CN116096431A - 肽修饰的aav衣壳 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有改进的向性，特别是增加的肌肉向性和/或降低的肝脏向性的肽修饰的AAV衣壳。本发明还涉及包装目标基因的衍生的重组AAV载体颗粒，及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗肌肉疾病。
Description
技术领域
本发明涉及具有改善的向性，特别是增加的肌肉向性和/或降低的肝脏向性的肽修饰的AAV衣壳。本发明还涉及包装目标基因的衍生的重组AAV载体颗粒，及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗肌肉疾病。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)载体广泛用于体内基因转移，并且目前正在进行使用AAV载体的临床试验来治疗许多疾病。
AAV是属于细小病毒科内的依赖细小病毒属的非致病性病毒。AAV是由直径约26nm的衣壳和4.7kb的单链DNA基因组组成的无包膜病毒。基因组携带两个基因，rep和cap，侧翼是两个命名为反向末端重复序列(ITR)的回文区域，其用作病毒复制起点和包装信号。cap基因编码三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，它们通过从不同起始密码子的可变剪接和翻译组成二十面体AAV衣壳。VP1、VP2和VP3共享相同的C-末端，即整个VP3。使用AAV2有参考，VP1具有735个氨基酸序列(GenBank登录号YP_680426.1，于2018年8月13日登录)；VP2(598个氨基酸)起始于苏氨酸138(T138)，以及VP3(533个氨基酸)起始于甲硫氨酸203(M203)。三种不同的VP相对于AAV2衣壳的比例为1VP1:1VP2:10VP3。所有AAV血清型的衣壳由60个VP单体与约50个拷贝的VP3、5个拷贝的VP2和5个拷贝的VP1组装。rep基因编码病毒复制Rep78、Rep68、Rep52和Rep40所需的四种蛋白。重组AAV载体包封侧翼为ITR的rAAV基因组，其中治疗性基因表达盒取代AAV蛋白质编码序列。
组织特异性由衣壳血清型决定，并且通常使用的分离自人和非人灵长类的AAV血清型可以比其它的(如肌肉组织中的AAV6、AAV8、AAV9和AAV-rh74)更有效地转导特定器官。
然而，所有通常使用的天然存在的AAV血清型具有在肝脏内积聚的倾向。这引起问题，特别是当AAV载体通过全身途径施用时。首先，目的在于在肌肉中表达的转基因可能对肝脏具有毒性作用。其次，AAV载体进入肝脏减少了可用于肌肉或神经组织的载体量。因此，需要较高剂量的AAV载体。这增加了诱导肝毒性的可能性和载体生产的成本。
WO2019/193119公开了杂合AAV9.rh74衣壳，其有利地结合了与AAV9和AAVrh74亲本血清型相比显著降低的肝向性和骨骼肌和心肌中高水平的基因转导效率。
已经产生了在各种AAV血清型表面上展示短随机肽的AAV衣壳变体文库，以筛选具有改变的细胞特异性和/或转导效率的基因治疗载体(
et al.,MolecularTherapy,April 2020,28,1017-1032；Kienle EC(Dissertation for the degree ofDoctor of natural Sciences,Combined Faculties for the Natural Sciences andfor Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg,Germany,2014；WO2019/207132；Michelfelder et al.,PLoS ONE,2009,4,e5122；Review in
etal.,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2019,12,248-)。
在原代乳腺肿瘤细胞上体外选择的展示肽RGDLGLS(SEQ IDNO:1或P1)的衣壳修饰的AAV2载体在体内不转导原代乳腺肿瘤(Michelfelder et al.,引述)。P1与AAV1、AAV2、AAV7至9和AAVrh10结合提高了体外神经元细胞转导(Kienle EC,引述)。据报道，展示肽P1的AAV9载体在人星形胶质细胞培养物中表现良好，并且具有增强的肌肉向性以及从肝脏去靶向(
et al.,引述；WO2019/207132)。
在所有这些参考文献中，细胞靶向肽插入策略涉及插入位点上游和下游AAV衣壳序列的修饰。所述插入策略的目的是促进AAV衣壳变体文库的克隆。插入AAV衣壳中的细胞靶向肽侧翼的氨基酸的数目和性质对体外载体转导效率的影响显示是不可预测的，因为肽具有特异性(
et al.,引述)。
用全身递送的AAV载体有效、选择性和安全地转导肌肉的能力将有益于许多人类疾病的基因治疗。
发明概述
本发明人意外地表明，在AAV衣壳中插入肽P1而不修饰插入位点上游和下游的衣壳序列可进一步改进肌肉向性和肝脏去靶向。
因此，本发明涉及修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其在衣壳蛋白序列的两个连续氨基酸之间包含肌肉靶向肽插入，并且在插入位点的上游和下游不对衣壳蛋白氨基酸序列进行任何修饰，其中靶向肽包含序列SEQ ID NO:1和在SEQ ID NO:1的N末端和C末端的小氨基酸序列。
在一些实施方案中，小氨基酸序列由最多五个选自A、G、N、T、D、L和S的氨基酸组成；优选地，N末端的G、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA或ALA和C末端的G、SG、AA、TG、GG、SA、AG或GA；更优选SEQ ID NO:1的N末端的AAA和C末端的SG。
在一些实施方案中，肌肉靶向肽由9个氨基酸至最多25、20或15个氨基酸的序列组成。
在一些实施方案中，根据AAV2衣壳蛋白序列中的编号，所述插入在可变区IV、V或VIII中；优选在选自第587、588、589、453、520、584和585位的位置。
在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自选自下组的AAV血清型：AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74和AAV9.rh74；优选AAV9或AAV9.rh74。
在一些优选实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自AAV9.rh74并且在第589位处包含肌肉靶向肽插入；优选地，其中靶向肽选自下组：SEQ ID NO:5、21、23、25、27、29、31、33、35和37；优选SEQ ID NO:5。
在一些优选实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白包含选自下组的序列：序列SEQ IDNO:6和与所述序列具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。
在一些优选实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白对肌肉，特别是心肌和/或骨骼肌具有增加的向性，和/或对肝脏具有降低的向性。
本发明还涉及编码根据本公开的修饰的AAV衣壳蛋白的多核苷酸；优选包含序列SEQ ID NO:7或与所述序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
本发明还涉及包含根据本公开的多核苷酸的重组质粒。
本发明的另一方面涉及包装目标基因的AAV载体颗粒，其包含根据本公开的修饰的AAV衣壳蛋白。
在一些优选的实施方案中，目标基因选自下组：治疗性基因；编码治疗性蛋白质或肽如治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶的基因；以及编码治疗性RNA如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的基因。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的根据本公开的AAV载体颗粒，或被根据本公开的所述AAV载体颗粒稳定转导的细胞。
本发明还涉及根据本公开的药物组合物，其用作基因治疗中的药物，优选用于治疗肌肉疾病。
在一些优选实施方案中，所述药物组合物靶向负责选自肌萎缩蛋白病和肢带肌营养不良的肌肉疾病的基因；优选靶向选自下组的基因：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。
发明详述
修饰的AAV衣壳蛋白
本发明涉及修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其在衣壳蛋白序列的两个连续氨基酸之间包含肌肉靶向肽插入，其中所述靶向肽包含序列SEQ ID NO:1(RGDLGLS)和在SEQID NO:1的N末端和C末端的小氨基酸序列，并且所述插入不修饰插入位点上游和下游的衣壳蛋白氨基酸序列。
