JP2023528580A - 筋肉及び中枢神経系障害の遺伝子治療のための合成ａａｖカプシドの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、筋肉及び/又は中枢神経系(CNS)障害、特に、遺伝的神経筋疾患などの神経筋疾患の遺伝子治療におけるペプチド改変ブタAAV血清型1(AAVpo1)カプシドを含む組換えブタアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用に関する。
Description
本発明は、筋肉及び/又は中枢神経系(CNS)障害、特に、遺伝的神経筋疾患などの神経筋疾患の遺伝子治療におけるペプチド改変ブタAAV血清型1(AAVpo1)カプシドを含む組換えブタアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用に関する。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV又はAAV)ベクターはin vivo遺伝子移行のために広く使用され、AAVベクターを使用する臨床試験は多数の疾患の処置のために現在行われている。
AAVベクターは、20nmの直径のカプシド及び4.7kbの単鎖DNAから構成される無エンベロープベクターである。ゲノムは、末端逆位配列(ITR)という名前の2個のパリンドローム領域、と隣接している2個の遺伝子rep及びcapを保有する。cap遺伝子は、AAVカプシドを構成する3個の構造タンパク質VP1、VP2及びVP3をコードする。VP1、VP2及びVP3は、VP3の全体である同じC末端を共有している。AAV2を参考として使用して、VP1は735アミノ酸配列(GenBank YP_680426)を有し; VP2(598アミノ酸)はスレオニン138(T138)で開始し、VP3(533アミノ酸)はメチオニン203 (M203)で開始する。
組織特異性は、カプシド血清型によって決定され、ヒト(AAV2、3、5、6)及び非ヒト霊長類(AAV1、4、7～11)から単離された一般に使用されるAAV血清型は、他よりも特定の器官を更に効率的に形質導入できる、例えば、筋肉組織におけるAAV6、AAV8、AAV9及びAAV-rh74並びに神経組織におけるAAV2、AAV9、AAVrh10、AAVcy.10、AAV-PHP.B、AAV-PHP.EB及びクレードF AAVHSC、例えば、AAVHSC7、AAVHSC15及びAAVHSC17。
しかし、今日までに検証されたすべての一般に使用される天然に存在するAAV血清型及びそのバリアントは、肝臓内に蓄積する傾向を有する。これは、特に、AAVベクターが全身経路によって投与される場合に、問題を生じる。第1に筋肉において発現されることを目的とする導入遺伝子は、肝臓に毒作用を有する場合がある。第2に肝臓に侵入したAAVベクターは、筋肉又は神経組織のために利用可能なベクター量を低減する。結果的に、更に高い用量のAAVベクターが必要である。これは、肝毒性を誘発する可能性及びベクター産生の費用を増加させる。
追加的に、AAVに対して予め存在する免疫は、ヒト及び非ヒト霊長類から単離された一般に使用されるAAVベクター血清型、特に、血清有病率(seroprevalent)が人口の80%に至るAAV2及び他の血清型における弱点である(Fuら、Hum Gene Ther Clin Dev.、2017年12月;28(4):187～196頁; Stanfordら、Res Pract Thromb Haemost.、2019年、3: 261～267°頁。
組換えAAVベクターは、さまざまなブタAAV(AAVpo1、po2.1、po4から6)由来のカプシドを使用して生成され、マウスでの全身投与後に肝臓からの完全な脱標的化(detargeting)を含む他の組織での乏しい形質導入と組み合わされた、すべての主な種類の骨格筋における強い導入遺伝子発現がAAVpo1について報告された。AAV po2.1も末梢投与後に肝臓から脱標的化された一方で、AAVpo4及びAAVpo6は脳を含む試料採取されたすべての主な器官を効率的に形質導入した。ブタAAVベクターは、すべての他の一般に使用されるAAVに対して生成された抗血清、又はプールされたヒトIgによって交差中和されなかった(Belloら、Gene Therapy、2009年、16、1320～1328頁. doi: 10.1038/gt.2009.82; Belloら、Sci Rep.、2014年、4, 6644, DOI: 10.1038/srep06644; Tulalambaら、Gene Therapy、2019年、doi.org/10.1038/s41434-019-0106-3; Puppoら、PLOS ONE、2013年、8, e59025; WO 2009/030025)。全体的にみて、このことは、組換えブタAAVベクター、特に、肝臓から脱標的化されているAAVpo1及びAAV po2.1を、筋肉疾患のヒト遺伝子治療のための魅力的なベクターにする。しかし、組換えブタAAVベクターを用いて達成された筋肉における導入遺伝子発現レベルは、高かったが、筋肉に方向付けられた遺伝子治療についての絶対的基準としばしば考えられているAAV9のものの2分の1から3分の1の範囲であった。追加的に、AAVpo1及びAAV po2.1を用いて報告された脳の形質導入効率は、低かった。
種々のAAV血清型の表面に短いペプチドを提示するAAVカプシドバリアントのライブラリーは、細胞特異性及び/又は形質導入効率が変更された遺伝子治療ベクターをスクリーニングするために生成された(Bornerら、Molecular Therapy、2020年4月、28, 1017～1032頁; Kienle EC (Dissertation for the degree of Doctor of natural Sciences, Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg、Germany、2014年; WO 2018/189244)。ヒトT細胞系、初代ヒトマクロファージ、肝細胞、アストロサイトのin vitro形質導入において有効なペプチド改変AAV1、7-9、rh10及びDJカプシドが報告された。モチーフNXXRXXX (配列番号12)を共有するペプチドは、複数のAAV血清型の文脈においてin vitroでの多数の細胞型の形質導入のための更に性能の良いものとして開示された。
全身に送達されるAAVベクターを用いてさまざまな筋肉群及び中枢神経系を効率的;選択的に及び安全に形質導入する能力は、多くのヒト疾患の遺伝子治療のために有益である。
Fuら、Hum Gene Ther Clin Dev.、2017年12月;28(4):187～196頁
Stanfordら、Res Pract Thromb Haemost.、2019年、3: 261～267°頁
Belloら、Gene Therapy、2009年、16, 1320～1328頁. doi: 10.1038/gt.2009.82
Belloら、Sci Rep.、2014年, 4, 6644, DOI: 10.1038/srep06644
Tulalambaら、Gene Therapy、2019年、doi.org/10.1038/s41434-019-0106-3
Puppoら、PLOS ONE、2013年, 8, e59025
Bornerら、Molecular Therapy、2020年4月、28, 1017～1032頁
Kienle EC (Dissertation for the degree of Doctor of natural Sciences, Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg、Germany、2014年
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本発明者らは、マウスにおいて全身投与によって目的の治療用遺伝子を送達するためにブタAAV血清型1(AAVpo1)由来のペプチド改変カプシドタンパク質を含む組換えブタアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用した。筋肉(AAV8、AAV9)又はCNS (AAV9、AAVrh10)形質導入のために一般に使用される最良のAAVベクター血清型の一部は、比較のために同時に検査された。本発明者らは、ペプチド改変AAVpo1ベクターは、同時に肝臓から脱標的化される一方で、AAV9ベクターのものより優れてはいなくても少なくとも同等である導入遺伝子発現レベルを、さまざまな筋肉群において並びに中枢神経系(脳及び脊髄)において有利に達成したことを驚くべきことに見出した。更に、このブタAAVベクターは、一般的なAAV(ヒト及び非ヒト霊長類AAV)に対する予め存在する抗体によって中和されないことが予測される。これらの理由から、かかるペプチド改変AAVpo1ベクターの使用は、筋肉及び/又はCNS障害、特に、遺伝的神経筋疾患などの神経筋疾患の遺伝子治療のための効率的、選択的及びより安全である可能性がある治療アプローチを示している。一部の実施形態では、ペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系疾患及び神経筋疾患、特に、遺伝的神経系疾患及び遺伝的神経筋疾患を処置するために、神経系細胞又は、神経系細胞及び筋肉細胞を標的化するために使用される。
したがって、本発明の一態様は、筋肉及び中枢神経系(CNS)障害;特に、CNSを冒すCNS障害及び神経筋障害などの神経系を冒す神経系障害及び神経筋障害の遺伝子治療のためのブタAAV血清型1由来のペプチド改変カプシドタンパク質を含む組換えブタアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに関する。
一部の実施形態では、本発明による使用のための組換えブタAAVベクターは、全身投与、特に静脈内投与後の、肝臓脱標的化と、AAV9ベクターのものより優れてはいなくても少なくとも同等であるさまざまな筋肉群における並びに脳及び脊髄における導入遺伝子発現レベルとの組合せによって特徴付けられる。
一部の実施形態では、ペプチド改変カプシドタンパク質は、配列MPLGAAG (配列番号2)を含む少なくとも1個のペプチド又は前記配列中に1個若しくは2個だけアミノ酸変異(挿入、欠失、置換)、好ましくは前記配列中に1個若しくは2個のアミノ酸置換を含むバリアントを含む。一部の好ましい実施形態では、ペプチドは、配列GMPLGAAGA (配列番号3)、又は前記配列中に4個まで(1、2、3若しくは4個)アミノ酸変異(挿入、欠失、置換)、好ましくは前記配列中に1個若しくは2個だけのアミノ酸欠失又は置換を含むバリアントを含み、有利には前記欠失はN及び/又はC末端においてである。一部の好ましい実施形態では、配列番号2若しくは3の配列又はそのバリアントは、5個までのアミノ酸にそのN及び/又はC末端で、例えばGQR及びGAAにそれぞれそのN及びC末端で隣接している。一部の更に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列GQRGMPLGAAGAQAA (配列番号4)を含むか又はそれからなる。
一部の実施形態では、ペプチドは、カプシドタンパク質の残基N567とS568との間又は残基N569とT570との間に挿入され;前記位置は配列番号1とのアライメントによって決定される。好ましくは、ペプチドは、N567とS568位との間に挿入されており、565～567位及び568～570位のすべての残基を置き換えている、又はペプチドはN569とT570位との間に挿入され、567～569位及び570～572位のすべての残基を置き換えており;前記位置は配列番号1とのアライメントによって決定される。
一部の好ましい実施形態では、前記ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、配列番号5の配列、並びに、本開示による前記ペプチドを含む、配列番号5に少なくとも95%、96% 97%、98%又は99%同一性を有する配列、並びに、VP2又はVP3カプシドタンパク質に対応するその断片からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、組換えブタAAVベクターは、治療のための目的の遺伝子をパッケージングしているベクター粒子である。
一部の好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されている。
一部の好ましい実施形態では、治療のための目的の遺伝子は:
(i)治療用遺伝子;
(ii)治療用抗体又は抗体断片などの治療用タンパク質又はペプチド及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに
(iii)干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA及びエクソンスキッピングできるアンチセンスRNAなどの治療用RNAをコードする遺伝子
からなる群から選択される。
(i)治療用遺伝子;
(ii)治療用抗体又は抗体断片などの治療用タンパク質又はペプチド及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに
(iii)干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA及びエクソンスキッピングできるアンチセンスRNAなどの治療用RNAをコードする遺伝子
からなる群から選択される。
