JPH06165679A

JPH06165679A - ヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモーター活性を有する領域を含有するｄｎａ

Info

Publication number: JPH06165679A
Application number: JP4322918A
Authority: JP
Inventors: Haruo Onda; 治夫音田; Chiharu Kimura; 千春木村; Shoichi Okubo; 尚一大久保
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-12-02
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 1994-06-14
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: JP3391484B2

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト・エンドセリン−２遺伝子の５’上流域か
らプロモーター活性を有する約３Ｋｂの領域をクローニ
ングした。該領域から制限酵素による切断、Ｂａｌ３１
処理等によって、更に短いＤＮＡ断片群を単離し、その
転写活性を調べたところ、転写開始点から上流４５塩基
までの領域を含有するＤＮＡ断片がプロモーターとして
機能することを見いだした。【効果】上記ヒト・エンドセリン−２のプロモーター
は、ＳＶ４０由来のプロモーターなど公知のものと比較
して強力であり、動物細胞用のプロモーターとして極め
て有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血管収縮ペプチド
であるヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモーター活
性を有する領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを含有する形
質転換体、及び該形質転換体を培養しプロモーター活性
を有するＤＮＡの下流に接続した蛋白質またはペプチド
をコードする構造遺伝子を発現させることを特徴とする
蛋白質またはペプチドの製造方法に関する。本明細書に
おいてプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合
し、ＲＮＡの転写の開始のシグナルとなるＤＮＡの領域
を指す。

【０００２】

【従来の技術】内皮依存性の血管拡張反応と並んで、種
々の刺激に対する内皮依存性の血管収縮反応が報告され
ている。血管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷に
よる収縮、トロンビンによる収縮、血中酸素の減少によ
る収縮、さらにはニューロペプチドＹ[Proc.Natl.Acad.
Sci.,U.S.A.,79,5485(1982);同,81,4577(1984)]による
ノルアドレナリン収縮の増強などがその例である。アメ
リカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Amer.J.P
hysiol.）,248,c550(1985)及びジャーナル・オブ・セル
・フィジオロジー（J.Cell.Physiol）,132,263(1982)に
は、内皮細胞由来の冠血管収縮因子（分子量はそれぞれ
８５００、３０００）が記載されているが構造は不明で
ある。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・ア
ンド・エクスペリメンタル・セラビューティクス（J.Ph
armach.Exp.Ther.）,236,339(1985)にも内皮細胞由来の
ペプチド様物質が記載されているが、これも構造は不明
である。

【０００３】また、血管収縮作用を有するペプチドとし
てバソプレッシン（Vasopressin)が知られておりそのア
ミノ酸配列も明らかにされているが、バソプレッシンが
哺乳類または鳥類の血管内皮細胞を起源として単離され
たという報告はない。更に、血管収縮作用を有するアン
ジオテンシン（Angiotenshin）がウシ大動脈の内皮細胞
から得られたという報告[Circulation Research,60,422
(1987)]があるが、アンジオテンシンは分子量約１００
０のペプチドである。

【０００４】本発明者らの一部は、血管収縮作用を有す
るペプチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・
エンドセリンを単離することに成功し（特開平１−２０
６９９７）、また本発明者らの一部は、ヒト・エンドセ
リンの単離、ブタ・エンドセリン及びヒト・エンドセリ
ンのｃＤＮＡのクローニングにも成功している（特開平
２−７２８７７）。このブタ及びヒトのエンドセリンの
成熟ポリペプチドのアミノ酸配列は同一で、これをエン
ドセリン−１と呼ぶ。また、本出願人は、ラット・エン
ドセリンの単離、ｃＤＮＡのクローニングに関しても出
願を行っており（特開平２−２７９８３）、これをエン
ドセリン−３と呼ぶ。

【０００５】更に、本出願人は、マウス・エンドセリン
の単離、ｃＤＮＡのクローニングに関しても出願を行っ
ており（特開平２ー７６５８３）、これをエンドセリン
Ｂと呼ぶ。更に、本出願人は、エンドセリン−１の一部
をコードする合成ＤＮＡをプローブとして使用して、ヒ
トゲノムＤＮＡライブラリーからエンドセリン−１とは
異なるアミノ酸配列を有するエンドセリンをコードする
ＤＮＡをクローニングした（特開平２−２７９８３）。
本発明者らはこのエンドセリンをエンドセリンー２と命
名した。エンドセリン−２は主に腎臓と小腸で生産され
ており、平滑筋収縮作用などの作用を有することが明ら
かになっている。ここでエンドセリンとは、分子量２５
００±３００でアミノ酸２１個からなる血管収縮作用を
有するペプチドの総称であり、そのアミノ酸のＮ末端か
ら数えて第１番目、第３番目、第１１番目、第１５番目
に位置する４個のシステインが２組のジスルフィド結合
を形成している構造を有するものである。このジスルフ
ィド結合の組合せとしては、１−１５、３−１１の組合
せ、及び１−１１、３−１５の組合せがあるが、前者の
組合せを有するものの方が生成比が高く、また活性も大
きい。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記エンドセリンのう
ち、ヒト・エンドセリン−２の発現機序、特にヒト・エ
ンドセリン−２遺伝子のプロモーターについてはいまだ
未知であり、プロモーター活性を有する最小の領域、プ
ロモーター活性の強さなどは解明されていない。本発明
は、ヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモーター領域
を含むＤＮＡをクローニングし、プロモーター活性を有
する最小の領域、プロモーター活性の強さなどを解明
し、遺伝子組換え技術を用いた蛋白質またはペプチドの
生産に役立てることを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、エンドセ
リン−１のゲノムＤＮＡの一部をコードする合成ＤＮＡ
からなるＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトゲノム
ＤＮＡライブラリーからヒト・エンドセリン−２遺伝子
を単離した。そして、ヒト・エンドセリン−２遺伝子の
様々な長さの５’末端領域のＤＮＡ断片をクローニング
し、該断片をクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ、ルシフェラーゼなどの構造遺伝子の上流に接
続して、該ＤＮＡ断片のプロモーター活性を確認した。
そして、プロモーター活性を有するのに必要なＤＮＡ領
域を決定し、この領域を含有するＤＮＡを、遺伝子組換
え技術を利用した蛋白質またはペプチドの大量生産に供
することに成功した。