序列RGDLGLS对应于现有技术中命名为P1的肽的序列。
根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白是功能性AAV衣壳，其能够形成重组AAV载体颗粒，所述颗粒转导细胞、组织或器官，特别是目标细胞组织或器官(靶细胞、组织或器官)，并在所述细胞、组织或器官，特别是靶细胞组织或器官中表达转基因。此外，与衍生它的相应的未修饰的AAV衣壳蛋白和相应的根据现有技术的修饰的AAV衣壳蛋白(例如，其中肽P1插入修饰了插入位点上游和下游的AAV衣壳蛋白序列)相比，根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白具有改进的向性。
如本文所用，术语“向性”是指存在于重组AAV载体颗粒中的AAV衣壳蛋白转导一些特定类型的细胞、组织或器官的能力(例如细胞或组织向性)。与如上所公开的未修饰的衣壳或根据现有技术的修饰的衣壳相比，具有改进向性的修饰的AAV衣壳蛋白可对至少一种靶细胞、组织或器官具有增加的向性和/或对至少一种脱靶细胞、组织或器官具有降低的向性(或去靶向)。增加的向性特别是指与未修饰的AAV衣壳蛋白相比，至少一种靶细胞、组织或器官中的转基因表达水平增加至少1.5倍，优选3、5、10、50、100倍或更多，并且与现有技术修饰的AAV衣壳蛋白相比，增加至少1.2；1.3；1.4；1.5；1.6；1.7；1.8；1.9；2倍或更多。去靶向特别是指与未修饰的AAV衣壳蛋白相比，至少一种脱靶细胞、组织或器官中的转基因表达水平降低至少1.5倍，优选3、5、10、50、100倍或更多，并且与现有技术修饰的AAV衣壳蛋白相比，降低至少1.5倍，优选3、5、10倍或更多。由于其改进的向性，根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白具有改进的生物分布。这意味着它明显更好地靶向限定的组织(靶组织)、组织(例如骨骼肌和/或心脏)或器官(靶组织或器官)组，而不增加其他(非靶)组织的靶向(例如改进的特异性)和/或它靶向具有较低功效(组织去靶向，例如肝脏去靶向)的特定组织(非靶或脱靶组织或器官)，通常降低不希望的毒性。
根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白对特定类型细胞、组织或器官的向性可以通过使用本领域熟知的标准测定法(如本申请实施例中公开的那些)测量包含修饰的AAV衣壳蛋白的AAV载体颗粒转导所述特定类型细胞、组织或器官或在所述特定类型细胞、组织或器官中表达转基因的能力来测定。例如，载体转导或转基因表达通过在动物模型(如小鼠模型)中局部或全身施用携带修饰的AAV衣壳蛋白的AAV载体颗粒来测定，所述动物模型是本领域熟知的并在本申请的实施例中公开。包含相应的未修饰的AAV衣壳蛋白和相应的根据现有技术的修饰的AAV衣壳蛋白的AAV载体用于比较。载体转导可通过本领域熟知的标准测定法(如实时PCR测定法)测量每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数来测定。转基因表达有利地使用报告基因(如萦光素酶或萦光蛋白(GFP或其他))通过本领域熟知的标准测定(如体内或体外定量生物发光或体内或体外萦光测定)来测量。
在下文的描述中，氨基酸残基用标准的单字母氨基酸代码表示。
“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”或“至少一个”在本文中可互换使用；除非另外规定，否则“或”意指“和/或”。
如本文所用，术语“肌肉”是指心肌(即心脏)和骨骼肌。术语“肌肉细胞”是指肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。根据骨骼肌肉在机体中的解剖位置将其分为不同的组。可以在小鼠胫骨肌(TA)、趾长伸肌(EDL)、四头肌(Qua)、腓肠肌(Ga)、比目鱼肌(Sol)、三头肌、二头肌和/或膈膜中；特别是在小鼠胫骨肌(TA)和膈膜肌中测量根据本发明的杂合AAV衣壳针对不同骨骼肌群的向性。表述“肌肉向性”指的是心脏和身体中存在的各种骨骼肌的向性。
如本文所用，“肌肉靶向肽”是指结合肌肉细胞并在体内将携带所述肽的衣壳修饰的rAAV载体导向或靶向肌肉细胞和组织的肽。
根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白是重组蛋白。
如本文所用，“序列”是指1个氨基酸或至少2个连续氨基酸。
在本说明书中，在AAV衣壳蛋白序列的给定位置的插入是指在该位置的氨基酸残基之后的插入。
术语“同一性”指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，那么相应的分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共有的匹配位置数除以比较的位置数并乘以100。通常，当两个序列进行比对以给出最大的同一性的方式时，进行比较。可以通过使用例如GCG(遗传学计算机组，GCG软件包程序手册，第7版，麦迪逊，威斯康星州)堆积程序或任何序列比较算法(如BLAST、FASTA或CLUSTALW)进行比对来计算同一性。
在一些实施方案中，根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白对肌肉，特别是心肌和/或骨骼肌具有增加的向性，和/或对肝脏具有降低的向性(肝脏去靶向)。与衍生它的相应的未修饰的AAV衣壳蛋白和相应的修饰的AAV衣壳蛋白(其中肌肉靶向肽插入修饰了插入位点前后的AAV衣壳蛋白序列(现有技术的修饰的AAV衣壳))相比，根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白的向性得到改进。
肌肉靶向肽通常由最多30个氨基酸的序列组成。靶向肽可以由9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸组成。在一些实施方案中，肌肉靶向肽由最多25、20或15个氨基酸的序列组成。优选地，靶向肽由12、13、14或15个氨基酸的序列组成。
将肌肉靶向肽插入暴露于衣壳表面的位点。AAV衣壳表面上暴露的位点是本领域公知的，并且具体包括在突起顶部形成环的可变区(VR)，例如VR-IV、-V和–VIII(综述于
et al.,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2019,12,248-)。根据AAV8衣壳蛋白序列中的编号，VR-IV对应于Y445至A476(广义定义)或Q451至L462(狭义定义)；VR-V对应于C485至G515(广义定义)或R490至T509(狭义定义)；VR-VIII对应于I581至L604(广义定义)或L586至I595(狭义定义)。根据AAV2衣壳蛋白序列中的编号，肽插入位点有利地位于AAV衣壳表面上合适暴露的共同VP3区的位点，例如第587、588、589、453、520(与584结合)、584和585位。所述肽插入位点通过参考AAV2或AAV8衣壳氨基酸序列来指示。使用本领域熟知的标准蛋白质序列比对程序，例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等，将任何其它AAV衣壳序列与AAV2或AAV8衣壳序列进行序列比对后，本领域技术人员可以容易地获得其它AAV衣壳序列中肽插入位点的相应位置。
用于AAV血清型的优选插入位点包括AAV1中的第590位；AAV2中的第587或588位；AAV3或AAV4中的第586位；AAV5中的第575位；AAV6中的第585位；AAV8中的第585或590位；AAV9中的第588或589位；AAV9.rh74中的第589位。
修饰的AAV衣壳蛋白可以在AAV衣壳蛋白的不同位点包含一个或多个肌肉靶向肽插入。
根据本发明，SEQ ID NO:1的N末端和C末端的小氨基酸序列是与SEQ ID NO:1的N末端和C末端直接相邻的侧翼序列。小氨基酸具有带小空间位阻的侧链，通常选自H或可被一个或多个甲基、羧基、羟基和/或胺基取代的C1-C2烷基；优选地，侧链由C、H、N和O原子组成和/或不包含环状基团。小氨基酸可以是中性的和/或柔性的。优选地，小氨基酸选自下组：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)和亮氨酸(L)；更优选A、G、S、T和L。优选地，侧翼序列由最多5个氨基酸(1、2、3、4或5)组成，它们可以相同或不同；更优选由2-5个氨基酸(2、3、4或5)组成，它们可以相同或不同。N末端和C末端侧翼序列有利地选自下组：G、SG、TG AA、GG、SA、AG、GA、AAA、GST、SGS、SGA、AGA、GAA和ALA；优选N末端中的G、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA或ALA和C末端中的G、SG、AA、TG、GG、SA、AG或GA。在一些更优选的实施方案中，肌肉靶向肽在SEQ ID NO:1的N末端包含AAA，并在C末端包含SG。