一部の実施形態では、疾患は、神経筋疾患、好ましくは遺伝的神経筋疾患である。好ましくは、疾患は、神経系を冒す神経筋疾患、好ましくは神経系を冒す遺伝的神経筋疾患である。
一部の実施形態では、遺伝的神経筋疾患は: (i)ミオパチー、例えば遺伝性心筋症、代謝ミオパチー、他のミオパチー、遠位型ミオパチー、筋ジストロフィー及び先天性ミオパチー;並びに(ii)脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患;好ましくは先天性ミオパチー及び筋ジストロフィー、及び脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患、を含む群から選択される。
一部の実施形態では、治療のための目的の遺伝子は:デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、筋細管ミオパチー、中心核ミオパチー、ネマリンミオパチー、セレノプロテインN関連ミオパチー、ポンペ病、糖原病III、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される遺伝的神経筋障害の原因となる遺伝子の機能性バージョン、又は疾患の原因となる前記遺伝子を標的化する治療用RNAである。
一部の実施形態では、遺伝的神経筋障害の原因となる前記遺伝子は:DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、MTM1、DNM2、BIN1、ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、LMOD3、SEPN1、GAA、AGL、SMN1及びASAH1遺伝子を含む群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、遺伝的神経筋疾患は:(i)ミオパチー、例えば先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;(ii)脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患; (iii)筋強直症候群、特に1型及び2型筋緊張性ジストロフィー;(iv)遺伝性運動感覚ニューロパチー;(v)遺伝性対麻痺及び遺伝性運動失調症;(vi)先天性筋無力症候群;好ましくは先天性筋無力症候群、先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;及び脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患、を含む群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、治療のための目的の遺伝子は:デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィー(DMD遺伝子); 肢帯型筋ジストロフィー(DYSF、FKRP遺伝子); 1型(DMPK遺伝子)及び2型(CNBP/ZNF9遺伝子)筋緊張性ジストロフィー、中心核ミオパチー(DNM2、BIN1遺伝子)、ポンペ病(GAA遺伝子);糖原病III (AGL遺伝子);脊髄性筋萎縮症(SMN1、ASAH1遺伝子);筋萎縮性側索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTNなど)、遺伝性対麻痺(SPAST (SPG4)、SPG7並びに他のSPG遺伝子、例えばSPG11、SPG20及びSPG21)、シャルコー・マリー・トゥース、4B1型(MTMR2)及び先天性筋無力症候群(CHAT、AGRN)を含む群から選択される、神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる遺伝子の機能性バージョン、又は疾患の原因となる前記遺伝子を標的化する治療用RNAである。
一部の更に好ましい実施形態では、神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる前記遺伝子は:DMD、DYSF、FKRP、DNM2、BIN1、GAA、AGL、SMN1及びASAH1遺伝子を含む群から選択される。
より好ましい他の実施形態では、神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる前記遺伝子は:FKTN、POMT1、POMT2、POMGNT1、POMGNT2、LMNA、ISPD、GMPPB、LARGE、LAMA2、TRIM32及びB3GALNT2遺伝子を含む群から選択される。
一部の実施形態では、組換えブタAAVベクターは、脊髄性筋萎縮症の遺伝子治療における使用のためであり、前記ベクターは、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含み、前記ベクターはニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されたヒトSMN1遺伝子を更にパッケージングしている。
一部の実施形態では、本開示による組換えブタAAVベクターは、体系的に(systematically)、好ましくは静脈内に投与される。
一部の実施形態では、本開示による組換えブタAAVベクターは、神経筋疾患の処置のための方法において使用される。
ペプチド改変AAVpo1ベクター
本発明は、筋肉及び中枢神経系(CNS)障害などの筋肉及び神経系障害の遺伝子治療における使用のためのペプチド改変ブタAAV血清型1カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターに関する。ペプチド改変ブタAAV血清型1カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、神経系(PNS及び/若しくはCNS)だけを冒す、又は神経系及び筋肉の両方を冒す疾患の遺伝子治療において使用され得る。これらとして、特にCNS疾患及び神経筋疾患が挙げられる。
本発明は、筋肉及び中枢神経系(CNS)障害などの筋肉及び神経系障害の遺伝子治療における使用のためのペプチド改変ブタAAV血清型1カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターに関する。ペプチド改変ブタAAV血清型1カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、神経系(PNS及び/若しくはCNS)だけを冒す、又は神経系及び筋肉の両方を冒す疾患の遺伝子治療において使用され得る。これらとして、特にCNS疾患及び神経筋疾患が挙げられる。
本発明による使用のためのペプチド改変カプシドタンパク質(又はペプチド改変AAVpo1ベクター)を含むブタAAV血清型1(AAVpo1)ベクターは、全身投与後の、特に肝臓が挙げられるオフターゲット器官からの脱標的化と標的器官(すなわち、神経系、例えばCNS;又は筋肉及び神経系、例えば筋肉及びCNS)における高い導入遺伝子発現レベルとを組み合わせる。
本明細書において使用される場合、用語「脱標的化」は、オフターゲット器官におけるベクター形質導入及び導入遺伝子発現の最小レベルへの、好ましくは検出限界に可能な限り近い、低減を指す。形質導入レベルで脱標的化される本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、同じ用量での全身投与後のAAV8、AAV9ベクターと比較して二倍体ゲノムあたりで少なくとも10分の1以下のベクターゲノムコピー数を有利には含む。導入遺伝子発現のレベルで脱標的化される本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、ヒト導入遺伝子を発現するベクターを使用する場合にタンパク質の内在性レベルより低いベクター由来タンパク質レベルを有利には含む。
本明細書において使用される場合、用語「筋肉」は、心筋(すなわち、心臓)及び骨格筋を指す。
本明細書において使用される場合、用語「筋肉細胞」は、筋細胞、筋管、筋芽細胞及び/又はサテライト細胞を指す。
本明細書において使用される場合、用語「神経系」は、中枢(CNS)及び末梢(PNS)神経系の両方を指す。
本明細書において使用される場合、用語「中枢神経系又はCNS」は、脳、脊髄、網膜、蝸牛、視神経、及び/又は嗅覚神経及び上皮を指す。本明細書において使用される場合、用語、CNS細胞は、ニューロン及びグリア細胞(オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、ミクログリア)を含むCNSの任意の細胞を指す。
本明細書において使用される場合、PNSは、脳及び脊髄の外の神経及び神経節を指す。
本明細書において使用される場合、用語「全身投与」は、循環系への物質(ベクター)の投与の経路を指し、経腸又は非経口投与を含む。非経口投与として、注射、注入、インプラントなどが挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「AAVベクター」は、AAVベクター粒子を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ブタAAVベクター又はAAVpo1ベクター」は、ブタAAV血清型1カプシドタンパク質を含むAAVベクターを指す。
本明細書において使用される場合、用語、AAV血清型は、天然及び人工AAV血清型、例えば、天然AAV血清型由来のバリアント及びハイブリッドカプシドを含む。AAV血清型は、標的器官を形質導入し、前記標的器官において導入遺伝子を発現できる機能性AAVカプシドを指す。
本明細書において使用される場合、「筋肉及び中枢神経系(CNS)障害などの筋肉及び神経系障害の遺伝子治療における使用のため」は、「遺伝子治療による筋肉及び中枢神経系(CNS)障害などの筋肉及び神経系障害の処置における使用のため」又は「筋肉及び中枢神経系(CNS)障害などの筋肉及び神経系障害の遺伝子治療による処置における使用のため」を意味する。
本明細書において使用される場合、「又は」は「及び/又は」を意味する。
神経筋障害(NMD)は、直接に随意筋の病態である、又は間接的に末梢神経系若しくは神経筋接合部の病態である、筋肉の機能を損なう広範な状態を包含する非常に広義の用語である。神経筋疾患は、すべて末梢神経又は筋肉又は神経筋接合部の損傷又は機能障害が関与する障害の群を広く定義する。損傷の部位は、細胞体(すなわち、筋萎縮性側索硬化症[ALS]若しくは感覚性神経節障害)、軸索(すなわち、軸索型末梢ニューロパチー若しくは上腕神経叢障害)、シュワン細胞(すなわち、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害)、神経筋接合部(すなわち、重症筋無力症若しくはランバート・イートン筋無力症症候群)、筋肉(すなわち、炎症性ミオパチー若しくは筋ジストロフィー)又はこれらの部位の任意の組合せにおいてであり得る。一部の神経筋疾患は、ALSなどの中枢神経系疾患とも関連する。
本明細書において使用される場合、「神経系を冒す神経筋疾患又は障害」は、神経系損傷を含む神経筋疾患を指す。神経筋疾患は、例えば、一次神経系損傷の結果としての二次筋肉損傷などの筋肉損傷を更に含み得る。
一部の実施形態では、本発明による使用のためのペプチド改変AAVpo1ベクターは全身投与後に、同時に、肝臓から脱標的化される一方で、標的器官(すなわち神経系、例えばCNS;又は筋肉及び神経系、例えば筋肉及びCNS)において高い導入遺伝子発現レベルをもたらす。神経系、例えばCNS;又は筋肉及び神経系、例えば筋肉及びCNSにおける形質導入(ベクターコピー数)は、ペプチドによって改変されていないカプシドを含む対照AAVpo1ベクターと比較して、ペプチド改変AAVpo1ベクターを用いて有利に増加する。ペプチド改変AAVpo1ベクターを用いた筋肉及び神経系、例えば筋肉及びCNSにおける導入遺伝子発現レベルは、ペプチドによって改変されていないカプシドを含む対照AAVpo1ベクターと比較して、筋肉において、特に骨格筋において及び中枢神経系において好ましくは少なくとも2倍、好ましくは3、4、5倍以上増加する。さまざまな筋肉の種類において、及び神経系において、例えば、さまざまな筋肉の種類において及びCNSにおいて、ペプチド改変AAVpo1ベクターを用いて達成される導入遺伝子発現レベルは、AAV8、AAV9、AAVrh10ベクターのものと好ましくは少なくとも同じ大きさ(3分の2以上;すなわち、同程度)である。
ベクター形質導入及び導入遺伝子発現は、当技術分野において周知であり、本出願の実施例において開示されるマウスモデルなどの動物モデルにおいて、ペプチド改変AAVpo1ベクターの全身投与によって判定される。未修飾カプシド及び最良のAAVベクター血清型(AAV2、AAV8、AAV9、AAVrh10など)を含む、筋肉形質導入のために一般に使用されるAAVpo1ベクターは、比較のために有利に使用される。ベクター形質導入は、本出願の実施例において開示されるリアルタイムPCRアッセイなどの当技術分野において周知である標準的アッセイによって二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムコピー数を測定することによって判定され得る。導入遺伝子発現は、本出願の実施例において開示される定量的RT-PCRアッセイ及び定量的ウエスタンブロット分析などの当技術分野において周知である標準的アッセイによってmRNA又はタンパク質レベルで測定される。
