CN111704705B - 一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高分子纳米药物技术领域，提供了一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡。本发明提供的嵌段聚合物mPEG‑PFPMA‑PGua中含有氟化疏水段和带胍基段，能够同时装载疏水药物和核酸类药物，利用其制备的载药囊泡能够有效使核酸类药物达到病灶并进入细胞发挥功能；本发明还提供了一种靶向载药囊泡，其中靶向囊泡由mPEG‑PFPMA‑PGua和Ang‑PEG‑PFPMA通过自组装形成。Ang‑PEG‑PFPMA表面具有Angiopep‑2修饰，Angiopep‑2是一种靶向脑神经胶质瘤的多肽，裸露于载体外部赋予载体穿过血脑屏障和靶向胶质瘤细胞的能力，从而使递送载体获得靶向能力。

Description

一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药 囊泡
技术领域
本发明涉及高分子纳米药物技术领域，尤其涉及一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡。
背景技术
脑神经胶质瘤作为最难以治疗的肿瘤之一，具有生长迅速，侵袭性强的特点，也是目前死亡率最高的肿瘤类型之一，在目前标准的治疗中生存期仅为15个月左右。替莫唑胺(TMZ)作为治疗脑胶质瘤的一线用药，能够使肿瘤细胞的DNA分子发生烷基化而损伤，导致细胞死亡。然而，O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-methyltrasferase，MGMT)能迅速将TMZ介导生成的O6-MeG中的甲基转移至自身的活性半胱氨酸残基上，修复替莫唑胺所引起的DNA损伤使得肿瘤细胞能够继续存活，导致替莫唑胺杀伤肿瘤细胞的作用大打折扣。Gaspar J.Kitange等人研究发现视网膜母细胞瘤结合蛋白4(RBBP4)可以通过调节MGMT和其他DNA修复蛋白的表达来影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，降低RBBP4蛋白的表达能够提高替莫唑胺对肿瘤细胞的杀伤作用。
为了实现降低RBBP4蛋白的表达以提高TMZ治疗效果的目的，研究人员采用了RNA干扰(RNAi)技术，即利用靶向RBBP4的小分子干扰RNA(siRBBP4)干扰RBBP4蛋白的合成，降低RBBP4蛋白的表达。但是利用siRNA来治疗脑神经胶质瘤还存在着许多挑战。裸露的siRNA对核酸酶敏感，在血液循环系统中能够被核酸酶迅速降解，很容易经肾脏排泄，因此需要有效的策略来保护循环系统中的siRNA。在将siRNA递送至大脑这一过程中，血脑屏障(BBB)被认为是最难以逾越的。血脑屏障可以抑制近98％的分子运输，仅允许分子量小于400Da的脂溶性小分子穿过。因此，分子量为14kDa的亲水性siRNA无法轻易到达大脑病灶。另一方面，细胞膜仅允许小于1000Da的中性、略微疏水的分子被动扩散通过，而亲水且带负电的裸siRNA则无法进入细胞。另外，即使siRNA设法进入细胞，它也不能轻易地从内涵体逃逸而与胞质RNAi机制结合。因此，如何有效使siRNA到达病灶并进入细胞发挥功能是利用siRNA治疗疾病的关键一环。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡。本发明提供的嵌段聚合物能够同时装载疏水药物和核酸类药物，利用其制备的载药囊泡能够有效使核酸类药物达到病灶并进入细胞发挥功能；本发明提供的靶向载药囊泡在载药囊泡的基础上进一步增加了靶向脑神经胶质瘤的能力，比非靶向囊泡具有更好的靶向能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种嵌段聚合物，具有式I所示结构，表示为mPEG-PFPMA-PGua，其中mPEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段，PGua表示聚N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺嵌段；
Figure BDA0002554680330000021
式I中：n、x、y表示聚合度，n为40～50，x为23～27，y为4～6。
优选的，所述mPEG-PFPMA-PGua中，mPEG嵌段的数均分子量为1.8～2.2kDa，PFPMA嵌段的数均分子量为4.8～5.2kDa，PGua嵌段的数均分子量为0.8～1.2kDa。
优选的，包括以下步骤：
(1)在阻聚剂和缚酸剂的作用下，将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐进行取代反应，得到N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺；
(2)在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和甲氧基聚乙二醇胺进行脱水缩合反应，得到mPEG-CPADN，结构式如式a所示；
Figure BDA0002554680330000022
(3)在引发剂作用下，将mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA，结构式如式b所示：
Figure BDA0002554680330000031
(5)在引发剂作用下，将mPEG-PFPMA、N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA-PGua；
所述步骤(1)和步骤(2)、步骤(1)和步骤(3)没有时间顺序的要求。
本发明提供了一种载药囊泡，所述载药囊泡包括囊泡和被装载在囊泡内部的药物；所述药物包括疏水药物和/或核酸类药物；所述囊泡由上述方案所述的嵌段聚合物自组装得到。
本发明还提供了一种靶向载药囊泡，所述靶向载药囊泡包括靶向囊泡和被装载在靶向囊泡内部的药物；所述药物包括疏水药物和/或核酸类药物；所述靶向囊泡由上述方案所述的嵌段聚合物和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA通过自组装形成；
所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA中，Ang表示修饰在聚乙二醇嵌段上的Angiopep-2多肽，PEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段；
所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA具有式II所示结构：
Figure BDA0002554680330000032
式II中：m、z表示聚合度，m为72～82，z为23～27。