修饰的AAV衣壳蛋白可衍生自任何天然或人工AAV衣壳血清型，包括杂合血清型和变异血清型。可以衍生修饰的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2i8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80、AAV3B和AAV9.rh74(如WO2019/193119中所公开)。在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自选自下组的AAV血清型：AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74和AAV9.rh74。在一些优选实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自AAV8、AAV9或AAV9.rh74；或来自AAV9或AAV9.rh74，仍更优选AAV9.rh74。AAV9衣壳特别对应于2004年6月24日访问的氨基酸序列GenBank登录号AY530579.1。AAV9.rh74衣壳对应于可由SEQ ID NO：3的CDS编码的氨基酸序列SEQ IDNO：2。肌肉靶向肽有利地插入AAV8的第585或590位、AAV9的第588或589位或AAV9.rh74的第589位。
在一些优选实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自AAV9.rh74并且在AAV9.rh74衣壳蛋白的第589位处包含肌肉靶向肽插入。
在一些优选实施方案中，靶向肽包含选自下组的序列或由其组成：AAARGDLGLSSG(SEQ ID NO:5)；AAARGDLGLSAA(SEQ IDNO:21)；GSTRGDLGLSTG(SEQ ID NO:23)；GRGDLGLSG(SEQ IDNO:25)；SGSRGDLGLSGG(SEQ ID NO:27)；SGARGDLGLSSA(SEQ ID NO:29)；SGARGDLGLSAG(SEQ ID NO:31)；AGARGDLGLSSG(SEQ ID NO:33)；GAARGDLGLSGA(SEQ ID NO:35)；和ALARGDLGLSAG(SEQ ID NO:37)；优选SEQ ID NO:5、21、23、27、29、31、33、35和37；更优选SEQ ID NO:5。在一些更优选的实施方案中，将包含前述序列中任一项或由其组成的靶向肽插入AAV8、AAV9或AAV9.rh74衣壳；优选AAV9.rh74衣壳中。靶向肽有利地插入AAV8的第590位、AAV9的第588位或AAV9.rh74的第589位。
在一些更优选的实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:6的序列和与所述序列具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；更优选地，其包含SEQ ID NO:6的序列或由SEQ ID NO:6的序列组成。根据本发明的变体在肌肉靶向肽序列和插入位点前后的5个氨基酸序列；优选10个氨基酸序列中没有突变。
在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白是修饰的VP1、VP2或VP3蛋白。在一些具体实施方案中，修饰的VP1、VP2或VP3蛋白衍生自SEQ ID NO:6。VP2对应于SEQ ID NO:6的从T138到末端的氨基酸序列。VP3对应于SEQ ID NO:6的从M204到末端的氨基酸序列。
在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白是嵌合VP1或VP2蛋白，其包含插入AAV血清型的共同VP3区和来自其它AAV血清型(例如不同于VP3区血清型的AAV血清型)的VP1特异性和/或VP2特异性N末端区的肌肉靶向肽。在一些具体实施方案中，嵌合VP1或VP2蛋白衍生自SEQ ID NO:6。
用于AAV载体生产的多核苷酸、载体和用途
本发明的另一方面是编码可表达形式的重组修饰的AAV衣壳蛋白的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA、RNA或合成或半合成核酸。
在一些实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，特别是包含靶向肽的修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，所述靶向肽包含选自下组的序列或由其组成：AAARGDLGLSSG(SEQ ID NO:5)；AAARGDLGLSAA(SEQ ID NO:21)；GSTRGDLGLSTG(SEQ ID NO:23)；GRGDLGLSG(SEQ ID NO:25)；SGSRGDLGLSGG(SEQ ID NO:27)；SGARGDLGLSSA(SEQ IDNO:29)；SGARGDLGLSAG(SEQ ID NO:31)；AGARGDLGLSSG(SEQ IDNO:33)；GAARGDLGLSGA(SEQID NO:35)；和ALARGDLGLSAG(SEQ ID NO:37)；优选SEQ ID NO:5、21、23、27、29、31、33、35and 37；还更优选SEQ ID NO:5。所述多核苷酸优选包含选自下组的序列：SEQ ID NO:7、22、24、26、28、30、32、34、36和38；更优选SEQ ID NO:7、22、24、28、30、32、34、36和38；还更优选SEQ ID NO:7。
在一些优选实施方案中，多核苷酸编码修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，其包含SEQ IDNO:6以及与所述序列具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的序列，或由其组成。
在一些更优选的实施方案中，多核苷酸包含序列SEQ ID NO:7或与所述序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。序列SEQ ID NO:7编码SEQ IDNO:6的修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白。多核苷酸是功能性多核苷酸序列，这意味着多核苷酸的序列编码根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，多核苷酸还编码可表达形式的AAV复制酶(Rep)蛋白，优选来自AAV2的Rep。
有利地将多核苷酸插入重组载体中，所述重组载体以非限制性方式包括由染色体、非染色体、合成或半合成核酸组成的线性或环状DNA或RNA分子，例如特别是病毒载体、质粒或RNA载体。可以将目标核酸分子插入其中以便将其引入并维持在真核宿主细胞中的许多载体本身是已知的；合适载体的选择取决于该载体的预期用途(例如，目标序列的复制、该序列的表达、该序列以染色体外形式维持、或整合到宿主的染色体材料中)，也取决于宿主细胞的性质。
在一些实施方案中，载体是质粒。
用于本发明的重组载体是包含用于表达修饰的AAV衣壳蛋白(AAV Cap)，也可以是AAV Rep蛋白的适当手段的表达载体。通常，将每个编码序列(修饰的AAV Cap和AAV Rep)以在同一载体中或分别插入单独的表达盒中。每个表达盒包含与调节序列功能性连接的编码序列(开放阅读框或ORF)，所述调节序列允许相应蛋白在AAV生产细胞中表达，如特别是启动子、启动子/增强子、起始密码子(ATG)、终止密码子、转录终止信号。或者，修饰的AAV Cap和AAV Rep蛋白可使用插入在两个编码序列或病毒2A肽之间的内部核糖体进入位点(IRES)从独特的表达盒表达。此外，编码修饰的AAV Cap和AAV Rep(如果存在)的密码子序列被有利地优化用于在AAV生产细胞，特别是人生产细胞中的表达。
本发明的另一方面是用重组载体稳定转化的细胞，用于表达修饰的AAV衣壳蛋白，优选还表达AAV Rep蛋白。细胞稳定表达修饰的AAV衣壳和AAV Rep蛋白(生产细胞系)。生产细胞有利地为人细胞。
使用本领域熟知的标准AAV生产方法(综述于Aponte-Ubillus etal.,AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018,102:1045-1054)，载体(优选重组质粒)或细胞可用于生产包含本发明的杂合AAV衣壳蛋白的杂合AAV载体。
AAV载体通常通过用含有重组AAV载体基因组的质粒共转染适于AAV生产的细胞来生产，所述重组AAV载体基因组包含插入表达盒中的目标基因，其侧翼为AAV ITR(AAV转移质粒)和表达AAV Rep和Cap蛋白的质粒。或者，可以用AAV转移质粒转染根据本发明的生产细胞(其稳定表达AAV Rep和Cap蛋白)。
简而言之，在存在足够的辅助功能以允许rAAV载体基因组包装到AAV衣壳颗粒中的情况下，将细胞孵育足够的时间以允许AAV载体颗粒的产生，然后收获细胞，裂解细胞，并通过标准纯化方法(如亲和层析或碘克沙醇或氯化铯密度梯度超速离心)来纯化AAV载体颗粒。
AAV颗粒、细胞
本发明的另一方面是包含本发明的修饰的重组AAV衣壳蛋白的AAV颗粒。