一部の実施形態では、本発明による使用のためのペプチド改変AAVpo1ベクターは、肝臓及び、脾臓などの少なくとも別の非標的器官から脱標的化される。
一部の実施形態では、本発明による使用のためのペプチド改変AAVpo1ベクターは、全身投与、特に、静脈内投与後に、好ましくは主な筋肉群を含むさまざまな筋肉群において、高い導入遺伝子発現レベルを有利にもたらす。ヒトの上半身を形成する主な骨格筋群は、腹部、胸筋、三角筋、僧帽筋、広背筋、脊柱起立筋、二頭筋、三頭筋及び横隔膜である。ヒト下半身の主な骨格筋群は、四頭筋、大腿屈筋、腓腹筋、ヒラメ筋及び殿筋である。下腿の前側部分の筋肉は、前脛骨筋、長指伸筋(extensor digitorium longus)、長母趾伸筋、長腓骨筋(fibularis longus)、短腓骨筋(fibularis brevis)及び第三腓骨筋(fibularis tertius)である。全身投与後に、さまざまな筋肉群において高い導入遺伝子発現レベルをもたらすペプチド改変AAVpo1ベクターの能力は、ペプチド改変AAVpo1ベクターを静脈注射されたマウスの脛骨(TA)、長指伸筋(EDL)、四頭筋(Qua)、腓腹筋(Ga)、ヒラメ筋(Sol)、三頭筋、二頭筋及び横隔膜における高い導入遺伝子発現レベルを示す本出願の実施例(図5)において例示されている。
一部の実施形態では、本発明による使用のためのペプチド改変AAVpo1ベクターは、全身投与、特に静脈内投与後の、肝臓脱標的化と、AAV9ベクターのものより優れてはいなくても少なくとも同等であるさまざまな筋肉群における並びに脳及び脊髄における導入遺伝子発現レベルとの組合せによって特徴付けられる。
AAVpo1 (GenBank受託番号FJ688147、2016年7月24日受託)は、部分ウイルスゲノム配列(2977bp)の780から2930位のCap遺伝子を含む:VP1 CDSは780から2930位である;VP2 CDSは1188から2930位であり、VP3 CDSは1329から2930位である。AAVpo1カプシドタンパク質(VP1)は、GenBank受託番号ACN42940.1、2016年7月24日受託又は配列番号1の配列を有する。ハイブリッドベクターとして、例えば、AAVpo1カプシド及びAAV2 repタンパク質及び/又はAAV2 ITRを含むベクターが挙げられる。AAVpo1血清型は、上に列挙される天然AAVpo1血清型及び前記血清型由来の任意の人工バリアント又はハイブリッドを含む。本発明は、上に列挙されるAAVpo1カプシド配列に少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一性を有するAAVカプシド配列由来のペプチド改変AAVpo1ベクターの使用を包含する。
一部の実施形態では、ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、配列番号1の配列に少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一性を有するAAVカプシド配列由来である。
用語「同一性」は、2個のポリペプチド分子間又は2個の核酸分子間の配列類似性を指す。比較される両方の配列において1つの位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基によって占められている場合、それぞれの分子は、その位置で同一である。2個の配列間の同一性の百分率は、2つの配列によって共有される合致する位置の数を比較される位置の数によって割り、100をかけたものに相当する。一般に比較は、2つの配列が最大の同一性をもたらすようにアラインされた場合で行われる。同一性は、例えば、GCG(Genetics Computer Group社、Program Manual for the GCG Package、Version 7、Madison、Wisconsin)パイルアッププログラム、又は任意の配列比較アルゴリズム、例えば、BLAST、FASTA若しくはCLUSTALWを使用するアライメントによって算出され得る。
ペプチドは、好ましくは30アミノ酸までである。一部の好ましい実施形態では、ペプチドは、25、20又は15アミノ酸(すなわち、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16又は15アミノ酸)までである。
一部の実施形態では、ペプチド、好ましくは、30アミノ酸までは、配列MPLGAAG(配列番号2)又は、前記配列中に1個若しくは2個だけのアミノ酸変異(挿入、欠失、置換)、好ましくは前記配列中に1個若しくは2個のアミノ酸置換を含むバリアントを含むか又はそれからなる。一部の好ましい実施形態では、ペプチドは、配列GMPLGAAGA(配列番号3)又は、前記配列中に4個(1、2、3若しくは4個)までのアミノ酸変異(挿入、欠失、置換)、好ましくは前記配列中に1個若しくは2個だけのアミノ酸欠失若しくは置換を含むバリアントを含むか、又はそれからなり;前記欠失は、有利にはN及び/又はC末端に有利にある。一部の好ましい実施形態では、配列番号2若しくは3の配列又は上に定義されるそのバリアントは、5個(1、2、3、4、5個)まで又はそれ以上のアミノ酸にそのN及び/又はC末端で、例えばGQR及びQAAにそれぞれそのN及びC末端で隣接している。代替的に、隣接配列は、アラニン(A)残基を含むか又はそれからなり得る。一部の更に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列GQRGMPLGAAGAQAA(配列番号4)を含むか又はそれからなる。
ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、AAVpo1カプシドタンパク質に挿入されたペプチドを少なくとも1コピー含む。挿入の位置に応じて、ペプチドは、VP1、VP1及びVP2、又はVP1、VP2及びVP3に挿入され得る。ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、ペプチドを5コピーまで、好ましくは前記ペプチドを1コピー含み得る。
本発明によるペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、AAVカプシド表面に露出された部位に挿入された1つ又は複数のペプチドを含む。カプシド表面に露出され、ペプチド挿入を許容する、すなわちウイルスカプシドのアセンブリ及びパッケージングに影響を与えないAAVカプシド上の部位は、当技術分野において周知であり、例えば、AAVカプシド表面ループ又は抗原性ループを含む(Girodら、Nat. Med.、1999年、5, 1052～1056頁; Grifmanら、Molecular Therapy、2001年、3, 964～975頁);他の部位は、Rabinowitzら、Virology、1999年、265, 274～285頁; Wuら、J. Virol.、2000年、74, 8635～8647頁に開示されている。
特に、少なくとも1つのペプチドは、配列番号1における番号付けに従ってカプシドタンパク質のN567、S568、N569、T570位、好ましくはカプシドタンパク質のN567とS568位との間又はN569とT570位との間のいずれかに挿入される。ペプチドの挿入は、ペプチド挿入部位に先行する及び/又は続く一部の残基、好ましくは前記残基の1から3個(1、2、3個)の欠失を生じる場合と生じない場合がある。一部の実施形態では、ペプチドは、N567とS568位との間に挿入され、565～567位及び568～570位のすべての残基を置き換える。一部の他の実施形態では、ペプチドは、N569とT570位との間に挿入され、567～569位及び570～572位のすべての残基を置き換える。位置は、配列番号1のAAVpo1カプシドタンパク質を参照して示される;当業者は、配列番号1を用いたアライメント後に別のAAVpo1カプシドタンパク質配列における対応する位置を容易に見出すことができる。
一部の好ましい実施形態では、前記ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、配列番号5の配列及び本開示による前記ペプチドを含む配列番号5に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列、及びVP2又はVP3カプシドタンパク質に対応するその断片からなる群から選択される配列を含む。VP2は、配列番号5のK136から末端までのアミノ酸配列に対応する。VP3は、配列番号5のM184から末端までのアミノ酸配列に対応する。一部の好ましい実施形態では、前記ペプチド改変AAVpo1カプシドタンパク質は、配列番号5の配列又は、VP2若しくはVP3カプシドタンパク質に対応するその断片を含む。
本発明は、本開示によるペプチド改変AAVpo1 VP3カプシドタンパク質由来のAAVpo1 VP1及びVP2キメラカプシドタンパク質も包含し、ここでVP1-特異的N末端領域及び/又はVP2-特異的N末端領域は、別の天然又は人工AAV血清型、好ましくは公知のAAVpo血清型から選択される別のAAVpo血清型、特にAAVpo2.1血清型由来である。本発明は、モザイクペプチド改変AAVpo1ベクターを更に包含し、ここでベクター粒子は、別の天然又は人工AAV血清型、好ましくは公知のAAVpo血清型から選択される別のAAVpo血清型、特に本開示によるAAVpo2.1血清型由来の別のAAVカプシドタンパク質を更に含む。
ペプチド改変AAVpo1ベクターのゲノムは、1本鎖又は自己相補的2本鎖ゲノムのいずれであってもよい(McCartyら、Gene Therapy、2003年12月、10(26)、2112～2118頁)。自己相補的ベクターは、AAV末端反復の1つから末端解離部位(terminal resolution site)(trs)を欠失させることによって生成される。その複製ゲノムが野生型AAVゲノムの長さの半分であるこれらの改変ベクターは、DNA二量体をパッケージングする傾向を有する。AAVゲノムは、ITRに隣接している。具体的な実施形態では、AAVベクターは、シュードタイプベクターである、すなわちそのゲノム及びカプシドは、異なる血清型のAAV由来である。一部の好ましい実施形態では、シュードタイプベクターのゲノムは、AAV2由来である。
本開示による使用のためのペプチド改変AAVpo1ベクターは、当技術分野において周知であるAAVベクターを産生するための標準的方法によって産生される(Aponte-Ubillusら、Applied Microbiology and Biotechnology、2018年、102: 1045～1054頁における総説)。簡潔には、AAV Rep及びカプシドタンパク質のための発現プラスミド、並びに発現カセット中にAAV ITRに隣接して挿入された目的の遺伝子を含む組換えAAVベクターゲノムを含有するプラスミドを用いて、AAVカプシド粒子へのrAAVベクターゲノムのパッケージングを可能にするために十分なヘルパー機能の存在下での同時トランスフェクション後に、細胞は、AAVベクター粒子の産生を可能にするための十分な時間についてインキュベートされ、次いで細胞は収集、溶解され、AAVベクター粒子は親和性クロマトグラフィー又はイオジキサノール若しくは塩化セシウム密度勾配超遠心分離法などの標準的精製方法によって精製される。
ペプチド改変AAVpo1ベクター粒子は、治療のための目的の遺伝子を通常パッケージングする。「治療のための目的の遺伝子」、「治療目的の遺伝子」、「目的の遺伝子」又は「目的の異種性遺伝子」は、治療用遺伝子又は治療用タンパク質、ペプチド若しくはRNAをコードする遺伝子を意味する。治療用遺伝子は、ゲノム編集酵素との組合せで使用され得る。
目的の遺伝子は、標的器官(すなわち、神経系、例えばCNS;又は筋肉及び/若しくは神経系、例えば筋肉及びCNS)の細胞において標的遺伝子又は標的の細胞経路を変更することができる任意の核酸配列である。疾患の種類に応じて、標的器官は、神経系、例えばCNSを本質的に含み得る、又は筋肉を更に含み得る。一部の具体的な実施形態では、標的器官は、少なくとも神経系、例えばCNSを含む。一部の好ましい実施形態では、標的器官は、神経系及び筋肉、例えばCNS及び筋肉を含む。例えば遺伝子は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は制御を変更し得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、遺伝子又はその断片の機能性バージョンである。前記遺伝子の機能性バージョンとして、野生型遺伝子、コードされるタンパク質の機能を少なくとも部分的に保存している同じファミリーに属するバリアントなどのバリアント遺伝子など又は切断型バージョンが挙げられる。遺伝子の機能性バージョンは、患者において欠損している又は非機能性である遺伝子を置き換えるような置換又は付加的遺伝子治療のために有用である。他の実施形態では、目的の遺伝子は、常染色体性優性遺伝的疾患を生じる優性対立遺伝子を不活性化する遺伝子である。遺伝子の断片は、ゲノム編集酵素との組合せにおける使用のための組換え鋳型として有用である。
代替的に、目的の遺伝子は、特定の用途のための目的のタンパク質(例えば、抗体若しくは抗体断片、ゲノム編集酵素)又はRNAをコードし得る。一部の実施形態では、タンパク質は、治療用抗体若しくは抗体断片を含む治療用タンパク質又はゲノム編集酵素である。一部の実施形態では、RNAは治療用RNAである。
