JP2023544683A - ペプチド改変されたａａｖカプシド - Google Patents

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Abstract

本発明は、改善された親和性、特に増加した筋肉親和性及び/又は低減した肝臓親和性を有するペプチド改変されたAAVカプシドに関する。本発明はまた、目的の対象の遺伝子をパッケージングした誘導された組換えAAVベクター粒子、及び遺伝子療法、特に筋肉疾患を処置するための遺伝子療法におけるその使用に関する。

Description

本発明は、改善された親和性、特に増加した筋肉親和性及び/又は低減した肝臓親和性を有するペプチド改変されたAAVカプシドに関する。本発明はまた、目的の対象の遺伝子をパッケージングした誘導された組換えAAVベクター粒子、及び遺伝子療法、特に筋肉疾患を処置するための遺伝子療法におけるその使用に関する。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターは、インビボでの遺伝子移入に広く使用されており、現在、AAVベクターを使用した臨床試験が、いくつかの疾患の処置について行われている。
AAVは、パルボウイルス(Parvoviridae)科内のデペンドパルボウイルス(Dependoparvovirus)属に属する非病原性ウイルスである。AAVは、約26nmの直径のカプシド及び4.7kbの一本鎖DNAゲノムから構成される非エンベロープ型ウイルスである。ゲノムは2つの遺伝子、rep及びcapを有し、これらは、ウイルス複製起点及びパッケージングシグナルとして役立つ逆末端反復(ITR)と命名された2つのパリンドローム領域により隣接されている。cap遺伝子は、選択的スプライシング及び異なる開始コドンからの翻訳を通じて20面体AAVカプシドを構成する3つの構造タンパク質VP1、VP2及びVP3をコードする。VP1、VP2及びVP3は同じC末端を共有し、これはVP3の全てである。AAV2を参照として使用すると、VP1は735アミノ酸の配列(GenBank受託番号YP_680426.1;アクセス日2018年8月13日)を有し;VP2(598アミノ酸)はスレオニン138(T138)で開始し、VP3(533アミノ酸)はメチオニン203(M203)で開始する。3つの異なるVPは、AAV2カプシドに対して1 VP1:1 VP2:10 VP3の比で寄与している。全てのAAV血清型のカプシドは、およそ50コピーのVP3、5コピーのVP2及び5コピーのVP1を含む60個のVPモノマーからアセンブルされる。rep遺伝子は、ウイルス複製のために要求される4つのタンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40をコードする。組換えAAVベクターは、ITR隣接rAAVゲノムをカプシド被包し、該ゲノムにおいて治療用遺伝子発現カセットがAAVタンパク質コーディング配列を置き換えている。
組織特異性は、カプシド血清型によって決定され、ヒト及び非ヒト霊長動物から単離された一般に使用されるAAV血清型は、他のものよりも効率的に特定の臓器に形質導入することができ、例えば、筋肉組織におけるAAV6、AAV8、AAV9及びAAV-rh74がある。
しかしながら、全ての一般に使用される天然に存在するAAV血清型は、肝臓内に蓄積する傾向がある。このことは、特にAAVベクターが全身経路によって投与される場合に問題を引き起こす。第1に、筋肉において発現することを意図された導入遺伝子は、肝臓に対して毒性効果を有し得る。第2に、AAVベクターが肝臓に進入することにより、筋肉又は神経組織に利用可能なベクターの量が低減する。結果として、より高い用量のAAVベクターが必要とされる。このことは、肝毒性を誘発する可能性、及びベクター製造のコストを増大させる。
WO2019/193119は、AAV9及びAAVrh74親血清型の両方と比較して劇的に低減した肝臓親和性と、骨格筋及び心筋における高レベルの遺伝子形質導入効率とを有利に組み合わせたハイブリッドAAV9.rh74カプシドを開示している。
様々なAAV血清型の表面上に短いランダムペプチドをディスプレイするAAVカプシドバリアントのライブラリーが、変更された細胞特異性及び/又は形質導入効率を有する遺伝子療法ベクターをスクリーニングするために生成されている(Bornerら、Molecular Therapy、2020年4月、28、1017～1032頁;Kienle EC(自然科学博士号のための学位論文、ルプレヒト・カール大学ハイデルベルク自然科学数学総合学部、ドイツ、2014);WO2019/207132;Michelfelderら、PLoS ONE、2009、4、e5122;Buningら、Molecular Therapy: Methods & Clinical Development、2019、12、248～において概略される)。
初代乳房腫瘍細胞についてインビトロで選択されたペプチドRGDLGLS(配列番号1又はP1)をディスプレイするカプシド改変されたAAV2ベクターは、インビボで初代乳房腫瘍に形質導入されなかった(Michelfelderら、以前に引用した)。P1は、AAV1、AAV2、AAV7～9及びAAVrh10と共に、インビトロにおいて神経細胞形質導入を改善した(Kienle EC、以前に引用した)。ペプチドP1をディスプレイするAAV9ベクターは、ヒトアストロサイト培養物において十分に機能し、増強された筋肉親和性、及び肝臓の脱標的化を有することが報告されている(Bornerら、以前に引用した;WO2019/207132)。
これらの参考文献の全てにおいて、細胞標的化ペプチド挿入戦略は、挿入部位の上流及び下流のAAVカプシド配列の改変を含む。前記挿入戦略は、AAVカプシドバリアントのライブラリーのクローニングを促進する目的を有した。AAVカプシドに挿入された細胞標的化ペプチドに隣接するアミノ酸の数及び性質の、インビトロでのベクター形質導入効率に対する影響は、ペプチド特異的であるため、予測不能であることが示された(Bornerら、以前に引用した)。
全身送達されたAAVベクターを、効率的に、選択的に、安全に筋肉に形質導入する能力は、多くのヒト疾患の遺伝子療法に有益であり得る。
WO2019/193119 WO2019/207132
Bornerら、Molecular Therapy、2020年4月、28、1017～1032頁 Kienle EC(自然科学博士号のための学位論文、ルプレヒト・カール大学ハイデルベルク自然科学数学総合学部、ドイツ、2014) Michelfelderら、PLoS ONE、2009、4、e5122 Buningら、Molecular Therapy: Methods & Clinical Development、2019、12、248～ Aponte-Ubillusら、Applied Microbiology and Biotechnology、2018、102: 1045～1054頁 McCartyら、Gene Therapy、2003、Dec.、10(26)、2112～2118頁 Babi Ramesh Reddy Nallamilliら、Annals of Clinical and Translational Neurology、2018、5、1574～1587頁 Ayuso E.ら(Hum. Gene Ther. 2014、25、977～987頁) Rohrら(J. Virol. Methods、2002、106、81～88頁)
本発明者らは驚くべきことに、AAVカプシドにおける、挿入部位の上流及び下流のカプシド配列を改変しない、ペプチドP1の挿入は、筋肉親和性及び肝臓脱標的化を更に改善し得ることを示した。
したがって、本発明は、カプシドタンパク質配列の2つの連続するアミノ酸の間に筋肉標的化ペプチド挿入を含み、挿入部位の上流及び下流のカプシドタンパク質アミノ酸配列のいかなる改変も含まない、改変されたアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、標的化ペプチドが、配列番号1の配列、並びに配列番号1のN末端及びC末端における小アミノ酸の配列を含む、改変されたAAVカプシドタンパク質に関する。
一部の実施形態において、小アミノ酸の配列は、A、G、N、T、D、L及びSから選択される最大5個のアミノ酸;好ましくは配列番号1のN末端におけるG、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA又はALA及びC末端におけるG、SG、AA、TG、GG、SA、AG又はGA;より好ましくはN末端におけるAAA及びC末端におけるSGからなる。
一部の実施形態において、筋肉標的化ペプチドは、9個のアミノ酸～最大25、20又は15個のアミノ酸の配列からなる。
一部の実施形態において、挿入は、可変領域IV、V又はVIII内に;好ましくはAAV2カプシドタンパク質配列における番号付けにしたがって587位、588位、589位、453位、520位、584位及び585位から選択される位置に存在する。
一部の実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74及びAAV9.rh74;好ましくはAAV9又はAAV9.rh74からなる群から選択されるAAV血清型からのものである。
一部の好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAV9.rh74からのものであり、589位において筋肉標的化ペプチド挿入を含み;好ましくは、標的化ペプチドは、配列番号5、21、23、25、27、29、31、33、35及び37;好ましくは配列番号5からなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、配列番号6の配列及び前記配列と少なくとも85%、87%、88%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、筋肉、特に心臓及び/若しくは骨格筋に対する増加した親和性、並びに/又は肝臓に対する減少した親和性を有する。
本発明はまた、本開示による改変されたAAVカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド;好ましくは配列番号7の配列、又は前記配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドに関する。
本発明は、本開示によるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドに更に関する。
本発明の別の態様は、本開示による改変されたAAVカプシドタンパク質を含む、目的の対象の遺伝子をパッケージングしたAAVベクター粒子に関する。
一部の好ましい実施形態において、目的の対象の遺伝子は、治療用遺伝子;治療用タンパク質又はペプチド、例えば治療用抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに治療用RNA、例えば干渉RNA、ゲノム編集用のガイドRNA及びエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される。
本発明の別の態様は、治療有効量の本開示によるAAVベクター粒子、又は本開示による前記AAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞を含む、医薬組成物に関する。
本発明はまた、遺伝子療法、好ましくは筋肉疾患を処置するための遺伝子療法における医薬としての使用のための本開示による医薬組成物に関する。
一部の好ましい実施形態において、医薬組成物は、ジストロフィノパチー及び肢帯型筋ジストロフィーから選択される筋肉疾患の原因である遺伝子;好ましくはDMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB及びSGCGを含む群から選択される遺伝子を標的化する。
改変されたAAVカプシドタンパク質