AAV颗粒包含根据本发明的修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒包含相同血清型的修饰的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒进一步或备选地包含本发明的嵌合VP1和/或VP2衣壳蛋白和修饰的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒是嵌合AAV颗粒，其进一步包含来自天然或人工AAV血清型的另一种AAV衣壳蛋白，所述天然或人工AAV血清型不同于包括嵌合修饰的AAV衣壳的修饰的AAV衣壳的血清型，其中所述嵌合AAV颗粒具有增加的肌肉向性和/或降低的肝向性。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或人源化AAV衣壳。该人工衣壳可以使用选择的AAV序列(例如VP1衣壳蛋白的片段)与异源序列组合通过任何合适的技术产生，所述异源序列可以从不同的选择的AAV血清型，相同AAV血清型的非连续部分，从非病毒AAV来源或非病毒来源获得。
优选地，AAV颗粒是重组AAV(rAAV)载体颗粒。AAV载体颗粒适用于针对个体中的靶组织或细胞，特别是肌肉细胞或组织的基因治疗。rAAV载体颗粒包装目标基因。rAAV载体的基因组可以是单链或自互补的双链基因组(McCarty et al,Gene Therapy,2003,Dec.,10(26),2112-2118)。通过从AAV末端重复序列中的一个删除末端解离位点(trs)产生自互补载体。这些修饰的载体(其复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半)具有包装DNA二聚体的趋势。AAV基因组侧接ITR。在具体实施方案中，AAV载体是假型载体，即其基因组和衣壳衍生自不同血清型的AAV。在一些优选实施方案中，所述假型载体的基因组衍生自AAV2。rAAV载体颗粒可以使用如上所述的本领域公知的标准AAV生产方法获得。
“目标基因”是指可用于特定应用的基因，例如但不限于诊断、报告、修饰、疗法和基因组编辑。
例如，目标基因可以是治疗性基因、报告基因或基因组编辑酶。
“用于治疗的目标基因”，“治疗性目标基因”或“异源目标基因”是指治疗性基因或编码治疗性蛋白质、肽或RNA的基因。
目标基因是能够在靶器官，特别是肌肉的细胞中修饰靶基因或靶细胞途径的任何核酸序列。例如，所述基因可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调节。在一些实施方案中，目标基因是基因或其片段的功能性版本。所述基因的功能性版本包括野生型基因、变体基因(例如属于相同家族和其他家族的变体)或截短的版本，其至少部分保留了所编码蛋白质的功能。基因的功能性版本可用于替换或附加基因治疗，以替换患者中有缺陷或无功能的基因。在其他实施方案中，目标基因是使导致常染色体显性遗传疾病的显性等位基因失活的基因。基因片段可用作重组模板，与基因组编辑酶组合使用。
或者，目标基因可以编码用于特定应用的目标蛋白质(例如抗体或抗体片段、基因组编辑酶)或RNA。在一些实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质，包括治疗性抗体或抗体片段，或基因组编辑酶。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。
在一些实施方案中，所述目标基因的序列被优化而用于在经治疗的个体，优选在人类个体中表达。序列优化可以包括核酸序列中的许多变化，包括密码子优化、GC含量的增加、CpG岛数量的减少、可选开放阅读框(ARF)数量的减少和/或剪接供体和剪接受体位点数量的减少。
目标基因是能够在疾病的靶细胞，特别是肌肉细胞中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能性基因。在一些实施方案中，目标基因是人基因。AAV病毒载体包含可在靶器官细胞，特别是肌细胞，包括心肌和骨骼肌细胞中表达的形式的目标基因。特别地，目标基因可以与用于在个体的靶细胞、组织或器官中的转基因表达的适当调节序列可操作地连接。本领域众所周知的这种序列特别包括启动子和能够进一步控制所述转基因表达的其他调节序列，例如但不限于增强子、终止子、内含子、沉默子，特别是组织特异性沉默子和microRNA。目标基因与在靶器官(特别是肌肉)的细胞中具有功能性的遍在的、组织特异性的或诱导型启动子可操作地连接。可以将目标基因插入到进一步包含如上所述的额外调节序列的表达盒中。
遍在启动子的实例包括CAG启动子、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/启动子(CMV)、SV40早期启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子和EF1启动子。肌肉特异性启动子包括但不限于衍生自结蛋白(Des)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC-2)启动子、心肌肌钙蛋白C(cTnC)启动子、人骨骼肌肌动蛋白(HSA)启动子或合成肌肉特异性启动子如SpC5-12启动子、CK6启动子的上游序列。
RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补或与靶蛋白结合。例如，所述RNA是干扰RNA，如shRNA、microRNA、与Cas酶或类似酶联合用于基因组编辑的向导RNA(gRNA)、能够外显子跳跃的反义RNA，如修饰的小核RNA(snRNA)或长的非编码RNA。干扰RNA或microRNA可用于调节与肌肉疾病相关的靶基因的表达。与Cas酶或用于基因组编辑的类似酶复合的向导RNA可用于修饰靶基因的序列，特别是校正突变/缺陷基因的序列或修饰疾病中涉及的靶基因的表达，特别是神经肌肉疾病。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框和恢复具有被破坏的阅读框的缺陷基因的表达。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。
根据本发明的基因组编辑酶是能够修饰(特别是在肌肉细胞中的)靶基因或靶细胞途径的任何酶或酶复合物。例如，基因组编辑酶可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调控。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，例如但不限于，大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应基核酸酶(TALEN)、来自簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)-Cas系统的Cas酶和类似酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶(如Cas酶)和类似酶，可以是在目标基因组基因座产生双链断裂(DSB)或单链DNA断裂(缺口酶，如Cas9(D10A))的功能性核酸酶，并且用于位点特异性基因组编辑应用，包括但不限于：基因校正、基因替换、基因敲入、基因敲除、诱变、染色体易位、染色体缺失等。对于位点特异性基因组编辑应用，可以将基因组编辑酶(特别是工程化核酸酶，如Cas酶和类似酶)与同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)组合使用，其通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组修饰靶基因组位点。特别地，HR模板可以将目标转基因引入靶基因组基因座中或修复靶基因组基因座中的突变，优选在引起肌肉障碍(如神经肌肉疾病)的异常或缺陷基因中。或者，可以将基因组编辑酶(如Cas酶和类似酶)工程化为核酸酶缺陷并用作DNA结合蛋白，以用于各种基因组工程化应用，例如但不限于：转录激活、转录抑制、表观基因组修饰、基因组成像、DNA或RNA下拉等。
本发明还涉及用本发明的rAAV载体颗粒稳定转导的分离的细胞，特别是来自个体的细胞。个体有利地为待治疗的患者。在一些实施方案中，细胞是根据本公开的肌肉细胞、所述细胞的祖细胞或多能干细胞(如诱导多能干细胞(iPS细胞))、胚胎干细胞、胎儿干细胞和成体干细胞。
药物组合物和治疗用途
本发明的另一方面是药物组合物，其包含至少一种选自本发明的AAV载体颗粒或细胞的活性剂和药学上可接受的载体。
本发明的rAAV载体颗粒、细胞和衍生的药物组合物可用于通过基因治疗，特别是针对肌肉细胞或组织的靶向基因治疗来治疗疾病。本发明的细胞和衍生的药物组合物可用于通过细胞疗法，特别是针对肌肉细胞的细胞疗法来治疗疾病。
本文所用的“基因治疗”是指个体的治疗，其涉及将目标核酸递送到个体的细胞中以治疗疾病。通常使用递送载体(也称为载体)实现核酸的递送。本发明的rAAV载体颗粒可用于将基因递送至患者细胞。
本文所用的“细胞治疗”是指其中通过任何合适的手段，例如通过静脉内注射(输注)或在目标组织中注射(植入或移植)，将由本发明的rAAV载体颗粒稳定转导的细胞递送至有此需要的个体的方法。在具体实施方案中，细胞治疗包括从个体收集细胞，用本发明的rAAV载体颗粒转导个体的细胞，并将稳定转导的细胞施用回患者。如本文所使用的“细胞”是指分离细胞、天然或人工细胞聚集体、生物人工细胞支架和生物人工器官或组织。