一部の実施形態では、目的の遺伝子の配列は、処置される個体、好ましくはヒトの個体における発現のために最適化される。配列最適化は、コドン最適化、GC含量の増加、CpGアイランドの数の減少、代替的翻訳領域(ARF)の数の減少、並びに/又はスプライス供与及びスプライス受容部位の数の減少を含む、核酸配列中の多数の変化を含み得る。
目的の遺伝子は、疾患の標的細胞、特に、筋肉細胞並びにCNSの細胞などの筋肉細胞並びに神経系(CNS及び/又はPNS)の細胞において、コードされたタンパク質、ペプチド又はRNAを産生することができる機能性遺伝子である。疾患の種類に応じて、標的細胞は、CNS細胞などの神経系細胞を本質的に含み得、筋肉細胞を更に含み得る。一部の具体的な実施形態では、疾患の標的細胞は、CNS細胞などの少なくとも神経系細胞を含む。一部の好ましい実施形態では、疾患の標的細胞は、神経系細胞及び筋肉細胞、例えばCNS細胞及び筋肉細胞を含む。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、ヒト遺伝子である。ペプチド改変AAVpo1ベクターは、目的の遺伝子を標的器官(すなわち、神経系、例えばCNS;又は筋肉及び/若しくは神経系、例えば筋肉及び/若しくはCNS)の細胞において発現可能な形態で含む。一部の具体的な実施形態では、目的の遺伝子は、少なくとも神経系細胞において、例えばCNS細胞において発現可能な形態にある。一部の好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、神経系細胞及び筋肉細胞、例えばCNS細胞及び筋肉細胞において発現可能な形態にある。特に、目的の遺伝子は、個体の標的細胞、組織又は器官における導入遺伝子の発現のために適切な制御配列に作動可能に連結される。当技術分野において周知であるそのような配列として、特にプロモーター、更に、非限定的にエンハンサー、ターミネーター、イントロン、サイレンサー、特に組織特異的サイレンサーなどの導入遺伝子の発現を更に調節することができる制御配列、並びにマイクロRNAが挙げられる。目的の遺伝子は、標的器官(すなわち、筋肉及び/又は神経系、例えば筋肉及び/又はCNS)の細胞において機能性であるユビキタスな、組織特異的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一部の具体的な実施形態では、標的器官は、少なくとも神経系、例えばCNSを含む。一部の好ましい実施形態では、標的器官は、神経系及び筋肉、例えばCNS及び筋肉を含む。一部の具体的な実施形態では、目的の遺伝子は、神経系細胞、例えばニューロン及び/若しくはグリア細胞において;又は、神経系細胞、例えばニューロン及び/若しくはグリア細胞において並びに筋肉細胞において機能性であるユビキタス、組織特異的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一部の具体的な実施形態では、目的の遺伝子は、少なくとも2個のプロモーターに作動可能に連結され、ここでそれらのうちの少なくとも1個は、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるニューロン及び/又はグリア細胞特異的又は誘導性プロモーターである。一部の具体的な実施形態では、目的の遺伝子は、少なくとも2個のプロモーターに作動可能に連結され、ここでそれらのうちの一方は、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるニューロン及び/又はグリア細胞特異的又は誘導性プロモーターであり、他方は筋肉細胞において機能性である筋肉特異的又は誘導性プロモーターである。
目的の遺伝子は、上に開示される追加的制御配列を更に含む発現カセットに挿入され得る。ユビキタスプロモーターの例として、CAGプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)、SV40初期プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター及びEF1プロモーターが挙げられる。
筋肉特異的プロモーターとして、非限定的に、デスミン(Des)プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、CK6プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖(アルファ-MHC)プロモーター、ミオシン軽鎖2(MLC-2)プロモーター、心臓性トロポニンC(cTnC)プロモーター、合成筋肉-特異的SpC5-12プロモーター、ヒト骨格アクチン(HSA)プロモーターが挙げられる。
CNS発現などの神経系のためのプロモーターは、ユビキタスな発現を駆動するプロモーター及びニューロンへの発現を駆動するプロモーターを含む。ユビキタスな発現を駆動する代表的なプロモーター、非限定的に:CAGプロモーター(サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータアクチンプロモーター、ニワトリベータ-アクチン遺伝子の第1エクソン及び第1イントロン並びにウサギベータ-グロビン遺伝子のスプライス受容体を含む);PGK(ホスホグリセレートキナーゼ1)プロモーター;β-アクチンプロモーター;EF1aプロモーター;CMVプロモーター。ニューロンへの発現を駆動する代表的なプロモーターとして、非限定的に、カルシトニン遺伝子-関連ペプチド(CGRP)、公知の運動ニューロン由来因子のプロモーターが挙げられる。他のニューロン-選択的プロモーターとして、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシン、Hb9のプロモーター及び神経特異的サイレンサーエレメント(NRSE)を含むユビキタスプロモーターが挙げられる。グリア細胞における選択的発現を駆動する代表的なプロモーターとして、グリア線維酸性タンパク質遺伝子(GFAP)のプロモーターが挙げられる。
筋肉細胞(骨格及び心筋細胞)における発現のために、目的の遺伝子は、有利にはデスミンプロモーター、特にヒトデスミンプロモーターの調節下である(Raguzら、Dev. Biol.、1998年、201, 26～42頁; Paulin D & Li Z, Exp. Cell. Res.、2004年11月15日;301(1):1～7頁)。骨格筋細胞における発現のために、目的の遺伝子は、有利にはデスミンプロモーター、特にヒトデスミンプロモーターの調節下であり、心筋細胞における(すなわち、心臓における; Roudaultら、Circulation、2013年、128, 1094～104頁. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.001340)発現を抑制するmiR208a標的配列を更に含む。
RNAは、有利には標的DNA若しくはRNA配列に相補的である、又は標的タンパク質に結合する。例えばRNAは、干渉RNA、例えばshRNA、マイクロRNA、Cas酵素若しくはゲノム編集のための類似の酵素との組合せにおける使用のためのガイドRNA (gRNA)、エクソンスキッピングできるアンチセンスRNA、例えば、改変核内低分子RNA (snRNA)又は長い非コードRNAである。干渉RNA又はマイクロRNAは、筋肉又は神経系疾患、例えば筋肉又はCNS疾患に関与する標的遺伝子の発現を制御するために使用され得る。一部の実施形態では、疾患は、神経系疾患、例えばCNS疾患である。本実施形態により、標的遺伝子は、神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/又はグリア細胞を含むCNS及び/又はPNS細胞中にある。一部の他の実施形態では、疾患は、神経系及び筋肉の疾患、例えばCNS及び筋肉の疾患である。この他の実施形態により、標的遺伝子は、少なくとも神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/若しくはグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞中にあり;標的遺伝子は、本質的に神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/若しくはグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞中にあり得る;又は、神経系細胞及び筋肉細胞、例えば、特にニューロン及び/又はグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞、並びに筋肉細胞中にあり得る。Cas酵素又はゲノム編集のための類似の酵素を含む複合体中のガイドRNAは、標的遺伝子の配列を改変するため、特に、変異/欠損遺伝子の配列を修正するため、又は疾患、特に筋肉若しくは神経系障害、例えば筋肉若しくは中枢神経系(CNS)障害に関与する標的遺伝子の発現を変更するために使用され得る。エクソンスキッピングできるアンチセンスRNAは、読み枠を修正し、読み枠が破壊された欠損遺伝子の発現を回復させるために特に使用される。一部の実施形態では、RNAは治療用RNAである。
本発明によるゲノム編集酵素は、特に、筋肉細胞及び/又は神経系の細胞、例えば筋肉細胞及び/又はCNSの細胞において標的遺伝子又は標的細胞経路を変更することができる任意の酵素又は酵素複合体である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、少なくとも神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/若しくはグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞中にあり;標的遺伝子は、本質的に神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/若しくはグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞中にあり得る;又は、神経系細胞及び筋肉細胞、例えば、特にニューロン及び/又はグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞、並びに筋肉細胞中にあり得る。一部の具体的な実施形態では、標的遺伝子は、神経系細胞、例えば、特にニューロン及び/若しくはグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞中にある。一部の他の具体的な実施形態では、標的遺伝子は、神経系細胞及び筋肉細胞、例えば、特にニューロン及び/又はグリア細胞を含むCNS及び/若しくはPNS細胞、並びに筋肉細胞中にあり得る。例えば、ゲノム編集酵素は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は制御を変更し得る。ゲノム編集酵素は、有利には、非限定的に、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化して規則的な配置の回文配列リピート(CRISPR)-Casシステム由来のCas酵素及び類似の酵素などの操作されたヌクレアーゼである。ゲノム編集酵素、特に、Cas酵素及び類似の酵素などの操作されたヌクレアーゼは、標的ゲノム遺伝子座において二重鎖切断(DSB)又は1本鎖DNA切断(ニッカーゼ、例えばCas9(D10A)を生じ、非限定的に:遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、変異導入、染色体移行、染色体欠失などが挙げられる部位特異的ゲノム編集用途のために使用される、機能性ヌクレアーゼであり得る。部位特異的ゲノム編集用途のために、ゲノム編集酵素、特に、Cas酵素及び類似の酵素などの操作されたヌクレアーゼは、二重鎖切断(DSB)-誘導相同組換えによって標的ゲノム遺伝子座を改変する相同組換え(HR)マトリックス又は鋳型(DNAドナー鋳型という名前でもある)との組合せにおいて使用され得る。特に、HR鋳型は、目的の導入遺伝子を標的ゲノム遺伝子座に導入できる、又は好ましくは、筋肉若しくは中枢神経系(CNS)障害などの筋肉若しくは神経系を生じる異常若しくは欠損遺伝子における、標的ゲノム遺伝子座中の変異を修復できる。一部の実施形態では、疾患は、神経系疾患、例えばCNS疾患である。一部の他の実施形態では、疾患は、神経系及び筋肉の疾患、例えば、特にCNS及び筋肉の疾患である。代替的に、Cas酵素及び類似の酵素などのゲノム編集酵素は、ヌクレアーゼ欠損になるように操作されてよく、非限定的に:転写活性化、転写抑制、エピゲノム修飾、ゲノムイメージング、DNA又はRNAプルダウンなどの種々のゲノムエンジニアリングのためのDNA-結合タンパク質として使用され得る。
一部の実施形態では、治療のための目的の遺伝子をパッケージングするペプチド改変AAVpo1ベクター粒子は、骨格筋細胞及び/又はニューロンを標的化する。
本発明による使用のための好ましいベクターの例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであって、前記ベクターは、更にデスミンプロモーター、好ましくはヒトデスミンプロモーターに作動可能に連結された治療のための目的の遺伝子、及び最終的には更にmiR208a標的配列への作動可能なリンカーをパッケージングしている。この第1のベクターは、全身、特に血管内投与後に、目的の遺伝子を肝臓においては発現させず、筋肉(骨格及び心臓;miR208a標的配列を含まない発現カセット)において、又は骨格筋(miR208a標的配列を含む発現カセット)においてだけ発現させるために有用である。
