BR112020021903A2 - terapia genética para degeneração do snc - Google Patents

terapia genética para degeneração do snc Download PDF

Info

Publication number
BR112020021903A2
BR112020021903A2 BR112020021903-7A BR112020021903A BR112020021903A2 BR 112020021903 A2 BR112020021903 A2 BR 112020021903A2 BR 112020021903 A BR112020021903 A BR 112020021903A BR 112020021903 A2 BR112020021903 A2 BR 112020021903A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gene
patient
gene therapy
transgene
promoter
Prior art date
Application number
BR112020021903-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Paven Battiprolu
Raj Prabhakar
Annahita Keravala
Roderick Wong
Piratip Pratumsuwan
Naveen Yalamanchi
Original Assignee
Rocket Pharmaceuticals, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rocket Pharmaceuticals, Ltd. filed Critical Rocket Pharmaceuticals, Ltd.
Publication of BR112020021903A2 publication Critical patent/BR112020021903A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

TERAPIA GENÉTICA PARA DEGENERAÇÃO DO SNC. A presente divulgação refere-se geralmente a composições e métodos para tratar, prevenir, inibir ou atrasar a degeneração do sistema nervoso central. A divulgação refere-se a um vetor de terapia genética recombinante compreendendo um gene PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA, ou seu fragmento funcional ou variante. A divulgação também se refere a sistemas de edição de genes baseados em CRISPR/Cas para tratar, prevenir, inibir ou atrasar a degeneração do sistema nervoso central.

Description

“TERAPIA GENÉTICA PARA DEGENERAÇÃO DO SNC” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica benefício de prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos EUA nº 62/664.006, depositado em 27 de abril de 2018, cuja divulgação é incorporada aqui por referência na sua totalidade para referência para todos os fins.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] A Listagem de Sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e é aqui incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequências é ROPA 009 O01WO ST25.txt. O arquivo de texto tem 254 KB, foi criado em 29 de abril de 2019 e está sendo enviado eletronicamente via EFS- Web.
CAMPO DA DIVULGAÇÃO
[003] A presente divulgação refere-se geralmente à terapia genética e/ou edição de genes para tratamento de distúrbios associados à degeneração do sistema nervoso central, como a doença de Parkinson. Em particular, a divulgação fornece composições e métodos para terapia genética ou reparo genético em neurônios ex vivo e in vivo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[004] Vários genes têm sido implicados em distúrbios da degeneração do sistema nervoso central, como a doença de Parkinson (DP). Esses genes incluem PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Creed et al. (2018) Mov Disord. 33:717-729; Blesa et al. (2014) Front. Neuroanat. 8:1-12; Alcalay et al. (2010) Arch Neurol. 67:1116-1122). O PARK2, também conhecido como PRKN, foi implicado em uma forma de DP, DP juvenil autossômica recessiva. Apesar das tentativas generalizadas, existem poucos relatos de terapia genética bem-sucedida para a degeneração do sistema nervoso central.
[005] Existe uma grande necessidade na técnica de novas composições e métodos para tratar e prevenir a degeneração do sistema nervoso central.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA DIVULGAÇÃO
[006] A presente divulgação fornece, em partes, composições e métodos para tratar, prevenir, inibir ou atrasar a degeneração do sistema nervoso central. Em particular, os inventores divulgam várias modalidades de, e métodos relacionados a, um vetor de terapia genética recombinante que compreende uma proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa- sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes.
[007] Os inventores adicionais divulgam várias modalidades e métodos relacionados a um sistema de edição de genes que compreende uma proteína Cas, RNA guia, um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes.
[008] Em um primeiro aspecto, a divulgação fornece um método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico que compreende uma mutação em um gene associado a uma doença de Parkinson (DP). Os genes mutados podem ser uma proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), um gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2(LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA). Nos métodos deste aspecto, o método compreende colocar o neurônio em contato com um vetor de terapia genética recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de tipo selvagem expressa por uma versão de tipo selvagem do gene mutado, ou um fragmento funcional ou variante destes. Após o contato com o vetor de terapia genética recombinante, o neurônio expressa a proteína de tipo selvagem ou fragmento funcional ou variante desta.
[009] Em algumas modalidades, a proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA compreende a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK2 e a proteína de tipo selvagem PARK2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a
17. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência de polinucleotídeo PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA apresentada nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK? e o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo isoforma PARK2 apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOs: 27 a 34. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende menos de 40, menos de 30,
menos de 20 ou 10 ou menos ilhas CpG. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 10 ilhas CpG. Em algumas modalidades, compreende entre 5 e 20 ilhas CpG.
[010] Podem ser usados vários vetores virais ou não virais. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante é um vírus adeno-associado recombinante (AAV). Qualquer um dos sorotipos conhecidos pode ser usado. Em algumas modalidades, o AAV possui o sorotipo AAV1, AAV2, AAVS5, AAV8, AAV9, AAVrhiO ou AAVrh74. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV autocomplementar. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV de fita simples. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado. Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com uma proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
[011] O vetor de terapia genética recombinante pode incluir elementos reguladores de gene. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um polinucleotídeo compreendendo, na seguinte ordem 5' a 3', uma sequência promotora eucarioticamente ativa e a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante destas. A sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante desta, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa.
[012] Sem ser limitado por exemplos da divulgação, o vetor de terapia genética recombinante em algumas modalidades compreende ainda um ou mais de um promotor específico de neurônio, opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em hSYN1 (sinapsina humana), INA (alfa-internexina), NES (nestina), TH (tirosina hidroxilase), FOXA2 ( Forkhead box A2), CaMKlII (proteína quinase || dependente de calmodulina) e promotores de NSE (enolase específica do neurônio); um promotor ubíquo selecionado do grupo que consiste em promotores de CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-alfa, GAPDH, SV40, HBV e beta-actina de frango; um intensificador; um íntron; um sinal poli-A; um WPRE (elemento regulador pós- transcricional do vírus de hepatite de marmota); e um HPRE (elemento regulador pós-transcricional da hepatite). O WPRE pode ser um WPRE(r) ou um WPRE(x).
[013] Em várias modalidades de qualquer um dos vetores e métodos divulgados neste documento, o vetor compreende um cassete de expressão compreendendo na ordem 5' a 3': promotor HuBA, o transgene, WPRE(x) e pAGlobin-Oc; promotor de CMV, intensificador de TPL-eMLP 5', o transgene, WPRE(r) e PAGIobin-Oc; promotor Syn, o transgene, WPRE(r), 3'UTR (globina) e pAGH-Bt; promotor CBA, o transgene e pAGH-Bt; promotor de EF1a, o transgene e pAGIobin-Oc; promotor HuBA, o transgene, R2QV17 e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, WPRE(x), 3'UTR (globina) e pAGH-Hs; promotor CaMKlla, o transgene, WPRE(r) e pPAGH-Hs; promotor de CMV e TPL, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor HuBA, o transgene e pAGH-Hs; promotor CMV e TPL, eMPL, o transgene, R2V17, 3UTR(globina) e pAGH- Bt; promotor EF1, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, R2V17 e pAGIobin-Oc; promotor CaMkKlla, o transgene, R2QV17 e pAGIobin-Oc; promotor CBA, o transgene, WPRE(x), 3 UTR(globina) e pAGH-Hs; promotor CBA, o transgene, 3'UTR(globina) e pAGIobin-Oc;
promotor CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGH-Bt; promotor de EF1a, o transgene, R2QV17, 3'globina e pAGH-Hs; promotor CMV, o transgene, R2V17, 3UTR(globina) e pAGH-Hs; ou promotor CMV, o transgene e pAGH-Hs, opcionalmente, em que o transgene codifica PARK2.
[014] Os métodos da divulgação podem ter vários efeitos. Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de moncamina oxidases após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, o neurônio sofre mitofagia aumentada após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[015] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade menor de monoamina oxidases em comparação com uma quantidade de monoamina oxidases expressa em um neurônio que não está em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente, em que a referida quantidade inferior é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% menos do que a quantidade expressa no neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina em comparação com uma quantidade de dopamina produzida e/ou liberada por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos
30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade produzida e/ou liberada pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, o neurônio sofre uma quantidade aumentada de autofagia em comparação com uma quantidade de autofagia sofrida por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade sofrida pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[016] O neurônio usado nos métodos da divulgação pode ter várias características. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio positivo para tirosina hidroxilase primária. Em algumas modalidades, o neurônio foi produzido a partir de uma célula-tronco pluripotente induzida preparada a partir de células obtidas de um paciente diagnosticado com doença de Parkinson.
[017] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vetor de terapia genética recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Parkinson 2 de tipo selvagem, um gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1I), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2) ou um gene de glucocerebrosidase (GBA) ou um fragmento funcional ou variante destes; em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor eucarioticamente ativo; e em que um neurônio transduzido com o referido vetor de terapia genética recombinante expressa a proteína de tipo selvagem ou fragmento funcional ou variante destes.
[018] Em algumas modalidades, a proteína funcional PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA compreende a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK? e a proteína de tipo selvagem PARK2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a 17. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência de polinucleotídeo PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT?2 ou GBA apresentada nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK2 e o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo isoforma PARK2 apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOs: 27 a 34. Em algumas modalidades, o vetor compreende um cassete de expressão compreendendo na ordem de 5' a 3': promotor HuBA, o transgene, WPRE(x) e pAGlobin-Oc; promotor de CMV, intensificador de TPL-eMLP 5', o transgene, WPRE(r) e PAGIlobin-Oc; promotor Syn, o transgene, WPRE(r), 3'UTR (globina) e pAGH-Bt; promotor CBA, o transgene e pAGH-Bt; promotor de EF1a, o transgene e pAGIobin-Oc; promotor HuBA, o transgene, R2V17 e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, WPRE(x), 3 UTR(globina) e pAGH-Hs;
promotor CaMKlla, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor de CMV e TPL, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor HuBA, o transgene e pAGH-Hs; promotor de CMV e TPL, eMPL, o transgene, R2V17, 3'UTR(globina) e PAGH-Bt; promotor de EF1a, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, R2V17 e pAGlobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGIobin-Oc; promotor CBA, o transgene, WPRE(x), 3'UTR(globina) e pAGH-Hs; promotor CBA, o transgene, 3'UTR(globina) e pAGIobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGH-Bt; promotor de EF1a, o transgene, R2V17, 3'UTR(globina) e pAGH-Hs;.
promotor CMV, o transgene, R2V17, 3'UTR(globina) e pAGH-Hs; ou promotor CMV, o transgene e pAGH-Hs, opcionalmente, em que o transgene codifica PARK2.
[019] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 a 38. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante é um vírus adeno-associado recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, o rAAV possui o sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrhiO ou AAVrh74. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um genoma AAV autocomplementar ou de fita simples. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado. Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
[020] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para tratar ou inibir o início de uma doença de Parkinson (DP) em um paciente que sofre de ou em risco de DP, compreendendo a administração de um vetor de terapia genética recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Parkinson 2 de tipo selvagem, um gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2) ou um gene de glucocerebrosidase (GBA) ou um fragmento funcional ou variante destes ao paciente; em que a administração do vetor de terapia genética recombinante trata ou inibe o aparecimento da doença de Parkinson no paciente.
[021] Em algumas modalidades, a DP é uma DP de aparecimento precoce, opcionalmente uma DP autossômica recessiva de aparecimento precoce. Em algumas modalidades, o paciente compreende uma mutação em um gene PARK2, gene PINK1, gene LRRK2, gene SCNA, gene c-Rel, gene ATG7, VMAT2 ou gene GBA. Em algumas modalidades, a proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA compreende a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK2 e a proteína de tipo selvagem PARK2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a 17. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência de polinucleotídeo PARK?2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA apresentada nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente. Em algumas modalidades, o gene é o gene PARK? e o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo isoforma PARK2 apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOs: 27 a 34. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
[022] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante é um vírus adeno-associado recombinante (AAV). Em algumas modalidades, o AAV possui o sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrhi1iO ou AAVrh74. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um genoma AAV autocomplementar. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV de fita simples. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado. Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
[023] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um polinucleotídeo compreendendo na ordem seguinte 5' a 3', uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e a sequência que codifica a proteina de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante deste; em que a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante deste, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa.
[024] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende ainda um ou mais de um promotor específico do neurônio, opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em hSYN1 (sinapsina humana), INA (alfa-internexina), NES (nestina), TH (tirosina hidroxilase), FOXA2 ( Forkhead box A2), CaMKlII (proteína quinase |l dependente de calmodulina) e promotores de NSE (enolase específica do neurônio); um promotor ubíquo selecionado do grupo que consiste em promotores de CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-
alfa, GAPDH, SV40, HBV, beta-actina humana e beta-actina de frango; um intensificador; um íntron; um sinal poli-A; um WPRE (elemento regulador pós- transcricional do vírus da hepatite de marmota); e um HPRE (elemento regulador pós-transcricional da hepatite).
[025] O vetor de terapia genética recombinante ou sistema de edição de genes pode ser administrado de várias maneiras. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende administração sistêmica, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intratecal com inclinação de Threndelenburg. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção direta na porção compacta da substância negra do cérebro. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a introdução do vetor de terapia genética recombinante no cérebro ou no líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.
[026] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente. Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10*º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao cérebro do paciente. Em algumas modalidades, 1x10º - 1xX10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao LCR do paciente. Em algumas modalidades, 1x107 - 1x10º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente.
[027] Os métodos da divulgação referem-se a formas de doença para adultos e jovens. Em algumas modalidades, o paciente é um adulto. Em algumas modalidades, o paciente é uma criança.
[028] Os métodos da divulgação podem ter vários efeitos sobre o paciente. Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos no paciente após a etapa de administração é maior do que o número de neurônios dopaminérgicos no paciente antes da etapa de administração. Em algumas modalidades, o nível de dopamina no paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de dopamina no paciente antes da etapa de administração. Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente não tratado. Em algumas modalidades, o nível de dopamina de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina em um paciente não tratado. Em algumas modalidades, o nível de dopamina na substância negra de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina na substância negra de um paciente não tratado. Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR do paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de PRKN no LCR do paciente antes da etapa de administração. Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS (Escala Unificada para Avaliação da Doença de Parkinson) do paciente antes da etapa de administração é melhorada em comparação com a pontuação de UPDRS do paciente antes da etapa de administração. Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de PRKN no LCR de um paciente não tratado. Em algumas modalidades, o nível de PRKN na substância negra do paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de PRKN na substância negra do paciente antes da etapa de administração. Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS de um paciente tratado pelo método é melhorada em comparação com a pontuação UPDRS de um paciente não tratado. Em algumas modalidades, o neurônio do paciente expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[029] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico que possui um gene Parkin mutado (PRKN), compreendendo colocar o neurônio em contato com um sistema de edição de genes que compreende: Proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; um RNA guia (gRNA); e um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2 funcional, um gene de proteína ubiquitina ligase ES(PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c- Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2) ou um gene de glucocerebrosidase (GBA) ou um fragmento funcional ou variante destes; em que o sistema de edição de genes é capaz de reparar um gene endógeno no neurônio ou inserir um gene funcional no genoma do neurônio.
[030] Em algumas modalidades, pelo menos um componente do sistema de edição de genes é liberado pelo AAV recombinante. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes é liberado pelo AAV recombinante.
[031] Em outro aspecto, a divulgação fornece um sistema de edição de genes para uma célula que compreende: Proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; um RNA guia (gRNA); e um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2 funcional, um gene de proteína ubiquitina ligase ES(PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA) ou um fragmento funcional ou variante destes; em que o sistema de edição de genes é capaz de reparar um gene endógeno na célula ou inserir um gene funcional no genoma da célula.
[032] Em algumas modalidades, pelo menos um componente do sistema de edição de genes é liberado pelo AAV recombinante. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes é liberado pelo AAV recombinante. Em algumas modalidades, a célula é um neurônio ex vivo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de um paciente.
[033] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vetor de terapia genética recombinante, compreendendo um polinucleotídeo transgene que codifica o gene da proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), em que o polinucleotídeo transgene está operacionalmente ligado a uma sequência promotora eucarioticamente ativa.
[034] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo transgênico compartilha pelo menos 95% de identidade com uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
[035] Em algumas modalidades, a sequência promotora é selecionada da Tabela 5.
[036] Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda um intensificador de CMV.
[037] Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma região não traduzida 5' (UTR) selecionada da Tabela 6.
[038] Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma região não traduzida 3' selecionada da Tabela 7.
[039] Em algumas modalidades, o vetor compreende ainda uma sequência de poliadenilação (poliA) selecionada da Tabela 8.
[040] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon.
[041] Em algumas modalidades, o cassete de expressão compartilha pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a
58.
[042] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor vírus adeno-associado (AAV).
[043] Em algumas modalidades, o vetor compreende duas repetições terminais invertidas AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão.
[044] Em algumas modalidades, o AAV possui o sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAVrh74.
[045] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV autocomplementar.
[046] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV de fita simples.
[047] Em algumas modalidades, o AAV é um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado.
[048] Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
[049] EM outro aspecto, a divulgação fornece célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores de terapia genética recombinantes anteriores.
[050] Em outro aspecto, a divulgação fornece método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico compreendendo uma mutação em um gene associado a uma Doença de Parkinson (DP), em que o gene mutado é uma proteína de Parkinson 2, um gene de proteína ubiquitina ligase E3
(PARK2), compreendendo colocar o neurônio em contato com o vetor de terapia genética recombinante da divulgação, em que após o contato com o vetor de terapia genética recombinante, o neurônio expressa a proteína de tipo selvagem.
[051] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[052] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de moncoamina oxidases após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[053] Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[054] Em algumas modalidades, o neurônio sofre mitofagia aumentada após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[055] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade menor de monoamina oxidases em comparação com uma quantidade de monoamina oxidases expressa em um neurônio que não está em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente, em que a referida quantidade inferior é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% menos do que a quantidade expressa no neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[056] Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina em comparação com uma quantidade de dopamina produzida e/ou liberada por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos
20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos vezes maior do que a quantidade produzida e/ou liberada pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[057] EM algumas modalidades, o neurônio sofre uma quantidade aumentada de autofagia em comparação com uma quantidade de autofagia sofrida por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade sofrida pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[058] Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio positivo para tirosina hidroxilase primária.
[059] Em algumas modalidades, o neurônio foi produzido a partir de uma célula-tronco pluripotente induzida preparada a partir de células obtidas de um paciente diagnosticado com doença de Parkinson.
[060] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento ou inibição do aparecimento de uma doença de Parkinson (DP) em um paciente que sofre de ou em risco da DP, compreendendo a administração de um vetor de terapia genética da divulgação, em que a administração do vetor de terapia genética recombinante trata ou inibe o aparecimento da doença de Parkinson no paciente.
[061] Em algumas modalidades, a DP é uma DP de aparecimento precoce, opcionalmente uma DP autossômica recessiva de aparecimento precoce.
[062] Em algumas modalidades, o paciente compreende uma mutação em um gene PARK2.
[063] Em algumas modalidades, o PARK2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1.
[064] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende administração sistêmica, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
[065] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
[066] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intratecal com inclinação de Threndelenburg.
[067] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção direta na porção compacta da substância negra do cérebro.
[068] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a introdução do vetor de terapia genética recombinante no cérebro ou no líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.
[069] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente.
[070] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao cérebro do paciente.
[071] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/Kkg) do vetor de terapia genética são administrados ao LCR do paciente.
[072] Em algumas modalidades, 1x107 - 1x10º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente.
[073] Em algumas modalidades, 1x107 - 1x10** genomas de vetores totais são administrados ao paciente, por exemplo, através de injeção direta no putâmen ou substância negra.
[074] Em algumas modalidades, o paciente é um adulto.
[075] Em algumas modalidades, o paciente é uma criança.
[076] Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos no paciente após a etapa de administração é maior do que o número de neurônios dopaminérgicos no paciente antes da etapa de administração.
[077] Em algumas modalidades, o nível de dopamina no paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de dopamina no paciente antes da etapa de administração.
[078] Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente não tratado.
[079] Em algumas modalidades, o nível de dopamina de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina em um paciente não tratado.
[080] Em algumas modalidades, o nível de dopamina na substância negra de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina na substância negra de um paciente não tratado.
[081] Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR do paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de PRKN no LCR do paciente antes da etapa de administração.
[082] Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS (Escala Unificada para
Avaliação da Doença de Parkinson) do paciente antes da etapa de administração é melhorada em comparação com a pontuação de UPDRS do paciente antes da etapa de administração.
[083] Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de PRKN no LCR de um paciente não tratado.
[084] Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS de um paciente tratado pelo método é melhorada em comparação com a pontuação UPDRS de um paciente não tratado.
[085] Em algumas modalidades, o neurônio do paciente expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
[086] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes e abrangidas pela seguinte descrição detalhada e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[087] O arquivo da patente ou pedido contém pelo menos uma Figura feita a cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com figura(s) em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[088] A Figura 1 mostra uma modalidade dos cassetes de expressão da divulgação.
[089] As Figuras 2A a 2J mostram micrografias representativas da expressão genética em células SH-SY5Y para controle negativo não transferido (Figura 2A) e um controle positivo (Figura 2B). Os cassetes de expressão foram testados em duplicado: WT (Figura 2C e Figura 2D), CO1 (Figura 2E e Figura 2F), CO2 (Figura 2G e Figura 2H), e CO3 (Figura 21 e Figura 2J).
[090] A Figura 2K mostra a porcentagem de células GFP+.
[091] A Figura 2L mostra a intensidade de fluorescência das células GFP+.
[092] A Figura 3 mostra um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) para Parkin realizado em lisados celulares de células transfectadas.
[093] As Figuras 4A a 4Dmonstram micrografias representativas da expressão genética em células SH-SY5Y para controle negativo não transferido (Figura 44), WT (Figura 4B), CO1 (Figura 4C) ou COA4 (Figura 4D).
[094] A Figura 4E mostra a porcentagem de células GFP+.
[095] A Figura mostra 4F a intensidade de fluorescência das células GFP+.
[096] A Figura 5 mostra um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) para Parkin realizado em lisados celulares de células transfectadas.
[097] As Figuras 6A a 6D mostram micrografias representativas da expressão genética em células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) derivadas de células precursoras dopaminérgicas de knockout de Parkinson para controle negativo não transferido (Figura 6A), WT (Figura 6B), CO1 (Figura 6C) ou CO4 (Figura 6D).
[098] A Figura 6E mostra a porcentagem de células GFP+ e a intensidade de fluorescência das células GFP+. Para cada um dos WT, CO1 e COS, a barra esquerda indica % da intensidade da mudança de GFP em relação à WT e a barra direita indica % de células GFP+.
[099] A Figura 7 mostra uma modalidade dos cassetes de expressão de vetores AAV da divulgação.
[0100] A Figura 8 mostra um diagrama de cassetes de transgene e vários elementos destes.
[0101] A Figura 9 mostra a expressão do transgene de Parkin nas células SH-SY5Y para cada uma das construções listadas na Tabela 10.
[0102] A Figura 10 mostra a expressão do transgene de Parkin em células precursoras dopaminérgicas de knockout de Parkin derivadas de iPSC para cada uma das construções listadas na Tabela 11.
[0103] As Figuras 11h a 11D mostram micrografias fluorescentes representativas para células precursoras dopaminérgicas knockout de Parkin derivadas de iPSC transfectadas com cada uma das construções na Tabela 11 fotografadas em campo claro (Figura 11A), ou por imunofluorescência para Parkin (Figura 11B), marcador neuronal NeuN (Figura 11C) ou marcador de astrócitos GFAP (Figura 11D)
[0104] A Figura 12A mostra uma imagem ampliada da Figura 11A.
[0105] A Figura 12B mostra uma imagem ampliada da Figura 11B.
[0106] A Figura 12C mostra uma imagem ampliada da Figura 11C.
[0107] A Figura 12D mostra uma imagem ampliada da Figura 11D.
[0108] A Figura 13 fornece diagramas de projetos de construção ilustrativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0109] A presente divulgação fornece, em parte, composições e métodos para tratar, prevenir, inibir ou atrasar a degeneração do sistema nervoso central, por exemplo, no tratamento de uma doença de Parkison. Em particular, os inventores divulgam várias modalidades de um vetor de terapia genética recombinante que compreende uma proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c- Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou fragmento funcional ou variante destes. Como usado aqui, o termo "gene" ou "transgene" é usado de forma intercambiável e refere-se a uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo ou proteína, como qualquer uma das proteínas divulgadas na Tabela 1.