优选的，所述嵌段聚合物和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的摩尔比为3～4:1。
优选的，所述靶向载药囊泡的平均粒径为80～100nm。
优选的，所述疏水药物为替莫唑胺；所述核酸类药物为siRNA。
优选的，所述靶向载药囊泡中疏水药物的载药量≤5％；所述靶向载药囊泡中核酸类药物的载药量≤10％。
优选的，所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的制备方法包括以下步骤：
(i)在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和氨基聚乙二醇马来酰亚胺进行脱水缩合反应，得到Mal-PEG-CPADN，结构式如式c所示；
Figure BDA0002554680330000041
(ii)在氮气保护下，将C端带有半胱氨酸修饰的多肽Angiopep-2和Mal-PEG-CPADN在溶剂中进行迈克尔加成反应，得到Ang-PEG-CPADN，结构式如式d所示；
Figure BDA0002554680330000042
(iii)在引发剂作用下，将Ang-PEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到Ang-PEG-PFPMA。
本发明提供了一种嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua，mPEG-PFPMA-PGua为两亲性含氟带胍基的三嵌段高分子聚合物，聚乙二醇(PEG)部分为亲水段包围在粒子的外围，为粒子提供良好的生物相容性，使其具有良好的血液循环表现；PFPMA部分是由含氟单体2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯通过聚合反应得到的疏水嵌段，可有助于高分子聚合物自组装形成稳定的粒子结构，形成一个疏水层，在自组装的过程中将疏水药物(如替莫唑胺分子)装载于此疏水层中；聚合物上的氟取代基在形成均匀的纳米颗粒、有效的内吞作用和维持低细胞毒性方面起着重要作用；PGua部分是由含胍基单体聚合成的嵌段，在生理条件下，胍基通过与核酸分子上的磷酸根静电吸附作用和形成盐桥的形式与核酸类药物结合，将核酸类药物装载于纳米载体内。
本发明还提供了一种载药囊泡，其中囊泡由嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua自组装得到。本发明提供的载药囊泡能同时装载疏水药物和核酸类药物，能够使核酸类药物达到病灶并进入细胞发挥功能，实施例结果表明，采用本发明的载药囊泡装载siRNA后，载药囊泡被U87和U251细胞内吞的量和游离siRNA被U87和U251细胞内吞的量相比显著提高。
本发明还提供了一种靶向载药囊泡，其中靶向囊泡由嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA通过自组装形成。Ang-PEG-PFPMA表面具有Angiopep-2修饰，Angiopep-2是一种靶向脑神经胶质瘤的多肽，裸露于载体外部赋予载体穿过血脑屏障和靶向胶质瘤细胞的能力，从而使递送载体获得靶向能力；且Ang-PEG-PFPMA具有和PEG-PFPMA-PGua相同的含氟疏水嵌段(PFPMA)，在自组装形成纳米粒子过程中，其含氟疏水嵌段能够与mPEG-PFPMA-Gua上的疏水嵌段一同组成含氟疏水层。实施例结果表明，利用本发明的靶向载药囊泡装载siRNA后，靶向载药囊泡被U87细胞内吞的量是非靶向囊泡被内吞的量的2.2倍，被U251细胞内吞的量是非靶向囊泡被内吞的量的2.0倍。此结果表明经过靶向修饰的囊泡比非靶向囊泡具有更好的靶向能力。
附图说明
图1为靶向载药囊泡的形成过程以及在脑胶质瘤细胞中发生作用的过程示意图；
图2为mPEG-PFPMA-PGua的1H-NMR图谱；
图3为Ang-PEG-PFPMA的1H-NMR图谱；
图4为fNP和fNP@(siRNA&TMZ)的粒径分布图；
图5为Ang-fNP和Ang-fNP@(siRNA&TMZ)的粒径分布图；
图6为凝胶阻滞实验检测囊泡siRNA装载能力的实验结果；
图7为实施例4中流式细胞技术检测囊泡被细胞内吞的实验结果，其中(a)为囊泡被U87细胞内吞的情况，(b)为囊泡被U251细胞内吞的情况；
图8为实施例5中共聚焦显微成像检测囊泡被U87细胞(a)和U251细胞(b)内吞的情况；
图9为实施例6中细胞毒性检测结果；
图10为实施例7中U87细胞凋亡实验结果，其中(a)未经处理的对照组；(b)Ang-fNP@siRBBP4组；(c)Ang-fNP@(siScr&TMZ)组；(d)Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)组；
图11为实施例7中U251细胞凋亡实验，其中(a)未经处理的对照组；(b)Ang-fNP@siRBBP4组；(c)Ang-fNP@(siScr&TMZ)组；(d)Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)组；
图12为实施例8中细胞核损伤实验结果；
图13为实施例9中囊泡的血液稳定性及半衰期测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种嵌段聚合物，具有式I所示结构，表示为mPEG-PFPMA-PGua，其中mPEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段，PGua表示聚N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺嵌段；
Figure BDA0002554680330000061
式I中：n、x、y表示聚合度，n为40～50，优选为43～45，x为23～27，优选为24～26，y为4～6，优选为5。
在本发明中，所述嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua中，mPEG嵌段的数均分子量优选为1.8～2.2kDa，更优选为2kDa，PFPMA嵌段的数均分子量优选为4.8～5.2kDa，更优选为4.8～5.0kDa，PGua嵌段的数均分子量优选为0.8～1.2kDa，更优选为0.8～1.0kDa。
本发明提供了上述方案所述嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua的制备方法，包括以下步骤：
(1)在阻聚剂和缚酸剂的作用下，将1H-吡唑1-甲脒盐酸盐和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐进行取代反应，得到N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺；