本発明による使用のための好ましいベクターの別の例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであって、前記ベクターは、CAGプロモーターに作動可能に連結された治療のための目的の遺伝子を更にパッケージングし、好ましくはヒトベータグロビンポリアデニル化シグナルを更に含む。この第2のベクターは、全身、特に血管内投与後に、目的の遺伝子を肝臓においては発現させず、心臓を含む筋肉において及び神経系において、例えば心臓を含む筋肉において及びCNSにおいて発現させるために有用である。
本発明による使用のための好ましいベクターの別の例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであって、前記ベクターは、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性のプロモーターに作動可能に連結された治療のための目的の遺伝子を更にパッケージングしている。プロモーターは、ユビキタスプロモーター、例えばCAGなど、組織特異的プロモーター又はニューロン及び/若しくはグリア細胞において機能性である誘導性プロモーターであってよい。一部の具体的な実施形態では、プロモーターは、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるニューロン及び/又はグリア細胞特異的又は誘導性プロモーターである。この第3のベクターは、全身、特に血管内投与後に、目的の遺伝子を肝臓において発現させず、神経系において発現させるために有用である。
本発明による使用のための好ましいベクターの別の例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであって、前記ベクターは、筋肉細胞において、並びにニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるプロモーター又はプロモーターの組合せに作動可能に連結された治療のための目的の遺伝子を更にパッケージングしている。この第4のベクターは、全身、特に血管内投与後に、目的の遺伝子を、肝臓において発現させず、心臓を含む筋肉において及び神経系において、例えば、心臓を含む筋肉において及びCNSにおいて発現させるために有用である。プロモーターは、ユビキタスプロモーター、例えばCAGなど、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーター又は、筋肉細胞において機能性の第1のプロモーター並びにニューロン及び/又はグリア細胞において機能性の第2のプロモーターを含む前記プロモーターの組合せであってよい。一部の具体的な実施形態では、目的の遺伝子は、少なくとも2個のプロモーターに作動可能に連結され、ここでそのうちの一方は、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるニューロン及び/又はグリア細胞特異的又は誘導性プロモーターであり、他方は筋肉細胞において機能性である筋肉特異的又は誘導性プロモーターである。
筋肉及びCNS障害などの筋肉及び神経系障害の遺伝子治療
本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、筋肉及び/又はCNS疾患又は障害などの筋肉及び/又は神経系疾患又は障害の遺伝子治療において使用される。一部の実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系、例えばCNSを少なくとも冒す疾患の遺伝子治療において使用され、ここで疾患は、神経系、例えばCNSを本質的に冒し得る、又は神経系及び筋肉、例えばCNS及び筋肉を冒し得る。例えば、疾患は、最初は神経系を冒す場合があり、神経系の一次損傷は、筋肉の二次損傷を生じる場合がある。一部の具体的な実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系疾患、特にCNS疾患の遺伝子治療において使用される。一部の他の具体的な実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系及び筋肉の疾患、例えばCNS及び筋肉の疾患、特に少なくとも神経系(CNS及び/又はPNS)を冒す神経筋疾患の遺伝子治療において使用される。
本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、筋肉及び/又はCNS疾患又は障害などの筋肉及び/又は神経系疾患又は障害の遺伝子治療において使用される。一部の実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系、例えばCNSを少なくとも冒す疾患の遺伝子治療において使用され、ここで疾患は、神経系、例えばCNSを本質的に冒し得る、又は神経系及び筋肉、例えばCNS及び筋肉を冒し得る。例えば、疾患は、最初は神経系を冒す場合があり、神経系の一次損傷は、筋肉の二次損傷を生じる場合がある。一部の具体的な実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系疾患、特にCNS疾患の遺伝子治療において使用される。一部の他の具体的な実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、神経系及び筋肉の疾患、例えばCNS及び筋肉の疾患、特に少なくとも神経系(CNS及び/又はPNS)を冒す神経筋疾患の遺伝子治療において使用される。
本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、好ましくは、ペプチド改変AAVpo1ベクター粒子、好ましくは、本開示による目的の治療用遺伝子をパッケージングしているペプチド改変AAVpo1ベクター粒子の治療有効量を含む医薬組成物の形態で使用される。
遺伝子治療は、核、ミドコンドリア若しくは細胞に含有される非限定的にウイルス配列などの共生核酸として含まれるものを含む細胞における任意のコード若しくは制御配列の遺伝子移行、遺伝子編集、エクソンスキッピング、RNA干渉、trans-スプライシング又は任意の他の遺伝子改変、によって実施され得る。
主な2種類の遺伝子治療は、以下のとおり:
- 欠損/異常遺伝子に対する機能的な置換遺伝子の提供を目的とする治療:これは、置換又は付加的遺伝子治療である;
- 遺伝子又はゲノム編集を目的とする治療:かかる場合では、目的は、機能性遺伝子が発現される又は異常な遺伝子が抑制(不活性化)されるように、配列を修正する又は欠損/異常遺伝子の発現若しくは制御を変更するために必要なツールを細胞に提供することである:これは、遺伝子編集治療である。
- 欠損/異常遺伝子に対する機能的な置換遺伝子の提供を目的とする治療:これは、置換又は付加的遺伝子治療である;
- 遺伝子又はゲノム編集を目的とする治療:かかる場合では、目的は、機能性遺伝子が発現される又は異常な遺伝子が抑制(不活性化)されるように、配列を修正する又は欠損/異常遺伝子の発現若しくは制御を変更するために必要なツールを細胞に提供することである:これは、遺伝子編集治療である。
付加的遺伝子治療では、目的の遺伝子は、例えば、遺伝的疾患の場合のように患者において欠損又は変異した遺伝子の機能性バージョンであってよい。この場合、目的の遺伝子は、機能性遺伝子の発現を回復させる。
遺伝子又はゲノム編集は:
(i)上に定義される治療用RNA、例えば、shRNA若しくはマイクロRNAなどの干渉RNA、Cas酵素若しくは類似の酵素との組合せにおける使用のためのガイドRNA(gRNA)、又はエクソンスキッピングできるアンチセンスRNA、例えば、改変核内低分子RNA(snRNA)をコードする遺伝子;及び
(ii)上に定義されるゲノム編集酵素、例えば、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)、Cas酵素若しくは類似の酵素などの操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子;又はかかる遺伝子の組合せ、及び上に定義される組換え鋳型としての使用のための遺伝子の機能性バージョンの断片であってもよい、
などの1つ又は複数の目的の遺伝子を使用する。
(i)上に定義される治療用RNA、例えば、shRNA若しくはマイクロRNAなどの干渉RNA、Cas酵素若しくは類似の酵素との組合せにおける使用のためのガイドRNA(gRNA)、又はエクソンスキッピングできるアンチセンスRNA、例えば、改変核内低分子RNA(snRNA)をコードする遺伝子;及び
(ii)上に定義されるゲノム編集酵素、例えば、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)、Cas酵素若しくは類似の酵素などの操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子;又はかかる遺伝子の組合せ、及び上に定義される組換え鋳型としての使用のための遺伝子の機能性バージョンの断片であってもよい、
などの1つ又は複数の目的の遺伝子を使用する。
遺伝子治療は、筋肉及び/又は神経系、例えば、骨格若しくは心筋、脳又は脊髄を含む、筋肉及び/又はCNSの構造又は機能を冒す種々の遺伝(遺伝的)又は後天性疾患又は障害を処置するために使用される。疾患は、外傷、感染、変性、構造的若しくは代謝的欠損、腫瘍、自己免疫性障害、脳卒中などによって生じる場合がある。一部の実施形態では、遺伝子治療は、少なくとも神経系(PNS及び/又はCNS)、特に、脳及び/又は脊髄を含むCNSの構造又は機能を冒す遺伝(遺伝的)又は後天性疾患又は障害を処置するために使用される。疾患は、神経系(PNS及び/若しくはCNS)、特に、脳及び/若しくは脊髄を含むCNSを本質的に冒す、又は骨格及び/若しくは心筋を含む筋肉を冒す。一部の具体的な実施形態では、疾患は、神経系疾患、特に、CNS疾患及び/又はPNS疾患である;CNS疾患は、脳及び/又は脊髄を冒し得る。一部の他の具体的な実施形態では、疾患は、神経系(PNS及び/又はCNS)並びに筋肉の疾患、例えばCNS及び筋肉の疾患である;疾患は、神経系、例えば、脳及び/又は脊髄を冒し、更に筋肉、例えば、骨格及び/又は心筋を冒す。本明細書において使用される場合、神経系及び筋肉の疾患は、二次筋肉合併症又は損傷、特に神経系、特にCNSの一次合併症又は損傷の結果としての疾患を含む。したがって、本明細書に開示される神経系及び筋肉の疾患は、一次筋肉損傷又は合併症によって特徴付けられる疾患である筋肉疾患とは異なる。
一部の実施形態では、遺伝子治療は、神経系疾患、特にCNS疾患、特に、遺伝的神経障害を処置するために使用される。CNS疾患として、例えば、アルツハイマー、パーキンソン、前頭側頭型認知症などが挙げられる。
本発明の医薬組成物を使用する遺伝子治療によって標的化され得る遺伝的神経障害において変異した遺伝子の例は、以下の表に列挙される:
遺伝的神経障害
本発明の医薬組成物を使用する遺伝子治療によって標的化され得る、遺伝的神経障害における変異された遺伝子の他の例は、下の表に列挙される脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患;遺伝性運動感覚ニューロパチー;遺伝性対麻痺及び遺伝性運動失調症;の原因となる遺伝子である。一部の具体的な実施形態では、前記神経疾患は:脊髄性筋萎縮症(SMN1、ASAH1遺伝子) ;筋萎縮性側索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTNなど);遺伝性対麻痺(SPAST (SPG4)、SPG7及び他のSPG遺伝子、例えばSPG11、SPG20及びSPG21;特にSPAST (SPG4)及びSPG7)並びにシャルコー・マリー・トゥース、4B1型(MTMR2)からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、前記遺伝子は:SMN1、ASAH1、DNM2、MTMR2及びSPAST遺伝子からなる群から選択される。一部の他の好ましい実施形態では、前記遺伝子は:SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4及びOPTNからなる群から選択される
一部の実施形態では、遺伝子治療は、ヒトにおける神経筋疾患、特に、遺伝的神経筋障害を処置するために使用される。本発明の医薬組成物を使用する遺伝子治療によって標的化され得る遺伝的筋障害を含む、遺伝的神経筋障害において変異された遺伝子の例は、以下の表に列挙される:
筋ジストロフィー
先天性筋ジストロフィー
先天性ミオパチー
遠位ミオパチー
他のミオパチー
筋強直症候群
イオンチャネル筋疾患
悪性高熱症
代謝ミオパチー
遺伝性心筋症
先天性筋無力症候群
脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患
遺伝性運動感覚ニューロパチー
遺伝性対麻痺
他の神経筋障害
遺伝性運動失調症
上に列挙される遺伝子のいずれの1つも置換遺伝子治療において標的化され得る、ここで目的の遺伝子は、欠損又は変異した遺伝子の機能性バージョンである。
代替的に、上に列挙された遺伝子は、遺伝子編集のための標的として使用され得る。遺伝子編集は、機能性遺伝子が筋肉細胞において発現されるように、変異された遺伝子の配列を修正するため、又は欠損/異常遺伝子の発現若しくは制御を変更するために使用される。そのような場合、目的の遺伝子は、干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA及びエクソンスキッピングできるアンチセンスRNAなどの治療用RNAをコードするものから選択され、ここで治療用RNAは、先の表の遺伝子を標的化する。CRISPR/Cas9などのツールは、この目的のために使用され得る。