基因治疗可以通过基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、反式剪接或细胞中任何编码或调控序列(包括细胞核、线粒体中包含的序列或作为常见核酸，例如但不限于细胞中包含的病毒序列)的任何其他遗传修饰来进行。
基因治疗的两种主要类型如下：
-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替代基因的疗法：这是替代或附加基因疗法；
-针对基因或基因组编辑的疗法：在这种情况下，目的是向细胞提供必要工具以纠正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调控，从而表达功能基因或抑制(失活)异常基因：这是基因编辑疗法。
在附加基因疗法中，目标基因可以是基因的功能形式，其在患者中是缺陷或突变的，例如在遗传疾病中的情况。在这种情况下，目标基因将恢复功能基因的表达。因此，通过基因编辑或基因替换，在靶细胞，特别是受影响患者的肌肉细胞中提供了该基因的正确形式，这可有助于针对该疾病的有效治疗。
基因或基因组编辑使用一个或多个目标基因，例如：
-编码如上定义的治疗性RNA的基因，例如干扰RNA，如shRNA或microRNA；与Cas酶或类似酶组合使用的向导RNA(gRNA)；或能够外显子跳跃的反义RNA，如修饰的小核RNA(snRNA)；和
-编码如上定义的基因组编辑酶的基因，例如工程化核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应基核酸酶(TALEN)、Cas酶或类似酶；或此类基因的组合，且也可以是如上定义的用作重组模板的基因功能形式的片段。
基因治疗用于治疗肌肉疾病。肌肉疾病包括影响肌肉(包括骨骼肌和心肌)的结构或功能的各种遗传性(基因性)和获得性疾病或障碍。这些疾病可以是由创伤、感染、变性、结构或代谢缺陷、肿瘤、炎性或自身免疫性疾病或其他病因引起的。可通过基因疗法治疗的肌肉疾病的非限制性实例包括神经肌肉遗传性病症，诸如肌肉遗传性病症；癌症和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是引起神经肌肉疾病的基因。神经肌肉遗传病症特别包括：肌营养不良、先天性肌营养不良、先天性肌病、远端肌病、其它肌病、肌强直综合征、离子通道肌病、恶性高热、代谢性肌病、遗传性心肌病、先天性肌无力综合征、运动神经元疾病、遗传性截瘫、遗传性运动和感觉神经病和其它神经肌肉疾病。
可以使用根据本发明的衣壳修饰的rAAV治疗的神经肌肉遗传疾病的具体实例列举如下：
-营养不良性疾病是由编码蛋白营养不良蛋白的DMD基因中的致病性变异引起的X连锁肌病谱。营养不良性疾病包括杜兴氏肌营养不良症(DMD)、贝克尔肌营养不良症(BMD)和DMD相关性扩张型心肌病。
-肢带状肌营养不良(LGMD)是与DMD临床相似但由于常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传而在两性中均发生的一组疾病。肢带营养不良由编码肌糖蛋白和与肌细胞膜相关的其他蛋白的基因突变引起，所述蛋白与肌营养不良蛋白相互作用。术语LGMD1是指显示显性遗传(常染色体显性)的遗传类型，而LGMD2是指具有常染色体隐性遗传的类型。已报道超过50个基因座的致病性变体(从LGMD1A到LGMD1G；从LGMD2A到LGMD2W)。钙蛋白酶病(LGMD2A)由具有描述的超过450种致病性变体的基因CAPN3的突变引起。LGMD表型的贡献基因包括：anoctamin 5(ANO5)、血管心外膜物质(BVES)、钙蛋白酶3(CAPN3)、caveolin 3(CAV3)、CDP-L-核糖醇焦磷酸化酶A(CRPPA)、营养不良聚糖1(DAG1)、结蛋白(DES)、DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)同源物、亚家族B、成员6(DNAJB6)、dysferlin(DYSF)、fukutin相关蛋白(FKRP)、fukutin(FKT)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)、异质核核糖核蛋白D样(HNRNPDL)、包含LIM锌指结构域的2(LIMS2)、lain A:C(LMNA)、肌球蛋白(MYOT)、网蛋白(PLEC)、蛋白O-葡萄糖基转移酶1(PLOGLUT1)、蛋白O-连锁的甘露糖N-乙酰葡糖胺基转移酶1(β1,2-)(POMGNT1)、蛋白O-甘露糖激酶(POMK)、蛋白O-甘露糖基转移酶1(POMT1)、蛋白O-甘露糖基转移酶2(POMT2)、肌聚糖α(SGCA)、肌聚糖β(SGCB)、肌聚糖δ(SGCD)、肌聚糖γ(SGCG)、肌联蛋白帽(TCAP)、转运蛋白3(TNPO3)、torsin 1A相互作用蛋白(TOR1AIP1)、转运蛋白颗粒复合物11(TRAPPC11)、包含32(TRIM 32)和肌联蛋白(TTN)的三联基序。LGMD表型的主要贡献基因包括CAPN3、DYSF、FKRP和ANO5(Babi Ramesh Reddy Nallamilli et al.,Annals of Clinical and Translational Neurology,2018,5,1574-1587)。
-由包括EMD基因(编码emerin)、FHL1基因和LMNA基因(编码核纤层蛋白A和C)的基因之一的缺陷引起的Emery-Dreifuss肌营养不良(EDMD)。
-分别由SYNE1和SYNE2基因的缺陷引起的Nesprin-1和Nesprin-2相关的肌营养不良；由TMEM43基因缺陷引起的LUMA相关的肌营养不良；由TOR1AIP1基因缺陷引起的LAP1B相关的肌营养不良。
-面肩肱型肌营养不良，1型(FSHD1A)，例如与DUX4基因(染色体4q35的亚端粒区域中的D4Z4大卫星重复序列的收缩)或FRG1基因的缺陷相关；面肩肱型肌营养不良，2型(FSHD1B)，由SMCHD1基因缺陷引起。
-脊髓性肌萎缩症是一种由生存运动神经元1(SMN1)基因突变引起的遗传性疾病，其特征是用于运动的肌肉无力和消瘦(萎缩)。
-X连锁肌管肌病是一种由肌管蛋白(MTM1)基因突变引起的遗传性疾病，该基因影响用于运动的肌肉(骨骼肌)，并且几乎只发生在男性身上。这种病症的特点是肌肉无力(肌病)和肌张力降低(张力减退)。
-Titin肌病是由Titin(TTN)基因突变引起的遗传病。据报道，显性和隐性TTN突变都引起广谱的心肌和骨骼肌疾病。显性Titin肌病包括由外显子344中的突变引起的具有早期呼吸衰竭(HMERF)的遗传性肌病和迟发性胫骨肌营养不良(TMD)。隐性Titin肌病包括肢带肌营养不良2J、年轻或早期成人发作的远端肌联蛋白病、无心肌病的Emery-Dreifuss样肌病和有或无心脏病的先天性肌病。
-庞贝病是一种由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因突变引起的遗传性疾病。GAA基因中的突变阻止酸性α-葡萄糖苷酶有效分解糖原，从而使这种糖在溶酶体中堆积到毒性水平。这种堆积损害贯穿机体的器官和组织，特别是肌肉，导致庞贝病的渐进性体征和症状。
-糖原贮积病III(GSD3)是一种常染色体隐性代谢紊乱，由编码糖原脱支酶的淀粉-α-1、6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖转移酶(AGL)基因的纯合或复合杂合突变引起，并与具有短外链的异常糖原的积累有关。临床上，GSD III患者在婴儿期或幼儿期出现肝肿大、低血糖和生长迟缓。IIIa患者的肌肉无力在儿童时期是轻微的，但在成人中可能会变得更加严重；一些患者发展为心肌病。
在一些实施方案中，用于基因疗法(附加基因疗法或基因编辑)的靶基因是负责神经肌肉疾病的基因，其选自包含以下的组：肌养蛋白病(DMD基因)和肢带肌营养不良(LGMD)(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、DNAJB6基因和其他如SGCA、SGCB、SGCG)。在一些优选实施方案中，用于基因治疗的靶基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。
基因编辑的具体实例是治疗由钙蛋白酶-3基因(CAPN3)突变引起的肢带型肌营养不良2A(LGMD2A)。其它非限制性实例是治疗DMD或TNT基因的突变。
因此，通过基因编辑或基因替换，在受影响患者的肌肉细胞中提供该基因的正确版本，这可有助于针对该疾病的有效治疗。可以使用相同的原理通过基因替换或基因编辑来治疗如上列出的肌肉的其它遗传疾病。
替代或附加基因疗法可用于治疗癌症，特别是横纹肌肉瘤。癌症中的目标基因可以调节肿瘤细胞的细胞周期或代谢和迁移，或诱导肿瘤细胞死亡。例如，诱导型半胱天冬酶-9可以在肌肉细胞中表达以触发细胞死亡，优选在联合疗法中引起持久的抗肿瘤免疫应答。
在自身免疫或癌症的情况下，基因编辑可用于修饰靶细胞(特别是肌肉细胞)中的基因表达，或扰乱此类细胞中的病毒周期。在这种情况下，优选地，目标基因选自编码向导RNA(gRNA)、位点特异性核酸内切酶(TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas核酸酶)、DNA模板和RNAi组分(如shRNA和microRNA)的那些。工具(如CRISPR/Cas9)可用于此目的。