(2)在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和甲氧基聚乙二醇胺进行脱水缩合反应，得到mPEG-CPADN，结构式如式a所示；
Figure BDA0002554680330000062
(3)在引发剂作用下，将mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA，结构式如式b所示：
Figure BDA0002554680330000063
(4)在引发剂作用下，将PEG-PFPMA、N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA-PGua；
所述步骤(1)和步骤(2)、步骤(3)没有时间顺序的要求。
本发明在阻聚剂和缚酸剂的作用下，将1H-吡唑1-甲脒盐酸盐(Praxadine)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐(APM)进行取代反应，得到N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺(Gua)。在本发明中，所述1H-吡唑1-甲脒盐酸盐和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐的质量比优选为500:410；所述取代反应用溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)，所述阻聚剂优选为对苯二酚，所述缚酸剂优选为三乙胺；所述1H-吡唑1-甲脒盐酸盐、阻聚剂和缚酸剂的用量比优选为500mg:1mg:1mL；所述取代反应优选在氮气保护条件下进行，所述取代反应的温度优选为室温，时间优选为24h。
在本发明中，取代反应的反应式如式A所示：
Figure BDA0002554680330000071
取代反应完成后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，得到N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺(Gua)；所述后处理优选包括以下步骤：将产物料液过滤，将滤液滴加到冰乙醚中，搅拌后离心除去上清液，将所得沉淀洗涤后得到N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)胍；所述洗涤优选为先用乙腈和三乙胺的混合液洗涤两遍，再用二氯甲烷洗涤一遍；所述混合液中乙腈和三乙胺的体积比优选为20:1。
本发明在N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPAND)和甲氧基聚乙二醇胺(记为mPEG-NH2)进行脱水缩合反应，得到mPEG-CPADN。在本发明中，所述N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和甲氧基聚乙二醇胺的质量比优选为62:30.48:69.85:200；所述甲氧基聚乙二醇胺的重均分子量优选为2000(记为mPEG(2000)-NH2)，所述脱水缩合反应用溶剂优选为四氢呋喃。在本发明中，所述脱水缩合反应优选在冰浴条件下进行，所述脱水缩合反应的时间优选为8h。
在本发明的具体实施例中，优选先将DCC溶解于四氢呋喃中，得到DCC溶液，将NHS和CPAND溶解于四氢呋喃中，得到NHS-CPAND混合溶液，然后在冰浴和搅拌条件下将DCC溶液滴加到NHS-CPAND混合溶液中，滴加完毕后反应24h，然后加入甲氧基聚乙二醇胺进行脱水缩合反应；所述DCC溶液的滴加速度为每5～8秒滴加1滴。
在本发明中，所述脱水缩合反应的反应式如式B所示：
Figure BDA0002554680330000081
脱水缩合反应结束后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将产物料液过滤，所得滤液蒸发浓缩至4～6mL，优选浓缩至5mL，将所得浓缩液在搅拌条件下滴加到冰乙醚中，在滴加过程中产生沉淀，滴加完毕后通过离心收集沉淀，将所得沉淀溶解于1～3mL二氯甲烷后再次在冰乙醚中沉淀，再次离心收集沉淀后，将所得沉淀用1～3mL二氯甲烷溶解后加入乙醇中，在低温下析出沉淀，然后在低温下离心除去上清液，将所得沉淀进行真空干燥，得到mPEG-CPADN；所述低温下析出沉淀的温度优选为-80℃，时间优选为1h；所述低温下离心的温度优选为-80℃；本发明对所述真空干燥的条件没有特殊要求，以充分干燥为宜。
得到mPEG-CPADN后，本发明在引发剂作用下，将mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯(FPMA)进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA。在本发明中，所述引发剂优选为偶氮二异丁腈(AIBN)；所述mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯和引发剂的摩尔比优选为1:40:0.15；所述聚合反应用溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO)；所述聚合反应的温度优选为70℃，时间优选为36～48h，更优选为42～46h；所述聚合反应优选在氮气保护下进行。
在本发明中，所述mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯(FPMA)进行聚合反应的反应式如式C所示：
Figure BDA0002554680330000091
聚合反应完成后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，得到mPEG-PFPMA，所述后处理优选包括以下步骤：将产物料液依次在乙醇和去离子水中进行透析，然后将透析所得产物冷冻干燥，得到mPEG-PFPMA。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为2kD，本发明在先在乙醇中透析，除去剩余的FPMA单体，然后再去离子水中透析除去乙醇；本发明对所述冷冻干燥的条件没有特殊要求，以充分干燥为宜。
得到mPEG-PFPMA和N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺后，本发明在引发剂作用下，将mPEG-PFPMA、N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA-PGua。在本发明中，所述引发剂优选为偶氮二异丁腈(AIBN)；所述mPEG-PFPMA、N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺(Gua)和引发剂的摩尔比优选为1:20:0.15；所述聚合反应的温度优选为70℃，时间优选为36～48h，更优选为42～46h；所述聚合反应优选在氮气保护下进行。