【０００８】本発明のヒト・エンドセリン−２遺伝子の
プロモーターは、配列番号１または図２に示される塩基
配列を含有するものであるか或はその一部であり、公知
のものとは異なる新規なものである。本発明におけるヒ
ト・エンドセリン−２遺伝子のプロモーターを含有する
発現ベクターは、例えば（i）ヒト細胞からゲノムＤＮ
Ａを分離し、このＤＮＡをファージまたはプラスミドに
組み込み、（ii）得られた組み換えファージまたはプラ
スミドで宿主を形質転換し、（iii）得られた形質転換
体を培養後、形質転換体から適当な方法（例えばヒト・
エンドセリン−２の一部をコードするＤＮＡプローブと
のハイブリタリゼーション）により、目的とするＤＮＡ
を含有するファージあるいはプラスミドを単離し、（i
v）その組み換えＤＮＡから目的とするＤＮＡを切り出
し、（v）該ＤＮＡまたはその一部を公知の動物細胞用
の発現ベクター中のプロモーター領域と置換することに
より製造することができる。

【０００９】ヒト細胞からゲノムＤＮＡを調製する方法
としては、例えばマニアティス（T.Maniatis）らの方法
［Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory
(1982),p.280-285］などが挙げられる。このようにして
得られたゲノムＤＮＡをコリンス(J.Collins)とホーン
(B.Hohn)の方法［Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,71,2442
(1978)］に従いファージまたはプラスミドに組み込む。
ＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλ
ｇｔ１１（Proc. Natl. Acid.Sci.,U.S.A.,80,1194(198
3)]などが挙げられるが、その他のものであっても、宿
主内で複製増殖されるものであれば用いることができ
る。ファージベクターにＤＮＡを組み込む方法として
は、例えばヒューン（HyunhT.V.）らの方法（DNA Cloni
ng, A Practical Approuch,1,49(1985)]などが挙げられ
る。

【００１０】ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例
えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２[Gene,2,95(1977)]、ｐ
ＢＲ３２５[Gene,4,121(1978)]、ｐＵＣ１２[Gene,19,2
59(1982)]、ｐＵＣ１３[Gene,19,259(1982)]、枯草菌由
来のｐＵＢ１１０[Biochemical and Biophisical Resea
rch Communication,112,678(1983)]などが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製増殖される
ものであればいずれをも用いることができる。プラスミ
ドにＤＮＡを組み込む方法としては、メッソズ・イン・
モレキュラ−・バイオロジ−に記載の方法[Methods in
Moleculer Biorogy,Elsevier(1986),p222-226]などが挙
げられる。このようにして得られたファージベクターま
たはプラスミドは、適当な宿主例えばエシェリキア（Es
cherichia）属菌などに導入する。

【００１１】上記エシェリキア属菌の例としては、エシ
ェリキア・コリ（Escherichia coli）の菌株Ｋ１２ＤＨ
１（Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,60,160(1968)]、
Ｍ１０３[(Nucleic Acids Research,9,309(1981)]、Ｊ
Ａ２２１[Journal of Molecular Biology,120,517(197
8)]、ＨＢ１０１[Journal of Molecular Biology,41,45
9(1969)]、Ｃ６００[Genetics,39,440(1954)]などが挙
げられる。ファージベクターで宿主を形質転換する方法
としては、例えばインビトロパッケージング法[Molecul
ar Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982),p.
256-268]などが挙げられる。

【００１２】またプラスミドで宿主を形質転換する方法
としては、例えばマニアティス(T.Maniatis)らのカルシ
ウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビ
ジウムクロライド法[Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory(1982),p.249-255]などが挙げられ
る。またヒト・エンドセリン−２遺伝子を含有するヒ
トゲノムＤＮＡライブラリ−は上記の方法などで得るこ
とができるが、市販品として購入することも可能であ
り、例えばクローンテクラボレトリーズ社(Clonetech L
aboratories Inc.,米国)から入手することができる。

【００１３】ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからヒト・
エンドセリン−２遺伝子をクローニングする方法として
は、例えば、ファージベクタ−ＥＭＢＬ３にヒトゲノム
ＤＮＡ断片を挿入したＤＮＡライブラリーから、ヒト・
エンドセリン−２のアミノ酸配列に基づいて化学合成し
たオリゴヌクレオチドをプローブとして使用するプラー
クハイブリダイゼーション法[Molecular Cloning Cold
Spring Harbor La-boratory(1982),p.320-328]によって
単離する方法などが挙げられる。このようにしてクロー
ニングされたヒト・エンドセリン−２遺伝子は必要があ
ればプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＵＣ１１９などにサブクローニングすることができる。
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、例えばマ
キサム・ギルバート(Maxam-Gilbert)法[Proc. Natl. Ac
id. Sci.,U.S.A.,74,560(1977)]あるいはジデオキシ法
[Nucleic Acids Research,9,309(1981)]によって決定
し、既知のアミノ酸配列との比較からヒト・エンドセリ
ン−２遺伝子の存在を確認する。以上のようにして、ヒ
ト・エンドセリン−２の遺伝子が得られる。