[0110] A invenção ainda inclui várias modalidades de um sistema de edição de gene que compreende uma proteína Cas, RNA guia, um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1I), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c- Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2) ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou fragmento funcional ou variante destes;
[0111] A divulgação inclui ainda métodos de para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico com um gene PARK2 mutado e métodos para tratar ou inibir o aparecimento ou progressão da doença de Parkinson em um paciente que sofre ou corre o risco de doença de Parkinson. Em modalidades particulares, a doença de Parkinson é uma doença de Parksinson juvenil de aparecimento precoce. Em certas modalidades, é associado a ou causado por uma mutação autossômica recessiva, por exemplo, no gene PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA de um paciente. Em algumas modalidades, um vetor viral, por exemplo, um vírus adeno-associado (AAV), é usado para fornecer uma construção de terapia gênica recombinante ao corpo ou, mais particularmente, ao cérebro de um paciente. Também são fornecidos vetores de terapia genética recombinante ou sistemas de edição de genes para PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA. A Tabela 1 fornece sequências de proteínas. Esses genes são expressos como várias isoformas. Por exemplo, e sem limitar a divulgação ao PARK2, as isoformas de PARK2 são fornecidas na Tabela 2. A Tabela 3 fornece sequências polinucleotídicas. A Tabela 4 fornece sequências polinucleotídicas para as isoformas de PARK2. A divulgação fornece composições e métodos que compreendem ou codificam qualquer uma das isoformas como proteínas ou polinucleotídeos, incluindo polinucleotídeos otimizados por códon e variantes com ou sem emendas (splice). TABELA 1: EXEMPLOS NÃO LIMITATIVOS DE GENES ASSOCIADOS À
DEGRADAÇÃO DO SNC Gene SEQ ID Sequência de proteínas sinônimo NO: >sp|O60260/PRKN HUMAN proteína ubiquitina ligase E3 parkin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN PE=1 SV=2
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQAQSIVHIVARP
WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPOSLTRVDL PARK2 | SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN (PRK2; SFYVYCKGPCOQRVAPGKLRVAQCSTCRQATLTLTAGP 1 PRKN; SCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAH Parkin) PTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQC
NSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPC VAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQ MGGVLCPRPGCGAGLLPEPDOQRKVTCEGGNGLGCG FAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERA AEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMH
MKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV >sp|Q9BXM7|PINK1 HUMAN proteína quinase PARK6 serina/treonina PINK1, mitocondrial OS=Homo sapiens (PRK6; 2 OX=9606 GN=PINK1 PE=1 SV=1 PINK1)
MAVRQALGRGLQLGRALLLRFTGKPGRAYGLGRPG
EL Tm E] Sequência de proteínas sinônimo NO:
PAAGCVRGERPGWAAGPGAEPRRVGLGLPNRLRFF RQSVAGLAARLARQFVVRAWGCAGPCGRAVFLAFG LGLGLIEEKQAESRRAVSACQEIQAIFTAKSKPGPDPL DTRRLQOGFRLEEYLIGQSIGKGCSAAVYEATMPTLPQ NLEVTKSTGLLPGRGPGTSAPGEGQERAPGAPAFPL AIKMMWNISAGSSSEAILNTMSQELVPASRVALAGEY GAVTYRKSKRGPKQLAPHPNIIRVLRAFTSSVPLLPG ALVDYPDVLPSRLHPEGLGHGRTLFLVMKNYPCTLR QYLCVNTPSPRLAAMMLLQLLEGVDHLVQQGIAHRD LKSDNILVELDPDGCPWLVIADFGCCLADESIGLQLPF SSWYVDRGGNGCLMAPEVSTARPGPRAVIDYSKAD AWAVGAIAYEIFGLVNPFYGQGKAHLESRSYQEAQLP ALPESVPPDVRQLVRALLOREASKRPSARVAANVLHL SLWGEHILALKNLKLDKMVGWLLQQSAATLLANRLTE
KCCVETKMKMLFLANLECETLCQAALLLCSWRAAL >sp|Q99497/PARK7 HUMAN Dedglicase de proteínas/ácidos nucleicos DJ-1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PARK7 PE=1 SV=2 PARK7 MASKRALVILAKGAEEMETVIPVDVMRRAGIKVTVAG (PRK7;DJ- | LAGKDPVQCSRDVVICPDASLEDAKKEGPYDVVVLP 3 1) GGNLGAQNLSESAAVKEILKEQENRKGLIAAICAGPT
ALLAHEIGFGSKVTTHPLAKDKMMNGGHYTYSENRV EKDGLILTSRGPGTSFEFALAIVEALNGKEVAAQVKAP
LVLKD | rrK2 | >splossooniLRRKa HUMAN proteina quinase2 | a |
E ee | Sequência de proteínas sinônimo NO: (PARK8; | serina/treonina rica em repetição de leucina OS=Homo PRK8) sapiens OX=9606 GN=LRRK2 PE=1 SV=2
MASGSCQGCEEDEETLKKLIVRLNNVQEGKQIETLVQ ILEDLLVFTYSERASKLFQGKNIHVPLLIVLDSYMRVAS VQAQQVGWSLLCKLIEVCPGTMOSLMGPQDVGNDWEV LGVHQLILKMLTVHNASVNLSVIGLKTLDLLLTSGKITL LILDEESDIFMLIFDAMHSFPANDEVQKLGCKALHVLF ERVSEEQLTEFVENKDYMILLSALTNFKDEEEIVLHVL HCLHSLAIPCNNVEVLMSGNVRCYNIVVEAMKAFPMS ERIQEVSCCLLHRLTLGNFFNILVLNEVHEFVVKAVQQ YPENAALQISALSCLALLTETIFLNQDLEEKNENQEND DEGEEDKLFWLEACYKALTWHRKNKHVQEAACWAL NNLLMYQNSLHEKIGDEDGHFPAHREVMLSMLMHSS SKEVFQASANALSTLLEQNVNFRKILLSKGIHLNVLEL MQKHIHSPEVAESGCKMLNHLFEGSNTSLDIMAAVVP KILTVMKRHETSLPVQLEALRAILHFIVPGMPEESRED TEFHHKLNMVKKQCFKNDIHKLVLAALNRFIGNPGIQK CGLKVISSIVHFPDALEMLSLEGAMDSVLHTLQMYPD DQEIQCLGLSLIGYLITKKNVFIGTGHLLAKILVSSLYRF KDVAEIQATKGFQTILAILKLSASFSKLLVHHSFDLVIFH QMSSNIMEQKDQQFLNLCCKCFAKVAMDDYLKNVML ERACDQNNSIMVECLLLLGADANQAKEGSSLICQVCE KESSPKLVELLLNSGSREQDVRKALTISIGKGDSQ!IISL LLRRLALDVANNSICLGGFCIGKVEPSWLGPLFPDKT SNLRKQTNIASTLARMVIRYQMKSAVEEGTASGSDG
E Qi | Sequência de proteínas sinônimo NO:
NFSEDVLSKFDEWTFIPDSSMDSVFAQSDDLDSEGS EGSFLVKKKSNSISVGEFYRDAVLORCSPNLORHSN SLGPIFDHEDLLKRKRKILSSDDSLRSSKLOSHMRHS DSISSLASEREYITSLDLSANELRDIDALSQKCCISVHL EHLEKLELHOQNALTSFPQQLCETLKSLTHLDLHSNKF TSFPSYLLKMSCIANLDVSRNDIGPSVVLDPTVKCPTL KQFNLSYNQLSFVPENLTDVVEKLEQLILEGNKISGIC SPLRLKELKILNLSKNHISSLSENFLEACPKVESFSAR MNFLAAMPFLPPSMTILKLSQNKFSCIPEAILNLPHLR SLDMSSNDIQYLPGPAHWKSLNLRELLFSHNQISILDL SEKAYLWSRVEKLHLSHNKLKEIPPEIGCLENLTSLDV SYNLELRSFPNEMGKLSKIWDLPLDELHLNFDFKHIG CKAKDIIRFLAQRLKKAVPYNRMKLMIVGNTGSGKTT LLAQQLMKTKKSDLGMQSATVGIDVKDWPIQIRDKRKR DLVLNVWDFAGREEFYSTHPHFMTORALYLAVYDLS KGQAEVDAMKPWLFNIKARASSSPVILVGTHLDVSDE KQRKACMSKITKELLNKRGFPAIRDYHFVNATEESDA LAKLRKTIINESLNFKIRDQLVVGOQLIPDCYVELEKIILS ERKNVPIEFPVIDRKRLLQLVRENQLQLDENELPHAV HFLNESGVLLHFQDPALQLSDLYFVEPKWLCKIMAQ! LTVKVEGCPKHPKGIISRRDVEKFLSKKRKFPKNYMS QYFKLLEKFQIALPIGEEYLLVPSSLSDHRPVIELPHCE NSEINIRLYEMPYFPMGFWSRLINRLLEISPYMLSGRE RALRPNRMYWRQGIYLNWSPEAYCLVGSEVLDNHP ESFLKITVPSCRKGCILLGQVVDHIDSLMEEWFPGLLE
E ee E Sequência de proteínas sinônimo NO:
IDICGEGETLLKKWALYSFNDGEEHQKILLDDLMKKAE EGDLLVNPDQPRLTIPISQIAPDLILADLPRNIMLNNDE LEFEQAPEFLLGDGSFGSVYRAAYEGEEVAVKIFNKH TSLRLLRQELVVLCHLHHPSLISLLAAGIRPRMLVMEL ASKGSLDRLLAQQDKASLTRTLQHRIALHVADGLRYLH SAMIIYRDLKPHNVLLFTLYPNAAIIAKIADYGIAQYCCR MGIKTSEGTPGFRAPEVARGNVIYNQQADVYSFGLLL YDILTTGGRIVEGLKFPNEFDELEIQGKLPDPVKEYGC APWPMVEKLIKQCLKENPQERPTSAQVFDILNSAELV CLTRRILLPKNVIVECMVATHHNSRNASIWLGCGHTD RGQLSFLDLNTEGYTSEEVADSRILCLALVHLPVEKE SWIVSGTOASGTLLVINTEDGKKRHTLEKMTDSVTCLY CNSFSKQOSKQKNFLLVGTADGKLAIFEDKTVKLKGAA PLKILNIGNVYSTPLMCLSESTNSTERNVMWGGCGTKI FSFSNDFTIQKLIETRTSQLFSYAAFSDSNIITVVVDTA LYIAKQONSPVVEVWDKKTEKLCGLIDCVHFLREVMVK ENKESKHKMSYSGRVKTLCLQOKNTALWIGTGGGHILL LDLSTRRLIRVIYNFCNSVRVMMTAQLGSLKNVMLVL GYNRKNTEGTQAKQKEIQSCLTVWDINLPHEVONLEK
HIEVRKELAEKMRRTSVE >sp|P37840/SYUA HUMAN Alfa-sinucleína OS=Homo aa sapiens OX=9606 GN=SNCA PE=1 SV=1 sinucleina MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKE 5 (PARKI; GVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVV PRI) TGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGA
E eee TE Sequência de proteínas sinônimo NO: | | rocereovevoroNEAvEMPSEEGYaDvEREn | == | >sp|Q04864/REL HUMAN Proto-oncogene c-Rel OS=Homo sapiens OX=9606 GN=REL PE=1 SV=1
MASGAYNPYIEIIEQPRQORGMRFRYKCEGRSAGSIPG EHSTDNNRTYPSIQIMNYYGKGKVRITLVTKNDPYKP HPHDLVGKDCRDGYYEAEFGQERRPLFFQNLGIRCV KKKEVKEAIITRIKAGINPFNVPEKQLNDIEDCDLNVVR LCFQVFLPDEHGNLTTALPPVVSNPIYDNRAPNTAEL RICRVNKNCGSVRGGDEIFLLCDKVQKDDIEVRFVLN
DWEAKGIFSQADVHRQVAIVFKTPPYCKAITEPVTVK eRer MQOLRRPSDQEVSESMDFRYLPDEKDTYGNKAKKQK
NAS TTLLFQOKLCQDHVETGFRHVDQDGLELLTSGDPPTLA SQSAGITVNFPERPRPGLLGSIGEGRYFKKEPNLFSH DAVVREMPTGVSSQAESYYPSPGPISSGLSHHASMA PLPSSSWSSVAHPTPRSGNTNPLSSFSTRTLPSNSQ GIPPFLRIPVYGNDLNASNACIYNNADDIVGMEASSMP SADLYGISDPNMLSNCSVNMMTTSSDSMGETDNPRL LSMNLENPSCNSVLDPRDLRQLHQMSSSSMSAGAN SNTTVFVSQSDAFEGSDFSCADNSMINESGPSNSTN
PNSHGFVQDSQYSGIGSMONEQLSDSFPYEFFQV >sp|Q9D906/ATG7 MOUSE enzima ativadora modificadora do tipo ubiquitina ATG7 OS=Mus ATG7 musculus OX=10090 GN=Atg7 PE=1 SV=1 7
MGDPGLAKLQFAPFNSALDVGFWHELTOQKKLNEYRL DEAPKDIKGYYYNGDSAGLPTRLTLEFSAFDMSASTP
EL le E Sequência de proteínas sinônimo NO:
AHCCPAMGTLHNTNTLEAFKTADKKLLLEQSANEIWE AIKSGAALENPMLLNKFLLLTFADLKKYHFYYWFCCP ALCLPESIPLIRGPVSLDQRLSPKQIQALEHAYDDLCR AEGVTALPYFLFKYDDDTVLVSLLKHYSDFFOGQORTK ITVGVYDPCNLAQYPGWPLRNFLVLAAHRWSGSFQS VEVLCFRDRTMQGARDVTHSIIFEVKLPEMAFSPDCP KAVGWEKNQKGGMGPRMVNLSGCMDPKRLAESSV DLNLKLMCWRLVPTLDLDKVVSVKCLLLGAGTLGCN VARTLMGWGVRHVTFVDNAKISYSNPVRQPLYEFED CLGGGKPKALAAAERLQKIFPGVNARGFNMSIPMPG HPVNFSDVTMEQARRDVEQLEQLIDNHDVIFLLMDTR ESRWLPTVIAASKRKLVINAALGFDTFVVMRHGLKKP KQQGAGDLCPSHLVAPADLGSSLFANIPGYKLGCYF CNDVVAPGDSTRDRTLDQQCTVSRPGLAVIAGALAV ELMVSVLQOHPEGGYAIASSSDDRMNEPPTSLGLVPH QIRGFLSRFDNVLPVSLAFDKCTACSPKVLDQYEREG FTFLAKVFNSSHSFLEDLTGLTLLHQETQAAEIWDMS
DEETV >sp|Q05940)|VMAT2 HUMAN Transportador sináptico de amina vesicular OS=Homo sapiens OX=9606 GN=SLC18A2 PE=1 SV=2 VMAT2 | MALSELALVRWLQESRRSRKLILFIVFLALLLDNMLLT VVVPIIPSYLYSIKHEKNATEIQTARPVHTASISDSFQS|
FSYYDNSTMVTGNATRDLTLHOTATQHMVTNASAVP SDCPSEDKDLLNENVQVGLLFASKATVQLITNPFIGLL
EL eee E Sequência de proteínas sinônimo NO:
TNRIGYPIPIFAGFCIMFVSTIMFAFSSSYAFLLIARSLQ
GIGSSCSSVAGMGMLASVYTDDEERGNVMGIALGGL AMGVLVGPPFGSVLYEFVGKTAPFLVLAALVLLDGA|
QLFVLAPSRVAQPESQKGTPLTTLLKDPYILIAAGSICF ANMGIAMLEPALPIWMMETMCSRKWQLGVAFLPAS|
SYLIGTNIFGILAHKMGRWLCALLGMIIVGVSILCIPFAK NIYGLIAPNFGVGFAIGMVDSSMMPIMGYLVDLRHVS VYGSVYAIADVAFCMGYAIGPSAGGAIAKAIGFPWLM TIIGIIDILFAPLCFFLRSPPAKEEKMAILMDHNCPIKTK
MYTQNNIQOSYPIGEDEESESD >sp|PO4062)|GLCM HUMAN Glucosilceramidase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=GBA PE=1 SV=3
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQOAVSWA SGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALG TFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQP EQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSY FSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHN GBA FSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTW LKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAY AEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQ RDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDORLLLPHWAK VVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRL FPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSH SIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPI IVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVAS
EL Te E] Sequência de proteínas sinônimo NO:
VGFLETISPGYSIHTYLWRRQ TABELA 2: ISOFORMAS DE PARK2 isoforma NO: PARK?2 (1) | >sp|O60260/PRKN HUMAN proteína ubiquitina ligase | 10 E3 parkin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN PE=1 SV=2
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQQSIVHIVORP WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDL SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN SFYVYCKGPCOQRVAPGKLRVAQCSTCRQATLTLTAGP SCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAH PTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQC NSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPC VAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQO MGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCG FAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERA AEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMH
MKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV PARK2 (2) | >sp|O60260-2|/|PRKN HUMAN Isoforma 2 de proteína | 11 ubiquitina ligase E3 parkin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN isoforma NO:
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQOSIVHIVARP WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDL SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN SFYVYCKGPCOQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQEF FFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRS PVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQL GYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGA EECVLOMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGG NGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTOQAY RVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEK NGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGD
HWFDV PARK?2 (3) | >spjO60260-3/PRKN HUMAN Isoforma 3 de proteína | 12 ubiquitina ligase E3 parkin OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN
MNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPG DSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCK GPCORVAPGKLRVAQCSTCROATLTLTAGPSCWDDV LIPNRMSGECOSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKET SVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICL
DCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVVCLLPGM PARK?2 (4) | >sp|O60260-4)|PRKN HUMAN Isoforma 3 de proteína | 13 ubiquitina ligase E3 parkih OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN isoforma NO:
MSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALH LIATNSRNITCITCETDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHL YCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELH HFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQOMGGVLCPRPGC GAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAY HEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAAS KETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRL
EWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV PARK?2 (5) | >sp|O60260-5) PRKN HUMAN Isoforma 5 de proteína | 14 ubiquitina ligase E3 parkihn OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQOQSIVHIVORP WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDL SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN SFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTAGP SCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAH PTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQC NSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPC VGTGDTVVLRGALGGFRRGVAGCPNSLIKELHHFRIL GEEQYNRYQQYGAEECVLAOMGGVLCPRPGCGAGLL
PEPDORKVTCEGGNGLGCGYGARRTK PARK?2 (6) | >sp|O60260-6/PRKN HUMAN Isoforma 6 de proteína | 15 ubiquitina ligase E3 parkih OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN isoforma NO:
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQEFFFKCGAHPTSDKET SVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICL DCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSL IKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCP RPGCGAGLLPEPDORKVTCEGGNGLGCGFAFCREC KEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARW EAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQP
QCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV PARK?2 (7) | >sp|O60260-7/|PRKN HUMAN Isoforma 7 de proteína | 16 ubiquitina ligase E3 parkih OS=Homo sapiens OX=9606 GN=PRKN
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQOQSIVHIVARP WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPOQSLTRVDL SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN SFYVYCKGPCOQRVQAQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQEF FFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRS PVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQL GYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQFAFCRECKE AYHEGECSAVFEASGTTTOAYRVDERAAEQARWEA ASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQ
CRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV ubiquitina ligase E3 parkin OS=Homo sapiens isoforma NO: OX=9606 GN=PRKN
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVP ADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQQSIVHIVARP WRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDL SSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYN SFYVYCKGPCOQRVQAQPGKLRVQCSTCRQATLTLTAGP SCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAH PTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQC NSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPC VAGCPNSLIKELHHFRILGEEQFAFCRECKEAYHEGE CSAVFEASGTTTQOAYRVDERAAE QARWEAASKETIK KTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWC
WNCGCEWNRVCMGDHWFDV TABELA 3: POLINUCLEOTÍDEOS DE GENES DE EXEMPLO NÃO
LIMITATIVOS ASSOCIADOS À DEGRADAÇÃO DO SNC sinônimo: NO: PARK2 >NM 004562 .2:135-1532 proteína ubiquitina ligase E3 | 18 (PRK2; RBR parkin de Homo sapiens (PRKN), variante de PRKN; transcrição 1, MRNA Parkin) ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG
TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG
GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG sinônimo NO:
GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGG GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC TCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC GCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATG ATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGC CAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATT TTTCTTTAMATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAA GGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAA ATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGAC GTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTC CCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATA CTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTC ACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTG GCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCA TCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTACAACC
GGTACCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGTCCT GCAGATGGGGGGCGTEGTTATGCCCCCGCceteGC sinônimo NO:
TGTGGAGCGGGGCTGCTGCCGGAGCCTGACCAGA GGAAAGTCACCTGCGAAGGGGGCAATGGCCTGGG CTGTGGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAAAGAAG CGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGTATTTGAA GCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACAGAGTCGA TGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTGGGAAGCA GCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCACCAAGCC CTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAAAAAAATG GAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCAGCCCCA GTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGTGGCTGC GAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCACTGGT
TCGACGTGTAG PARK6 >NM 032409.2:95-1840 quinase putativa 1 induzida | 19 (PRK6; por PTEN de Homo sapiens (PINK1), MGRNA PINK1) ATGGCGGTGCGACAGGCGCTEGGCCGCGGCCTGE
CAGCTGGGTCGAGCGCTGCTGCTGCGCTTCACGG GCAAGCCCGGCCEGEGCCTACEGCTTGGEGCEGGC CEGGECCCEGCEGCEGECTETETCCGCEGEGAGEC GTCCAGGCTGGGCCGCAGGACCGGGCGCEGAGC CTCGCAGGGTCGGGCTCGGGCTCCCTAACCGTCT CCGCTTCTTCEGCCAGTEGGTEGCCGGGCTEGCGÇ GCGCEGTTECAGCGGCAGTTCGTGGTECEGGCCT GGGGCTEGCECEGECCCTTECEGCCEGGCAGTCT TTCTGGCCTTCGGGCTAGEGCTEGGGCCTCATCGA
GGAAAAACAGGCGGAGAGCCGGCGGGCGGTCTC sinônimo NO:
GGCCTGTCAGGAGATCCAGGCAATTTTTACCCAGA AAAGCAAGCCGGGGCCTGACCCGTTGGACACGAG ACGCTTGCAGGGCTTTCGGCTGGAGGAGTATCTGA TAGGGCAGTCCATTGGTAAGGGCTGCAGTGCTGCT GTGTATGAAGCCACCATGCCTACATTGCCCCAGAA CCTGGAGGTGACAAAGAGCACCGGGTTGCTTCCA GGGAGAGGCCCAGGTACCAGTGCACCAGGAGAAG GGCAGGAGCGAGCTCCGGGGGCCCCTGCCTTCCC CTTGGCCATCAAGATGATGTGGAACATCTCGGCAG GTTCCTCCAGCGAAGCCATCTTGAACACAATGAGC CAGGAGCTGGTCCCAGCGAGCCGAGTGGCCTTGG CTGGGGAGTATGGAGCAGTCACTTACAGAAAATCC AAGAGAGGTCCCAAGCAACTAGCCCCTCACCCCAA CATCATCCGGGTTCTCCGCGCCTTCACCTCTTCCG TGCCGCTGCTGCCAGGGGCCCTGGTCGACTACCOC TGATGTGCTGCCCTCACGCCTCCACCCTGAAGGCC TGGGCCATGGCCGGACGCTGTTCCTCGTTATGAAG AACTATCCCTGTACCCTGCGCCAGTACCTTTGTGT GAACACACCCAGCCCCCGCCTCGCCGCCATGATG CTGCTGCAGCTGCTGGAAGGCGTGGACCATCTGG TTCAACAGGGCATCGCGCACAGAGACCTGAAATCC GACAACATCCTTGTGGAGCTGGACCCAGACGGCT GCCCCTGGCTGGTGATCGCAGATTTTGGCTGCTGC CTGGCTGATGAGAGCATCGGCCTGCAGTTGCCCTT
CAGCAGCTGGTACGTGGATCGGGGCGGAAACGGC sinônimo NO:
TGTCTGATGGCCCCAGAGGTGTCCACGGCCCGTC CTGGCCCCAGGGCAGTGATTGACTACAGCAAGGC TGATGCCTGGGCAGTGGGAGCCATCGCCTATGAA ATCTTCGGGCTTGTCAATCCCTTCTACGGCCAGGG CAAGGCCCACCTTGAAAGCCGCAGCTACCAAGAG GCTCAGCTACCTGCACTGCCCGAGTCAGTGCCTCC AGACGTGAGACAGTTGGTGAGGGCACTGCTCCAG CGAGAGGCCAGCAAGAGACCATCTGCCCGAGTAG CCGCAAATGTGCTTCATCTAAGCCTCTGGGGTGAA CATATTCTAGCCCTGAAGAATCTGAAGTTAGACAAG ATGGTTGGCTGGCTCCTCCAACAATCGGCCGCCAC TTTGTTGGCCAACAGGCTCACAGAGAAGTGTTGTG TGGAAACAAAAATGAAGATGCTCTTTCTGGCTAACC TGGAGTGTGAAACGCTCTGCCAGGCAGCCCTCCT
CCTCTGCTCATGGAGGGCAGCCCTGTGA PARK7 >NM 007262.4:164-733 Deglicase associado ao/20 (PRK7;DJ- | parkinsonismo de Homo sapiens (PARK7), variante de 1) transcrição 1, MRNA
ATGGCTTCCAAAAGAGCTCTGGTCATCCTGGCTAA AGGAGCAGAGGAAATGGAGACGGTCATCCCTGTA GATGTCATGAGGCGAGCTGGGATTAAGGTCACCGT TGCAGGCCTGGCTGGAAAAGACCCAGTACAGTGTA GCCGTGATGTGGTCATTTGTCCTGATGCCAGCCTT GAAGATGCAAAAAAAGAGGGACCATATGATGTGGT
GGTTCTACCAGGAGGTAATCTGGGCGCACAGAATT sinônimo NO:
TATCTGAGTCTGCTGCTGTGAAGGAGATACTGAAG GAGCAGGAAAACCGGAAGGGCCTGATAGCCGCCA TCTGTGCAGGTCCTACTGCTCTGTTGGCTCATGAA ATAGGTTTTGGAAGTAAAGTTACAACACACCCTCTT GCTAAAGACAAAATGATGAATGGAGGTCATTACAC CTACTCTGAGAATCGTGTGGAAAAAGACGGCCTGA TTCTTACAAGCCGGGGGCCTGGGACCAGCTTCGA GTTTGCGCTTGCAATTGTTGAAGCCCTGAATGGCA AGGAGGTGGCGGCTCAAGTGAAGGCTCCACTTGT
TCTTAAAGACTAG LRRK2 >NM 198578.3:122-7705 quinase rica em leucina de | 21 (PARK8; repetição 2 de Homo sapiens (LRRK2), MGRNA PRK8) ATGGCTAGTGGCAGCTGTCAGGGGTGCGAAGAGG
ACGAGGAAACTCTGAAGAAGTTGATAGTCAGGCTG AACAATGTCCAGGAAGGAAAACAGATAGAAACGCT GGTCCAAATCCTGGAGGATCTGCTGGTGTTCACGT ACTCCGAGCACGCCTCCAAGTTATTTCAAGGCAAA AATATCCATGTGCCTCTGTTGATCGTCTTGGACTCC TATATGAGAGTCGCGAGTGTGCAGCAGGTGGGTT GGTCACTTCTGTGCAAATTAATAGAAGTCTGTCCAG GTACAATGCAAAGCTTAATGGGACCCCAGGATGTT GGAAATGATTGGGAAGTCCTTGGTGTTCACCAATT GATTCTTAAAATGCTAACAGTTCATAATGCCAGTGT AAACTTGTCAGTGATTGGACTGAAGACCTTAGATCT
CCTCCTAACTTCAGGTAAAATCACCTTGCTGATATT sinônimo NO:
GGATGAAGAAAGTGATATTTTCATGTTAATTTTTGA TGCCATGCACTCATTTCCAGCCAATGATGAAGTCC AGAAACTTGGATGCAAAGCTTTACATGTGCTGTTTG AGAGAGTCTCAGAGGAGCAACTGACTGAATTTGTT GAGAACAAAGATTATATGATATTGTTAAGTGCGTTA ACAAATTTTAAMAGATGAAGAGGAAATTGTGCTTCAT GTGCTGCATTGTTTACATTCCCTAGCGATTCCTTGC AATAATGTGGAAGTCCTCATGAGTGGCAATGTCAG GTGTTATAATATTGTGGTGGAAGCTATGAAAGCATT CCCTATGAGTGAAAGAATTCAAGAAGTGAGTTGCT GTTTGCTCCATAGGCTTACATTAGGTAATTTTTTCA ATATCCTGGTATTAAMACGAAGTCCATGAGTTTGTGG TGAAAGCTGTGCAGCAGTACCCAGAGAATGCAGCA TTGCAGATCTCAGCGCTCAGCTGTTTGGCCCTCCT CACTGAGACTATTTTCTTAAATCAAGATTTAGAGGA AAAGAATGAGAATCAAGAGAATGATGATGAGGGGG AAGAAGATAAATTGTTTTGGCTGGAAGCCTGTTACA AAGCATTAACGTGGCATAGAAAGAACAAGCACGTG CAGGAGGCCGCATGCTGGGCACTAAATAATCTCCT TATGTACCAAAACAGTTTACATGAGAAGATTGGAGA TGAAGATGGCCATTTCCCAGCTCATAGGGAAGTGA TGCTCTCCATGCTGATGCATTCTTCATCAAAGGAAG TTTTCCAGGCATCTGCGAATGCATTGTCAACTCTCT TAGAACAAAATGTTAATTTCAGAAAAATACTGTTATC
AAAAGGAATACACCTGAATGTTTTGGAGTTAATGCA sinônimo NO:
GAAGCATATACATTCTCCTGAAGTGGCTGAAAGTG GCTGTAAAATGCTAAATCATCTTTTTGAAGGAAGCA ACACTTCCCTGGATATAATGGCAGCAGTGGTCCCC AAAATACTAACAGTTATGAAACGTCATGAGACATCA TTACCAGTGCAGCTGGAGGCGCTTCGAGCTATTTT ACATTTTATAGTGCCTGGCATGCCAGAAGAATCCA GGGAGGATACAGAATTTCATCATAAGCTAAATATG GTTAAAAAACAGTGTTTCAAGAATGATATTCACAAA CTGGTCCTAGCAGCTTTGAACAGGTTCATTGGAAA TCCTGGGATTCAGAAATGTGGATTAAAAGTAATTTC TTCTATTGTACATTTTCCTGATGCATTAGAGATGTTA TCCCTGGAAGGTGCTATGGATTCAGTGCTTCACAC ACTGCAGATGTATCCAGATGACCAAGAAATTCAGT GTCTGGGTTTAAGTCTTATAGGATACTTGATTACAA AGAAGAATGTGTTCATAGGAACTGGACATCTGCTG GCAAAAATTCTGGTTTCCAGCTTATACCGATTTAAG GATGTTGCTGAAATACAGACTAAAGGATTTCAGACA ATCTTAGCAATCCTCAAATTGTCAGCATCTTTTTCTA AGCTGCTGGTGCATCATTCATTTGACTTAGTAATAT TCCATCAAATGTCTTCCAATATCATGGAACAAAAGG ATCAACAGTTTCTAAACCTCTGTTGCAAGTGTTTTG CAAAAGTAGCTATGGATGATTACTTAAAAAATGTGA TGCTAGAGAGAGCGTGTGATCAGAATAACAGCATC ATGGTTGAATGCTTGCTTCTATTGGGAGCAGATGC
CAATCAAGCAAAGGAGGGATCTTCTTTAATTTGTCA sinônimo NO:
GGTATGTGAGAAAGAGAGCAGTCCCAAATTGGTGG AACTCTTACTGAATAGTGGATCTCGTGAACAAGATG TACGAAAAGCGTTGACGATAAGCATTGGGAAAGGT GACAGCCAGATCATCAGCTTGCTCTTAAGGAGGCT GGCCCTGGATGTGGCCAACAATAGCATTTGCCTTG GAGGATTTTGTATAGGAAAAGTTGAACCTTCTTGGC TTGGTCCTTTATTTCCAGATAAGACTTCTAATTTAAG GAAACAAACAAATATAGCATCTACACTAGCAAGAAT GGTGATCAGATATCAGATGAAAAGTGCTGTGGAAG AAGGAACAGCCTCAGGCAGCGATGGAAATTTITTCT GAAGATGTGCTGTCTAAATTTGATGAATGGACCTTT ATTCCTGACTCTTCTATGGACAGTGTGTTTGCTCAA AGTGATGACCTGGATAGTGAAGGAAGTGAAGGCTC ATTTCTTGTGAAAAAGAAATCTAATTCAATTAGTGTA GGAGAATTTTACCGAGATGCCGTATTACAGCGTTG CTCACCAAATTTGCAAAGACATTCCAATTCCTTGGG GCCCATTTTTGATCATGAAGATTTACTGAAGCGAAA AAGAAAAATATTATCTTCAGATGATTCACTCAGGTC ATCAAAACTTCAATCCCATATGAGGCATTCAGACAG CATTTCTTCTCTGGCTTCTGAGAGAGAATATATTAC ATCACTAGACCTTTCAGCAAATGAACTAAGAGATAT TGATGCCCTAAGCCAGAAATGCTGTATAAGTGTTC ATTTGGAGCATCTTGAAAAGCTGGAGCTTCACCAG AATGCACTCACGAGCTTTCCACAACAGCTATGTGA
AACTCTGAAGAGTTTGACACATTTGGACTTGCACA sinônimo NO:
GTAATAAATTTACATCATTTCCTTCTTATTTGTTGAA AATGAGTTGTATTGCTAATCTTGATGTCTCTCGAAA TGACATTGGACCCTCAGTGGTTTTAGATCCTACAGT GAAATGTCCAACTCTGAAACAGTTTAACCTGTCATA TAACCAGCTGTCTTTTGTACCTGAGAACCTCACTGA TGTGGTAGAGAAACTGGAGCAGCTCATTTTAGAAG GAAATAAAATATCAGGGATATGCTCCCCCTTGAGA CTGAAGGAACTGAAGATTTTAAACCTTAGTAAGAAC CACATTTCATCCCTATCAGAGAACTTTCTTGAGGCT TGTCCTAAAGTGGAGAGTTTCAGTGCCAGAATGAA TTTTCTTGCTGCTATGCCTTTCTTGCCTCCTTCTAT GACAATCCTAAAATTATCTCAGAACAAATTTTCCTG TATTCCAGAAGCAATTTTAAATCTTCCACACTTGCG GTCTTTAGATATGAGCAGCAATGATATTCAGTACCT ACCAGGTCCCGCACACTGGAAATCTTTGAACTTAA GGGAACTCTTATTTAGCCATAATCAGATCAGCATCT TGGACTTGAGTGAAAAAGCATATTTATGGTCTAGAG TAGAGAAACTGCATCTTTCTCACAATAAACTGAAAG AGATTCCTCCTGAGATTGGCTGTCTTGAAAATCTGA CATCTCTGGATGTCAGTTACAACTTGGAACTAAGAT CCTTTCCCAATGAAATGGGGAAATTAAGCAAAATAT GGGATCTTCCTTTGGATGAACTGCATCTTAACTTTG ATTTTAAACATATAGGATGTAAAGCCAAAGACATCA TAAGGTTTCTTCAACAGCGATTAAAAAAGGCTGTGC
CTTATAACCGAATGAAACTTATGATTGTGGGAAATA sinônimo NO:
CTGGGAGTGGTAAAACCACCTTATTGCAGCAATTA ATGAAAACCAAGAAATCAGATCTTGGAATGCAAAGT GCCACAGTTGGCATAGATGTGAAAGACTGGCCTAT CCAAATAAGAGACAAAAGAAAGAGAGATCTCGTCC TAAATGTGTGGGATTTTGCAGGTCGTGAGGAATTC TATAGTACTCATCCCCATTTTATGACGCAGCGAGCA TTGTACCTTGCTGTCTATGACCTCAGCAAGGGACA GGCTGAAGTTGATGCCATGAAGCCTTGGCTCTTCA ATATAAAGGCTCGCGCTTCTTCTTCCCCTGTGATTC TCGTTGGCACACATTTGGATGTTTCTGATGAGAAG CAACGCAAAGCCTGCATGAGTAAAATCACCAAGGA ACTCCTGAATAAGCGAGGGTTCCCTGCCATACGAG ATTACCACTTTGTGAATGCCACCGAGGAATCTGAT GCTTTGGCAAAACTTCGGAAAACCATCATAAACGA GAGCCTTAATTTCAAGATCCGAGATCAGCTTGTTGT TGGACAGCTGATTCCAGACTGCTATGTAGAACTTG AAAAAATCATTTTATCGGAGCGTAAAAATGTGCCAA TTGAATTTCCCGTAATTGACCGGAAACGATTATTAC AACTAGTGAGAGAAAATCAGCTGCAGTTAGATGAA AATGAGCTTCCTCACGCAGTTCACTTTCTAAATGAA TCAGGAGTCCTTCTTCATTTTCAAGACCCAGCACTG CAGTTAAGTGACTTGTACTTTGTGGAACCCAAGTG GCTTTGTAAAATCATGGCACAGATTTTGACAGTGAA AGTGGAAGGTTGTCCAAAACACCCTAAGGGCATTA
TTTCGCGTAGAGATGTGGAAAAATTTCTTTCAAAAA sinônimo NO:
AAAGGAAATTTCCAAAGAACTACATGTCACAGTATT TTAAGCTCCTAGAAAAATTCCAGATTGCTTTGCCAA TAGGAGAAGAATATTTGCTGGTTCCAAGCAGTTTGT CTGACCACAGGCCTGTGATAGAGCTTCCCCATTGT GAGAACTCTGAAATTATCATCCGACTATATGAAATG CCTTATTTTCCAATGGGATTTTGGTCAAGATTAATC AATCGATTACTTGAGATTTCACCTTACATGCTTTCA GGGAGAGAACGAGCACTTCGCCCAAACAGAATGTA TTGGCGACAAGGCATTTACTTAAATTGGTCTCCTGA AGCTTATTGTCTGGTAGGATCTGAAGTCTTAGACAA TCATCCAGAGAGTTTCTTAAAMAATTACAGTTCCTTC TTGTAGAAAAGGCTGTATTCTTTTGGGCCAAGTTGT GGACCACATTGATTCTCTCATGGAAGAATGGTTTC CTGGGTTGCTGGAGATTGATATTTGTGGTGAAGGA GAAACTCTGTTGAAGAAATGGGCATTATATAGTTTT AATGATGGTGAAGAACATCAAAAAATCTTACTTGAT GACTTGATGAAGAAAGCAGAGGAAGGAGATCTCTT AGTAAATCCAGATCAACCAAGGCTCACCATTCCAAT ATCTCAGATTGCCCCTGACTTGATTTTGGCTGACCT GCCTAGAAATATTATGTTGAATAATGATGAGTTGGA ATTTGAACAAGCTCCAGAGTTTCTCCTAGGTGATG GCAGTTTTGGATCAGTTTACCGAGCAGCCTATGAA GGAGAAGAAGTGGCTGTGAAGATTTTTAATAAACAT ACATCACTCAGGCTGTTAAGACAAGAGCTTGTGGT
GCTTTGCCACCTCCACCACCCCAGTTTGATATCTTT sinônimo NO:
GCTGGCAGCTGGGATTCGTCCCCGGATGTTGGTG ATGGAGTTAGCCTCCAAGGGTTCCTTGGATCGCCT GCTTCAGCAGGACAAAGCCAGCCTCACTAGAACCC TACAGCACAGGATTGCACTCCACGTAGCTGATGGT TTGAGATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGA GACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTTTCACACT GTATCCCAATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTG ACTACGGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGGGG ATAAAAACATCAGAGGGCACACCAGGGTTTCGTGC ACCTGAAGTTGCCAGAGGAAATGTCATTTATAACCA ACAGGCTGATGTTTATTCATTTGGTTTACTACTCTA TGACATTTTGACAACTGGAGGTAGAATAGTAGAGG GTTTGAAGTTTCCAAATGAGTTTGATGAATTAGAAA TACAAGGAAAATTACCTGATCCAGTTAAAGAATATG GTTGTGCCCCATGGCCTATGGTTGAGAAATTAATTA AACAGTGTTTGAAAGAAAATCCTCAAGAAAGGCCT ACTTCTGCCCAGGTCTTTGACATTTTGAATTCAGCT GAATTAGTCTGTCTGACGAGACGCATTTTATTACCT AAAAACGTAATTGTTGAATGCATGGTTGCTACACAT CACAACAGCAGGAATGCAAGCATTTGGCTGGGCTG TGGGCACACCGACAGAGGACAGCTCTCATTTCTTG ACTTAAATACTGAAGGATACACTTCTGAGGAAGTTG CTGATAGTAGAATATTGTGCTTAGCCTTGGTGCATC TTCCTGTTGAAAAGGAAAGCTGGATTGTGTCTGGG
ACACAGTCTGGTACTCTCCTGGTCATCAATACCGA sinônimo NO:
AGATGGGAAAAAGAGACATACCCTAGAAAAGATGA CTGATTCTGTCACTTGTTTGTATTGCAATTCCTTTTC CAAGCAAAGCAAACAAAAAAATTTTCTTTTGGTTGG AACCGCTGATGGCAAGTTAGCAATTTTTGAAGATAA GACTGTTAAGCTTAAAGGAGCTGCTCCTTTGAAGA TACTAAATATAGGAAATGTCAGTACTCCATTGATGT GTTTGAGTGAATCCACAAATTCAACGGAAAGAAAT GTAATGTGGGGAGGATGTGGCACAAAGATTTTCTC CTTTTCTAATGATTTCACCATTCAGAAACTCATTGA GACAAGAACAAGCCAACTGTTTTCTTATGCAGCTTT CAGTGATTCCAACATCATAACAGTGGTGGTAGACA CTGCTCTCTATATTGCTAAGCAAAATAGCCCTGTTG TGGAAGTGTGGGATAAGAAAACTGAAAAACTCTGT GGACTAATAGACTGCGTGCACTTTTTAAGGGAGGT AATGGTAAAAGAAAACAAGGAATCAAAACACAAAAT GTCTTATTCTGGGAGAGTGAAAMACCCTCTGCCTTC AGAAGAACACTGCTCTTTGGATAGGAACTGGAGGA GGCCATATTTTACTCCTGGATCTTTCAACTCGTCGA CTTATACGTGTAATTTACAACTTTTGTAATTCGGTCA GAGTCATGATGACAGCACAGCTAGGAAGCCTTAAA AATGTCATGCTGGTATTGGGCTACAACCGGAAAAA TACTGAAGGTACACAAAAGCAGAAAGAGATACAAT CTTGCTTGACCGTTTGGGACATCAATCTTCCACATG AAGTGCAAAATTTAGAAAAACACATTGAAGTGAGAA
AAGAATTAGCTGAAAAAATGAGACGAACATCTGTTG sinônimo NO: Lea alfa- >NM 000345.3:264-686 alfa sinucleína (SNCA) de |22 sinucleína | Homo sapiens, variante de transcrição 1, MGRNA (PARK1; | ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAA PRK1) GGAGGGAGTTGTGGCTGCTGCTGAGAAAACCAAA
CAGGGTGTGGCAGAAGCAGCAGGAAAGACAAAAG AGGGTGTTCTCTATGTAGGCTCCAAAACCAAGGAG GGAGTGGTGCATGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGA AGACCAAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGAGGAGCA GTGGTGACGGGTEGTGACAGCAGTAGCCCAGAAGA CAGTGGAGGGAGCAGGGAGCATTGCAGCAGCCAC TGGCTTTGTCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATG AAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGAATTCTGGAAGAT ATGCCTGTGGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAAT GCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTG
AAGCCTAA c-Rel- >NM 002908.3:347-2206 Proto-oncogene REL do/|23 NFKB Homo sapiens, subunidade NF-kB (REL), variante de transcrição 1, MRNA
ATGGCCTCCGGTGCGTATAACCCGTATATAGAGAT AATTGAACAACCCAGGCAGAGGGGAATGCGTTTTA GATACAAATGTGAAGGGCGATCAGCAGGCAGCATT CCAGGGGAGCACAGCACAGACAACAACCGAACAT ACCCTTCTATCCAGATTATGAACTATTATGGAAAAG
GAAAAGTGAGAATTACATTAGTAACAAAGAATGACC sinônimo NO:
CATATAAACCTCATCCTCATGATTTAGTTGGAAAAG ACTGCAGAGACGGCTACTATGAAGCAGAATTTGGA CAAGAACGCAGACCTTTGTTTTTCCAAAATTTGGGT ATTCGATGTGTGAAGAAAAAAGAAGTAAAAGAAGC TATTATTACAAGAATAAAGGCAGGAATCAATCCATT CAATGTCCCTGAAAAACAGCTGAATGATATTGAAGA TTGTGACCTCAATGTGGTGAGACTGTGTTTTCAAGT TTTTCTCCCTGATGAACATGGTAATTTGACGACTGC TCTTCCTCCTGTTGTCTCGAACCCAATTTATGACAA CCGTGCTCCAAATACTGCAGAATTAAGGATTTGTC GTGTAAACAAGAATTGTGGAAGTGTCAGAGGAGGA GATGAAATATTTCTACTTTGTGACAAAGTTCAGAAA GATGACATAGAAGTTCGTTTTGTGTTGAACGATTGG GAAGCAAAAGGCATCTTTTCACAAGCTGATGTACA CCGTCAAGTAGCCATTGTTTTCAAAACTCCACCATA TTGCAAAGCTATCACAGAACCCGTAACAGTAAAAAT GCAGTTGCGGAGACCTTCTGACCAGGAAGTTAGTG AATCTATGGATTTTAGATATCTGCCAGATGAAAAAG ATACTTACGGCAATAAAGCAAAGAAACAAAAGACAA CTCTGCTTTTCCAGAAACTGTGCCAGGATCACGTA GAAACAGGGTTTCGCCATGTTGACCAGGATGGTCT TGAACTCCTGACATCAGGTGATCCACCCACCTTGG CCTCCCAMAGTGCTGGGATTACAGTTAATTTTCCTG AGAGACCAAGACCTGGTCTCCTCGGTTCAATTGGA
GAAGGAAGATACTTCAAAAAAGAACCAAACTTGTTT sinônimo NO:
TCTCATGATGCAGTTGTGAGAGAAATGCCTACAGG GGTTTCAAGTCAAGCAGAATCCTACTATCCCTCAC CTGGGCCCATCTCAAGTGGATTGTCACATCATGCC TCAATGGCACCTCTGCCTTCTTCAAGCTGGTCATC AGTGGCCCACCCCACCCCACGCTCAGGCAATACA AACCCACTGAGTAGTTTTTCAACAAGGACACTTCCT TCTAATTCGCAAGGTATCCCACCATTCCTGAGAATA CCTGTTGGGAATGATTTAAATGCTTCTAATGCTTGC ATTTACAACAATGCCGATGACATAGTCGGAATGGA AGCGTCATCCATGCCATCAGCAGATTTATATGGTAT TTCTGATCCCAACATGCTGTCTAATTGTTCTGTGAA TATGATGACAACCAGCAGTGACAGCATGGGAGAGA CTGATAATCCAAGACTTCTGAGCATGAATCTTGAAA ACCCCTCATGTAATTCAGTGTTAGACCCAAGAGAC TTGAGACAGCTCCATCAGATGTCCTCTTCCAGTAT GTCAGCAGGCGCCAATTCCAATACTACTGTTTITGT TTCACAATCAGATGCATTTGAGGGATCTGACTTCAG TTGTGCAGATAACAGCATGATAAATGAGTCGGGAC CATCAAACAGTACTAATCCAAACAGTCATGGTTTTG TTCAAGATAGTCAGTATTCAGGTATTGGCAGTATGC AAAATGAGCAATTGAGTGACTCCTTTCCATATGAAT
TTTTTCAAGTATAA ATG7 >NM 028835.4:74-2170 Autofagia relacionada ao Mus | 24 musculus 7 (Atg7), variante de transcrição 1, MRNA
ATGGGGGACCCTGGACTGGCCAAGTTGCAGTTCG sinônimo NO:
CCCCCTTTAATAGTGCCCTGGACGTTGGCTTCTGG CACGAACTGACCCAGAAGAAGTTGAACGAGTACCG CCTGGACGAGGCACCCAAAGACATCAAGGGCTATT ACTACAATGGTGACTCTGCTGGTCTGCCCACCCGC TTGACGTTGGAGTTCAGTGCTTTTGACATGAGTGC CTCCACGCCTGCCCACTGCTGCCEGGCCATGGGA ACCCTGCACAACACCAACACACTTGAGGCTTTTAA GACAGCAGACAAGAAGCTCCTTCTGGAGCAGTCAG CAAATGAGATCTGGGAAGCCATAAAGTCAGGTGCT GCTCTCGAAAACCCCATGCTCCTCAACAAGTTTCT GCTCCTGACCTTCEGCGGACCTAAAGAAGTACCACT TCTACTACTGGTTTTGCTGCCCCGCCCTCTGTCTTC CTGAGAGCATCCCTCTAATCCGGGGACCTGTGAGC TTGGATCAAAGGCTTTCACCAAAACAGATCCAGGC CCTGGAGCATGCCTATGATGATCTGTGTCGAGCCG AAGGCGTCACGGCCCTGCCCTACTTCTTATTCAAG TACGATGACGACACTGTTCTGGTCTCCTTGCTCAA ACACTACAGTGATTTCTTCCAAGGTCAAAGGACAAA GATAACAGTTGGTGTGTACGATCCCTGTAACCTAG CCCAGTACCCTGGATGGCCTTTGAGGAATTTTITTG GTCCTGGCAGCCCACAGATGGAGCGGCAGTTTCC AGTCCGTTGAAGTCCTCTGCTTTCGGGACCGCACC ATGCAGGGAGCTAGAGACGTGACACATAGCATCAT CTTTGAAGTGAAACTTCCAGAAATGGCATTTAGCCC
AGATTGTCCTAAAGCTGTTGGCTGGGAGAAGAACC sinônimo NO:
AGAAAGGAGGCATGGGTCCGAGGATGGTGAACCT CAGTGGATGTATGGACCCCAAAAGGCTGGCTGAGT CATCTGTGGATCTGAATCTCAAGCTGATGTGCTGG CGATTGGTCCCCACCTTGGACTTGGACAAGGTCGT GTCTGTCAAGTGCCTGCTGCTGGGAGCTGGTACCT TGGGGTGTAATGTGGCTAGGACACTGATGGGCTG GGGCGTCAGACATGTCACCTTTGTGGATAACGCCA AGATCTCCTACTCCAATCCCGTGAGGCAGCCTCTG TATGAATTTGAAGATTGTCTAGGGGGTGGCAAGCC CAAGGCCCTGGCTGCAGCAGAGCGGCTACAGAAA ATATTTCCCGGAGTGAATGCCAGAGGGTTCAACAT GAGCATCCCCATGCCAGGACACCCTGTGAACTTCT CTGACGTCACGATGGAGCAGGCCCGCAGAGATGT GGAGCAGCTGGAGCAGCTCATTGATAACCATGATG TCATCTTCCTGCTAATGGACACCAGGGAGAGCCGG TGGCTTCCTACTGTTATTGCAGCCAGCAAGCGAAA GCTGGTCATCAACGCTGCCTTGGGGTTTGATACCT TTGTTGTCATGAGACATGGCCTGAAGAAACCCAAG CAGCAGGGAGCCGGAGACCTCTGCCCAAGCCATC TTGTAGCACCTGCTGACCTGGGCTCCTCACTTTIT GCCAACATCCCTGGATACAAGCTTGGCTGCTACTT CTGCAATGATGTGGTGGCTCCAGGAGATTCAACCA GAGACCGGACTCTGGACCAGCAGTGCACAGTGAG CCGCCCAGGCCTGGCCGTGATTGCAGGTGCCCTG
GCTGTGGAGCTGATGGTCTCTGTCCTGCAGCATCC sinônimo NO:
TGAGGGGGGCTACGCCATCEGCCAGCAGCAGTGAT GACCGCATGAATGAGCCTCCCACCTCGCTGGGAC TTGTGCCTCACCAGATCCGGGGTTTTCTGTCACGG TTCGATAATGTTCTTCCTGTCAGCCTGGCATTTGAT AAATGTACAGCCTGTTCACCCAAAGTTCTTGATCAG TACGAGCGAGAAGGATTCACCTTCCTAGCGAAGGT TTTTAACTCCTCACATTCCTTCTTAGAAGACTTGAC CGGTCTTACCCTGCTCCATCAAGAGACCCAAGCTG CTGAGATCTGGGACATGAGTGACGAGGAGACTGT
CTGA VMAT2 >NM 003054.4:164-1708 Família de transportador de | 25 soluto de 18 membros A2 (SLC1I8A2) de Homo sapiens, MGRNA
ATGGCCCTGAGCGAGCTGGCGCTEGGTCCGCTGGC TGCAGGAGAGCCGCCGCTCGCGGAAGCTCATCCT GTTCATCGTGTTCCTGGCGCTGCTGCTGGACAACA TGCTGCTCACTGTCGTGGTCCCCATCATCCCAAGT TATCTGTACAGCATTAAGCATGAGAAGAATGCTACA GAAATCCAGACGGCCAGGCCAGTGCACACTGCCT CCATCTCAGACAGCTTCCAGAGCATCTTCTCCTATT ATGATAACTCGACTATGGTCACCGGGAATGCTACC AGAGACCTGACACTTCATCAGACCGCCACACAGCA CATGGTGACCAACGCGTCCGCTGTTCCTTCCGACT GTCCCAGTGAAGACAAAGACCTCCTGAATGAAAAC
GTGCAAGTTGGTCTGTTGTTTGCCTCGAAAGCCAC sinônimo NO:
CGTCCAGCTCATCACCAACCCTTTCATAGGACTAC TGACCAACAGAATTGGCTATCCAATTCCCATATTTG CGGGATTCTGCATCATGTTTGTCTCAACAATTATGT TTGCCTTCTCCAGCAGCTATGCCTTCCTGCTGATT GCCAGGTCGCTECAGGGCATCGGCTCGTCCTGCT CCTCTGTGGCTGGGATGGGCATGCTTGCCAGTGT CTACACAGATGATGAAGAGAGAGGCAACGTCATGG GAATCGCCTTGGGAGGCCTGGCCATGGGGGTCTT AGTGGGCCCCCCCTTCGGGAGTGTGCTCTATGAG TTTGTGGGGAAGACGGCTCCGTTCCTGGTGCTEG CCGCCCTGGTACTCTTGGATGGAGCTATTCAGCTC TTTGTGCTCCAGCCGTCCCGGGTEGCAGCCAGAGA GTCAGAAGGGGACACCCCTAACCACGCTGCTGAA GGACCCGTACATCCTCATTGCTGCAGGCTCCATCT GCTTTGCAAACATGGGCATCGCCATGCTGGAGCCA GCCCTGCCCATCTGGATGATGGAGACCATGTGTTC CCGAAAGTGGCAGCTGGGCGTTGCCTTCTTGCCA GCTAGTATCTCTTATCTCATTGGAACCAATATTTTT GGGATACTTGCACACAAAATGGGGAGGTGGCTTTG TGCTCTTCTGGGAATGATAATTGTTGGAGTCAGCAT TTTATGTATTCCATTTGCAAAAAACATTTATGGACTC ATAGCTCCGAACTTTGGAGTTGGTTTTGCAATTGGA ATGGTGGATTCGTCAATGATGCCTATCATGGGCTA CCTCGTAGACCTGCGGCACGTGTCCGTCTATGGG
AGTGTGTACGCCATTGCGGATGTGGCATTTTGTAT sinônimo NO:
GGGGTATGCTATAGGTCCTTCTGCTGGTGGTGCTA TTGCAAAGGCAATTGGATTTCCATGGCTCATGACA ATTATTGGGATAATTGATATTCTTTTTGCCCCTCTCOT GCTTTTTTCTTCGAAGTCCACCTGCCAAAGAAGAAA AAATGGCTATTCTCATGGATCACAACTGCCCTATTA AAACAAAAATGTACACTCAGAATAATATCCAGTCAT ATCCGATAGGTGAAGATGAAGAATCTGAAAGTGAC
TGA GBA >NM 000157.3 glucosilceramidase beta (GBA) de/26 Homos sapiens, variante de transcrição 1, M6nRNA
ATCACATGACCCATCCACATCGGGAAGCCGGAATT ACTTGCAGGGCTAACCTAGTGCCTATAGCTAAGGC AGGTACCTGCATCCTTGTTTTTGTTTAGTGGATCCT CTATCCTTCAGAGACTCTGGAACCCCTGTGGTCTT CTCTTCATCTAATGACCCTGAGGGGATGGAGTTTT CAAGTCCTTCCAGAGAGGAATGTCCCAAGCCTTTG AGTAGGGTAAGCATCATGGCTGGCAGCCTCACAG GATTGCTTCTACTTCAGGCAGTGTCGTGGGCATCA GGTGCCCGCCCCTGCATCCCTAAAAGCTTCGGCTA CAGCTCGGTGGTGTGTGTCTGCAATGCCACATACT GTGACTCCTTTGACCCCCCGACCTTTCCTGCCCOTT GGTACCTTCAGCCGCTATGAGAGTACACGCAGTGG GCGACGGATGGAGCTGAGTATGGGGCCCATCCAG GCTAATCACACGGGCACAGGCCTGCTACTGACCCT
GCAGCCAGAACAGAAGTTCCAGAAAGTGAAGGGAT sinônimo NO:
TTGGAGGGGCCATGACAGATGCTGCTGCTCTCAAC ATCCTTGCCCTGTCACCCCCTGCCCAAAATTTGCT ACTTAAATCGTACTTCTCTGAAGAAGGAATCGGATA TAACATCATCCGGGTACCCATGGCCAGCTGTGACT TCTCCATCCGCACCTACACCTATGCAGACACCCCT GATGATTTCCAGTTGCACAACTTCAGCCTCCCAGA GGAAGATACCAAGCTCAAGATACCCCTGATTCACC GAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTC CTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAA GACCAATGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTC AAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCT GGGCCAGATACTTTGTGAAGTTCCTGGATGCCTAT GCTGAGCACAAGTTACAGTTCTGGGCAGTGACAGC TGAAAATGAGCCTTCTGCTGGGCTGTTGAGTGGAT ACCCCTTCCAGTGCCTGGGCTTCACCCCTGAACAT CAGCGAGACTTCATTGCCCGTGACCTAGGTCCTAC CCTCGCCAACAGTACTCACCACAATGTCCGCCTAC TCATGCTGGATGACCAACGCTTGCTGCTGCCCCAC TGGGCAAAGGTGGTACTGACAGACCCAGAAGCAG CTAAATATGTTCATGGCATTGCTGTACATTGGTACC TGGACTTTCTGGCTCCAGCCAAAGCCACCCTAGGG GAGACACACCGCCTGTTCCCCAACACCATGCTCTT TGCCTCAGAGGCCTGTGTGGGCTCCAAGTTCTGG GAGCAGAGTGTGCGGCTAGGCTCCTGGGATCGAG
GGATGCAGTACAGCCACAGCATCATCACGAACCTC sinônimo NO:
CTGTACCATGTGGTCGGCTGGACCGACTGGAACCT TGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTG CGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATC ACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTA CCACCTTGGCCACTTCAGCAAGTTCATTCCTGAGG GCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAA GAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCC GATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGCTC CTCTAAGGATGTGCCTCTTACCATCAAGGATCCTG CTGTGGGCTTCCTGGAGACAATCTCACCTGGCTAC TCCATTCACACCTACCTGTGGCGTCGCCAGTGATG GAGCAGATACTCAAGGAGGCACTGGGCTCAGCCT GGGCATTAAAGGGACAGAGTCAGCTCACACGCTGT CTGTGACTAMAGAGGGCACAGCAGGGCCAGTGTG AGCTTACAGCGACGTAAGCCCAGGGGCAATGGTTT GGGTGACTCACTTTCCCCTCTAGGTGGTGCCAGGE GGCTGGAGGCCCCTAGAAAAAGATCAGTAAGCCC CAGTGTCCCCCCAGCCCCCATGCTTATGTGAACAT GCGCTGTGTGCTGCTTGCTTTGGAAACTGGGCCTG GGTCCAGGCCTAGGGTGAGCTCACTGTCCGTACA AACACAAGATCAGGGCTGAGGGTAAGGAAAAGAA GAGACTAGGAAAGCTGGGCCCAAAACTGGAGACT GTTTGTCTTTCCTGGAGATGCAGAACTGGGCCCGT GGAGCAGCAGTGTCAGCATCAGGGCGGAAGCCTT
AAAGCAGCAGCGGGTGTGCCCAGGCACCCAGATG sinônimo NO: mm |
TTAAAGGAGAAAATGTTTGAGCCCAGTCA TABELA 4: POLINUCLEOTÍDEOS PARA ISOFORMAS DE PARK2 isoforma NO: PARK?2 (1) | >NM 004562.2:135-1532 proteína ubiquitina ligase E3 | 27 RBR parkin de Homo sapiens (PRKN), variante de transcrição 1, MRNA
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCEG GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC TCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC
GCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATG isoforma NO:
ATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGC CAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATT TTTCTTTASATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAA GGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAA ATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGAC GTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTC CCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATA CTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTC ACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTG GCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCA TCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTACAACC GGTACCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGTCCT GCAGATGGGGGGCGTGTTATGCCCCCGCCCTGGC TGTGGAGCGGGGCTGCTGCCGGAGCCTGACCAGA GGAAAGTCACCTGCGAAGGGGGCAATGGCCTGGG CTGTGGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAAAGAAG CGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGTATTTGAA GCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACAGAGTCGA TGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTGGGAAGCA GCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCACCAAGCC CTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAAAAAAATG GAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCAGCCCCA GTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGTGGCTGC GAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCACTGGT
TCGACGTGTAG isoforma NO: PARK2 (2) | >NM 013987.2:135-1448 proteína ubiquitina ligase E3 | 28 RBR parkin de Homo sapiens (PRKN), variante de transcrição 2, MRNA
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGG GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC TCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC GCTCACCTTGACCCAGGAATTTTTCTTTAAATGTGG AGCACACCCCACCTCTGACAAGGAAACATCAGTAG CTTTGCACCTGATCGCAACAAATAGTCGGAACATC ACTTGCATTACGTGCACAGACGTCAGGAGCCCCGT CCTGGTTTTCCAGTGCAACTCCCGCCACGTGATTT GCTTAGACTGTTTCCACTTATACTGTGTGACAAGAC
TCAATGATCGGCAGTTTGTTCACGACCCTCAACTT isoforma NO:
GGCTACTCCCTGCCTTGTGTGGCTGGCTEGTCCCAA CTCCTTGATTAMAGAGCTCCATCACTTCAGGATTCT GGGAGAAGAGCAGTACAACCGGTACCAGCAGTAT GGTGCAGAGGAGTGTGTCCTGCAGATGGGGGGCG TGTTATGCCCCCGCCCTGGCTETEGAGCGGGGCT GCTGCCGGAGCCTGACCAGAGGAAAGTCACCTGC GAAGGGGGCAATGGCCTGGGCTGTGGGTTTGCCT TCTGCCGGGAATGTAAAGAAGCGTACCATGAAGGG GAGTGCAGTGCCGTATTTGAAGCCTCAGGAACAAC TACTCAGGCCTACAGAGTCGATGAAAGAGCCGCC GAGCAGGCTCGTTGGGAAGCAGCCTCCAAAGAAA CCATCAAGAAAACCACCAAGCCCTGTCCCCGCTGC CATGTACCAGTGGAAAAAAATGGAGGCTGCATGCA CATGAAGTGTCCGCAGCCCCAGTGCAGGCTCGAG TGGTGCTGGAACTGTGGCTGCGAGTGGAACCGCG
TCTGCATGGGGGACCACTGGTTCGACGTGTAG PARK?2 (3) | >Ensembl ENSTO0000479615.5 29
ATGAATGCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACG CGGCGGGAGGCTETGAGCGGGAGCCCCAGAGCT TGACTCGGGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCA GGAGACTCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACAC TGACAGCAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGT CCAGCAGGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTG TATTGCAAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGG
GAAAACTCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCA isoforma NO:
GGCAACGCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCT GGGATGATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGT GAATGCCAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGC AGAATTTTTCTTTAMATGTGGAGCACACCCCACCTC TGACAAGGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCG CAACAAATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGC ACAGACGTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTG CAACTCCCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCC ACTTATACTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAG TTTGTTCACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCT
TGTGTGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAA PARK?2 (4) | >Ensembl ENSTO0000338468.7 30
ATGAGTGGTGAATGCCAATCCCCACACTGCCCTGG GACTAGTGCAGAATTTTTCTTTAMATGTGGAGCACA CCCCACCTCETGACAAGGAAACATCAGTAGCTTTGC ACCTGATCGCAACAAATAGTCGGAACATCACTTGC ATTACGTGCACAGACGTCAGGAGCCCCGTCCTGGT TTTCCAGTGCAACTCCCGCCACGTGATTTGCTTAG ACTGTTTCCACTTATACTGTGTGACAAGACTCAATG ATCGGCAGTTTGTTCACGACCCTCAACTTGGCTAC TCCCTGCCTTGTGTGGCTGGCTGTCCCAACTCCOTT GATTAAAGAGCTCCATCACTTCAGGATTCTGGGAG AAGAGCAGTACAACCGGTACCAGCAGTATGGTGCA
GAGGAGTGTGTCCTGCAGATGGGGGGCGTGTTAT GCCCCCGCCetzesetzetzeGAGCGGGGCTGCTEC isoforma NO:
CGGAGCCTGACCAGAGGAAAGTCACCTGCGAAGG GGGCAATGGCCTGGGCTGTGGGTTTGCCTTCTGC CGGGAATGTAAAGAAGCGTACCATGAAGGGGAGT GCAGTGCCGTATTTGAAGCCTCAGGAACAACTACT CAGGCCTACAGAGTCGATGAAAGAGCCGCCGAGC AGGCTCGTTGGGAAGCAGCCTCCAAAGAAACCATC AAGAAAACCACCAAGCCCTGTCCCCGCTGCCATGT ACCAGTGGAAAAAAATGGAGGCTGCATGCACATGA AGTGTCCGCAGCCCCAGTGCAGGCTCGAGTGGTG CTGGAACTGTGGCTGCGAGTGGAACCGCGTCTGC
ATGGGGGACCACTGGTTCGACGTGTAG PARK?2 (5) | ENAJALQO33698/ALQ33698.1 Proteína de parkinson | 31 parcial (humana) de Homo sapiens 2 E3 isoforma da proteína ubiquitina ligase 1
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGG GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC
TCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG isoforma NO:
CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC GCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATG ATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGC CAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATT TTTCTTTAMATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAA GGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAA ATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGAC GTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTC CCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATA CTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTC ACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTG GGAACTGGAGACACAGTGGTGCTTAGAGGAGCTC TGGGGGGATTCAGGAGAGGAGTCGCTGGCTGTCC CAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCATCACTTCAGGAT TCTGGGAGAAGAGCAGTACAACCGGTACCAGCAG
TATGGTGCAGAGGAGTGTGTCCTGCAGATGGGGG GCGTGTTATGCCCCCGCCoTtTGGCTGTGGAGCGEGG
GCTGCTGCCGGAGCCTGACCAGAGGAAAGTCACC TGCGAAGGGGGCAATGGCCTGGGCTGTGGGTATG
GACAACGAAGAACAAAA RBR parkin de Homo sapiens (PRKN), variante de isoforma NO: transcrição 2, MGRNA
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGGA ATTTTTCTTTAMATGTGGAGCACACCCCACCTCTGA CAAGGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAA CAAATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACA GACGTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAA CTCCCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTT ATACTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTG TTCACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGT GTGGCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCT CCATCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTACA
ACCGGTACCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGT CCTGCAGATGGGGGGCGTEGTTATGCCCCeGCeeT
GGCTEGTGGAGCGGGGCTECTECCGGAGCCTGAC CAGAGGAAAGTCACCTGCGAAGGGGGCAATGGCC TGGGCTGTGGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAAA GAAGCGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGTAT TTGAAGCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACAGA GTCGATGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTGGGE AAGCAGCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCACC
AAGCCCTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAAAA isoforma NO:
AAATGGAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCAGC CCCAGTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGTGG CTGCGAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCAC
TGGTTCGACGTGTAG PARK?2 (7) | ENAJADB91979/ADB91979.1 Variante de parkin|33 (humano) de Homo sapiens SV5,9DEL
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGG GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC TCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC GCTCACCTTGACCCAGGAATTTTTCTTTAAATGTGG AGCACACCCCACCTCTGACAAGGAAACATCAGTAG CTTTGCACCTGATCGCAACAAATAGTCGGAACATC
ACTTGCATTACGTGCACAGACGTCAGGAGCCCCGT isoforma NO:
CCTGGTTTTCCAGTGCAACTCCCGCCACGTGATTT GCTTAGACTGTTTCCACTTATACTGTGTGACAAGAC TCAATGATCGGCAGTTTGTTCACGACCCTCAACTT GGCTACTCCCTGCCTTGTGTGGCTGGCTETCCCAA CTCCTTGATTAMAGAGCTCCATCACTTCAGGATTCT GGGAGAAGAGCAGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTA AAGAAGCGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGT ATTTGAAGCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACA GAGTCGATGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTG GGAAGCAGCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCA CCAAGCCCTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAA AAAAATGGAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCA GCCCCAGTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGT GGCTGCGAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCE
ACTGGTTCGACGTGTAG PARK?2 (8) | ENAJADB90271/ADB90271.1 Variante de parkin de | 34 (humano) Homo sapiens SV9DEL
ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGG TTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCT TCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGG GGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAG GGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAA TTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTG TGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAAT
GCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGG isoforma NO:
GAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCG GGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGAC TCTGTGGGGCTEGGCTGTCATTCTGCACACTGACAG CAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCA GGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGC AAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAAC TCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAAC GCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATG ATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGC CAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATT TTTCTTTAMATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAA GGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAA ATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGAC GTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTC CCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATA CTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTC ACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTG GCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCA TCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTTTGCCT TCTGCCGGGAATGTAAAGAAGCGTACCATGAAGGG GAGTGCAGTGCCGTATTTGAAGCCTCAGGAACAAC TACTCAGGCCTACAGAGTCGATGAAAGAGCCGCC GAGCAGGCTCGTTGGGAAGCAGCCTCCAAAGAAA CCATCAAGAAAACCACCAAGCCCTGTCCCCGCTGC
CATGTACCAGTGGAAAAAAATGGAGGCTGCATGCA isoforma NO:
CATGAAGTGTCCGCAGCCCCAGTGCAGGCTCGAG TGGTGCTGGAACTGTGGCTGCGAGTGGAACCGCG TCTGCATGGGGGACCACTGGTTCGACGTGTAG
[0112] EM modalidades particulares, as composições e métodos aqui divulgados contemplam o uso de fragmentos funcionais e variantes funcionais de qualquer uma dessas sequências de proteínas ou polinucleotídeos. Fragmentos e variantes funcionais mantêm as propriedades ou atividades biológicas da proteína de tipo selvagem correspondente, embora as propriedades ou atividades possam em alguns casos ser reduzidas, por exemplo, para cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80%, como em comparação com a proteína de tipo selvagem, ou aumentada, por exemplo, 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes como em comparação com a proteína de tipo selvagem. Em certas modalidades, um fragmento funcional ou variante de uma proteína tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a proteína de tipo selvagem correspondente. Em certas modalidades, um fragmento funcional de uma proteína compreende pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% , pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da proteína de tipo selvagem correspondente.
[0113] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vetor de terapia genética recombinante, compreendendo um polinucleotídeo transgene que codifica a proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2) em que o polinucleotídeo transgene está operacionalmente ligado a uma sequência promotora eucarioticamente ativa. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo transgênico compartilha pelo menos 95%
de identidade com uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
[0114] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um polinucleotídeo otimizado por códon que codifica PARK2. Em alguns casos, toda a sequência do transgene é otimizada por códon para expressão em uma célula de mamífero. À otimização por códon refere-se à descoberta de que a frequência de ocorrência de códons sinônimos (ou seja, códons que codificam o mesmo aminoácido) na codificação do DNA é influenciada por diferentes espécies. Essa degenerescência de códon permite que um polipeptídeo idêntico seja codificado por uma variedade de sequências de nucleotídeos. Uma variedade de métodos de otimização por códon é conhecida na técnica e inclui, por exemplo, métodos divulgados pelo menos nas Patentes dos EUA nº 5.786.464 e 6.114.148.
[0115] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo otimizado por códon que codifica PARK2 compreende menos ilhas CpG do que a sequência polinucleotídica humana nativa que codifica PARK2 humano. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência humana nativa compreende 95 ilhas CpG, enquanto os polinucleotídeos otimizados por códon compreendem menos do que 95, menos do que 90, menos do que 85, menos do que 80, menos do que 75, menos do que 70, menos do que 65, menos do que 60, menos do que 55, menos do que 50, menos do que 45, menos do que 40, menos do que 35, menos do que 30, menos do que 25, menos do que 20, menos do que 15, menos do que 10, menos do que 5 ou sem ilhas CpG. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica otimizada por códon compreende 2 a 20, 5 a 20, cerca de 5 ou cerca de 10 ilhas CpG. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica otimizada por códon compreende uma ou mais ilhas CpG. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 58. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 58.
[0116] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, o vetor compreende duas repetições terminais invertidas AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o AAV possui o sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh1o ou AAVrh74. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV autocomplementar. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética recombinante compreende um AAV de fita simples. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado. Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína de capsídeo com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
[0117] EM outro aspecto, a divulgação fornece célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores de terapia genética recombinantes anteriores. Células hospedeiras exemplares incluem células HEK293, 293T, HeLa, Vero e Sf9.
[0118] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para inibir, reduzir ou atrasar a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico compreendendo uma mutação em um gene associado a uma Doença de Parkinson (DP), em que o gene mutado é uma proteína de Parkinson 2, um gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), compreendendo colocar o neurônio em contato com o vetor de terapia genética recombinante da divulgação, em que após o contato com o vetor de terapia genética recombinante, o neurônio expressa a proteína de tipo selvagem. O método pode ser praticado in vitro ou in vivo, por exemplo, em um paciente em necessidade deste.
[0119] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, a alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy são reduzidas em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou mais.
[0120] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade reduzida de monoamina oxidases após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, a quantidade de monoamina oxidases é reduzida em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou mais.
[0121] Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, a quantidade de dopamina produzida e/ou liberada é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou mais.
[0122] Em algumas modalidades, o neurônio sofre mitofagia aumentada após o contato com o vetor de terapia genética recombinante. Em algumas modalidades, a mitofagia é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40% ou mais.
[0123] Em algumas modalidades, o neurônio expressa uma quantidade menor de monoamina oxidases em comparação com uma quantidade de monoamina oxidases expressa em um neurônio que não está em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente, em que a referida quantidade inferior é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% menos do que a quantidade expressa no neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[0124] Em algumas modalidades, o neurônio produz e/ou libera uma quantidade aumentada de dopamina em comparação com uma quantidade de dopamina produzida e/ou liberada por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos vezes maior do que a quantidade produzida e/ou liberada pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[0125] EM algumas modalidades, o neurônio sofre uma quantidade aumentada de autofagia em comparação com uma quantidade de autofagia sofrida por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade sofrida pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
[0126] Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio positivo para tirosina hidroxilase primária. Em algumas modalidades, o neurônio foi produzido a partir de uma célula-tronco pluripotente induzida preparada a partir de células obtidas de um paciente diagnosticado com doença de Parkinson.
[0127] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para tratar ou inibir ou atrasar o aparecimento ou progressão de uma doença de Parkinson (DP) em um paciente que sofre de ou em risco da DP, compreendendo administrar um vetor de terapia genética da divulgação ao paciente, em que a administração do vetor de terapia genética recombinante trata ou inibe ou atrasa o aparecimento ou a progressão da doença de Parkinson no paciente.
[0128] Em algumas modalidades, a DP é uma DP de aparecimento precoce. Em algumas modalidades, a DP é uma DP autossômica recessiva de aparecimento precoce. Em algumas modalidades, o paciente compreende uma mutação em um gene PARK2.
[0129] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética compreende um cassete de expressão que compreende um transgene que codifica para PARK2 ou um fragmento funcional ou variante deste. Em algumas modalidades, o PARK2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% idêntica à mesma. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo transgênico compartilha pelo menos 95% de identidade com uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
[0130] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende administração sistêmica, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
[0131] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal|, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
[0132] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção intratecal com inclinação de Threndelenburg.
[0133] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende injeção direta na porção compacta da substância negra do cérebro.
[0134] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a introdução do vetor de terapia genética recombinante no cérebro ou no líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.
[0135] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10º** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente.
[0136] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao cérebro do paciente.
[0137] Em algumas modalidades, 1x10º - 1x10º** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao LCR do paciente.
[0138] Em algumas modalidades, 1x107 - 1x10º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética são administrados ao paciente.
[0139] Em algumas modalidades, o paciente é um adulto ou uma criança.
[0140] Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos no paciente após a etapa de administração é maior do que o número de neurônios dopaminérgicos no paciente antes da etapa de administração.
[0141] Em algumas modalidades, o nível de dopamina no paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de dopamina no paciente antes da etapa de administração.
[0142] Em algumas modalidades, o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente não tratado.
[0143] Em algumas modalidades, o nível de dopamina de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina em um paciente não tratado.
[0144] Em algumas modalidades, o nível de dopamina na substância negra de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de dopamina na substância negra de um paciente não tratado.
[0145] Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR do paciente após a etapa de administração é maior do que o nível de PRKN no LCR do paciente antes da etapa de administração.
[0146] Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS (Escala Unificada para Avaliação da Doença de Parkinson) do paciente antes da etapa de administração é melhorada em comparação com a pontuação de UPDRS do paciente antes da etapa de administração.
[0147] Em algumas modalidades, o nível de PRKN no LCR de um paciente tratado pelo método é aumentado em comparação com o nível de PRKN no LCR de um paciente não tratado.
[0148] Em algumas modalidades, a pontuação UPDRS de um paciente tratado pelo método é melhorada em comparação com a pontuação UPDRS de um paciente não tratado.
[0149] Em algumas modalidades, o neurônio do paciente expressa uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
DEFINIÇÕES
[0150] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto a que esta invenção se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade. Em casos de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.
[0151] Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade, como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada como incorporada por referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui contidas, prevalecerá. No entanto, a menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente aqui citada não é e não deve ser tomada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que eles constituam estado da técnica válido ou formem parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
[0152] Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de proporção ou faixa de número inteiro deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa recitada e, quando apropriado, frações desta (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), salvo indicação em contrário. O termo “cerca”, quando precede imediatamente um número ou numeral, significa que o número ou numeral varia mais ou menos 10%. Deve ser entendido que os termos "um" e "uma", conforme aqui usados, se referem a "um ou mais" dos componentes enumerados, a menos que indicado de outra forma. O uso do alternativo (por exemplo, "ou") deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. O termo "e/ou" deve ser entendido como significando uma ou ambas as alternativas. Conforme usado aqui, os termos "inclui" e "compreende" são usados como sinônimos.
[0153] As abreviações PRKN e PARK2 são usadas aqui de forma intercambiável.
[0154] Os títulos das seções aqui usados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.
VÍRUS ADENO-ASSOCIADO (AAV
[0155] Como usado aqui, o termo “AAV” é uma abreviação padrão para vírus adeno-associado ou um vetor recombinante deste. O vírus adeno-associado é um parvovírus de DNA de fita simples que cresce apenas em células nas quais determinadas funções são fornecidas por um vírus auxiliar coinfectante. Informações gerais e revisões de AAV podem ser encontradas em, por exemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, e Berns, 1990, Virology, pp.1743- 1764, Raven Press, (Nova York). É esperado que os mesmos princípios descritos nessas revisões sejam aplicáveis a sorotipos AAV adicionais, caracterizados após as datas de publicação das revisões, porque é bem sabido que os vários sorotipos estão intimamente relacionados, tanto estrutural quanto funcionalmente, mesmo no nível genético. (Vide, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 de Parvovírus e Doenças Humanas, J.R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)). Por exemplo, todos os sorotipos de AAV aparentemente exibem propriedades de replicação muito semelhantes mediadas por genes rep homólogos; e todos possuem três proteínas capsídicas relacionadas, como as expressas no AAV?2. O grau de parentesco é ainda sugerido pela análise heteroduplex, que revela extensa hibridação cruzada entre sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de autorrecozimento análogos nos terminais que correspondem a "sequências repetidas de terminal invertidas" (ITRs). Os padrões semelhantes de infectividade também sugerem que as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulatório semelhante.
[0156] Como aqui usado, um "vetor AAV" ou "vetor rAAV" refere-se a um vetor recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminal AAV (ITRs). Tais vetores AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectada com um plasmídeo que codifica e expressa produtos genéticos rep e cap. Alternativamente, os vetores AAV podem ser empacotados em partículas infecciosas usando uma célula hospedeira que foi projetada de maneira estável para expressar genes rep e cap.
[0157] Como aqui usado, um "vírion AAV" ou "partícula viral AAV" ou "partícula de vetor AAV" refere-se a uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína de capsídeo AAV e um vetor AAV polinucleotídico encapsulado. Como aqui usado, se a partícula compreende um polinucleotídeo heterólogo (ou seja, um polinucleotídeo que não seja um genoma AAV de tipo selvagem, como um transgene a ser entregue a uma célula de mamífero), é normalmente referido como uma"partícula de vetor AAV" ou simplesmente um "vetor AAV". Assim, a produção de partícula de vetor AAV inclui necessariamente a produção de vetor AAV, pois esse vetor está contido dentro de uma partícula de vetor AAV.
[0158] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus deficiente em replicação, cujo genoma de DNA de cadeia simples tem cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleotídeos. Existem várias variantes conhecidas de AAV, também denominadas sorotipos quando classificadas por epítopos antigênicos. As sequências nucleotídicas dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas.
Por exemplo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 001401 e Srivastava et al., J.
Virol., 45: 555-564 (1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 001829; o genoma de AAV-5 é fornecido no número de acesso do GenBank AFO85716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 00 1862; pelo menos porções dos genomas AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos números de acesso GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma do AAV-9 é fornecido em Gao et al., J.
Virol., 78: 6381- 6388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol.
Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375-383 (2004). A sequência do genoma AAVrh.74 é fornecida na Patente dos EUA 9.434.928, aqui incorporada por referência.
As sequências de ação Cis direcionando a replicação do DNA viral (rep), encapsidação/empacotamento e integração do cromossomo da célula hospedeira estão contidas nas ITRs de AAV.
Três promotores AAV (denominados p5, p19 e p40 por suas localizações relativas no mapa) dirigem a expressão dos duas estruturas de leitura abertas internas de AAV que codificam os genes rep e cap.
Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados ao splicing diferencial do íntron AAV simples (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep78, rep68, rep52 e rep40) a partir do gene rep.
As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são responsáveis pela replicação do genoma viral.
O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Splicing alternativo e locais de começo de translação sem consenso são responsáveis pela produção das três proteínas capsídicas relacionadas.
Um único local de poliadenilação por consenso está localizado na posição 95 do mapa do genoma de AAV. O ciclo de vida e a genética de AAV são revisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992). O AAV possui características únicas que o tornam atraente como vetor para a liberação de DNA estranho às células, por exemplo, na terapia genética. A infecção pelo AAV das células em cultura não é citopática e a infecção natural de humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamíferos, permitindo a possibilidade de ter como alvo muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz células que se dividem lentamente e que não se dividem e pode persistir essencialmente durante a vida útil dessas células como um epissoma nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma proviral AAV é inserido como DNA clonado nos plasmídeos, o que viabiliza a construção de genomas recombinantes. Além disso, como os sinais que direcionam a replicação AAV e a encapsidação do genoma estão contidos nas ITRs do genoma AAV, alguns ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (codificação da replicação e proteínas estruturais do capsídeo, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho. Para gerar vetores AAV, as proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outra característica importante de AAV é que ele é um vírus extremamente estável e saudável. Ele suporta facilmente as condições usadas para desativar o adenovírus (56º a 65 ºC por várias horas), tornando a preservação de AAV a frio menos crítica. O AAV pode até ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção.
[0159] O DNA AAV nos genomas rAAV pode ser de qualquer variante ou sorotipo AAV para o qual um vírus recombinante possa ser derivado, incluindo, mas não limitado a, variantes AAV ou sorotipos de AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV -5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 e AAVrhi1O. À produção de rAAV pseudotipado é divulgada em, por exemplo, WO 01/83692.
Outros tipos de variantes rAAV, por exemplo rAAV com mutações no capsídeo, também são contemplados. Vide, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). As sequências nucleotídicas dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas no estado da técnica. Para promover a expressão ocular específica, podem ser usados AAV6, AAV8 ou AAV9.