在本发明中，所述mPEG-PFPMA和Gua进行聚合反应的反应式如式D所示：
Figure BDA0002554680330000092
聚合反应完成后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，得到mPEG-PFPMA-PGua；所述后处理优选包括以下步骤：将产物料液在去离子水中进行透析除去二甲基亚砜与剩余的Gua，将透析产物进行冷冻干燥，得到mPEG-PFPMA-PGua。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为2kD。
本发明还提供了一种载药囊泡，所述载药囊泡包括囊泡和被装载在囊泡内部的药物；所述药物包括疏水药物和/或核酸类药物，优选为同时装载疏水药物和核酸类药物；所述囊泡由上述方案所述的嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua自组装得到；所述载药囊泡的粒径优选为80nm；所述载药囊泡中疏水药物的载药量优选≤5％，核酸类药物的载药量优选≤10％。在本发明中，所述疏水药物以及核酸类药物的种类和后续靶向载药囊泡中一致，后续进行具体说明；所述载药囊泡的制备方法和后续靶向载药囊泡的制备方法一致，区别仅在于靶向载药囊泡的制备方法中添加靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA，后续进行具体说明。
本发明还提供了一种靶向载药囊泡，所述靶向载药囊泡包括靶向囊泡和被装载在靶向囊泡内部的药物；所述药物包括疏水药物和/或核酸类药物，优选为同时装载疏水药物和核酸类药物；所述靶向囊泡由上述方案所述的嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA通过自组装形成。
在本发明中，所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA具有式II所示结构：
Figure BDA0002554680330000101
式II中：m、z表示聚合度，m为72～82，优选为75～80，z为22～27，优选为24.5～26。
在本发明中，所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA中，Ang表示修饰在聚乙二醇嵌段上的Angiopep-2多肽，所述Angiopep-2的C端经半胱氨酸修饰(即半胱氨酸含有疏基S-H)，C端经半胱氨酸修饰的Angiopep-2的单字母序列为NH2-TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC-COOH，所述Angiopep-2和PEG嵌段通过多肽上半胱氨酸的侧链巯基与Mal-PEG-NH2上的马来酰亚胺基通过迈克尔加成反应连接；PEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段；所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA中，Ang基团的数均分子量为2.4kDa，PEG嵌段的数均分子量优选为3.4kDa，PFPMA嵌段的数均分子量优选为4.7kDa。
在本发明中，所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的制备方法优选包括以下步骤：
(i)在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和氨基聚乙二醇马来酰亚胺进行脱水缩合反应，得到Mal-PEG-CPADN，结构式如式c所示；
Figure BDA0002554680330000111
(ii)在氮气保护下，将C端经半胱氨酸修饰的多肽Angiopep-2和Mal-PEG-CPADN在溶剂中进行迈克尔加成反应，得到Ang-PEG-CPADN，结构式如式d所示；
Figure BDA0002554680330000112
(iii)在引发剂作用下，将Ang-PEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到Ang-PEG-PFPMA。
本发明在N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADN)和氨基聚乙二醇马来酰亚胺(Mal-PEG-NH2)进行脱水缩合反应，得到Mal-PEG-CPADN，具体操作条件、后处理过程均和上述制备mPEG-PFPMA-PGua的过程中步骤(2)一致，仅将上述步骤(2)中的甲氧基聚乙二醇胺替换为氨基聚乙二醇马来酰亚胺即可；在本发明中，所述氨基聚乙二醇马来酰亚胺的分子量优选为3.4k，记为Mal-PEG(3.4k)-NH2。
得到Mal-PEG-CPADN后，本发明在氮气保护下，将C端经半胱氨酸修饰多肽Angiopep-2和Mal-PEG-CPADN在溶剂中进行迈克尔加成反应，得到Ang-PEG-CPADN。在本发明中，所述Angiopep-2和Mal-PEG-CPADN的摩尔比优选为3:1；所述迈克尔加成反应的温度优选为37℃，时间优选为12h；所述迈克尔加成反应用溶剂优选为二甲基亚砜。
迈克尔加成反应完成后，本发明优选将所得产物料液进行后处理，得到Ang-PEG-CPADN；所述后处理优选包括以下步骤：将产物料液依次在二甲基亚砜和去离子水中进行透析，将透析产物冷冻干燥，得到Ang-PEG-CPADN；所述透析用透析袋的截留分子量优选为3.5kD。
得到Ang-PEG-CPADN后，本发明在引发剂作用下，将Ang-PEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到Ang-PEG-PFPMA，具体操作条件、后处理过程均和上述制备mPEG-PFPMA-PGua的过程中步骤(3)一致，区别仅在于将上述步骤(3)中的mPEG-CPADN替换为Ang-PEG-CPADN。
在本发明中，所述Ang-PEG-CPADN的制备过程如式E所示：
Figure BDA0002554680330000121
在本发明中，所述嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的摩尔比优选为3～4:1，更优选为3.5～4:1；所述靶向载药囊泡的平均粒径优选为90nm。
在本发明中，所述疏水药物优选为替莫唑胺；所述核酸类药物优选为siRNA；所述siRNA具体为siRBBP4；所述siRBBP4正义链的序列为5’-GCU GAA GUG AAC UGC CUU UTT-3’，siRBBP4反义链的序列为5’-AAA GGC AGU UCA CUU CAG CTT-3’。在本发明中，所述靶向载药囊泡中疏水药物的载药量优选为5％；所述靶向载药囊泡中核酸类药物的载药量优选为10％。本发明提供的靶向载药囊泡同时装载疏水药物和核酸类药物，且具有靶向能够力，能够有效使核酸类药物和疏水药物达到病灶并进入细胞发挥功能。本发明中靶向载药囊泡的形成过程以及在脑胶质瘤细胞中发生作用的过程示意图如图1所示。