【００１４】後述の実施例２で得られたヒト・エンドセ
リン−２の遺伝子断片の制限酵素地図を図１に示す。ま
たジデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配列を図２ない
し図４に示す。以上のようにしてクローニングされたヒ
ト・エンドセリン−２遺伝子は目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化して使用することができ
る。クローニングされたＤＮＡからプロモーターとして
使用する領域を切り出し、発現に適したベクター中のプ
ロモーターと置換し、更に該エンドセリン−２由来のプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片の下流に発現させたい構造
遺伝子を連結して、発現ベクターを得ることができる。
発現ベクターを作成する際の原料となるベクターとして
はレトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイ
ルスなどが挙げられる。

【００１５】動物ウイルス由来の発現ベクターにおいて
ＳＶ−４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショ
ックプロモーターなどの代わりに、このヒト・エンドセ
リン−２遺伝子のプロモーターを使用することができ
る。このようにして構築されたヒト・エンドセリン−２
遺伝子プロモーターを含有するベクターを用いて、形質
転換体を製造する。宿主としては、例えばエシェリキア
属菌、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキア属
菌としては、前記したものと同様のものが挙げられる。

【００１６】動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ
−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、
マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。上記エ
シェリキア属菌の形質転換は、例えばプロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
[Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.,69,2110(1972)]やジーン
[Gene,17,107(1982)]に記載の方法に従って行うことが
できる。動物細胞の形質転換は、例えばヴィロロジー[V
irology,52,456(1973)]に記載の方法によって行うこと
ができる。このようにして、ヒト・エンドセリン−２遺
伝子のプロモーターを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。

【００１７】宿主がエシェリキア属菌である形質転換体
を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地
が適当であり、その中には該形質転換体の生成に必要な
炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭
素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶
性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニ
ウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプト
ン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液な
どの無機または有機物質、無機物としては例えば塩化カ
ルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム
などが挙げられる。また、酵母抽出物、ビタミン類、生
長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５．
８が望ましい。

【００１８】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば５〜２０％の牛胎児血清を
含むＭＥＭ培地[Science,122,501(1952)]、ＤＭＥＭ培
地[Virology,8,396(1959)]、ＲＰＭＩ１６４０培地[The
Journal of the American Medical Association,199,5
19(1967)]、１９９培地[Proceeding of the Society fo
r the Biological Medicine,73,1(1950)]などが挙げら
れる。ｐＨは約６．８であるのが好ましい。培養は、通
常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。上記培養物から、ヒト・エンド
セリン−２遺伝子のプロモーターの下流に結合した構造
遺伝子から発現した生成物を分離精製するには、例えば
下記の方法により行うことができる。

【００１９】発現された蛋白質またはペプチドを培養菌
体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後公知の
方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に
懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解など
によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や
ろ過により蛋白質またはペプチドの粗抽出液を得る方法
などが適宜用いうる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジ
ンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界
面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質や成
熟ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自
体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上
清を集める。

【００２０】このようにして得られた培養上清あるいは
抽出液中に含まれる蛋白質や成熟ペプチドは、公知の分
離、精製法を適切に組み合わせて精製、分離することが
できる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や
溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法限外ろ
過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。

【００２１】このようにして得られたヒト・エンドセリ
ン−２遺伝子のプロモーター下流に結合した構造遺伝子
がコードする蛋白質またはペプチドは、エンザイムイム
ノアッセイなどにより測定することができる。また生成
物が生理活性を有する場合は、該活性を指標にして測定
することができる。本明細書及び図面において、塩基な
どを略号で記載する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commisi
on on Biochemical Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用記号に基づくものであり、その例
を以下に挙げる。

【００２２】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸ＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンなお、本発明のヒト・エンドセリン−２のプロモーター
ＤＮＡにおいては、その塩基配列の一部が修飾（付加、
除去、その他の塩基の置換など）されていてもよい。

【００２３】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、実施例３で得られた形質転換体エシェリキア・コ
リ（Escherichia Coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＨＧＥＴ２は、
平成４年１１月２６日から通商産業省微生物工業技術研
究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４０８３と
して寄託されている。

【００２４】実施例１ヒト・エンドセリン−２の遺伝
子の一部をコ−ドするＤＮＡプロ−ブの作成ヒト・エンドセリン−２のｃＤＮＡの５´末端側の配列
である、配列番号４の塩基配列のＤＮＡを化学合成し、
Ｔ４ポリヌクレオチヂキナ−ゼを用いて常法に従って[M
olecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory(198
2),p.122-127に記載] ＤＮＡの５´末端を32Ｐでラベル
し、ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリ−のスクリ−ニング
に用いた。

【００２５】実施例２ヒト・エンドセリン−２遺伝子
の単離とその塩基配列の決定大腸菌Ｙ１０９０にヒト白血球由来のゲノムＤＮＡライ
ブラリ−（Clontech Laboratories Inc.製）を感染させ
てプレ−ティングし、ファ−ジプラ−クを出現させた。
ベントンとデ−ビス（benton W.,Davis R.) の方法[Sci
ence,196,180(1977)] に従って、プラ−クを形成したフ
ァ−ジＤＮＡの一部をナイロン膜にレプリカし、32Ｐで
標識した実施例１記載のＤＮＡプロ−ブとプラ−クハイ
ブリダイゼ−ションを行った。ハイブリダイゼ−ション
は２０％ホルムアミドの存在下４２℃で行い、該膜は２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で４０℃で洗浄した。プロ
−ブとハイブリダイズしたクロ−ンを単離し、そのうち
の１クロ−ンからヒトゲノムＤＮＡインサ−トを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切り出して、プラスミドｐＵＣ１１
８にサブクロ−ニングし、ｐＨＧＥＨ１を得た。このプ
ラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形質転換体エ
シェリキア・コリ（Eschrichia Coli）ＤＨ５α／ｐＨ
ＧＥＨ１を得た。