したがって、遺伝子編集又は遺伝子置換によって、この遺伝子の正しいバージョンが罹患した患者の筋肉細胞及び/又は神経系(PNS及び/又はCNS)の細胞に、特に罹患した患者の筋肉細胞及びCNSの細胞に提供され、このことは、この疾患に対する有効な治療に寄与できる。
一部の実施形態では、遺伝子治療(付加的遺伝子治療又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、上に列挙される、好ましくは:(i)ミオパチー、例えば、遺伝性心筋症、代謝ミオパチー、他のミオパチー、遠位ミオパチー、筋ジストロフィー及び先天性ミオパチー;(ii)脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患;(iii)筋強直症候群、特に、1型及び2型筋緊張性ジストロフィー;先天性筋無力症候群;遺伝性運動感覚ニューロパチー;遺伝性対麻痺及び遺伝性運動失調症、特に、先天性ミオパチー及び筋ジストロフィー、及び脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患を含む群から選択される神経筋疾患のうちの1つの原因となる遺伝子である。
一部の具体的な実施形態では、遺伝子治療(付加的遺伝子治療又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、上に列挙された、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィー(DMD遺伝子)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5遺伝子など)、脊髄性筋萎縮症(SMN1、ASAH1遺伝子)及び筋萎縮性側索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTNなど)、筋細管ミオパチー(MTM1遺伝子)、中心核ミオパチー(MTM1、DNM2、BIN1遺伝子)、ネマリンミオパチー(ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13遺伝子)、セレノプロテインN関連ミオパチー(SEPN1遺伝子)、先天性筋無力症(ColQ、CHRNE、RAPSN、DOK7、MUSK遺伝子)、ポンペ病(GAA遺伝子)、糖原病III(GSD3)(AGL遺伝子)、1型(DMPK遺伝子)及び2型(CNBP/ZNF9遺伝子)筋緊張性ジストロフィー;遺伝性対麻痺(SPAST)及びシャルコー・マリー・トゥース、4B1型(MTMR2)を含む群から選択される神経筋疾患のうちの1つの原因となる遺伝子である。一部の更に好ましい実施形態では、標的遺伝子は: DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、MTM1、DNM2、BIN1、ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、LMOD3、SEPN1、GAA、AGL、SMN1及びASAH1遺伝子からなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、遺伝子治療(付加的遺伝子治療又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、上に列挙される、好ましくは:(i)ミオパチー、例えば先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;(ii)脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患;(iii)筋強直症候群、特に1型及び2型筋緊張性ジストロフィー;(iv)遺伝性運動感覚ニューロパチー;(v)遺伝性対麻痺及び遺伝性運動失調症;(vi)先天性筋無力症候群、特に、先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー、先天性筋無力症候群及び脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患を含む群から選択される、少なくとも神経系を冒す神経筋疾患のうちの1つの原因となる遺伝子である。
一部の更に好ましい実施形態では、遺伝子治療のための標的遺伝子は、少なくとも神経系を冒すミオパチー、例えば少なくとも神経系を冒す先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーの原因となる遺伝子であり:FKTN、POMT1、POMT2、POMGNT1、POMGNT2、LMNA、ISPD、GMPPB、LARGE、LAMA2、TRIM32及びB3GALNT2からなる群から選択される。
一部の他のより好ましい実施形態では、遺伝子治療のための標的遺伝子は、少なくとも神経系を冒すミオパチー、先天性筋無力症候群、例えば先天性筋無力症の原因となる遺伝子であり、上に記載される表に列挙された先天性筋無力症候群の原因となる遺伝子から選択される。
一部の他のより好ましい実施形態では、遺伝子治療(付加的遺伝子治療又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、上に列挙される、好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィー(DMD遺伝子)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)(DYSF、FKRP)、脊髄性筋萎縮症(SMN1、ASAH1遺伝子)及び筋萎縮性側索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTNなど)、中心核ミオパチー(DNM2、BIN1遺伝子)、ポンペ病(GAA遺伝子)、糖原病III(GSD3)(AGL遺伝子)、1型(DMPK遺伝子)及び2型(CNBP/ZNF9遺伝子)筋緊張性ジストロフィー;遺伝性対麻痺(SPAST(SPG4)、SPG7及び他のSPG遺伝子、例えばSPG11、SPG20及びSPG21;特にSPAST(SPG4)及びSPG7);シャルコー・マリー・トゥース、4B1型(MTMR2);並びに先天性筋無力症候群、例えば、先天性筋無力症(CHAT、AGRN遺伝子)を含む群から選択される少なくとも神経系を冒す神経筋疾患のうちの1つの原因となる遺伝子である。
一部の更により好ましい実施形態では、標的遺伝子は:DMD、DYSF、FKRP、DNM2、BIN1、GAA、AGL、SMN1及びASAH1遺伝子からなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、本開示によるペプチド改変AAVpo1ベクターは、運動ニューロン疾患を処置するために運動ニューロンを標的化するために使用される。標的遺伝子は、上の表に列挙される脊髄性筋萎縮症(SMA)及び運動ニューロン疾患に関与する遺伝子のいずれか1つであり得る。運動ニューロン疾患として、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、進行性球麻痺(PBP)、仮性球麻痺、進行性筋萎縮症(PMA)、原発性側索硬化症(PLS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)及び単肢萎縮症(monomelic atrophy)(MMA)並びにALSに似たいくつかの更に稀な異型が挙げられる。
ジストロフィン異常症は、タンパク質ジストロフィンをコードするDMD遺伝子における病原性バリアントによって生じるX連鎖筋肉疾患のスペクトルである。ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)及びDMD-関連拡張型心筋症を含む。
肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)は、臨床的にDMDに似ているが、常染色体性劣性及び常染色体性優性遺伝の結果として両性に生じる障害の群である。肢帯型ジストロフィーは、サルコグリカン及びジストロフィンと相互作用する筋肉細胞膜に関連する他のタンパク質をコードする遺伝子の変異によって生じる。用語、LGMD1は優性遺伝(常染色体優性)を示す遺伝子の型を指す、一方LGMD2は常染色体性劣性遺伝の型を指す。50を超える遺伝子座での病原性バリアントが報告されている(LGMD1AからLGMD1G;LGMD2AからLGMD2W)。カルパイノパチー(Calpainopathy)(LGMD2A)は、記載された450を超える病原性バリアントを有する遺伝子CAPN3の変異によって生じる。LGMD表現型に寄与する遺伝子として:アノクタミン5 (ANO5)、血管心外膜物質(blood vessel epicardial substance)(BVES)、カルパイン3 (CAPN3)、カベオリン3(CAV3)、CDP-L-リビトールピロホスホリラーゼA(CRPPA)、ジストログリカン1 (DAG1)、デスミン(DES)、DnaJ熱ショックタンパク質ファミリー(Hsp40)ホモログサブファミリーBメンバー6(DNAJB6)、ディスフェリン(DYSF)、フクチン関連タンパク質(FKRP)、フクチン(FKT)、GDP-マンノースピロホスホリラーゼB(GMPPB)、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質D様(HNRNPDL)、LIM亜鉛フィンガードメイン含有2(LIMS2)、レイン(lain) A:C(LMNA)、ミオチリン(MYOT)、プレクチン(PLEC)、タンパク質O-グルコース転移酵素1(PLOGLUT1)、タンパク質O-連結マンノースN-アセチルグルコサミン転移酵素1(ベータ1、2-)(POMGNT1)、タンパク質O-マンノースキナーゼ(POMK)、タンパク質O-マンノシル転移酵素1(POMT1)、タンパク質O-マンノシル転移酵素2(POMT2)、サルコグリカンアルファ(SGCA)、サルコグリカンベータ(SGCB)、サルコグリカンデルタ(SGCD)、サルコグリカンガンマ(SGCG)、タイチン-cap(TCAP)、トランスポーチン3(TNPO3)、トーシン1A相互作用タンパク質(TOR1AIP1)、輸送タンパク質粒子複合体11(TRAPPC11)、三要素モチーフ含有32(TRIM 32)及びタイチン(TTN)が挙げられる。LGMD表現型に寄与する主な遺伝子として、CAPN3、DYSF、FKRP及びANO5が挙げられる(Babi Ramesh Reddy Nallamilliら、Annals of Clinical and Translational Neurology、2018年、5, 1574～1587頁。
ディスフェリンは、多発性硬化症(Hochmeisterら、J. Neuropathol. Exp. Neurol.、2006年9月;65(9):855～65頁);アルツハイマー(Galvinら、Acta Neuropathol.、2006年12月;112(6):665～71頁及び舞踏病性運動(Takahashi Tら、Mov. Disord.、2006年9月;21(9):1513～5頁)を含む神経障害に関与している。
脊髄性筋萎縮症は、運動のために使用される筋肉の脱力及び消耗(萎縮(atrophy))によって特徴付けられる、生存運動ニューロン1(SMN1)遺伝子中の変異によって生じる遺伝的障害である。ASAH1遺伝子中の変異は、SMA-PME(進行性ミオクローヌスてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症)を生じる。
X連鎖筋細管ミオパチーは、ミオチューブラリン(MTM1)遺伝子中の変異によって生じる遺伝的障害であり、運動のために使用される筋肉(骨格筋)を冒し、ほとんど男性においてだけ生じる。この状態は、筋肉脱力(ミオパチー)及び筋緊張の減少(筋緊張低下)によって特徴付けられる。
ポンペ病は、酸性アルファグルコシダーゼ(GAA)遺伝子中の変異によって生じる遺伝的障害である。GAA遺伝子中の変異は、酸性アルファグルコシダーゼがグリコーゲンを効果的に分解することを妨げ、この糖をリソソーム中で毒性レベルまで増大させる。この増大が、全身の器官及び組織、特に筋肉を損傷し、ポンペ病の進行性の徴候及び症状をもたらす。
糖原病III(GSD3)は、グリコーゲン脱分枝酵素をコードし、短い外側の鎖を有する異常なグリコーゲンの蓄積と関連するアミロ-アルファ-1, 6-グルコシダーゼ, 4-アルファ-グルカノ転移酵素(AGL)遺伝子におけるホモ接合性又は複合ヘテロ接合性変異によって生じる常染色体性劣性代謝障害である。臨床的には、GSD IIIを有する患者は、乳児期又は幼児期に肝腫大、低血糖及び発達遅滞を示す。IIIaを有する者での筋肉脱力は、小児期にはわずかだが、成人において更に重度になり;一部の患者は心筋症を発症する。
ゲノムワイド関連解析は、BIN1遺伝子座をアルツハイマー病(AD)における遺伝的リスクの主な調節因子として同定した(Voskobiynykら、eLife doi: 10.7554/eLife.57354; 2020年7月13日)。遺伝性痙性対麻痺(HSP)は、幅広い臨床的及び遺伝的不均一性によって特徴付けられる稀な遺伝神経疾患の群である。最初の運動ニューロン合併症を伴う下肢痙縮は、すべてのHSPの中核症状である。HSPの原因となる遺伝子は、少なくとも79個のSPG遺伝子を含む。SPG7及びSPASTにおける変異が、遺伝性痙性対麻痺(HSP)の共通の原因である(Lallemant-Dudek P.ら、Fac. Rev.、2021年3月10日;10:27における概説)。