在本发明中，所述靶向载药囊泡的制备方法优选包括以下步骤：
将嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA溶解于溶剂中，得到聚合物溶液；
将所述混合聚合物溶液、疏水药物溶液和核酸类药物溶液混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液加入HEPES缓冲液中，然后依次进行搅拌和透析，得到靶向载药囊泡。
本发明将嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA溶解于溶剂中，得到聚合物溶液。在本发明中，所述溶剂优选为二甲基亚砜；所述嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的摩尔比优选为3～4:1；所述聚合物溶液中mPEG-PFPMA-PGua的浓度优选为20mg/mL。
得到聚合物溶液后，本发明将所述混合聚合物溶液、疏水药物溶液和核酸类药物溶液混合，得到混合溶液。在本发明中，所述疏水药物溶液的溶剂优选为二甲基亚砜；所述疏水药物溶液的浓度优选为20mg/mL；所述核酸类药物溶液的溶剂优选为DEPC(二乙基焦碳酸酯)处理过的水(即灭菌蒸馏水)；所述核酸类药物溶液的浓度优选为5mg/mL；所述疏水药物溶液中的疏水药物与混合聚合物溶液中mPEG-PFPMA-PGua的质量比优选为1～3:10，更优选为2:10；所述核酸类药物溶液中的核酸类药物和混合聚合物溶液中mPEG-PFPMA-PGua的质量比优选为1～4:10，更优选为1:10；本发明对三种溶液混合的方式没有特殊要求，充分混合均匀即可。
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液加入HEPES缓冲液中，然后依次进行搅拌和透析，得到靶向载药囊泡。在本发明中，所述HEPES的浓度优选为10mmol/L，pH值优选为7.4；所述混合溶液加入HEPES缓冲液中的方式优选为滴加，所述滴加的速度为每10秒滴加一滴；所述滴加在搅拌条件下进行，滴加完毕后优选继续搅拌1h；在滴加和搅拌过程中，嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA发生自组装，形成囊泡，并将药物装载载囊泡中。本发明对所述透析没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法，能够将二甲基亚砜等有机溶剂以及没有被装载的药物去除即可；最终所得靶向载药囊泡分散于HEPES缓冲液中，靶向载药囊泡的浓度可以根据实际所需药量进行调节。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例中制备嵌段聚合物和靶向聚合物所用原料如表1所示：
表1 制备嵌段聚合物和靶向聚合物所用原料
Figure BDA0002554680330000141
其中，购买的Angiopep-2是C端带有半胱氨酸修饰的Angiopep-2。
实施例中制备囊泡所用原料如表2所示：
表2 制备囊泡所用原料
Figure BDA0002554680330000142
其中，siRNA具体为siScramble(没有功能的siRNA，作为对照使用)和siRBBP4，序列如下(1)siScramble：5’-UUC UCCGAA CGU GUC ACG UdTdT-3’(正义)，5’-ACG UGA CACGUU CGG AGA AdTdT-3’(反义)；(2)siRBBP4：5’-GCU GAA GUG AAC UGC CUU UTT-3’(正义)，5’-AAA GGC AGU UCA CUU CAG CTT-3’(反义)。
实施例1
嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua的合成：
(1)N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺(Gua)的合成
500mg 1H-吡唑1-甲脒盐酸盐(Praxadine)和410mg N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐(APM)溶解于10mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入1mg对苯二酚(阻聚剂)和1mL三乙胺(缚酸剂)。在氮气保护下室温反应24h。将上述反应液过滤后滴加到100mL冰乙醚中，并不停搅拌，离心除去上清液，留下的有机相棕黄色粘稠沉淀先用乙腈(20mL)和三乙胺(1mL)的混合液洗两遍，再用二氯甲烷(30mL)洗一遍，最后将得到的淡黄色沉淀真空干燥。
(2)mPEG-CPADN的合成
DCC 62mg溶于5毫升无水四氢呋喃中，将NHS 30.48mg与CPADN 69.85mg共同溶于10毫升无水四氢呋喃并加入反应瓶中，冰浴搅拌，将前面制备的DCC溶液通过恒压漏斗逐滴加入反应瓶中(5～8秒一滴)。反应进行24小时后，向反应瓶中加入200mg mPEG(2k)-NH2继续反应8小时。反应结束后，将反应液过滤除去沉淀，滤液通过旋转蒸发仪浓缩至5mL左右，逐滴加入到150mL冰乙醚中，一边滴加一边搅拌，产生沉淀，离心弃去上清液收集沉淀，用2mL二氯甲烷溶解后再次在冰乙醚中沉淀，离心收集沉淀，再用2mL二氯甲烷溶解沉淀，加入30mL乙醇混匀置于-80℃1小时后有沉淀析出，低温离心弃去上清液，将沉淀置于真空干燥箱中24小时，即得到产物。
(3)mPEG-PFPMA的合成
mPEG-CPADN，FPMA和引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在一定摩尔比下(1:40:0.15)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，在氮气保护下70℃聚合反应36小时后，反应液用截留孔径为2kD的透析袋在乙醇中透析纯化产物，再将透析液换成去离子水继续透析除去乙醇，最后将样品冷冻干燥。
(4)mPEG-PFPMA-PGua的合成
PEG-PFPMA，Gua和引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在一定摩尔比下(1:20:0.15)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，在氮气保护下70℃聚合反应36小时后，反应液用截留孔径为2kD的透析袋在去离子水中透析纯化产物后冷冻干燥。
实施例2
靶向高分子聚合物Ang-PEG-PFPMA的合成