在一些实施方案中，基因治疗用于通过在靶组织(特别是肌肉组织)中表达治疗性基因来治疗影响其他组织的疾病。这可用于避免治疗性基因在肝脏中表达，特别是在患有并发性肝病(例如肝炎)的患者的肝脏中表达。治疗性基因优选编码治疗性蛋白质、肽或抗体，其从肌肉细胞分泌到血流中，在血流中其可被递送至其他靶组织(如肝脏)。治疗性基因的实例包括但不限于：因子VIII，因子IX和GAA基因。
包含具有降低的肝向性的AAV载体颗粒的本发明的药物组合物可以施用于患有并发肝病，例如肝炎，包括病毒性或毒性肝炎的患者。
在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的rAAV载体颗粒或细胞。在本发明的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的一种或多种症状的发展的剂量。术语“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。
根据各种因素确定和调整有效剂量，例如所用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及医学领域的技术人员将了解的其他因素。
在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或介质。
“药学上可接受的载体”是指当酌情向哺乳动物，尤其是人施用时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的载体。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何形式的制剂助剂。
优选地，药物组合物包含介质，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可以特别是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)，或干燥，尤其是冻干组合物，其视情况加入灭菌水或生理盐水后允许构建可注射溶液。
适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定程度的流动性，以达到易于注射的能力。它必须在制备和储存条件下稳定，并且必须保存以防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乳酸林格氏液。
本发明还提供了通过在靶组织，特别是肌肉组织中表达治疗性基因来治疗疾病的方法，其包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。
本发明还提供了治疗肌肉疾病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。
本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物在制备用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的药物中的用途。
本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物，其用作药物和/或用于基因治疗，特别是用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病。
本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的用途。
本发明的另一方面涉及用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的药物组合物，其包含根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞作为活性组分。
本发明的另一方面涉及包含根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞的药物组合物，其用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病。
本文所用的术语“患者”或“个体”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。优选地，根据本发明的患者或个体是人。
本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”定义为向患者应用或施用治疗剂或治疗剂的组合，或向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用所述治疗剂，所述患者患有疾病，特别是肌肉病症，其目标是愈合、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病或疾病的任何症状。特别地，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指减少或减轻与疾病相关的至少一种不良临床症状。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”在本文中也用于预防性地施用治疗剂的上下文中。
本发明的药物组合物通常根据已知的方法，以有效诱导患者治疗效果的剂量和时间段施用。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如以非限制性方式通过输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。施用可以是全身施用、局部施用或全身与局部联合施用；全身性施用包括肠胃外和口服，并且局部施用包括局部和局部区域。全身施用优选肠胃外施用，例如皮下(SC)、肌内(IM)、例如静脉内(IV)或动脉内施用的血管内施用；腹膜内(IP)；皮内注射(ID)；硬膜外或其他。施用可以例如通过注射或灌注。在一些优选实施方案中，施用肠胃外施用，优选血管内施用，例如静脉内(IV)或动脉内。肠胃外施用有利地是通过注射或灌注。
本公开的各种实施方案可以彼此组合，并且本公开涵盖本公开的实施方案的各种组合。
除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。
现在将参考附图，用以下非限制性的实施例来举例说明本发明，
其中：
附图说明
图1：注射AAV9.rh74修饰衣壳的小鼠肝脏中萦光素酶转基因表达的比较
将具有修饰的AAV9.rh74衣壳的rAAV载体：根据本发明的AAV9-rh74-HB-P1(HB-P1)和根据现有技术的AAV9-rh74-K-P1(K-P1)和对照(AAV9；AAV9-rh74)静脉内注射(4x1010vg/小鼠)到5周龄B6白化病雄性小鼠(n＝4)中。通过肝组织裂解物的体外萦光素酶测定在肝中分析萦光素酶表达。数据显示为相对发光单位(RLU)/μg蛋白质的平均值±SEM(n＝4)。通过Dunnett多重比较检验进行统计学分析(*p值≤±0.05)。
图2：注射AAV9.rh74修饰衣壳的大鼠肌肉中钙蛋白酶3转基因表达的比较
将在肌肉特异性启动子控制下表达钙蛋白酶3(C3)转基因并含有根据本发明的修饰的AAV9.rh74衣壳(AAV9-rh74-HB-P1-C3)或根据现有技术的修饰的AAV9.rh74衣壳(AAV9-rh74-K-P1-C3)和AAV9对照(AAV9-C3)的rAAV载体静脉内注射(4x1010 vg/大鼠)到1月龄大鼠中。使用肌动蛋白作为内部对照，通过肌肉活检的体外蛋白质印迹分析来分析钙蛋白酶3表达。A.比目鱼肌(SOL)的蛋白质印迹。B.比目鱼肌中钙蛋白酶3与肌动蛋白相比的相对信号。WT：正常大鼠。KO：钙蛋白酶3缺陷大鼠。
图3：注射AAV9.rh74修饰衣壳的小鼠肌肉与肝脏中载体基因组拷贝数的比较
将具有修饰的AAV9.rh74衣壳的rAAV载体：根据本发明的AAV9-rh74-AAA-P1-SG(HB-P1)；根据现有技术的AAV9-rh74-GQSG-P1-AQAA(K-P1)；和阴性对照AAV9-rh74-AKA-P1-AK静脉内注射(1x1011 v/小鼠)到5周龄B6白化雄性小鼠(n＝4)中。通过多重qPCR对肌肉(胫骨肌(TA)；腰大肌)和肝脏中的载体基因组拷贝数(VCN)进行量化，并测定肌肉与肝脏中的VCN比率。A.TA/肝脏的VCN比率。B.腰大肌/肝脏的VCN比率。
图4：注射AAV9和AAV8修饰衣壳的小鼠的肌肉与肝脏中载体基因组拷贝数的比较
将根据本发明的AAV8和AAV9修饰衣壳的rAAV载体(AAV8-AAA-P1-SG和AAV9-AAA-P1-SG)和对照(AAV9，AAV8)静脉内注射(1x1011 v/小鼠)到5周龄B6白化雄性小鼠(n＝4)中。通过多重qPCR对肌肉(胫骨肌(TA)；腰大肌)和肝脏中的载体基因组拷贝数(VCN)进行量化，并测定肌肉与肝脏中的VCN比率。A.根据本发明的P1修饰的AAV8衣壳。B.根据本发明的P1修饰的AAV9衣壳。
具体实施方式
衣壳修饰的rAAV载体的构建和生物分布
根据本发明构建肽P1修饰的AAV衣壳，而不修饰插入位点上游和下游的AAV衣壳氨基酸序列(本文命名为HB-P1)。为了比较，根据现有技术构建肽P1修饰的AAV衣壳，其中修饰插入位点的上游和/或下游的AAV衣壳氨基酸序列(本文命名为K-P1)。