【００２６】このプラスミドに含有されるヒト・エンド
セリン−２遺伝子の制限酵素地図を図１に示す。図中の
□の区域は、ヒト・エンドセリン−２成熟体の一部のコ
−ド領域を示す。また、図１中、ＨはＨｉｎｄＩＩＩ、
ＰはＰｓｔＩ、ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、Ｓｍ
はＳｍａＩ、ＳａはＳａｃＩ、ＳｐはＳｐｈＩ、Ａｃは
ＡｃｃＩ、ＨｃはＨｉｎｃＩＩの切断部位を表す。ま
た、この成熟体のコ−ド領域とその周辺の塩基配列をサ
ンガ−（Sanger) の方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,
74,5463(1977)]によって決定した。この塩基配列の一部
を図２ないし図４（配列番号１）及び図５ないし図６に
示す。図５ないし図６中、矢印の起点（Ｇ）は転写開始
点を、ＴＡＴＡｂｏｘで示した□の区域は真核細胞のプ
ロモーターのコンセンサス配列であるＴＡＴＡボックス
を、負の数字は転写開始点からの距離を示す。

【００２７】実施例３ヒト・エンドセリン−２遺伝子
のプロモ−タ−領域の決定（１）（i）実施例２においてプラスミドｐＨＧＥＨ１にサブ
クロ−ニングされたヒト・エンドセリン−２の遺伝子の
塩基配列（ii）ヒト・エンドセリン−２をコ−ドするｃ
ＤＮＡの塩基配列（特開平３−１４３１２７に記載）を
比較して、プラスミドｐＨＧＥＨ１にサブクロ−ニング
したヒト・エンドセリン−２の遺伝子の塩基配列中に、
ヒト・エンドセリン−２の前駆体のエクソンが存在する
ことを確認し、ヒト・エンドセリン−２遺伝子の５´上
流領域の３´末端側の境界（エクソンＩの５’末端に相
当）を決定した。

【００２８】図１に示すように、プラスミドｐＨＧＥＨ
１にサブクロ−ニングされたヒト・エンドセリン−２遺
伝子の５´上流には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ切断部位が存在する。ｐＨＧＥＨ１をＢ
ａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで部分分解したのち、大腸菌
ＤＮＡポリメラ−ゼＩ処理により粘着末端（staggered-
end ）を平滑末端（blant-end）に変換した[Molecular
Cloning,Cold SpringHarbor Laboratory(1982),p.113-1
14 記載の方法による] 。その後、形成した平滑末端に
Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼによりＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を接
続した。引き続きＢｓｓＩで更にＤＮＡ切断を行った後
（ＢｓｓＩＩ切断部位はヒト・エンドセリン−２のエク
ソンＩのすぐ下流に存在する）、同様の方法でＢｓｓＩ
Ｉ切断部位を平滑末端化し、ＳａｌＩリンカ−を接続し
た。これらの操作により、５´末端にＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位、３´末端にＳａｌＩ切断部位を有し、異なる長
さのヒト・エンドセリン−２遺伝子の５´上流領域のＤ
ＮＡからなる３種類のＤＮＡ断片が得られた（それぞれ
約３Ｋｂ、２Ｋｂ、１Ｋｂ）。

【００２９】この３種のＤＮＡ断片を、クロラムフェニ
コ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ（ＣＡＴ）をコ−ド
するＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＡＴ−ｂａｓｉｃ
（Promega社）のＣＡＴ遺伝子の直上流に位置するマル
チクロ−ニング部位内のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＳａ
ｌＩ切断部位との間に挿入し、３種のプラスミド（それ
ぞれＡ、Ｄ、Ｅ）を得た（図７）。このプラスミドＡ
は、形質転換体エシェリキア・コリ（Escherichia Col
i）ＤＨ１０Ｂ／ｐＧＥＴ２（ＦＥＲＭＢＰ−４０８
３）に保持されている。図７中、ＨはＨｉｎｄＩＩＩ、
ＢはＢａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＳｍはＳｍａＩ、Ｓ
ａｌはＳａｌＩの切断部位を表す。また、■で示される
領域はヒト・エンドセリン−２遺伝子の５´上流領域の
ＤＮＡを、ＣＡＴと記された□で示される領域はクロラ
ムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼをコ−ドす
るＤＮＡを、ＳＶ４０と記された□で示される領域はＳ
Ｖ４０の複製開始点を含むＤＮＡをそれぞれ表す。プラ
スミドＡは約３Ｋｂのインサ−トを、プラスミドＤは約
２Ｋｂのインサ−トを、プラスミドＥは約１Ｋｂのイン
サ−トを有している。なおこのプラスミドＡは、形質転
換体エシェリキア・コリ（Escherichia Coli）ＤＨ１０
Ｂ／ｐＨＧＥＴ２（ＦＥＲＭＢＰ−４０８３）に保持
されている。

