここでの教訓を考慮して当業者の能力内にあるものと
見做される。

【００９２】本発明のポリペプチドは望ましくは単離形態で提供され、また望ましくは等質
性に精製される。ポリペプチドに適応される時には、「単離された」という用語
はすでに述べられた意味を有する。

【００９３】本発明のポリペプチドは配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１
６，１８，２０，２２，２４，２６および２９のポリペプチド、とりわけ成熟ポ
リペプチド、同じくこれらのポリペプチドに対し少なくとも７０％の同一性、ま
たはこれらのポリペプチドに対し少なくとも９０％の同一性、更により望ましく
はこれらのポリペプチドに対し少なくとも９５％の同一性を持ち、更に一般に少
なくとも３０個のアミノ酸またより望ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を持
つポリペプチドを含む。

【００９４】本発明のポリペプチドの断片または部分はペプチド合成により対応する全長ポ
リペプチドを産生するために使用される。従ってこの断片は全長ポリペプチドを
産生するための中間体として使用される。本発明のポリヌクレオチドの断片また
は部分は本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用される。

【００９５】本発明は更に本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターで遺伝子操作され
る宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生を含むベクター
に関する。

【００９６】宿主細胞は、本発明のベクターで遺伝子操作（形質導入または形質転換もしく
は形質移入）され、そのベクターは例えば、クローニングベクターまたは発現ベ
クターであり、そのいずれかはプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態
にある。操作宿主細胞は本発明のプロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択
し、または遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地で培養する
ことができる。温度、ｐＨその他の培養条件は発現のために選択された宿主細胞
でこれまでに使用されたものであり当業者にとっては周知である。

【００９７】本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によるポリペプチドの産生に使用され
る。かくして例えば、ポリヌクレオチドはポリペプチドを発現する各種の発現ベ
クターのいずれか一つに含まれる。このようなベクターは染色体、非染色体およ
び合成ＤＮＡ配列を含み、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド、ファージ
ＤＮＡ；バキュロウイルス・酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、腫
瘍疹、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡ
の組合せから誘導されるベクターを含む。しかし他のベクターでもそれが宿主で
複製可能また生存可能である限り使用することができる。

【００９８】本発明に従って、適切なＤＮＡ配列、またはセグメントが各種の手順でベクタ
ーに挿入される。一般にＤＮＡは公知の手順で適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順その他は当業者に周知であると見做される。

【００９９】発現ベクターでのＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成に指向するように適切な発現制御
配列（例えばプロモーター配列）に操作可能に連鎖される。このようなプロモー
ターの代表的な例として以下のものがあげられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモ
ーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、原核または真核細胞もしくはそのウイルス
で遺伝子発現を制御することで知られるファージラムダＰ_Lプロモーターとその
他のプロモーター。発現ベクターは更に翻訳開始および転写終結因子のためのリ
ボソーム結合部位を含む。ベクターはまた増幅発現のための適切な配列を含む。

【０１００】加えて、発現ベクターは望ましくは形質転換宿主細胞の選択のために真現型形
質を提供する１個またはそれ以上の選択標識遺伝子を含み、それは真核細胞培養
に対するジヒドロ葉酸レダクダーゼまたはネオマイシン耐性など、あるいは大腸菌でのキトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの標識遺伝子である。

【０１０１】前に記載の適切なＤＮＡ配列を含むベクター、同じく適切なプロモーターもし
くは制御配列は宿主にタンパク質の発現を可能にするため適切な宿主を形質転換
するために使用される。

【０１０２】適切な宿主の代表的な例としては、下記のものがあげられる：例えば大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞：ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ
またはＢＯＷＥＳメラノーマなどの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞、等。
適切な宿主の選択はここでの教示から当業者の範囲内にあるものと見做される。