筋細管ミオパチーの遺伝子治療における使用のためのベクターの非限定的例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであり、前記ベクターは、ヒトデスミンプロモーターに作動可能に連結されたヒトMTM1遺伝子及び、更にmiR208a標的配列への作動可能なリンカーを更にパッケージングしている。このベクターは、血管内注射などの全身投与後に、肝臓において発現せずに、骨格筋において目的の遺伝子を発現させるために有用である。
脊髄性筋萎縮症の遺伝子治療における使用のためのベクターの別の非限定的例は、配列番号5の配列又は配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含むAAVpo1ベクターであり、前記ベクターは、CAGプロモーターに作動可能に連結されたヒトSMN1遺伝子及び、好ましくは更にヒトベータグロビンポリアデニル化シグナルを更に含んでパッケージングしている。このベクターは、血管内注射などの全身投与後に、肝臓において発現せずに、心臓を含む筋肉において及び神経系において、特に、心臓を含む筋肉において及びCNSにおいて目的の遺伝子を発現させるために有用である。
肝臓指向性が低減したペプチド改変AAVpo1ベクター粒子を含む本発明の医薬組成物は、同時に肝臓変性、例えば線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、ウイルス性若しくは中毒性肝炎を併発している又は肝臓変性を誘発する根底となる遺伝的障害を有する患者に投与され得る。
本発明の文脈では、治療有効量は、かかる用語が適用される障害若しくは状態の進行を逆戻りさせる、軽減する若しくは抑制する、又はかかる用語が適用される障害若しくは状態の1つ又は複数の症状の進行を逆戻りさせる、軽減する若しくは抑制するために十分な用量を指す。
有効用量は、使用される組成物、投与の経路、検討される個体の身体的特徴、例えば性別、年齢及び体重、併用する薬物療法並びに医学分野の当業者が認識する他の要因などの要因に応じて決定及び調整される。
本発明の種々の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び/又はビヒクルを含む。
「薬学的に許容される担体」は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与された場合に有害な、アレルギー性又は他の有害作用を生じないビヒクルを指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半流動体又は液体増量剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の製剤補助剤(formulation auxiliary)を指す。
好ましくは、医薬組成物は、注射され得る製剤について薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張、滅菌、生理食塩水(リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど若しくはかかる塩の混合物)又は、場合により、滅菌水若しくは生理食塩水の添加で注射可能な溶液を構成できる乾燥、特に凍結乾燥された組成物であり得る。
注射可能な使用のために好適な医薬用形態として、滅菌水溶液又は懸濁液が挙げられる。溶液又は懸濁液は、ウイルスベクターと適合性であり、ウイルスベクター粒子が標的細胞に侵入することを妨げない添加物を含み得る。すべての場合において製剤は、滅菌されていなければならず、容易にシリンジを通過する程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の混入作用に対抗して保存されなければならない。適切な溶液の例は、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS)又は乳酸リンゲルである。
本発明は:上に記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、筋肉又は神経系障害、特に、本開示による筋肉又はCNS障害を処置するための方法も提供する。より好ましくは、本発明は、筋肉及び神経系障害、特に、本開示による筋肉及びCNS障害を処置するための方法を提供する。
本発明は、筋肉又は神経系障害、特に、本開示による筋肉又はCNS障害;好ましくは筋肉及び神経系障害、特に、本開示による筋肉及びCNS障害を処置するための医薬の調製物のための本開示による医薬組成物の使用も提供する。
本明細書において使用される場合、用語「患者」又は「個体」は、哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明による患者又は個体は、ヒトである。
本発明の文脈では、用語「処置する」又は「処置」は、本明細書において使用される場合、用語が適用される障害若しくは状態の進行を逆戻りさせる、軽減する若しくは抑制する、又はかかる用語が適用される障害若しくは状態の1つ若しくは複数の症状を逆戻りさせる、軽減する若しくは抑制することを意味する。
本発明の医薬組成物は、一般に、患者において治療効果を誘導するために十分な投与量及び期間で公知の手順に従って投与される。
投与は、全身、局所的又は局所的と組み合わせた全身であってよい。全身投与は、好ましくは非経口、例えば皮下(SC)、筋肉内(IM)、血管内、例えば静脈内(IV)若しくは動脈内;腹腔内(IP);皮内(ID)又はその他である。局所投与は、好ましくは脳内、脳室内、大槽内、及び/又はくも膜下腔内投与である。投与は、例えば、注射又は灌流によってであり得る。一部の好ましい実施形態では、投与は、非経口、好ましくは血管内、例えば静脈内(IV)又は動脈内である。一部の他の好ましい実施形態では、投与は、脳内、脳室内、大槽内、及び/又はくも膜下腔内投与で、単独又は非経口投与、好ましくは血管内投与との組合せである。一部の他の好ましい実施形態では、投与は、非経口、好ましくは血管内の単独又は脳内、脳室内、大槽内及び/若しくはくも膜下腔内投与との組合せである。
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の技術の範囲内である従来の技術を使用する。かかる技術は、文献に完全に説明されている。
本発明は、限定的でない以下の実施例を用い、添付の図を参照して例示される。
材料及び方法
ブタ由来のAAVpo1A1カプシド(配列番号1のAAVpo1カプシドタンパク質の567～569位及び570～572位のすべての残基を置き換えている配列番号4のペプチドを含む配列番号5のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号13)を血清型8、9、rh10及びpo1 (Belloら、Gene Therapy、2009年、16, 1320～1328頁. doi: 10.1038/gt.2009.821)と、ミオチューブラリン遺伝子の構成的ノックアウト(Mtm1 KOマウス系)において比較した、以前記載のとおり(Buj-Belloら、PNAS、2002年、99, 15060～5頁. doi:10.1073/pnas.212498399; Al-Qusairiら、PNAS、2009年、106, 18763～8頁.doi:10.1073/pnas.0900705106)。ベクターは、HEK 293細胞を使用してトリプルトランスフェクション法によってすべて産生し、ヒトデスミンプロモーター(1kb)の調節下でのヒトMTM1及びmiR208aの標的配列を発現するカセットを保有した(Raguzら、Dev. Biol.、1998年、201, 26～42頁; Paulin D & Li Z, Exp. Cell. Res., 2004年11月15日;301(1):1～7; Roudaultら、Circulation、2013年、128, 1094～104頁. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.001340)。AAVpo1A1及びAAV9カプシドもC57BL/6マウスにおいて、HAタグ配列に融合したヒトSMNをユビキタスCAGプロモーターの調節下で発現するカセットを用いて評価した(Meyerら、Molecular Therapy、2015年、23. doi: 10.1038/mt.2014.210)。
ブタ由来のAAVpo1A1カプシド(配列番号1のAAVpo1カプシドタンパク質の567～569位及び570～572位のすべての残基を置き換えている配列番号4のペプチドを含む配列番号5のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号13)を血清型8、9、rh10及びpo1 (Belloら、Gene Therapy、2009年、16, 1320～1328頁. doi: 10.1038/gt.2009.821)と、ミオチューブラリン遺伝子の構成的ノックアウト(Mtm1 KOマウス系)において比較した、以前記載のとおり(Buj-Belloら、PNAS、2002年、99, 15060～5頁. doi:10.1073/pnas.212498399; Al-Qusairiら、PNAS、2009年、106, 18763～8頁.doi:10.1073/pnas.0900705106)。ベクターは、HEK 293細胞を使用してトリプルトランスフェクション法によってすべて産生し、ヒトデスミンプロモーター(1kb)の調節下でのヒトMTM1及びmiR208aの標的配列を発現するカセットを保有した(Raguzら、Dev. Biol.、1998年、201, 26～42頁; Paulin D & Li Z, Exp. Cell. Res., 2004年11月15日;301(1):1～7; Roudaultら、Circulation、2013年、128, 1094～104頁. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.001340)。AAVpo1A1及びAAV9カプシドもC57BL/6マウスにおいて、HAタグ配列に融合したヒトSMNをユビキタスCAGプロモーターの調節下で発現するカセットを用いて評価した(Meyerら、Molecular Therapy、2015年、23. doi: 10.1038/mt.2014.210)。
MTM1を発現する各ベクターの2x1013vg/kgの単一用量を3週齢変異体マウスに静脈内で投与し、組織を採取し、注射後4週間で窒素中で凍結した。対照としてPBSをMtm1-KO及び野生型のオス同腹仔に注射した。C57BL/6マウスは、AAV9又はAAVpo1A1ベクターのいずれか8x1012vg/kgの用量を4週齢で受け、組織を3週間後に回収した。
LightCycler480 thermocycler(Roche社)を使用してTaqman リアルタイムPCRによって32ngの総DNAからの二倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの数を定量した。タイチン遺伝子をプライマー及びプローブ:5'-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3'(フォワード;配列番号6)、5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3'(リバース;配列番号7)及び5'-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3'(プローブ;配列番号8)を用いた標準化のために使用した。ベクターゲノム(MTM1)増幅のために使用したプライマーは: 5'-TTGGTTGTCCAGTTTGGAGTCTACT-3'(フォワード;配列番号9)、5‘-CCGTCACTGCAATGCACAAG-3'(リバース;配列番号10)及び5'-ATATCAAGCTCGTTTTGAC-3'(プローブ;配列番号11)であった。ベクターゲノム(SMN1)増幅のために使用したプライマーは:5'-CAGTGCAGGCTGCCTATCAG-3'(フォワード;配列番号15)、5'-TGTGGGCCAGGGCATTAG-3'(リバース;配列番号16)、5'-AAGTGGTGGCTGGTGTG-3'(プローブ;配列番号17)であった。ベクターゲノム(SMN1)増幅のために使用した他のプライマーは:5'-GCTGCCTCCATTTCCTTCTG-3'(フォワード;配列番号18)、5'-ACATACTTCCCAAAGCATCAGCAT-3'(リバース;配列番号19)、5'-CACCACCTCCCATATGTCCAGATTCTCTTG-3'(プローブ;配列番号20)であった。
MTM1転写物のレベルをRevertAid H Minus Reverse Transcriptase キット(Thermo Scientific社)を使用する逆転写に供して350ngの総RNAから定量した。次に、cDNA量をLightCycler480 thermocycler(Roche社)を使用してqPCRによって増幅した。RPLP0遺伝子をプライマー及びプローブ:5'-CTCTGGAGAAACTGCTGCCT-3'(フォワード;配列番号21)、5'-CTGCACATCACTCAGAATTTCAA-3'(リバース;配列番号22)及び5'-AGGACCTCACTGAGATTCGGGATATGC -3'(プローブ;配列番号23)を用いた標準化のために使用した。