【００３０】これらのプラスミドを精製した後[Molecul
ar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory(1982),p88
-96記載の方法による] 、これらのプラスミドを、６cm
シャ−レ（Ｆａｌｃｏｎ社製）中で培養したヒト腎臓細
胞ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１１）に燐酸カルシ
ウム法[Methods in Molecular Biology,Elsevier(1986)
p.286-289 ] により導入した。形質転換から４８時間後
に細胞を回収し、ＣＡＴアッセイを行った[Proc.Natl.A
cad.Sci.,U.S.A.,83,1598(1986) 記載の方法による] 。

【００３１】図８に示すオ−トラジオグラムは、プラス
ミドＡ、プラスミドＤ、プラスミドＥで形質転換した細
胞はいずれもクロラムフェニコ−ルを産生したことを示
している。即ち、ヒト・エンドセリン−２遺伝子から単
離された上記３種類のＤＮＡ断片はいずれもプロモ−タ
−活性を有することが判明した。なお、図５中、Ａ、
Ｄ、ＥはそれぞれプラスミドＡ、プラスミドＤ、プラス
ミドＥで形質転換した細胞に対するＣＡＴアッセイのレ
ーンを、Ｂはネガティブコントロールとしてのプラスミ
ドＢで形質転換した細胞に対するＣＡＴアッセイのレー
ンを、Ｃはポジティブコントロールとしてのプラスミド
Ｃで形質転換した細胞に対するＣＡＴアッセイのレーン
を示す。

【００３２】実施例４ヒト・エンドセリン−２遺伝子
のプロモ−タ−領域の決定（２）実施例３で得られたプロモ−タ−活性を有するＤＮＡ断
片のうち、プラスミドＥにクロ−ニングされた最も短い
約１Ｋｂの断片について、プロモ−タ−活性を有する領
域をさらに限定するために、該断片に含まれるより短い
ＤＮＡ断片がプロモ−タ−活性を有するかどうかを検討
した。実施例３で使用したクロラムフェニコ−ルアセチ
ルトランスフェラ−ゼ（ＣＡＴ）をコ−ドするＤＮＡに
代えて、ホタル・ルシフェラ−ゼをコ−ドするＤＮＡを
プロモ−タ−活性を測定するＤＮＡ断片の下流に接続し
たプラスミドを構築した。構築方法は以下の通りであ
る。

【００３３】プラスミドＥをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
切断されたＤＮＡに対してエキソヌクレア−ゼＢａｌ３
１を用いて５´末端側からＤＮＡの消化を行った[Molec
ularCloning,Cold Spring Harbor Laboratory(1982),p.
135-139 記載の方法による］。Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼ
を用いてＤＮＡの末端を平滑化した後、ＳａｃＩリンカ
−を接続した。その後ＳａｌＩ（ＳａｌＩ切断部位は、
ヒト・エンドセリン−２のエクソンＩのすぐ下流に存在
する）でＤＮＡを切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼを用
いてＤＮＡの末端を平滑化した後、ＢｇｌＩＩのリンカ
−を接続した。これらの操作により、５´末端にＳａｃ
Ｉ切断部位、３´末端にＢｇｌＩＩ切断部位を有し、プ
ラスミドＥにクロ−ニングされた約１Ｋｂのヒト・エン
ドセリン−２遺伝子の５´上流領域のＤＮＡの一部分か
らなる、様々な長さのＤＮＡ断片が得られた。

【００３４】これらのＤＮＡ断片をルシフェラ−ゼ発現
ベクタ−ｐＧＶのＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ部位に組み込
み、ｐＧＶ（−１１７３／＋６９ＬＵＣ）、ｐＧＶ（−
６５８／＋６９ＬＵＣ）、ｐＧＶ（−３５５／＋６９Ｌ
ＵＣ）を構築した（図９）。図９中、ｌｕｃはホタル・
ルシフェラ−ゼをコ−ドするＤＮＡを示す。上記断片よ
りさらに大きく５´領域を欠損したＤＮＡ断片はＰＣＲ
法を利用して合成した。ＤＮＡの５´末端にＭｌｕＩ認
識配列、３´末端にＢｇｌＩＩ認識配列が存在するよう
に合成を行った。合成した種々の長さのＤＮＡ断片をｐ
ＧＶのＭｌｕＩ−ＢｇｌＩＩ部位に組み込み、ｐＧＶ
（−２０１／＋６９ＬＵＣ）、ｐＧＶ（−１４７／＋６
９ＬＵＣ）、ｐＧＶ（−１１７／＋６９ＬＵＣ）、ｐＧ
Ｖ（−４５／＋６９ＬＵＣ）、ｐＧＶ（−２５／＋６９
ＬＵＣ）、ｐＧＶ（＋１／＋６９ＬＵＣ）を構築した
（図９）。

【００３５】これらのプラスミドを精製した後[Molecul
ar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory(1982),p88
-96記載の方法による] 、これらのプラスミドを、６cm
シャ−レ（Falcon社製）中で培養したヒト腎臓細胞ＡＣ
ＨＮに燐酸カルシウム法[Methods in Molecular Biolog
y,Elsevier(1986)p.286-289 ] により導入した。その
後、発現されたルシフェラ−ゼ活性を測定した[Mol.Cel
l.Biol.,725(1987)記載の方法による]。その結果、ヒト
・エンドセリン−２の遺伝子の転写開始部位から上流４
５塩基までの領域を有するＤＮＡ断片をルシフェラ−ゼ
遺伝子の上流に結合したｐＧＶ（−４５／＋６９ＬＵ
Ｃ）もルシフェラ−ゼ遺伝子を発現することが判明した
（図１０）。即ち、ヒト・エンドセリン−２の遺伝子の
転写開始部位から上流４５塩基までの領域が、プロモ−
タ−活性を有する最小単位であることが示された。