【０１０３】「組換え発現伝達体またはベクター」はＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチ
ドを発現するプラスミドまたはファージあるいはウイルスまたはベクターを引用
する。発現伝達体は（１）遺伝子発現で調節役割を持つ遺伝要素、例えばプロモ
ーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されタンパク質内に翻訳され
る構造またはコーディング配列、（３）適切な転写開始と終結配列、のアセンブ
リより成る転写ユニットを含むことができる。酵母または真核発現システムでの
使用を意図された構造ユニットは、望ましくは宿主細胞により翻訳タンパク質の
細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。選択肢として、組換えタンパク質
がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合には、それはＮ−末端メチ
オニン残基を含むであろう。この残基は最終産物を提供するために発現された組
換えタンパク質から続いて切断されることもされないこともある。

【０１０４】「組換え発現システム」は組換え、転写ユニットを染色体ＤＮＡに安定して組
込んだ宿主細胞、または組換え転写ユニットを染色体外に輸送する宿主細胞を意
味する。細胞は原核性でも真核性でもある。ここで定義される組換え発現システ
ムは発現されるＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連鎖される調節エレメント
の導入に際し異種タンパク質を発現するであろう。

【０１０５】成熟タンパク質は適切なプロモーターの制御下で哺乳類細胞、酵母、細菌、ま
たは他の細胞を発現できる。無細胞翻訳システムも本発明のＤＮＡ構築物から誘
導されるＲＮＡｓを用いてこのようなタンパク質を産生するために使用できる。
原核および真核宿主と共に使用される適切なクローニングおよび発現ベクターは
サムブルック、他、分子クローニング：研究所マニュアル、第２版（コールド・
スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９）、ウー他、遺伝子バイオテク
ノロジーの方法（ＣＲＣプレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９９７）；お
よび組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学の方法、６２巻所収（トゥアン、
編、ハマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、１９９７）に記載されており
、その開示はここで引用例として組み込まれている。

【０１０６】高次真核細胞による本発明に基づくポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写
は、エンハンサー配列をベクターに挿入することで増加することができる。この
ようなエンハンサーはある時期に周知となっており、転写を増加するためのプロ
モーターに作用する通常どこでも１０乃至３００塩基対のＤＮＡのシス作用エレ
メントである。普通の例はＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、ポリオーマ（ウイルス）エンハンサーおよびアデノウ
イルスで見られるエンハンサーである。

【０１０７】一般に組換え発現ベクターは宿主細胞、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝
子とビール酵母菌ＴＲＰ１遺伝子の形質転換を可能にする複製起点および選択
標識、および下流構造配列の直接転写に向けて高度発現遺伝子から誘導されるプ
ロモーターを含む。このようなプロモーターはいろいろのものの中でも例えば３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、また
は熱ショックタンパク質など解糖酵素をコード化するオペロンから誘導すること
ができる。異種構造配列は翻訳開始と終結配列、および望ましくは細胞周辺腔ま
たは細胞外培地に翻訳タンパク質の分泌を向ける能力のあるリーダー配列で適当
な相で組立てられる。選択肢として、異種配列は例えば発現された組換え産物の
安定化または単純な精製などの望ましい特性を与えるＮ−末端同定ペプチドを含
む融合タンパク質をコード化することができる。

【０１０８】細菌用に有用な発現ベクターは望ましいタンパク質をコード化する構造ＤＮＡ
配列を適切な翻訳開始および終結シグナルと共に操作可能リーディング相に機能
性プロモーターと挿入することにより構築される。ベクターはベクターの維持を
確実にし、もし望ましければ宿主内で増幅を提供するために１個またはそれ以上
の表現型選択標識と複製起点を含むであろう。形質転換に適した原核宿主は、他
のものも選択の問題として作用され得るけれども、大腸菌、枯草菌、ネズミチフ
ス菌、およびシュードモナス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌属の属にある
各種の種を含む。

【０１０９】代表的ではあるけれどもそれに限定されない例として、細菌用の有用な発現ベ
クターは周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺
伝子エレメントを含む商業利用可能なプラスミドから誘導される選択標識と細菌
複製起点を含むことができる。このような商業的ベクターは、例えばｐＫＫ２２
３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ウプサラ−スエーデン）とＧＥ
Ｍ１（プロメガ・バイオテック、ウイスコンシン、アメリカ合衆国）を含む。
これらｐＢＲ３２２「バックボーン」部分は適当なプロモーターと発現される構
造配列と組み合わせられる。