[0160] Em — alguns casos, o rAAV compreende um genoma autocomplementar. Como aqui definido, um rAAV compreendendo um genoma "autocomplementar"ou "fita dupla" refere-se a um rAAV que foi projetado de modo que a região codificadora de rAAV seja configurada para formar um modelo de DNA de fita dupla intramolecular, como descrito em McCarty et al. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (sCAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Therapy. 8 (16): 1248—54 (2001). A presente divulgação contempla o uso, em alguns casos, de um rAAV que compreende um genoma autocomplementar porque após a infecção (tal transdução), em vez de aguardar a síntese mediada por células da segunda fita do genoma rAAV, as duas metades complementares de scAAV se associarão para formar uma unidade de DNA de fita dupla (dsDNA) pronta para replicação e transcrição imediata. Será entedido que, em vez da capacidade de codificação completa encontrada no rAAV (4,7 a 6kb), o rAAV compreendendo um genoma autocomplementar pode conter apenas metade dessa quantidade (=2,4kb).
[0161] Em outros casos, o vetor rAAV compreende um genoma de cadeia simples. Conforme definido aqui, um genoma de "padrão único" refere-se a um genoma que não é autocomplementar. Na maioria dos casos, os AAV não recombinantes têm genomas de DNA em cadeia simples. Houve algumas indicações de que os rAAVs devem ser scAAVs para obter uma transdução eficiente de células, como as células oculares. A presente divulgação contempla, no entanto, vetores rAAV que talvez tenham genomas de cadeia simples, em vez de genomas autocomplementares, com o entendimento de que outras modificações genéticas do vetor rAAV podem ser benéficas para obter a transcrição genética ideal nas células- alvo. Em alguns casos, a presente divulgação refere-se a vetores rAAV de fita simples capazes de obter transferência eficiente de genes para o segmento anterior no olho do camundongo. Vide Wang et al. Single stranded adeno-associated virus achieves efficient gene transfer to anterior segment in the mouse eye. PLoS ONE 12(8): e0182473 (2017).
[0162] Em alguns casos, o vetor rAAV é do sorotipo AAV1, AAV2, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11, AAV12, AAVI3 ou AAVrhiO. À produção de rAAV pseudotipado é divulgada em, por exemplo, WO 01/83692. Outros tipos de variantes rAAV, por exemplo rAAV com mutações no capsídeo, também são contemplados. Vide, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Em alguns casos, o vetor rAAV é do sorotipo AAV9. Em algumas modalidades, o referido vetor rAAV é do sorotipo AAV9 e compreende um genoma de fita simples. Em algumas modalidades, o referido vetor rAAV é do sorotipo AAV9 e compreende um genoma autocomplementar. Em algumas modalidades, um vetor rAAV compreende as sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2. Em algumas modalidades, o vetor rAAV compreende um genoma de AAV2, de modo que o vetor rAAV é um vetor AAV-2/9, um vetor AAV-2/6 ou um vetor AAV-2/8.
[0163] Sequências completas e sequências para genes de capsídeo para os AAV mais conhecidos são fornecidas na Patente dos EUA nº 8.524.446 , que é incorporada aqui na sua totalidade.
[0164] Os vetores AAV podem compreender uma sequência AAV de tipo selvagem ou podem compreender uma ou mais modificações em uma sequência AAV de tipo selvagem. Em certas modalidades, um vetor AAV compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, por exemplo, substituições, supressões ou inserções, dentro de uma proteína de capsídeo, por exemplo, VP1, VP2 e/ou VP3. Em modalidades particulares, a modificação fornece imunogenicidade reduzida quando o vetor AAV é fornecido a um paciente.
PROMOTORES
[0165] Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica que codifica as proteínas PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante deste, está operacionalmente ligada a um promotor de CMV. A presente divulgação contempla ainda o uso de outras sequências promotoras. Os promotores úteis nas modalidades da presente divulgação incluem, sem limitação, um promotor de fosfoglicerato quinase (PGK) de citomegalovírus (CMV) ou uma sequência promotora composta pelo intensificador de CMV e porções do promotor de beta-actina de frango e do gene da beta-globina de coelho (CAG). Em alguns casos, o promotor pode ser um promotor sintético. Promotores sintéticos exemplares são fornecidos por Schlabach et al. Synthetic design of strong promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 9 de fevereiro; 107(6): 2538-2543.
[0166] Em alguns casos, uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína terapêutica ou uma proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, cNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA de tipo selvagem, ou um fragmento funcional ou variante destas, está ligada operacionalmente a um promotor indutível. Uma sequência polinucleotídica operacionalmente ligada a um promotor indutível pode ser configurada para fazer com que a sequência polinucleotídica seja expressa transcricionalmente ou expressa não transcricionalmente, em resposta à adição ou acumulação de um agente ou em resposta à remoção, degradação ou diluição de um agente. O agente pode ser um fármaco. O agente pode ser tetraciclina ou um de seus derivados, incluindo, sem limitação, doxiciclina. Em alguns casos, o promotor induzível é um promotor tet-onn um promotor tet-offf um promotor regulado quimicamente, um promotor fisicamente regulado (isto é, um promotor que responde à presença ou ausência de luz ou a baixa ou alta temperatura). Esta lista de promotores induzíveis não é limitativa.
[0167] Como usado aqui, "promotor eucarioticamente ativo" ou "promotor" são usados de forma intercambiável e referem-se a promotor capaz de promover o início da transcrição de RNA a partir de um polinucleotideo em uma célula eucariótica. Em alguns casos, o promotor é um promotor específico de tecido, como um promotor capaz de dirigir a expressão em um neurônio em maior extensão do que em uma célula não neuronal. Em algumas modalidades, o promotor específico de tecido é selecionado a partir de uma lista de promotores específicos de neurônios que consistem em: hSYN1 (sinapsina humana), INA (alfa-internexina),) NES (nestina), TH (tirosina hidroxilase), FOXA2 (Forkhead box A2), CaMKlII (proteína quinase Il dependente de calmodulina) e NSE (enolase específica do neurônio). Em alguns casos, o promotor é um promotor ubíquo. Um "promotor ubíquo" refere-se a um promotor que não é específico de tecido em condições experimentais ou clínicas. Em alguns casos, o promotor ubíquo é selecionado do grupo que consiste em: CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-alfa, GAPDH, SV40, HBV, beta-actina de frango e beta-actina humana.
[0168] Em algumas modalidades, a sequência promotora é selecionada da Tabela 5 e sequências com pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade.
TABELA 5 NO: Beta-actina humana | GCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGC | 59 (HuBa) CAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAA
TCTCGCTCTCGCTCTTTITITITITCGCO NO: AAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAA ATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGT GAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGC GTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTA TGGCTCGAGCGGCCGCGEGCGGCGCCE TATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCC
ACCACCGCCGAGTC Beta-actina de frango, GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTT (CBA) CACTCTCCCCATCETCCCcccoceteceoo
ACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTITT AATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCEG GEGGGCGGGGCGGGGCEGCEGCGCCAGECGÇ GGGCEGGGCGGGGCGAGEGGCEGEGS CEGEGCEAGECGGAGAGGTGCGGCG GCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCG AAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCG GCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAA
GCGCEGCEGCEGECEGÇGA Citomegalovírus TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCA | 61 (CMV) ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC
GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTC GTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAA TGGGCGETAGEGCGTETACGEGTEGÇGAG
NO: e]
ACCG EF1-alfa humano | CAACCTTTGGAGCTAAGCCAGCAATGG | 62 (EF1-a) TAGAGGGAAGATTCTGCACGTCCCTTC
CAGGCGGCCTCCCCEGTCACCACCOCCOC CCCAACCCGCCCoGACCGGAGCTGAG
AGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCC TGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTC GTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCA GAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCAC CCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTG GAGAATAGCATGCGTGAGGCTCCGGT GCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATC GCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGÇ GAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCC TAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTG GGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCG CCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACC
GTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAA ceTT Sinapsina Humana1 | CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGC |63 (Syn) AAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGC
GGGGTGGGGGTEGCCTACCTGACGACC GACCCCGACCCACTGGACAAGCACCC AACCCCCATTCCCCAMATTGCGCATCC NO: CCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACA GGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTG
CCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCT TCGCCCCEGCeteGCGGCGCGCGCCA
CCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGECEC TGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAA
CTCCCCTTCCCEGGCCACCTTGGTCGCG TCCGCGCCGCCGCCGGCCcAGCCGGA
CCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGG GGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCT
GCGGCECCEGCGACTCAGCGCTECCT Cc CamkKlla humana | ACTTGTGGACAAAGTTTGCTCTATTCCA (CaMKlla) CCTCCETCCAGGCCCTCCTTGGGTCCAT
CACCCCAGGGGTGCTGGGTCCATCCC ACCCCCAGGCCCACACAGGCTTGCAGT ATTGTGTGCGGTATGGTCAGGGCGTCC GAGAGCAGGTTTCGCAGTGGAAGGCA GGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCG GGGCAACGGGAACAGGGCGTTTTGGA GGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGC TGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGC AGCCACAGTGCCCTGC
[0169] Outros exemplos ilustrativos de promotores são o promotor tardio SV40 do vírus símio 40, o elemento promotor/promotor do poliedro de baculovírus,
timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV tk), o promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV) e vários promotores retrovirais, incluindo elementos LTR. Os promotores induzíveis incluem promotores indutíveis de íons de metais pesados (como o promotor de vírus eo tumor mamário em camundongos (mMMTV) ou vários promotores de hormônio de crescimento) e os promotores do fago T7 que são ativos na presença da polimerase do RNA T7. A título ilustrativo, exemplos de promotores específicos de tecido incluem vários promotores de surfactina (para expressão no pulmão), promotores de miosina (para expressão no músculo) e promotores de albumina (para expressão no fígado). Uma grande variedade de outros promotores é conhecida e geralmente disponível na técnica, e as sequências de muitos desses promotores estão disponíveis em bancos de dados de sequências, como o banco de dados GenBank.
[0170] EM algumas modalidades, o vetor compreende ainda um intensificador de CMV.
OUTROS ELEMENTOS REGULAMENTARES
[0171] Em alguns casos, os vetores da presente divulgação compreendem ainda um ou mais elementos reguladores selecionados do grupo que consiste em um intensificador, um íntron, um sinal poli-A, uma sequência de codificação de peptídeo 2A, um WPRE (elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite de marmota) e um HPRE (elemento regulador pós-transcricional da hepatite B).
[0172] Em certas modalidades, os vetores compreendem um ou mais intensificadores. Em modalidades particulares, o intensificador é uma sequência intensificadora de CMV, uma sequência intensificadora de GAPDH, uma sequência intensificadora de B-actina ou uma sequência intensificadora de EF1-a. As sequências do precedente são conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, a sequência do intensificador inicial imediato de CMV (IE) é:
CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATA GGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCT
ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA (SEQ ID NO: 79)
[0173] Em certas modalidades, os vetores compreendem um ou mais íntrons. Em modalidades particulares, o íntron é uma sequência de íntron de globina de coelho, uma sequência de íntron de B-actina de frango, uma sequência de íntron sintética ou uma sequência de íntron EF1-a.
[0174] Em certas modalidades, os vetores compreendem uma sequência poliA. Em modalidades particulares, a sequência poliA é uma sequência poliA de globina de coelho, uma sequência poliA de hormônio de crescimento humano, uma sequência poliA de hormônio de crescimento bovino, uma sequência poliK de PGK, uma sequência poliA de SV40 ou uma sequência poliA de SV40 ou uma sequência poliA da TK. Em algumas modalidades, o sinal poli-A pode ser um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGHpA).
[0175] Em certas modalidades, os vetores compreendem um ou mais elementos estabilizadores de transcrição. Em modalidades particulares, o elemento estabilizador de transcrição é uma sequência WPRE, uma sequência HPRE, uma região de fixação de armação, um 3' UTR ou um 5' UTR . Em modalidades particulares, os vetores compreendem um 5' UTR e um 3' UTR.
[0176] Em algumas modalidades, o vetor compreende uma região não traduzida 5' (UTR) selecionada da Tabela 6.
TABELA 6 TRADUZIDA 5' NO:
TRADUZIDA 5' NO: Éxon/íntron de beta- | CGCGTCCGCCCGCGAGCACAGAGCCT | 65 actina humana CGCCTTTGCCGATCCEGCEGCCeGTCCA
CACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCA GCCGACCGGGGCATGCGGCCGCEGC CCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCOT GGGCCGCAGCGEGGEGGEGCGCATEGEG CGGAACCGGACCGCCGTEGGGGGECGÇ CGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAG ATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGC AGGCGCGAGGCCGCGCTCGEGGCGGSGÇ CGCGCTCEGGGGSETEGCCGCTCTCGGG GCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGT CTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGAT CGCACGGTGGGCGCGGCGTAGCCCECC GTCAGGCCCGEGTEGGGGCTEGGGGCGÇE CCATGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTG GGCGCTAACTGCGTGCGCGCTEGGGAA TTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTE GGACTCAATGGCGCTAATCGCGCGTGC GTTCTGGGGCCCGGGCGCTTGCGCCA CTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCGCCEGS AGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGC GCGACCCGGTCGCTGTTTGAACCOGGG CGGAGGCGGGGCTEGGCGCCCGGTTG GGAGGGGGTTGGEGCCTEGCTTCCTG
TRADUZIDA 5' NO:
CCGCGCGECCECGGGGACGCCTCCGAC CAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGC
GGCCEGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAA TCTGGGCECECECCEGCGCCCceteGs
CGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAA GTGGCCAGGGCGGCAGCGGCTGCTCT TGGCGEGCCCCGAGGTGACTATAGCCTT CTTTTGTGTCTTGATAGTTCGCCAGCCT CTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTT TTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCT GGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGC
AAAGAATTC Éxon/íntron de beta-| |STCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGT actina de frango + | GCCCCGCTCCGCCGCEGCCTEGCGCC Íntron de globina de | GCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCG coelho TTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGEGGA
CGGCCCTTCTCCETCCGGGCTGTAATTA GCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCT TTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAG GGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGG GGGGAGCGGCTCEGGGGGTECGTEC GTGTGTGTGTGCETGEGEGAGCGCEGC GTGCGGCTCCGECGCTGCCCGGCEGEGCT GTGAGCGCTGCEGGCEGCEGCGCEGÇE GCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGA
TRADUZIDA 5' NO:
GGGGAGCGCEGCCEGEGGCEGTECC CCGCEGTECEGEGEGEGCTEGCGAGGE GGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTG TGCGTGGGGGGGTSGAGCAGGGGGTGET
GGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCC CCCTGCACCCCCCTCCCoGAGTTGCTG
AGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGEGEG CTCCGTACGGGGCGTEGCGCGGGGCT CGCCEETGCEGGGCEGEGEGTEGCEG CAGGTGGGGGTEGCCGGGCGGGGCGG GGCCGCCTCGGGCCEGGEGAGGGCTC GGGGGAGGGGCECEGCEGCCCCEGGE AGCGCCGGCGGCTETCGAGGCGCEGC GAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTA ATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTC CTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGA AATCTGGGAGGCGCCGCCGCACOCCC TCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGE CGGCECCGGCAGGAAGGAAATGGGCG GGGAGGGCCTTCGTGCGETCGCCGCGC CGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCT CGGGGCTEGTCCGCGEGGGGGACGGCT GCCTTCEGGGGGGGACEGEGCAGEGC GGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCG GCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATG
TRADUZIDA 5' NO:
TTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCOT CCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCT
GTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC Éxon de sinapse 1 AGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCE | 67
GTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGCTGTG CTCCTGGGCACCGCGCAGTCCGCCec
CGCGGCTCCTGECCAGACCACCCCTA
GGACCCCCTGCCCCAAGTCGCAG Éxon de CMV IE TCAGATCGCCTGGAGAGGCCATCCACG
CTGTTTTGACCTCCATAGTGGACACCG GGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCEGE AACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCC
GTGCCAAGAGTGAC TPL-eMLP (elemento | ETCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGC intensificador GAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTT derivado de | GAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCA adenovírus) GTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGC
CTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGG GACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGG ATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTC TAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCT GAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGST GGCGGTCGGGGTTEGTTTCTGGCGGAG GTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAG GCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGA
TRADUZIDA 5' NO:
GGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCC AGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCA AAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGA TTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGAT TTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCC ATACACTTGAGTGACAATGACATCCACT TTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTC
CCAG Íntron/éxon de EF1a | CTTTTTOEGCAACGGGTTTGCCGCCAGA |70 humano ACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCC
CGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTAT GGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCC ACCTGGCTCCAGTACGTGATTCTTGAT CCCGAGCTGGAGCCAGGGGCGEGGCCT TGCGCTTTAGGAGCCCCTTCGCCTCGT GCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGT GGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTT TCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTT TTGATGACGTGCTGCGACGCTTTTIITTC TGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGC CAGGATCTGCACACTGGTATTTCGGTT TTTGGGCCCGCGGCCGEGCGACEGGGC CCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGG CGAGGCGGGGCCTECGAGCGCEGCC
TRADUZIDA 5' NO:
ACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTC AAGCTGGCCGGCCTGCTCTGETGCCT GGCCTCGCGCCGCCGTETATEGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGT CGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGA TGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTCCAGGE GGGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCT CGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCC ACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCC TCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACG GAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCT CGATTAGTTCTGGAGCTTTTGGAGTAC GTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTT TTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGA GTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG CTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGGCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGG TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTC
AAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG CamKlla humano 5'| TEAGAAGCCCCGGGCTCGTCAGTCAAA | 71
UTR CCGGTTCTCTGTTTGCACTCEGGCAGCA
CGGGCAGGCAAGTGGTCCCTAGGTTC GGGç
[0177] Em algumas modalidades, o vetor compreende uma região não traduzida 3' selecionada da Tabela 7.
TABELA 7 TRADUZIDA 3' NO: WPRE(x) (elemento | TICCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAA |72 regulador de hepatite , AATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTT de marmota mutado) | AACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTG
GATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCA TGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATT TTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGC TGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCG TTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCA CTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTG GTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGC TCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCT CCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGC CGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAG GGGCTCGGCTEGTTGGGCACTGACAATT CCGTGGTEGTTGTCGGGGAAGCTGACG TCCTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGSTT GCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGETC CTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAA TCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCEOT GCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGC CTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTC GGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC CCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGT TTTTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTT
TRADUZIDA 3' NO:
CAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCG GCTTTGGGGCATGGACATAGATCCCTA TAAAGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTG
TTGAATTTTCTTCCTTTGGAC R2V17 (elemento | TICCTGTAMACAGGCCTATTGATTGGAA | 73 intensificador AGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTG derivado de HepB) GGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGT
GGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATG CATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTAC TTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTC AGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCG TTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCC AAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTG GTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGC GCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTC TGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAG CCGCTTGTTTTGCTCGCAGCTGGACTG GAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATT CTGTCGTACTCTCCCGCAAGCACTCAC CGTTTCEGCGGCTGCTCGCCTGTGTTG CCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCT TCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATC CAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTG CTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCEGCCT CTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGG
TRADUZIDA 3' NO: ATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCco
ATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTT TTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTTCA AGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCGGCT TTGGGGCATGGACATAGATCCCTATAA AGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTGTTG
AATTTTCTTCCTTTGGAC 3'UTR(globina) GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCOT | 74
GCCCGCTGGEGCCTCCCAACGGGCCCOT CCTCCCCTCCTTGCACOGGCCCTTCCOT
GGTCTTTGAATAAA WPRE(r) ATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCC |75
CATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGG GTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAA TGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGG GATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATT GCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTT TCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTA ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGA AAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTT GCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCT GCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTG CTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTC CTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTT TATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGT
TRADUZIDA 3' NO:
CAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTT GCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGÇ CATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCT GGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATC GCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTG CCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTA GGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGG TGTTGTCGGEGAAGGGCC
[0178] Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de poliadenilação (poliA) selecionada da Tabela 8. TABELA 8 NO: Globina de coelho) TGGCTAATAAAGGAAATTTATTITTCATT |76 (PpAGIobin-Oc) GCAATAGTGTGTTGGAATTTITITGTGTC
TCTCACTCGGAAGAACATATGGGAGGG CAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTA TTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCC CATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGT TGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGA AACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATT CCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTA GATTTTTTTTATATTTTGTTITGTGTTAT TTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCC TTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCC
NO: Em
CTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC Hormônio do | TIGCCAGCCATCTGTTGTTTGCOCCCOTE |77 crescimento — bovino | CCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG (PAGH-Bt) TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAA
AATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTG AGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGT GGGCGTEGEGCAGGACAGCAAGGGGG AGGATTGGGAATACAATAGCAGGCATG CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGT ACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGT
TCCTCCTGGG Hormônio do | CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCOC |78 crescimento humano | CTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGA (PpAGH-Hs) AGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCT
TGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATT TTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATA TTATGGGGTGGAGGGGGGTEGGTATGG AGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAA CCTGTAGGGCCTEGC
[0179] Cassetes de expressão ilustrativas estão representadas na Figura 13 e fornecidas como SEQ ID NOs: 39 a 58, listados na Tabela 10. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência polinucleotídica que compartilha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer um dos SEQ ID NOs: 39 a 58. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência polinucleotídica que compartilha pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer um dos SEQ ID NOs: 39 a 58, excluindo a sequência que codifica o produto do gene terapêutico. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o produto do gene terapêutico si é substituída por uma sequência que codifica um produto do gene terapêutico diferente.
[0180] Numa modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, o promotor HUBA, o transgene, WPRE(x) e pAGlobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0181] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem de 5' a 3', o promotor de CMV, o intensificador de TPL-eMLP, o transgene, WPRE(r) e pAGlobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0182] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3', promotor Syn, o transgene, WPRE(r), 3'UTR (globina) e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0183] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem
5' a3,o promotor de CBA, o transgene e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARKS6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou a38.
[0184] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, promotor EF1I, o transgene e pAGlobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a38.
[0185] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3', o Promotor HuBA, o transgene, R2QV17 e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0186] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3', promotor Syn, o transgene, WPRE(x), 3UTR (globina) e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0187] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a3,0o promotor de CaMKlla, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0188] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem de 5' a 3', promotor CMV, intensificador de TPL-eMLP, transgene, WPRE(r) e pAGH- Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0189] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, o promotor HUBA, o transgene e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou a38.
[0190] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem de 5' a 3', promotor de CMV, intensificador de TPL/eMLP, o transgene, R2V17, 3'UTR (globina) e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleíina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0191] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, promotor EF1 , o transgene, WPRE(r) e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a38.
[0192] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem
5'a 3', promotor Syn, o transgene, R2QV17 e pAGIobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARKS6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a38.
[0193] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 'a 3', o promotor de CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGlobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0194] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5'a 3', o promotor CBA, o transgene, WPRE(x), 3UTR (globina) e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0195] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5 'a 3, o promotor CBA, o transgene, 3'UTR (globina) e pAGIobin-Oc. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0196] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5 'a3,0o promotor de CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGH-Bt. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK?2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0197] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, o promotor EF1 , o transgene, R2QV17, 3UTR (globina) e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0198] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem de 5' a 3', o promotor de CMV, o transgene, R2V17, 3'UTR (globina) e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRHK2, a-sinucleína e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35 a 38.
[0199] Em uma modalidade, o cassete de expressão compreende, na ordem 5' a 3, o promotor de CMV, o transgene e pAGH-Hs. Em certas modalidades, o transgene codifica PARK2, PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), LRRK2, a-sinucleina e DJ-1. Em modalidades particulares, ele codifica PARK2, e em certas modalidades, compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 ou 35a38.
[0200] Em modalidades do precedente, a ordem dos elementos 5' para o transgene é revertida de modo que o promotor preceda os elementos intensificadores ou o elemento intensificador preceda o elemento promotor.
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[0201] Conforme aqui usado, o termo "enfermo em necessidade" ou "paciente em necessidade" refere-se a um enfermo ou paciente em risco ou que sofra de uma doença, distúrbio ou condição passível de tratamento ou melhoria com um vetor de terapia genética recombinante ou sistema de edição de genes aqui divulgado. Um enfermo ou paciente em necessidade pode, por exemplo, ser um enfermo ou paciente diagnosticado com um distúrbio associado à degradação do sistema nervoso central. Um paciente pode ter uma mutação ou mau funcionamento em um gene ou proteína de PARK2, PARK6, PARK7, LRRK2 ou a-sucucleína. "Paciente" e "indivíduo" são usados de forma intercambiável neste documento. O paciente tratado pelos métodos aqui descritos pode ser um adulto ou uma criança. Os pacientes podem variar de idade. O paciente pode ser uma pessoa identificada como em risco de uma doença de Parkinson, por exemplo, uma doença de Parkinson de aparecimento precoce.
[0202] As terapias de combinação também são contempladas pela invenção. A combinação como aqui usada inclui tratamento simultâneo ou tratamento sequencial. Combinações de métodos da invenção com tratamentos médicos padrão (por exemplo, corticosteróides ou medicamentos tópicos para redução da pressão) são especificamente contempladas, assim como combinações com novas terapias. Em alguns casos, um paciente pode ser tratado com um esteróide para prevenir ou reduzir uma resposta imune à administração de um rAAV aqui descrito. Em certos casos, um paciente pode receber medicamentos tópicos para redução da pressão antes, durante ou após a administração de um rAAV aqui descrito.
[0203] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor rAAV é uma dose de rAAV que varia de cerca de 1e7 vg/kg a cerca de 5e15 vg/Kkg, ou cerca de 1e7 vg/kg a cerca de 1e14 vg/kg ou cerca de 1e8 vg/kg a cerca de 1614 vg/kg, ou cerca de 1e9 vg/kg a cerca de 1613 vg/kg, ou cerca de 1e9 vg/kg a cerca de 1612 vg/kg, ou cerca de 1e7 vg/kg a cerca de 5e7 vg/kg ou cerca de 1e8 vg/kg a cerca de 5e8 vg/Kkg, ou cerca de 1e9 vg/kg a cerca de 5e9 vg/Kkg, ou cerca de 1610 vg/kg a cerca de 5€10 vg/kg, ou cerca de 1e11 vg/kg a cerca de 5e11 vg/kg ou cerca de 1e12 vg/kg a cerca de 5e12 vg/kg, ou cerca de 1e13 vg/kg a cerca de 5e13 vg/kg, ou cerca de 1e14 vg/kg a cerca de 5e14 vg/kg, ou cerca de 1e15 vg/kg a cerca de 5e15 vg/kg. A invenção também compreende composições compreendendo essas faixas de vetor rAAV.
[0204] Por exemplo, em modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor rAAV é uma dose de cerca de 1e610 vg/Kkg, cerca de 28610 vg/kg, cerca de 3e10 vg/kg, cerca de 4610 vg/kg, cerca de 5e10 vg/kg, cerca de 6610 vg/kg, cerca de 7e10 vg/kg, cerca de 8e10 vg/kg, cerca de 9e10 vg/kg, cerca de 1612 vg/kg, cerca de 2e12 vg/kg, cerca de 3e12 vg/kg, cerca de 4612 vg/kg e 5612 vg/kg. A invenção também compreende composições compreendendo essas doses do vetor rAAV.
[0205] Em algumas modalidades, por exemplo, onde a injeção direta na substância negra é realizada, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor rAAV é uma dose na faixa de 1e7 vg a 1e11 vg ou cerca de 1e7 vg, cerca de 1e8 vg, cerca de 1e9 vg, cerca de 1610 vg ou cerca de 1e11 vg.
[0206] Em algumas modalidades, por exemplo, onde a injeção direta no intraputaminal é realizada, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor rAAV é uma dose na faixa de 1e7 vg a 1e11 vg ou cerca de 1e7 vg, cerca de 1e8 vg, cerca de 1e9 vg, cerca de 1610 vg ou aproximadamente 1e11 vg.