【００３６】更に、ヒト・エンドセリン−２の遺伝子の
転写開始部位から上流１１７３塩基までの領域を有する
ＤＮＡ断片をルシフェラ−ゼ遺伝子の上流に結合したｐ
ＧＶ（−１１７３／＋６９ＬＵＣ）は、ＳＶ４０のプロ
モ−タ−の下流にルシフェラ−ゼ構造遺伝子を結合した
プラスミドｐＧＶ−Ｐに比べて約４倍の発現量を示して
おり（図１０）、該領域を有するＤＮＡ断片は、動物細
胞用プロモ−タ−として非常に有用であることが判明し
た。なお、上記ｐＧＶ（−１１７３／＋６９ＬＵＣ）
は、ヒト腎臓由来のＡＣＮＨ細胞のみならずサル腎臓由
来のＣＯＳ７細胞中でも発現が認められ、ヒト・エンド
セリン−２の遺伝子のプロモ−タ−は、動物細胞の腎臓
由来の細胞で広く活性を有することが判明した。

【００３７】

【発明の効果】本発明のヒト・エンドセリン−２遺伝子
のプロモーターと製造したい蛋白質またはペプチドをコ
ードする構造遺伝子とを結合した発現ベクターによって
形質転換された細胞は、大量の目的とする蛋白質または
ペプチドを産生するので、目的とする蛋白質またはペプ
チドの生産を効率よく行うことができる。また、ここに
製造されるヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモータ
ーを含有するベクターは、他の遺伝子のプロモーター
（例えばヒト・エンドセリン−１遺伝子のプロモータ
ー、ヒト・エンドセリン−３遺伝子のプロモーター）と
同じく、プロモーター活性を増減させる物質の検索にも
利用することができる。更に、ここに製造されるヒト・
エンドセリン−２遺伝子のプロモーターを含有するベク
ターを用いて、生体におけるヒト・エンドセリン−２の
発現機構の解析や、ヒト・エンドセリン−２遺伝子のプ
ロモーターの制御物質の解明が可能となる。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３３６７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No 起源：生物名：Homo sapiens 細胞の種類：白血球配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置：3323..3367 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：3338..3344 特徴を決定した方法：S 配列： AAGCTTCCTG GTCCAGGGCC TCGATTGCAA TCCCAGGCAC CTGCTGCAGC CCAGCCCTGT 60 TGTGTCAGGC ATCACTAGGA GACTTAGTCT TCACTCCCAT GCAACCTCCA TTCAGCTCAG 120 TGTCCACAGC TGCTGGACAG CTGCTTGACG GGACCATATT TGCTCTTAGA GCTGGGACTA 180 TAGAGGGAGC TTTGGGGTGC ACAGAGAGAC AGCCTAACCT CATCCCAATG CCCCAGCCTT 240 CCTGCCAGTG GGGTCCTTCC TGACGGCCTT TCTCCAAGGG ACCCAGGATC CTGGGCTCAG 300 TTTGGACCCC TGGGAGAGCT TCACGGGTGT ACAGGAAAGG GTGAGGCAGG TTAGGAACCA 360 AGAGAACACA CCCAGCCCCA TCAGTGTCTT GAGCCAGTTG CTCCTCCTCT TGCACCTCAG 420 TTATCTCATC TACCAAATGG GAGTGGAGAC GGGGATTTCT AGGGGGAAGT TTCTAGCCCA 480 GTGTCTGACT CAGAAATACA CTCAACTGCT CTCTTCTGCC AGCCCTCCCT CCCCATACAT 540 CCCTCTTTCT TGGATTGGGC TGCTGCAAGC ATAAGGGAAA CAAATCGCTT AGCGAGTAAA 600 GCAATTCTCT TCAAATTCTG AGAGGGTGAC CTTCGGTGGC TCCCTGCCCT TCCCCCTGCA 660 GCCTCAACAA ACTCGGGCAG GTGCCAGGGC CAGAGAAGTG GGGCCAGGGG GTCGTGAAGC 720 CAGGCCACCT AGAAAGGACA GGGACAGTGA GGCCAGGACA GTTATAGGTG GCAGGGTCAT 780 GCAGTCCGAC CAGCCACGAG GGGCAGAGGC AACGGACAGA GGCCCAGGCT AAGCGACCCA 840 GGGAGATGGG GCTATTTTTA ACTCAGCTTA ATTTTCCCTA CCTGGAAACT AACTCTTGTC 900 AGTGGAGCAG CGCTGTTCCG GGAATGGCTT CATCCCCTAA GATCTGTGCT CGCTTAGGTT 960 CCTGGGCCAG TCCTCTCCAT TTCACAGGAG CCCTGCTTGT TCAGCTCAGG CAGAGGGCAG 1020 AGAAGGAGAG AAACCGGAGC CCGGCCCAGC TCGCAGCTGG CTGTGCTGAC CCTGCGGGGC 1080 TCGGGCAGCA GCCCCTGCCT TGTAGTCACC CTTCTTTCAC ACCCGGGAGG GATCCTGTCT 1140 CTGGGTTCAT TTAATGCTTC TATTATGTTT CCCCGGCTCG GAGCCTCTGG TTCCCTATTG 1200 TCTTGAGCAG GCGTTTTGCA TTTGTGTAAA GATTAGACGC TTTATAACCT TCCCTCTTCT 1260 CCCTATGGTT TCCCTCTTTT ACTTTCTCAA ATCTGAGTTC TTTCTTTCTG GCTACGCACT 1320 GCTTCCTCAT TCTCCCCCTC TCTCCCTGCC TGTCTTTATC TGCCTCCCTG TTTGTTTTCC 1380 TCCCCACCAT GACCCCCTCC GTCTCCCCGC TGACCTGCTT TTCCTTCTTT CTTCTCTTCA 1440 CGGTCCAGCG ATTTGAATTC TCTATCCACC CCCAAGCAGC CCCCAGCCCT GCTTAATTCC 1500 GTATTCATAT TCTTGCAGAG GCTGATAGAA ATGACTGTGA GTATTGCTCA CCTCATTCCA 1560 GAAATACTCT TCTAAATTCT TCGAGAGGCA CGACGTGGGA GGGCAGAGAG CACCTCACGG 1620 GGAGTCCCTT GTGCTTTGCT TGATAGACCA AGCCACCTGC CCGCTGGGTG GCCTTGACCA 1680 GGCCCTGCTC CTCTCTGAGC CTCGTGGGCA GTCCTGAGCT GACTCCCCTG TGATAATAGC 1740 TGCCTCCTGG GGTTGTGGTG AGGAAGAGTC GATAGTGCTC CAAGCACGTA GTAGGTGCTC 1800 AGGAAACATT TGTTTGTTTT TTTCACAGGA GCCAGCTCAG TCTCCAGGAA GGAAGATCCT 1860 GCTCTCACCC TCCATCAGTT CTGCCAGTTT CTCCAGGATT TCACACATGC ACGCTTGCTC 1920 TGGGCACACC CTAGGAAGAT GCAAACTTGC CTGTTCCTGG TGGTCACCTA CTGTCCCCTT 1980 CATAAATGTC CAAGGACAAA GGAGCTGCTG AATACAGGAA CTGAGCATTG GGCATCCTGG 2040 GTTCTGTAAG TGGAAAGCCA GGTGTGCATC TCTTGACCCC CCTGCCCTCA GGAAGCACTC 2100 