【０１１０】適当な宿主菌株の形質転換と適当な細胞密度への宿主菌株の成長に続き、選択
されたプロモーターは適切な手段（例えば温度移行または化学的誘導）により活
性化され、細胞は追加の期間培養される。細胞は典型的には遠心分離で収穫され
、物理的または化学的手段で破壊され、精製する粗抽出物は更なる精製のために
保持される。

【０１１１】各種の哺乳類細胞培養システムは同じく組換えタンパク質を発現するために使
用することができる。哺乳類発現システムの例は、グラズマン、細胞、２３：１
７５（１９８１）に記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ７系、および適合ベ
クターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａお
よびＢＨＫ細胞系を含む。哺乳類発現ベクターは複製起点、適切なプロモーター
とエンハンサー、また何らかの必要リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、
スプライス供与体と受容体部位、転写終結配列、および５′フランキング非転写
配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例え
ばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリア
デニル化部位は必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され
る。

【０１１２】細菌培養で産生される組換えタンパク質は細胞ペレットから最初の抽出で便利
に単離され、続いて塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー
の一つまたはそれ以上のステップが行われる。必要に応じて成熟タンパク質の立
体配置を完成するために、タンパク質リフォールディングステップを使用するこ
とができる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製ステッ
プで使用できる。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は凍結融解反復、超
音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれかの便利な方法で
破壊することができる。

【０１１３】タンパク質、その断片または他の誘導体あるいはその類似体もしくはそれらを
発現する細胞はそれらへの抗体を産生する免疫原として使用できる。これらの抗
体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグ
メント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物であることができる。従来公知の
各種の手順はポリクローナル抗体の産生に使用される。

【０１１４】本発明の配列に一致するポリペプチドに対して精製された抗体はポリペプチド
を動物に直接注射することで、またはポリペプチドを動物、望ましくは非ヒトに
投与することで得ることができる。このようにして得られた抗体は次いでポリペ
プチド自身に結合する。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコード化す
る配列においてもなお全天然ポリペプチドに結合する抗体を精製するために使用
することができる。このような抗体は次いでポリペプチドを発現する組織からポ
リペプチドを単離するために使用できる。更に大きな数のポリペプチドに特異的
なこのような抗体のパネルはこのような組織を同定し分化するために使用できる
。

【０１１５】モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞系培養で産生される抗体を提供
するいずれかの方法を使用することができる。その例はハイブリドーマ法（ケー
ラーおよびミルシュタイン、１９７５、ネイチャー、２５６：４９５-４９７）
、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コズボー他、１９８３、今日の
免疫学、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハ
イブリドーマ法（コール、他、１９８５、モノクローナル抗体と癌治療、アラン
・Ｒ・リス，インコーポレイテッド７７−９６ページ所収）を含む。

【０１１６】一本鎖抗体の産生を記載した方法（合衆国特許第４，９４６，７７８号）は本
発明の免疫ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生するために適用できる。

【０１１７】この抗体は本発明のタンパク質配列の局在化と活性に関する方法として、例え
ばこれらのタンパク質をイメージし、適当な生理学的サンプルおよび類似のもの
の中でその水準を測定する方法に利用できる。

【０１１８】本発明の手順を実行するに際して、特殊な緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条
件その他は限定するものではなくて、議論が提示される特殊な前後関係の中で当
業者が関心または価値があると認識するすべての関連する物質を含むように読み
取られるべきであることはもち論理解されるべきである。例えば、一つの緩衝シ
ステムまたは培養培地をも一つのものに置換してそれでもなお同一ではないにし
ても類似の結果を達成することがしばしば可能である。当業者はこのようなシス
テムと方法についての十分な知識を持ち、そのため過度の実験をすることなくこ
こで開示される方法と手順を使用して当業者の目的に最適に役立つようにこの置
換を行うことができるであろう。

【０１１９】本発明の特異的実施例はこれから更に下記の非制限的実施例により詳細に記載
され、本発明の教示の追加および異なる実施例が間違いなくそれ自身を当業者に
提案し、また他の実施例がここで開示されるものから充分に推論されるというこ
とが評価されるであろう。