1.材料和方法
1.1质粒构建
含有由肽P1修饰的杂合AAV9.rh74衣壳的质粒衍生自WO2019/193119中公开的含有AAV2 Rep和杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74)基因的质粒pRep2-Cap9rh74。质粒pRep2-Cap9rh74-HB-P1编码修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74-HB-P1或Cap9rh74-AAA-P1-SG)，其包含插入杂合AAV9.rh74衣壳的第589位(例如在N589和A590之间)的侧接AAA和SG的P1肽序列(AAARGDLGLSSG；SEQ ID NO:5)。对照质粒pRep2-Cap9rh74-AKA-P1-AK编码修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74-AKA-P1-AK)，其包含插入杂合AAV9.rh74衣壳的第589位(例如N589和A590之间)的分别在N末端和C末端侧接非小氨基酸序列AKA和AK的P1肽序列(AKARGDLGLSAK；SEQ ID NO:39)。
质粒pRep2-Cap9-HB-P1(Cap9-AAA-P1-SG)编码修饰的杂合AAV9衣壳(Cap9-HB-P1或Cap9-AAA-P1-SG)，其包含插入AAV9衣壳的第588位(例如Q588和A589之间)的侧接AAA和SG的P1肽序列(AAARGDLGLSSG；SEQ ID NO:5)。质粒pRep2-Cap8-HB-P1(Cap8-AAA-P1-SG)编码修饰的杂合AAV8衣壳(Cap8-HB-P1或Cap8-AAA-P1-SG)，其包含插入AAV8衣壳的第590位(例如N590和T591之间)的侧接AAA和SG的P1肽序列(AAARGDLGLSSG；SEQ ID NO:5)。
编码由根据Kienle EC公开的肽插入AAV衣壳的策略获得(Dissertation、2014；引述)的通过肽P1修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74-K-P1或Cap9rh74-GQSG-P1-AQAA)的质粒pRep2-Cap9rh74-K-P1用作对照用于与根据本发明的pRep2-Cap9rh74-HB-P1比较。根据WO 19207132中所述的策略，Cap9rh74-K-P1构建体包含在杂合AAV9.rh74衣壳的第589位插入的P1肽序列。所述策略包括首先修饰侧翼序列GQSG和AQAA，替换杂合AAV9.rh74衣壳中插入位点侧翼的初始587QQN589和590AAP592序列，然后插入P1肽。因此，Cap9rh74-K-P1构建体包含插入杂合AAV9.rh74衣壳的Q586和I593之间的含有序列GQSGRGDLGLSAQAA(SEQ ID NO:9)的P1。
针对每个Cap9rh74构建体(GeneWiz)；Cap9rh74-HB-P1(SEQ IDNO:10)；Cap9rh74-K-P1(SEQ ID NO:11)和Cap9rh74-AKA-P1-AK(SEQ ID NO:40)合成含有P1肽插入的MscI片段，并克隆到pUC质粒中。针对Cap9和Cap8构建体(GeneWiz)；Cap9-HB-P1(SEQ ID NO:41)和Cap8-HB-P1(SEQ ID NO:42)合成含有P1肽插入的AfeI-BsiWI片段。然后，使用InFusion克隆系统亚克隆片段，以替换pRep2-Cap9rh74、pRep2-Cap9和pRep2-Cap8质粒中的相应区域。对细菌克隆进行序列验证，并作为甘油储存在-80℃和作为纯化质粒储存在-20℃。Cap9rh74-HB-P1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO:7并编码氨基酸序列SEQ ID NO:6的AAV9-rh74-HB-P1衣壳蛋白。Cap9rh74-K-P1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO:12并编码氨基酸序列SEQ ID NO:14的AAV9-rh74-K-P1衣壳蛋白。
1.2rAAV的生产
如Ayuso E.et al.(Hum.Gene Ther.2014,25,977–987)所述，在Généthon中产生包含修饰和未修饰的AAV9rh74、AAV9、AAV8衣壳和AAV9、AAV9rh74、AAV8对照的重组AAV(rAAV)，其含有在CMV启动子控制下的GFP-萦光素酶转基因或在肌肉特异性启动子控制下的钙蛋白酶3。如Rohr et al.(J.Virol.Methods,2002,106,81–88)所述定量病毒基因组。rAAV滴度表示为病毒基因组拷贝数(vg)。
1.3体内实验
根据法国和欧洲立法处理AAV9rh74动物。动物程序由当地伦理委员会和高等教育，研究和创新部(APAFIS#19736)批准。通过静脉内(IV)注射将表达GFP-萦光素酶的rAAV以4x1012 vg/kg或1x1013vg/kg的剂量施用于5周龄B6白化小鼠(每组n＝4或5)。注射后14天采集体内生物发光图像。注射后3周，通过颈脱位处死小鼠，并取样若干肌肉和器官：胫骨肌、腰大肌、隔膜、心脏、肝脏、肾脏、肺脏和肾上腺。通过静脉内注射表达钙蛋白酶3(AAV9-ms-C3(9-C3),AAV9-rh74-K-P1_C3(K-P1-C3)；AAV9-rh74-HBP1_C3(HBP1-C3)的rAAV以1xe14vg/kg的剂量施用于1月龄Sprague Dawley大鼠(每组n＝4)。注射后2个月，取样目鱼肌。
1.4体内生物发光
注射后14天采集体内生物发光图像。通过吸入异氟烷麻醉小鼠并腹膜内注射100μl 50mg/ml D-萤光素(LifeTechnologies,California,USA)。使用
发光成像体系(PerkinElmer)进行体内成像。
1.5载体拷贝数定量
使用NucleoMag Pathogen试剂盒(Macherey-Nagel)和KingFisher Flex仪器(ThermoFisher Scientific)从取样的不同肌肉和器官提取gDNA和病毒DNA。
通过在Light Cycler 480仪器(Roche)中的多重qPCR，使用Thermo ScientificAbsolute qPCR ROX Mix,引物(正向:CATCAATGGGCGTGGATAGC(SEQ ID NO:15)；反向:GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA(SEQ ID NO:16))和探针(ATTTCCAAGTCTCCACCC,FAM(SEQ IDNO:17))来检测来自载体的CMV启动子，并且使用引物(正向:CTCCAAGCAGATGCAGCAGA(SEQID NO:18)；反向ATAGCCTTGCGCATCATGGT(SEQ ID NO:19))和探针(CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA,VIC(SEQ ID NO:20))来检测作为样品的内部对照的Rplp0(60S酸性核糖体蛋白P0)。
1.6体外萦光素酶测定
使用FastPrep-24 Classic Instrument(MP Biomedicals)(5m/s,40s)将样品在裂解缓冲液(25mM三磷酸,15％甘油,1mM DTT,1mM EDTA,8mM MgCl2,0.2％ Triton X-100)中与蛋白酶抑制剂混合物(cOmpleteTM ULTRA Tablets,Mini EDTA-free,EASYpackProtease Inhibitor Cocktail Tablets REF:5892791001)均化。对样品进行3次冷冻/解冻循环。离心(5min,10000g,+4℃)后，将10ul上清液转移至白色不透明板。具有泵系统的EnSpire多模式平板读数器(PerkinElmer)用于测量来自样品匀浆的发光信号，所述泵系统允许分配100μl测定缓冲液(与不含Triton X-100和含2nM ATP的裂解缓冲液相同，Sigma,REF:10519979001)和100μl 167μM D-萦光素。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质的定量，以通过样品的蛋白质的量使发光信号标准化。
1.7钙蛋白酶3蛋白质印迹
从注射动物的肌肉活检制备蛋白质提取物。将取样的不同肌肉的冷冻切片在以下缓冲液尿素缓冲液中裂解：8M尿素，2M硫脲，3％SDS,50mM Tris-HCl pH 6.8,0.03％溴酚蓝和不含EDTA的蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM ULTRA Tablets,Mini EDTA-free,EASYpackProtease Inhibitor Cocktail Tablets)。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质浓度的定量。在95℃下变性10分钟后，将20μg加载到4-12％ Bis-Tris胶上。在硝酸纤维素膜上干转移后，使用抗钙蛋白酶3的抗体(小鼠抗体NCL-CALP-12A2,Novocastra，稀释度1:200和山羊抗体COP-080049,Operon Biotechnologies)进行蛋白质印迹。将膜与一抗在4℃孵育过夜，在PBS中洗涤3次后，将二抗在室温孵育1h。使用的二抗是：抗兔Donkey抗Rabbit780，稀释度1/10000)。