[0207] Em alguns casos, a composição terapêutica compreende mais do que cerca de 1e9, 1610 ou 1e1l1 genomas do vetor rAAV por volume de composição terapêutica injetada. Em alguns casos, a composição terapêutica compreende mais do que cerca de 1e9, 1e10 ou 1lei1l genomas do vetor rAAV por volume de composição terapêutica injetada. Em alguns casos, a composição terapêutica compreende mais do que aproximadamente 1e10, 1611, 1e12 ou 1613 genomas do vetor rAAV por mL. Em certas modalidades, a composição terapêutica compreende menos do que cerca de 1614, 1e13 ou le1e12 do genoma do vetor rAAV por mL.
ADMINISTRAÇÃO DE COMPOSIÇÕES
[0208] A administração de uma dose eficaz das composições pode ser por vias padrão na técnica, incluindo, mas não se limitando a, injeção sistêmica, local, direta, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal,intra-hipocampal, intraestriatal, ou administração intracerebroventricular. Em alguns casos, administração compreende injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra- hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular. A administração pode ser realizada por injeção intratecal com inclinação de Threndelenberg. A(s) via(s) de administração e sorotipo(s) dos componentes de AAV do rAAV (em particular, os ITRs de AAV e a proteína de capsídeo) da invenção podem ser escolhidos e/ou compatíveis pelos técnicos no assunto, levando em consideração o distúrbio tratado e as células/tecido-alvo que devem expressar o gene reparado e/ou fornecido exogenamente.
[0209] Em certa modalidade, a divulgação fornece administração local e administração sistêmica de uma dose eficaz de rAAV e composições da invenção. Por exemplo, a administração sistêmica pode ser administrada no sistema circulatório para que todo o corpo seja afetado. A administração sistêmica inclui administração enteral, como absorção pelo trato gastrointestinal e administração parenteral por injeção, infusão ou implantação.
[0210] Em particular, a administração real de rAAV da presente invenção pode ser realizada usando qualquer método físico que transporte o vetor recombinante rAAV para o tecido-alvo de um animal. A administração de acordo com a invenção inclui, mas não está limitada a, injeção no sistema nervoso central (SNC) ou líquido cefalorraquidiano (LCR) e/ou diretamente no cérebro.
[0211] As proteínas de capsídeo de um rAAV podem ser modificadas para que o rAAV seja direcionado para um tecido-alvo de interesse específico, como neurônios ou, mais particularmente, um neurônio dopaminérgico. Vide, por exemplo ,
Albert et al. AAV Vector-Mediated Gene Delivery to Substantia Nigra Dopamine Neurons: Implications for Gene Therapy and Disease Models. Genes. 8 de fevereiro de 2017; vide também Patente dos EUA nº 6.180.613 e Pub. Patente dos EUA nº US20120082650A1, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência. Em algumas modalidades, o rAAV é diretamente injetado na substância negra do paciente.
[0212] Para fins de administração, por exemplo, por injeção, várias soluções podem ser empregadas, como soluções aquosas estéreis. Tais soluções aquosas podem ser tamponadas, se desejado, e o primeiro diluente líquido tornado isotônico com solução salina ou glicose. Soluções de rAAV como um ácido livre (o DNA contém grupos fosfato ácido) ou um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparados em água adequadamente misturada com um surfactante como a hidroxipropilcelulose. Uma dispersão de rAAV também pode ser preparada em glicerol, polietileno glicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de microorganismos. Neste contexto, os meios aquosos estéreis usados são todos facilmente obtidos por técnicas padrão bem conhecidas dos técnicos no assunto.
[0213] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem, mas não estão limitadas a, soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma é estéril e deve ser fluida na medida em que exista facilidade de seringa. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra as ações contaminantes de microrganismos, como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e similares), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de uma dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. À absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0214] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando rAAV na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização por filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o ingrediente ativo esterilizado em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a técnica de liofiização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado da sua solução previamente filtrada por esterilização.
[0215] A transdução com rAAV também pode ser realizada in vitro. Em uma modalidade, as células-alvo desejadas são removidas do paciente, transduzidas com rAAV e reintroduzidas no paciente.
[0216] Métodos adequados para a transdução e reintrodução de células transduzidas em um paciente são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as células podem ser transduzidas in vitro combinando rAAV com células, por exemplo, em meios apropriados, e pesquisando aquelas células que abrigam o DNA de interesse usando técnicas convencionais, como Southern blot e/ou PCR, ou usando marcadores selecionáveis. As células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêuticas, e a composição introduzida no paciente por várias técnicas, como por injeção sistêmica, local, direta, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal , ou administração intracerebroventricular. Em alguns casos, administração compreende injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular. A administração pode ser realizada por injeção intratecal com inclinação de Threndelenburg.
[0217] A transdução de células com rAAV da invenção resulta na expressão sustentada de um gene de interesse, como PARK2, PARK6, PARK7, LRRK2 ou a- sinucleína. A presente invenção fornece, assim, métodos de administração ou liberação de vetores de terapia genética recombinantes (por exemplo, vetores rAAV) que expressam um gene relacionado à degeneração do SNC a um paciente mamífero, preferencialmente um ser humano. Estes métodos incluem a transdução de tecidos (incluindo, mas não se limitando aos tecidos do cérebro) com um ou mais rAAV da presente invenção. A transdução pode ser realizada com cassetes de genes compreendendo elementos de controle específicos de tecido. Por exemplo, uma modalidade da invenção fornece métodos de transdução de células neuronais e tecidos cerebrais direcionados por elementos de controle específicos de neurônios, incluindo, mas não limitados a, aqueles derivados de promotores enriquecidos com neurônios e outros elementos de controle.
SISTEMA DE EDIÇÃO DE GENE
[0218] Como aqui usado, um sistema de edição de gene é um sistema que compreende uma ou mais proteínas ou polinucleotídeos capazes de editar um gene alvo endógeno ou lócus de uma maneira específica de sequência. Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é um sistema de regulação de gene baseado em proteína que compreende uma proteína que compreende um ou mais domínios de ligação dedo de zinco e um domínio enzimático. Em algumas modalidades, o sistema de regulação de genes à base de proteína compreende uma proteína que compreende um Efetor Tipo-Ativador de Transcrição nucleases (TALEN) e um domínio enzimático. Tais modalidades são aqui referidas como "TALENS".
1. SISTEMAS À BASE DE DEDOS DE ZINCO
[0219] Os sistemas á base de dedo de zinco compreendem uma proteína de fusão compreendendo dois domínios de proteína: um domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco e um domínio enzimático. Um "domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco", "proteína de dedo de zinco" ou "ZFP" é uma proteína ou um domínio dentro de uma proteína maior que liga o DNA de uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões da sequência de aminoácidos no domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O domínio de dedo de zinco, ao se ligar a uma sequência de DNA alvo, direciona a atividade do domínio enzimático para a vizinhança da sequência e, portanto, induz a modificação do gene alvo endógeno na vizinhança da sequência-alvo. Um domínio de dedo de zinco pode ser projetado para se ligar a praticamente qualquer sequência desejada. Consequentemente, após a identificação de um locus genético-alvo contendo uma sequência de DNA-alvo na qual é desejada a clivagem ou recombinação (por exemplo, um locus alvo em um gene alvo referido na Tabela 1), um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco podem ser manipulados para se ligar a uma ou mais sequências de DNA-alvo no lócus genético-alvo. A expressão de uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação ao dedo de zinco e um domínio enzimático em uma célula afeta a modificação no lócus genético-alvo.
[0220] Em algumas modalidades, um domínio de ligação de dedo de zinco compreende um ou mais dedos de zinco. Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 16010- 1714; Rhodes (1993) Scientific American February: 56-65; Pat. dos EUA nº
6.453.242. Normalmente, um único domínio de dedo de zinco tem cerca de 30 aminoácidos de comprimento. Um dedo de zinco individual se liga a uma sequência de três nucleotídeos (isto é, tripleto) (ou uma sequência de quatro nucleotídeos que pode se sobrepor, por um nucleotídeo, ao local de ligação de quatro nucleotídeos de um dedo de zinco adjacente). Portanto, o comprimento de uma sequência na qual um domínio de ligação de dedo de zinco é projetado para se ligar (por exemplo, uma sequência-alvo) determinará o número de dedos de zinco em um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado. Por exemplo, para ZFPs em que os motivos dos dedos não se ligam a sublocais sobrepostos, uma sequência-alvo de seis nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação com dois dedos; uma sequência- alvo de nove nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação de três dedos, etc. Locais de ligação para os dedos de zinco individuais (isto é, sublocais) em uma necessidade local alvo não ser contígua, mas podem ser separados por um ou vários nucleótidos, dependendo do comprimento e da natureza das sequências de aminoácidos entre os dedos de zinco (isto é, os ligantes entre os dedos) em um domínio de ligação de vários dedos. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao DNA de ZFNs individuais compreendem entre três e seis repetições individuais de dedo de zinco e podem reconhecer cada um entre 9 e 18 pares de bases.
[0221] Os domínios de ligação com o dedo de zinco podem ser projetados para se ligar a uma sequência de escolha. Vide, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação com uma proteína de dedo de zinco que ocorre naturalmente. Os métodos de manipulação incluem, mas não estão limitados a, projeto racional e vários tipos de seleção.
[0222] A seleção de uma sequência de DNA-alvo para ligação por um domínio de dedo de zinco pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na Patente dos EUA nº 6.453.242. Ficará claro para os técnicos no assunro que a inspeção visual simples de uma sequência nucleotídica também pode ser usada para a seleção de uma sequência de DNA-alvo. Por conseguinte, quaisquer meios para a seleção da sequência de DNA-alvo podem ser usados nos métodos aqui descritos. Um local alvo geralmente tem um comprimento de pelo menos 9 nucleotídeos e, consequentemente, é ligado por um domínio de ligação de dedo de zinco compreendendo pelo menos três dedos de zinco. No entanto, a ligação de, por exemplo, um domínio de ligação de 4 dedos a um local alvo de 12 nucleotídeos, um domínio de ligação de 5 dedos a um local alvo de 15 nucleotídeos ou um domínio de ligação de 6 dedos a um local alvo de 18 nucleotídeos também é possível. Como será aparente, a ligação de domínios de ligação maiores (por exemplo, 7, 8, 9 dedos e mais) a locais-alvo mais longos também é possível.
[0223] Em algumas modalidades, os domínios de ligação de dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA alvo dentro de um lócus-alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA-alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios de ligação do dedo de zinco se ligam a uma sequência de DNA-alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na Tabela 1.
[0224] A porção de domínio enzimático das proteínas de fusão de dedos de zinco pode ser obtida de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplares das quais um domínio enzimático pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a, endonucleases de restrição e endonucleases de retorno. Vide, por exemplo, Catálogo 2002 a 2003, New England Biolabs, Beverly, Mass.; e Belfortet al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. São conhecidas enzimas adicionais que clivam o DNA (por exemplo, Nuclease 51; nuclease de feijão mungo; DNase | pancreática; nuclease microcócica; endonuclease HO de levedura; vide também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais deste) podem ser usadas como fonte de domínios de clivagem.
[0225] Endonucleases de restrição exemplares (enzimas de restrição) adequadas para uso como domínio enzimático dos ZFPs aqui descritos estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica de sequências ao DNA (em um local de reconhecimento) e clivagem de DNA no local ou próximo ao local de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA em locais removidos do local de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Tipo IIS Fok | catalisa a clivagem de DNA de fita dupla em 9 nucleotídeos do seu local de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos do seu local de reconhecimento na outra. Vide, por exemplo, Pat. dos EUA nº 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Assim, em uma modalidade, as proteínas de fusão compreendem o domínio enzimático de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação ao dedo de zinco.
[0226] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplificativa, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok |. Essa enzima específica é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10.570-
10.575. Assim, para a clivagem de DNA de fita dupla direcionada usando fusões de dedo de zinco-Fok |, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio enzimático de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula polipeptídica contendo um domínio de ligação ao dedo de zinco e dois domínios enzimáticos de Fok | também podem ser usados. ZFPs exemplares compreendendo domínios enzimáticos de Fokl são descritos na Patente dos EUA nº 9.782.437.
2. SISTEMAS À BASE TALEN
[0227] Os sistemas à base TALEN compreendem uma proteína que compreende um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL e um domínio enzimático. Eles são feitos pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA (uma nuclease que corta as fitas de DNA). A enzima de restrição Fok | descrita acima é um domínio enzimático exemplar adequado para uso em sistemas de regulação de genes à base TALEN.
[0228] Os efetores de TAL são proteínas secretadas pela bactéria Xanthomonas através do seu sistema de secreção tipo Ill quando infectam plantas. O domínio de ligação ao DNA contém uma sequência repetida e altamente conservada de 33-34 aminoácidos com aminoácidos 12º e 13º divergentes. Essas duas posições, referidas como Diresidue variável repetida (RVD), são altamente variáveis e fortemente correlacionadas com o reconhecimento específico de nucleotídeos. Portanto, os domínios efetores TAL podem ser manipulados para ligar sequências de DNA-alvo específicas selecionando uma combinação de segmentos de repetição contendo os RVDs apropriados. A especificidade do ácido nucleico para combinações de RVD é a seguinte: HD tem como alvo citosina, NI tem como alvo adenina, NG tem como alvo timina e NN tem como alvo guanina (embora, em algumas modalidades, o NN também possa se ligar à adenina com menor especificidade).
[0229] Em algumas modalidades, os domínios efetores TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios efetores TAL se ligam a uma sequência de DNA-alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na tabela 1. Em algumas modalidades, os domínios efetores de TAL se ligam a uma sequência de DNA alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado aqueles listados na Tabela 1.
[0230] Os métodos e composições para montar as repetições efetoras de TAL são conhecidos na técnica. Vide,por exemplo, Cermak et al., Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82. Os plasmídeos para construções das repetições efetoras de TAL estão disponíveis comercialmente na Addgene.
[0231] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes é um sistema de regulação de genes de combinação que compreende um polipeptídeo modificador direcionado ao local e uma molécula guia de ácido nucleico. Aqui, um "polipeptídeo modificador direcionado ao local" refere-se a um polipeptídeo que se liga a uma molécula guia de ácido nucleico, é alvo de uma sequência de ácido nucleico-alvo, como, por exemplo, uma sequência de DNA, pela molécula guia de ácido nucleico à qual está ligado e modifica a sequência de DNA-alvo (por exemplo, clivagem, mutação ou metilação do DNA-alvo) Um polipeptídeo modificador direcionado ao local compreende duas porções, uma porção que liga o guia de ácido nucleico e uma porção de atividade. Em algumas modalidades, um polipeptídeo modificador direcionado ao local compreende uma porção de atividade que exibe atividade enzimática direcionada ao local por exemplo , metilação do DNA, clivagem do DNA, acetilação da histona, metilação da histona, etc.), em que o local da atividade enzimática é determinado pelo guia ácido nucleico.
[0232] O guia de ácido nucleico compreende duas porções: uma primeira porção que é complementar a, e capaz de se ligar a uma sequência de DNA-alvo endógena (referida aqui como um "segmento de ligação ao DNA") e uma segunda porção que é capaz de interagir com o polipeptídeo modificador direcionado ao local (referido aqui como um "segmento de ligação a proteínas"). Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao DNA e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nucleico estão compreendidos dentro de uma única molécula de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o segmento de ligação ao DNA e o segmento de ligação à proteína de um guia de ácido nucleico estão compreendidos dentro de moléculas de polinucleotídeo separadas, de modo que o guia de ácido nucleico compreende duas moléculas de polinucleotídeo que se associam para formar o guia funcional.
[0233] O guia de ácido nucleico medeia a especificidade alvo dos sistemas reguladores combinados de proteína/gene nucleico, hibridando especificamente com uma sequência de DNA alvo compreendida na sequência de DNA de um gene alvo. A referência aqui mencionada a um gene alvo abrange a sequência de DNA completa para esse gene em particular e uma sequência de DNA completa para um determinado gene alvo compreenderá uma pluralidade de locus genético alvo, que se referem a partes de uma sequência genética específica (por exemplo, um éxon ou um íntron). Dentro de cada loci genético direcionado, há trechos mais curtos de sequências de DNA aqui referidos como "sequências de DNA direcionado" ou "sequências direcionadas" que podem ser modificados pelos sistemas de regulação de genes aqui descritos. Além disso, cada loci genético-alvo compreende um "local de modificação-alvo", que se refere à localização precisa da modificação induzida pelo sistema regulador de genes (por exemplo, a localização de uma inserção, uma supressão ou mutação, a localização de uma quebra de DNA ou a localização de uma modificação epigenética). Os sistemas de regulação de genes aqui descritos podem compreender um único guia de ácido nucleico ou podem compreender uma pluralidade de guias de ácido nucleico (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais guias de ácido nucleico).
[0234] Os sistemas CRISPR/Cas descritos abaixo são modalidades exemplares de um sistema combinado de proteína/ácido nucleico.
3. SISTEMAS DE REGULAÇÃO CRISPR/CAS GENE
[0235] Em algumas modalidades, os sistemas de edição de genes aqui descritos são sistemas de nuclease CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas entre Espaços Regularmente Agrupados em Cluster)/Cas (CRISPR Associados). Em tais modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao local é uma endonuclease associada ao CRISPR (uma endonuclease "Cas") e a molécula guia de ácido nucleico é um RNA guia (gRNA).
[0236] Um polipeptídeo Cas refere-se a um polipeptídeo que pode interagir com uma molécula de gRNA e, em conjunto com a molécula de gRNA, hospeda ou localiza uma sequência de DNA-alvo e inclui proteínas Cas de ocorrência natural e proteínas Cas manipuladas, alteradas ou modificadas que diferem por um ou mais resíduos de aminoácidos de uma sequência Cas que ocorre naturalmente.
[0237] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Cas9 é uma enzima de múltiplos domínios que usa um domínio de nuclease HNH para Clivar a fita direcionada do DNA e um domínio semelhante a RuvC para clivar a fita não direcionada. Em algumas modalidades, mutantes de Cas9 podem ser gerados por inativação de domínio seletivo, permitindo a conversão de WT Cas9 em um mutante enzimaticamente inativo (por exemplo, dCas9), que é incapaz de clivar o DNA, ou um mutante de nickase, que é capaz de produzir quebras de DNA de fita simples, clivando uma ou outra da fita-alvo ou não-alvo.
[0238] Um RNA guia (gRNA) compreende dois segmentos, um segmento de ligação ao DNA e um segmento de ligação à proteína. Em algumas modalidades, o segmento de ligação a proteínas de um gRNA é compreendido em uma molécula de RNA e o segmento de ligação a DNA é compreendido em outra molécula de RNA separada. Tais modalidades são aqui referidas como "gRNAs de molécula dupla" ou "gRNA de duas moléculas" ou "gRNAs duplos". Em algumas modalidades, o gRNA é uma molécula de RNA única e é aqui referido como um "RNA guia único" ou um "sgRNA". O termo "RNA guia" ou "gRNA" é inclusivo, referindo-se a RNAs guia de duas moléculas e sgaRNAs.
[0239] O segmento de ligação a proteínas de um gRNA compreende, em parte, dois trechos complementares de nucleotídeos que hibridam entre si para formar um duplex de RNA de fita dupla (dsRNA duplex), que facilita a ligação à proteína Cas.
[0240] O segmento de ligação ao DNA (ou "sequência de ligação ao DNA") de um gRNA compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar e capaz de se ligar a uma sequência específica de uma sequência de DNA-alvo. O segmento de ligação às proteínas do gRNA interage com um polipeptídeo Cas e a interação da molécula de gRNA e do polipeptídeo modificador direcionado ao local resulta na ligação de Cas ao DNA endógeno e produz uma ou mais modificações dentro ou ao redor da sequência de DNA-alvo. A localização precisa do local de modificação-alvo é determinada por (i) complementaridade de emparelhamento de bases entre o gRNA e a sequência de DNA-alvo; e (ii) a localização de um motivo curto, referido como motivo adjacente do protospacer (PAM), na sequência de DNA- alvo. A sequência PAM é necessária para a ligação de Cas à sequência de DNA- alvo. Uma variedade de sequências de PAM são conhecidas na técnica e são adequadas para uso com uma endonuclease Cas específica (por exemplo, uma endonuclease Cas9) são conhecidas na técnica (Vide, por exemplo, Nat Methods.
2013 Nov; 10(11): 1116-1121 e Sci Rep. 2014; 4: 5405). Em algumas modalidades, a sequência de PAM está localizada dentro de 50 pares de bases do local de modificação-alvo. Em algumas modalidades, a sequência de PAM está localizada dentro de 10 pares de bases do local de modificação-alvo. As sequências de DNA que podem ser direcionadas por este método são limitadas apenas pela distância relativa da sequência PAM ao local de modificação-alvo e pela presença de uma sequência exclusiva de 20 pares de bases para mediar a sequência específica, ligação de Cas mediada por gRNA. Em algumas modalidades, o local de modificação alvo está localizado no terminal 5' do locus alvo. Em algumas modalidades, o local de modificação alvo está localizado na extremidade 3' do locus alvo. Em algumas modalidades, o local de modificação alvo está localizado dentro de um íntron ou um éxon do locus alvo.
[0241] EM algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica um gRNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica o gRNA é compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao local. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificador direcionado ao local é compreendido em um vetor de expressão, por exemplo, um vetor de expressão recombinante.
a. PROTEÍNAS CAS
[0242] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificador direcionado ao local é uma proteína Cas. Moléculas Cas de várias espécies podem ser usadas nos métodos e composições aqui descritos, incluindo moléculas Cas derivadas de S. pyogenes,S. aureus, N. meningitidis, S. thermophiles, Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus,
Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis,Bacteroides sp ., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterospoxus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirilum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens,Corynebacterium difteria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gammaproteobacteria, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputomm, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes bactéria Listeriaceae, Methylocystis sp. , Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., ou Verminephrobacter eiseniae.
[0243] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 ou um ortólogo Cas9 e é selecionada do grupo que consiste em SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, e NmeCas9. Em algumas modalidades, a endonuclease é selecionada a partir do grupo que consiste em C2C1, C2C3, Cpf1 (também referido como Cas12a), Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também referido como Csnl e Csx12), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, emr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, e Csf4. Ortólogos Cas9 adicionais são descritos na Publicação Internacional PCT nº
WO 2015/07 1474.
[0244] Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é uma proteína Cas9 de ocorrência natural. Moléculas exemplares Cas9 de ocorrência natural são descritas em Chylinski et al. , RNA Biology 2013 10:5, 727 a 737. Essas moléculas Cas9 incluem moléculas Cas9 de uma família bacteriana de cluster 1, família bacteriana de cluster 2, família bacteriana de cluster 3, família bacteriana de cluster 4, família bacteriana de cluster 5, família bacteriana de cluster 6, família bacteriana de cluster 7, família bacteriana de cluster 8, uma família bacteriana de cluster 9, uma família bacteriana de cluster 10, uma família bacteriana de cluster 11, uma família bacteriana de cluster 12, uma família bacteriana de cluster 13, uma família bacteriana de cluster 14, uma família bacteriana de cluster 15, uma família bacteriana de cluster 16, uma família bacteriana de cluster 17, uma família bacteriana de cluster 18, uma família bacteriana de cluster 19, uma família bacteriana de cluster 20, uma família bacteriana de cluster 21, uma família bacteriana de cluster 22, uma família bacteriana de cluster 23, uma família bacteriana cluster de 24, uma família bacteriana de cluster 25, uma família bacteriana de cluster 26, uma família bacteriana de cluster 27, uma família bacteriana de cluster 28, uma família bacteriana de cluster 29, uma família bacteriana de cluster 30, uma família bacteriana de cluster 31, uma família bacteriana de cluster 32, uma família bacteriana de cluster 33, uma família bacteriana de cluster 34, uma família bacteriana de cluster 35, uma família bacteriana de cluster 36, uma família bacteriana de cluster 37, uma família bacteriana de cluster 38, uma família bacteriana de cluster 39, uma família bacteriana de cluster 40, uma família bacteriana de cluster 41, uma família bacteriana de cluster 42, uma família bacteriana de cluster 43, uma família bacteriana de cluster 44, uma família bacteriana de cluster 45, uma família bacteriana de cluster 46, uma família bacteriana de cluster 47, uma família bacteriana de cluster 48, uma família bacteriana de cluster 49, uma família bacteriana de cluster 50, uma família bacteriana de cluster 51, uma família bacteriana de cluster 52, uma família bacteriana de cluster 53, uma família bacteriana de cluster 54, uma família bacteriana de cluster 55, uma família bacteriana de cluster 56, uma família bacteriana de cluster 57, família bacteriana de cluster 58, uma família bacteriana de cluster 59, uma família bacteriana de cluster 60, uma família bacteriana de cluster 61, uma família bacteriana de cluster 62, uma família bacteriana de cluster 63, uma família bacteriana de cluster 64, uma família bacteriana de cluster 65, uma família bacteriana de cluster 66, uma família bacteriana de cluster 67, uma família bacteriana de cluster 67, uma família bacteriana de cluster 68, uma família bacteriana de cluster 69, uma família bacteriana de cluster 70, uma família bacteriana de cluster 71, uma família bacteriana de cluster 72, uma família bacteriana de cluster 73, uma família bacteriana de cluster 74, uma família bacteriana de cluster 75, uma família bacteriana de cluster 76, uma família bacteriana de cluster 77 ou uma família bacteriana de cluster 78.
[0245] Em algumas modalidades, uma proteína Cas9 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% , ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos Cas9 descrita em Chylinski et al. RNA Biology 2013 10:5, 727 a 737; Hou et al. ,/PNAS Early Edition 2013, 1-6).
[0246] Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas compreende uma ou mais das seguintes atividades: a) uma atividade de nickase,isto é, a capacidade de clivar uma fita simples, por exemplo, a fita não complementar ou a fita complementar de uma molécula de ácido nucleico; b) uma atividade de nuclease de fita dupla, isto é, a capacidade de clivar as duas fitas de um ácido nucleico de fita dupla e criar uma quebra de fita dupla, que em uma modalidade é a presença de duas atividades de nickase; Cc) uma atividade de endonuclease; d) uma atividade de exonuclease; e/ou e) uma atividade de helicase, isto é, a capacidade de desenrolar a estrutura helicoidal de um ácido nucleico de fita dupla.
[0247] Em algumas modalidades, o Cas9 é uma proteína Cas9 ou ortólogo de tipo selvagem (WT). O WT Cas9 compreende dois domínios cataliticamente ativos (HNH e RuvC). A ligação do WT Cas9 ao DNA com base na especificidade do gRNA resulta em quebras de DNA de fita dupla que podem ser reparadas por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR). Em algumas modalidades, Cas9 é fundido a proteínas heterólogas que recrutam proteínas sinalizadoras de dano ao DNA, exonucleases ou fosfatases para aumentar ainda mais a probabilidade ou a taxa de reparo da sequência-alvo por um mecanismo de reparo ou outro. Em algumas modalidades, um WT Cas9 é coexpresso com um modelo de reparo de ácido nucleico para facilitar a incorporação de uma sequência de ácido nucleico exógena por reparo direcionado à homologia.
[0248] Em algumas modalidades, diferentes proteínas Cas9 (ou seja, proteínas Cas9 de várias espécies) podem ser vantajosas para uso nos vários métodos fornecidos, a fim de capitalizar várias características enzimáticas das diferentes proteínas Cas9 (por exemplo, para diferentes preferências de sequência de PAM; uma atividade enzimática aumentada ou diminuída; para um nível aumentado ou diminuído de toxicidade celular; para alterar o equilíbrio entre NHEJ, reparo direcionado à homologia, quebras de fita simples, quebras de fita dupla, etc.).