本発明は、カプシドタンパク質配列の2つの連続するアミノ酸の間に筋肉標的化ペプチド挿入を含む改変されたアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、標的化ペプチドが、配列番号1(RGDLGLS)の配列、並びに配列番号1のN末端及びC末端における小さいアミノ酸の配列を含み、挿入が、挿入部位の上流及び下流のカプシドタンパク質アミノ酸配列を改変しない、改変されたAAVカプシドタンパク質に関する。
配列RGDLGLSは、先行技術においてP1と名付けられたペプチドの配列に対応する。
本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質は、細胞、組織又は臓器、特に目的の対象の細胞、組織又は臓器(標的細胞、組織又は臓器)に形質導入して、前記細胞、組織又は臓器、特に標的細胞、組織又は臓器中で導入遺伝子を発現させる組換えAAVベクター粒子を形成することができる機能的なAAVカプシドである。更に、本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質は、それが由来する対応する改変されていないAAVカプシドタンパク質と比較して、及び先行技術による対応する改変されたAAVカプシドタンパク質(例えば、ペプチドP1挿入が、挿入部位の上流及び下流のAAVカプシドタンパク質配列を改変する、改変されたAAVカプシドタンパク質)と比較して、改善された親和性を有する。
本明細書において使用される場合、「親和性」という用語は、一部の特定の種類の細胞、組織又は臓器に形質導入する、組換えAAVベクター粒子中に存在するAAVカプシドタンパク質の能力(例えば、細胞又は組織親和性)を指す。改善された親和性を有する改変されたAAVカプシドタンパク質は、改変されていないカプシド又は上記に開示される先行技術による改変されたカプシドと比較して少なくとも1つの標的細胞、組織若しくは臓器に対する増加した親和性及び/又は少なくとも1つのオフターゲット細胞、組織若しくは臓器に対する減少した親和性(若しくは脱標的化)を有してもよい。増加した親和性は、改変されていないAAVカプシドタンパク質と比較して、少なくとも1つの標的細胞、組織又は臓器において少なくとも1.5倍、好ましくは3、5、10、50、100倍又はより大きく、及び先行技術の改変されたAAVカプシドタンパク質と比較して少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2倍、好ましくは1.3倍又はより大きく増加した導入遺伝子発現レベルを特に指す。脱標的化は、改変されていないAAVカプシドタンパク質と比較して、少なくとも1つのオフターゲット細胞、組織又は臓器において少なくとも1.5倍、好ましくは3、5、10、50、100倍又はより大きく、及び先行技術の改変されたAAVカプシドタンパク質と比較して少なくとも1.5倍、好ましくは3、5、10倍又はより大きく減少した導入遺伝子発現レベルを特に指す。その改善された親和性の結果として、本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質は、改善された体内分布を有する。これは、それは有意により良好に、定義された組織(標的組織)、組織の群(例えば骨格筋及び/若しくは心臓)若しくは臓器(標的組織若しくは臓器)の群を、他の(非標的)組織の標的化を増加させることなく標的化し(例えば改善された特異性)、並びに/又は、それは、通常は望ましくない毒性を低減させるために、特有の組織(非標的若しくはオフターゲット組織若しくは臓器)をより低い有効性で標的化する(組織脱標的化、例えば肝臓脱標的化)ことを意味する。
特定の種類の細胞、組織又は臓器に対する本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質の親和性は、前記特定の種類の細胞、組織若しくは臓器に形質導入するか又は前記特定の種類の細胞、組織若しくは臓器中で導入遺伝子を発現する、改変されたAAVカプシドタンパク質を含むAAVベクター粒子の能力を、当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えば本出願の実施例において開示されるものを使用して測定することによって決定されてもよい。例えば、ベクター形質導入又は導入遺伝子発現は、動物モデル、例えば当技術分野において周知の及び本出願の実施例において開示されるマウスモデルにおける、改変されたAAVカプシドタンパク質を有するAAVベクター粒子の局所又は全身投与により決定される。対応する改変されていないAAVカプシドタンパク質、及び先行技術による対応する改変されたAAVカプシドタンパク質を含むAAVベクターは比較のために使用される。ベクター形質導入は、当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えばリアルタイムPCRアッセイにより二倍体ゲノム当たりのベクターゲノムコピー数を測定することにより決定されてもよい。導入遺伝子発現は、有利には、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質(GFP若しくはその他)を使用して当技術分野において周知の標準的なアッセイ、例えばインビボ又はインビトロでのインビボ又はインビトロ定量的生物発光又は蛍光アッセイにより測定される。
以下の説明において、アミノ酸残基は、標準の1文字アミノ酸表記によって示される。
文脈が他に明確に指し示さなければ、「a」、「an」、及び「the」は複数の指示対象を含む。そのため、「a」(若しくは「an」)、「1つ又は複数」又は「少なくとも1つ」という用語は、本明細書において交換可能に使用可能であり;他に指定されなければ、「又は」は「及び/又は」を意味する。
本明細書において使用される場合、「筋肉」という用語は心筋(即ち心臓)及び骨格筋を指す。「筋肉細胞」という用語は、筋細胞、筋管細胞、筋芽細胞、及び/又はサテライト細胞を指す。骨格筋は、身体中のそれらの解剖学的位置に基づいて異なる群に分類される。異なる骨格筋群に対する本発明によるハイブリッドAAVカプシドの親和性は、マウス脛骨(TA)、長指伸筋(EDL)、四頭筋(Qua)、腓腹筋(Ga)、ヒラメ筋(Sol)、三頭筋、二頭筋及び/又は横隔膜;特にマウス脛骨(TA)及び横隔膜筋において測定されてもよい。「筋肉に対する親和性」という表現は、身体に存在する心臓及び様々な骨格筋に対する親和性を指す。
本明細書において使用される場合、「筋肉標的化ペプチド」は、筋肉細胞に結合し、そのペプチドを有するカプシド改変されたrAAVベクターをインビボで筋肉細胞及び組織へ方向付けるか又は標的化するペプチドを指す。
本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質は、組換えタンパク質である。
本明細書において使用される場合、「配列」は、1アミノ酸又は少なくとも2つの連続するアミノ酸を指す。
本説明において、AAVカプシドタンパク質配列の所与の位置における挿入は、その位置のアミノ酸残基の後の挿入を指す。
「同一性」という用語は、2つのポリペプチド分子の間又は2つの核酸分子の間の配列類似性を指す。両方の比較される配列中の位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基により占有される場合、それぞれの分子はその位置において同一である。2つの配列の間の同一性のパーセンテージは、2つの配列により共有されるマッチする位置の数を比較される位置の数で割り、100を掛けたものに対応する。一般に、2つの配列がアライメントされて最大同一性を与える場合に比較が行われる。同一性は、例えば、GCG(Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、Madison、Wisconsin)パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズムのいずれか、例えばBLAST、FASTA若しくはCLUSTALWを使用してアライメントにより算出されてもよい。
一部の実施形態において、本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質は、筋肉、特に心臓及び/若しくは骨格筋に対する増加した親和性、並びに/又は肝臓に対する減少した親和性(肝臓脱標的化)を有する。本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質の親和性は、それが由来する対応する改変されていないAAVカプシドタンパク質と比較して、及び筋肉標的化ペプチド挿入が、挿入部位の前後のAAVカプシドタンパク質配列を改変する、対応する改変されたAAVカプシドタンパク質(先行技術の改変されたAAVカプシド)と比較して、改善されている。
筋肉標的化ペプチドは、一般に、最大30個のアミノ酸の配列からなる。標的化ペプチドは、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個のアミノ酸からなってもよい。一部の実施形態において、筋肉標的化ペプチドは、最大25、20又は15個のアミノ酸の配列からなる。好ましくは、標的化ペプチドは、12、13、14又は15個のアミノ酸の配列からなる。
筋肉標的化ペプチドは、カプシド表面上の露出される部位に挿入される。AAVカプシド表面上に露出される部位は、当技術分野において周知であり、特に突起の頂上においてループを形成する可変領域(VR)、例えばVR-IV、-V及び-VIIIを包含する(Buningら、Molecular Therapy: Methods & Clinical Development、2019、12、248～において概略される)。AAV8カプシドタンパク質配列における番号付けにより、VR-IVは、Y445～A476(広い定義)又はQ451～L462(狭い定義)に対応し;VR-Vは、C485～G515(広い定義)又はR490～T509(狭い定義)に対応し;VR-VIIIは、I581～L604(広い定義)又はL586～I595(狭い定義)に対応する。ペプチド挿入部位は、有利には、AAVカプシド表面上に露出されるために好適な一般のVP3領域の部位、例えば、AAV2カプシドタンパク質配列における番号付けによる587位、588位、589位、453位、520位(584位と組み合わせた)、584位及び585位に存在する。ペプチド挿入部位は、AAV2又はAAV8カプシドアミノ酸配列を参照することにより示される。当技術分野において周知の標準のタンパク質配列アライメントプログラム、例えば、BLAST、FASTA、CLUSTALW等を使用した、任意の他のAAVカプシド配列と、AAV2又はAAV8カプシド配列との配列アライメント後、当業者は、他のAAVカプシド配列におけるペプチド挿入部位の対応する位置を容易に得ることができる。
AAV血清型についての好ましい挿入部位は、AAV1の590位;AAV2の587位又は588位;AAV3又はAAV4の586位;AAV5の575位;AAV6の585位;AAV8の585位又は590位;AAV9の588位又は589位;AAV9.rh74の589位を包含する。
改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAVカプシドタンパク質の様々な部位において1つ又は複数の筋肉標的化ペプチド挿入を含んでもよい。