【０１２０】〔実施例〕配列識別番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２
３，２５，２７と２８のヌクレオチド配列でコード化されるタンパク質はＵ２０
Ｓ細胞で発現される。これは（利用できるオープンリーディングフレームに基づ
き）そのコーディング領域を選択的にＰＣＲ増幅し、次いで生成するアンプリコ
ンを一つの適切な哺乳類発現ベクターにクローニングすることにより達成される
。そのような一つのベクターはｐｃＤＮＡ３．１（インヴァイトロジェン−＃Ｋ
４８００−０１で販売されているもの）である。前記のポリヌクレオチド配列で
コード化されたタンパク質の発現は２種の方法、すなわちアミノ酸配列から誘導
されるペプチドに対して高められた特異的抗体の使用により、またはクローニン
グ手順の間に加えられる標識に対し抗体の使用によるいずれかにより検出される
。このような標識の例はｐｃＤＮＡ３．１ベクターに包含されるＶ５エピトープ
またはポリヒスチジン配列である。これを達成するために、細胞は通常は発現構
築物で形質移入され、１乃至５日間培養される。細胞は次いで溶解され、そのタ
ンパク質内容物は前記抗体を適切に使用するウエスタンブロッティングにより分
析される。細胞は更に適切なチャンバで細胞を形質移入し、それを１乃至５日間
培養し、またそれを原位置で固定することにより前記ポリヌクレオチド配列でコ
ード化されたタンパク質の細胞以下の局在化を分析されるであろう。このような
細胞は次いで前に引用された抗体で細胞を染色することによりコード化タンパク
質の存在と局在化を分析される。選択肢として、細胞は、前記ポリヌクレオチド
配列でコード化されたタンパク質がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など直接
検出可能標識に融合される発現システムで形質移入されるであろう。前記のポリ
ヌクレオチド配列でコード化されたタンパク質の発現と局在化は次いでＧＦＰの
それを分析することにより検出される。

【０１２１】ここで開示されるポリペプチドの同定の目的のために、このような各ペプチド
はその分子量（ダルトン）と期待される等電点（ｐ１）と共に下記の表で示され
る。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】配列識別番号８と２０は部分配列のみに一致し、従って値は計算することがで
きなかったため、それらの配列は表には存在しない。

【０１２４】これらのポリペプチド配列が誘導されるポリヌクレオチドはすべて骨形成補充
剤の存在下で４日培養された骨形成間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の差動スクリーンの
間に単離されたｃＤＮＡｓである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】約２．５キロベースの長さのコンセンサス配列（配列識別番号２
７）の異なったｃＤＮＡクローンから決定される本発明の新規なＤＮＡ配列とし
てのコンセンサス配列を示す図

【図２】残基１２５乃至１７１７で配列識別番号２９に対応する図１の配
列から発現されるタンパク質の推定アミノ酸配列を示す図。アステリスクの間で
強調されたアミノ酸は二極性核局在化シグナルを構成する。等電点と分子量も推
定上のタンパク質で計数された。

【図３】各種のヒト組織で新規なＤＮＡ配列の存在のためのドットブロッ
ト検定の結果を示す図。この検定のために、クロンテックからのプレハブドット
プロット（＃７７７０−１）が図１の２．５キロベースｃＤＮＡから生成された
プローブを用いてハイブリッド形成され、製造業者指示書に基づき処置された。
プローブに結合する筈のシグナルはストーム８６０ホスホルイメージャーとイメ
ージカントソアトウエアを用いて分析された。

【図４Ａ】相対的にｍＲＮＡ発生量に基づく各種のヒト組織での図１の配
列の分布を示す棒グラフ。最高のシグナル強度は成人の心臓にあり最低は胎児の
胸腺にあった。棒グラフは図３のドットブロットからのデータを用いて作られ、
エクセル・スプレッドシートに持ち込まれた。データは次いで（非特異的にハイ
ブリッド形式に起因する）バックグラウンドを差し引いた後、組織当りの任意の
シグナル強度として分析された。棒グラフでの組織のオーダーはシグナル強度を
反映する（従って図３のドットブロット上のものとは異なる）。