[0249] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. pyogenes e reconhece o motivo de sequência PAM NGG, NAG, NGA (Mali et al, Science 2013; 339 (6121): 823-826). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. thermophiles e reconhece o motivo da sequência PAM NGGNG e/ou NNAGAAW (W = A ou T) (Vide, por exemplo, Horvath et al, Science, 2010; 327 (5962): 167-170 e Deveau et al., J.
BACTERIOL 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. mutans e reconhece o motivo da sequência PAM NGG e/ou NAAR (R = A ou G) (vide, por exemplo, Deveau et al., J.
BACTERIOL 2008; 190 (4): 1390-1400). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. aureus e reconhece o motivo de sequência PAM NNGRR (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. aureus e reconhece o motivo da sequência PAM N GRRT (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de S. aureus e reconhece o motivo da sequência PAM N GRRV (R = A ou G). Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 derivada de N. meningitidis e reconhece o motivo da sequência PAM N GATT ou N GCTT (R= A ou G, V= A, G ou C) (Vide, por exemplo, Hou et ah, PNAS 2013, 1-6). Nas modalidades mencionadas acima, N pode ser qualquer resíduo de nucleotídeo, por exemplo, qualquer um de A, G, C ou T.
Em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas.
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 90% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Internacional PCT nº WO 2015/071474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma proteína Cas descrita na Publicação Internacional PCT nº WO 2015/07 1474 ou Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína Cas que é 100% idêntica à proteína Cas descrita na Publicação Internacional PCT nº WO 2015/071474 ou Chylinski et al. , RNA Biology 2013 10:5, 727-737.
i. CAS MUTANTS
[0250] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Cas são projetados para alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo Cas. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo Cas compreende propriedades enzimáticas alteradas, por exemplo, atividade alterada de nuclease (em comparação com uma molécula Cas de ocorrência natural ou outra referência) ou atividade alterada de helicase. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas modificado pode ter uma alteração que altera seu tamanho, por exemplo, uma supressão da sequência de aminoácidos que reduz seu tamanho sem efeito significativo em outra propriedade do polipeptídeo Cas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas manipulado compreende uma alteração que afeta o reconhecimento de PAM. Por exemplo, um polipeptídeo Cas modificado pode ser alterado para reconhecer uma sequência PAM diferente da sequência PAM reconhecida pela correspondente proteína Cas de tipo selvagem.
[0251] Os polipeptídeos Cas com propriedades desejadas podem ser feitos de várias maneiras, incluindo a alteração de um polipeptídeo Cas que ocorre naturalmente ou polipeptídeo Cas parental, para fornecer um polipeptídeo Cas mutante ou alterado com uma propriedade desejada. Por exemplo, uma ou mais mutações podem ser introduzidas na sequência de um polipeptídeo Cas parenteral (por exemplo, um polipeptíideo Cas que ocorre naturalmente ou que seja manipulado). Tais mutações e diferenças podem compreender substituições (por exemplo, substituições conservadoras ou substituições de aminoácidos não essenciais); inserções; ou supressões. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas mutante compreende uma ou mais mutações (por exemplo, pelo menos 1, 2,3, 4,5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 mutações) em relação a um polipeptídeo Cas parental.
[0252] Em uma modalidade, um polipeptídeo Cas mutante compreende uma propriedade de clivagem que difere de um polipeptídeco Cas que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o Cas é um mutante de Cas nickase. Os mutantes de cas nickase compreendem apenas um domínio cataliticamente ativo (o domínio HNH ou o domínio RuvC). Os mutantes da Cas nickase retêm a ligação do DNA com base na especificidade do gRNA, mas são capazes de cortar apenas uma fita de DNA, resultando em uma quebra de fita única (por exemplo, um "nick"). Em algumas modalidades, dois mutantes complementares de Cas nickase (por exemplo, um mutante de Cas nickase com um domínio RuvC inativado e um mutante de Cas nickase com um domínio HNH inativado) são expressos na mesma célula com dois gRNAs correspondentes a duas respectivas sequências-alvo; uma sequência-alvo na cadeia de DNA dos sentidos e uma na cadeia de DNA anti-sentido. Esse sistema de dupla nickase resulta em quebras de cadeia dupla escalonadas e pode aumentar a especificidade-alvo, pois é improvável que dois "nicks" fora da alvo sejam gerados perto o suficiente para gerar uma quebra de cadeia dupla. Em algumas modalidades, um mutante de Cas nickase é coexpresso com um modelo de reparo de ácido nucleico para facilitar a incorporação de uma sequência de ácido nucleico exógena por reparo direcionado à homologia.
[0253] Em algumas modalidades, os polipeptídeos Cas aqui descritos podem ser manipulados para alterar a especificidade de PAM do polipeptídeo Cas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo Cas mutante tem uma especificidade de PAM que é diferente da especificidade de PAM do polipeptídeo Cas parental. Por exemplo, uma proteína Cas de ocorrência natural pode ser modificada para alterar a sequência de PAM que o polipeptídeo mutante de Cas reconhece para diminuir os locais-alvo, melhorar a especificidade ou eliminar um requisito de reconhecimento de PAM. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode ser modificada para aumentar o comprimento da sequência de reconhecimento de PAM. Em algumas modalidades, o comprimento da sequência de reconhecimento de PAM é de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 aminoácidos de comprimento. Os polipeptídeos Cas que reconhecem diferentes sequências de PAM e/ou têm atividade fora do alvo reduzida podem ser gerados usando evolução direcionada. Métodos e sistemas exemplares que podem ser usadoss para evolução dirigida de polipeptídeos Cas são descritos, por exemplo, em Esvelt et al. Nature 2011, 472 (7344): 499-503.
[0254] Exemplos de mutantes de Cas são descritos na Publicação Internacional PCT nº WO 2015/161276, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade.
2. GRNAS
[0255] A presente divulgação fornece RNAs guia (gRNAs) que direcionam um polipeptídeo modificador direcionado ao local para uma sequência de DNA-alvo específica. Un gRNA compreende um segmento de DNA-alvo e um segmento de ligação à proteínas. O segmento de DNA-alvo de um gRNA compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência na sequência de DNA alvo. Como tal, o segmento de DNA-alvo de um gRNA interage com um DNA- alvo de uma maneira específica de sequência por hibridação (isto é, emparelhamento de bases), e a sequência nucleotídica do segmento de DNA-alvo determina a localização no DNA-alvo na qual o RNAm se ligará. O segmento de DNA-alvo de um gRNA pode ser modificado (por exemplo, por manipulação genética) para hibridar com qualquer sequência desejada dentro de uma sequência de DNA-alvo.
[0256] O segmento de ligação às proteínas de um RNA quia interage com um polipeptídeo modificador direcionado ao local (por exemplo, uma proteína Cas9) para formar um complexo. O RNA guia guia o polipeptídeo ligado a uma sequência nucleotídica específica dentro do DNA-alvo através do segmento de DNA-alvo descrito acima. O segmento de ligação às proteínas de um RNA guia compreende dois trechos de nucleotídeos que são complementares entre si e que formam um duplex de RNA de fita dupla.
[0257] Em algumas modalidades, um gRNA compreende duas moléculas de
RNA separadas. Em tais modalidades, cada uma das duas moléculas de RNA compreende um trecho de nucleotídeos que são complementares entre si, de modo que os nucleotídeos complementares das duas moléculas de RNA hibridizam para formar o duplex de RNA de fita dupla do segmento de ligação à proteína. Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma molécula de RNA simples (S9RNA).
[0258] A especificidade de um gRNA para loci alvos é mediada pela sequência do segmento de ligação ao DNA, que compreende cerca de 20 nucleotídeos que são complementares a uma sequência de DNA-alvo dentro do locus alvo. Em algumas modalidades, a sequência de DNA-alvo correspondente tem aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA da presente invenção são pelo menos 90% complementares a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA da presente invenção são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementares a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo. Em algumas modalidades, os segment os de ligação ao DNA das sequências de gRNA da presente invenção são 100% complementares a uma sequência de DNA alvo dentro de um locus alvo.
[0259] Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA-alvo que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de DNA-alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de DNA- alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA se ligam a uma sequência de DNA alvo que é 100% idêntica a uma sequência de DNA alvo dentro de um locus alvo de um gene alvo selecionado daqueles listados na Tabela 1.
[0260] Em algumas modalidades, os segmentos de ligação ao DNA das sequências de gRNA aqui descritas são projetados para minimizar a ligação fora do alvo usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, localizador Cas-OFF) para identificar sequências-alvo que são exclusivas de um locus alvo específico ou gene alvo.
[0261] Em algumas modalidades, os gRNAs aqui descritos podem compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados que introduzem estabilidade em relação para as nucleases. Em tais modalidades, esses gRNAs modificados podem desencadear uma imunidade inata reduzida em comparação com um gRNA não modificado. O termo "resposta imune inata" inclui uma resposta celular a ácidos nucleicos exógenos, incluindo ácidos nucleicos de cadeia simples, geralmente de origem viral ou bacteriana, que envolvem a indução da expressão e liberação de citocinas, particularmente os interferons, e a morte celular. Em algumas modalidades, os gRNAs aqui descritos são modificados na extremidade 5' ou próximos a ela (por exemplo, dentro de 1 a 10, 1 a 5 ou 1 a 2 nucleotídeos da extremidade 5'). Em algumas modalidades, a extremidade 5' de um gRNA é modificada pela inclusão de uma estrutura cap de mMRNA eucariótica ou de um análogo de cap (por exemplo, um análogo de cap G(5 ')ppp(5 ')G, um análogo da cap m7G(5 ')ppp(5 ')G ou um análogo de cap anti-reverso (ARCA) 3 '-0-Me-m7G(5 )PPp(5 ')G). Em algumas modalidades, um gRNA transcrito in vitro é modificado por tratamento com uma fosfatase (por exemplo, fosfatase alcalina intestinal da bezerro) para remover o grupo trifosfato 5'. Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma modificação na extremidade 3' ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 1 a 10, 1a5ou1a2 nucleotídeos da extremidade 3'). Por exemplo, em algumas modalidades, a extremidade 3' de um RNAm é modificada pela adição de um ou mais (por exemplo, 25 a 200) resíduos de adenina (A).
[0262] Em algumas modalidades, nucleosídeos modificados e nucleotídeos modificados podem estar presentes em um gRNA, mas também podem estar presentes em outros sistemas de regulação de genes, por exemplo, sistemas à base de mRNA, RNAi ou siRNA. Em algumas modalidades, nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir um ou mais de: a) alteração, por exemplo, substituição, de um ou ambos os oxigênios de fosfato não-ligados e/ ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação na ligação do backbone de fosfodiéster; b) alteração, por exemplo , substituição, de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, do hidroxil 2' no açúcar ribose; c) substituição por atacado da fração fosfato por ligantes "defosfo"; d) modificação ou substituição de uma nucleobase de ocorrência natural; e) substituição ou modificação do backbone de ribose-fosfato; f) modificação da extremidade 3' ou da extremidade 5' do oligonucleotídeo, por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma porção; e 9) modificação do açúcar.
[0263] Em algumas modalidades, as modificações listadas acima podem ser combinadas para fornecer nucleosídeos e nucleotídeos modificados que podem ter duas, três, quatro ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase modificada. Em algumas modalidades, cada base de um gRNA é modificada. Em algumas modalidades, cada um dos grupos fosfato de uma molécula de gRNA é substituído por grupos fosforotioato. Em algumas modalidades, uma ferramenta de software pode ser usada para otimizar a escolha do gRNA dentro da sequência-alvo do usuário,por exemplo, para minimizar a atividade total fora do alvo em todo o genoma. A atividade fora do alvo pode ser diferente de clivagem. Por exemplo, para cada escolha possível de gRNA usando S. pyogenes Cas9, as ferramentas de software podem identificar todas as possíveis sequências fora do alvo (precedendo os NAM ou NGG PAMs) no genoma que contêm até um determinado número (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de pares de bases incompatíveis. A eficiência da clivagem em cada sequência fora do alvo pode ser prevista, por exemplo, usando um esquema de ponderação derivado experimentalmente. Cada possível gRNA pode então ser classificado de acordo com sua clivagem total prevista fora do alvo; os gRNAs mais bem classificados representam aqueles com maior probabilidade de apresentar maior clivagem no alvo e menos fora do alvo. Outras funções, por exemplo, projeto automatizado de reagente para construção de vetor gRNA, projeto de primer para o ensaio Surveyor no alvo e projeto de primer para detecção de alto rendimento e quantificação da clivagem fora do alvo via sequenciamento de próxima geração, também podem ser incluídos na ferramenta.
[0264] A invenção é ainda descrita nos seguintes Exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
AVALIAÇÃO DE VARIANTES DE TRANSGENE DE PARKIN
[0265] Uma série de vetores plasmídicos foi gerada para avaliar a expressão de variantes do transgene de Parkin. O cassete de expressão (Figura 1) continha, na ordem de 5' a 3', um intensificador/promotor inicial imediato de CMV (IE) e 5' UTR, um transgene de Parkin 2A ligado à proteína de fluorescência verde aprimorada (eGFP), uma sequência de poliadenilação de 3' UTR e globina de coelho (poliA). Para o transgene de Parkin, foi testada a sequência de tipo selvagem de PRKN humano (WT) ou uma das quatro variantes otimizadas por códon (CO1 a CO4). As sequências dos transgenes de Parkin de tipo selvagem e otimizados por códon são fornecidas nas SEQ ID NOs: 27, 35, 36, 37 e 38.
[0266] Uma consideração no projeto de CO1 a CO4 otimizado por códon foi o número de locais de CpG. As ilhas CpG são regiões do DNA onde um nucleotídeo de citosina é seguido por um nucleotídeo de guanina na sequência linear de bases ao longo de sua direção 5'—3'. As ilhas CpG (que são tipicamente definidas como uma sequência polinucleotídica de pelo menos 200 pb, uma porcentagem de GC maior do que 50% e uma proporção de CpG observada para o esperado maior do que 60%) são conhecidas por estar associadas à imunogenicidade do vetor. Portanto, esperava-se que a diminuição do número de locais CpG melhorasse o desempenho do vetor diminuindo a imunogenicidade. O número de locais CpG (5'- C-G-3') em cada variante de códon de Parkin é apresentado na Tabela 9.
TABELA 9: LOCAIS CPG EM VARIANTES EXEMPLARES DE CÓDON DE
PARKIN "
[0267] Células SH-SY5Y. Uma linha celular de neuroblastoma humano, SH- SY5Y, foi usada para avaliar a expressão genética em células da linhagem neuronal. As células SH-SY5Y foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço. Após 24 horas, as células foram transfectadas com 0,10 ug de plasmídeo WT, CO1, CO2 ou CO3 complexado com 4 upL de Fugene HD por ug de plasmídeo. As células foram cultivadas por mais 48 horas e depois analisadas quanto à expressão de eGFP por microscopia de fluorescência.
[0268] Micrografias representativas são mostradas nas Figuras 2A a 2J. Os controles foram células não transferidas como controle negativo (Figura 2A ) e um plasmídeo conhecido como controle positivo ( Figura 2B). Os cassetes de expressão foram testados em duplicado: WT (Figuras 2C a 2D ), CO1 (Figuras 2E a 2F), CO2 (Figuras 2G a 2H ) e CO3 (Figuras 2| a 2J). A porcentagem de células GFP e a intensidade de fluorescência das células GFP são plotadas na Figura 2H e Figura 2K, respectivamente. O lisado celular foi coletado sete dias após a transfecção e analisado por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para Parkin, como mostrado na Figura 3. Essas experiências demonstraram que o CO1 ao CO3 não aumentou a expressão de Parkin e, de fato, diminuiu a porcentagem de células que expressavam Parkin e o nível geral da expressão de Parkin.
[0269] A variante de códon CO4 foi então testada contra WT e CO1. Micrografias de fluorescência de células SH-SY5Y para controle negativo não transferido (Figura 4A), WT (Figura 4B), CO1 (Figura 4C) ou CO4 (Figura 4D) são mostrados e os resultados foram quantificados para a porcentagem de GFP+ (Figura 4E) e intensidade (Figura 4F). Os lisados celulares foram analisados quanto à expressão de Parkin por ELISA (Figura 5). Nas células SH-SY5Y, a expressão de CO4 foi semelhante a WT e CO1.
[0270] Células precursoras dopaminérgicas knockout de Parkin, derivadas da iPSC. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) derivadas de células precursoras dopaminérgicas de knockout de Parkin foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células por poço. Após 7 dias, as células foram transfectadas com 0,15 ug de plasmídeo WT, CO1 e CO4 complexado com 4 ul de ViaFect por ug de plasmídeo). A expressão do transgene foi avaliada 7 dias após a transfecção em poços não transfectados (Figura
6A), WT (Figura 6B), CO1 (Figura 6C) ou COA4 (Figura 6D) poços. Como mostrado na Figura 6E, os três transgenes (WT, CO1 e CO4) resultaram em porcentagens semelhantes de células GFP, mas, surpreendentemente, o CO4 causou um aumento de 20% na intensidade de GFP em comparação com o WT.
EXEMPLO 2
SELEÇÃO DE CASSETE PARA EXPRESSÃO DE TRANSGENE DE PARKIN CO4
[0271] Para avaliar outros elementos reguladores, uma variedade de cassetes de expressão AAV foram construídos na forma de plasmídeos de transferência para uso em um sistema de empacotamento AAV sem auxiliar. Os cassetes de expressão AAV (Figura 7) continham, na ordem 5 'a 3', o ITR de 5' do AAV2, o intensifcador de CMV (Enh) ou nenhum intensificador, um promotor selecionado da Tabela 5, uma região não traduzida (UTR) 5' selecionada da Tabela 6, o variante de transgene de Parkin CO4 (SEQ ID NO: 38), uma região não traduzida em 3' selecionada naTabela 7, uma sequência de poliadenilação (poliA) selecionada na Tabela 8 e a ITR 3' de AAV2. Um diagrama de cassete e vários elementos são fornecidos na Figura 8. Para detecção da expressão do transgene em testes in vitro, uma sequência polinucleotídica (SEQ ID NO: 80) codificando uma etiqueta FLAG/HA do terminal N (SEQ ID NO: 81) foi inserida após o códon de início no transgene de Parkin em cada uma das sequências listadas na Tabela 10.
[0272] Células SH-SY5Y. As células SH-SY5Y foram cultivadas em placas de 24 poços a uma densidade de semeadura de 50.000 células por poço. Após 24 horas, as células foram transfectadas com 0,75 ug de plasmídeo complexado com 4 upL de Fugene6 por ug de plasmídeo. As células foram cultivadas por mais 48 horas, e a expressão de Parkin foi testada através da realização de um ELISA em lisados celulares com um anticorpo primário anti-Parkin. Os resultados para cada construção são mostrados na Tabela 10 e representados graficamente na Figura 9.
Notavelmente, a expressão da proteína foi menor com os promotores neuroespecíficos (Syn e CaMKlla). TABELA 10. EXPRESSÃO DE PARKIN EM CÉLULAS SH-SY5Y (MÉDIA DE
REPLICATAS Número | Promotor/S'UTR/3'UTR /poliA Cassete — de | Parkin Pg expressão por ug de SEQIDNO: | proteína total Oc Bt le jneaRavinaener la 1 | Hs [8 fcavamerenpaenEs la 6 = | e [emvrecemeneRrenpaents Jar —jaso — | 1 CMV/TPL- 49 365 eMPL/R2V17/3'UTR(globina)/pAGH- Bt
Número | Promotor/S'UTR/3'UTR /poliA Cassete — de | Parkin Pg expressão por ug de SEQ ID NO: proteína total ode = Hs Hs
[0273] Células precursoras dopaminérgicas knockout para Parkin, derivadas de iPSC. As células precursoras dopaminérgicas knockout para Parkin, derivadas da iPSC, foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de semeadura de
10.000 células por poço. Após 15 dias, as células foram transfectadas com 0,15 ug de plasmídeo complexado com 4 uL de ViaFect por ug de plasmídeo). A expressão de parkin foi testada 2 dias depois, realizando um ELISA em lisados celulares com um anticorpo primário anti-Parkin'n Os resultados para cada construção são mostrados na Tabela 11 e representados graficamente na Figura 10 (três réplicas mostradas para cada construção). TABELA 11. EXPRESSÃO DE PARKIN EM CÉLULAS DERIVADAS DE IPSC (MÉDIA DE REPLICADAS Número | Promotor/S'UTR/3'UTR /poliA Cassete — de | Média de expressão Parkin Pg SEQ ID NO: por proteína total ug
Número | Promotor/S'UTR/3'UTR /poliA Cassete — de | Média de expressão Parkin Pg SEQ ID NO: por proteína total ug Hs 186 jesvamerençaenEs — a = 2 | le jemvrrecemenveremepaents lar [az = | E CMV/TPL- 49 35,5 eMPL/R2V17/3UTR(globina)/pAGH- Bt Hs Hs
[0274] Para microscopia de fluorescência, as células transfectadas foram fixadas 8 dias após a transfecção, coradas e fotografadas em campo claro (Figura 11A e Figura 12A), ou por imunofluorescência para Parkin (Figura 11B e Figura 12B), marcador neuronal NeuN (Figura 11C e Figura 12C) ou marcador de astrócitos GFAP (Figura 11D e Figura 12D). As Figuras 12A a 12D mostram imagens ampliadas dasFiguras 11A a 11D. EXEMPLO 3 TESTES CLÍNICOS E /N VIVO DA TERAPIA GENÉTICA DE PARKIN AAV
[0275] Os vetores AAV são gerados por empacotamento de genomas de vetores AAV das construções 1 a 20 no Exemplo 2, em particular as construções 1,
7, 11 é 15 da Tabela 11. O teste é realizado em ratos e uma ou mais construções são selecionadas para teste em primatas não humanos (NHPs). São realizados estudos de localização de doses e uma dose inicial para ensaios clínicos é determinada pela medição da expressão e toxicidade de proteínas observadas.
[0276] Os ensaios clínicos são realizados em pacientes identificados com mutações recessivas no gene PRKN (também conhecido como PRK2). A expressão de proteínas e a toxicidade observada são usadas para determinar uma dose ideal. A eficácia é avaliada usando melhorias na Escala de Classificação de Doenças de Parkinson Unificada (UPDRS).
EXEMPLO 4 TESTE /N VITRO
[0277] Cassetes recombinantes são testados em uma linha celular de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). (VideJiang et al. Extracellular dopamine induces the oxidative toxicity of SH-SY5Y cells. Synapse. Novembro de 2008; 62 (11):797-
803. doi: 10.1002/syn.20554.) Os genes de interesse testados são uma proteína de Parkinson 2 funcional, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), um gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2(LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes.
[0278] Cada linha celular é tratada com um vetor de terapia genética recombinante para cada gene de interesse. A expressão do gene de interesse é aumentada. A função do gene de interesse é melhorada. Em alguns casos, é observada uma melhora na mitofagia, toxicidade celular reduzida e/ou estresse oxidativo reduzido.
EXEMPLO 5 TESTE /N VIVO
[0279] Um roedor ou primata não humano com uma combinação de uma ou mais mutações conhecidas em um gene de interesse é tratado com um vetor de terapia genética recombinante para esse gene de interesse. Os genes de interesse testados são uma proteína de Parkinson 2 funcional, gene de proteína ubiquitina ligase ES(PARK2), um gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2(LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto- oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA)
[0280] O paciente do teste possui um ou mais das seguintes características: Perda de dopamina (DA), perda celular 220%, discinesia, corpos de Lewy, indicações de disfunção mitocondria, ROS, inflamação, outros déficits comportamentais locomotores e sintomas neurodegenerativos.
[0281] Os animais nos quais os métodos da presente divulgação são testados incluem animais não doentes e doentes e animais transportadores de mutações e não transportadores. Modelos animais e leituras ilustrativas de comportamento motor nas quais os métodos da presente divulgação são testados são fornecidos na Tabela 12.
TABELA 12 CE] eme mae Camundongo MPTP Locomoção reduzida, bradicinesia toxinas eo ço Macacos MPTP alterado, tremor e rigidez
[ ] Modelo animal Comportamento motor Locomoção reduzida, comportamento Rato 6-O0HDA alterado Lo Rena | Locomoção reduzida = | |] Peraquauveneo Lo] venvoma Mutações Comportamento alterado, atividade a-Sinucleína genéticas motora reduzida ou aumentada | ] LRKK2 Alteração comportamental leve Sem alterações óbvias ou locomoção PINK1 reduzida Sem alterações óbvias ou locomoção
PARKIN reduzida Camundongos mutados Sem alterações óbvias ou locomoção com PRKN Éxon3 reduzida Sem alterações óbvias ou locomoção Ratos knockout para PRKN reduzida Lo mo | Atvidade locomotora diminuída Déficits sensório-motores de ATP13A2 aparecimento tardio
E A REA Po engates | mi] Pitx3 Locomoção reduzida | mi] c-Rel-NFKB Marcha, bradicinesia, rigidez Locomoção, tremor e rigidez MitoPark reduzidos
TO E Atg7 tardio Cm EE. VMAT2 comportamento alterado
[0282] O paciente do teste apresenta melhorias em qualquer uma das leituras de comportamento motor ou em uma ou mais das seguintes características: Ganho de DA no estriado, ganho de células nigrais, redução de corpos libertos, déficits comportamentais ou outros déficits locomotores melhorados, função mitocondrial aprimorada, marcadores inflamatórios reduzidos, vida útil melhorada.
EXEMPLO 6
TESTE CLÍNICO
[0283] O diagnóstico de tipo parkin da doença de Parkinson de aparecimento precoce é considerado principalmente em indivíduos com parkinsonismo de aparecimento precoce (idade <40 anos), principalmente se houver suspeita de herança autossômica recessiva. PRKN (anteriormente denominado PARK2), o gene que codifica a proteína parkin, é o principal gene no qual as variantes patogênicas são conhecidas por causar o tipo parkin da doença de Parkinson de aparecimento precoce. O diagnóstico de tipo parkin da doença de Parkinson de aparecimento precoce só pode ser confirmado quando variantes patogênicas são identificadas nos dois alelos de PRKN (ou seja, o indivíduo é homozigoto para o mesmo alelo patogênico ou composto heterozigótico para dois alelos patogênicos diferentes). À frequência de detecção de variantes varia de acordo com o histórico familiar e a idade de aparecimento.
[0284] Outros mutantes relacionados à doença de Parkinson são fornecidos na Tabela 13.
TABELA 13
Modo de Mutações no Gene Mutações Humanas herança modelo de rato a- E46K humano A53T, A5SSE, ASOP, H500, Sinucleina(PRK Dominante expresso via E46K, G51D 1 transgênico BAC G20198S humano expresso via N1437H, R1441C/G/H, transgênico BAC; LRRK2 (PRK8) Dominante Y1699C, G20198, 12020T R1441C humano expresso via transgênico BAC Supressões, inserções, mudança de armação, mutações missense e Supressão de 5 pb Parkin (PRK2) | nonsense em todos os éxons; | Recessivo no éxon 4 supressões e duplicações de 1 ou mais éxons são mutações mais comuns Mutações missense e nonsense Q21X, G440E, Q456X, Q1290fxX157, Supressão de 26 pb PINK1 (PRK6) Recessivo WA437X, A271D, G309D, no éxon 4 supressões ou duplicações de éxons L166P, D149A, R98Q, Supressão de 9 pb DJ-1 (PRK7) supressões do éxon ou Recessivo | e inserção de 1 pb alterações no local da emenda no éxon 5
[0285] Os pacientes humanos com uma ou mais mutações associadas à Doença de Parkinson são tratados com vetores de terapia genética recombinante que codificam variantes de tipo selvagem ou funcionais do gene mutado. Os pacientes apresentam melhora em qualquer uma das leituras de comportamento motor listadas na Tabela 12, ou em qualquer uma das seguintes características: aumento da dopamina no cérebro, especialmente a substância negra, aumento do número de neurônios dopaminérgicos, aumento da expressão de genes de interesse, incluindo PRKN, ou melhoria na escala unificada de classificação de doenças de Parkinson (UPDRS).