本発明により、配列番号1のN末端及びC末端における小さいアミノ酸の配列は、配列番号1のN末端及びC末端に直接的に隣接する隣接配列である。小さいアミノ酸は、一般に、メチル、カルボキシル、ヒドロキシル及び/又はアミン基のうちの1つ又は複数により置換され得るH又はC1～C2アルキル基から選択される、立体障害の小さい側鎖を有し;好ましくは、側鎖は、C、H、N及びO原子からなり、且つ/又は環式基を含まない。小さいアミノ酸は、中性及び/又は可撓性であってもよい。好ましくは、小さいアミノ酸は、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)、アスパラギン酸(D)及びロイシン(L);より好ましくはA、G、S、T及びLからなる群から選択される。好ましくは、隣接配列は、同じであっても異なっていてもよい最大5個のアミノ酸(1、2、3、4又は5個);より好ましくは、同じであっても異なっていてもよい2～5個のアミノ酸(2、3、4又は5個)からなる。N末端及びC末端隣接配列は、G、SG、TG、AA、GG、SA、AG、GA、AAA、GST、SGS、SGA、AGA、GAA及びALA;好ましくはN末端のG、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA又はALA、及びC末端のG、SG、AA、TG、GG、SA、AG又はGAからなる群から有利に選択される。一部のより好ましい実施形態において、筋肉標的化ペプチドは、配列番号1のN末端においてAAA、及びC末端においてSGを含む。
改変されたAAVカプシドタンパク質は、ハイブリッド血清型及びバリアント血清型を包含する、任意の天然の又は人工的なAAVカプシド血清型に由来し得る。改変されたAAVカプシドタンパク質が由来し得るAAVカプシド血清型の非限定的な例は、AAV1、AAV2、AAV3(3A型及び3B型を包含する)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2i8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80、AAV3B及びAAV9.rh74(WO2019/193119において開示される)を包含する。一部の実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74及びAAV9.rh74からなる群から選択されるAAV血清型からのものである。一部の好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAV8、AAV9若しくはAAV9.rh74からの;又はAAV9若しくはAAV9.rh74からの、更により好ましくはAAV9.rh74からのものである。AAV9カプシドは、特に、アクセス日2004年6月24日のアミノ酸配列GenBank受託番号AY530579.1に対応する。AAV9.rh74カプシドは、配列番号3のCDSによってコードされ得る配列番号2のアミノ酸配列に対応する。筋肉標的化ペプチドは、AAV8の585位若しくは590位、AAV9の588位若しくは589位、又はAAV9.rh74の589位において有利に挿入される。
一部の好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、AAV9.rh74からのものであり、AAV9.rh74カプシドタンパク質の589位において筋肉標的化ペプチド挿入を含む。
一部の好ましい実施形態において、標的化ペプチドは、AAARGDLGLSSG(配列番号5);AAARGDLGLSAA(配列番号21);GSTRGDLGLSTG(配列番号23);GRGDLGLSG(配列番号25);SGSRGDLGLSGG(配列番号27);SGARGDLGLSSA(配列番号29);SGARGDLGLSAG(配列番号31);AGARGDLGLSSG(配列番号33);GAARGDLGLSGA(配列番号35);及びALARGDLGLSAG(配列番号37);好ましくは配列番号5、21、23、27、29、31、33、35及び37;更により好ましくは配列番号5からなる群から選択される配列を含むか又はからなる。一部のより好ましい実施形態において、前記配列のうちの任意の1つを含むか又はからなる標的化ペプチドは、AAV8、AAV9又はAAV9.rh74カプシド;好ましくはAAV9.rh74カプシドに挿入される。標的化ペプチドのペプチドは、AAV8の590位、AAV9の588位、又はAAV9.rh74の589位において有利に挿入される。
一部のより好ましい実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、配列番号6の配列及び前記配列と少なくとも85%、87%、88%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか又はからなり;より好ましくは、改変されたAAVカプシドタンパク質は、配列番号6の配列を含むか又はからなる。本発明によるバリアントは、筋肉標的化ペプチド配列及び挿入部位の前後の5個のアミノ酸配列;好ましくは10個のアミノ酸配列において突然変異を有しない。
一部の実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、改変されたVP1、VP2又はVP3タンパク質である。一部の特定の実施形態において、改変されたVP1、VP2又はVP3タンパク質は、配列番号6に由来する。VP2は、配列番号6のT138～末端のアミノ酸配列に対応する。VP3は、配列番号6のM204～末端のアミノ酸配列に対応する。
一部の実施形態において、改変されたAAVカプシドタンパク質は、あるAAV血清型の一般のVP3領域への筋肉標的化ペプチド挿入、並びに他のAAV血清型(例えば、VP3領域の血清型とは異なるAAV血清型)からのVP1特異的及び/又はVP2特異的N末端領域を含む、キメラVP1又はVP2タンパク質である。一部の特定の実施形態において、キメラVP1又はVP2タンパク質は、配列番号6に由来する。
ポリヌクレオチド、ベクター、及びAAVベクター製造のための使用
本発明の別の態様は、組換え改変AAVカプシドタンパク質を発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又は合成若しくは半合成核酸であってもよい。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明による改変されたAAV9.rh74カプシドタンパク質、特に、AAARGDLGLSSG(配列番号5);AAARGDLGLSAA(配列番号21);GSTRGDLGLSTG(配列番号23);GRGDLGLSG(配列番号25);SGSRGDLGLSGG(配列番号27);SGARGDLGLSSA(配列番号29);SGARGDLGLSAG(配列番号31);AGARGDLGLSSG(配列番号33);GAARGDLGLSGA(配列番号35);及びALARGDLGLSAG(配列番号37);好ましくは配列番号5、21、23、27、29、31、33、35及び37;更により好ましくは配列番号5からなる群から選択される配列を含むか又はからなる標的化ペプチドを含む改変されたAAV9.rh74カプシドタンパク質をコードする。ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号7、22、24、26、28、30、32、34、36及び38;より好ましくは配列番号7、22、24、28、30、32、34、36及び38;更により好ましくは配列番号7からなる群から選択される配列を含む。
一部の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号6及び前記配列と少なくとも85%、87%、88%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含むか又はからなる改変されたAAV9.rh74カプシドタンパク質をコードする。
一部のより好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号7の配列、又は前記配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む。配列番号7の配列、は、配列番号6の改変されたAAV9.rh74カプシドタンパク質をコードする。ポリヌクレオチドは、機能的なポリヌクレオチド配列であり、このことは、このポリヌクレオチドの配列が本発明による改変されたAAVカプシドタンパク質をコードすることを意味する。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、AAVレプリカーゼ(Rep)タンパク質、好ましくはAAV2からのRepを発現可能な形態で更にコードする。
ポリヌクレオチドは、有利には、組換えベクターに挿入され、組換えベクターは、非限定的な方式で、染色体、非染色体、合成又は半合成核酸からなる直鎖状又は環状DNA又はRNA分子、例えば特にウイルスベクター、プラスミド又はRNAベクターを包含する。目的の対象の核酸分子を、それを真核宿主細胞に導入して該細胞中で維持するために挿入することができる多数のベクターがそれ自体公知であり;適切なベクターの選択は、このベクターのために想定される用途(例えば、目的の対象の配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持、又は他に宿主の染色体材料への組込み)、そしてまた宿主細胞の性質に依存する。
一部の実施形態において、ベクターはプラスミドである。
本発明における使用のための組換えベクターは、改変されたAAVカプシドタンパク質(AVV Cap)、及びおそらくまたAAV Repタンパク質の発現のための適切な手段を含む発現ベクターである。通常は、各々のコーディング配列(改変されたAAV Cap及びAAV Rep)は、同じベクター中又は別々のいずれかで別々の発現カセットに挿入される。各々の発現カセットは、AAV産生細胞中での対応するタンパク質の発現を可能とする調節配列、例えば特にプロモーター、プロモーター/エンハンサー、開始コドン(ATG)、停止コドン、転写終結シグナルに機能的に連結されたコーディング配列(オープンリーディングフレーム又はORF)を含む。代替的に、改変されたAAV Cap及びAAV Repタンパク質は、2つのコーディング配列又はウイルス2Aペプチドの間に挿入された内部リボソーム進入部位(IRES)を使用して独特の発現カセットから発現されてもよい。追加的に、改変されたAAV Cap、及び存在する場合にAAV Repをコードするコドン配列は、有利には、AAV産生細胞、特にヒト産生細胞中での発現のために最適化される。
本発明の別の態様は、改変されたAAVカプシドタンパク質、及び好ましくはまたAAV Repタンパク質の発現用の組換えベクターで安定して形質転換された細胞である。細胞は、改変されたAAVカプシド及びAAV Repタンパク質を安定して発現する(産生細胞株)。産生細胞は有利にはヒト細胞である。
ベクター、好ましくは組換えプラスミド、又は細胞は、当技術分野において周知の標準的なAAV製造方法(Aponte-Ubillusら、Applied Microbiology and Biotechnology、2018、102: 1045～1054頁中の総説)を使用して、本発明のハイブリッドAAVカプシドタンパク質を含むハイブリッドAAVベクターを製造するために有用である。
AAVベクターは、通常、AAV製造に好適な細胞に、AAV ITRにより隣接された、発現カセット中に挿入された目的の対象の遺伝子を含む組換えAAVベクターゲノムを含有するプラスミド(AAV移行プラスミド)と、AAV Rep及びCapタンパク質を発現するプラスミドとを共トランスフェクトすることによって製造される。或いは、本発明による産生細胞(AAV Rep及びCapタンパク質を安定して発現する細胞)に、AAV移行プラスミドをトランスフェクトしてもよい。
簡潔に述べれば、AAVカプシド粒子へのrAAVベクターゲノムのパッケージングを可能にするための十分なヘルパー機能の存在下での上記のプラスミドのトランスフェクション後に、細胞は、AAVベクター粒子の製造を可能とするために十分な時間にわたりインキュベートされ、細胞は次に採取され、溶解され、AAVベクター粒子は、標準的な精製方法、例えばアフィニティークロマトグラフィー及びイオジキサノール又は塩化セシウム密度勾配超遠心分離により精製される。
AAV粒子、細胞
本発明の別の態様は、本発明の改変された組換えAAVカプシドタンパク質を含むAAV粒子である。