GCAAGGCCCC TACTGTGTGC AGGGTAGGTG TCAGGCCCTG CCTCCTCTGG GGCTCTGGAC 2160 CTTGAGATTG CAGGGGAGAT AAGTGCAATG GGATGAGTCA GGCAGGCACG AGAGGCACAG 2220 GCCCTGGGAA TTCCAAGAAA CGAGAGGGCC TTTCCTGTTG TGCCTGGAGA CAGGGTCCCT 2280 GAGAAGACTC CAGCAGGAAG TGGACTCTCA GCCAGGGCAG GAACAGAGGG TGCCTGCCAG 2340 TTCCCTGAGC TGCTCAGCAC AGCTGTGGTT CATCCCTGCT TTCCCCTCCC CGGCAAGGCT 2400 TCTGGGCCAG CAGAGGGGCA GGAGCAGAAT GCCAGTCCCC AGAGAAGTCC CCTGGCTTAC 2460 TTCTTTTGCA GACAGTAGCC CCCGGTGGAA GCCAAGACAT CCTGTCATGG CCAGGACAGG 2520 AGACTGTTCA AGGGGCGCTT TGTGTGTGTG TCCTCAGGGA CATCTTTCTG GAAAGGGGTC 2580 TGAAGCCACC TTCTTAGTCT CAAAGGAGCC TGTAAGCCAA GCAGGTGAAG TACCTTCTTG 2640 TTTTGGCCTT GTTTGCAAAC AAGGAAACAG GCCCAGGAAG GATGCCCTTG GCCATGGCTG 2700 CATAGCTGAA CAGCTTCTGG AAGGGACTAG AACTCCTGCC CCAGGCCCTG GGGTGACAGG 2760 GCAGGGGTTG AGGGGGGCAT TTCCTGGGTG AGGTGGGGAT GAAGCAGTTC CAGGCTTGTC 2820 AGAAGTCAGG CATGAGCTGT GTCCTTCACA GAGGGAGGCA GGCCCAGAGA GGGCTCTGAC 2880 TCGCCCAAGG CCACACAGCC TTGCGTGGGC CTTTCACATC CCACACAACA GAGGGGCATC 2940 CTCAGCCTGG TTGGCAGAGG GCAGGCAGGA TAGATGGCAG AGTCTTCTCC GAGGAGAGGG 3000 GTTTTGCTCA TGGAACCTCC TCCTCCACAC TCACAGCCCT GGGCGAGACC TGTGGAGCAG 3060 CCGCCAACAG AGTGAGGGAG GGGGCTCGGG GCAGCTGGGG GTGACTTGAG GAAGTCCAGC 3120 TGGACTGCGA GGGGCCCCTG GGGACTGCCA GGGAGCCTCA GGACTCCCAG AGGTGCTCCA 3180 GGCACAGAGG GAGGAATGGG CCTTCCATCT CCCTCCCCCC TTCACTGCAG AGGCTGGGTC 3240 GGGCCAGGTG CCCGGGGAGG AGGCGGTGTC CCTGGCTCCC AGCCCGCCGG TGCAGCGGGG 3300 CAGGGCTGGA CCAGAAGGGG TGGGGCACCG TGCCTGGTAT AAGAGGCAGC CAGGGCACCG 3360 AGGCAAT 3367 配列番号：２配列の長さ：１１７３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No 起源：生物名：Homo sapiens 細胞の種類：白血球配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置：1129..1173 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：1144..1150 特徴を決定した方法：S 配列： GAGTCAGGCA GGCACGAGAG GCACAGGCCC TGGGAATTCC AAGAAACGAG AGGGCCTTTC 60 CTGTTGTGCC TGGAGACAGG GTCCCTGAGA AGACTCCAGC AGGAAGTGGA CTCTCAGCCA 120 GGGCAGGAAC AGAGGGTGCC TGCCAGTTCC CTGAGCTGCT CAGCACAGCT GTGGTTCATC 180 CCTGCTTTCC CCTCCCCGGC AAGGCTTCTG GGCCAGCAGA GGGGCAGGAG CAGAATGCCA 240 GTCCCCAGAG AAGTCCCCTG GCTTACTTCT TTTGCAGACA GTAGCCCCCG GTGGAAGCCA 300 AGACATCCTG TCATGGCCAG GACAGGAGAC TGTTCAAGGG GCGCTTTGTG TGTGTGTCCT 360 CAGGGACATC TTTCTGGAAA GGGGTCTGAA GCCACCTTCT TAGTCTCAAA GGAGCCTGTA 420 AGCCAAGCAG GTGAAGTACC TTCTTGTTTT GGCCTTGTTT GCAAACAAGG AAACAGGCCC 480 AGGAAGGATG CCCTTGGCCA TGGCTGCATA GCTGAACAGC TTCTGGAAGG GACTAGAACT 540 CCTGCCCCAG GCCCTGGGGT GACAGGGCAG GGGTTGAGGG GGGCATTTCC TGGGTGAGGT 600 GGGGATGAAG CAGTTCCAGG CTTGTCAGAA GTCAGGCATG AGCTGTGTCC TTCACAGAGG 660 GAGGCAGGCC CAGAGAGGGC TCTGACTCGC CCAAGGCCAC ACAGCCTTGC GTGGGCCTTT 720 CACATCCCAC ACAACAGAGG GGCATCCTCA GCCTGGTTGG CAGAGGGCAG GCAGGATAGA 780 TGGCAGAGTC TTCTCCGAGG AGAGGGGTTT TGCTCATGGA ACCTCCTCCT CCACACTCAC 840 AGCCCTGGGC GAGACCTGTG GAGCAGCCGC CAACAGAGTG AGGGAGGGGG CTCGGGGCAG 900 CTGGGGGTGA CTTGAGGAAG TCCAGCTGGA CTGCGAGGGG CCCCTGGGGA CTGCCAGGGA 960 GCCTCAGGAC TCCCAGAGGT GCTCCAGGCA CAGAGGGAGG AATGGGCCTT CCATCTCCCT 1020 CCCCCCTTCA CTGCAGAGGC TGGGTCGGGC CAGGTGCCCG GGGAGGAGGC GGTGTCCCTG 1080 GCTCCCAGCC CGCCGGTGCA GCGGGGCAGG GCTGGACCAG AAGGGGTGGG GCACCGTGCC 1140 TGGTATAAGA GGCAGCCAGG GCACCGAGGC AAT 1173 配列番号：３配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No 起源：生物名：Homo sapiens 細胞の種類：白血球配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..45 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：TATA signal 存在位置：16..22 特徴を決定した方法：S 配列： GGGCACCGTG CCTGGTATAA GAGGCAGCCA GGGCACCGAG GCAAT 45 配列番号：４配列の長さ：４５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル配列：No 配列： AAAGAGTGTG TCTACTTCTG CCACCTGGAC ATCATCTGGG TCAAC 45