(1)Mal-PEG-CPADN的合成
合成条件与实施例1中合成mPEG-CPADN的条件相同，仅将mPEG(2k)-NH2替换为Mal-PEG(3.4k)-NH2。
(2)Ang-PEG-CPADN的合成
巯基修饰的多肽Angiopep-2与Mal-PEG-CPADN以摩尔比3:1溶于DMSO中，在氮气保护下37℃反应过夜。将反应液用截留分子量为3.5kD的透析袋在DMSO中透析纯化，再将透析液换成去离子水透析除去DMSO，然后冷冻干燥得到产物。
(3)Ang-PEG-PFPMA的合成
合成条件与实施例1中合成PEG-PFPMA的条件相同，仅将PEG-CPADN替换为Ang-PEG-CPADN。
聚合物表征：
(1)mPEG-PFPMA-PGua的表征
以氘代二甲基亚砜为溶剂，mPEG-PFPMA-PGua的1H-NMR图谱如图2所示。a峰位置为δ3.51，b峰位置为δ1.90，c峰位置为δ0.99，d峰位置为δ1.90，e峰位置为δ0.81，f峰位置为δ4.45，g峰位置为δ6.56，h峰位置为δ1.59。a，b+d+h，c+e，f，g峰的积分比值为182：66：63：49：24，可得出PFPMA的聚合度x为24，PGua的聚合度y约为5，mPEG-NH2分子量为2kDa，mPEG的聚合度n固定为45.5，所得的三嵌段聚合物mPEG-PFPMA-PGua的分子量为2kDa-4.8kDa-0.8kDa。
(2)Ang-PEG-PFPMA的表征
以氘代二甲基亚砜为溶剂，Ang-PEG-PFPMA的1H-NMR图谱如图3所示。a峰位置为δ3.51，b峰位置为δ1.90，c峰位置为δ0.81，d峰位置为δ4.45，e峰位置为δ6.56，Angiopep-2的氢原子峰位置介于δ7-δ7.5。a，d，e峰的积分比值为312：46：24，可得出FPMA的聚合度为24.5，Mal-PEG-NH2的分子量为3.4kDa，PEG的聚合度m固定为77，所得的Ang-PEG-PFPMA的分子量为2.4kDa-3.4kDa-4.7kDa。
实施例3
将mPEG-PFPMA-PGua和Ang-PEG-PFPMA以4:1的摩尔比溶解于二甲基亚砜中，控制其中mPEG-PFPMA-PGua的浓度为20mg/mL，得到混合聚合物溶液备用。siRNA粉末溶于经过DEPC处理过的水中，配置成5mg/mL的siRNA溶液备用。替莫唑胺(TMZ)溶于二甲基亚砜中，配置成20mg/mL的TMZ溶液备用。
(1)空载囊泡的制备：
空载靶向囊泡：取100μL混合聚合物溶液，每10秒一滴逐滴加入到置于磁力搅拌器上搅拌着的900μL 10mM的HEPES(pH 7.4)溶液中，滴加完成后继续搅拌1小时，再通过透析除去二甲基亚砜。形成1mg/mL的空载靶向囊泡，记为Ang-fNP。
空载非靶向囊泡：制备方法和空载靶向囊泡一致，仅将混合聚合物溶液替换为mPEG-PFPMA-PGua溶液，浓度为20mg/mL，所得空载非靶向囊泡记为fNP。
(2)装载siRNA的靶向囊泡
将混合聚合物溶液与siRNA的溶液以不同比例混合形成不同质量比的混合液(混合比例见表3)，然后以10秒每滴的速度逐滴加入到1mL HEPES溶液中，滴加完成后继续搅拌1小时，再通过透析除去二甲基亚砜，得到装载siRNA的靶向囊泡，记为Ang-fNP@siRNA(其中siRNA为siScramble时，记为Ang-fNP@siScr，siRNA为siRBBP4时，记为Ang-fNP@siRBBP4)。
表3 聚合物溶液与siRNA的溶液的质量比
Figure BDA0002554680330000171
(3)装载siRNA的非靶向囊泡
制备步骤和(2)中一致，仅将混合聚合物溶液替换为仅包括PEG-PFPMA-PGua的溶液，浓度为20mg/L，记为fNP@siRNA。
(4)装载替莫唑胺(TMZ)的靶向囊泡
将混合聚合物溶液与TMZ的溶液以不同比例混合形成不同质量比的混合液(混合比例见表4)，然后以10秒每滴的速度逐滴加入到HEPES溶液中，滴加完成后继续搅拌1小时，再通过透析除去二甲基亚砜和未被装载的TMZ，得到装载TMZ的靶向囊泡，记为Ang-fNP@TMZ。
表4 制备fNP@TMZ的材料用量
Figure BDA0002554680330000172
(5)共载siRNA与替莫唑胺(TMZ)的靶向囊泡
将混合聚合物溶液与siRNA溶液和TMZ溶液混合，形成混合液，混合液中siRNA与mPEG-PFPMA-PGua的质量比为1:10，TMZ和PEG-PFPMA-PGua的质量比为2:10，然后以10秒每滴的速度将混合液逐滴加入到1mL HEPES溶液中，滴加完成后继续搅拌1小时，再通过透析除去二甲基亚砜和没有被装载的药物，得到共载siRNA和TMZ的靶向囊泡Ang-fNP@(siRNA&TMZ)，(其中siRNA为siScramble时，记为Ang-fNP@(siScr&TMZ)，siRNA为siRBBP4时，记为Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ))。
聚合物囊泡性质分析：
(1)囊泡的粒径
囊泡的粒径及粒径分布通过动态光散射仪(DLS)检测。
①非靶向囊泡的粒径
如图4所示，空载非靶向囊泡fNP的平均粒径在70nm左右，PDI为0.16，装载siRNA和TMZ的非靶向囊泡fNP@(siRNA&TMZ)的平均粒径在80nm左右，PDI为0.17。
②靶向囊泡的粒径
如图5所示，空载靶向囊泡Ang-fNP的平均粒径在80nm左右，PDI为0.18，装载siRNA和TMZ的靶向囊泡Ang-fNP@(siRNA&TMZ)的平均粒径在90nm左右，PDI为0.13。
(2)靶向囊泡装载siRNA的能力
通过凝胶阻滞实验来检测聚合物囊泡装载siRNA的能力，测试对象为上述实施例3(2)中制备的Ang-fNP@siScr：制备2％的琼脂糖凝胶，每个样品孔上样体积为20μL，在电压为40V的条件下电泳30分钟，如果siRNA被完全装载，siRNA会留在上样孔内。所得结果如图6所示。结果表明，siRNA与mPEG-PFPMA-PGua的质量比为1:10时，靶向囊泡Ang-fNP@siScr能够完全装载siRNA。
(3)靶向囊泡装载替莫唑胺(TMZ)的能力
测试靶向囊泡装载替莫唑胺(TMZ)的能力，测试对象为实施例3(4)中制备的Ang-fNP@TMZ：通过酶标仪在紫外光327nm处检测TMZ的吸收，通过对比TMZ在紫外光327nm处的吸收与浓度的标准曲线，利用酶标仪检测系统自带软件(SoftMax Pro 7.0)运算得出TMZ的浓度，可通过公式(1)和公式(2)计算出其装载量(DLC)和装载效率(DLE)。
Figure BDA0002554680330000181
其中：m1为被装载药物的质量，m为聚合物囊泡的质量；
Figure BDA0002554680330000182
其中：m1为被装载药物的质量，m0为投入药物的总质量。
所得结果如表5所示：
表5 替莫唑胺装载情况
Figure BDA0002554680330000191