AAV粒子は、本発明による改変されたVP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、AAV粒子は、同じ血清型の改変されたVP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、AAV粒子は、更に又は或いは、キメラVP1及び/又はVP2カプシドタンパク質、並びに本発明による改変されたVP3タンパク質を含む。一部の実施形態において、AAV粒子は、キメラの改変されたAAVカプシドを包含する改変されたAAVカプシドの血清型以外の、天然の又は人工的なAAV血清型からの別のAAVカプシドタンパク質を更に含むモザイクAAV粒子であり、モザイクAAV粒子は、増加した筋肉親和性及び/又は低減した肝臓親和性を有する。人工的なAAV血清型は、限定なく、キメラAAVカプシド、組換えAAVカプシド又はヒト化AAVカプシドであってもよい。そのような人工的なカプシドは、選択されたAAV配列(例えば、VP1カプシドタンパク質の断片)を、異なる選択されたAAV血清型から、同じAAV血清型の非連続部分から、非ウイルスAAV源から、又は非ウイルス源から得られ得る異種の配列と共に使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。
好ましくは、AAV粒子は、組換えAAV(rAAV)ベクター粒子である。AAVベクター粒子は、個体における標的組織又は細胞、特に筋肉細胞又は組織に方向付けられた遺伝子療法のために好適である。rAAVベクター粒子は、目的の対象の遺伝子をパッケージングしている。rAAVベクターのゲノムは、一本鎖ゲノム又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれかであってもよい(McCartyら、Gene Therapy、2003、Dec.、10(26)、2112～2118頁)。自己相補的なベクターは、AAV末端反復の1つから末端分解部位(terminal resolution site; trs)を欠失させることにより生成される。その複製性ゲノムが野生型AAVゲノムの半分の長さであるこれらの改変されたベクターは、DNA二量体をパッケージングする傾向を有する。AAVゲノムはITRにより隣接される。特定の実施形態において、AAVベクターはシュードタイプベクターであり、即ちそのゲノム及びカプシドは、異なる血清型のAAVに由来する。一部の好ましい実施形態において、シュードタイプベクターのゲノムはAAV2に由来する。rAAVベクター粒子は、上記に開示されるように当技術分野において周知の標準のAAV製造方法を使用して得られ得る。
「目的の対象の遺伝子」により、特定の応用、例えば限定なく、診断、レポート(報告)、改変、療法及びゲノム編集のために有用な遺伝子が意味される。
例えば、目的の対象の遺伝子は、治療用遺伝子、レポーター遺伝子又はゲノム編集酵素であってもよい。
「療法のための目的の対象の遺伝子」、「治療的に目的の対象の遺伝子」、又は「目的の対象の異種遺伝子」により、治療用遺伝子又は治療用タンパク質、ペプチド若しくはRNAをコードする遺伝子が意味される。
目的の対象の遺伝子は、標的臓器、特に筋肉の細胞中の、標的遺伝子又は標的細胞経路を改変する能力を有する任意の核酸配列である。例えば、遺伝子は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は調節を改変してもよい。一部の実施形態において、目的の対象の遺伝子は、遺伝子又はその断片の機能的なバージョンである。前記遺伝子の機能的なバージョンは、野生型遺伝子、バリアント遺伝子、例えば同じファミリーに属するバリアント及びその他、又はコードされるタンパク質の機能性を少なくとも部分的に保存する切断されたバージョンを包含する。遺伝子の機能的なバージョンは、患者において欠損しているか又は非機能的な遺伝子を置き換えるための置換又は付加的な遺伝子療法のために有用である。他の実施形態において、目的の対象の遺伝子は、常染色体優性遺伝子疾患を引き起こす優性アレルを不活性化する遺伝子である。遺伝子の断片は、ゲノム編集酵素と組み合わせた使用のための組換え鋳型として有用である。
代替的に、目的の対象の遺伝子は、特定の応用のための目的の対象のタンパク質(例えば抗体若しくは抗体断片、ゲノム編集酵素)又はRNAをコードしてもよい。一部の実施形態において、タンパク質は、治療用抗体若しくは抗体断片、又はゲノム編集酵素を含む治療用タンパク質である。一部の実施形態において、RNAは治療用RNAである。
一部の実施形態において、目的の対象の遺伝子の配列は、処置される個体、好ましくはヒト個体における発現のために最適化される。配列最適化は、核酸配列中のいくつかの変化を含んでもよく、これは、コドン最適化、GC含有量の増加、CpGアイランドの数の減少、選択的オープンリーディングフレーム(ARF)の数の減少並びに/又はスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を包含する。
目的の対象の遺伝子は、疾患の標的細胞、特に筋肉細胞中でコードされるタンパク質、ペプチド又はRNAを産生することができる機能的な遺伝子である。一部の実施形態において、目的の対象の遺伝子はヒト遺伝子である。AAVウイルスベクターは、標的臓器の細胞、特に心筋及び骨格筋細胞を包含する筋肉細胞中で発現可能な形態で目的の対象の遺伝子を含む。特に、目的の対象の遺伝子は、個体の標的細胞、組織又は臓器中での導入遺伝子の発現のための適切な調節配列に作動可能に連結している。当技術分野において周知のそのような配列は、特にプロモーター、及び導入遺伝子の発現を更に制御する能力を有する更なる調節配列、例えば限定なく、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、サイレンサー、特に組織特異的サイレンサー、及びmicroRNAを包含する。目的の対象の遺伝子は、標的臓器、特に筋肉の細胞中で機能的である遍在的、組織特異的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結している。目的の対象の遺伝子は、上記に開示されている追加の調節配列を更に含む発現カセットに挿入されてもよい。
遍在性プロモーターの例は、CAGプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーター(CMV)、SV40初期プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、及びEF1プロモーターを包含する。筋肉特異的プロモーターは、限定なく、デスミン(Des)プロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖(アルファ-MHC)プロモーター、ミオシン軽鎖2(MLC-2)プロモーター、心臓トロポニンC(cTnC)プロモーター、ヒト骨格アクチン(HSA)プロモーター又は合成筋肉特異的プロモーター、例えばSpC5-12プロモーター、CK6プロモーターに由来する上流配列を包含する。
RNAは、有利には、標的DNA若しくはRNA配列に相補的であるか、又は標的タンパク質に結合する。例えば、RNAは、干渉RNA、例えばshRNA、microRNA、Cas酵素若しくはゲノム編集用の類似した酵素と組み合わせた使用のためのガイドRNA(gRNA)、エクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNA、例えば改変された核内低分子RNA(snRNA)又は長鎖非コーディングRNAである。干渉RNA又はmicroRNAは、筋肉疾患に関与する標的遺伝子の発現を調節するために使用されてもよい。Cas酵素又はゲノム編集用の類似した酵素と複合状態のガイドRNAは、標的遺伝子の配列を改変するため、特に突然変異型/欠損型遺伝子の配列を矯正するため又は疾患、特に神経筋疾患に関与する標的遺伝子の発現を改変するために使用されてもよい。エクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAは、特に、リーディングフレームを矯正し、妨害されたリーディングフレームを有する欠損型遺伝子の発現を回復させるために使用される。一部の実施形態において、RNAは治療用RNAである。
本発明によるゲノム編集酵素は、特に筋肉細胞中の、標的遺伝子又は標的細胞経路を改変する能力を有する任意の酵素又は酵素複合体である。例えば、ゲノム編集酵素は、標的遺伝子又は細胞経路の発現、配列又は調節を改変してもよい。ゲノム編集酵素は、有利には、人工ヌクレアーゼ、例えば限定なく、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート(clustered regularly interspaced palindromic repeats:CRISPR)-CasシステムからのCas酵素及び類似した酵素である。ゲノム編集酵素、特に人工ヌクレアーゼ、例えばCas酵素及び類似した酵素は、標的ゲノム座位中に二本鎖切断(DSB)又は一本鎖DNA切断を生成し(ニッカーゼ、例えばCas9(D10A))、限定なく遺伝子矯正、遺伝子置換、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、突然変異誘発、染色体転座、及び染色体欠失等を包含する、部位特異的なゲノム編集応用のために使用される機能的なヌクレアーゼであってもよい。部位特異的なゲノム編集応用のために、ゲノム編集酵素、特に人工ヌクレアーゼ、例えばCas酵素及び類似した酵素は、二本鎖切断(DSB)に誘導された相同組換えにより標的ゲノム座位を改変する相同組換え(HR)マトリックス又は鋳型(DNAドナー鋳型とも命名されている)と組み合わせて使用されてもよい。特に、HR鋳型は、目的の対象の導入遺伝子を標的ゲノム座位に導入するか、又は筋肉障害、例えば神経筋疾患等を引き起こす標的ゲノム座位中、好ましくは異常な若しくは欠損型遺伝子中の突然変異を修復するものであってもよい。代替的に、ゲノム編集酵素、例えばCas酵素及び類似した酵素は、ヌクレアーゼ欠損型となるように操作されてもよく、様々なゲノム操作応用、例えば限定なく、転写活性化、転写抑制、エピゲノム修飾、ゲノムイメージング、及びDNA又はRNAプルダウン等のためのDNA結合タンパク質として使用されてもよい。
本発明はまた、本発明のrAAVベクター粒子で安定して形質導入された、単離された細胞、特に個体からの細胞に関する。個体は、有利には、処置されるべき患者である。一部の実施形態において、細胞は、本開示による筋肉細胞、前記細胞の前駆細胞又は多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞、胎性幹細胞及び成体幹細胞である。
医薬組成物及び治療的使用
本発明の別の態様は、本発明のAAVベクター粒子又は細胞から選択される活性剤、及び医薬的に許容される担体を少なくとも含む医薬組成物である。
本発明のrAAVベクター粒子、細胞及び派生された医薬組成物は、遺伝子療法、特に筋肉細胞又は組織に方向付けられた標的化された遺伝子療法により疾患を処置するために使用されてもよい。本発明の細胞及び派生された医薬組成物は、細胞療法、特に筋肉細胞に方向付けられた細胞療法により疾患を処置するために使用されてもよい。
本明細書において使用される場合、「遺伝子療法」は、疾患を処置する目的のために個体の細胞への目的の対象の核酸の送達を伴う個体の処置を指す。核酸の送達は、一般に、ベクターとしても公知の、送達媒体を使用して達成される。本発明のrAAVベクター粒子は、患者の細胞に遺伝子を送達するために用いられてもよい。
本明細書において使用される場合、「細胞療法」は、本発明のrAAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞が、任意の適切な手段により、例えば静脈内注射(注入)、又は目的の対象の組織への注入(埋込み若しくは移植)により、それを必要とする個体に送達されるプロセスを指す。特定の実施形態において、細胞療法は、個体から細胞を収集する工程、本発明のrAAVベクター粒子を用いて個体の細胞への形質導入を行う工程、安定して形質導入された細胞を患者に戻すように投与する工程を含む。本明細書において使用される場合、「細胞」は、単離された細胞、天然の又は人工的な細胞凝集物、バイオ人工細胞スキャフォールド及びバイオ人工臓器又は組織を指す。