2.结果
本发明人测试了P1肽(RGDLGLS(SEQ ID NO:1)；Michelfelder et al.,PLoS ONE,2009,4,e5122)在插入WO2019/193119中公开的AAV9-rh74杂合衣壳(SEQ ID NO:2)以及AAV9和AAV8衣壳血清型后增加肌肉中转导和转基因表达的效率的能力。
将根据本发明的P1-修饰的AAV9-rh74杂合衣壳与根据Kienle EC(论文，2014；引述)中公开的肽插入AAV衣壳的策略获得的P1-修饰的AAV9-rh74杂合衣壳进行比较。简言之，将N末端和C末端分别侧接AAA和SG的P1序列插入AAV9-rh74杂合衣壳的第589位(例如N589和A590之间)，而不修饰插入位点上游和下游的衣壳氨基酸序列。在根据Kienle EC制备的P1-修饰的杂合AAV9.rh74衣壳中，侧接插入位点(分别为插入位点的上游和下游)的587QQN589和590AAP592序列分别变为GQSG和AQAA，然后将肽P1插入杂合AAV9.rh74衣壳中。得到的根据本发明的P1-修饰的杂合衣壳(文本命名为Cap9rh74-HB-P1或AAV9-rh74-HB-P1衣壳)具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。得到的根据Kienle EC的P1-修饰的杂合衣壳(本文命名为Cap9rh74-K-P1或AAV9-rh74-K-P1衣壳)具有氨基酸序列SEQ ID NO:14。测试在N末端和C末端中分别包含侧接非小氨基酸序列AKA和AK的P1肽序列的P1-修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74-AKA-P1-AK)作为阴性对照。还测试了根据本发明的P1-修饰的AAV9和AAV8衣壳以评估肽P1插入策略在其它AAV血清型中的效率。
为了评估肽修饰的AAV衣壳的生物分布，产生携带P1肽和GFP-萤光素酶作为在CMV启动子控制下的转基因的重组AAV9-rh74、AAV9和AAV8载体，并(静脉内)注入5周龄B6白化小鼠(4x1010vg/小鼠或1x1011 vg/小鼠)中。
注射后14天进行体内生物发光图像的采集，以及注射后第21天进行处死和组织取样。
体内生物发光图像显示，使用现有技术策略(“策略K”)和上述本发明策略(“策略HB”)在AAV9.rh74衣壳中添加P1肽在两种情况下都导致后肢中更高的萦光素酶表达。
然而，与未修饰的衣壳和AAV9-rh74-K-P1相比，在注射AAV9-rh74-HB-P1衣壳的小鼠的肝脏中，不同组织裂解物中萦光素酶表达分析的结果显示出较低的信号(图1和表1)。这证明与AAV9-rh74-K-P1相比，AAV9-rh74-HB-P1具有增加的从肝脏去靶向作用。
表1：与AAV9-rh74-K-P1相比，AAV9-rh74-HB-P1的肝靶向减少
在注射小鼠的不同器官中的载体拷贝数(VCN)分析表明，与现有技术策略(“策略K”)相比，根据本发明的P1肽插入策略(“策略HB”)改进肌肉靶向，特别是骨骼肌中的肌肉靶向和从肝脏的去靶向，如通过与AAV9-rh74-K-P1(AAV9rh74-GQSG-P1-AQAA)相比，AAV9-rh74-HB-P1(AAV9rh74-AAA-P1-SG)的骨骼肌与肝脏的载体拷贝数比率显著更高(2至3倍)所评估(图3)。相比之下，肌肉中的低载体拷贝数和肝脏中的高载体拷贝数导致肌肉与肝脏的载体拷贝数比率低，这在用包含侧接非小氨基酸序列的P1修饰的AAV9.rh74衣壳的对照载体中观察到(AAV9rh74-AKA-P1-AK；图3)。这证明了侧接P1肽的小氨基酸序列在根据本发明的P1修饰的AAV衣壳的向性改进中的主要贡献。用根据本发明的P1修饰的AAV8和AAV9衣壳也观察到肌肉靶向和从肝脏去靶向，证明根据本发明的肽P1插入策略(“策略HB”)是功能性的，与AAV血清型无关(图4)。
为了进一步评价与AAV9-rh74-K-P1和未修饰的AAV9相比，AAV9-rh74-HB-P1在肌肉中的效率，产生携带P1肽和钙蛋白酶3作为在肌肉特异性启动子控制下的转基因的重组AAV载体，并以110e14 vg/kg(4x1010 vg/大鼠)的剂量静脉内注入1月龄大鼠。
取样后，对肌肉进行蛋白质印迹。结果显示最有效转导肌肉的载体是AAV9-rh74-HB-P1(图2)。
总之，本发明人已经鉴定了具有较高肌肉转移和肝脏去靶向的肽修饰的AAV衣壳，表明肽的插入模式对AAV衣壳的生物分布具有影响。
Claims (15)
1.修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其在衣壳蛋白序列的两个连续氨基酸之间包含肌肉靶向肽插入，并且在插入位点的上游和下游不对衣壳蛋白氨基酸序列进行任何修饰，其中靶向肽包含序列SEQ ID NO:1和在SEQ ID NO:1的N末端和C末端的小氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其中所述小氨基酸序列由最多五个选自A、G、N、T、D和L的氨基酸组成；优选地，N末端的G、GST、AAA、SGS、SGA、AGA、GAA或ALA和C末端的G、SG、AA、TG、GG、SA、AG或GA；更优选SEQ ID NO:1的N末端的AAA和C末端的SG。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其中所述肌肉靶向肽由9个氨基酸至最多25、20或15个氨基酸的序列组成。
4.根据权利要求1-3任一项所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其中根据AAV2衣壳蛋白序列中的编号，所述插入在可变区IV、V或VIII中；优选在选自第587、588、589、453、520、584和585位的位置处。
5.根据权利要求1-4任一项所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其来自选自下组的AAV血清型：AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh74和AAV9.rh74；优选AAV9或AAV9.rh74。
6.根据权利要求5所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其来自AAV9.rh74并且在第589位处包含肌肉靶向肽插入；优选地，其中靶向肽选自下组：SEQ ID NO:5、21、23、25、27、29、31、33、35和37；优选SEQ ID NO:5。
7.根据权利要求6所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其包含选自下组的序列：序列SEQ IDNO:6和与所述序列具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的修饰的AAV衣壳蛋白，其对肌肉，特别是心肌和/或骨骼肌具有增加的向性，和/或对肝脏具有降低的向性。
9.编码根据权利要求1-8任一项所述的修饰的AAV衣壳蛋白的多核苷酸；优选包含序列SEQ ID NO:7或与所述序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
10.重组质粒，其包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.包装目标基因的AAV载体颗粒，其包含根据权利要求1-8任一项所述的修饰的AAV衣壳蛋白。
12.根据权利要求11所述的AAV载体颗粒，其中所述目标基因选自下组：治疗性基因；编码治疗性蛋白质或肽如治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶的基因；以及编码治疗性RNA如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的基因。
13.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求11或12所述的AAV载体颗粒，或被根据权利要求11或12所述的AAV载体颗粒稳定转导的细胞。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用作基因治疗中的药物，优选用于治疗肌肉疾病。
15.根据权利要求14所述的用于其用途的药物组合物，其靶向负责选自肌萎缩蛋白病和肢带肌营养不良的肌肉疾病的基因；优选靶向选自下组的基因：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。
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