【図４Ｂ】図４Ａの続きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ムバラビール，ガブリエルアメリカ合衆国，21045 メリーランド，コロンビア，グレーストーンレーン 8488−１ＧＦターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA11 HA01 HA12 4B063 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ52 QR55 QS32 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA13 4B065 AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１
８，２０，２２，２４，２６および２９より成るグループから選択されるアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに少なくとも９０％
同一であるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項２】配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１
８，２０，２２，２４，２６および２９より成るグループから選択されるアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに少なくとも９５％
同一であるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項３】配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１
８，２０，２２，２４，２６および２９より成るグループから選択されるアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに少なくとも９８％
同一であるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項４】請求項１,２または３記載のＤＮＡ配列または断片のいずれ
かに一致するＲＮＡを含むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項５】配列識別番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７
，１９，２１，２３，２５，２７および２８ならびにこれらの補体より成るグル
ープから選択される配列に同一のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする一つの分離
核酸。
【請求項６】請求項５記載のＤＮＡ配列に一致するＲＮＡを含むことを特
徴とする一つの分離核酸。
【請求項７】ヒト遺伝子の少なくともポリペプチドコーディング領域を含
む一つの分離核酸であって、前記ヒト遺伝子が請求項１に基づくＤＮＡ配列を含
むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項８】請求項５のＤＮＡ配列を有するヒト遺伝子の少なくともポリ
ペプチドコーディング領域を含むことを特徴とする一つの分離核酸。
【請求項９】適切な発現システムにある時にヒトタンパク質を発現するこ
とを特徴とする請求項８記載の核酸。
【請求項１０】請求項１記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする一つの
ベクター。
【請求項１１】請求項３記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする一つの
ベクター。
【請求項１２】請求項５記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする一つの
ベクター。
【請求項１３】請求項９記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする一つの
ベクター。
【請求項１４】請求項７記載のＤＮＡ配列によりコードされることを特徴
とする一つのポリペプチド、およびその活性断片、誘導体ならびに機能性類似体
。
【請求項１５】請求項８記載のＤＮＡ配列によりコードされることを特徴
とする一つのポリペプチドおよびその活性断片、誘導体ならびに機能性類似体。
【請求項１６】配列識別番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，
１８，２０，２２，２４，２６および２９より成るグループから選択されるアミ
ノ酸配列を含むことを特徴とする一つのポリペプチド。
【請求項１７】請求項７記載のＤＮＡのゲノムに挿入されたことを特徴と
する一つの遺伝子操作細胞。
【請求項１８】請求項１７記載の遺伝子操作細胞を用いてポリペプチドを
発現する細胞を産生することを特徴とする一つのプロセス。
【請求項１９】請求項５記載のＤＮＡの断片を含む一つの分離ＤＮＡ配列
であって、ここで前記断片が前記配列の少なくとも１５個の連続塩基を含むこと
を特徴とする分離ＤＮＡ配列。
【請求項２０】請求項５記載のＤＮＡの断片を含む一つの分離ＤＮＡ配列
であって、ここで前記断片が前記配列の少なくとも３０個の連続塩基を含むこと
を特徴とする分離ＤＮＡ配列。
【請求項２１】請求項５記載のＤＮＡの断片を含む一つの分離ＤＮＡ配列
であって、ここで前記断片が前記配列の少なくとも５０個の連続塩基を含むこと
を特徴とする分離ＤＮＡ配列。
【請求項２２】請求項５記載のＤＮＡの断片を含む一つの分離ＤＮＡ配列
であって、ここで前記断片が前記配列の少なくとも８０個の連続塩基を含むこと
を特徴とする分離ＤＮＡ配列。
【請求項２３】ヒトゲノム内の遺伝子を検出する一つの方法であって、前
記ゲノムのサンプルを請求項１９、２０、２１および２２記載のＤＮＡｓより成
るグループから選択される分離ＤＮＡに接触することを含むことを特徴とする方
法。
【請求項２４】請求項１４および１５記載のポリペプチドより成るグルー
プから選択されることを特徴とするポリペプチドに対する一つのモノクローナル
抗体。