遺伝子療法は、核中に、ミトコンドリア中に又は共生核酸、例えば限定なく、細胞中に含有されるウイルス配列として含まれるものを包含する、細胞における任意のコーディング又は調節配列の遺伝子移入、遺伝子編集、エクソンスキッピング、RNA干渉、トランス-スプライシング又は任意の他の遺伝子改変により行われ得る。
遺伝子療法の2つの主な種類は以下である:
- 欠損型/異常遺伝子のための機能的な置換え遺伝子を提供することを目的とする療法:これは置換又は付加遺伝子療法である;
- 遺伝子又はゲノム編集を目的とする療法:そのような場合において、目的は、配列を矯正するか又は欠損型/異常遺伝子の発現若しくは調節を改変するために必要なツールを細胞に提供し、その結果、機能的な遺伝子が発現されるか又は異常な遺伝子が抑制(不活性化)されるようにすることである:これは遺伝子編集療法である。
付加遺伝子療法において、目的の対象の遺伝子は、例えば遺伝子疾患の場合に該当するように、患者において欠損型又は突然変異型である遺伝子の機能的なバージョンであってもよい。そのような場合において、目的の対象の遺伝子は、機能的な遺伝子の発現を回復させる。そのため、遺伝子編集又は遺伝子置換えによりこの遺伝子の正確なバージョンが、標的細胞、特に罹患した患者の筋肉細胞中に提供され、これは、疾患に対する有効な療法に寄与し得る。
遺伝子又はゲノム編集は、1つ又は複数の目的の対象の遺伝子、例えば
- 上記に定義されている治療用RNA、例えば干渉RNA、例えばshRNA若しくはmicroRNA、Cas酵素若しくは類似した酵素と組み合わせた使用のためのガイドRNA(gRNA)、又はエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNA、例えば改変された核内低分子RNA(snRNA)をコードする遺伝子;及び
- 上記に定義されているゲノム編集酵素、例えば人工ヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、Cas酵素若しくは類似した酵素をコードする遺伝子;又はそのような遺伝子の組合せであり、そしてまた、上記に定義されている、組換え鋳型としての使用のための遺伝子の機能的なバージョンの断片であってもよい
を使用する。
遺伝子療法は、筋肉疾患を処置するために使用される。筋肉疾患は、骨格筋及び心筋を包含する、筋肉の構造又は機能に影響する様々な遺伝性(遺伝子)及び後天性疾患又は障害を包含する。疾患は、外傷、感染症、変性、構造若しくは代謝障害、腫瘍、炎症若しくは自己免疫障害、又はその他の原因により引き起こされるものであってもよい。遺伝子療法により処置され得る筋肉疾患の非限定的な例は、神経筋遺伝性障害、例えば筋肉遺伝性障害;がん及び自己免疫疾患を包含する。
一部の実施形態において、遺伝子療法(付加遺伝子療法又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、神経筋疾患の原因となる遺伝子である。神経筋遺伝性障害は、特に、筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、他のミオパチー、ミオトニー症候群、イオンチャネル筋肉疾患、悪性高熱症、代謝性ミオパチー、遺伝性心筋症、先天性筋無力症候群、運動ニューロン疾患、遺伝性対麻痺、遺伝性運動感覚ニューロパチー及び他の神経筋障害を包含する。
本発明によるカプシド改変されたrAAVを使用して処置され得る神経筋遺伝性障害の特定の例を、以下に列挙する。
- ジストロフィノパチーは、タンパク質ジストロフィンをコードするDMD遺伝子における病原性バリアントにより引き起こされるX連鎖性筋肉疾患のスペクトルである。ジストロフィノパチーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)及びDMD関連拡張型心筋症を含む。
- 肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)は、DMDに臨床的に類似しているが、常染色体劣性及び常染色体優性遺伝の結果として両方の性別において起こる障害の群である。肢帯型ジストロフィーは、サルコグリカン、及びジストロフィンと相互作用する筋肉細胞膜と会合した他のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされる。LGMD1という用語は、優性遺伝(常染色体優性)を示す遺伝子型を指す一方、LGMD2は、常染色体劣性遺伝を伴う型を指す。50より多くの座位における病原性バリアントが報告されている(LGMD1A～LGMD1G;LGMD2A～LGMD2W)。カルパイノパチー(LGMD2A)は、450より多くの病原性バリアントが記載されている遺伝子CAPN3の突然変異により引き起こされる。LGMD表現型に対する寄与遺伝子は、アノクタミン5(ANO5)、血管心外膜物質(blood vessel epicardial substance; BVES)、カルパイン3(CAPN3)、カベオリン3(CAV3)、CDP-L-リビトールピロホスホリラーゼA(CRPPA)、ジストログリカン1(DAG1)、デスミン(DES)、DnaJ熱ショックタンパク質ファミリー(Hsp40)ホモログ、サブファミリーB、メンバー6(DNAJB6)、ジスフェリン(DYSF)、フクチン関連タンパク質(FKRP)、フクチン(FKT)、GDP-マンノースピロホスホリラーゼB(GMPPB)、ヘテロ核内リボ核タンパク質D様(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D like; HNRNPDL)、LIMジンクフィンガードメイン含有2(LIM zinc finger domain containing 2; LIMS2)、ラミンA:C(LMNA)、ミオチリン(MYOT)、プレクチン(PLEC)、タンパク質O-グルコシルトランスフェラーゼ1(PLOGLUT1)、タンパク質O結合型マンノースN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1(ベータ1,2-)(POMGNT1)、タンパク質O-マンノースキナーゼ(POMK)、タンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ1(POMT1)、タンパク質O-マンノシルトランスフェラーゼ2(POMT2)、サルコグリカンアルファ(SGCA)、サルコグリカンベータ(SGCB)、サルコグリカンデルタ(SGCD)、サルコグリカンガンマ(SGCG)、タイチン-cap(TCAP)、トランスポーチン3(TNPO3)、トルシン1A相互作用タンパク質(TOR1AIP1)、トラフィッキングタンパク質粒子複合体11(TRAPPC11)、トリパータイトモチーフ含有32(tripartite motif containing 32; TRIM 32)及びタイチン(TTN)を包含する。LGMD表現型に対する主要な寄与遺伝子は、CAPN3、DYSF、FKRP及びANO5を包含する(Babi Ramesh Reddy Nallamilliら、Annals of Clinical and Translational Neurology、2018、5、1574～1587頁)。
- EMD遺伝子(エメリンをコードする)、FHL1遺伝子及びLMNA遺伝子(ラミンA及びCをコードする)を包含する遺伝子のうちの1つにおける欠陥によって引き起こされるエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー(EDMD)。
- SYNE1及びSYNE2遺伝子における欠陥によって、それぞれ、引き起こされるネスプリン(Nesprin)-1及びネスプリン-2関連筋ジストロフィー;TMEM43遺伝子における欠陥によって引き起こされるLUMA関連筋ジストロフィー;TOR1AIP1遺伝子における欠陥によって引き起こされるLAP1B関連筋ジストロフィー。
- 例えば、DUX4遺伝子(染色体4q35のサブテロメア領域におけるD4Z4マクロサテライト反復の短縮)又はFRG1遺伝子における欠陥と関連付けられる顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー1型(FSHD1A);SMCHD1遺伝子における欠陥によって引き起こされる顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー2型(FSHD1B)。
- 脊髄筋萎縮症は、運動のために使用される筋肉における虚弱及び消耗症(萎縮症)により特徴付けられる生存運動ニューロン1(SMN1)遺伝子における突然変異により引き起こされる遺伝的障害である。
- X連鎖性ミオチュブラーミオパチーは、運動のために使用される筋肉(骨格筋)に影響し、ほぼ排他的に男性において起こるミオチューブラリン(MTM1)遺伝子における突然変異により引き起こされる遺伝的障害である。この状態は、筋肉衰弱(ミオパチー)及び筋緊張の減少(筋緊張低下)により特徴付けられる。
- タイチノパチー(Titinopathy)は、タイチン(TTN)遺伝子における突然変異によって引き起こされる遺伝性障害である。優性及び劣性TTN突然変異の両方が、広いスペクトルの心筋及び骨格筋疾患を引き起こすことが報告されている。優性タイチノパチーは、エクソン344における突然変異によって引き起こされる初期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー(HMERF:hereditary myopathy with early respiratory failure)、及び遅発性脛骨筋ジストロフィー(TMD)を包含する。劣性タイチノパチーは、肢帯型筋ジストロフィー2J、若年又は成人初期発症型遠位性タイチノパチー、心筋症を伴わないエメリ・ドレフュス様ミオパチー、及び心疾患を伴う又は伴わない先天性ミオパチーを包含する。
- ポンペ病は、酸アルファ-グルコシダーゼ(GAA)遺伝子における突然変異により引き起こされる遺伝的障害である。GAA遺伝子における突然変異は、酸アルファ-グルコシダーゼがグリコーゲンを有効に分解することを予防し、これはこの糖をリソソーム中に毒性レベルまで蓄積させる。この蓄積は、身体の全体を通じた臓器及び組織、特には筋肉を損傷し、ポンペ病の進行性の徴候及び症状に繋がる。
- グリコーゲン貯蔵病III(GSD3)は、グリコーゲン脱分枝酵素をコードし、短い外側鎖を有する異常なグリコーゲンの蓄積と関連付けられるアミロ-アルファ-1,6-グルコシダーゼ、4-アルファ-グルカノトランスフェラーゼ(AGL)遺伝子におけるホモ接合性又は複合ヘテロ接合性突然変異により引き起こされる常染色体劣性代謝障害である。臨床的に、GSD IIIを有する患者は、乳児期又は幼児期において肝腫大、低血糖症、及び成長遅延を示す。IIIaを有する者における筋肉衰弱は小児期において最小であるが、成人においてより重症となることがあり;一部の患者は心筋症を発症する。
一部の実施形態において、遺伝子療法(付加的な遺伝子療法又は遺伝子編集)のための標的遺伝子は、ジストロフィン異常症(DMD遺伝子)及び肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)を含む群から選択される神経筋疾患の原因である遺伝子(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、DNAJB6遺伝子及びその他、例えば、SGCA、SGCB、SGCG)である。一部の好ましい実施形態において、遺伝子療法のための標的遺伝子は、DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB及びSGCGからなる群から選択される。