[0286] Todas as patentes americanas acima, publicações de pedidos de patentes nos EUA, pedidos de patentes nos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não relacionadas a patentes referidas neste relatório descritivo e/ou listadas na Folha de Dados do Pedido, são incorporadas aqui por referência, em suas totalidade.
[0287] A presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas, sem se afastar de suas estruturas, métodos ou outras características essenciais, como aqui amplamente descrito e reivindicado a seguir. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas, e não pela descrição anterior. Todas as alterações que se enquadram no significado e na faixade equivalência das reivindicações devem ser adotadas dentro de seu escopo.

Claims (131)

REIVINDICAÇÕES
1.Vetor de terapia genética recombinante CARACTERIZADO por compreender um cassete de expressão que compreende um transgene que codifica uma proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), uma proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), uma quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), alfa-sinucleína (SNCA), um Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), uma enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou uma glucocerebrosidase (GBA)em que o polinucleotídeo do transgene está operacionalmente ligado a uma sequência promotora eucarioticamente ativa.
2. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo transgene codificar o PARK2, e a sequência polinucleotídica de transgene compartilhar pelo menos 95% de identidade com uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
3. Vetor, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pela sequência promotora ser selecionada da Tabela 5.
4. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compreender ainda um intensificador de CMV.
5. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 4, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compreender ainda uma região não traduzida 5' (UTR) selecionada da Tabela 6.
6. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compreender ainda uma região não traduzida 3' selecionada da Tabela 7.
7. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compreender ainda uma sequência de poliadenilação (poliA) selecionada da Tabela 8.
8. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo transgene ser otimizado por códon.
9. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compartilhar pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 58.
10. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo cassete de expressão compreender na ordem 5' a 3': promotor HuBA, o transgene, WPRE(x) e pAGlobin-Oc; promotor CMV, intensificador de TPL-eMLP, o transgene, WPRE(r) e PAGIlobin-Oc; promotor Syn, o transgene, WPRE(r), 3'UTR (globina) e pAGH-Bt; promotor CBA, o transgene e pAGH-Bt; promotor EF1, o transgene e pAGlobin-Oc; promotor HuBA, o transgene, R2V17 e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, WPRE(x), 3 UTR (globina) e pAGH-Hs; promotor CaMKlla, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor CMV, intensificador de TPL-eMLP 5', o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor HuBA, o transgene e pAGH-Hs; promotor CMV e TPL, eMPL, o transgene, R2V17, 3UTR(globina) e pAGH- Bt; promotor EF1, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, R2V17 e pAGIobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGIobin-Oc; promotor CBA, o transgene, WPRE(x), 3 UTR(globina) e pAGH-Hs; promotor CBA, o transgene, 3'UTR(globina) e pAGIlobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2V17 e pAGH-Bt;
promotor EF1, o transgene, R2V17, 3UTR(globina) e pAGH-Hs; promotor CMV, o transgene, R2QV17, 3 UTR(globina) e pPAGH-Hs; ou promotor CMV, o transgene e pAGH-Hs, opcionalmente, em que o transgene codifica PARK2.
11. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo vetor ser um vetor vírus adeno-associado (AAV).
12. Vetor, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo vetor compreender duas repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão.
13. Vetor, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo AAV ter o sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAVrh74.
14. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um AAV autocomplementar ou um AAV de cadeia simples.
15. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, CARACTERIZADO pelo AAV ser um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado.
16. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, CARACTERIZADO pelo AAV compreender uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
17. Célula hospedeira, CARACTERIZADA por compreender o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico CARACTERIZADO por compreender uma mutação em um gene associado a uma doença de Parkinson (DP), compreendendo: colocar o neurônio em contato com o vetor de terapia genética recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16;
em que após o contato com o vetor de terapia genética recombinante, o neurônio expressa o PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA, opcionalmente em que o neurônio compreende uma mutação em um gene PARK?2 e em que o cassete de expressão codifica PARK2.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreende uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade reduzida de monoamina oxidases após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, CARACTERIZADO pelo neurônio produzir e/ou liberar uma quantidade aumentada de dopamina após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, CARACTERIZADO pelo neurônio sofrer mitofagia aumentada após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade inferior de monoamina oxidases em comparação com uma quantidade de monoamina oxidases expressa em um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade inferior é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% inferior à quantidade expressa no neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, CARACTERIZADO pelo neurônio produzir e/ou liberar uma quantidade aumentada de dopamina em comparação com uma quantidade de dopamina produzida e/ou liberada por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade produzida e/ou liberada pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, CARACTERIZADO pelo neurônio sofrer uma quantidade aumentada de autofagia em comparação com uma quantidade de autofagia sofrida por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade sofrida pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, CARACTERIZADO pelo neurônio ser um neurônio positivo para tirosina hidroxilase primária.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, CARACTERIZADO pelo neurônio ser produzido a partir de uma célula-tronco pluripotente induzida preparada a partir de células obtidas de um paciente diagnosticado com doença de Parkinson.
28. Método para tratar ou inibir o aparecimento de uma doença de Parkinson (DP) em um paciente que sofre de ou está em risco de DP, CARACTERIZADO por compreender: administrar o vetor de qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ao paciente; em que a administração do vetor de terapia genética recombinante trata ou inibe o aparecimento da doença de Parkinson no paciente.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pela DP ser uma DP de aparecimento precoce, opcionalmente uma DP autossômica recessiva de aparecimento precoce.
30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo paciente compreender uma mutação em um gene PARK2.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo PARK2 compreender a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 1.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender administração sistêmica, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção intratecal com inclinação de Thredelenberg.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção direta na porção compacta da substância negra do cérebro.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender a introdução do vetor de terapia genética recombinante no cérebro ou no líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao paciente.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao cérebro do paciente.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10*º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao LCR do paciente.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, CARACTERIZADO por 1x107 - 1x10º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao paciente.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 40, CARACTERIZADO pelo paciente ser um adulto.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 40, CARACTERIZADO pelo paciente ser uma criança.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 42,
CARACTERIZADO pelo número de neurônios dopaminérgicos no paciente após a etapa de administração ser maior do que o número de neurônios dopaminérgicos no paciente antes da etapa de administração.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 43, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina no paciente após a etapa de administração ser maior do que o nível de dopamina no paciente antes da etapa de administração.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 44, CARACTERIZADO pelo número de neurônios dopaminérgicos em um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente não tratado.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 45, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de dopamina em um paciente não tratado.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 46, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina na substância negra de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de dopamina na substância negra de um paciente não tratado.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 47, CARACTERIZADO pelo nível de PRKN no LCR do paciente após a etapa de administração ser maior do que o nível de PRKN no LCR do paciente antes da etapa de administração.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 48, CARACTERIZADO pela pontuação de Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson (UPDRS) do paciente antes da etapa de administração melhorar em comparação com a pontuação de UPDRS do paciente antes da etapa de administração.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 49, CARACTERIZADO pelo nível de PRKN no LCR de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de PRKN no LCR de um paciente não tratado.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 59, CARACTERIZADO pela pontuação de UPDRS de um paciente tratado pelo método melhorar em comparação com a pontuação de UPDRS de um paciente não tratado.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 51, CARACTERIZADO pelos neurônios do paciente expressarem uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreenderem uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
53. Método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico CARACTERIZADO por compreender uma mutação em um gene associado à Doença de Parkinson (DP), em que o gene mutado é: proteína de Parkinson 2, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa- sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), compreendendo: colocar o neurônio em contato com um vetor de terapia genética recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de tipo selvagem expressa por uma versão do tipo selvagem do gene mutado, ou seu fragmento funcional ou variante; em que após o contato com o vetor de terapia genética recombinante, o neurônio expressa a proteína de tipo selvagem ou seu fragmento funcional ou variante.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pela proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA de tipo selvagem compreender a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1a, respectivamente.
55. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo gene ser o gene PARK? e a proteína PARK2 de tipo selvagem compreender a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a
17.
56. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2, ou GBA estabelecida nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente.
57. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo gene ser o gene PARK?2 e o polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo isoforma PARK? estabelecida em qualquer um das SEQ ID NOs: 27 a34.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 57, CARACTERIZADO pelo polinucleotídeo ser otimizado por códon.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 58, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante ser um vírus adeno- associado recombinante (AAV).
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo AAV possui sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAVrh74.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou reivindicação 60,
CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um AAV autocomplementar.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um AAV de fita simples.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 62, CARACTERIZADO pelo AAV ser um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 63, CARACTERIZADO pelo AAV compreender uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 64, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um polinucleotídeo compreendendo na seguinte ordem 5' a 3': a. uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e b.a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante desta.
em que a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante desta, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 65, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender ainda um ou mais dentre: um promotor específico de neurônio, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em hSYN1 (sinapsina humana), INA (alfa-internexina), NES (nestina), TH (tirosina hidroxilase), FOXA2 (Forkhead box A2), CaMKII (proteína quinase || dependente de calmodulina), e promotores NSE (enolase específica dos neurônios);
um promotor ubíquo selecionado do grupo que consiste em CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-alfa, GAPDH, SV40, HBV e beta-actina de frango, promotores de beta-actina humana; um intensificador; um Ííntron; um sinal poli-A; uma sequência que codifica um peptídeo 2A; e um WPRE (elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite de marmota).
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 64, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade reduzida de alfa- sinucleína e/ou compreender uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia gênica recombinante.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 ou 67, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade reduzida de monoamina oxidases após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 68, CARACTERIZADO pelo neurônio produzir e/ou liberar uma quantidade aumentada de dopamina após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 69, CARACTERIZADO pelo neurônio sofre mitofagia aumentada após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 70, CARACTERIZADO pelo neurônio expressar uma quantidade inferior de monoamina oxidases em comparação com uma quantidade de monoamina oxidases expressa em um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade inferior é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% inferior à quantidade expressa no neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 71, CARACTERIZADO pelo neurônio produzir e/ou liberar uma quantidade aumentada de dopamina em comparação com uma quantidade de dopamina produzida e/ou liberada por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a referida quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade produzida e/ou liberada pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 72, CARACTERIZADO pelo neurônio sofrer uma quantidade aumentada de autofagia em comparação com uma quantidade de autofagia sofrida por um neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante, opcionalmente em que a quantidade aumentada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes ou pelo menos 10 vezes maior do que a quantidade sofrida pelo neurônio que não foi colocado em contato com o referido vetor de terapia genética recombinante.
74, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 73, CARACTERIZADO pelo neurônio ser um neurônio positivo para tirosina hidroxilase primária.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 74, CARACTERIZADO pelo neurônio ter sido produzido a partir de uma célula-tronco pluripotente induzida preparada a partir de células obtidas de um paciente diagnosticado com doença de Parkinson.
76. Vetor de terapia genética recombinante, CARACTERIZADO por compreender um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Parkinson 2 de tipo selvagem, um gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa- sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA)ou seu fragmento funcional ou variante; em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor eucarioticamente ativo; e em que um neurônio transduzido com o referido vetor de terapia genética recombinante expressa a proteína de tipo selvagem ou seu fragmento funcional ou variante.
77. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA de tipo selvagem compreende a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente.
78. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo gene ser o gene PARK?2 e a proteína PARK2 de tipo selvagem compreender a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a 17.
79. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2, ou GBA apresentada nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente.
80. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo gene ser o gene PARK2 e o polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo isoforma PARK?2 estabelecida em qualquer um das SEQ ID NOs: 27 a 34.
81. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo polinucleotídeo ser otimizado por códon.
82. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 81, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante ser um vírus adeno-associado recombinante (rAAV).
83. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo rAAV possuir o sorotipo AAV1I, AAV2, AAV5, AAVB8, AAV9, AAVrhi10 ou AAVrh74.
84. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 83, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um AAV autocomplementar ou um AAV de fita simples.
85. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 83, CARACTERIZADO pelo AAV ser um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado.
86. Vetor de terapia genética recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 85, CARACTERIZADO pelo AAV compreender uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
87. Método para tratar ou inibir o aparecimento de uma doença de Parkinson
(DP) em um paciente que sofre de ou está em risco de DP, CARACTERIZADO por compreender: administrar um vetor de terapia genética recombinante que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de Parkinson de tipo selvagem 2, proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), uma proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), uma quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), alfa-sinucleína (SNCA), um Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), uma enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou uma proteína glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes ao paciente; em que a administração do vetor de terapia genética recombinante trata ou inibe o aparecimento da doença de Parkinson no paciente.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, CARACTERIZADO pela DP ser uma DP de aparecimento precoce, opcionalmente uma DP autossômica recessiva de aparecimento precoce.
89. Método, de acordo com a reivindicação 87 ou reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo paciente compreender uma mutação no gene PARK2, gene PINK1, gene LRRK2, gene SCNA, gene c-Rel, gene ATG7, gene ATG7, VMAT2 ou gene GBA.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, CARACTERIZADO pela proteína PARK2, PINK1I, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT?2 ou GBA compreender a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NOs: 1 a 9, respectivamente.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, CARACTERIZADO pela sequência codificar o gene PARK? e a proteína PARK2 de tipo selvagem compreender a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 a 17.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, CARACTERIZADO pelo polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA estabelecida nas SEQ ID NOs: 18 a 26, respectivamente.
93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, CARACTERIZADO pela sequência codificar o gene PARK2 e o polinucleotídeo compreender uma sequência com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 95% ou 99% de identidade para uma sequência de polinucleotídeo PARK?2 isoforma estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 27 a 34.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 93, CARACTERIZADO pela sequência que codifica a proteína PARK2, PINK1, LRRK2, SCNA, c-Rel, ATG7, VMAT2 ou GBA ou fragmento funcional ou variante destas ser otimizada por códon, opcionalmente em que o sequência compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 a 38.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 94, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante ser um vírus adeno- associado recombinante (AAV).
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, CARACTERIZADO pelo AAV possuir sorotipo AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAVrh74.
97. Método, de acordo com a reivindicação 95 ou reivindicação 96, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um AAV autocomplementar ou um AAV de fita simples.
98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 95 a 97, CARACTERIZADO pelo AAV ser um AAV de tipo selvagem ou um AAV modificado.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 95 a 98, CARACTERIZADO pelo AAV compreender uma proteína de capsídeo com pelo menos 95% de identidade com a proteína de capsídeo VP1, VP2 ou VP3 de tipo selvagem.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 95 a 99, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender um polinucleotídeo que compreende na seguinte ordem 5º a 3": a. uma sequência promotora eucarioticamente ativa; e b.a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante desta; em que a sequência que codifica a proteína de tipo selvagem, ou fragmento funcional ou variante desta, está operacionalmente ligada à sequência promotora eucarioticamente ativa.
101. Método, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender ainda um ou mais dentre: um promotor específico de neurônio, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em hSYN1 (sinapsina humana), INA (alfa-internexina), NES (nestina), TH (tirosina hidroxilase), FOXA2 (Forkhead box A2), CaMKllI (proteína quinase || dependente de calmodulina), e promotores NSE (enolase específica dos neurônios); um promotor ubíquo selecionado do grupo que consiste em CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-alfa, GAPDH, SV40, HBV e beta-actina de frango, promotores de beta-actina humana; um intensificador; um Ííntron; um sinal poli-A; uma sequência que codifica um peptídeo 2A; e um WPRE (elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite de marmota).
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo vetor de terapia genética recombinante compreender na ordem 5' a 3': promotor HuBA, o transgene, WPRE(x) e pAGIobin-Oc; promotor CMV, intensificador de TPL-eMLP, o transgene, WPRE(r) e PAGIobin-Oc; promotor Syn, o transgene, WPRE(r), 3'UTR (globina) e pAGH-Bt; promotor CBA, o transgene e pAGH-Bt; promotor EF1, o transgene e pAGlobin-Oc; promotor HuBA, o transgene, R2V17 e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, WPRE(x), 3 UTR (globina) e pAGH-Hs; promotor CaMKlla, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Hs; promotor CMV, intensificador de TPL-eMLP, o transgene, WPRE(r) e pAGH- Hs; promotor HuBA, o transgene e pAGH-Hs; promotor CMV e TPL, eMPL, o transgene, R2V17, 3UTR(globina) e pAGH- Bt; promotor EF1, o transgene, WPRE(r) e pAGH-Bt; promotor Syn, o transgene, R2V17 e pAGIobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2QV17 e pAGIobin-Oc; promotor CBA, o transgene, WPRE(x), 3 UTR(globina) e pAGH-Hs; promotor CBA, o transgene, 3'UTR(globina) e pAGIobin-Oc; promotor CaMKlla, o transgene, R2V17 e pAGH-Bt; promotor EF1, o transgene, R2QV17, 3'UTR (globina) e pAGH-Hs ;.
promotor CMV, o transgene, R2QV17, 3 UTR(globina) e pAGH-Hs; ou promotor CMV, o transgene e pAGH-Hs, opcionalmente, em que o transgene codifica PARK2.
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 102, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender administração sistêmica, parenteral, intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipocampal, intraestriatal ou intracerebroventricular.
104. Método, de acordo com a reivindicação 103, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção intravenosa, cerebral, cerebrospinal, intratecal, intracisternal, intraputaminal, intra-hipococampal, intraestriatal! ou intracerebroventricular.
105. Método, de acordo com a reivindicação 103, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção intratecal com inclinação de Trendelenberg.
106. Método, de acordo com a reivindicação 103, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender injeção direta na porção compacta da substância negra do cérebro.
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 106, CARACTERIZADO pela etapa de administração compreender a introdução do vetor de terapia genética recombinante no cérebro ou no líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 107, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10** genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao paciente.
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 108, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10**º* genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao cérebro do paciente.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 108, CARACTERIZADO por 1x10º - 1x10*º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao LCR do paciente.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 110, CARACTERIZADO por 1x107 - 1x10º genomas de vetores por quilograma de massa corporal do paciente (vg/kg) do vetor de terapia genética serem administrados ao paciente.
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 111, CARACTERIZADO pelo paciente ser um adulto.
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 112, CARACTERIZADO pelo paciente ser uma criança.
114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 113, CARACTERIZADO pelo número de neurônios dopaminérgicos no paciente após a etapa de administração ser maior do que o número de neurônios dopaminérgicos no paciente antes da etapa de administração.
115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 114, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina no paciente após a etapa de administração ser maior do que o nível de dopamina no paciente antes da etapa de administração.
116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 115, CARACTERIZADO pelo número de neurônios dopaminérgicos em um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o número de neurônios dopaminérgicos em um paciente não tratado.
117. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 116, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de dopamina em um paciente não tratado.
118. Método, de acordo com a reivindicação 87 ou reivindicação 117, CARACTERIZADO pelo nível de dopamina na substância negra de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de dopamina na substância negra de um paciente não tratado.
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 118, CARACTERIZADO pelo nível de PRKN no LCR do paciente após a etapa de administração ser maior do que o nível de PRKN no LCR do paciente antes da etapa de administração.
120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 119, CARACTERIZADO pela pontuação da UPDRS (Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson) do paciente antes da etapa de administração melhorar em comparação com a pontuação UPDRS do paciente antes da etapa de administração.
121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 120, CARACTERIZADO pelo nível de PRKN no LCR de um paciente tratado pelo método aumentar em comparação com o nível de PRKN no LCR de um paciente não tratado.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 121, CARACTERIZADO pela pontuação UPDRS de um paciente tratado pelo método melhorar em comparação com a pontuação UPDRS de um paciente não tratado.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 112, CARACTERIZADO pelos neurônios do paciente expressarem uma quantidade reduzida de alfa-sinucleína e/ou compreenderem uma quantidade reduzida de corpos de Lewy após o contato com o vetor de terapia genética recombinante.
124. Método para inibir a degeneração ou morte de um neurônio dopaminérgico com um gene Parkin mutado (PRKN), CARACTERIZADO por compreender colocar o neurônio em contato com um sistema de edição de genes que compreende: a. uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; b. um RNA-guia (gRNA); e c. um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2 funcional, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleina (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes; em que o sistema de edição de genes é capaz de reparar um gene endógeno no neurônio ou inserir um gene funcional no genoma do neurônio.
125. Método, de acordo com a reivindicação 124, CARACTERIZADO por pelo menos um componente do sistema de edição de genes ser liberado pelo AAV recombinante.
126. Método, de acordo com a reivindicação 124, CARACTERIZADO pelo sistema de edição de gene ser liberado pelo AAV recombinante.
127. Sistema de edição de genes para uma célula, CARACTERIZADO por compreender: a. uma proteína Cas ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína Cas; b. um RNA-guia (gRNA); e c. um modelo de reparo que compreende uma proteína de Parkinson 2 funcional, gene de proteína ubiquitina ligase E3 (PARK2), gene de quinase putativa 1 induzida por PTEN (PINK1), um gene de proteína deglicase DJ-1 (DJ-1), um gene de quinase rica em leucina de repetição 2 (LRRK2), um gene de alfa-sinucleína (SNCA), um gene de Proto-oncogene c-Rel (c-Rel), um gene de enzima ativadora modificadora tipo ubiquitina (ATG7), um gene de transportador de amina vesicular sináptica (VMAT2), ou um gene de glucocerebrosidase (GBA), ou um fragmento funcional ou variante destes;
em que o sistema de edição de gene é capaz de reparar um gene endógeno na célula ou inserir um gene funcional no genoma da célula.
128. Sistema de edição de gene, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO por pelo menos um componente do sistema de edição de gene ser liberado pelo AAV recombinante.
129. Sistema de edição de gene, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo sistema de edição de gene ser liberado pelo AAV recombinante.
130. Sistema de edição de gene, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 129, CARACTERIZADO pela célula ser um neurônio ex vivo.
131. Sistema de edição de gene, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 130, CARACTERIZADO pela célula ser uma célula de um paciente.
BR112020021903-7A 2018-04-27 2019-04-29 terapia genética para degeneração do snc BR112020021903A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862664006P 2018-04-27 2018-04-27
US62/664,006 2018-04-27
PCT/US2019/029744 WO2019210325A1 (en) 2018-04-27 2019-04-29 Gene therapy for cns degeneration

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020021903A2 true BR112020021903A2 (pt) 2021-03-02

Family

ID=68295821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020021903-7A BR112020021903A2 (pt) 2018-04-27 2019-04-29 terapia genética para degeneração do snc

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210230631A1 (pt)
EP (1) EP3810781A4 (pt)
JP (2) JP2021522273A (pt)
KR (1) KR20210005889A (pt)
CN (1) CN112368390A (pt)
AU (1) AU2019261646A1 (pt)
BR (1) BR112020021903A2 (pt)
CA (1) CA3096293A1 (pt)
IL (1) IL278213A (pt)
MX (1) MX2020011386A (pt)
RU (1) RU2020134965A (pt)
SG (1) SG11202010061PA (pt)
WO (1) WO2019210325A1 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019111258A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-13 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Treatment for parkinsonian patients with mutations in the lrrk2 gene
AU2021273979A1 (en) * 2020-05-21 2023-01-05 Nysnobio Gt Neurology, Llc Gene therapy delivery of Parkin mutants having increased activity to treat Parkinson's Disease
EP4189097A1 (en) * 2020-08-03 2023-06-07 Prevail Therapeutics, Inc. Aav vectors encoding parkin and uses thereof
MX2023001615A (es) 2020-08-07 2023-03-08 Spacecraft Seven Llc Genoterapia con placofilina-2 (pkp2) mediante el uso de vector de aav.
WO2022040530A2 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 Capsida, Inc. Virus compositions for treating mucopolysaccharidosis ii
CN113846122B (zh) * 2021-08-16 2023-08-25 中国医学科学院医学生物学研究所 一种过表达snca的腺相关病毒载体aav-snca、制备方法及其应用
CN115029360A (zh) * 2022-05-30 2022-09-09 上海勉亦生物科技有限公司 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003234337B2 (en) * 2002-05-02 2008-08-07 University Of Rochester Vectors having both isoforms of beta-hexosaminidase
US20060171935A1 (en) * 2005-01-31 2006-08-03 Asa Abeliovich Protecting cell therapy for neurological disorders including Parkinson's disease
US8603994B2 (en) * 2010-11-11 2013-12-10 Valted, Llc Transcriptional repression leading to Parkinson's disease
DE18200782T1 (de) * 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
EP2669381A1 (en) * 2012-05-30 2013-12-04 AmVac AG Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector comprising a mutated P protein
CN105745326A (zh) * 2013-10-24 2016-07-06 优尼科Ip有限公司 用于基因治疗神经疾病的aav-5假型载体
CA3028334A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Engineered parasites for delivering protein to the central nervous system (cns)

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020134965A (ru) 2022-04-27
US20210230631A1 (en) 2021-07-29
JP2024059727A (ja) 2024-05-01
EP3810781A1 (en) 2021-04-28
MX2020011386A (es) 2021-01-29
JP2021522273A (ja) 2021-08-30
KR20210005889A (ko) 2021-01-15
WO2019210325A1 (en) 2019-10-31
CA3096293A1 (en) 2019-10-31
EP3810781A4 (en) 2022-08-17
AU2019261646A1 (en) 2020-11-12
IL278213A (en) 2020-11-30
SG11202010061PA (en) 2020-11-27
CN112368390A (zh) 2021-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020021903A2 (pt) terapia genética para degeneração do snc
RU2725813C2 (ru) Векторы, содержащие спейсерные/филлер полинуклеотидные последовательности, и способы их применения
JP2020513811A (ja) 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達
EP3256170A1 (en) Compositions and methods for transient delivery of nucleases
JP2020528734A (ja) バリアントカプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
JPH09509564A (ja) 高力価組換えａａｖベクターの生成
JP2022513034A (ja) 神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療
US20240209030A1 (en) Peptide-Modified AAV Capsid
ES2920477T3 (es) Vectores virales autolimitantes que codifican nucleasas
JP2022091764A (ja) 血管性浮腫の治療としてのｃ１ｅｉのアデノ随伴ウイルス介在性送達
CN115023242A (zh) 腺相关病毒载体变体
JP2018501791A (ja) 改変ｇ６ｐｃをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用
EP3952920A1 (en) Hybrid promoters for muscle expression
Hunanyan et al. Adeno-associated virus-mediated gene therapy in the Mashlool, Atp1a3Mashl/+, mouse model of alternating hemiplegia of childhood
BR112020015798A2 (pt) Composições de vírus adeno-associado para restaurar função de gene da pah e métodos de uso das mesmas
US20210246466A1 (en) Regulatable gene editing compositions and methods
Li et al. An overview of the therapeutic strategies for the treatment of spinal muscular atrophy
CN114144518A (zh) 用于基因疗法的双亮氨酸拉链激酶抑制剂
US20230072954A1 (en) Compositions and methods for circular rna expression
KR20230043794A (ko) 변이체 캡시드를 갖는 아데노-연관 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
KR20210138030A (ko) 안구인두 근이영양증 (opmd) 치료용 조성물 및 방법
Collaud et al. 286. An Optimized AAV Vector for Liver-Directed Expression of the UGT1A1 Gene in Crigler-Najjar Syndrome, towards Clinical Development
US20230279405A1 (en) Dna-binding domain transactivators and uses thereof
CN117980484A (zh) 新颖的转录因子
US20210261982A1 (en) Raav-mediated nuclease-associated vector integration (raav-navi)

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: SPACECRAFT SEVEN, LLC (US)