根据表5中的结果可知，TMZ和PEG-PFPMA-PGua投料比为2:10时装载量(DLC)为4.8％，装载效率(DLE)为24.4％，提高至3:10(DLC＝5.1％)时装载量提升不明显且装载效率(DLE＝18％)较低，所以后续试验中TMZ与聚合物的投料比均定为2:10。
实施例4流式细胞检测内吞情况
通过检测标记在siRNA上的Cy5分子的荧光信号，可反映出载药囊泡被细胞内吞的情况，所使用的siRNA为经Cy5标记的siScramble，测试对象为靶向囊泡Ang-fNP@Cy5-siRNA和非靶向囊泡fNP@Cy5-siRNA(制备方法和实施例3一致，仅将siScramble替换为经Cy5标记的siScramble)，其中siRNA和mPEG-PFPMA-PGua的质量比均为1:10，测试用细胞为U87细胞和U251细胞。
所得结果如图7所示，图7中(a)为聚合物囊泡被U87细胞内吞的情况；(b)为聚合物囊泡被U251细胞内吞的情况。
图7结果显示，靶向囊泡Ang-fNP@Cy5-siRNA被U87细胞内吞的量是非靶向囊泡fNP@Cy5-siRNA被内吞的量的2.2倍。靶向囊泡Ang-fNP@Cy5-siRNA被U251细胞内吞的量是非靶向囊泡fNP@Cy5-siRNA被内吞的量的2.0倍。此结果表明经过靶向修饰的聚合物囊泡比非靶向囊泡具有更好的靶向能力。
实施例5共聚焦显微成像检测内吞情况
通过共聚焦显微镜成像对记在siRNA上的Cy5分子的荧光信号与细胞核染色剂上的Hoechst荧光信号进行定位与观察来反应聚合物囊泡被细胞内吞的情况，所使用的siRNA为经Cy5标记的siScramble，测试用细胞为U87细胞和U251细胞，测试对象为游离的Cy5-siRNA、靶向囊泡Ang-fNP@Cy5-siRNA和非靶向囊泡fNP@Cy5-siRNA，其中siRNA和mPEG-PFPMA-PGua的质量比均为1:10。
所得结果如图8所示。游离的Cy5-siRNA几乎不能被U87细胞和U251细胞内吞，通过靶向多肽Angiopep-2修饰的聚合物囊泡Ang-fNP@Cy5-siRNA比非靶向囊泡fNP@Cy5-siRNA更容易被细胞内吞，说明经过靶向修饰的聚合物囊泡具有更好的靶向能力。
实施例6细胞毒性实验
通过检测经过不同浓度的空载靶向囊泡处理后的细胞的活性来反映囊泡材料本身对细胞的毒性。细胞接种于96孔细胞培养板中，每个孔5×103个细胞，培养24小时后，分别向细胞培养液中加入一系列不同浓度的空载聚合物囊泡(通过稀释或浓缩实施例3(1)中制备的空载靶向囊泡得到)，每个样品浓度设置4个重复。孵育48小时后，向细胞培养液中加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，放入培养箱孵育4小时后，移走细胞培养液，并加入110μL二甲基亚砜，放置于摇床摇晃15min后用酶标仪检测在570nm处的紫外吸收值。
所得结果如图9所示，在较低浓度下(≤0.2mg/mL)，囊泡对细胞基本无毒，浓度升高时，表现出轻微毒性。
实施例7细胞凋亡实验
细胞经Ang-fNP@siRBBP4，Ang-fNP@(siScr&TMZ)和Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)，(其中siScr和siRBBP4与mPEG-PFPMA-PGua的质量比均为1:10，TMZ和mPEG-PFPMA-PGua的质量比为2:10)处理48小时，用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒对细胞染色，并用流式细胞仪检测。测试用细胞为U87细胞和U251细胞。
所得结果如图10～11所示，图10为U87细胞凋亡实验结果，其中(a)未经处理的对照组；(b)Ang-fNP@siRBBP4组；(c)Ang-fNP@(siScr&TMZ)组；(d)Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)组。
图11为U251细胞凋亡实验结果，其中(a)未经处理的对照组；(b)Ang-fNP@siRBBP4组；(c)Ang-fNP@(siScr&TMZ)组；(d)Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)组。
图10表明，在U87细胞的凋亡实验中，对照组细胞凋亡率为3.23％，经Ang-fNP@siRBBP4处理的细胞凋亡率为10.57％，经Ang-fNP@(siScr&TMZ)处理的细胞凋亡率为10.66％，经Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)处理的细胞凋亡率为24.3％。通过siRBBP4的作用能够提高U87细胞对TMZ的敏感性，导致更多的凋亡。
图11表明，在U251细胞的凋亡实验中，对照组细胞凋亡率为3.03％，经Ang-fNP@siRBBP4处理的细胞凋亡率为10.63％，经Ang-fNP@(siScr&TMZ)处理的细胞凋亡率为5.91％，经Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)处理的细胞凋亡率为23％。通过siRBBP4的作用能够提高U251细胞对TMZ的敏感性，导致更多的凋亡。
实施例8细胞核损伤实验
通过免疫荧光标记方法来标记细胞核中的γH2AX，测试对象为Ang-fNP@siRBBP4，Ang-fNP@(siScr&TMZ)和Ang-fNP@(siRBBP4&TMZ)，(其中siScr和siRBBP4与mPEG-PFPMA-PGua的质量比均为1:10，TMZ和mPEG-PFPMA-PGua的质量比为2:10)，以PBS作为对照，测试用细胞为U87细胞和U251细胞。
共聚焦显微成像结果如图12所示。结果显示，经过共载siRBBP4和TMZ的囊泡处理的细胞，其核内的信号更强更丰富，表明在siRBBP4的作用下，替莫唑胺可以引起更多的细胞核损伤。
实施例9动物水平检测聚合物囊泡的血液稳定性及半衰期
两组小鼠分别通过尾静脉注射Cy5-siRNA、fNP@Cy5-siRNA和Ang-fNPCy5-siRNA(fNP@Cy5-siRNA和Ang-fNP@Cy5-siRNA的制备方法和实施例3一致，仅将其中的siRNA替换为Cy5-siRNA，Cy5-siRNA和mPEG-PFPMA-PGua的质量比均为1:10)，所使用的siRNA为Cy5标记的siScramble。然后在预定时间点用毛细玻璃管通过小鼠的眼眶取血，最后将小鼠血离心后，取20μL血清与50μL磷酸盐缓冲液混匀，加入到96孔板中后用酶标仪检测荧光值(激发：630nm，发射670nm)。
所得结果如图13所示。图13中的结果显示，游离的Cy5-siRNA的血液半衰期为5.8分钟，fNP@Cy5-siRNA的血液半衰期为46.3分钟，Ang-fNP@Cy5-siRNA的血液半衰期为42.6分钟。