遺伝子編集の特定の例は、カルパイン-3遺伝子(CAPN3)における突然変異によって引き起こされる肢帯型筋ジストロフィー2A(LGMD2A)の処置であり得る。他の非限定的な例は、DMD又はTNT遺伝子における突然変異の処置であり得る。
したがって、遺伝子編集又は遺伝子置換によって、この遺伝子の正確なバージョンが、罹患している患者の筋肉細胞に提供され、これは、この疾患に対する有効な治療に寄与し得る。上記に列挙される、筋肉の他の遺伝性疾患は、同じ原理を使用する遺伝子置換又は遺伝子編集により処置され得る。
置換又は付加遺伝子療法は、がん、特に横紋筋肉腫を処置するために使用されてもよい。がんにおける目的の対象の遺伝子は、腫瘍細胞の細胞周期若しくは代謝及び遊走を調節し得るか、又は腫瘍細胞の死を誘導し得る。例えば、誘導性カスパーゼ-9は、好ましくは永続性のある抗腫瘍免疫応答を誘発するための併用療法において、筋肉細胞中で発現されて細胞死のトリガーとなり得る。
遺伝子編集を使用して、自己免疫若しくはがんの場合に、標的細胞、特に筋肉細胞における遺伝子発現を改変するか、又はそのような細胞中でのウイルスのサイクルを撹乱させてもよい。そのような場合において、好ましくは、目的の対象の遺伝子は、ガイドRNA(gRNA)、部位特異的エンドヌクレアーゼ(TALEN、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Casヌクレアーゼ)、DNA鋳型並びにRNAi成分、例えばshRNA及びmicroRNAをコードするものから選択される。ツール、例えばCRISPR/Cas9がこの目的のために使用されてもよい。
一部の実施形態において、遺伝子療法は、標的組織、特に、筋肉組織における治療用遺伝子の発現により、他の組織に影響する疾患を処置するために使用される。これは、特に同時発生的な肝臓障害、例えば肝炎を有する患者において、肝臓における治療用遺伝子の発現を回避するために有用である。治療用遺伝子は、好ましくは、筋肉細胞から血流に分泌されて、そこにおいて他の標的組織、例えば肝臓等に送達され得る治療用タンパク質、ペプチド又は抗体をコードする。治療用遺伝子の例は、限定なく、第VIII因子、第IX因子及びGAA遺伝子を包含する。
低減した肝臓親和性を有するAAVベクター粒子を含む本発明の医薬組成物は、同時発生的な肝臓疾患、例えば、ウイルス性肝炎又は中毒性肝炎を包含する肝炎を有する患者に投与してもよい。
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、治療有効量のrAAVベクター粒子又は細胞を含む。本発明の文脈において、治療有効量は、そのような用語が適用される障害若しくは状態を逆転させるか、軽減するか若しくはその進行を阻害するため、又はそのような用語が適用される障害若しくは状態の1つ若しくは複数の症状を逆転させるか、軽減するか若しくはその進行を阻害するために十分な用量を指す。「有効用量」又は「有効投薬量」という用語は、所望される効果を達成するか、又は少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。
有効用量は、要因、例えば使用される組成物、投与の経路、考慮されている個体の身体的特徴、例えば性別、年齢及び体重、同時的な医薬品、並びに当業者が認識する他の要因に依存して決定及び調整される。
本発明の様々な実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容される担体及び/又は媒体を含む。
「医薬的に許容される担体」は、適切なように、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じない媒体を指す。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、被包性材料又は製剤助剤を指す。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のために医薬的に許容される媒体を含有する。これらは、特に、等張の、無菌の、食塩水溶液(リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等若しくはそのような塩の混合物)、又は、場合に依存して、滅菌水若しくは生理食塩水の添加で、注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥、特にフリーズドライ組成物であってもよい。
注射可能な用途のために好適な薬学的形態は、無菌水性溶液又は懸濁液を包含する。溶液又は懸濁液は、ウイルスベクターと適合性であり、及びウイルスベクター粒子が標的細胞に侵入することを予防しない添加剤を含んでもよい。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流体でなければならない。それは、生産及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用から保護されなければならない。適切な溶液の例は、緩衝剤、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)又はリンゲル乳酸塩である。
本発明はまた、標的組織、特に筋肉組織中での治療用遺伝子の発現により疾患を処置する方法であって、患者に治療有効量の上記されている医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明はまた、筋肉障害を処置する方法であって、治療有効量の上記されている医薬組成物を患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明の更なる態様は、筋肉障害、特に本開示による神経筋遺伝性疾患の処置のための医薬の生産における、本開示によるrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物の使用に関する。
本発明の更なる態様は、医薬としての及び/又は遺伝子療法における使用のための、特に筋肉障害、特に本開示による神経筋遺伝性疾患の処置における使用のための、本開示によるrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物に関する。
本発明の更なる態様は、筋肉障害、特に本開示による神経筋遺伝性疾患の処置のための本開示によるrAAVベクター粒子、細胞、医薬組成物の使用に関する。
本発明の更なる態様は、活性成分として本開示によるrAAVベクター粒子、細胞を含む、筋肉障害、特に本開示による神経筋遺伝性疾患の処置のための医薬組成物に関する。
本発明の更なる態様は、筋肉障害、特に本開示による神経筋遺伝性疾患を処置するための、本開示によるrAAVベクター粒子、細胞を含む医薬組成物に関する。
本明細書において使用される場合、「患者」又は「個体」という用語は、予防的処置又は治療的処置のいずれかを与えられるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。好ましくは、本発明による患者又は個体はヒトである。
「処置」、又は「処置する」は、本明細書において使用される場合、疾患、又は疾患の任意の症状の治癒、回復、軽減、緩和、変更、治療、寛解、改善又は影響を目的とした、患者への治療剤若しくは治療剤の組合せの適用若しくは投与、又は疾患、特に筋肉障害を有する患者からの単離された組織若しくは細胞株への前記治療剤の適用若しくは投与として定義される。特に、「処置する」又は「処置」という用語は、疾患と関連付けられる少なくとも1つの有害な臨床症状を低減させるか又は軽減することを指す。
「処置」又は「処置する」という用語はまた、治療剤を予防的に投与する文脈において本明細書において使用される。
本発明の医薬組成物は、一般に、公知の手順にしたがって、患者において治療効果を誘導するために有効な投薬量及び時間的期間において投与される。医薬組成物は、任意の好都合な経路により投与されてもよく、これは例えば、非限定的な方式において、注入又はボーラス注射によるもの、上皮又は粘膜皮膚裏(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)を通じた吸収によるものである。投与は、全身、局所又は局所と組み合わせた全身のものであることができ;全身は非経口及び経口を包含し、局所は局所及び局所領域を包含する。全身投与は、好ましくは、非経口、例えば皮下(SC)、筋肉内(IM)、血管内、例えば静脈内(IV)若しくは動脈内;腹腔内(IP);皮内(ID)、硬膜外又はその他である。投与は、例えば、注射又は灌流によるものであってもよい。一部の好ましい実施形態において、投与は、非経口、好ましくは血管内、例えば静脈内(IV)又は動脈内である。非経口投与は、有利には、注射又は灌流による。
本開示の様々な実施形態は互いと組合せ可能であり、本開示は本開示の実施形態の様々な組合せを包含する。
本発明の実施は、他に指し示されなければ、当技術分野の技術的範囲内である従来技術を用いる。そのような技術は文献において十分に説明されている。
本発明はこれより、添付の図面を参照して、限定的ではない以下の実施例を用いて例示される。
AAV9.rh74の改変されたカプシドを注射されたマウスの肝臓におけるルシフェラーゼ導入遺伝子発現の比較 5週齢のB6アルビノ雄マウス(n=4)に、本発明による改変されたAAV9.rh74カプシド:AAV9-rh74-HB-P1(HB-P1)を含むrAAVベクター、及び先行技術によるAAV9-rh74-K-P1(K-P1)を含むrAAVベクター、並びに対照(AAV9;AAV9-rh74)を、静脈内注射した(4x1010vg/マウス)。肝臓組織溶解物のインビトロでのルシフェラーゼアッセイによって、肝臓におけるルシフェラーゼ発現を分析した。データは、タンパク質1μg当たりの相対発光単位(RLU)の平均値±SEMとして示す(n=4)。統計解析はダネットの多重比較検定によって行った(*p値≦0.05)。 AAV9.rh74の改変されたカプシドを注射されたラットの筋肉におけるカルパイン3導入遺伝子発現の比較 1ヶ月齢のラットに、筋肉特異的プロモーターの制御下においてカルパイン3(C3)導入遺伝子を発現するrAAVベクターであって、本発明による改変されたAAV9.rh74カプシド(AAV9-rh74-HB-P1-C3)を含むか又は先行技術による(AAV9-rh74-K-P1-C3)rAAVベクター、及びAAV9対照(AAV9-C3)を、静脈内注射した(4x1010vg/ラット)。カルパイン3発現を、内部標準としてアクチンを使用して、筋肉生検のインビトロでのウェスタンブロットアッセイによって分析した。A.ヒラメ筋(SOL)のウェスタンブロット。B.ヒラメ筋におけるアクチンと比較したカルパイン3の相対シグナル。WT:正常なラット。KO:カルパイン3欠損ラット。 AAV9.rh74の改変されたカプシドを注射されたマウスの筋肉におけるベクターゲノムコピー数の、肝臓におけるベクターゲノムコピー数に対する比の比較 5週齢のB6アルビノ雄マウス(n=4)に、本発明による改変されたAAV9.rh74カプシド:AAV9-rh74-AAA-P1-SG(HB-P1)を含むrAAVベクター;先行技術によるAAV9-rh74-GQSG-P1-AQAA(K-P1)を含むrAAVベクター;及び陰性対照AAV9-rh74-AKA-P1-AKを、静脈内注射した(1x1011vg/マウス)。マルチプレックスqPCRによって、ベクターゲノムコピー数(VCN)を筋肉(前脛骨筋(TA);腰筋)及び肝臓において定量し、筋肉の肝臓に対するVCN比を決定した。A.VCN比 TA/肝臓。B.VCN比 腰筋/肝臓。 AAV9及びAAV8の改変されたカプシドを注射されたマウスの筋肉におけるベクターゲノムコピー数の、肝臓におけるベクターゲノムコピー数に対する比の比較 5週齢のB6アルビノ雄マウス(n=4)に、本発明によるAAV8及びAAV9の改変されたカプシド(AAV8-AAA-P1-SG及びAAV9-AAA-P1-SG)を含むrAAVベクター、並びに対照(AAV9、AAV8)を、静脈内注射した(1x1011vg/マウス)。マルチプレックスqPCRによって、ベクターゲノムコピー数(VCN)を筋肉(前脛骨筋(TA);腰筋)及び肝臓において定量し、筋肉の肝臓に対するVCN比を決定した。本発明によるP1改変されたAAV8カプシド。 AAV9及びAAV8の改変されたカプシドを注射されたマウスの筋肉におけるベクターゲノムコピー数の、肝臓におけるベクターゲノムコピー数に対する比の比較 5週齢のB6アルビノ雄マウス(n=4)に、本発明によるAAV8及びAAV9の改変されたカプシド(AAV8-AAA-P1-SG及びAAV9-AAA-P1-SG)を含むrAAVベクター、並びに対照(AAV9、AAV8)を、静脈内注射した(1x1011vg/マウス)。マルチプレックスqPCRによって、ベクターゲノムコピー数(VCN)を筋肉(前脛骨筋(TA);腰筋)及び肝臓において定量し、筋肉の肝臓に対するVCN比を決定した。本発明によるP1改変されたAAV9カプシド。