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト・エンドセリン−２の前駆体の一部をコー
ドするＤＮＡを含むゲノムＤＮＡの制限酵素地図であ
る。

【図２】ヒト・エンドセリン−２遺伝子の５’上流域
の塩基配列を示す図である。

【図３】ヒト・エンドセリン−２遺伝子の５’上流域
の塩基配列を示す図である。

【図４】ヒト・エンドセリン−２遺伝子の５’上流域
の塩基配列を示す図である。

【図５】図２の塩基配列の一部で、ＴＡＴＡＡボックス
などの転写シグナルの位置を示す図である。

【図６】図２の塩基配列の一部で、ＴＡＴＡＡボックス
などの転写シグナルの位置を示す図である。

【図７】ヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモーター
を含むＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片の下流に接続された
ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミドである、プラスミド
Ａ、プラスミドＤ、プラスミドＥの構成を示す図であ
る。

【図８】プラスミドＡ、プラスミドＤ、プラスミドＥで
形質転換されたヒト腎臓細胞のＣＡＴアッセイのオート
ラジオグラムを示す。

【図９】発現ベクターに含有されるヒト・エンドセリン
−２のプロモーターを含む種々のＤＮＡ断片とその下流
に結合されたルシフェラーゼ遺伝子とを示す図である。

【図１０】図９に示されるＤＮＡ断片を含有するプラス
ミドでＡＣＮＨ細胞を形質転換した後、発現されるルシ
フェラーゼの活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/70 15/85 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＴ 8314−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト・エンドセリン−２遺伝子のプロモー
ター活性を有する領域を含有するＤＮＡ。
【請求項２】配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを含
有する請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを含
有する請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】ヒトゲノムＤＮＡ由来の請求項１記載のＤ
ＮＡ。
【請求項５】ヒトゲノムＤＮＡが配列番号１の塩基配列
を有するＤＮＡである請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】請求項１記載のＤＮＡを含有するベクタ
ー。
【請求項７】請求項６記載のベクターを保持する形質転
換体。
【請求項８】細菌である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】動物細胞である請求項７記載の形質転換
体。
【請求項１０】請求項７記載の形質転換体を培養し、プ
ロモーター活性を有するＤＮＡの下流に接続した蛋白質
またはペプチドをコードする構造遺伝子を発現させるこ
とを特徴とする該蛋白質またはペプチドの製造方法。