タンパク質を抽出し、NuPAGE 4～12% Bis-Trisゲル電気泳動及びウエスタンブロットによって分析した。膜をヒトミオチューブラリンに対するポリクローナル抗体(Abnova社)を使用して探索した。GAPDHに対して特異的なマウスモノクローナル抗体(Merck Millopore社)を内部対照として使用した。検出を二次抗体(ロバ抗ヤギ800又はヤギ抗マウス680(Invitrogen社)及びOdyssey infrared imaging system(LI-COR Biotechnology Inc.社)を使用して実施した。
ベクター由来HA-SMNの免疫染色のために、C57BL/6マウスに5x1013vg/kgのAAVpo1A1ベクター単一用量を注射し、4週間後に腹腔内麻酔注射(10mg/kgキシラジン、100mg/kgケタミン)によって安楽死させ、PBS、次に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いた心臓内灌流が続いた。組織を単離し、4%PFA中でのインキュベーションによって後固定した。次に、脊髄をPBS-ショ糖溶液(30%)中でインキュベートした。腰髄の連続的な冠状クリオスタット切片をマウス-オン-マウスIgGブロッキング溶液(Invitrogen社)を用いたマウスIgGブロッキング、次にウサギ抗HA一次抗体(Sigma-Aldrich社)を用いた抗HAタグ(hSMN)染色、及びマウス抗NeuN一次抗体(Sigma-Aldrich社)を用いた抗NeuN染色について処理した。検出を蛍光コンジュゲート二次抗体(ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488及びヤギ抗マウスAlexa Fluor 594(Invitrogen社))を用いて実施した。切片をFluoroMount-G medium + DAPIを用いてマウントし、画像をaxioscan Z1(Zeiss社)を使用して捕捉した。
結果
MTM1を発現するAAVベクター(AAVpo1、AAVpo1A1、AAV8、AAV9、AAVrh10)をMtm1-KOマウス、3週齢に2x1013vg/kgで静脈注射した。注射後2週間から、処置KO及びWTマウスの体重は同様であった一方で、未処置KOマウスは6週齢後に体重が減少し始めた(図1)。AAVpo1-及びAAVpo1A1-処置群からの変異体マウスの前脛骨筋(TA)、四頭筋(Qua)、腓腹筋(Ga)及び三頭筋(Tri)などの骨格筋は、AAV8処置群マウスにおけるものより重かった(図2)。
MTM1を発現するAAVベクター(AAVpo1、AAVpo1A1、AAV8、AAV9、AAVrh10)をMtm1-KOマウス、3週齢に2x1013vg/kgで静脈注射した。注射後2週間から、処置KO及びWTマウスの体重は同様であった一方で、未処置KOマウスは6週齢後に体重が減少し始めた(図1)。AAVpo1-及びAAVpo1A1-処置群からの変異体マウスの前脛骨筋(TA)、四頭筋(Qua)、腓腹筋(Ga)及び三頭筋(Tri)などの骨格筋は、AAV8処置群マウスにおけるものより重かった(図2)。
骨格筋におけるベクターゲノム定量(図3及び図4)により、AAVpo1A1ベクターは、大部分の骨格筋をAAV8ベクターと同様に効率的に形質導入した。興味深いことに、AAVpo1A1ベクターは、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺及び脳などの器官において低い形質導入レベルを生じた。
MTM1導入遺伝子の発現を種々の筋肉及び器官においてRT-qPCRによって分析した(図5及び図6)。AAVpo1A1ベクターは、同様の形質導入レベルにもかかわらずAAV8と比較してすべての骨格筋において高いMTM1転写物レベルをもたらし、AAV9ベクターに匹敵する導入遺伝子発現レベルに達した。更に、AAVpo1A1ベクターの投与は、AAV8ベクター送達後に観察されたものより更に低いMTM1転写物レベルで、肝臓及び脾臓などの器官における導入遺伝子発現を脱標的化した。導入遺伝子発現レベルはAAV8群と比較してAAVpo1A1-処置マウスの皮質及び脊髄などの中枢神経系の領域において高く、更に脊髄においてAAV9-処置マウスよりも高かった。
MTM1タンパク質発現を免疫ブロット法によって種々の筋肉(腓腹筋、三頭筋及び横隔膜)において分析した(図7)。AAVpo1A1ベクター投与は、AAV8及びAAVpo1ベクターと比較して変異体マウスの骨格筋において高いMTM1タンパク質レベルを生じた。
SMN1を発現するAAVpo1A1及びAAV9ベクターをC57BL/6マウス、4週齢に8x1012vg/kgで静脈注射した。数個の筋肉及び器官を3週間後に回収した。AAVpo1A1ベクターは、WTマウスにおいてすべての骨格筋及び心臓を同様のレベルで形質導入した。Mtm1-KOマウスにおいて以前観察されたとおり、AAVpo1A1ベクターの投与は、肝臓の低い形質導入を生じた。
導入遺伝子発現をRT-qPCRによって分析し、結果は、SMN1転写物レベルがAAVpo1A1及びAAV9ベクター形質導入後に骨格筋において同様であったことを示す。AAVpo1A1-由来SMN1 mRNAのレベルは、AAV9と比較して心臓、肝臓、脾臓及び腎臓において低かった。中枢神経系では、AAVpo1A1-由来SMN1転写物は、分析されたすべての領域(皮質、小脳及び脊髄)において、脊髄においてよりもわずかに高いレベルで存在した。
脊髄におけるSMNの細胞局所を評価するために、抗HA抗体及び抗NeuN抗体を使用する免疫蛍光染色を5x1013vg/kgでのAAVpo1A1-SMN1ベクターの注射の4週間後に実施した。図8に示すとおり、HA-SMNは、ニューロン、特に、脊髄の前角に位置する大きな運動ニューロンにおいて発現された。大部分の運動ニューロン(平均80%、範囲72%から94%、マウスn=4)は、AAVpo1A1を用いて形質導入され、導入遺伝子を発現した。
全体として、これは、骨格筋、脳及び脊髄においてAAV9ベクターに匹敵する高い導入遺伝子発現レベルと肝臓及び脾臓などの他の器官における導入遺伝子発現を脱標的化されたベクターとを有利に組み合わせたことから、筋肉-及び/又はCNS-に方向付けられた遺伝子移行のためのAAVpo1A1ベクターの強度及び組織特異性の改善を実証している。
Claims (16)
- 神経系を冒す神経系障害及び神経筋障害の遺伝子治療における使用のための、ペプチド改変カプシドタンパク質を含む組換えブタアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであって、ペプチド改変カプシドタンパク質が、配列MPLGAAG (配列番号2)又は前記配列中に1個若しくは2個だけアミノ酸変異を含むバリアントを含む少なくとも1つのペプチドを含み、前記少なくとも1つのペプチドがブタAAV血清型1由来のカプシドに挿入されている、組換えブタアデノ随伴ウイルスベクター。
- 全身投与、特に静脈内投与後の、肝臓脱標的化と、AAV9ベクターのものより優れてはいなくても少なくとも同等であるさまざまな筋肉群における並びに脳及び脊髄における導入遺伝子発現レベルとの組合せによって特徴付けられる、請求項1に記載の組換えブタAAVベクター。
- ペプチドが、配列GMPLGAAGA (配列番号3)又は、前記配列中に1個若しくは2個のアミノ酸欠失若しくは置換を含むバリアントを含み、好ましくはそのN及び/又はC末端で5個までのアミノ酸が隣接している、請求項1又は2に記載の組換えAAVベクター。
- ペプチドが配列GQRGMPLGAAGAQAA(配列番号4)を含むか又はそれからなる、請求項3に記載の組換えブタAAVベクター。
- ペプチドが、カプシドタンパク質の残基N567とS568との間又は残基N569とT570との間に挿入され;前記位置が配列番号1とのアライメントによって決定される;好ましくは、ペプチドが565～567位及び568～570位のすべての残基又は567～569位及び570～572位のすべての残基を置き換えており;前記位置が配列番号1とのアライメントによって決定される、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
- 前記ペプチド改変カプシドタンパク質が、配列番号5の配列、並びに、前記ペプチドを含む、配列番号5に少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一性を有する配列、並びに、VP2又はVP3カプシドタンパク質に対応するその断片からなる群から選択される配列を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
- 治療のための目的の遺伝子をパッケージングしているベクター粒子である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
- 目的の遺伝子が、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項7に記載の組換えブタAAVベクター。
- 治療のための目的の遺伝子が:
(i)治療用遺伝子;
(ii)治療用抗体又は抗体断片などの治療用タンパク質又はペプチド及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに
(iii)干渉RNA、ゲノム編集のためのガイドRNA及びエクソンスキッピングできるアンチセンスRNAなどの治療用RNAをコードする遺伝子
からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の組換えブタAAVベクター。 - 疾患が、神経系を冒す神経筋疾患、好ましくは神経系を冒す遺伝的神経筋疾患である、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
- 神経系を冒す遺伝的神経筋疾患が:(i)ミオパチー、例えば先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;(ii)脊髄性筋萎縮症及び運動ニューロン疾患;(iii)筋強直症候群、特に1型及び2型筋緊張性ジストロフィー;(iv)遺伝性運動感覚ニューロパチー;(v)遺伝性対麻痺及び遺伝性運動失調症;並びに(vi)先天性筋無力症候群;好ましくは先天性筋無力症候群、先天性筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー;及び脊髄性筋萎縮症及び運動ニューロン疾患、を含む群から選択される、請求項10に記載の組換えブタAAVベクター。
- 治療のための目的の遺伝子が:デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィー(DMD遺伝子);肢帯型筋ジストロフィー(DYSF、FKRP遺伝子);1型(DMPK遺伝子)及び2型(CNBP/ZNF9遺伝子)筋緊張性ジストロフィー;中心核ミオパチー(DNM2、BIN1遺伝子);ポンペ病(GAA遺伝子);糖原病III(AGL遺伝子);脊髄性筋萎縮症(SMN1、ASAH1遺伝子);筋萎縮性側索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTNなど);遺伝性対麻痺(SPAST、SPG7);シャルコー・マリー・トゥース、4B1型(MTMR2)及び先天性筋無力症候群(CHAT、AGRN)を含む群から選択される、神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる遺伝子の機能性バージョン、又は疾患の原因となる前記遺伝子を標的化する治療用RNAである、請求項7から11のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
- 神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる前記遺伝子が:DMD、DYSF、FKRP、DNM2、BIN1、GAA、AGL、SMN1及びASAH1遺伝子を含む群から選択される、請求項12に記載の組換えブタAAVベクター。
- 神経系を冒す遺伝的神経筋障害の原因となる前記遺伝子が:FKTN、POMT1、POMT2、POMGNT1、POMGNT2、LMNA、ISPD、GMPPB、LARGE、LAMA2、TRIM32及びB3GALNT2を含む群から選択される、請求項12に記載の組換えブタAAVベクター。
- 脊髄性筋萎縮症の遺伝子治療における使用のための請求項12又は13に記載の組換えブタAAVベクターであって、配列番号5の配列、又は、配列番号2から4のいずれか1つのペプチドを含む前記配列に少なくとも95%、96%、97%、98%若しくは99%同一性を有する配列を含むペプチド改変カプシドタンパク質を含み、ニューロン及び/又はグリア細胞において機能性であるプロモーターに作動可能に連結されたヒトSMN1遺伝子を更にパッケージングしている、組換えブタAAVベクター。
- 体系的な経路によって、好ましくは血管内に;脳内、脳室内、大槽内、及び/又はくも膜下腔内経路によって、又はこれらの組合せによって投与される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組換えブタAAVベクター。
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