カプシド改変されたrAAVベクターの構築及び体内分布
ペプチドP1改変されたAAVカプシドを、本発明にしたがって、挿入部位の上流及び下流のAAVカプシドアミノ酸配列の改変を伴わずに構築した(本明細書においてHB-P1と命名した)。比較のために、ペプチドP1改変されたAAVカプシドを、先行技術にしたがって、挿入部位の上流及び/又は下流のAAVカプシドアミノ酸配列の改変を伴って構築した(本明細書においてK-P1と命名した)。
1.材料及び方法
1.1.プラスミド構築
ペプチドP1によって改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシドを含有するプラスミドは、WO2019/193119において開示される、AAV2 Rep及びハイブリッドAAV9.rh74カプシド(Cap9rh74)遺伝子を含有するプラスミドpRep2-Cap9rh74に由来した。プラスミドpRep2-Cap9rh74-HB-P1は、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドの589位(例えば、N589とA590との間)において挿入された、AAA及びSGにより隣接されたP1ペプチド配列(AAARGDLGLSSG;配列番号5)を含む改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシド(Cap9rh74-HB-P1又はCap9rh74-AAA-P1-SG)をコードする。対照プラスミドpRep2-Cap9rh74-AKA-P1-AKは、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドの589位(例えば、N589とA590との間)において挿入された、N末端及びC末端においてそれぞれ、小さくないアミノ酸の配列AKA及びAKによって隣接されたP1ペプチド配列(AKARGDLGLSAK;配列番号39)を含む改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシド(Cap9rh74-AKA-P1-AK)をコードする。
プラスミドpRep2-Cap9-HB-P1(Cap9-AAA-P1-SG)は、AAV9カプシドの588位(例えば、Q588とA589との間)において挿入された、AAA及びSGにより隣接されたP1ペプチド配列(AAARGDLGLSSG;配列番号5)を含む改変されたハイブリッドAAV9カプシド(Cap9-HB-P1又はCap9-AAA-P1-SG)をコードする。プラスミドpRep2-Cap8-HB-P1(Cap8-AAA-P1-SG)は、AAV8カプシドの590位(例えば、N590とT591との間)において挿入された、AAA及びSGにより隣接されたP1ペプチド配列(AAARGDLGLSSG;配列番号5)を含む改変されたハイブリッドAAV8カプシド(Cap8-HB-P1又はCap8-AAA-P1-SG)をコードする。
Kienle EC(学位論文、2014;以前に引用した)において開示される、AAVカプシドへのペプチド挿入戦略にしたがって得た、ペプチドP1によって改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシド(Cap9rh74-K-P1又はCap9rh74-GQSG-P1-AQAA)をコードするプラスミドpRep2-Cap9rh74-K-P1を、本発明によるpRep2-Cap9rh74-HB-P1との比較のための対照として使用する。Cap9rh74-K-P1構築物は、WO19207132において説明される戦略にしたがって、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドの589位において挿入された、P1ペプチド配列を含む。前記戦略は、最初に隣接配列GQSG及びAQAAを改変し、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドの挿入部位に隣接する最初の587QQN589及び590AAP592配列を置換し、第2に、P1ペプチドを挿入することからなる。したがって、Cap9rh74-K-P1構築物は、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドのQ586とI593との間に挿入された、P1含有配列GQSGRGDLGLSAQAA(配列番号9)を含む。
P1ペプチド挿入を含有するMscI断片を、各Cap9rh74構築物(GENEWIZ社);Cap9rh74-HB-P1(配列番号10)、Cap9rh74-K-P1(配列番号11)及びCap9rh74-AKA-P1-AK(配列番号40)について合成し、pUCプラスミドにクローニングした。P1ペプチド挿入を含有するAfeI-BsiWI断片を、Cap9及びCap8構築物(GENEWIZ社);Cap9-HB-P1(配列番号41)及びCap8-HB-P1(配列番号42)について合成した。その後、断片を、InFusionクローニングシステムを使用してサブクローニングして、pRep2-Cap9rh74、pRep2-Cap9及びpRep2-Cap8プラスミドにおける対応する領域を置換した。細菌クローンの配列を確証し、グリセロール液として-80℃において、及び精製プラスミドとして-20℃において保存した。Cap9rh74-HB-P1遺伝子は、配列番号7のヌクレオチド配列を有し、配列番号6のアミノ酸配列のAAV9-rh74-HB-P1カプシドタンパク質をコードする。Cap9rh74-K-P1遺伝子は、配列番号12のヌクレオチド配列を有し、配列番号14のアミノ酸配列のAAV9-rh74-K-P1カプシドタンパク質をコードする。
1.2. rAAV製造
筋肉特異的プロモーターの制御下においてCMVプロモーター又はカルパイン3の制御下にてGFP-ルシフェラーゼ導入遺伝子を含有する、改変された及び改変されていないAAV9rh74、AAV9、AAV8カプシドを含む組換えAAV(rAAV)、並びにAAV9、AAV9rh74、AAV8対照を、Ayuso E.ら(Hum. Gene Ther. 2014、25、977～987頁)において説明されるようにGenethon社において製造した。ウイルスゲノムを、Rohrら(J. Virol. Methods、2002、106、81～88頁)において説明されるように定量する。rAAV力価を、ウイルスゲノムコピー数(vg)として表す。
1.3 インビボでの実験
AAV9rh74動物を、フランス及び欧州の法制に沿って取り扱った。動物についての手技は、地元の倫理委員会により、及び高等教育研究革新省庁(Ministry of Higher Education, Research and Innovation)(APAFIS#19736)により承認された。5週齢のB6アルビノマウス(1群当たりn=4又は5)に、GFP-ルシフェラーゼを発現するrAAVを、4x1012vg/kg又は1x1013vg/kgの用量において静脈内(IV)注射によって投与した。注射の14日後にインビボでの生物発光画像の取得を行った。注射の3週間後に、マウスを頸椎脱臼により致死させ、いくつかの筋肉及び臓器:前脛骨筋、腰筋、横隔膜、心臓、肝臓、腎臓、肺及び副腎を試料として採取した。1ヶ月齢のSprague Dawleyラット(1群当たりn=4)に、カルパイン3を発現するrAAV(AAV9-ms-C3(9-C3)、AAV9-rh74-K-P1_C3(K-P1-C3);AAV9-rh74-HBP1_C3(HBP1-C3)を、1xe14vg/kgの用量において静脈内注射によって投与した。注射の2ヶ月後に、ヒラメ筋を試料として採取した。
1.4 インビボでの生物発光
注射の14日後にインビボでの生物発光画像の取得を行った。マウスをイソフルランの吸入によって麻酔し、50mg/ml D-ルシフェリン(LifeTechnologies社、カリフォルニア、米国)100μlを腹腔内注射した。インビボでの画像化を、IVIS(登録商標)Lumina Imagingシステム(PerkinElmer社)を使用して行った。
1.5 ベクターコピー数定量
NucleoMag Pathogenキット(Macherey-Nagel社)及びKingFisher Flex器具(ThermoFisher Scientific社)を使用して、試料採取した様々な筋肉及び臓器から、gDNA及びウイルスDNAを抽出した。
Light Cycler 480器具(Roche社)におけるマルチプレックスqPCRによって、Thermo Scientific Absolute qPCR ROX Mix、プライマー(フォワード:CATCAATGGGCGTGGATAGC(配列番号15);リバース:GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA(配列番号16))及びプローブ(ATTTCCAAGTCTCCACCC、FAM(配列番号17))を使用してウイルスゲノムコピーを定量して、ベクターからのCMVプロモーターを検出し、プライマー(フォワード:CTCCAAGCAGATGCAGCAGA(配列番号18);リバース:ATAGCCTTGCGCATCATGGT(配列番号19))及びプローブ(CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA、VIC(配列番号20))を使用してウイルスゲノムコピーを定量して、試料の内部標準としてのRplp0(60S酸性リボソームタンパク質P0)を検出した。
1.6.インビトロでのルシフェラーゼアッセイ
試料を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(cOmpleteTM ULTRA Tablets, Mini EDTA-free, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Tablets REF:5892791001)を含む溶解緩衝液(25mMトリス-リン酸、15%のグリセロール、1mM DTT、1mM EDTA、8mM MgCl2、0.2%のTritonX-100)中で、FastPrep-24 Classic器具(MP Biomedicals社)を使用してホモジナイズした(5m/秒、40秒)。試料を3回の凍結/融解周期にかけた。遠心分離(5分、10000g、+4℃)後、上清10μlを、白色不透明プレートへ移した。EnSpireマルチモードプレートリーダー(PerkinElmer社)、並びにアッセイ緩衝液100μl(溶解緩衝液と同じであるが、TritonX-100を伴わず2nM ATPを伴う、Sigma社、REF:10519979001)及び167μM D-ルシフェリン100μlの配布を可能にするポンピングシステムを使用して、試料のホモジネートからの発光シグナルを測定した。試料のタンパク質の量によって発光シグナルを正規化するための、タンパク質の定量を、Pierce BCAタンパク質アッセイキットを使用して行った。