以上实施例结果表明，本发明提供的载药囊泡和靶向载药囊泡粒径小、能够同时装载TMZ和siRNA，毒性低，能够有效使siRNA到达病灶并进入细胞发挥功能，且其中靶向载药囊泡能够靶向脑神经胶质瘤、更易被细胞内吞，能够诱导更多的细胞凋亡和更多的细胞核损伤，在脑神经胶质瘤的治疗中具有极大潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南大学
<120> 一种嵌段聚合物及其制备方法以及一种载药囊泡和靶向载药囊泡
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys
20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uucuccgaac gugucacgud tdt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgugacacg uucggagaad tdt 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcugaaguga acugccuuut t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaggcaguu cacuucagct t 21

Claims (7)

1.一种靶向载药囊泡，其特征在于，所述靶向载药囊泡包括靶向囊泡和被装载在靶向囊泡内部的药物；所述药物包括疏水药物和/或核酸类药物；所述靶向囊泡由嵌段聚合物和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA通过自组装形成；
所述嵌段聚合物具有式I所示结构，表示为mPEG-PFPMA-PGua，其中mPEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段，PGua表示聚N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺嵌段；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式I；
式I中：n、x、y表示聚合度，n为40~50，x为23~27，y为4~6；
所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA中，Ang表示修饰在聚乙二醇嵌段上的半胱氨酸修饰的Angiopep-2多肽，PEG表示聚乙二醇嵌段，PFPMA表示聚2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯嵌段；
所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA具有式II所示结构：
Figure 425167DEST_PATH_IMAGE002
式II；
式II中：m、z表示聚合度，m为72~82，z为23~27。
2.根据权利要求1所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述嵌段聚合物和靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的摩尔比为3~4:1。
3.根据权利要求1所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述靶向载药囊泡的平均粒径为80~100nm。
4.根据权利要求1所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述疏水药物为替莫唑胺；所述核酸类药物为siRNA。
5.根据权利要求1或4所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述靶向载药囊泡中疏水药物的载药量≤5%；所述靶向载药囊泡中核酸类药物的载药量≤10%；所述载药量的计算公式如下式所示：
Figure 155357DEST_PATH_IMAGE004
其中：DLC为载药量，m 1 为被装载药物的质量，m为聚合物囊泡的质量。
6.根据权利要求1所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述靶向聚合物Ang-PEG-PFPMA的制备方法包括以下步骤：
（i）在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和氨基聚乙二醇马来酰亚胺进行脱水缩合反应，得到Mal-PEG-CPADN，结构式如式c所示；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
式c；
（ii）在氮气保护下，将C端带有半胱氨酸修饰的多肽Angiopep-2和Mal-PEG-CPADN在溶剂中进行迈克尔加成反应，得到Ang-PEG-CPADN，结构式如式d所示；
Figure 997411DEST_PATH_IMAGE006
式d；
（iii）在引发剂作用下，将Ang-PEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到Ang-PEG-PFPMA。
7.根据权利要求1所述的靶向载药囊泡，其特征在于，所述嵌段聚合物的制备方法包括以下步骤：
（1）在阻聚剂和缚酸剂的作用下，将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐进行取代反应，得到N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺；
（2）在N,N'-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作用下，将4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸和甲氧基聚乙二醇胺进行脱水缩合反应，得到mPEG-CPADN，结构式如式a所示；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
式a；
（3）在引发剂作用下，将mPEG-CPADN、2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA，结构式如式b所示：
Figure 704205DEST_PATH_IMAGE008
式b；
在引发剂作用下，将mPEG-PFPMA、N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺进行聚合反应，得到mPEG-PFPMA-PGua；
所述步骤（1）和步骤（2）、步骤（1）和步骤（3）没有时间顺序的要求。
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