1.7.カルパイン3ウェスタンブロット
注射した動物の筋肉生検からタンパク質抽出物を調製した。試料採取した様々な筋肉の凍結切片を、EDTA非含有プロテアーゼ阻害剤(cOmplete(商標)ULTRA Tablets, Mini EDTA-free, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Tablets)を含む以下の尿素緩衝液の緩衝液:8M尿素、2Mチオ尿素、3%のSDS、50mMトリス-HCl pH6.8、0.03%のブロモフェノールブルー中に溶解した。Pierce BCAタンパク質アッセイキットを使用して、タンパク質濃度の定量を行った。95℃において10分間の変性後、4～12%のビス-トリスゲル上に20μgをロードした。ニトロセルロース膜への乾燥移行後、カルパイン3に対する抗体(マウス抗体NCL-CALP-12A2、Novocastra社、希釈1:200及びヤギ抗体COP-080049、Operon Biotechnologies社)を使用してウェスタンブロットを行った。膜を一次抗体と共に4℃において一晩インキュベートし、PBS中での3回の洗浄後、二次抗体を室温で1時間インキュベートした。使用した二次抗体は、抗ウサギ、ロバ、抗ウサギ780、希釈1/10000であった。
2.結果
本発明者らは、WO2019/193119において開示されるAAV9-rh74ハイブリッドカプシド(配列番号2)並びにAAV9及びAAV8カプシド血清型における挿入後に、P1ペプチド(RGDLGLS(配列番号1);Michelfelderら、PLoS ONE、2009、4、e5122)の、筋肉における形質導入及び導入遺伝子発現の効率を増加させる能力を試験した。
本発明によるP1改変されたAAV9-rh74ハイブリッドカプシドを、Kienle EC(学位論文、2014;以前に引用した)において開示される、AAVカプシドへのペプチド挿入戦略にしたがって得たP1改変されたAAV9-rh74ハイブリッドカプシドと比較した。簡潔に述べれば、N末端及びC末端においてそれぞれ、AAA及びSGによって隣接されたP1配列を、AAV9-rh74ハイブリッドカプシドの589位(例えば、N589とA590との間)において挿入し、挿入部位の上流及び下流のカプシドアミノ酸配列は改変しなかった。Kienle ECにしたがって調製したP1改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシドにおいて、挿入部位に隣接する587QQN589及び590AAP592配列(それぞれ、挿入部位の上流及び下流)を、それぞれ、GQSG及びAQAAに変更し、その後、ペプチドP1を、ハイブリッドAAV9.rh74カプシドに挿入する。本発明による、得られたP1改変されたハイブリッドカプシドは、本明細書においてCap9rh74-HB-P1又はAAV9-rh74-HB-P1カプシドと命名され、配列番号6のアミノ酸配列を有する。Kienle ECによる、得られたP1改変されたハイブリッドカプシドは、本明細書においてCap9rh74-K-P1又はAAV9-rh74-K-P1カプシドと命名され、配列番号14のアミノ酸配列を有する。N末端及びC末端においてそれぞれ、小さくないアミノ酸の配列、AKA及びAKによって隣接されたP1ペプチド配列を含むP1改変されたハイブリッドAAV9.rh74カプシド(Cap9rh74-AKA-P1-AK)を、陰性対照として試験した。また、本発明によるP1改変されたAAV9及びAAV8カプシドを試験して、他のAAV血清型におけるペプチドP1挿入戦略の効率を評価した。
ペプチド改変されたAAVカプシドの体内分布を評価するために、CMVプロモーターの制御下において導入遺伝子としてP1ペプチド及びGFP-ルシフェラーゼを有する組換えAAV9-rh74、AAV9及びAAV8ベクターを製造し、5週齢のB6アルビノマウスに注射(静脈内)した(4x1010vg/マウス又は1x1011vg/マウス)。
注射の14日後に、インビボでの生物発光画像の取得を行い、注射後21日目に致死させ、組織試料採取を行った。
インビボでの生物発光画像は、以前に説明した先行技術の戦略(「戦略K」)及び本発明の戦略(「戦略HB」)の両方を使用した、AAV9.rh74カプシドにおけるP1ペプチドの付加は、両方の場合において、後肢におけるより高いルシフェラーゼ発現をもたらすことを示す。
しかしながら、様々な組織の溶解物におけるルシフェラーゼ発現分析の結果は、改変されていないカプシドと比較して及びAAV9-rh74-K-P1と比較して、AAV9-rh74-HB-P1カプシドを注射されたマウスの肝臓におけるより低いシグナルを示した(図1及びTable 1(表1))。これは、AAV9-rh74-HB-P1が、AAV9-rh74-K-P1と比較して、肝臓の増加した脱標的化を有することを実証する。
注射されたマウスの様々な臓器におけるベクターコピー数(VCN)分析は、AAV9-rh74-K-P1(AAV9rh74-GQSG-P1-AQAA)と比較したAAV9-rh74-HB-P1(AAV9rh74-AAA-P1-SG)による、骨格筋の肝臓に対する有意に高い(2～3倍)ベクターコピー数の比によって評価されるように、本発明によるP1ペプチド挿入戦略(「戦略HB」)が、先行技術戦略(「戦略K」)と比較して、特に骨格筋における筋肉標的化、及び肝臓の脱標的化を改善することを示す(図3)。対照的に、小さくないアミノ酸の配列(AAV9rh74-AKA-P1-AK)によって隣接されたP1改変されたAAV9.rh74カプシドを含む対照ベクターでは、筋肉における低いベクターコピー数及び肝臓における高いベクターコピー数が観察され、筋肉の肝臓に対する低いベクターコピー数の比をもたらす(図3)。これは、本発明によるP1改変されたAAVカプシドの改善された親和性における、P1ペプチドに隣接する小アミノ酸配列の主要な寄与を実証する。また、本発明によるP1改変されたAAV8及びAAV9カプシドにより、筋肉標的化及び肝臓の脱標的化が観察され、本発明によるペプチドP1挿入戦略(「戦略HB」)は、AAV血清型にかかわらず機能的であることを実証した(図4)。
筋肉におけるAAV9-rh74-K-P1と比較した及び改変されていないAAV9と比較したAAV9-rh74-HB-P1の効率を更に評価するために、筋肉特異的プロモーターの制御下において導入遺伝子としてP1ペプチド及びカルパイン3を有する組換えAAVベクターを製造し、1ヶ月齢のラットに1 10e14vg/kg(4x1010vg/ラット)の用量において注射(静脈内)した。
試料採取後、筋肉をウェスタンブロットに供した。結果は、筋肉に形質導入するために最も有効なベクターはAAV9-rh74-HB-P1であることを示した(図2)。
結論として、本発明者らは、より高い筋肉移行及び肝臓脱標的化を有するペプチド改変されたAAVカプシドを同定し、ペプチドの挿入様式はAAVカプシドの体内分布に影響を与えることを示した。

Claims (15)

  1. カプシドタンパク質配列の2つの連続するアミノ酸の間に筋肉標的化ペプチド挿入を含み、挿入部位の上流及び下流のカプシドタンパク質アミノ酸配列のいかなる改変も含まない、改変されたアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質であって、前記標的化ペプチドが、配列番号1の配列、並びに配列番号1のN末端及びC末端における小アミノ酸の配列を含む、改変されたAAVカプシドタンパク質。
  2. 小アミノ酸の前記配列が、A、G、S、N;T、D及びLから選択される最大5個のアミノ酸;好ましくは配列番号1のN末端におけるG、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA又はALA及びC末端におけるG、SG、AA、TG、GG、SA、AG又はGA;より好ましくはN末端におけるAAA及びC末端におけるSGからなる、請求項1に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  3. 前記筋肉標的化ペプチドが、9個のアミノ酸～最大25、20又は15個のアミノ酸の配列からなる、請求項1又は2に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  4. 前記挿入が、可変領域IV、V又はVIII内に;好ましくはAAV2カプシドタンパク質配列における番号付けにしたがって587位、588位、589位、453位、520位、584位及び585位から選択される位置に存在する、請求項1から3のいずれか一項に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  5. AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74及びAAV9.rh74;好ましくはAAV9又はAAV9.rh74からなる群から選択されるAAV血清型のものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  6. AAV9.rh74からの改変されたAAVカプシドタンパク質であり、589位において前記筋肉標的化ペプチド挿入を含み;好ましくは、前記標的化ペプチドが、配列番号5、21、23、25、27、29、31、33、35及び37;より好ましくは配列番号5からなる群から選択される、請求項5に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  7. 配列番号6の配列、及び前記配列と少なくとも85%、87%、88%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む、請求項6に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  8. 筋肉、特に心臓及び/若しくは骨格筋に対する増加した親和性、並びに/又は肝臓に対する減少した親和性を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質。
  9. 請求項1から8のいずれか一項に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド;好ましくは配列番号7の配列、又は前記配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド。
  10. 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えプラスミド。
  11. 請求項1から8のいずれか一項に記載の改変されたAAVカプシドタンパク質を含む、目的の対象の遺伝子をパッケージングしたAAVベクター粒子。
  12. 前記目的の対象の遺伝子が、治療用遺伝子;治療用タンパク質又はペプチド、例えば治療用抗体又は抗体断片及びゲノム編集酵素をコードする遺伝子;並びに治療用RNA、例えば干渉RNA、ゲノム編集用のガイドRNA及びエクソンスキッピングする能力を有するアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項11に記載のAAVベクター粒子。
  13. 治療有効量の請求項11若しくは12に記載のAAVベクター粒子、又は請求項11若しくは12に記載の前記AAVベクター粒子により安定して形質導入された細胞を含む、医薬組成物。
  14. 遺伝子療法、好ましくは筋肉疾患を処置するための遺伝子療法における医薬としての使用のための、請求項13に記載の医薬組成物。
  15. ジストロフィノパチー及び肢帯型筋ジストロフィーから選択される筋肉疾患の原因である遺伝子;好ましくはDMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB及びSGCGを含む群から選択される遺伝子を標的化する、請求項14に記載の使用のための医薬組成物。
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